KR20190135912A

KR20190135912A - Ox40l을 발현하는 배양보조세포 및 이를 이용한 자연살해세포 배양 방법

Info

Publication number: KR20190135912A
Application number: KR1020190044625A
Authority: KR
Inventors: 조덕; 천세종; 김석호; 이재민
Original assignee: 사회복지법인 삼성생명공익재단; 한국생명공학연구원; 주식회사 박셀바이오
Priority date: 2018-05-29
Filing date: 2019-04-17
Publication date: 2019-12-09
Also published as: KR102227155B1

Abstract

본 발명은 OX40L을 발현하는 배양보조세포 및 이를 이용한 자연살해세포 배양 방법에 관한 것으로서, 본 발명의 따른 OX40L을 발현하는 배양보조세포를 말초혈액단핵구와 함께 공배양시킬 경우, 일반적인 K562 세포주를 배양보조세포로 이용하는 방법과 비교하여 높은 수준의 순도 및 증폭률로 자연살해세포를 증식시킬 수 있는바, 자연살해세포를 이용한 다양한 면역 세포 치료 분야에서 치료 효율 및 치료 효능을 획기적으로 증진시킬 수 있을 것으로 기대된다.

Description

OX40L을 발현하는 배양보조세포 및 이를 이용한 자연살해세포 배양 방법{Feeder cells expressing OX40L and natural killer cell culture method using the same}

본 발명은 OX40L(CD134 ligand)을 발현하는 배양보조세포(feeder cell) 및 이를 이용한 자연살해세포 배양 방법에 관한 것으로서, 보다 구체적으로는 OX40L의 발현이 증가되도록 형질 전환시킨 배양보조세포를 포함하는 NK 세포 배양용 조성물, 배양보조세포주 및 이를 이용한 NK 세포 배양 방법에 관한 것이다.

자연살해세포(이하 NK 세포)는 혈액 내 백혈구로서, 세포독성 및 면역기능을 조절하는 역할을 하는 것으로 알려져 있으며, 특히, 세포독성 기능과 관련하여 암세포 및 바이러스에 감염된 세포 등을 직접 파괴하는 면역 세포이며, 체내의 암세포, 병원균, 감염된 세포, 이종 세포 등을 제거하는 선천성 면역 기능을 가지는 것으로 알려져 있어, NK 세포는 세포 면역 치료제로서 가능성이 높게 평가되고 있다.

NK 세포의 기능에 대한 결함은 다수의 질환에서 보고되었으며, 특히 암 환자의 경우 대다수 NK 세포의 불활성화가 있는 것으로 보고되었다. 일부 연구자들은 정상혈액을 가진 자 또는 NK 세포의 기능이 감소된 환자를 대상으로 NK 세포를 체외에서 증식시키고 활성화시키는 방법에 대한 연구를 진행하였고, 상기 연구 결과 체외에서 증폭된 NK 세포를 다양한 암종에 대하여 반응시킨 결과, 우수한 세포독성(cytotoxicity)을 보인다는 점도 증명되었다. 특히 일부 혈액암에 대하여는 임상시험에서 긍정적인 치료효과를 보여주었다.

한편, 배양보조세포를 활용하여 NK 세포를 증폭시키는 방법의 명확한 기전은 정확히 알려져 있지 않으나, 대상자의 혈액으로부터 추출된 말초혈액단핵구와 배양보조세포를 같이 배양할 경우 NK 세포를 선택적으로 증폭시키는 점에서 공통된다. 그러나, 다수의 연구에서는 NK 세포 외에도 T 세포 등 다른 림프구의 증폭이 동반되어, 상기 NK 세포를 활용한 면역 세포 치료의 부적합한 면을 보이기도 한다.

한편, 종래 보고된 NK 세포의 증식 방법은 다수의 고가 사이토카인을 고농도로 사용하여야 하는바, 경제력이 있는 일부 환자만이 해당 치료의 적용을 받을 수 있는 실정이다.

따라서, NK 세포의 선택적 증폭을 위한 효율적인 방법에 대한 개발 연구가 주목받고 있으며, 이에 대한 연구가 이루어지고 있으나(한국등록특허 제10-1525199호), 아직은 미비한 실정이다.

본 발명은 상기와 같은 문제점을 해결하기 위해 안출된 것으로서, 본 발명자들은 NK 세포를 선택적으로 증폭시키는 방법에 대한 연구를 진행하던 중, 표면 항원 중 수지상 세포나 T 세포의 분화에 관여하는 것으로 알려진 OX40L의 발현이 증가되도록 형질 전환시킨 배양보조세포를 말초혈액단핵구와 공배양하면, NK 세포를 높은 순도 및 증폭률(Fold expansion)로 얻을 수 있음을 확인하였는바, 이에 기초하여 본 발명을 완성하게 되었다.

본 발명의 목적은 OX40L을 발현하는 배양보조세포(feeder cells)를 유효성분으로 포함하는, NK 세포 배양용 조성물을 제공하는 것이다.

본 발명의 다른 목적은 하기 단계를 포함하는 자연살해세포 대량 증식 배양 방법을 제공하는 것이다.

(a) 말초혈액으로부터 말초혈액단핵구(Peripheral blood mononuclear cell, PBMC)를 수득하는 단계; 및

(b) 상기 수득한 말초혈액단핵구와 OX40L을 발현하는 배양보조세포(feeder cells)를 사이토카인을 함유하는 배지에서 공배양하는 단계.

본 발명의 또 다른 목적은 OX40L 유전자로 형질 전환된 NK 세포의 배양보조세포주를 제공하는 것이다.

그러나 본 발명이 이루고자 하는 기술적 과제는 이상에서 언급한 과제에 제한되지 않으며, 언급되지 않은 또 다른 과제들은 아래의 기재로부터 당업자에게 명확하게 이해될 수 있을 것이다.

상기 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은

OX40L을 발현하는 배양보조세포(feeder cells)를 유효성분으로 포함하는, NK 세포 배양용 조성물을 제공한다.

본 발명의 일 구현예로, 상기 배양보조세포는 K562 세포일 수 있다.

본 발명의 다른 구현예로, 상기 OX40L을 발현하는 배양보조세포는 OX40L 유전자가 삽입된 발현 벡터로 형질 전환될 수 있다.

본 발명의 또 다른 구현예로, 상기 OX40L 유전자는 서열번호 1로 표시되는 염기서열로 이루어질 수 있다.

본 발명의 또 다른 구현예로, 상기 발현 벡터는 플라스미드 벡터, 코스미드 벡터, 박테리오파지 벡터 및 바이러스 벡터로 이루어진 군으로부터 선택될 수 있다.

본 발명의 또 다른 구현예로, 상기 바이러스 벡터는 렌티바이러스(lentivirus) 또는 레트로바이러스(retrovirus) 벡터일 수 있다.

또한, 본 발명은 하기 단계를 포함하는 자연살해세포 배양 방법을 제공한다.

본 발명의 일 구현예로, 상기 사이토카인은 IL-2, IL-15, IL-21, Flt3-L, IL-7, IL-12 및 IL-18로 이루어진 군으로부터 선택되는 1 종 이상일 수 있다.

본 발명의 다른 구현예로, 상기 OX40L을 발현하는 배양보조세포(feeder cells)는 50 Gy 내지 300 Gy 방사선을 처리하여 수득될 수 있다.

본 발명의 또 다른 구현예로, 상기 공배양은 2일 내지 30일 동안 수행될 수 있다.

또한, 본 발명은 OX40L 유전자로 형질 전환된 NK 세포의 배양보조세포주를 제공한다.

본 발명에 따른 배양보조세포, 보다 구체적으로 OX40L의 발현이 증가된 K562 세포를 말초혈액단핵구와 함께 공배양시킬 경우, 일반적인 K562 세포를 배양보조세포로 이용하는 방법과 비교하여 높은 수준의 순도 및 증폭률로 NK 세포를 증식시킬 수 있는바, NK 세포를 이용한 다양한 면역 세포 치료 분야에서 치료 효율 및 치료 효능을 획기적으로 증진시킬 수 있을 것으로 기대된다.

도 1은 OX40L을 발현하는 배양보조세포를 이용한 NK 세포 증폭 방법을 나타내는 전체 개요도이다.
도 2는 K562-OX40L 세포주 및 K562 세포주의 mRNA 발현에 관한 것으로, (a)는 OX40L mRNA의 발현 여부를 확인한 결과를 나타낸 것이고, (b)는 OX40L mRNA의 발현량을 확인한 결과를 나타낸 것이다.
도 3은 NK 세포의 순도 및 증폭률 측정에 관한 것으로, (a)는 K562-OX40L 세포주와 말초혈액단핵구를 공배양하여 얻어진 NK 세포의 순도를 대조군과 비교하여 나타낸 것이고, (b)는 K562-OX40L 세포주와 말초혈액단핵구를 공배양하여 얻어진 NK 세포의 증폭률을 대조군과 비교하여 나타낸 것이다.
도 4는 NK 세포의 순도 및 증폭률 측정에 관한 것으로, (a)는 K562 세포주와 말초혈액단핵구를 공배양하여 얻어진 NK 세포의 순도와 K562-OX40L 세포주와 말초혈액단핵구를 공배양하여 얻어진 NK 세포의 순도를 비교한 결과를 나타낸 것이고, (b)는 K562 세포주와 말초혈액단핵구를 공배양하여 얻어진 NK 세포의 순도와 K562-OX40L 세포주와 말초혈액단핵구를 공배양하여 얻어진 NK 세포의 증폭률을 비교한 결과를 나타낸 것이다.
도 5는 NK 세포의 기능 측정에 관한 것으로, (a)는 K562 세포주와 말초혈액단핵구를 공배양하여 얻어진 NK 세포의 세포독성과 K562-OX40L 세포주와 말초혈액단핵구를 공배양하여 얻어진 NK 세포의 세포독성을 비교한 결과를 나타낸 것이고, (b)는 K562 세포주와 말초혈액단핵구를 공배양하여 얻어진 NK 세포의 ADCC와 K562-OX40L 세포주와 말초혈액단핵구를 공배양하여 얻어진 NK 세포의 ADCC를 비교한 결과를 나타낸 것이다.
도 6은 K562 세포주와 말초혈액단핵구를 공배양하여 얻어진 NK 세포의 세포 표면 수용체와 K562-OX40L 세포주와 말초혈액단핵구를 공배양하여 얻어진 NK 세포의 세포 표면 수용체의 발현 결과를 비교하여 나타낸 것이다.
도 7은 NK 세포의 증폭률 측정에 관한 것으로, (a)는 K562-OX40L 세포주 및 IL-21(5 ng/㎖)에 의해 얻어진 NK 세포의 증폭률과 K562 세포주 및 IL-21(5 ng/㎖)에 의해 얻어진 NK 세포의 증폭률을 비교한 결과를 나타낸 것이고, (b)는 상기 IL-21(50 ng/㎖)인 조건 하의 증폭률을 비교한 결과를 나타낸 것이고, (c)는 상기 IL-21(100 ng/㎖)인 조건 하의 증폭률을 비교한 결과를 나타낸 것이고, (d)는 상기 (a) 내지 (c)의 NK 세포의 평균 증폭률을 나타낸 것이다.
도 8은 다양한 농도의 IL-21(0, 50, 100 ng/㎖)과 E:T 비율(2:1, 1:1, 0.5:1)에서, NK 세포의 기능 측정에 관한 것으로, (a)는 K562 세포주와 말초혈액단핵구를 공배양하여 얻어진 NK 세포의 세포독성 및 K562-OX40L 세포주와 말초혈액단핵구를 공배양하여 얻어진 NK 세포의 세포독성을 비교한 결과를 나타낸 것이고, (b)는 상기 각 NK 세포의 ADCC를 비교한 결과를 나타낸 것이다.
도 9는 OX40L-K562 세포주 및 IL-21(0, 5, 50 ng/㎖)에 의해 얻어진 NK 세포의 기능 측정에 관한 것으로, (a)는 탈과립 마커인 CD107a의 발현비를 나타낸 것이고, (b)는 탈과립 마커인 TNF-α의 발현비를 나타낸 것이고, (c)는 탈과립 마커인 IFN-γ의 발현비를 나타낸 것이고, (d)는 텔로미어 길이 증가비를 나타낸 것이다.

이하 본 발명을 상세히 설명한다.

본 발명자들은 표면 항원 중 수지상 세포나 T 세포의 분화에 관여하는 것으로 알려진 OX40L의 발현이 증가되도록 형질 전환시킨 배양보조세포를 말초혈액단핵구와 공배양하여 높은 순도와 증폭률을 가지는 NK 세포를 수득할 수 있음을 확인함으로써, 본 발명을 완성하였다.

이에, 본 발명은 OX40L을 발현하는 배양보조세포(feeder cells)를 유효성분으로 포함하는, NK 세포 배양용 조성물을 제공한다.

본 발명에서 사용되는 용어, “OX40L”은 OX40(CD134)의 리간드로서, TNF 패밀리의 구성원이고, B 세포, 대식세포, 내피 세포 및 수지상 세포(DC)를 비롯한 활성화된 항원제시세포(APC)에서 발현되는 것으로 알려져 있다. 또한, OX40L은 활성화 T 세포에 발현하는 OX40을 매개하여 T 세포 수용체(TCR)를 자극하여 T 세포의 증식에 관여하고, IL-2, IL-4, IFN-γ등의 사이토카인 생산의 공(共)자극으로 작용하는 것으로 알려져 있으며, 이외에도 활성화된 혈관내피세포에서 발현되는 OX40L은 활성화된 T 세포가 염증 부위로 침윤하는 것에 관여하는 것으로 알려져 있다.

본 발명에서 사용되는 용어, “배양보조세포(feeder cells, 지지세포라고도 한다)”는 분열 증식하는 능력은 없지만 대사 활성이 있기 때문에 여러 가지 대사물질을 생산하여 목적 NK 세포의 증식을 돕는 세포이다. 본 발명에서 사용될 수 있는 배양보조세포로는 유전자가 도입된 동물 세포주(cell line)나 각종 사이토카인이나 화합물이 처리된 말초혈 백혈구 세포(PBL), 자기 또는 타인의 말초혈 백혈구 세포, T 세포, B 세포 또는 다단핵구(monocyte) 등이 있으며, 바람직하게는 유전자가 도입된 동물 세포주가 사용될 수 있으며, 보다 바람직하게는 인간만성골수백혈병세포주의 하나인 K562 세포일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니며, 본 발명이 속하는 기술 분야에서 통상적으로 사용 가능한 것으로 알려진 다른 배양보조세포들도 본 발명의 목적에 부합한다면, 제한 없이 사용 가능함은 당연한 것이다.

한편, 본 발명에 있어서, OX40L을 발현하는 배양보조세포는 OX40L 유전자가 삽입된 발현 벡터로 형질 전환된 것을 특징으로 한다.

본 발명에 따른 OX40L 유전자(NCBI accession number : NM_003326)는 서열번호 1의 염기서열로 이루어진 것일 수 있으며, 상기 염기서열의 상동체가 본 발명의 범위 내에 포함된다. 구체적으로, 상기 유전자는 서열번호 1의 염기서열과 각각 70% 이상, 바람직하게는 80% 이상, 더욱 바람직하게는 90% 이상, 가장 바람직하게는 95% 이상의 서열 상동성을 가지는 염기서열을 포함할 수 있다.

본 발명에서 사용되는 용어, “발현 벡터”는 적당한 숙주세포에서 목적 단백질 또는 목적 RNA를 발현할 수 있는 벡터로서, 유전자 삽입물이 발현되도록 작동 가능하게 연결된(operably linked) 필수적인 조절요소를 포함하는 유전자 제작물을 말한다.

본 발명에서 용어, “작동 가능하게 연결된(operably linked)”은 일반적 기능을 수행하도록 핵산 발현조절 서열과 목적하는 단백질 또는 RNA를 코딩하는 핵산 서열이 기능적으로 연결(functional linkage)되어 있는 것을 말한다. 예를 들어 프로모터와 단백질 또는 RNA를 코딩하는 핵산 서열이 작동 가능하게 연결되어 코딩하는 핵산 서열의 발현에 영향을 미칠 수 있다. 재조합 발현 벡터와의 작동적 연결은 당해 기술 분야에 잘 알려진 유전자 재조합 기술을 이용하여 달성할 수 있으며, 부위-특이적 DNA 절단 및 연결은 해당 기술 분야에 일반적으로 알려진 효소 등을 사용한다.

본 발명에 사용 가능한 발현 벡터는 플라스미드 벡터, 코스미드(cosmid) 벡터, 박테리오파아지 벡터, 바이러스 벡터 등을 포함하나 이에 제한되지는 않으며, 바람직하게는 바이러스 벡터일 수 있으며, 보다 바람직하게는 렌티바이러스(lentivirus) 또는 레트로바이러스(retrovirus) 벡터일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니며, 적합한 발현 벡터는 프로모터(promoter), 오퍼레이터(operator), 개시 코돈(initiation codon), 종결 코돈(termination codon), 폴리아데닐화 신호(polyadenylation signal), 인핸서(enhancer)와 같은 발현 조절 서열 외에도, 막 표적화 또는 분비를 위한 신호서열(signal sequence) 또는 리더서열(leader sequence)을 포함하여 목적에 따라 다양하게 제조될 수 있다. 발현 벡터의 프로모터는 구성적(constitutive) 또는 유도성(inducible)일 수 있다. 또한, 발현 벡터는 벡터를 함유하는 숙주세포를 선택하기 위한 선택 마커를 포함하고, 복제가 가능한 발현 벡터인 경우 복제 기원을 포함한다.

본 발명의 다른 양태로서, 본 발명은 하기 단계를 포함하는 자연살해세포 배양 방법을 제공한다.

본 발명에서 말초혈액단핵구(peripheral blood mononuclear cell, PBMC)는 혈액 내 존재하는 구형 핵을 가진 세포를 의미하며, 이러한 말초혈액단핵구에는 B 세포, T 세포, 대식세포(macrophage), 수지상 세포(dendritic cell), 자연살해세포(NK cell, natural killer cell) 등의 면역세포들이 포함되어 있다.

본 발명에서 배지에 포함될 수 있는 사이토카인(cytokine)은 인터루킨(interleukin) 류에서 선택된 하나 이상인 것이 바람직하며, 인터루킨은 림프구나 단구 및 대식세포 등 면역담당 세포가 생산하는 단백질성 생물활성물질의 총칭으로 본 발명에서 사용가능한 인터루킨으로는 IL-2, IL-15, IL-21, Flt3-L, IL-7, IL-12 및 IL-18로 이루어진 군에서 선택되는 하나 이상인 것이 바람직하며, 특히, IL-2 및 IL-15 또는 IL-2, IL-15 및 IL-21을 사용하는데, IL-21은 지속적 사용이 아닌 단기(배양시작일에 배양액에 한번 투여 후 중단)로 사용함이 바람직하지만, 이에 한정되는 것은 아니며, 본 발명에 속하는 기술분야에서 통상의 지식을 가진 자에게 다른 사이토카인도 본 발명의 목적에 부합하는 한 제한없이 이용 가능함은 자명한 것이다.

상기 사이토카인들이 NK 세포 분화에 관여한다는 사실은 여러 문헌에서 찾을 수 있다. 사이토카인 수용체의 γ의 발현이 결핍된 쥐에서 B 세포와 T 세포는 발견이 되지만 NK 세포는 발견되지 않는 점에서 γ를 지닌 수용체들이 NK 분화에 중요한 역할을 한다고 알려져 있으며, 수용체의 γ형태는 IL-2, IL-4, IL-7, IL-9, IL-15 또는 IL-21의 수용체이다.

상기 IL-2는 성숙된 NK 세포의 증식과 활성화를 증진시키는 기능을 지니고 있음이 보고되고 있다. IL-2가 결핍된 인간과 마우스에서는 NK 세포의 수가 현저히 감소한다는 보고가 있으나, 한편으로는 IL-2 및 IL-2Ra 결핍은 간접적으로 NK 세포의 수와 활성화에 영향을 미친다는 연구 결과도 있으며, IL-2R 사슬은 IL-15의 수용체를 형성하는데 관여한다고 알려져 있다.

상기 IL-15에 관하여, IL-15 또는 IL-15Rα가 결핍된 쥐에서는 NK 세포가 발견되지 않는다는 사실과 IL-15 생성에 요구되는 전사인자 인터페론(transcription factor interferon, IFN)-조절 인자 1이 결핍된 쥐에서는 NK 세포가 결핍됨이 밝혀졌다. 이로써, IL-15가 NK 세포 분화에 관여한다는 것과 IL-15는 NK 세포에서 발현되는 IL-15 수용체를 통해서 NK 세포의 성장과 분화를 직접적으로 증진시킨다는 것이 알려져 있다.

상기 IL-21은 transcription-3(STAT-3)을 자극시킴으로써 NK 세포의 텔로미어 길이(telomere length)를 증가시키고 NK 세포의 활성, 성장, 증폭에 중요한 역할을 하는 것으로 알려져 있다. 특히, 인간의 CD34+ 조혈모세포에서 IL-15와의 조합을 통해 NK 세포의 성장을 돕는다는 것이 보고되었고, 멤브레인에 결합된(membrane-bound, mb) IL-21을 통해 NK 세포를 증폭시킬 시, 인터페론 감마(IFN-γ의 발현이나 세포독성이 증가한다는 것이 확인되었다. 또한, 배양액에 IL-21의 주입을 지속하는 것보다 처음 한 번만 주입하는 것이 NK 세포 증폭에 효과적인 것으로 보고되었다.

본 발명은 말초혈액단핵구(Peripheral Blood Mononuclear Cell, PBMC)와 방사선을 조사한 OX40L이 발현된 배양보조세포(feeder cells)를 이용하여 높은 순도 및 증폭률로 NK 세포를 유도하고 증식하는 방법으로서, 이때, 본 발명에 따른 방사선은 감마선일 수 있고, 바람직한 방사선 조사량은 50 Gy 내지 300 Gy일 수 있으며, 보다 바람직하게는 70 Gy 내지 200 Gy일 수 있으며, 가장 바람직하게는 100 Gy일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.

NK 세포 증식 방법은 대부분 MACs(magnetic activated cell sorting)를 이용하여 T 세포를 제거하거나, NK 세포만을 분리하여 증식시키는 방법을 사용하였다. 그러나, NK 세포를 분리 시 cliniMACs나 FACs sorter 등 고가 장비의 사용이 필요하고, 별도로 단핵구에 다량으로 존재하는 T 세포를 키트를 사용하여 제거해야하므로 비용이 많이 들고 증식 과정이 복잡한 문제점이 있었다.

상기와 같은 문제를 해결하기 위해서, 본 발명자들이 개발한 방법은 별도의 분리 과정없이 상기 OX40L을 발현하는 배양보조세포(feeder cells)에 방사선을 조사한 후, 말초혈액단핵구와 공동 배양함으로써 높은 순도와 증폭률로 NK 세포를 유도하고 증식시킬 수 있다.

보다 구체적으로, 본 발명의 일실시예에서는 OX40L을 발현하는 배양보조세포주로서, OX40L를 발현하는 K562(K562-OX40L) 및 정상인 유래 말초혈액단핵구를 준비하여(실시예 1 참조), 상기 준비된 배양보조세포주 및 말초혈액단핵구를 사이토카인인 IL-2 및 IL-15 존재 하에서 공배양시켰으며, trypan blue exclusion method 및 FITC-anti-human CD3 및 PE-Cy5 anti-human CD56 모노클로날 항체를 사용하여 NK 세포 수 및 증폭된 NK 세포의 순도를 확인한 결과, 높은 증폭률 및 순도를 나타내는 NK 세포를 수득할 수 있음을 확인하였다(실시예 2 참조).

또한, 본 발명의 다른 일실시예에서는 상기 준비된 배양보조세포주 및 말초혈액단핵구를 사이토카인인 IL-2, IL-15 및 IL-21(한번만 노출) 존재 하에서 공배양시켰으며, trypan blue exclusion method 및 FITC-anti-human CD3 및 PE-Cy5 anti-human CD56 모노클로날 항체를 사용하여 NK 세포 수 및 증폭된 NK 세포의 순도를 확인한 결과, 높은 증폭률을 나타내는 NK 세포를 수득할 수 있음을 확인하였다(실시예 3 참조).

본 발명의 또 다른 양태로서, 본 발명은 OX40L 유전자로 형질 전환된, NK 세포 배양보조세포주를 제공한다.

이하, 본 발명의 이해를 돕기 위하여 바람직한 실시예를 제시한다. 그러나 하기의 실시예는 본 발명을 보다 쉽게 이해하기 위하여 제공되는 것일 뿐, 하기 실시예에 의해 본 발명의 내용이 한정되는 것은 아니다.

[실시예]

실시예 1. 실험준비 및 실험방법

1-1. OX40L 발현 렌티바이러스의 생산

본 발명에 따른 OX40L을 발현하는 배양보조세포를 생산하기 위해서, 인간 유래 OX40L 유전자를 렌티바이러스 벡터인 pLVX-IRES-ZsGreen에 클로닝하여 재조합 렌티바이러스 생산용 벡터를 제작하였다. 이후, 바이러스 생산을 위해 상기로부터 제작된 재조합 유전자(OX40L-pLVX-IRES-ZsGreen)를 293FT 세포에 패키징 벡터와 함께 lipofectamin3000(Invitrogen)을 이용하여 형질 주입시킨 다음, 24시간이 지나면, 새로운 배지로 교환하여 48시간 동안 세포를 배양한 후, 바이러스가 함유된 배지를 회수하였다. 회수된 배지는 500 × g 에서 10분간 원심분리하고, 0.45 ㎛ 필터를 이용하여 바이러스가 함유된 순수한 배지만을 분리하여 OX40L 발현 렌티바이러스를 생산하였다. 마지막으로, Centricon을 이용하여 렌티바이러스를 농축하고 멸균된 1.5 ㎖ 튜브에 1 ㎖씩 분주한 후 -70 ℃에 보관하였다.

1-2. OX40L 발현 K562(K562-OX40L) 세포주 생산

상기 실시예 1-1의 OX40L 발현 렌티바이러스의 생산 하루 전에 배양보조세포인 K562를 미리 준비하고, 준비된 K562 세포 배지 9 ㎖에 냉동 보관한 OX40L 발현 렌티바이러스 1 ㎖를 녹여 polybrene(8 ㎍/㎖)을 함께 첨가한 후, 미리 준비된 K562 세포 배지와 교환하고, 48시간 동안 세포 배양을 진행하였다. 이후, 초고속 유세포 자동분리기를 이용한 녹색 형광 발현 세포의 선별과정을 통하여 감염된 세포만을 선별하였다. 또한, 역전사 중합효소 연쇄반응(RT-PCR)을 통해 감염된 세포의 OX40L mRNA 발현 여부를 확인하고, 유세포분석기(FACS)를 통해 감염된 세포 표면에서 OX40L 단백질의 발현 여부를 확인하여, OX40L이 발현된 K562 세포주를 생산하였다.

1-3. OX40L 발현 K562(K562-OX40L)의 배양

상기 실시예 1-2로부터 생산한 OX40L을 발현하는 K562(K562-OX40L) 세포주를 5 % CO₂가 공급된 배양기를 이용하여, 37 ℃의 25 ㎖의 완전 RPMI 1640 배지가 들어있는 T-75 플라스크에서 배양시켰다. 이후, 400 × g 조건 하에서 3분 동안 원심 분리를 진행하였으며, 5 ㎖의 완전 RPMI 1640 배지에서 세포 펠릿을 재부유시켜 배양보조세포를 수확한 뒤, 상기 배양보조세포의 과도한 성장을 방지하기 위해서, 상기 배양보조세포에 Gammacell 3000 Elan 방사기를 이용하여 100 Gy로 감마선을 조사하였다.

1-4. 말초혈액단핵구(Peripheral Blood Mononuclear Cells, PBMCs)의 분리

말초혈액단핵구(PBMCs)의 분리를 위해서, 정상인 공여자의 전혈을 PBS와 1:2 비율(10 ㎖ 전혈 : 20 ㎖ PBS)로 희석하여, 15 ㎖ Lymphoprep 상에서 오버레이하고, 상온에서 1200 × g 조건으로 25분 동안 중지없이 원심 분리를 진행하고(가속 1, 감속 0), 연막층(buffy coat layer)에서 세포를 수확하고, 7분 동안 400 × g 에서 PBS로 세 번 세척하였다. 이후, 세포 펠릿을 탭핑(tapping)하여 재부유시킨 다음, NK 세포 배양 배지를 추가하여 trypan blue exclusion method를 통해 세포 수를 카운트하였다.

실시예 2. 분리된 말초혈액단핵구(PBMCs) 및 OX40L 발현 K562(K562-OX40L)를 이용한 NK 세포의 배양을 통한 NK 세포의 순도 및 증폭률 확인

본 발명에 따라 상기 실시예 1로부터 준비한 말초혈액단핵구(PBMCs) 및 OX40L 발현 K562(K562-OX40L) 세포주를 이용하여 NK 세포의 증폭을 수행하였으며, 실험디자인은 도 1에 나타낸 바와 같다. 보다 구체적으로, 3 × 10⁶ 개의 말초혈액단핵구 및 0.5 × 10⁶ 개의 방사선 100 Gy가 조사된 K562-OX40L 세포주를 1 ㎖ NK 세포 배지가 포함된 24 웰 플레이트 상에 접종한 다음, 20 U/㎖ IL-2가 함유된 1 ㎖ NK 세포 배지를 추가하여 총 배지 부피는 2 ㎖/well, IL-2의 최종 농도는 10 U/㎖로 만든 뒤, 부드럽게 피펫팅(pipetting) 하여 혼합시킨 후, 37 ℃, 5 % CO₂ 조건의 배양기에서 배양하였다.

상기 방법으로 만들어진 K562-OX40L 세포주가 제대로 OX40L를 발현하는지 확인하기 위해, RT-PCR실험을 수행하였다. 그 결과, 도 2a에서 나타낸 바와 같이 K562-OX40L 세포주에서 OX40L mRNA의 발현을 확인하였다. 또한, 도 2b에서 나타낸 바와 같이 K562-OX40L 세포주에서 발현된 OX40L mRNA의 양을 확인하였다.

① 배양 3일 및 5일 째: 배지의 절반을 제거하고 새로운 IL-2를 함유하는 1 ㎖의 새로운 배지를 추가하여 2 ㎖ 최종 부피에 대해 IL-2가 10 U/㎖가 되도록 만들었다.

② 배양 7일 째: 배지에 포함된 세포의 수를 카운트하였다. 이 때, 하나의 웰에 세포를 500 μℓ씩 나누고 여기에 방사선 100 Gy가 조사된 K562-OX40L 0.5 × 10⁶개를 첨가하여 재접종을 한 후, 총 배지 부피를 2 ㎖/well, IL-2의 농도를 100 U/㎖로 증가시키고, 추가적으로 5 ng/㎖의 IL-15를 배지에 첨가하였다.

한편, 이 방법에서 NK 세포는 전체 21일 중 0, 7, 14일 째에만 K562-OX40L 세포로 총 세 번 자극시켰으며, 매주 FITC-anti-human CD3 및 PE-Cy5 anti-human CD56 모노클로날 항체를 사용하여 NK 세포의 순도 및 증폭률(Fold expansion)을 평가하였다.

③ 배양 10일 및 12일 째: 배지의 절반을 제거하고, 200 U/㎖의 IL-2 및 10 ng/㎖의 IL-15가 함유된 1 ㎖의 새로운 배지를 추가하여, 총 2 ㎖의 배지 내 농도가 100 U/㎖의 IL-2 및 5 ng/㎖의 IL-15가 되도록 하였다.

④ 배양 14일 째: 배양 14일 째에는 2주 동안 배양된 세포의 수를 카운트했으며, 7일 째와 마찬가지로, 다시 한번 세포를 하나의 웰 당 500 μℓ씩 나누고 여기에 0.5 × 10⁶개의 방사선 100 Gy가 조사된 K562-OX40L 첨가하여 재접종을 한 후, 총 배지 부피를 2 ㎖/well, IL-2의 농도를 100 U/㎖로, 5 ng/㎖의 IL-15를 배지에 첨가하였다. 전술한 바와 같이, FITC-anti-human CD3 및 PE-Cy5 anti-human CD56 모노클로날 항체를 사용하여 NK 세포의 순도 및 증폭률을 평가하였다.

또한, NK 세포의 기능을 평가하기 위해, NK 세포의 독성(cytotoxicity), ADCC(antibody dependent cellular cytotoxicity), 세포 아형 검사를 실시하였다. 보다 구체적으로, 세포독성 및 ADCC의 경우 K562 세포주와 리툭시맙(Retuximab) 항체가 코팅된 Raji 세포를 CFSE를 통해 염색하고 두 번의 세척 과정 후, 증폭된 NK 세포와 2:1, 1:1, 0.5:1의 비율로 4시간 동안 공조 배양하였다. 그 다음, Propidium iodide(PI)로 염색하여 유세포분석법으로 죽은 K562 세포, Raji 세포의 비율을 조사하였다.

NK 세포의 아형 검사의 경우, 튜브 두 개에 각각 하기 표 1의 단클론성 항체를 넣고 빛이 차단된 공간에서 15분 동안 실온으로 항온한 후 세척 과정을 거쳐 유세포 분석기로 분석하였다.

⑤ 배양 17일 및 19일 째: 배지의 절반을 제거하고, 200 U/㎖의 IL-2 및 10 ng/㎖의 IL-15가 함유된 1 ㎖의 새로운 배지를 추가하였다.

⑥ 배양 21일 째: trypan blue exclusion method을 통해서, NK 세포 수를 카운트하고, FITC-anti-human CD3 및 PE-Cy5 anti-human CD56 모노클로날 항체를 사용하여 증폭된 NK 세포의 순도를 확인하였으며, 이 때, NK 세포 수는 총 말초혈액단핵구와 NK 세포의 분포의 비율을 곱하여 'NK 세포의 순도(purity)'를 산정하였다.

⑦ 배양 23일 및 24일 째: 배지의 절반을 제거하고, 200 U/㎖의 IL-2 및 10 ng/㎖의 IL-15가 함유된 1 ㎖의 새로운 배지를 추가하였다.

⑧ 배양 25 및 26 일 째: 배지의 절반을 제거하고, 200 U/㎖의 IL-2 및 10 ng/㎖의 IL-15가 함유된 1 ㎖의 새로운 배지를 추가하였다.

⑨ 배양 28일 째: trypan blue exclusion method를 통해서, NK 세포 수를 카운트하고, FITC-anti-human CD3 및 PE-Cy5 anti-human CD56 모노클로날 항체를 사용하여 증폭된 NK 세포의 순도를 확인 후 남은 세포는 얼려서 보관해 두었다.

도 3a 및 도 3b에서 나타낸 바와 같이, 확보된 NK 세포의 순도 및 증폭률은 대조군에 비해 2.5 배 내지 3 배 정도 높았으며, 높은 순도를 나타내는 것을 확인할 수 있었다.

또한, 상기 배양방법으로 배양한 결과, 도 4a 및 도 4b에서 나타낸 바와 같이 K562-OX40L 세포주와 말초혈액단핵구를 공배양하여 얻어진 NK 세포의 순도 및 증폭률은 일관되게 K562 세포주와 말초혈액단핵구를 공배양하여 얻어진 NK 세포의 순도 및 증폭률보다 유의하게 높음을 확인하였다.

한편, 도 5a 및 도 5b에서 나타낸 바와 같이, K562 세포주와 말초혈액단핵구를 공배양하여 얻은 NK 세포의 세포독성 및 ADCC의 측정값과 K562-OX40L 세포주와 말초혈액단핵구를 공배양하여 얻은 NK 세포의 세포독성 및 ADCC의 측정값은 유의한 차이가 없음을 확인하였다.

또한, 도 6에서 나타낸 바와 같이, K562 세포주와 말초혈액단핵구를 공배양하여 얻은 NK 세포의 세포 표면 수용체의 발현 결과와 K562-OX40L 세포주와 말초혈액단핵구를 공배양하여 얻은 NK 세포의 세포 표면 수용체의 발현 결과는 유의한 차이가 없음을 확인하였다.

상기 결과를 종합하여 보면, K562-OX40L 세포주를 배양보조세포로 하고, IL-2 및 IL-15를 첨가하여 말초혈액단핵구 세포와 공배양시킨 경우, NK 세포가 높은 순도로 증폭되는 것을 확인할 수 있었다. 또한, 상기 공배양으로 얻어진 NK 세포는 일반적인 배양보조세포주인 K562에 의해 얻어진 NK 세포와 기능에 있어 차이가 없음을 확인할 수 있었다.

실시예 3. 분리된 말초혈액단핵구 (PBMCs) 및 IL-21, K562-OX40L를 이용한 NK 세포의 배양을 통한 NK 세포 증폭률 및 기능 확인

본 발명에 따라 상기 실시예 1로부터 준비한 말초혈액단핵구 및 K562-OX40L 세포주를 이용하여 NK 세포의 증폭을 수행하였다. 전체적인 실험 방법은 실시예 2와 같지만 처음 말초혈액단핵구와 K562-OX40L 배양 시 다양한 농도의 IL-21을 '한 번만' 첨가한다는 점에서 차이가 있다. 보다 구체적으로, 3 × 10⁶ 개의 PBMC 및 방사선 100 Gy가 조사된 K562-OX40L 0.5 × 10⁶개를 1 ㎖ NK 세포 배지가 포함된 24 웰 플레이트 상에 접종한 다음, 20 U/㎖ IL-2가 함유된 1 ㎖ NK 세포 배지를 추가하여 총 배지 부피는 2 ㎖/well, IL-2의 최종 농도는 10 U/㎖로 한 뒤, 여기에 5, 50, 100 ng/㎖의 IL-21을 각각 다른 다른 웰에 첨가한 후, 부드럽게 피펫팅(pipetting) 하여 혼합한 후 37 ℃5 % CO₂배양기에서 배양하였다.

배양 7, 14, 21, 28, 35일 째에 NK 세포 수를 카운트하고, NK 세포의 순도를 확인하여 처음 NK세포에 비해 증폭된 정도를 나타내는 증폭률을 산출하였다.

배양 21일 째: trypan blue exclusion method을 통해서, NK 세포 수를 카운트하고, FITC-anti-human CD3 및 PE-Cy5 anti-human CD56 모노클로날 항체를 사용하여 증폭된 NK 세포의 순도를 확인하였으며, 이 때, NK 세포 수는 총 PBMC와 NK 세포의 분포의 비율을 곱하여 'NK 세포의 순도'를 산정하였다.

상기 배양방법으로 배양한 결과, 도 7a 내지 도 7d에서 나타낸 바와 같이 말초혈액단핵구를 K562 세포주와 공배양하는 경우에는 IL-20(5, 50, 100 ng/㎖)에 노출되더라도 NK 세포가 크게 증폭되지 않았으나, K562-OX40L 세포주와 공배양하는 경우에는 IL-20(5, 50, 100 ng/㎖)에 노출되면 NK 세포가 크게 증폭되는 것을 확인하였다.

또한, NK 세포의 기능을 평가하기 위해, NK 세포의 세포독성, ADCC, 세포 아형 검사, 탈과립(degranulation) 마커인 CD107a, IFN-g, TNF-α 분비능, 텔로미어 길이(Telemere length)를 분석하였다. 보다 구체적으로, 탈과립 마커인 CD107a, IFN-g, TNF-α 측정은 0.5 × 10⁶개의 증폭된 NK 세포와 0.5 × 10⁶개의 K562 세포를 배양 후 1시간 후에 brefeldin A와 monensin을 첨가하여 세포 외로 단백질을 이동을 막은 후, 4시간 후에 PE anti-human CD107a와 FITC-anti-human CD3 및 PE-Cy5 anti-human CD56 모노클로날 항체를 이용하여 CD107a의 발현 정도를 확인하였으며, IFN-g 와 TNF-α는 FITC-anti-human CD3 및 PE-Cy5 anti-human CD56 모노클로날 항체로 염색한 후 세척, 고정, 투과 과정 후 PE anti-human IFN-g 과 APC mouse anti-human TNF-α를 30분 동안 염색한 후 유세포 분석기로 확인하였다. 또한, 텔로미어 길이(Telemere length)는 21일 동안 증폭된 NK 세포를 대상으로 Telemere PNA kit/FITC를 이용하여 상대적인 텔로미어 길이를 확인하였다.

그 결과, 도 8a 및 도 8b에서 나타낸 바와 같이, 다양한 농도의 IL-21(0, 50, 100 ng/㎖)과 E:T 비율(2:1, 1:1, 0.5:1)에서, K562-OX40L 세포주와 말초혈액단핵구를 공배양하여 얻어진 NK 세포의 세포독성 및 ADCC의 측정값과 IL-21의 첨가없이 K562 세포주와 말초혈액단핵구를 공배양하여 얻어진 NK 세포의 세포독성 및 ADCC의 측정값은 유의한 차이가 없음을 확인하였다.

또한, 도 9a 내지 도 9d에서 나타낸 바와 같이, 『IL-21의 첨가없이 K562 세포주를 배양보조세포』로 하여 말초혈액단핵구와 공배양하여 얻어진 NK 세포의 CD107a, TNF-α, IFN-γ의 발현비 및 텔로미어 길이 증가비와 『IL-21을 배양 초기에 한번만 첨가하고 OX40L-K562 세포주를 배양보조세포』로 하여 말초혈액단핵구와 공배양하여 얻어진 NK 세포의 CD107a, TNF-α, IFN-γ의 발현비 및 텔로미어 길이 증가비는 유의한 차이가 없음을 확인하였다.

상기 결과를 종합하여 보면, K562-OX40L을 배양보조세포로 하고 IL-21이 한번 첨가되어 말초혈액단핵구와 공배양하여 얻어진 NK 세포는, K562를 배양보조세포로 하고 IL-21이 한번 첨가되어 말초혈액단핵구와 공배양하여 얻어진 NK 세포에 비해 높은 순도 및 증폭률을 가지는 것을 확인할 수 있었다. 또한, 상기 공배양으로 얻어진 NK 세포는 IL-21의 첨가 없이 K562 세포주와 공배양하여 얻어진 NK 세포와 기능면에서 차이가 없음을 확인하였다.

전술한 본 발명의 설명은 예시를 위한 것이며, 본 발명이 속하는 기술분야의 통상의 지식을 가진 자는 본 발명의 기술적 사상이나 필수적인 특징을 변경하지 않고서 다른 구체적인 형태로 쉽게 변형이 가능하다는 것을 이해할 수 있을 것이다. 그러므로 이상에서 기술한 실시예들은 모든 면에서 예시적인 것이며 한정적이 아닌 것으로 이해해야만 한다.

<110> SAMSUNG LIFE PUBLIC WELFARE FOUNDATION <120> Feeder cells expressing OX40L and natural killer cell culture <130> PD17-112-P1 <150> KR 10-2018-0061385 <151> 2018-05-29 <160> 1 <170> KoPatentIn 3.0 <210> 1 <211> 552 <212> DNA <213> OX40L <400> 1 atggaaaggg tccaacccct ggaagagaat gtgggaaatg cagccaggcc aagattcgag 60 aggaacaagc tattgctggt ggcctctgta attcagggac tggggctgct cctgtgcttc 120 acctacatct gcctgcactt ctctgctctt caggtatcac atcggtatcc tcgaattcaa 180 agtatcaaag tacaatttac cgaatataag aaggagaaag gtttcatcct cacttcccaa 240 aaggaggatg aaatcatgaa ggtgcagaac aactcagtca tcatcaactg tgatgggttt 300 tatctcatct ccctgaaggg ctacttctcc caggaagtca acattagcct tcattaccag 360 aaggatgagg agcccctctt ccaactgaag aaggtcaggt ctgtcaactc cttgatggtg 420 gcctctctga cttacaaaga caaagtctac ttgaatgtga ccactgacaa tacctccctg 480 gatgacttcc atgtgaatgg cggagaactg attcttatcc atcaaaatcc tggtgaattc 540 tgtgtccttt ga 552

Claims

OX40L(CD134 ligand)을 발현하는 배양보조세포(feeder cells)를 유효성분으로 포함하는, NK 세포 배양용 조성물.
제1항에 있어서,
상기 배양보조세포는 K562 세포인 것을 특징으로 하는, 조성물.
제1항에 있어서,
상기 OX40L을 발현하는 배양보조세포는 OX40L 유전자가 삽입된 발현 벡터로 형질 전환된 것을 특징으로 하는, 조성물.
제3항에 있어서,
상기 OX40L 유전자는 서열번호 1로 표시되는 염기서열로 이루어진 것을 특징으로 하는, 조성물.
제3항에 있어서,
상기 발현 벡터는 플라스미드 벡터, 코스미드 벡터, 박테리오파지 벡터 및 바이러스 벡터로 이루어진 군으로부터 선택되는 것을 특징으로 하는, 조성물.
제5항에 있어서,
상기 바이러스 벡터는 렌티바이러스(lentivirus) 또는 레트로바이러스(retrovirus) 벡터인 것을 특징으로 하는, 조성물.
하기 단계를 포함하는 자연살해세포 배양 방법:
(a) 말초혈액으로부터 말초혈액단핵구(Peripheral blood mononuclear cell, PBMC)를 수득하는 단계; 및
(b) 상기 수득한 말초혈액단핵구와 OX40L을 발현하는 배양보조세포(feeder cells)를 사이토카인을 함유하는 배지에서 공배양하는 단계.
제7항에 있어서,
상기 사이토카인은 IL-2, IL-15, IL-21, Flt3-L, IL-7, IL-12 및 IL-18로 이루어진 군으로부터 선택되는 1 종 이상인 것을 특징으로 하는, 방법.
제7항에 있어서,
상기 OX40L을 발현하는 배양보조세포(feeder cells)는 50 Gy 내지 300 Gy 방사선을 처리하여 수득된 것을 특징으로 하는, 방법.
제7항에 있어서,
상기 공배양은 2 일 내지 30 일 동안 수행되는 것을 특징으로 하는, 방법.
OX40L 유전자로 형질 전환된, NK 세포 배양보조세포주.
제11항에 있어서,
상기 OX40L 유전자는 서열번호 1로 표시되는 염기서열로 이루어진 것을 특징으로 하는, 세포주.
제11항에 있어서,
상기 배양보조세포주는 K562 세포주인 것을 특징으로 하는, 세포주.
제11항에 있어서,
상기 형질 전환은 OX40L 유전자가 삽입된 발현 벡터를 통해 이루어지는 것을 특징으로 하는, 세포주.
제14항에 있어서,
상기 발현 벡터는 플라스미드 벡터, 코스미드 벡터, 박테리오파지 벡터 및 바이러스 벡터로 이루어진 군으로부터 선택되는 것을 특징으로 하는, 세포주.
제15항에 있어서,
상기 바이러스 벡터는 렌티바이러스(lentivirus) 또는 레트로바이러스(retrovirus) 벡터인 것을 특징으로 하는, 세포주.