JP2023548969A - Nk細胞の大量増殖培養方法 - Google Patents
Nk細胞の大量増殖培養方法 Download PDFInfo
- Publication number
- JP2023548969A JP2023548969A JP2023551941A JP2023551941A JP2023548969A JP 2023548969 A JP2023548969 A JP 2023548969A JP 2023551941 A JP2023551941 A JP 2023551941A JP 2023551941 A JP2023551941 A JP 2023551941A JP 2023548969 A JP2023548969 A JP 2023548969A
- Authority
- JP
- Japan
- Prior art keywords
- cells
- rpmi
- culturing
- cell
- nkp46
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Pending
Links
- 210000000822 natural killer cell Anatomy 0.000 title claims abstract description 75
- 230000035755 proliferation Effects 0.000 title description 10
- 238000012136 culture method Methods 0.000 title description 2
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 claims abstract description 84
- 108010002350 Interleukin-2 Proteins 0.000 claims abstract description 55
- 102000003812 Interleukin-15 Human genes 0.000 claims abstract description 54
- 108090000172 Interleukin-15 Proteins 0.000 claims abstract description 54
- 238000000034 method Methods 0.000 claims abstract description 30
- 210000003819 peripheral blood mononuclear cell Anatomy 0.000 claims abstract description 30
- 210000002865 immune cell Anatomy 0.000 claims abstract description 27
- 102000004127 Cytokines Human genes 0.000 claims abstract description 22
- 108090000695 Cytokines Proteins 0.000 claims abstract description 22
- 238000012258 culturing Methods 0.000 claims abstract description 22
- 239000008280 blood Substances 0.000 claims abstract description 12
- 239000001963 growth medium Substances 0.000 claims abstract description 12
- 210000004369 blood Anatomy 0.000 claims abstract description 11
- 239000008188 pellet Substances 0.000 claims abstract description 8
- 230000003213 activating effect Effects 0.000 claims abstract description 4
- 239000006146 Roswell Park Memorial Institute medium Substances 0.000 claims abstract 7
- 108010088751 Albumins Proteins 0.000 claims description 16
- 102000009027 Albumins Human genes 0.000 claims description 16
- 210000003743 erythrocyte Anatomy 0.000 claims description 11
- 229920001917 Ficoll Polymers 0.000 claims description 6
- 238000005119 centrifugation Methods 0.000 claims description 6
- 239000000725 suspension Substances 0.000 claims description 5
- 239000012979 RPMI medium Substances 0.000 claims description 4
- 239000012139 lysis buffer Substances 0.000 claims description 4
- 239000002609 medium Substances 0.000 claims description 4
- 108010004222 Natural Cytotoxicity Triggering Receptor 3 Proteins 0.000 claims description 2
- 102100032852 Natural cytotoxicity triggering receptor 3 Human genes 0.000 claims description 2
- 238000004113 cell culture Methods 0.000 claims description 2
- 239000013028 medium composition Substances 0.000 claims description 2
- 238000000926 separation method Methods 0.000 claims description 2
- 238000012364 cultivation method Methods 0.000 claims 1
- 206010028980 Neoplasm Diseases 0.000 abstract description 17
- 201000011510 cancer Diseases 0.000 abstract description 16
- 238000002659 cell therapy Methods 0.000 abstract description 6
- 239000003795 chemical substances by application Substances 0.000 abstract description 5
- 102000000588 Interleukin-2 Human genes 0.000 description 44
- LOKCTEFSRHRXRJ-UHFFFAOYSA-I dipotassium trisodium dihydrogen phosphate hydrogen phosphate dichloride Chemical compound P(=O)(O)(O)[O-].[K+].P(=O)(O)([O-])[O-].[Na+].[Na+].[Cl-].[K+].[Cl-].[Na+] LOKCTEFSRHRXRJ-UHFFFAOYSA-I 0.000 description 14
- 239000002953 phosphate buffered saline Substances 0.000 description 14
- 230000000694 effects Effects 0.000 description 13
- 238000011282 treatment Methods 0.000 description 11
- 102100037850 Interferon gamma Human genes 0.000 description 10
- 108010074328 Interferon-gamma Proteins 0.000 description 10
- 239000000203 mixture Substances 0.000 description 10
- 210000004698 lymphocyte Anatomy 0.000 description 8
- 108700018351 Major Histocompatibility Complex Proteins 0.000 description 7
- 230000020382 suppression by virus of host antigen processing and presentation of peptide antigen via MHC class I Effects 0.000 description 7
- 210000001744 T-lymphocyte Anatomy 0.000 description 6
- 239000011886 peripheral blood Substances 0.000 description 6
- 210000005259 peripheral blood Anatomy 0.000 description 6
- 239000006228 supernatant Substances 0.000 description 6
- 230000004083 survival effect Effects 0.000 description 6
- 238000002474 experimental method Methods 0.000 description 5
- 238000009169 immunotherapy Methods 0.000 description 5
- 238000005259 measurement Methods 0.000 description 5
- 241000282414 Homo sapiens Species 0.000 description 4
- 101000581981 Homo sapiens Neural cell adhesion molecule 1 Proteins 0.000 description 4
- 102000002698 KIR Receptors Human genes 0.000 description 4
- 108010043610 KIR Receptors Proteins 0.000 description 4
- 102100029185 Low affinity immunoglobulin gamma Fc region receptor III-B Human genes 0.000 description 4
- 102100027347 Neural cell adhesion molecule 1 Human genes 0.000 description 4
- 241000700605 Viruses Species 0.000 description 4
- 239000006285 cell suspension Substances 0.000 description 4
- 238000000684 flow cytometry Methods 0.000 description 4
- 238000001943 fluorescence-activated cell sorting Methods 0.000 description 4
- 238000012360 testing method Methods 0.000 description 4
- KCXVZYZYPLLWCC-UHFFFAOYSA-N EDTA Chemical compound OC(=O)CN(CC(O)=O)CCN(CC(O)=O)CC(O)=O KCXVZYZYPLLWCC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 101000917858 Homo sapiens Low affinity immunoglobulin gamma Fc region receptor III-A Proteins 0.000 description 3
- 101000917839 Homo sapiens Low affinity immunoglobulin gamma Fc region receptor III-B Proteins 0.000 description 3
- 238000003782 apoptosis assay Methods 0.000 description 3
- 238000001914 filtration Methods 0.000 description 3
- 238000002156 mixing Methods 0.000 description 3
- 210000000581 natural killer T-cell Anatomy 0.000 description 3
- 230000008569 process Effects 0.000 description 3
- 230000005522 programmed cell death Effects 0.000 description 3
- 230000000638 stimulation Effects 0.000 description 3
- 239000000126 substance Substances 0.000 description 3
- 210000004881 tumor cell Anatomy 0.000 description 3
- 108010065805 Interleukin-12 Proteins 0.000 description 2
- GLNADSQYFUSGOU-GPTZEZBUSA-J Trypan blue Chemical compound [Na+].[Na+].[Na+].[Na+].C1=C(S([O-])(=O)=O)C=C2C=C(S([O-])(=O)=O)C(/N=N/C3=CC=C(C=C3C)C=3C=C(C(=CC=3)\N=N\C=3C(=CC4=CC(=CC(N)=C4C=3O)S([O-])(=O)=O)S([O-])(=O)=O)C)=C(O)C2=C1N GLNADSQYFUSGOU-GPTZEZBUSA-J 0.000 description 2
- 230000004913 activation Effects 0.000 description 2
- 230000000735 allogeneic effect Effects 0.000 description 2
- 239000000427 antigen Substances 0.000 description 2
- 108091007433 antigens Proteins 0.000 description 2
- 102000036639 antigens Human genes 0.000 description 2
- 230000006907 apoptotic process Effects 0.000 description 2
- 230000007541 cellular toxicity Effects 0.000 description 2
- 239000011248 coating agent Substances 0.000 description 2
- 238000000576 coating method Methods 0.000 description 2
- 210000001151 cytotoxic T lymphocyte Anatomy 0.000 description 2
- 238000000354 decomposition reaction Methods 0.000 description 2
- 210000004443 dendritic cell Anatomy 0.000 description 2
- 229940079593 drug Drugs 0.000 description 2
- 239000003814 drug Substances 0.000 description 2
- 230000036039 immunity Effects 0.000 description 2
- 239000003287 lymphocyte surface marker Substances 0.000 description 2
- 210000005087 mononuclear cell Anatomy 0.000 description 2
- 230000017074 necrotic cell death Effects 0.000 description 2
- 230000002265 prevention Effects 0.000 description 2
- 230000002062 proliferating effect Effects 0.000 description 2
- JQMFQLVAJGZSQS-UHFFFAOYSA-N 2-[4-[2-(2,3-dihydro-1H-inden-2-ylamino)pyrimidin-5-yl]piperazin-1-yl]-N-(2-oxo-3H-1,3-benzoxazol-6-yl)acetamide Chemical compound C1C(CC2=CC=CC=C12)NC1=NC=C(C=N1)N1CCN(CC1)CC(=O)NC1=CC2=C(NC(O2)=O)C=C1 JQMFQLVAJGZSQS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- CONKBQPVFMXDOV-QHCPKHFHSA-N 6-[(5S)-5-[[4-[2-(2,3-dihydro-1H-inden-2-ylamino)pyrimidin-5-yl]piperazin-1-yl]methyl]-2-oxo-1,3-oxazolidin-3-yl]-3H-1,3-benzoxazol-2-one Chemical compound C1C(CC2=CC=CC=C12)NC1=NC=C(C=N1)N1CCN(CC1)C[C@H]1CN(C(O1)=O)C1=CC2=C(NC(O2)=O)C=C1 CONKBQPVFMXDOV-QHCPKHFHSA-N 0.000 description 1
- 241000894006 Bacteria Species 0.000 description 1
- 241000283690 Bos taurus Species 0.000 description 1
- 208000005623 Carcinogenesis Diseases 0.000 description 1
- 241000282693 Cercopithecidae Species 0.000 description 1
- 238000008157 ELISA kit Methods 0.000 description 1
- 241000283073 Equus caballus Species 0.000 description 1
- 241000282326 Felis catus Species 0.000 description 1
- 238000012413 Fluorescence activated cell sorting analysis Methods 0.000 description 1
- 241000282412 Homo Species 0.000 description 1
- 108010073807 IgG Receptors Proteins 0.000 description 1
- 108010050904 Interferons Proteins 0.000 description 1
- 102000014150 Interferons Human genes 0.000 description 1
- 241000124008 Mammalia Species 0.000 description 1
- 241000699666 Mus <mouse, genus> Species 0.000 description 1
- 108091093105 Nuclear DNA Proteins 0.000 description 1
- 241000283973 Oryctolagus cuniculus Species 0.000 description 1
- 241001494479 Pecora Species 0.000 description 1
- 241000009328 Perro Species 0.000 description 1
- 241000293871 Salmonella enterica subsp. enterica serovar Typhi Species 0.000 description 1
- 241000282898 Sus scrofa Species 0.000 description 1
- 108091008874 T cell receptors Proteins 0.000 description 1
- 102000016266 T-Cell Antigen Receptors Human genes 0.000 description 1
- 108091023040 Transcription factor Proteins 0.000 description 1
- 102000040945 Transcription factor Human genes 0.000 description 1
- 208000036142 Viral infection Diseases 0.000 description 1
- 230000002159 abnormal effect Effects 0.000 description 1
- 230000009471 action Effects 0.000 description 1
- 230000003321 amplification Effects 0.000 description 1
- 238000004458 analytical method Methods 0.000 description 1
- 230000000259 anti-tumor effect Effects 0.000 description 1
- 210000003719 b-lymphocyte Anatomy 0.000 description 1
- 230000004071 biological effect Effects 0.000 description 1
- 210000000601 blood cell Anatomy 0.000 description 1
- 210000001185 bone marrow Anatomy 0.000 description 1
- 239000000872 buffer Substances 0.000 description 1
- 230000036952 cancer formation Effects 0.000 description 1
- 231100000504 carcinogenesis Toxicity 0.000 description 1
- 230000030833 cell death Effects 0.000 description 1
- 230000022534 cell killing Effects 0.000 description 1
- 230000004663 cell proliferation Effects 0.000 description 1
- 238000011254 conventional chemotherapy Methods 0.000 description 1
- 210000004748 cultured cell Anatomy 0.000 description 1
- 230000003013 cytotoxicity Effects 0.000 description 1
- 231100000135 cytotoxicity Toxicity 0.000 description 1
- 230000006378 damage Effects 0.000 description 1
- 230000007423 decrease Effects 0.000 description 1
- 230000008260 defense mechanism Effects 0.000 description 1
- 238000003745 diagnosis Methods 0.000 description 1
- 230000004069 differentiation Effects 0.000 description 1
- 201000010099 disease Diseases 0.000 description 1
- 208000037265 diseases, disorders, signs and symptoms Diseases 0.000 description 1
- 238000001035 drying Methods 0.000 description 1
- 238000005516 engineering process Methods 0.000 description 1
- 230000006870 function Effects 0.000 description 1
- 210000000987 immune system Anatomy 0.000 description 1
- 238000000338 in vitro Methods 0.000 description 1
- 230000015788 innate immune response Effects 0.000 description 1
- 229940079322 interferon Drugs 0.000 description 1
- 230000003834 intracellular effect Effects 0.000 description 1
- 210000004185 liver Anatomy 0.000 description 1
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 description 1
- 239000003550 marker Substances 0.000 description 1
- 230000007246 mechanism Effects 0.000 description 1
- 230000001404 mediated effect Effects 0.000 description 1
- 239000012528 membrane Substances 0.000 description 1
- 238000012986 modification Methods 0.000 description 1
- 230000004048 modification Effects 0.000 description 1
- 238000003199 nucleic acid amplification method Methods 0.000 description 1
- 210000005105 peripheral blood lymphocyte Anatomy 0.000 description 1
- 239000000047 product Substances 0.000 description 1
- 108020003175 receptors Proteins 0.000 description 1
- 102000005962 receptors Human genes 0.000 description 1
- 238000011160 research Methods 0.000 description 1
- 238000010079 rubber tapping Methods 0.000 description 1
- 230000003248 secreting effect Effects 0.000 description 1
- 230000028327 secretion Effects 0.000 description 1
- 210000000130 stem cell Anatomy 0.000 description 1
- 239000000021 stimulant Substances 0.000 description 1
- 230000001629 suppression Effects 0.000 description 1
- 230000009385 viral infection Effects 0.000 description 1
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N5/00—Undifferentiated human, animal or plant cells, e.g. cell lines; Tissues; Cultivation or maintenance thereof; Culture media therefor
- C12N5/06—Animal cells or tissues; Human cells or tissues
- C12N5/0602—Vertebrate cells
- C12N5/0634—Cells from the blood or the immune system
- C12N5/0646—Natural killers cells [NK], NKT cells
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12M—APPARATUS FOR ENZYMOLOGY OR MICROBIOLOGY; APPARATUS FOR CULTURING MICROORGANISMS FOR PRODUCING BIOMASS, FOR GROWING CELLS OR FOR OBTAINING FERMENTATION OR METABOLIC PRODUCTS, i.e. BIOREACTORS OR FERMENTERS
- C12M25/00—Means for supporting, enclosing or fixing the microorganisms, e.g. immunocoatings
- C12M25/06—Plates; Walls; Drawers; Multilayer plates
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N5/00—Undifferentiated human, animal or plant cells, e.g. cell lines; Tissues; Cultivation or maintenance thereof; Culture media therefor
- C12N5/0068—General culture methods using substrates
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N5/00—Undifferentiated human, animal or plant cells, e.g. cell lines; Tissues; Cultivation or maintenance thereof; Culture media therefor
- C12N5/0081—Purging biological preparations of unwanted cells
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N2500/00—Specific components of cell culture medium
- C12N2500/30—Organic components
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N2501/00—Active agents used in cell culture processes, e.g. differentation
- C12N2501/20—Cytokines; Chemokines
- C12N2501/23—Interleukins [IL]
- C12N2501/2302—Interleukin-2 (IL-2)
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N2501/00—Active agents used in cell culture processes, e.g. differentation
- C12N2501/20—Cytokines; Chemokines
- C12N2501/23—Interleukins [IL]
- C12N2501/2315—Interleukin-15 (IL-15)
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N2501/00—Active agents used in cell culture processes, e.g. differentation
- C12N2501/50—Cell markers; Cell surface determinants
- C12N2501/599—Cell markers; Cell surface determinants with CD designations not provided for elsewhere
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N2506/00—Differentiation of animal cells from one lineage to another; Differentiation of pluripotent cells
- C12N2506/11—Differentiation of animal cells from one lineage to another; Differentiation of pluripotent cells from blood or immune system cells
Landscapes
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Biomedical Technology (AREA)
- Wood Science & Technology (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Zoology (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Microbiology (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- General Engineering & Computer Science (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Cell Biology (AREA)
- Immunology (AREA)
- Hematology (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Sustainable Development (AREA)
- Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
- Medicines Containing Material From Animals Or Micro-Organisms (AREA)
Abstract
本発明は、NK細胞の培養方法に関し、より詳細には、1)血液から末梢血単核球(PBMC:peripheral blood mononuclear cell)の免疫細胞のペレット(pellet)を分離するステップと、2)前記PBMCを抗CD16抗体によりコーティングされた培養器を用いてRPMI培養培地において培養するステップと、3)前記PBMCを継代培養するステップと、4)前記PBMCにIL-2、IL-15及びIL-2+IL-15からなるサイトカイン群から選ばれたサイトカインを処理することにより、NK細胞を活性化させるステップと、を含むNK細胞の培養方法に関する。本発明は、様々なサイトカインのうち、IL-2、IL-15を用いてNK細胞に処理したとき、効果的に細胞を活性化できる最適な組み合わせとしてのIL-2+IL-15を処理したときにNK細胞を大量で培養可能であり、これを用いる場合、がん細胞の細胞死滅または殺傷能が促されることができて、がんの予防または治療に効く免疫細胞治療剤として用いることができる。
Description
本発明は、免疫療法に適用されるナチュラルキラー細胞(Natural Killer cell;NK細胞)の大量増殖培養方法に関し、より詳細には、ヒトの抹消血液に由来したリンパ球を培養して悪性腫瘍の治療効果が抜群であるNK細胞を効率よく増幅及び活性化させるとともに、NK細胞が占める割合を著しく増加させることのできるNK細胞の大量増殖培養方法に関する。
免疫療法は、ナチュラルキラー細胞(Natural Killer cell;NK細胞)、樹状細胞(DC)、B細胞、T細胞などがんの治療に最も重要な免疫細胞を患者の血液から抽出した後、色々な種類の刺激剤を用いてがんに強く働く免疫細胞として育てた後、再び患者に注入する方法であって、患者自分の血液を使用するので、従来の化学療法などに比べて副作用も少なく、投与法もまた簡便であることから、最近、それに関する研究が盛んに行われている。
免疫療法において活性化させる免疫細胞の中でも、特に、NK細胞は、リンパ球の一種である特徴的な形態である大顆粒状リンパ球(LGL;Large granular lymphocytes)であって、感染されたウィルス、腫瘍細胞を殺す能力が抜群であり、ほとんどの正常細胞は殺さないという特性を有しているが、その抗腫瘍作用は、壊死(ネクローシス)やプログラム細胞死(アポトーシス)、またはこれらの2種類の作用機序が同時に生じて行われる。NK細胞は、IL-2、IL-12、インターフェロン(Interferon)などのサイトカイン(cytokine)に反応し、これにより、力価(cytotoxicity)、分泌性(secretory)、増殖性(proliferative)の機能が上昇する。NK細胞の表現型(phenotype)は、ヒトにおいてCD16(FcγRIII)、CD56であり、CD16とCD56は、細胞の表面にT細胞受容体複合体(TRC:T-cell receptor complex)がないため、NK細胞に対するマーカー(marker)として活用される。
このようなNK細胞は、初期の生体防御機構と人体の腫瘍免疫において重要な役割を果たすことが知られている。
すなわち、NK細胞は、主要組織適合遺伝子複合体(Major Histocompatibility Complex:MHC)の発現に伴う免疫の獲得過程なしにも特定の自己細胞、同種細胞、さらには異種がん細胞もまた殺傷することができ、特に、クラス1MHC(Class1 MHC)を少なく発現させるか、あるいは、全く発現させない標的細胞をさらに上手く殺すこともできる。したがって、NK細胞は、MHCが発現しないほとんどのがん細胞を効果的に殺すことができ、その他にも、いくつかのウィルスに感染された細胞と腸チフス菌(salmonella typhi)などのような細菌を殺すことができる。
このようなNK細胞は、先天免疫(自然免疫、innateimmunity)を担う重要な細胞であって、T細胞とは異なり、肝(liver)、骨髄(bone marrow)において成熟される。特に、ウィルス(virus)に感染された細胞や腫瘍細胞(tumor cells)など非正常細胞を自ら識別して死滅させる機能を有する。さる10余年の間に患者の免疫システムを用いた腫瘍免疫治療が絶えず発展されてきており、これを用いた「細胞治療剤(cell therapy product)」もまた商業化されている。細胞治療剤は、自己(autologous)、同種(allogeneic)、もしくは異種(xenogeneic)の細胞を体外(in vitro)において増殖させ、かつ選別する方法を用いて、細胞の生物学的特性を変化させる一連の行為を通じて治療、診断、予防の目的で使用する医薬品であると定義される(韓国の食品医薬安全庁告示第2003-26号第2条)。
がんのような難治性疾患の治療のための細胞治療剤であって、免疫拒否反応を解消することができ、患者に合わせてカスタマイズされた細胞治療を提供することのできる、NK細胞を大量で増殖させる方法及び活性が強化されたNK細胞を培養する方法が求められる。
しかしながら、このように、がん細胞の殺傷に卓越した作用をするNK細胞は、正常人の場合であっても、抹消血リンパ球の5~15%のみを占めており、特に、がん患者の場合には、その割合が1%未満に低下するため、免疫療法を通じた別途の増幅過程なしには、がん細胞を効果的に攻撃するのに限界がある。
NK細胞の分化と増殖、生存は、機能的な側面からみて、サイトカインに多大な影響を受け、従来の色々な研究によれば、IL-2、IL-12、IL-15、IL-18などのサイトカインが細胞の毒性及び活性化を増加させると言われている。現在、免疫細胞、特に、NK細胞を活性化させ、かつ増殖させるに当たって、IL-2などのサイトカインとCD3などの抗体が用いられる。現行の技術は、免疫細胞の増殖において非常に重要な役割を果たすのがCD3抗体であるが、問題は、この抗体を用いて免疫細胞を活性化させることが非常に煩雑であるということである。
特に、最初からCD3抗体の強い刺激が加えられると、未成熟前駆細胞はT細胞として成熟されることになるため、一般的に行われている現行の方法としては、最初にCD3抗体を僅かに刺激する方法を用いるが、個人差など周辺環境の多くの要件に左右されて活性化済みの大量で増殖したNK細胞を得る上で難点がある。
したがって、現行の方法において、必ずフラスコにCD3抗体を固定した後、一定の時間の間に反応させることを余儀なくされるという煩雑さを除去しながらも、NK細胞を安定的に増幅させて大量で増殖させることのできる新規な培養培地組成物及び培養方法に関する開発や取り組みへのニーズが取り上げられているのが現状である。
このため、本発明者らは、サイトカインを用いたNK細胞の大量増殖培養方法について悩んでいた中、ヒトの抹消血液に由来した免疫細胞であるリンパ球を分離、培養し、抗CD3抗体ではなく、抗CD16抗体によりコーティングされた培養器において様々なサイトカイン、特に、IL-2とIL-15を一緒に処理したとき、NK細胞が大量増殖し、かつ、活性化されるという知見を得ることにより、本発明を完成するに至った。
本発明の目的は、サイトカインを用いたNK細胞の大量増殖培養方法を提供することである。
上記の目的を達成するために、本発明は、1)フィコール(ficoll)と遠心分離を用いて、血液から免疫細胞を含有している末梢血単核球(PBMC:peripheral blood mononuclear cell)のペレット(pellet)を分離するステップと、2)前記分離されたPBMCを、抗CD16抗体によりコーティングされた培養器を用いて、RPMI培養培地、血漿、IL-2、IL-15、抗CD56、抗NKp46及び抗NKp30を含有している培地において培養するステップと、3)前記培養されたPBMCをRPMI培地、アルブミン、IL-2、IL-15、抗CD56、抗NKp46、抗NKp30において継代培養するステップと、4)前記継代培養されたPBMCをRPMI及びアルブミン、抗NKp30、抗NKp46、抗CD56抗体の添加を基本とした培地組成物に添加し、IL-2、IL-15及びIL-2+IL-15からなるサイトカイン群から選ばれたサイトカインを処理することにより、NK細胞を活性化させるステップと、を含む、NK細胞の培養方法を提供する。
以下、本発明について詳しく説明する。
NK細胞は、リンパ球の一種である大顆粒状リンパ球(Large granular lymphocytes:LGL)であって、感染されたウィルス及び腫瘍細胞を殺す能力が抜群であり、ほとんどの正常細胞は殺さないという特性を有する。したがって、NK細胞は、活性細胞毒性Tリンパ球が大量で生成される前に、ウィルス感染もしくは腫瘍形成の初期段階において重要な役割を果たす。例えば、NK細胞が標的細胞と接触する場合、いくつかの分子は、標的細胞の膜に穴を形成して細胞を溶解させ、他の分子は、標的細胞に入っていって核DNAの分節を増加させて、壊死(necrosis)、細胞死滅(Apotosis)またはプログラム細胞死(PCD:Programmed Cell Death)を引き起こす。
そのため、NK細胞は、特定のウィルスに感染された細胞とがん細胞を先刺激なしに溶解させることができる。TCRの発現を通じて抗原-特異的に認識する細胞毒性Tリンパ球とは異なり、NK細胞は、抗原-特異的収容体が欠如している。
NK細胞は、正常細胞のMHC類型Iと結合するキラー細胞免疫グロブリン様受容体(killer cell immunoglobulin-like receptor:KIR)を発現させる。キラー細胞免疫グロブリン様受容体は、MHC類型Iと結合すれば、特定の転写因子の抑制を誘導する細胞内信号が生成される。この結果、NK細胞の活性化、標的細胞の分解及び破壊が抑制される。ウィルス感染細胞またはがん細胞は、それらの表面にMHC類型I分子が大幅に減少されている。したがって、このような細胞がNK細胞に出会うと、効果的にキラー細胞免疫グロブリン様受容体と結合することができないため、NK細胞-媒介の細胞の毒性に露出されて溶解される。
前記NK細胞は、例えば、哺乳動物、ヒト、猿、豚、馬、牛、羊、犬、猫、マウスまたは兎などに由来したものであってもよい。前記NK細胞は、正常人またはがん患者から得たものであってもよい。前記NK細胞は、血液、抹消血単核球(Peripheral blood mononuclear cell:PBMC)から分離されたものであってもよい。血液を分離する方法、これからPBMCを分離する方法、これからNK細胞を分離する方法は、公知の方法により行われるものであってもよい。
本発明のNK細胞の培養方法において、前記4)ステップのサイトカインとしては、IL-2+IL-15を処理することが好ましく、このとき、IL-2 20ng/mlとIL-15 50ng/mlを処理することがさらに好ましい。
また、本発明のNK細胞の培養方法において、前記1)ステップの免疫細胞の分離に際して、免疫細胞のペレット(pellet)にRBC(赤血球)分解用緩衝液(lysis buffer)を処理することにより、赤血球を除去することが好ましく、前記2)ステップの培養は、細胞数が3×107以下である場合に抗CD16抗体によりコーティングされたT25フラスコにおいて、細胞数が3×107以上である場合に抗CD16抗体によりコーティングされたT75フラスコにおいて、RPMI 8ml、血漿2ml、IL-2 20ng/ml、IL-15 50ng/ml、抗CD56 5ng/ml、抗NKp46 5ng/ml、抗NKp30 5ng/mlを入れ、PBMCペレットをRPMI 10mlに浮遊させてさらに入れた後、37℃、5% CO2培養器において3~4日間培養することが好ましい。
また、本発明のNK細胞の培養方法において、前記3)ステップの継代培養は、2)ステップの細胞培養懸濁液20ml、RPMI 72ml、アルブミン8ml、IL-2 20ng/ml、IL-15 50ng/ml、抗NKp30 5ng/ml、抗NKp46 5ng/ml、抗CD56 5ng/mlを入れ、37℃、5% CO2培養器において3~5日間1次継代培養を行い、1次継代培養懸濁液50ml、RPMI 180ml、アルブミン20ml、IL-2 20ng/ml、IL-15 50ng/ml、抗NKp30 5ng/ml、抗NKp46 5ng/ml、抗CD56 5ng/mlを入れ、37℃、5% CO2培養器において5~7日間2次継代培養を行うことが好ましい。
以上述べたように、本発明は、様々なサイトカインのうち、IL-2、IL-15を用いてNK細胞に処理したとき、効果的に細胞を活性化できる最適な組み合わせとしてのIL-2+IL-15を処理したときに、NK細胞を大量培養することが可能であり、特に、IL-2 20ng/mlとIL-15 50ng/mlを処理したときに最も効果的である。これを用いる場合、がん細胞の細胞死滅または殺傷能が促されることができて、がんの予防または治療に効く免疫細胞治療剤として用いることができる。
以下、実施例を挙げて本発明をより詳しく説明する。これらの実施例は、単に本発明をより詳しく説明するためのものであって、本発明の要旨により本発明の範囲がこれらの実施例により何ら制限されないということは、当業界において通常の知識を有する者にとって自明である。
<実施例1>血液からの免疫細胞の分離
血液から免疫細胞を分離するために、まず、フィコール(ficoll)(GEヘルスケア社製)、リン酸緩衝生理食塩水(PBS:Phosphate-buffered saline)(WELGENE社製)、ろ過チューブ(filter tube)(Greiner bio-one)(2本)、50mlチューブ(VWR社製)(4本)、EDTAチューブ(BDバイオサイエンス社製)、血球計算器(hematocytometer)(MARIENFELD(マリエンフェルド)社製)を準備した。
滅菌されたエチレンジアミン四酢酸(EDTA:ethylenediaminetetraacetic acid)チューブに採取された50~100mlの血液を製造室に運び、前記血液を50mlチューブに分けて入れた。ろ過チューブ2本にフィコール(ficoll)15mlずつを入れ、2000rpmにて1分間遠心分離して準備された前記フィコールが含有されているろ過チューブに前記血液を分けて入れた。これを2500rpmにて25分間遠心分離した。ここで、末梢血単核球(PBMC:peripheral blood mononuclear cell)層のみを分離して新たな50mlチューブに集め、リン酸緩衝生理食塩水(PBS)にて体積を50mlに合わせた後、2000rpmにて10分間遠心分離した。もし、ペレット(pellet)にRBC(赤血球)が多い場合、RBC分解用緩衝液(lysis buffer)を用いた。
遠心分離後に前記上澄み液を除去した後、ロズウェルパーク記念研究所(RPMI: Roswell Park Memorial Institute)培養培地(Hyclone(登録商標))10mlにてペレットを解離させた後、懸濁液を適量採取して細胞数の計数に用い、残りは、RPMI培養培地にて体積を50mlに合わせた後、2000rpmにて10分間遠心分離した。
このとき、RBC分解用緩衝液の使用は、次の通りである。
1×108~2×108の細胞当たりにRBC分解用緩衝液1mlを入れた。1分間タッピング(tapping)した。ここにRPMI培養培地15~20mlを入れた後、1500rpm(250~500×G)にて7分間遠心分離した。もし、RBCの除去がさらに必要である場合、上記の過程を2~3回繰り返し行った。
<実施例2>試料抹消血単核球(PBMC:peripheral blood mononuclear cell)免疫細胞の分布
前記実施例1に記載されたように、抹消血液40~60ccをフィコールが入れられているろ過チューブ2本に分けて分注した後、2500rpmにて25分間遠心分離した。層分離された抹消血液から抹消血単核球(PBMC:peripheral blood mononuclear cell)層のみを分離して新たな50mlチューブに集め、リン酸緩衝生理食塩水(PBS)にて洗浄した後、上澄み液を捨て、得られた細胞に蛍光物質を含む抗体(CD56-PE、CD3-BV421)を反応させた後、フローサイトメトリー(Flow cytometry)を用いて解析した。抗体に応じた免疫細胞の分布結果を下記の表1と図1に示す。
上記の表1と図1に記載されたように、全体的に血液から分離された抹消血単核球(PBMC)免疫細胞は、NK細胞5~6%、NKT細胞2~7%、T細胞60~80%の分布を示しているということを確認することができた。
<実施例3>IL-2及びIL-15サイトカインの濃度の設定のためのNK活性度の測定試験(IFN-γの測定)
予備実験にてIL-2及びIL-15サイトカインの効果と濃度を設定するために、前記実施例1による抹消血液から得られた単核球に、抗CD16抗体によりコーティングされたフラスコにRPMI 18ml、血漿2ml、抗CD56 5ng/ml、抗NKp46 5ng/ml、抗NKp30 5ng/mlを入れた培地において、IL-2及びIL-15サイトカインのそれぞれの濃度を処理して7日間培養した後、細胞をすべて回収した。収集された細胞を2000rpmにて5分間遠心分離して上澄み液1mlを新たなチューブに移し替えた後、細胞の活性度を測定した。細胞の活性度の測定は、IFN-γ ELISAキットを用いてIFN-γの分泌量にて確認することにより行った。
NK細胞にIL-2及びIL-15の処理濃度に応じたIFN-γの分泌量を図2に、前記図2によるIL-2及びIL-15の最適な濃度を設定し、前記設定した濃度を処理した後のIFN-γの分泌量に応じた活性度を図3に記載した。
具体的に、図2から明らかなように、IL-2の場合には、濃度を5、10、15、20、40(ng/ml)にして処理したとき、次第にIFN-γの分泌量が増えていて、20ng/mlにおいて最高の濃度を示し、40ng/mlにおいてはそれ以上増加しなかった。一方、IL-15の場合には、10、30、50、100(ng/ml)の濃度を比較したとき、IFN-γの分泌量は、50ng/mlにおいて最高の濃度を示し、100ng/mlにおいてそれ以上増加しなかった。2種類の実験の結果、IL-2は20ng/ml、IL-15は50ng/mlにおいて細胞の活性度が最も効果的になる濃度であるということを確認した。
図3から、IL-2及びIL-15をそれぞれ処理した細胞のIFN-γの分泌量よりも、IL-2+IL-15を一緒に処理して培養された細胞のIFN-γの分泌量の方が確然として増えて細胞の活性度が増加したことを確認した。
<実施例4>IL-2及びIL-15処理による免疫細胞の分布及び細胞の生存率、並びに細胞数の測定
NK細胞の大量培養をするための予備実験にて、抗体及びIL-2及びIL-15のそれぞれの条件でNK細胞の割合及び細胞の生存率または細胞数の効果を得るために、前記実施例1による抹消血液から得られた単核球に、抗CD16抗体によりコーティングされたフラスコにRPMI 18ml、血漿2mlを入れた状態で、それぞれの条件を処理して7日間培養した後、細胞をすべて回収してNK細胞の表面抗原を分析した。抗CD16抗体によりコーティングされたフラスコにRPMI 18ml、血漿2mlを基本として入れた状態で、抗体(抗CD56 5ng/ml、抗NKp46 5ng/ml、抗NKp30 5ng/ml)のみを添加した群、抗CD16抗体によりコーティングされたフラスコにRPMI 18ml、血漿2mlを基本として入れた状態で、IL-2(20ng/ml)+IL-15(50ng/ml)サイトカインのみを添加した群、抗CD16抗体によりコーティングされたフラスコにRPMI 18ml、血漿2mlを基本として入れた状態で、抗体(抗CD56 5ng/ml、抗NKp46 5ng/ml、抗NKp30 5ng/ml)+IL-2(20ng/ml)のみを添加した群、抗CD16抗体によりコーティングされたフラスコにRPMI 18ml、血漿2mlを基本として入れた状態で、抗体(抗CD56 5ng/ml、抗NKp46 5ng/ml、抗NKp30 5ng/ml)+IL-15(50ng/ml)のみを添加した群、抗CD16抗体によりコーティングされたフラスコにRPMI 18ml、血漿2mlを基本として入れた状態で、抗体(抗CD56 5ng/ml、抗NKp46 5ng/ml、抗NKp30 5ng/ml)+IL-2(20ng/ml)+IL-15(50ng/ml)を添加した群に分けてそれぞれ処理して7日間培養し、2000rpmにて10分間遠心分離して上澄み液を除去し、得られた細胞に蛍光物質を含む抗体(CD56-PE、CD3-BV421)を反応させた後、フローサイトメトリー(Flow cytometry)を用いて解析した。細胞数の測定は、遠心分離して得られた細胞をリン酸緩衝生理食塩水(PBS)に浮遊させた後、10μlを取ってトリパンブルー10μlと混ぜた後、血球計算器(hemocytometer)を用いて行った。抗体に応じた免疫細胞の分布結果を下記の表2と図4に示し、総細胞数と細胞の生存率は図5に記載した。
上記の表2と図4に記載されたように、抗体のみを処理した試料よりも、IL-2+IL-15サイトカインを処理した混合物の方においてNK細胞の割合がさらに増加したものの、抗体+IL-2+IL-15を組み合わせた混合物を処理したとき、NK及びNKT細胞を増加させる上で有効であるということを確認した。なお、図5でのように、抗体+IL-2+IL-15の混合物が他の比較群よりも2~4倍ほど高い増殖効果を示しており、生存率もまた高く保持されるということを確認した。
<実施例5>設定された濃度でのNK免疫細胞の大量培養方法
<5-1>抗CD16コーティング
T75フラスコにリン酸緩衝生理食塩水(PBS)10mlと抗CD16 5ng/mlを混合し、常温で6時間放置した後、冷蔵において一晩中(24時間)保管することにより、抗CD16をコーティングした。前記コーティングされたフラスコは、一週間以内に使用しなければならず、使用する前にリン酸緩衝生理食塩水(PBS)を除去し、リン酸緩衝生理食塩水(PBS)にて一回洗浄した後に使用した。コーティングされているため、底面が乾かないようにしなければならず、フラスコの底面に直接的にピペッティングしないように注意を払った。
<5-2>免疫細胞の培養
まず、前記実施例5-1において準備した、抗CD16によりコーティングされたT75フラスコの他に、RPMI培地、血漿、IL-2、IL-15、抗CD56、抗NKp46、抗NKp30を準備した。
細胞懸濁液の細胞数が3×107以下である場合に抗CD16抗体によりコーティングされたT25フラスコにおいて、3×107以上である場合には抗CD16抗体によりコーティングされたT75フラスコにおいて細胞を培養した。具体的に、コーティングされたT75フラスコにRPMI 8ml、血漿2ml、IL-2 20ng/ml、IL-15 50ng/ml、抗CD56 5ng/ml、抗NKp46 5ng/ml、抗NKp30 5ng/mlを入れ、実施例1の方法と同様にして得られた細胞を、上澄み液を除去し、RPMI 10mlにてピペッティングした後、前記フラスコに入れた。37℃、5% CO2培養器において細胞の状態に合うように3~4日間培養した。
<5-3>継代培養
継代培養のために、T175またはT225フラスコ、RPMI培地、アルブミン、IL-2、IL-15、抗CD56、抗NKp46、抗NKp30を準備した。
<5-3-1>1次継代培養(T75フラスコからT175フラスコへの植え継ぎ(継代培養))
前記実施例5-2のT75フラスコにおいて培養された免疫細胞をT175フラスコにおいて継代培養した。具体的に、T75フラスコをスクレーパー(scraper)にて掻いて底面に付いている細胞を剥がし、ピペッティングして固まった細胞を解離させた。このようにして準備した細胞懸濁液20mlを、新たなT175フラスコに入れ、RPMI 72ml、アルブミン8ml、IL-2 20ng/ml、IL-15 50ng/ml、抗NKp30 5ng/ml、抗NKp46 5ng/ml、抗CD56 5ng/mlを入れ、培養培地と混ぜた後、37℃、5% CO2培養器において細胞の状態に合うように3~5日間培養した。
<5-3-2>2次継代培養(T175フラスコからT225フラスコ2個への植え継ぎ(継代培養))
T175フラスコからT225フラスコ2個への植え継ぎ(継代培養)を行った。具体的に、T175フラスコをスクレーパーにて掻いて底面に付いている細胞を剥がし、ピペッティングして固まった細胞を解離させた。このようにして準備した細胞懸濁液100mlをそれぞれ50mlずつ、新たなT225フラスコ2個に入れ、それぞれRPMI 180ml、アルブミン20ml、IL-2 20ng/ml、IL-15 50ng/mlを入れ、前記培養培地と混ぜた後、37℃、5% CO2培養器において細胞の状態に合うように5~7日間培養した。このとき、細胞の状態に合うように培地を追加してT225フラスコ1個当たりに最終的に400mlを超えないように注意を払った。
<実施例6>設定された濃度でNK細胞を14日間培養した後の細胞数の測定試験
大量増殖のために設定された組成が、14日間の培養にも拘わらず、NK細胞の大量増殖及び分布の増加が可能であるか否かを調べてみた。具体的に、実施例1の方法により分離されたリンパ球細胞5×107 cellをそれぞれ試料の培養培地に添加し、設定された組成であるRPMI+アルブミン+抗体(抗CD56 5ng/ml、抗NKp46 5ng/ml、抗NKp30 5ng/ml)+IL-2(20ng/ml)+IL-15(50ng/ml)をさらに処理して14日間培養した。また、対照群としては、RPMI+アルブミン+IL-2(20ng/ml)+IL-15(50ng/ml)サイトカインのみを処理した群、RPMI+アルブミン+抗体(抗CD56 5ng/ml、抗NKp46 5ng/ml、抗NKp30 5ng/ml)のみを添加した群に分けた。なお、細胞数に応じて継代培養して培養培地を添加して14日間培養した。細胞数の測定のために日付け毎に培養した細胞を回収した後、浮遊させた細胞から10μlを取ってトリパンブルー10μlと混ぜた後、血球計算器にて測定した。その結果を図6に記載した。図6に記載されたように、造成された培養培地において14日間培養したときに、2×109 cell以上の細胞増殖結果を示した。
<実施例7>設定された濃度でのNK細胞の大量培養の組成に応じたFACS解析試験
前記実施例5-3-2に従い培養されたリンパ球免疫細胞分布(蛍光活性化細胞ソーティング(FACS))実験は、RPMI+アルブミン+抗体(抗CD56 5ng/ml、抗NKp46 5ng/ml、抗NKp30 5ng/ml)+IL-2(20ng/ml)+IL-15(50ng/ml)を処理して14日間培養し、対照群として行った実験は、RPMI+アルブミン+IL-2(20ng/ml)+IL-15(50ng/ml)サイトカインのみを処理した群、RPMI+アルブミン+抗体(抗CD56 5ng/ml、抗NKp46 5ng/ml、抗NKp30 5ng/ml)のみを処理した群をそれぞれ細胞数に応じて継代培養により14日間培養して比較した。2000rpmにて10分間遠心分離して上澄み液を除去し、得られた細胞に蛍光物質を含む抗体(CD56-PE、CD3-BV421)を反応させた後、フローサイトメトリー(Flow cytometry)を用いて分析した。その結果を下記の表3及び図7に記載した。
上記の表3及び図7に記載されたように、大量増殖のために設定された組成が、14日間の大量培養後にもNK及びNKT細胞が85%、T細胞が8.5%という組成となって、NK細胞の割合が他の対照群に比べて確然として増えるという結果を確認することができた。
以上、本発明について、好適な実施形態を挙げて詳しく説明したが、本発明は、上記の実施形態に何ら限定されるものではなく、本発明の技術思想の範囲内において当分野において通常の知識を有する者により色々な変形が可能である。
Claims (6)
- 1)フィコール(ficoll)と遠心分離を用いて、血液から免疫細胞を含有している末梢血単核球(PBMC:peripheral blood mononuclear cell)のペレット(pellet)を分離するステップと、
2)前記分離された末梢血単核球(PBMC)を、抗CD16抗体によりコーティングされた培養器を用いて、RPMI培養培地、血漿、IL-2、IL-15、抗CD56、抗NKp46及び抗NKp30を含有している培地において培養するステップと、
3)前記培養された末梢血単核球(PBMC)をRPMI培地、アルブミン、IL-2、IL-15、抗CD56、抗NKp46、抗NKp30において継代培養するステップと、
4)前記継代培養された末梢血単核球(PBMC)をRPMI及びアルブミン、抗NKp30、抗NKp46、抗CD56抗体の添加を基本とした培地組成物に添加し、IL-2、IL-15及びIL-2+IL-15からなるサイトカイン群から選ばれたサイトカインを処理することにより、NK細胞を活性化させるステップと、
を含む、NK細胞の培養方法。 - 前記4)ステップのサイトカインとしては、IL-2+IL-15を処理することを特徴とする、請求項1に記載のNK細胞の培養方法。
- 前記サイトカインは、IL-2 20ng/mlとIL-15 50ng/mlを処理することを特徴とする、請求項2に記載のNK細胞の培養方法。
- 前記1)ステップの免疫細胞の分離に際して、免疫細胞のペレット(pellet)にRBC(赤血球)分解用緩衝液(lysis buffer)を処理することにより、赤血球を除去することを特徴とする、請求項1に記載のNK細胞の培養方法。
- 前記2)ステップの培養は、細胞数が3×107以下である場合に抗CD16によりコーティングされたT25フラスコにおいて、細胞数が3×107以上である場合に抗CD16によりコーティングされたT75フラスコにおいて、RPMI 8ml、血漿2ml、IL-2 20ng/ml、IL-15 50ng/ml、抗CD56 5ng/ml、抗NKp46 5ng/ml、抗NKp30 5ng/mlを入れ、PBMCペレットをRPMI 10mlに浮遊させてさらに入れた後、37℃、5% CO2培養器において3~4日間培養することを特徴とする、請求項1に記載のNK細胞の培養方法。
- 前記3)ステップの継代培養は、2)ステップの細胞培養懸濁液20ml、RPMI 72ml、アルブミン8ml、IL-2 20ng/ml、IL-15 50ng/ml、抗NKp30 5ng/ml、抗NKp46 5ng/ml、抗CD56 5ng/mlを入れ、37℃、5% CO2培養器において3~5日間1次継代培養を行い、1次継代培養懸濁液50ml、RPMI 180ml、アルブミン20ml、IL-2 20ng/ml、IL-15 50ng/mlを入れ、37℃、5% CO2培養器において5~7日間2次継代培養を行うことを特徴とする、請求項1に記載のNK細胞の培養方法。
Applications Claiming Priority (3)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
KR1020200150118A KR102236011B1 (ko) | 2020-11-11 | 2020-11-11 | Nk 세포의 대량증식 배양방법 |
KR10-2020-0150118 | 2020-11-11 | ||
PCT/KR2021/005785 WO2022102887A1 (ko) | 2020-11-11 | 2021-05-10 | Nk 세포의 대량증식 배양방법 |
Publications (1)
Publication Number | Publication Date |
---|---|
JP2023548969A true JP2023548969A (ja) | 2023-11-21 |
Family
ID=75461787
Family Applications (1)
Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
---|---|---|---|
JP2023551941A Pending JP2023548969A (ja) | 2020-11-11 | 2021-05-10 | Nk細胞の大量増殖培養方法 |
Country Status (7)
Country | Link |
---|---|
US (1) | US20240002801A1 (ja) |
EP (1) | EP4245847A1 (ja) |
JP (1) | JP2023548969A (ja) |
KR (1) | KR102236011B1 (ja) |
CN (1) | CN116745404A (ja) |
CA (1) | CA3198511A1 (ja) |
WO (1) | WO2022102887A1 (ja) |
Families Citing this family (4)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
KR102236011B1 (ko) * | 2020-11-11 | 2021-04-05 | 한바이오 주식회사 | Nk 세포의 대량증식 배양방법 |
KR20230150113A (ko) * | 2022-04-21 | 2023-10-30 | (주) 엘피스셀테라퓨틱스 | 유사 기억 자연 살해 세포 제조방법 및 이를 이용하여 제조된 유사 기억 자연 살해 세포의 항암 용도 |
CN115466726B (zh) * | 2022-09-05 | 2023-09-19 | 北京景达生物科技有限公司 | 一种nk细胞的高效基因转导方案 |
CN117551608B (zh) * | 2023-11-10 | 2024-04-30 | 深圳泽医细胞治疗集团有限公司 | 活化培养基、高分泌IFN-γ的NK细胞的培养方法及应用 |
Family Cites Families (6)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
AU2003294930B2 (en) * | 2002-12-23 | 2008-12-04 | Innate Pharma | Pharmaceutical compositions having an effect on the proliferation of NK cells and a method using the same |
KR101415039B1 (ko) * | 2013-09-30 | 2014-08-13 | 지엔에스바이오(주) | 자기유래 활성화 림프구의 대량 증식을 위한 배지 조성물 및 배양방법 |
KR101760764B1 (ko) * | 2017-02-10 | 2017-07-24 | 케이셀바이오뱅킹 주식회사 | Nk세포의 대량 증식을 위한 배양방법 |
KR102265437B1 (ko) * | 2017-11-24 | 2021-06-15 | 의료법인 성광의료재단 | Nk 배양용 조성물 및 이를 이용하여 nk 세포를 배양하는 방법 |
KR102123489B1 (ko) * | 2020-03-13 | 2020-06-16 | 주식회사 휴먼셀바이오 | 자연살해세포 배양액 조성물 및 이를 이용한 자연살해세포 배양방법 |
KR102236011B1 (ko) * | 2020-11-11 | 2021-04-05 | 한바이오 주식회사 | Nk 세포의 대량증식 배양방법 |
-
2020
- 2020-11-11 KR KR1020200150118A patent/KR102236011B1/ko active IP Right Grant
-
2021
- 2021-05-10 WO PCT/KR2021/005785 patent/WO2022102887A1/ko active Application Filing
- 2021-05-10 CA CA3198511A patent/CA3198511A1/en active Pending
- 2021-05-10 US US18/252,572 patent/US20240002801A1/en active Pending
- 2021-05-10 JP JP2023551941A patent/JP2023548969A/ja active Pending
- 2021-05-10 CN CN202180087238.0A patent/CN116745404A/zh active Pending
- 2021-05-10 EP EP21892057.7A patent/EP4245847A1/en active Pending
Also Published As
Publication number | Publication date |
---|---|
EP4245847A1 (en) | 2023-09-20 |
CA3198511A1 (en) | 2022-05-19 |
CN116745404A (zh) | 2023-09-12 |
US20240002801A1 (en) | 2024-01-04 |
WO2022102887A1 (ko) | 2022-05-19 |
KR102236011B1 (ko) | 2021-04-05 |
Similar Documents
Publication | Publication Date | Title |
---|---|---|
US20180223257A1 (en) | Method for the induction and expansion of natural killer cells derived from peripheral blood mononuclear cells | |
JP6869994B2 (ja) | Nk細胞培養用培地添加キット、及びキットを用いるnk細胞培養方法 | |
JP2023548969A (ja) | Nk細胞の大量増殖培養方法 | |
JP5572863B2 (ja) | Nk細胞の増幅方法 | |
JP5977238B2 (ja) | 抗白血病/リンパ腫処置のための抗第三者セントラルメモリーt細胞の使用 | |
US11566227B2 (en) | Kit containing medium for culturing natural killer cells and method of effectively culturing natural killer cells using the same | |
JP2018501779A (ja) | T細胞を利用したナチュラルキラー細胞の培養方法 | |
KR20190135912A (ko) | Ox40l을 발현하는 배양보조세포 및 이를 이용한 자연살해세포 배양 방법 | |
JP5989016B2 (ja) | Nk細胞の増幅方法 | |
JP3619853B2 (ja) | ナチュラルキラー細胞の増殖方法 | |
JP2017061558A (ja) | Th1特性と細胞溶解性を発現する細胞 | |
JP7477120B2 (ja) | Nk細胞の活性化及び増幅のために遺伝的に操作された細胞株、及びその用途 | |
US20050112762A1 (en) | Method for culturing dendritic cells | |
KR101447546B1 (ko) | 제대혈 cd14 양성 단핵세포로부터 자연살해세포 분화 및 증식 방법 | |
WO2023216799A1 (zh) | 一种人nkt细胞系及其应用 | |
JP6838750B2 (ja) | Nk細胞を含む細胞集団の製造方法 | |
KR102032384B1 (ko) | 제대혈 단핵세포에서의 자연살해세포의 제조 방법 | |
KR20220036287A (ko) | 고순도 및 고효율의 자연살해세포 제조방법 및 이의 용도 | |
WO1999003980A1 (fr) | Cellules de stroma derivees d'agm | |
KR102566680B1 (ko) | 면역세포 및 자연살해세포 배양을 위한 신규한 이중배양 제조방법 및 이의 용도 | |
JP2021035400A (ja) | Nk細胞を含む細胞集団の製造方法 | |
김병수 | The Role of Regulatory T Cells Expanded by Anti-DR3 Antibody for Alleviation of Acute Graft-versus-Host Disease | |
NZ533348A (en) | Method of supporting the viability, proliferation and/or differentiation of mammalian dendritic cells comprising culturing dendritic cells and/or precursors thereof in the presence of mononuclear immune cells | |
AU2002365446A1 (en) | Method for culturing dendritic cells |
Legal Events
Date | Code | Title | Description |
---|---|---|---|
A621 | Written request for application examination |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A621 Effective date: 20230519 |
|
A131 | Notification of reasons for refusal |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A131 Effective date: 20240514 |
|
A977 | Report on retrieval |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A971007 Effective date: 20240515 |