CN114214286A - 一种用于高效扩增nk细胞的k562-ox40l细胞系的制备方法 - Google Patents

一种用于高效扩增nk细胞的k562-ox40l细胞系的制备方法 Download PDF

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张文桦
田静
彭家伟
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刘泽熙
陈晓敏
崔明青
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Abstract

本发明属于生物医药领域，提供了一种K562‑OX40L（OX40‑配体）细胞系的制备方法及其应用。所述的制备方法包括：OX40L慢病毒表达质粒的构建、包装和收集；将OX40L慢病毒表达质粒和转染试剂加入K562悬浮细胞中孵育，以实现OX40L慢病毒表达质粒转染K562细胞；转染2‑6小时后加入不含转染试剂的培养基，继续培养转染后的K562悬浮细胞；获得稳定表达OX40L的K562细胞株。本发明还涉及将K562‑OX40L用于扩增NK细胞及相应的细胞检测、鉴定方法。本发明制备的K562‑OX40L细胞能够获得足够数量的活化NK细胞，不仅操作简便，而且能够高效、安全的扩增NK细胞。

Description

一种用于高效扩增NK细胞的K562-OX40L细胞系的制备方法
技术领域
本发明属于生物医药领域，涉及一种用于高效扩增NK细胞的方法。具体而言，本发明涉及一种K562-OX40L（OX40-配体）细胞系的制备方法及其应用。
背景技术
免疫疗法是利用个体免疫系统治疗其疾病的一种方法，指针对机体非正常的免疫状态、人为的改变免疫功能达到治疗疾病目的的治疗方法，可以分为主动免疫和被动免疫两大类。免疫疗法在肿瘤的发生发展过程中有很重要的作用，不仅可以预防癌症的发生，还可以通过增强机体的免疫力而缓解甚至治疗癌症。自然杀伤(NK)细胞的过继转移是癌症免疫治疗的一种有前景的辅助方法，因此获得足够数量的活化NK细胞对于有效的基于NK细胞的免疫治疗很重要。
几种可溶性细胞因子（例如IL-2和IL-15）已被用于扩增 NK细胞，但单独使用IL-2或与IL-15 联合使用会导致NK细胞扩增最小。其他辅助因子或刺激物（即饲养细胞）大大增强了NK细胞的体外扩增。与单独使用IL-2相比，当同时使用K562细胞和IL-2时，NK细胞的扩增倍数更高。最近，使用基因工程(GE)的K562细胞表达细胞因子和共刺激因子，如膜结合(mb)IL-15、mbIL-21和4-1BB配体，实现了NK细胞的显着激活和扩增。但是，通过表达共刺激因子的基因工程饲养细胞与NK细胞之间的相互作用、NK细胞扩增的机制均不明了，通过表达共刺激因子的GE饲养细胞与NK细胞之间的相互作用存在一些盲目性和随机性。无论是IL-2抑或IL-15这些可溶性细胞因子加入细胞培养环境会同时产生很多其他效应，具体在何种情况下会产生哪些副作用尚不可知。
因此，研究者们仍在不断寻找其他用于NK细胞活化和扩增的新型的更小、更加安全和方便操作的共刺激因子。
发明内容
本发明要解决的技术问题是提供一种被修饰的K562细胞的制备方法。
本发明再一目的在于提供K562-OX40L细胞。
本发明的又一目的在于，提供K562-OX40L的培养方法，获得较好的NK细胞扩增的效率和能力。
基于目前已有的研究，本发明以OX40L（OX40-配体）作为一种新的促进人类NK细胞扩增的共刺激因子。采用生物工程的方法将OX40L在K562细胞中过表达，构建了K562-OX40L的工程细胞系，并且检测了K562-OX40L工程化细胞在NK细胞的扩增和激活方面的能力。本发明研制了一种将OX40L作为一种新的促进人类NK细胞扩增的共刺激因子的扩增方法。本发明中我们研制了一种K562-OX40L的细胞系，K562-OX40L具有扩增NK细胞扩增的效率和能力，同时评估了扩增后获得的NK细胞的活性和能力。本发明在上述研究基础上完成。
本发明提供了一种被修饰的K562细胞的制备方法，所述的被修饰的K562细胞是过表达OX40L的K562细胞，在本发明中称为K562-OX40L细胞。
所述被修饰的K562细胞的制备方法包括以下步骤：
OX40L慢病毒表达质粒的构建、包装和收集；
将OX40L慢病毒表达质粒和转染试剂加入K562悬浮细胞中，孵育以实现OX40L慢病毒表达质粒转染K562细胞；
转染2-6小时后加入不含转染试剂的培养基，继续培养转染后的K562悬浮细胞；
获得稳定表达OX40L 的K562细胞株。
本发明中，OX40L的氨基酸序列可以从NCBI网站的数据库中获得。在本发明的一个优选例中，OX40L的氨基酸序列如下：
MCVGARRLGRGPCAALLLLGLGLSTVTGLHCVGDTYPSNDRCCHECRPGNGMVSRCSRSQNTVCRPCGPGFYNDVVSSKPCKPCTWCNLRSGSERKQLCTATQDTVCRCRAGTQPLDSYKPGVDCAPCPPGHFSPGDNQACKPWTNCTLAGKHTLQPASNSSDAICEDRDPPATQPQETQGPPARPITVQPTEAWPRTSQGPSTRPVEVPGGRAVAAILGLGLVLGLLGPLAILLALYLLRRDQRLPPDAHKPPGGGSFRTPIQEEQADAHSTLAKI（SEQ ID NO 1）。
较好的，OX40L慢病毒表达质粒的构建方法包括：
根据OX40L的氨基酸编码序列制备或者合成OX40L核酸分子，构建入表达质粒；和/或
通过病毒的包装和收集获得含有pLVTHM-OX40L病毒的上清液；
过滤含有pLVTHM-OX40L病毒的上清液，获得pLVTHM-OX40L病毒表达质粒。
本发明中，OX40L核酸分子经过表达获得OX40L的多肽（氨基酸）序列可以采用本领域的常规基因表达方法，或者根据核酸和氨基酸序列人工或者半人工合成。
较好的，转染过程中以较低离心速度120-200g在15-28℃条件下离心3-4小时。该步骤可以用于部分转染困难的细胞，以增加转染效率。较好的，离心速度是150g-180g，例如160g或者170g，具体的离心转速可以根据离心机和实际情况调整。较好的，离心的温度可以采用18-26℃，更好的采用20-25℃。例如，采用室温或者21℃、22℃、23℃、24℃，等等。
本发明的细胞转染过程中可以采用常见的细胞转染试剂，例如在本发明的一个优选例中，转染试剂是polybrene。
相应的，本发明提供了一种被修饰的K562细胞，所述的被修饰的K562细胞是过表达OX40L的K562细胞；或者使用上述制备方法获得。
另一方面，本发明还提供了上述制备方法的应用，所述的过表达OX40L的K562细胞用于扩增NK细胞。
本发明提供了一种NK细胞扩增的方法：使用过表达OX40L的K562细胞与NK细胞共培养；或者将K562-OX40L细胞与含有NK细胞的培养液共培养1-4周。较好的，共培养的时间为2-3周，视原始培养液中NK细胞的数量和NK细胞的状态而调整。例如，可以培养7天、8天、10天、12天、14天以获得较好细胞状态的大量纯的NK细胞。
较好的，过表达OX40L的K562细胞或K562-OX40L细胞可以与外周血中分离的PBMC共培养，以快速的获得大量的NK细胞。
本发明中，PBMC是指外周血单个核细胞。
再一方面，本发明还提供了一种NK细胞的检测方法，收集上述共培养获得的NK细胞，观察NK细胞的形态、鉴定NK细胞、计算NK细胞的数量，或者检测所得细胞培养物中的CD3-、CD16+、CD56+以确定NK细胞的纯度、活性或者质量。
较好的，可以使用流式细胞仪进行NK细胞的检测和鉴定。
本发明首次将OX40L作为一种促进人类NK细胞扩增的共刺激因子。本发明研制了一种K562-OX40L的细胞系，并且评估了K562-OX40L扩增NK细胞扩增的效率和能力。自然杀伤(NK)细胞的过继转移是癌症免疫治疗的一种有前景的辅助方法，本发明制备的K562-OX40L细胞能够获得足够数量的活化NK细胞，不仅操作简便，而且能够高效扩增NK细胞，可以为癌症的免疫治疗提供了大量符合要求的NK细胞。相比于使用白介素类共刺激因子，本发明的OX40L对机体的损伤相对小而安全。
附图说明
为了更清楚地说明本申请实施例中的技术方案，下面将对实施例中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本申请的一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。
图1是流式检测OX40L在K562细胞表面的表达情况图，其中，OX40L在 K562细胞表面的表达的阳性率90%以上；
图2是K562-OX40L 细胞与PBMC细胞共培养4周对NK细胞的扩增纯度和扩增效率的检测结果图；
图3是第14天K562-OX40L扩增获得的NK细胞的特征图。
具体实施方式
下面将对本申请实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本申请一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本申请中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本申请保护的范围。
实施例1.
一种OX40L慢病毒表达质粒的构建、包装和收集：
从NCBI的数据库中获取OX40L的核酸和氨基酸序列，采用全基因合成的方法合成OX40L分子，然后将获得的OX40L分子通过双酶切的方法构建入pLVTHM质粒，使用293细胞进行病毒的包装和收集，获得pLVTHM-OX40L病毒上清液，过滤后备用。
OX40L氨基酸序列如下：MCVGARRLGRGPCAALLLLGLGLSTVTGLHCVGDTYPSNDRCCHECRPGNGMVSRCSRSQNTVCRPCGPGFYNDVVSSKPCKPCTWCNLRSGSERKQLCTATQDTVCRCRAGTQPLDSYKPGVDCAPCPPGHFSPGDNQACKPWTNCTLAGKHTLQPASNSSDAICEDRDPPATQPQETQGPPARPITVQPTEAWPRTSQGPSTRPVEVPGGRAVAAILGLGLVLGLLGPLAILLALYLLRRDQRLPPDAHKPPGGGSFRTPIQEEQADAHSTLAKI（SEQ ID NO 1）。
实施例2.
K562细胞的培养的转染和鉴定：
（1）在2×105/mlK562悬浮细胞中加入polybrene至6 μg/ml和适量病毒，充分混匀，37℃孵育，对于部分难转染的细胞系可以150g室温离心4小时以提高转染效率；
（2）4小时后加入等体积新鲜培养基以稀释polybrene；
（3）继续培养3-4天，中间视细胞生长情况可传代或换液；
（4）获得稳定表达OX40L-K562细胞株；
（5）用流式细胞仪分析OX40L在 K562细胞表面的表达情况。
如图1所示，OX40L在 K562细胞表面的表达的阳性率90%以上。
实施例3.
K562-OX40L饲养细胞提高了PBMC中NK细胞的扩增：
将K562细胞和K562-OX40L分别与外周血中分离的PBMC共培养1-4周后，利用流式的方法检测CD3-、CD16+、CD56+确定PBMC中NK细胞的纯度。
我们比较了用 K562或K562-OX40L饲养细胞培养后NK细胞的纯度和扩增倍数。在培养 2周后与K562-OX40L细胞一起生长时，观察到扩增NK细胞的纯度增加，如图 2A所示；与 K562-OX40L细胞一起培养的NK细胞在培养3至4周后的倍数扩增显著高于与K562细胞一同培养的NK细胞，如图 2B所示；K562组的中位数（范围）为235 (125.8–594.6)、303 (66.7–1261.3)；K562-OX40L组分别为486.3 (261.4–1096.7)、1013.5 (578.9-2959.5)。
实施例4
K562-OX40L扩增获得的NK细胞的特征：
使用K562或K562-OX40L细胞扩增的NK细胞的细胞毒性，第14天扩增的NK细胞之间没有发现显着差异使用不同E:T比率的K562或K562-OX40L细胞（图3A）和 ADCC（图3B）。图3A和图3B（ADCC）显示了扩增NK细胞在第14天的直接细胞毒性。扩增的NK细胞之间没有发现显着差异使用不同E:T比率的K562或K562-OX40L细胞。
同时分析了在第7天和第14天用K562或K562-OX40L饲养细胞扩增的NK细胞各种表面受体（CD16、NKG2A、NKG2C、CD57、CD8a、NKp30、NKp46、CD62L、NKG2D和DNAM-1）的差异（图3C）。第14天对K562-OX40L扩增获得的NK细胞的细胞杀伤活性和CK562-OX40L扩增获得的NK细胞的表面分子标志物进行检测，结果表明，K562-OX40L对NK细胞表面的分子标志物没有影响。
以上所述，仅为本申请的具体实施方式，但本申请的保护范围并不局限于此，任何熟悉本领域技术的技术人员在本申请公开的技术范围内，可轻易想到的变化或替换，都应涵盖在本申请的保护范围之内。因此，本申请的保护范围应以所述权利要求的保护范围为准。
SEQUENCE LISTING
<110> 上海纳米技术及应用国家工程研究中心有限公司
<120> 一种用于高效扩增NK细胞的K562-OX40L细胞系的制备方法
<130> 20211126
<160> 1
<170> PatentIn version 3.5
<210> 1
<211> 277
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> 人工序列
<400> 1
Met Cys Val Gly Ala Arg Arg Leu Gly Arg Gly Pro Cys Ala Ala Leu
1 5 10 15
Leu Leu Leu Gly Leu Gly Leu Ser Thr Val Thr Gly Leu His Cys Val
20 25 30
Gly Asp Thr Tyr Pro Ser Asn Asp Arg Cys Cys His Glu Cys Arg Pro
35 40 45
Gly Asn Gly Met Val Ser Arg Cys Ser Arg Ser Gln Asn Thr Val Cys
50 55 60
Arg Pro Cys Gly Pro Gly Phe Tyr Asn Asp Val Val Ser Ser Lys Pro
65 70 75 80
Cys Lys Pro Cys Thr Trp Cys Asn Leu Arg Ser Gly Ser Glu Arg Lys
85 90 95
Gln Leu Cys Thr Ala Thr Gln Asp Thr Val Cys Arg Cys Arg Ala Gly
100 105 110
Thr Gln Pro Leu Asp Ser Tyr Lys Pro Gly Val Asp Cys Ala Pro Cys
115 120 125
Pro Pro Gly His Phe Ser Pro Gly Asp Asn Gln Ala Cys Lys Pro Trp
130 135 140
Thr Asn Cys Thr Leu Ala Gly Lys His Thr Leu Gln Pro Ala Ser Asn
145 150 155 160
Ser Ser Asp Ala Ile Cys Glu Asp Arg Asp Pro Pro Ala Thr Gln Pro
165 170 175
Gln Glu Thr Gln Gly Pro Pro Ala Arg Pro Ile Thr Val Gln Pro Thr
180 185 190
Glu Ala Trp Pro Arg Thr Ser Gln Gly Pro Ser Thr Arg Pro Val Glu
195 200 205
Val Pro Gly Gly Arg Ala Val Ala Ala Ile Leu Gly Leu Gly Leu Val
210 215 220
Leu Gly Leu Leu Gly Pro Leu Ala Ile Leu Leu Ala Leu Tyr Leu Leu
225 230 235 240
Arg Arg Asp Gln Arg Leu Pro Pro Asp Ala His Lys Pro Pro Gly Gly
245 250 255
Gly Ser Phe Arg Thr Pro Ile Gln Glu Glu Gln Ala Asp Ala His Ser
260 265 270
Thr Leu Ala Lys Ile
275

Claims (11)

1.一种被修饰的K562细胞的制备方法，其特征在于，所述的被修饰的K562细胞是过表达OX40L的K562细胞，称为K562-OX40L细胞；包括以下制备步骤：
（1）OX40L慢病毒表达质粒的构建、包装和收集；
（2）将OX40L慢病毒表达质粒和转染试剂加入K562悬浮细胞中，孵育以实现OX40L慢病毒表达质粒转染K562细胞；
（3）转染2-6小时后加入不含转染试剂的培养基，继续培养转染后的K562悬浮细胞；
（4）获得稳定表达OX40L 的K562细胞株。
2.根据权利要求1所述的被修饰的K562细胞的制备方法，其特征在于，
OX40L的氨基酸序列如下：MCVGARRLGRGPCAALLLLGLGLSTVTGLHCVGDTYPSNDRCCHECRPGNGMVSRCSRSQNTVCRPCGPGFYNDVVSSKPCKPCTWCNLRSGSERKQLCTATQDTVCRCRAGTQPLDSYKPGVDCAPCPPGHFSPGDNQACKPWTNCTLAGKHTLQPASNSSDAICEDRDPPATQPQETQGPPARPITVQPTEAWPRTSQGPSTRPVEVPGGRAVAAILGLGLVLGLLGPLAILLALYLLRRDQRLPPDAHKPPGGGSFRTPIQEEQADAHSTLAKI。
3.根据权利要求1所述的被修饰的K562细胞的制备方法，其特征在于，OX40L慢病毒表达质粒的构建方法包括：
根据OX40L的氨基酸编码序列制备或者合成OX40L核酸分子，构建入表达质粒；和/或
通过病毒的包装和收集获得含有pLVTHM-OX40L病毒的上清液；
过滤含有pLVTHM-OX40L病毒的上清液，获得pLVTHM-OX40L病毒表达质粒。
4.根据权利要求1所述的被修饰的K562细胞的制备方法，其特征在于，转染过程中以120-200g的离心速度在15-28℃条件下离心3-4小时。
5.根据权利要求4所述的被修饰的K562细胞的制备方法，其特征在于，离心速度是150g-180g。
6.根据权利要求1所述的被修饰的K562细胞的制备方法，其特征在于，所述的转染试剂是polybrene。
7.一种被修饰的K562细胞，其特征在于，
所述的被修饰的K562细胞是过表达OX40L的K562细胞；或者
所述的被修饰的K562细胞通过权利要求1-6中任意一种制备方法获得。
8.一种根据权利要求7被修饰的K562细胞的应用，其特征在于，所述的过表达OX40L的K562细胞用于扩增NK细胞。
9.一种NK细胞扩增的方法，其特征在于，使用过表达OX40L的K562细胞与NK细胞共培养；或者
将K562-OX40L细胞与含有NK细胞的培养液共培养1-4周。
10.根据权利要求9所述的NK细胞扩增的方法，其特征在于，过表达OX40L的K562细胞或K562-OX40L细胞与外周血中分离的PBMC共培养，以快速的获得大量的NK细胞。
11.一种NK细胞的检测方法，其特征在于，收集权利要求9所述的方法获得的NK细胞，观察NK细胞的形态、鉴定NK细胞的特征、计算NK细胞的数量，或者检测所得细胞培养物中的CD3-、CD16+、CD56+以确定NK细胞的纯度、活性或者质量。
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