CN114213527B

CN114213527B - 一种t细胞受体及其应用

Info

Publication number: CN114213527B
Application number: CN202111390174.XA
Authority: CN
Inventors: 李亮平; 李清扬
Original assignee: Tesai Immunization Guangzhou Technology Co ltd
Current assignee: Tesai Immunization Guangzhou Technology Co ltd
Priority date: 2021-11-22
Filing date: 2021-11-22
Publication date: 2023-09-01
Anticipated expiration: 2041-11-22
Also published as: CN114213527A

Abstract

本发明公开了一种T细胞受体(T cell receptor，TCR)及其应用，该TCR能够与CT83抗原短肽CT83_14‑22/HLA‑A*11：01复合物特异性结合；转导了本发明TCR的T细胞能够被表达CT83_14‑22/HLA‑A*11：01复合物的树突状细胞特异性激活，并且对CT83和HLA‑A*11：01阳性的靶细胞(如癌细胞)产生强有力的杀伤作用；该发明为CT83癌症睾丸抗原相关性疾病的TCR‑T细胞免疫治疗提供了一个新的途径。

Description

一种T细胞受体及其应用

技术领域

本发明涉及免疫治疗技术领域，具体地，涉及一种T细胞受体(TCR)及其应用。

背景技术

睾丸抗原83(CT83)作为一种内源性蛋白质，在各种恶性肿瘤细胞均有高表达，属于癌症睾丸抗原类。CT83在细胞内生成后被降解成长短不一的小分子短肽，其中能够与HLA分子结合的短肽，与之形成复合物，被转运呈递到细胞表面。CT83最早是由Fukuyama等人于2006年发现的[FUKUYAMA T,HANAGIRI T,TAKENOYAMA M,et al.Identification of a newcancer/germLine gene,CT83,encoding an antigen recognized by autologous CTLinduced on human lung adenocarcinoma.Cancer research,2006,66(9)：4922-8.]；以后陆续有研究表明CT83在81％胃癌[Shida A,Futawatari N,Fukuyama T,et al.FrequentHigh Expression of Kita-Kyushu Lung Cancer Antigen-1(KK-LC-1)in GastricCancer.Anticancer Res.2015；35(6)：3575-3579.]，53％三阴性乳腺癌[Paret C,SimonP,Vormbrock K,et al.CXorf61 is a target for T cell based immunotherapy oftriple-negative breast cancer.Oncotarget.2015；6(28)：25356-25367.]，40％转移性宫颈癌和40％非小细胞肺癌[S,Pasetto A,Helman SR,et al.Landscape ofimmunogenic tumor antigens in successful immunotherapy of virally inducedepithelial cancer.Science.2017；356(6334)：200-205.]中表达，但不在除睾丸外的正常组织中表达，这表明它可能作为T细胞免疫治疗的安全靶点。

目前，对于上述疾病的治疗，可以采用化疗和放射性治疗等方法，但都会对自身的正常细胞造成损害。细胞过继免疫治疗指的是，体外活化和扩增的自体或异体免疫效应细胞输注患者体内的治疗方法，该方法对于患者的自身的正常细胞不会严重的损害。因此进行细胞过继免疫治疗的十分必要。

T细胞过继免疫治疗是将对靶抗原具有特异性的T细胞输入病人体内，使其对靶细胞发挥杀伤作用。T细胞受体(TCR)是T细胞表面的一种膜蛋白，其能够识别靶细胞表面的抗原短肽/MHC复合物(pMHC复合物)。在免疫系统中，通过特异性的TCR与pMHC复合物的结合引发T细胞与抗原提呈细胞(antigen-presenting cells，APC)直接的物理接触，然后T细胞及APC两者的其他细胞膜表面分子就会发生相互作用，导致T细胞活化，从而引起一系列后续的细胞内信号传递和反应。活化的T细胞进入增生状态，进而分化为效应细胞与记忆细胞。当这些抗原特异性T细胞，再次遇到抗原阳性同时表达对应MHC分子的靶细胞(如癌症细胞)时，会对靶细胞产生杀伤作用，从而产生抗癌效果。因此，我们致力于分离出对CT83抗原短肽具有特异性的T细胞，进而分离对CT83抗原短肽具有特异性的TCR，以便用该TCR转导外周血T细胞，从而大量产生对CT83短肽具有特异性的T细胞，进而用于癌症的过继T细胞免疫治疗。

发明内容

本发明的目的是为了克服现有技术的上述不足，建立一种精准肿瘤免疫治疗新技术，发明TCR-T抗癌原创细胞药，因此，提供一种T细胞受体及其应用，该T细胞受体具有抗癌的作用。

本发明的第一个目的是提供一种T细胞受体。

本发明的第二个目的是提供一种核酸分子。

本发明的第三个目的是提供一种表达载体。

本发明的第四个目的是提供一种宿主细胞。

本发明的第五个目的是提供中任一项所述的T细胞受体，所述的核酸分子、任一项所述的表达载体，或权利要求所述的宿主细胞，在制备治疗疾病的药物中的应用。

为了实现上述目的，本发明是通过以下方案予以实现的：

本发明人经过实验研究，成功分离得到了能够与CT83癌症睾丸抗原表位CT83_14-22(ALIVFWKYR，氨基端酸序列如SEQ IN NO：9所示)特异性结合的TCR基因(命名为TCR3851^CT83)，其能够与被呈递到细胞表面的CT83_14-22/HLA-A*11：01复合物特异性结合。进一步还提供了编码所述TCR的核酸分子以及包含所述核酸分子的载体，以及转导本发明TCR的细胞(体外扩增的原代T细胞)。

因此本发明要求保护以下内容：

一种T细胞受体(TCR)，所述T细胞受体包含TCRα链和TCRβ链；

其中，TCRα链的可变域的αCDR1、αCDR2、αCDR3氨基酸序列分别如SEQ ID NO：10～12所示；TCRβ链的可变域的βCDR1、βCDR2、βCDR3氨基酸序列分别如SEQ ID NO：13～15所示。

本发明的TCR分子是由α与β链构成的异二聚体，α与β链均包括可变域和恒定域。

具体地，其中，所述TCRα链可变域的3个互补决定区(CDR)为：

αCDR1：TSESDYY(氨基酸序列如SEQ ID NO：10所示)，

αCDR2：QEAYKQQN(氨基酸序列如SEQ ID NO：11所示)，

αCDR3：CAYRSFRQDSGNTPLVF(氨基酸序列如SEQ ID NO：12所示)；

所述TCRβ链可变域的3个互补决定区(CDR)为：

βCDR1：SGHRS(氨基酸序列如SEQ ID NO：13所示)，

βCDR2：YFSETQ(氨基酸序列如SEQ ID NO：14所示)，

βCDR3：CKNSRTNYGYTF(氨基酸序列如SEQ ID NO：15所示)。

优选地，所述TCR分子是分离的或纯化的。

优选地，T细胞受体具有结合CT83抗原短肽CT83_14-22/HLA-A*11：01复合物的性质，其中所述CT83抗原短肽CT83_14-22氨基酸序列如SEQ ID NO：9所示。

优选地，TCRα链可变域的氨基酸序列如SEQ ID NO：1所示。

更优选地，所述TCRα链的氨基酸序列如SEQ ID NO：3所示。

优选地，TCRβ链可变域的氨基酸序列如SEQ ID NO：5所示。

更优选地，所述TCRα链的氨基酸序列如SEQ ID NO：7所示。

将TCR的氨基酸序列嵌入到任何适合的框架结构中来制备嵌合TCR。只要框架结构与本发明的TCR的CDR区兼容，本领域技术人员根据本发明公开的CDR区就能够设计或合成出具有相应功能的TCR分子。因此，本发明TCR分子是指包含上述α和/或β链CDR区序列及任何适合的框架结构的TCR分子。本发明TCRα链可变域为与氨基酸序列如SEQ ID NO：1所示序列具有至少90％，优选地95％，更优选地98％序列相同性的氨基酸序列；和/或本发明TCRβ链可变域为与氨基酸序列如SEQ ID NO.5所示序列具有至少90％，优选地95％，更优选地98％序列相同性的氨基酸序列。

本发明的TCR是包含衍生自超过一种物种序列的杂合TCR。有研究显示含有鼠源TCR恒定区的TCRα和β链在人T细胞中能够更好的相互配对，避免与人T细胞内源性TCR配对，从而有效地表达转导的人TCR。因此，本发明TCR可包含人的可变域和鼠的恒定域。本领域技术人员知晓或可以通过查阅相关书籍或IMGT(国际免疫遗传学信息系统)的公开数据库来获得鼠的恒定域氨基酸序列。

更优选地，本发明TCR分子α链和β链的恒定域序列为小鼠源性的。

应理解，本文中氨基酸名称采用国际通用的单英文字母或三英文字母表示，氨基酸名称的单英文字母与三英文字母的对应关系如下：Ala(A)、Arg(R)、Asn(N)、Asp(D)、Cys(C)、Gln(Q)、Glu(E)、Gly(G)、His(H)、Ile(I)、Leu(L)、Lys(K)、Met(M)、Phe(F)、Pro(P)、Ser(S)、Thr(T)、Trp(W)、Tyr(Y)、Val(V)。

一种核酸分子，所述核酸分子编码包含任一项所述的TCR的核苷酸序列，或其互补序列。即所述分子编码包含一个或多个CDR，α和/或β链的可变域，以及α链和/或β链。

相应的，编码所述TCR分子α链CDR区的核苷酸序列如下：

αCDR1：accagtgagagtgattattat(SEQ ID NO：16)，

αCDR2：caagaagcttataagcaacagaat(SEQ ID NO：17)，

αCDR3：tgtgcttataggagcttccgccaggattcaggaaacacacctcttgtcttt(SEQ ID NO：18)；

编码所述TCR分子β链CDR区的核苷酸序列如下：

βCDR1：tctgggcataggagt(SEQ ID NO：19号序列)，

βCDR2：tacttcagtgagacacag(SEQ ID NO：20号序列)，

βCDR3：tgcaaaaatagccggactaactatggctacaccttc(SEQ ID NO：21)。

优选地，所述核苷酸分子包含SEQ ID NO：2所示的编码TCRα链可变域的核苷酸分子和/或SEQ ID NO：6所示的编码TCRβ链可变域的核苷酸分子，或其互补序列。

更优选地，所述核苷酸分子包含SEQ ID NO：4所示的编码TCRα链的核苷酸分子和/或SEQ ID NO：8所示的编码TCRβ链的核苷酸分子，或其互补序列。

本发明核酸分子的核苷酸序列可以是单链或双链的，该核酸分子可以是RNA或DNA，并且可以包含或不包含内含子。

优选地，本发明核酸分子的核苷酸序列不包含内含子但能够编码本发明多肽。

应理解，由于遗传密码的简并，不同的核苷酸序列可以编码相同的多肽。因此，编码本发明TCR的核酸序列可以与本发明附图中所示的核酸序列相同或是简并的变异体。以本发明中的其中一个例子来说明，“简并的变异体”是指编码具有SEQ ID NO：1所示序列的蛋白序列，但与SEQ ID NO：2所示序列的序列有差别的核酸序列。

核苷酸序列可以是经密码子优化的。不同的细胞在具体密码子的利用上是不同的，可以根据细胞的类型，改变序列中的密码子来增加表达量。哺乳动物细胞以及多种其他生物的密码子选择表是本领域技术人员公知的。

本发明的核酸分子全长序列或其片段通常可以用但不限于PCR扩增法、重组法或人工合成的方法获得。目前，已经可以完全通过化学合成来得到编码本发明TCR(或其片段，或其衍生物)的DNA序列。然后可将该DNA序列引入本领域中已知的各种现有的DNA分子(或如载体)和细胞中。DNA可以是编码链或非编码链。

有许多方法适合于用编码本发明TCR的DNA或RNA进行T细胞转导(Paul FRobbins,Yong F Li,Mona El-Gamil,et al.Single and dual amino acidsubstitutions in TCR CDRs can enhance antigen-specific T cell functions,Immunol,2008,180：6116-6131)，表达本发明TCR的T细胞可以用于过继免疫治疗。本领域技术人员能够知晓进行过继性治疗的许多合适方法(如Rosenberg SA,Restifo NP,Yang JC,et al.Adoptive cell transfer：a clinical path to effective cancerimmunotherapy.Nat Rev Cancer.2008 Apr；8(4)：299-308)。

一种表达载体，包含所述的核酸分子，或其互补序列。包括表达载体，即能够在体内或体外表达的构建体。常用的载体包括细菌质粒、噬菌体和动植物病毒。

优选地，所述表达载体是病毒载体，包括但不限于腺病毒载体、腺相关病毒(AAV)载体、疱疹病毒载体、逆转录病毒载体、慢病毒载体、杆状病毒载体。

载体可以将本发明的核苷酸转移至细胞中，例如T细胞中，使得该细胞表达CT83抗原特异性的TCR。理想的情况下，该载体应当能够在T细胞中持续高水平地表达。

更优选地，述病毒载体是慢病毒载体或逆转录病毒载体。

一种宿主细胞，包含任一项所述的T细胞受体，所述的核酸分子，或任一项所述的表达载体中的至少一项。该宿主细胞，有本发明的载体或染色体中整合有本发明的核酸分子。宿主细胞选自：原核细胞和真核细胞，例如大肠杆菌、酵母细胞、CHO细胞等。

优选地，所述宿主细胞为免疫系统细胞或干细胞。

更优选地，所述宿主细胞为T细胞。

任一项所述的T细胞受体，所述的核酸分子、任一项所述的表达载体，或权利要求所述的宿主细胞，在制备治疗疾病的药物中的应用。

优选地，所述疾病为CT83抗原相关疾病。

更优选地，所述疾病能同时表达癌症睾丸抗原CT83和HLA-A*11：01。

优选地，所述疾病为胃癌、肺癌、肝癌、食道癌、膀胱癌、前列腺癌、乳腺癌、结直肠癌、卵巢癌、宫颈癌、多发性骨髓瘤、恶性黑色素瘤、脑胶质瘤、软组织肉瘤、睾丸癌、胰腺癌、头颈鳞状细胞癌、子宫内膜癌、胆管癌、肾嫌色细胞癌、肾透明细胞癌、和甲状腺癌等。

本发明还涉及在受试者中治疗和/或预防与CT83相关疾病的方法，其包括过继性转移CT83特异性T细胞至该受试者的步骤。该CT83特异性T细胞识别CT83_14-22/HLA-A*11：01复合物。

本发明的CT83特异性T细胞可用于治疗任何呈递CT83抗原短肽CT83_14-22/HLA-A*11：01复合物的CT83相关疾病。包括但不限于肿瘤，如胃癌、肺癌、肝癌、食道癌、膀胱癌、前列腺癌、乳腺癌、结直肠癌、卵巢癌、宫颈癌、多发性骨髓瘤、恶性黑色素瘤、脑胶质瘤、软组织肉瘤、睾丸癌、胰腺癌、头颈鳞状细胞癌、子宫内膜癌、胆管癌、肾嫌色细胞癌、肾透明细胞癌、和甲状腺癌等。

本发明还提供一种CT83抗原相关疾病的治疗方法。

可以通过分离患有与CT83抗原相关疾病的病人或志愿者的T细胞，并将本发明的TCR导入上述T细胞中，随后将这些基因工程修饰的细胞回输到病人体内来进行治疗。因此，本发明提供了一种治疗CT83相关疾病的方法，包括将分离的表达本发明TCR的T细胞，优选地，该T细胞来源于病人本身，输入到病人体内。一般地，包括(1)分离病人的T细胞，(2)用本发明核酸分子或能够编码本发明TCR分子的核酸分子体外转导T细胞，(3)将基因工程修饰的T细胞输入到病人体内。分离、转染及输入的细胞的数量可以由医师决定。

本发明还包括表达本发明的TCR的分离的细胞，特别是T细胞。该T细胞可衍生自从受试者分离的T细胞，或者可以是从受试者中分离的混合细胞群，诸如外周血单个核细胞(PBMC)群的一部分。一般地，该细胞可以用抗体(如，抗-CD3或抗-CD28的抗体)活化，以便使它们能够更容易接受转导，例如用包含编码本发明TCR分子的核苷酸序列的载体进行转导。

备选地，本发明的细胞还可以是或衍生自干细胞，如造血干细胞(HSC)。将基因转移至HSC不会导致在细胞表面表达TCR，因为干细胞表面不表达CD3分子。然而，当干细胞分化为迁移至胸腺的淋巴前体(lymphoid precursor)时，CD3分子的表达将启动在胸腺细胞的表面表达该引入的TCR分子。

术语解释：

MHC是免疫球蛋白超家族的蛋白质，可以分为Ⅰ类或Ⅱ类MHC分子。不同的个体有不同的MHC分子，每种MHC分子能与一种蛋白质中一组不同的短肽相结合，呈递到APC细胞表面，因此，其对于抗原表位的呈递具有特异性。人类的MHC通常称为人类白细胞抗原(humanleukocyte antigen，HLA)。

TCR是在T细胞表面由MHC呈递的特异性抗原肽的唯一受体。在免疫系统中，通过抗原特异性的TCR与pMHC复合物的结合引发T细胞与APC直接的物理接触，然后T细胞及APC两者的其他细胞膜表面分子就发生相互作用，引起了一系列后续的细胞信号传递和生理生化反应，从而使得抗原特异性的T细胞对其靶细胞发挥免疫效应。

TCR是由α链/β链或者γ链/δ链以异二聚体形式存在的细胞膜表面的糖蛋白。在约95％的T细胞中TCR异二聚体由α和β链组成，而约5％的T细胞具有由γ和δ链组成的TCR。天然αβ异二聚TCR具有α链和β链，α链和β链构成αβTCR异二聚的亚单位。广义上讲，α和β各包含可变区、连接区和恒定区，β链通常还在可变区和连接区之间含有短的多变区，但该多变区常视作连接区的一部分。各可变区包含嵌合在框架结构(framework regions)中的3个CDR(互补决定区)，CDR1、CDR2和CDR3。CDR区决定了TCR与pMHC复合物的结合，其中CDR3由可变区和连接区DNA片段随机重排而成，序列高度多样化，被称为超变区。TCR的α和β链一般看作各有两个“结构域”即可变域和恒定域，可变域由连接的可变区和连接区构成。TCRα和β链的恒定域，包含胞外区，跨膜区和胞质区，胞质区很短。各种TCRα和β链序列可以在国际免疫遗传学信息系统(IMGT)的公开数据库中找到。

在以下实施例中，术语“TCR”、“T细胞受体”可互换使用。

与现有技术相比，本发明具有以下有益效果：

本发明公开了一种T细胞受体(T cell receptor，TCR)及其应用，该TCR能够与CT83抗原短肽CT83_14-22/HLA-A*11：01复合物特异性结合；转导了本发明TCR的T细胞能够被表达CT83_14-22/HLA-A*11：01复合物的树突状细胞特异性激活，并且对CT83和HLA-A*11：01阳性的靶细胞(如癌细胞)产生强有力的杀伤作用；该发明为CT83癌症睾丸抗原相关性疾病的TCR-T细胞免疫治疗提供了一个新的途径。

附图说明

图1为流式细胞术散点图，显示用流式细胞仪分选出CD8+CD137+抗原反应性T细胞的结果。

图2为柱状图，显示用IFN-γELISA试验检测转导本发明TCR3851^CT83的原代T细胞与加载不同短肽的T2-A11细胞反应，测量上清中IFN-γ释放的含量。

图3为流式细胞术散点图，显示CT83_14-22/HLA-A*11：01四聚体-PE染色的结果，TCR3851^CT83转导T细胞后，CD8+和四聚体双阳性的T细胞为CT83特异性T细胞。

图4为折线图，显示用IFN-γELISA试验检测转导本发明TCR3851^CT83的效应T细胞与加载不同浓度梯度短肽的T2-A11的细胞活性反应，测量上清中IFN-γ释放的含量。

图5为柱状图，显示用qPCR试验检测不同肿瘤靶细胞CT83的表达结果。

图6为柱状图，显示转导本发明TCR3851^CT83的效应T细胞与不同肿瘤细胞系共培养的免疫反应结果，测量上清中IFN-γ释放的含量。

具体实施方式

下面结合说明书附图及具体实施例对本发明作出进一步地详细阐述，所述实施例只用于解释本发明，并非用于限定本发明的范围。下述实施例中所使用的试验方法如无特殊说明，均为常规方法；所使用的材料、试剂等，如无特殊说明，为可从商业途径得到的试剂和材料。

下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件，例如(Sambrook和Russell等人，分子克隆：实验室手册(Molecular Cloning-A Laboratory Manual)(第三版)(2001)CSHL出版社)中所述的条件，或按照制造厂商所建议的条件。除非另外说明，否则百分比和份数按重量计算。除非另外说明，否则百分比和份数按重量计算。

以下实施例中所用的实验材料和试剂如无特别说明均可从市售渠道获得。

实施例1 克隆特异性T细胞

1、实验方法

利用合成CT83多肽LASSILCALIVFWKYRRFQR(金斯瑞生物科技有限公司)刺激来自于基因分型为HLA-A*11：01的健康志愿者的外周血单个核细胞(PBMC)。

通过ELISPOT试剂盒(达优，目录号2110005)检测特异性T细胞的INF-γ表达，先用流式细胞术圈出CD3+T细胞，再采用流式细胞术分选出CD8+CD137+的T细胞(图1)，再用大剂量IL2(PeproTech，目录号200-02-50UG)扩增。

2、实验结果

流式细胞术分选出结果如图1所示，分选出5×10⁴个CD3+CD8+CD137+T细胞，扩增至2×10⁵。

实施例2 CT83特异性CD8+T细胞克隆的TCR基因的获取与载体的构建

一、CT83特异性CD8+T细胞克隆的TCR基因的获取

1、实验方法

通过对实施例1利用流式细胞术分选扩增得到的T细胞进行单细胞转录组和TCR组库测序，对获得的TCR进行序列分析。

2、实验结果

结果显示，TCR的CDR3克隆占比最高(20.8％)的α链和β链的氨基酸序列如SEQ IDNO：3和SEQ ID NO：7所示。其编码基因的核苷酸序列分别如SEQ ID NO：4和SEQ ID NO：8所示。其中氨基酸序列如SEQ ID NO：3的α链的可变域的氨基酸序列如SEQ ID NO：1所示，其编码基因的核苷酸序列分别SEQ ID NO：2所示；氨基酸序列如SEQ ID NO：7的β链的可变域的氨基酸序列如SEQ ID NO：5所示，其编码基因的核苷酸序列分别SEQ ID NO：6所示。

TCR的结构域分析表明：

TCRα链为TRAV38-2-CAYRSFRQDSGNTPLVF-TRAJ29；

TCRβ链为TRBV5-1-CKNSRTNYGYTF-TRBJ1-2，

因此，将这一TCR命名为TCR3851^CT83。

经鉴定，α链包含具有以下氨基酸序列的CDR：

αCDR1：TSESDYY(氨基酸序列如SEQ ID NO：10所示)，

αCDR2：QEAYKQQN(氨基酸序列如SEQ ID NO：11所示)，

αCDR3：CAYRSFRQDSGNTPLVF(氨基酸序列如SEQ ID NO：12所示)；

β链包含具有以下氨基酸序列的CDR：

βCDR1：SGHRS(氨基酸序列如SEQ ID NO：13所示)，

βCDR2：YFSETQ(氨基酸序列如SEQ ID NO：14所示)，

βCDR3：CKNSRTNYGYTF(氨基酸序列如SEQ ID NO：15所示)。

对应的，以上CDR的编码基因为：

编码所述TCR分子α链CDR区的核苷酸序列如下：

αCDR1：accagtgagagtgattattat(SEQ ID NO：16)，

αCDR2：caagaagcttataagcaacagaat(SEQ ID NO：17)，

αCDR3：tgtgcttataggagcttccgccaggattcaggaaacacacctcttgtcttt(SEQ ID NO：18)；

编码所述TCR分子β链CDR区的核苷酸序列如下：

βCDR1：tctgggcataggagt(SEQ ID NO：19)，

βCDR2：tacttcagtgagacacag(SEQ ID NO：20)，

βCDR3：tgcaaaaatagccggactaactatggctacaccttc(SEQ ID NO：21)。

二、含有TCR载体的构建

1、实验方法

为了方便检测TCR转基因，在TCR表达载体中加入通用的用于示踪的LNGFR基因(核苷酸序列如SEQ ID NO：22所示)，将LNGFR、T2A序列、TCRβ(核苷酸序列如SEQ ID NO：8)、P2A序列、和TCRα(核苷酸序列如SEQ ID NO：4)的DNA序列依次连接，得到人工合成LNGFR-T2A-TCRβ-P2A-TCRα基因片段(核苷酸序列如SEQ ID NO：23所示)，插入质粒pMP71的NotI和EcoRI位点。作为对照用，同时也构建表达eGFP的慢病毒载体pMP71-eGFP(上海生工生物工程有限公司)。

2、实验结果

得到pMP71-LNGFR-T2A-TCRβ-P2A-TCRα质粒和pMP71-eGFP质粒。

实施例3 TCR逆转录病毒包装与原代T细胞转染

一、通过GALV细胞制备逆转录病毒

1、实验方法

利用逆转录病毒包装系统包装含有编码实施例1的TCR的基因的逆转录病毒。GALV细胞本身转导了包装质粒，只需要加入目的质粒即可，利用Lipofectamine^TM 3000试剂盒(Invitrogen，目录号L3000015)将实施例2制备得到的pMP71-LNGFR-T2A-TRB-P2A-TRA和pMP71-eGFP质粒转导进GALV细胞。

为进行转染，第0天种细胞，在六孔板种上1.0×10⁶个/孔GALV细胞，使细胞均匀分布在培养皿上，汇合度略高于70％。第1天转导质粒，配制溶液(六孔板每孔的量为)：A液：250μL Opti-MEM(Gibco，目录号31985-070)+7.5μL Lipofectamine 3000，混合均匀；B液：250μL Opti-MEM+5μL P3000+2μg pMP71-LNGFR-T2A-TRB-P2A-TRA，混合均匀。A液和B液充分混合，静置20分钟。20分钟后，吸去GALV细胞的培养液，沿着孔壁小心滴入AB混合液，并微微摇匀。如果液体不足以覆盖细胞，则可以再加入1mL Opti-MEM培养液，防止细胞暴露在空气中干涸。8～12小时后，吸去板内培养液，替换成DMEM(Gibco，目录号C11995500BT)+20％FBS(PAN-Seratech，目录号ST30-3302)培养液。转导后的48小时即可收取第一批含病毒的细胞上清液。补入新的培养液后，24小时后可收获第二批病毒液。所收集到的培养上清1000g离心15分钟去除细胞碎片，再经0.45微米过滤器(PALL，目录号4614)过滤，最后用50KD截留量的浓缩管(Merck，目录号UFC910096)进行浓缩，除去大部分上清液，最后浓缩到1毫升，制备得到TCR3851^CT83的逆转录病毒。作为对照用，同时转pMP71-eGFP病毒。

2、实验结果

准备好转染T细胞的病毒后，可以进行下一步实验。

二、逆转录病毒转导原代T细胞

健康志愿者的血液中分离到PBMC。计数这些细胞，在六孔板中，在含3000IU/mLIL-2、30ng/mL抗CD3抗体(Biolegend，目录号300465)和抗CD28抗体(Biolegend，目录号302943)的含10％AB血清(ACCESS，515-H)的1640培养液(Gibco，目录号C11875500BT)扩增两天刺激。加入已浓缩的TCR3851^CT83的逆转录病毒，32℃，2500rpm离心感染2小时。第二天加入病毒感染液，用加入50IU/mL IL-2和10％AB血清的1640培养液重悬细胞，放置37℃/5％CO₂培养箱，从第5天开始用于后续功能试验(例如，IFN-γ释放的ELISPOT和杀伤实验检测)。

2、实验结果

TCR3851^CT83的逆转录病毒转染的T细胞(TCR-T细胞)，转染效率一般在30％左右，可以通过流式细胞术测出。

实施例4 肿瘤抗原CT83表位

1、实验方法

按照长肽LASSILCALIVFWKYRRFQR的序列，连续位移合成一组不同的9mer短肽：LASSILCAL、ASSILCALI、SSILCALIV、SILCALIVF、ILCALIVFW、LCALIVFWK、CALIVFWKY、ALIVFWKYR、LIVFWKYRR、IVFWKYRRF、VFWKYRRFQ、FWKYRRFQR。

将T2细胞(ATCC)敲除B2M并转导B2M-HLA-A*11：01，构建靶细胞T2-A11。实施例3构建好的TCR-T细胞与T2-A11共培养，分别加入上述不同短肽，过夜后收集上清液，使用HumanIFN-γELISASet(达优，目录号1110002)检测IFN-γ产量，作为T细胞激活的读出值。

以下是试剂盒γ干扰素(IFN-γ)的测量方法：(1)包被抗体：把capture AB按照1：500的比例溶解在包被缓冲液中。ELISA板每个孔包被100μL包被缓冲液，用封口膜包被好，4℃保存过夜。(2)标准样品的配置：试剂盒里提供的人IFN-γ粉末用Assay Diluent按8000pg/mL配成储存液，冻存在-80℃中，不可反复冻融。使用时，用Assay Diluent分别稀释成如下梯度：2000pg/mL，1000pg/mL，500pg/mL，250pg/mL，125pg/mL，62.5pg/mL，31.3pg/mL和0pg/mL。以Assay Diluent作为阴性对照组。标准样品和样本液都不能反复冻融，需要现配现用。(3)封闭酶标反应孔：第二天，吸走包被的包被缓冲液，用300μL每个孔的清洗液清洗每个孔5次，吸尽板内所有液体。每个孔加入200μL的Assay Diluent，室温封闭一小时。(4)结合IFN-γ：封闭完成后，按照上一步清洗酶标板5次，吸尽液体，每孔加入100μL标准样品或实验样本。每个孔做3个重复组，室温孵育2小时。(5)加入酶标抗体和底物：2小时后，用清洗液清洗酶标板5次，每孔加入100μL Working Detector溶液，室温孵育一小时。孵育完后用清洗液清洗板子10次，注意每次加入洗涤液后要等30秒-1分钟再清洗第二次。(6)显色和终止反应：清洗完成后，每个孔再加入100μL Subtrate Solution，室温避光孵育30分钟。最后每个孔加入50μL终止液，终止30分钟即可在酶标仪中进行读数。(7)标准曲线的绘制：分别读取酶标孔在450nm和570nm处的读数。在EXCEL表格中以标准液浓度作为横坐标值，450～570nm的值作为纵坐标值，在坐标轴上标出点。用这些点拟合线性方程，即为该次实验的标准曲线。其他样本测出的450～570nm的读数可以利用该方程求出样本的IFN-γ浓度。

通过ELISA试验(如上所述)检验TCR3851^CT83的逆转录病毒转导的T细胞对负载CT83_14-22短肽的靶细胞(T2-A11)和非特异性短肽的靶细胞起反应的IFN-γ释放。没有转导的T细胞为阴性组(UT-Ts)。利用graphpad prism6绘制各孔中IFN-γ释放量(图2)。

2、实验结果

各孔中IFN-γ释放量如图2所示，结果显示加载ALIVFWKYR短肽的组可以使实施例3构建好的TCR-T细胞释放大量IFN-γ，其他组几乎没有反应。终实验测定ALIVFWKYR(氨基酸序列如SEQ ID NO：9所示)为TCR3851^CT83所识别的表位，记为CT83_14-22。

实施例5 HLA四聚体染色TCR3851^CT83转导的原代T细胞

1、实验方法

利用置换型HLA-A*11：01四聚体QuickSwitch试剂盒(北京博尔迈生物技术有限公司，MBL BEIJING BIOTECH)，用DMSO制备10mM CT83_14-22短肽溶液，将50μL的QuickSwichTMTetramer加入微孔板，加入1μL短肽溶液，混匀，再加入1μL CT83_14-22短肽置换因子，并用移液器混匀，避光于室温下孵育4小时以上，于2～8℃下避光储存。制备的HLA-A*11：01四聚体与CT83_14-22肽复合物称为CT83_14-22/A11 tetramer-PE，此四聚体能把表达了实施例1的TCR基因(TCR3851^CT83)的T细胞标记为PE阳性细胞。把经转导的T细胞样品和未经转导的T细胞对照组用CT83_14-22/A11 tetramer-PE、抗人CD8PE/CY7抗体混合避光孵育20分钟，PBS清洗2次后用BD Arial检测表达了CD8+CT83_14-22/A11 tetramer-PE+的T细胞，数据分析采用FlowJo软件分析。

2、实验结果

经检测分析，结果如图3所示，用CT83_14-22/A11 tetramer-PE、抗人CD8 PE/CY7染色后，用未经TCR病毒转导的对照组T细胞几乎没有CD8+CT83_14-22/A11 tetramer-PE+的阳性细胞，而经TCR3851^CT83逆转录病毒感染的T细胞出现表达CD8+CT83_14-22/A11 tetramer-PE+阳性细胞(24％)，对照组几乎没有阳性细胞，实验结果说明了表达了实施例1的TCR基因的T细胞能够被HLA-A*11：01四聚体特异性染色，表明实施例1的TCR3851^CT83具有HLA-A*11：01特异性。

实施例6 TCR3851^CT83的活性

1、实验方法

用DMSO制备10^-6M CT83_14-22短肽溶液，并用蒸馏水依次10倍稀释成10^-7M，10^-8M，10^-9M，10^-10M，10^-11M。TCR3851^CT83转导的T细胞用30U/mL IL2的含10％AB血清的1640培养液静息四天，并以同一志愿者的未转导T细胞作为阴性对照效应细胞(UT-Ts)，与实施例3中构建好的T2-A11细胞共培养，加入上述不同短肽，温育孔板过夜(37℃/5％CO₂)第二天收集上清液，使用人IFN-γELISA Set试剂盒检测IFN-γ产量。

通过ELISA试验(如上所述)检验TCR3851^CT83转导的T细胞对负载不同浓度的CT83_14-22短肽的靶细胞起反应的IFN-γ释放。利用graphpad prism6绘制各孔中测量的IFN-γ释放量。

2、实验结果

结果如图4所示，在CT83_14-22短肽浓度为10^-9～10^-7M时，实施例3构建的TCR-T细胞对T2-A11细胞结合的短肽敏感，IFN-γ的释放量随着浓度升高而升高。而超过10^-7浓度时，IFN-γ的释放量趋于稳定。

实施例7 TCR识别CT83抗原阳性肿瘤细胞产生T细胞免疫反应

ELISA试验检测的IFN-γ产量作为T细胞激活的读出值，以证明TCR3851^CT83转导的T细胞对靶细胞特异性识别产生的T细胞激活反应。

1、实验方法

(1)靶细胞制备

本实施例的靶细胞为改造后的不同实体瘤的肿瘤细胞系，在试验培养基中制备靶细胞：靶细胞浓度调至5×10⁴个细胞/孔(96孔板)。

胃癌细胞株：7901、823；为CT83阳性(CT83+)和HLA-A*11：01阴性细胞(A11-)。

乳腺癌细胞株：MB231为CT83阳性与A11阴性细胞(CT83+,A11-)；BT549 CT83阴性与A11阴性细胞(CT83-,A11-)。

肺癌细胞株：HCC827、PC9；HCC827为CT83阳性与A11阳性细胞(CT83+,A11+)；PC9为CT83阳性与A11阴性细胞(CT83+,A11-)。

其中7901、823、MB231、BT549、PC9均用CRISPR/CAS9技术敲除B2M，再转入B2M-HLA-A*11：01,构建成7901-1(CT83+,A11+)、823-A11(CT83+,A11+)、MB231-A11(CT83+,A11+)、BT549-A11(CT83-,A11+)、PC9-A11(CT83+,A11+)；7901用CRISPR/CAS9技术敲除CT83，构建7901-2(CT83-,A11-)。通过qPCR测出这些细胞系的CT83表达值(图5)。

(2)效应细胞制备

本试验的效应细胞(T细胞)是实施例3中经流式细胞术分析表达TCR3851^CT83的T细胞，并以同一志愿者的未转染T细胞作为阴性对照效应细胞。用IL2、CD3、CD28抗体刺激T细胞，用携带本发明TCR基因的逆转录病毒转导，在含有50IU/mL IL-2的含10％AB血清的1640培养基扩增直至转导后9～12天，然后将这些细胞置于试验培养液中，300g常温离心10分钟进行洗涤。然后将T细胞和肿瘤细胞以2：1的比例重悬在试验培养基中。同样处理阴性对照效应细胞。24小时后收集所有孔上清并进行IFN-γELISA检测。

并且进一步通过ELISA试验(如上所述)检验TCR3851^CT83转导的T细胞对CT83+A11+靶细胞、CT83+A11-靶细胞、CT83-A11+靶细胞和CT83-A11-靶细胞具有明显不同的激活反应，利用graphpad prism6绘制各孔中IFN-γ释放量。

2、实验结果

实验结果如图6所示，TCR-T细胞(效应细胞)与非特异性靶细胞BT549-A11(CT83-,A11+)、7901-2(CT83-,A11-)、7901(CT83+,A11-)(靶细胞)反应时释放IFN-γ很少。

TCR-T细胞(效应细胞)与特异性靶细胞7901-1(CT83+,A11+)、823-A11(CT83+,A11+)、HCC827(CT83+,A11+)、MB231-A11(CT83+,A11+)、PC9-A11(CT83+,A11+)释放IFN-γ较多。同源未转染T细胞对靶细胞的激活反应明显低于TCR3851^CT83转导的T细胞组。

说明了TCR3851^CT83转导的T细胞只对CT83+A11+靶细胞具有激活反应能力，分离的TCR是CT83和HLA-A*11：01特异性TCR，是一个活性高、特异性强、对多种实体瘤的杀伤功能优秀的TCR，应用范围广，临床价值高。

最后所应当说明的是，以上实施例仅用以说明本发明的技术方案而非对本发明保护范围的限制，对于本领域的普通技术人员来说，在上述说明及思路的基础上还可以做出其它不同形式的变化或变动，这里无需也无法对所有的实施方式予以穷举。凡在本发明的精神和原则之内所作的任何修改、等同替换和改进等，均应包含在本发明权利要求的保护范围之内。

序列表

<110> 暨南大学

<120> 一种T细胞受体及其应用

<160> 23

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 111

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 1

Met Ala Cys Pro Gly Phe Leu Trp Ala Leu Val Ile Ser Thr Cys Leu

1 5 10 15

Glu Phe Ser Met Ala Gln Thr Val Thr Gln Ser Gln Pro Glu Met Ser

20 25 30

Val Gln Glu Ala Glu Thr Val Thr Leu Ser Cys Thr Tyr Asp Thr Ser

35 40 45

Glu Ser Asp Tyr Tyr Leu Phe Trp Tyr Lys Gln Pro Pro Ser Arg Gln

50 55 60

Met Ile Leu Val Ile Arg Gln Glu Ala Tyr Lys Gln Gln Asn Ala Thr

65 70 75 80

Glu Asn Arg Phe Ser Val Asn Phe Gln Lys Ala Ala Lys Ser Phe Ser

85 90 95

Leu Lys Ile Ser Asp Ser Gln Leu Gly Asp Ala Ala Met Tyr Phe

100 105 110

<210> 2

<211> 333

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 2

atggcatgcc ctggcttcct gtgggcactt gtgatctcca cctgtcttga atttagcatg 60

gctcagacag tcactcagtc tcaaccagag atgtctgtgc aggaggcaga gaccgtgacc 120

ctgagctgca catatgacac cagtgagagt gattattatt tattctggta caagcagcct 180

cccagcaggc agatgattct cgttattcgc caagaagctt ataagcaaca gaatgcaaca 240

gagaatcgtt tctctgtgaa cttccagaaa gcagccaaat ccttcagtct caagatctca 300

gactcacagc tgggggatgc cgcgatgtat ttc 333

<210> 3

<211> 275

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 3

Met Ala Cys Pro Gly Phe Leu Trp Ala Leu Val Ile Ser Thr Cys Leu

1 5 10 15

Glu Phe Ser Met Ala Gln Thr Val Thr Gln Ser Gln Pro Glu Met Ser

20 25 30

Val Gln Glu Ala Glu Thr Val Thr Leu Ser Cys Thr Tyr Asp Thr Ser

35 40 45

Glu Ser Asp Tyr Tyr Leu Phe Trp Tyr Lys Gln Pro Pro Ser Arg Gln

50 55 60

Met Ile Leu Val Ile Arg Gln Glu Ala Tyr Lys Gln Gln Asn Ala Thr

65 70 75 80

Glu Asn Arg Phe Ser Val Asn Phe Gln Lys Ala Ala Lys Ser Phe Ser

85 90 95

Leu Lys Ile Ser Asp Ser Gln Leu Gly Asp Ala Ala Met Tyr Phe Cys

100 105 110

Ala Tyr Arg Ser Phe Arg Gln Asp Ser Gly Asn Thr Pro Leu Val Phe

115 120 125

Gly Lys Gly Thr Arg Leu Ser Val Ile Ala Asn Ile Gln Asn Pro Glu

130 135 140

Pro Ala Val Tyr Gln Leu Lys Asp Pro Arg Ser Gln Asp Ser Thr Leu

145 150 155 160

Cys Leu Phe Thr Asp Phe Asp Ser Gln Ile Asn Val Pro Lys Thr Met

165 170 175

Glu Ser Gly Thr Phe Ile Thr Asp Lys Thr Val Leu Asp Met Lys Ala

180 185 190

Met Asp Ser Lys Ser Asn Gly Ala Ile Ala Trp Ser Asn Gln Thr Ser

195 200 205

Phe Thr Cys Gln Asp Ile Phe Lys Glu Thr Asn Ala Thr Tyr Pro Ser

210 215 220

Ser Asp Val Pro Cys Asp Ala Thr Leu Thr Glu Lys Ser Phe Glu Thr

225 230 235 240

Asp Met Asn Leu Asn Phe Gln Asn Leu Ser Val Met Gly Leu Arg Ile

245 250 255

Leu Leu Leu Lys Val Ala Gly Phe Asn Leu Leu Met Thr Leu Arg Leu

260 265 270

Trp Ser Ser

275

<210> 4

<211> 825

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 4

atggcatgcc ctggcttcct gtgggcactt gtgatctcca cctgtcttga atttagcatg 60

gctcagacag tcactcagtc tcaaccagag atgtctgtgc aggaggcaga gaccgtgacc 120

ctgagctgca catatgacac cagtgagagt gattattatt tattctggta caagcagcct 180

cccagcaggc agatgattct cgttattcgc caagaagctt ataagcaaca gaatgcaaca 240

gagaatcgtt tctctgtgaa cttccagaaa gcagccaaat ccttcagtct caagatctca 300

gactcacagc tgggggatgc cgcgatgtat ttctgtgctt ataggagctt ccgccaggat 360

tcaggaaaca cacctcttgt ctttggaaag ggcacaagac tttctgtgat tgcaaacatc 420

cagaaccctg agccagccgt gtaccagctg aaggacccca gaagccagga cagcaccctg 480

tgcctgttca ccgacttcga cagccagatc aacgtgccca agaccatgga aagcggcacc 540

ttcatcaccg acaagacagt gctggatatg aaggccatgg acagcaagag caacggcgcc 600

attgcctggt ccaatcagac aagcttcaca tgccaggaca tcttcaaaga gacaaacgcc 660

acctacccca gcagcgacgt gccctgtgat gccaccctga ccgagaagtc cttcgagaca 720

gacatgaacc tgaatttcca gaacctgtcc gtgatgggcc tgagaatcct gctgctgaag 780

gtggccggct tcaacctgct gatgaccctg agactgtggt ccagc 825

<210> 5

<211> 109

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 5

Met Gly Ser Arg Leu Leu Cys Trp Val Leu Leu Cys Leu Leu Gly Ala

1 5 10 15

Gly Pro Val Lys Ala Gly Val Thr Gln Thr Pro Arg Tyr Leu Ile Lys

20 25 30

Thr Arg Gly Gln Gln Val Thr Leu Ser Cys Ser Pro Ile Ser Gly His

35 40 45

Arg Ser Val Ser Trp Tyr Gln Gln Thr Pro Gly Gln Gly Leu Gln Phe

50 55 60

Leu Phe Glu Tyr Phe Ser Glu Thr Gln Arg Asn Lys Gly Asn Phe Pro

65 70 75 80

Gly Arg Phe Ser Gly Arg Gln Phe Ser Asn Ser Arg Ser Glu Met Asn

85 90 95

Val Ser Thr Leu Glu Leu Gly Asp Ser Ala Leu Tyr Leu

100 105

<210> 6

<211> 327

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 6

atgggctcca ggctgctctg ttgggtgctg ctttgtctcc tgggagcagg cccagtaaag 60

gctggagtca ctcaaactcc aagatatctg atcaaaacga gaggacagca agtgacactg 120

agctgctccc ctatctctgg gcataggagt gtatcctggt accaacagac cccaggacag 180

ggccttcagt tcctctttga atacttcagt gagacacaga gaaacaaagg aaacttccct 240

ggtcgattct cagggcgcca gttctctaac tctcgctctg agatgaatgt gagcaccttg 300

gagctggggg actcggccct ttatctt 327

<210> 7

<211> 303

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 7

Met Gly Ser Arg Leu Leu Cys Trp Val Leu Leu Cys Leu Leu Gly Ala

1 5 10 15

Gly Pro Val Lys Ala Gly Val Thr Gln Thr Pro Arg Tyr Leu Ile Lys

20 25 30

Thr Arg Gly Gln Gln Val Thr Leu Ser Cys Ser Pro Ile Ser Gly His

35 40 45

Arg Ser Val Ser Trp Tyr Gln Gln Thr Pro Gly Gln Gly Leu Gln Phe

50 55 60

Leu Phe Glu Tyr Phe Ser Glu Thr Gln Arg Asn Lys Gly Asn Phe Pro

65 70 75 80

Gly Arg Phe Ser Gly Arg Gln Phe Ser Asn Ser Arg Ser Glu Met Asn

85 90 95

Val Ser Thr Leu Glu Leu Gly Asp Ser Ala Leu Tyr Leu Cys Lys Asn

100 105 110

Ser Arg Thr Asn Tyr Gly Tyr Thr Phe Gly Ser Gly Thr Arg Leu Thr

115 120 125

Val Val Glu Asp Leu Arg Asn Val Thr Pro Pro Lys Val Ser Leu Phe

130 135 140

Glu Pro Ser Lys Ala Glu Ile Ala Asn Lys Gln Lys Ala Thr Leu Val

145 150 155 160

Cys Leu Ala Arg Gly Phe Phe Pro Asp His Val Glu Leu Ser Trp Trp

165 170 175

Val Asn Gly Lys Glu Val His Ser Gly Val Ser Thr Asp Pro Gln Ala

180 185 190

Tyr Lys Glu Ser Asn Tyr Ser Tyr Cys Leu Ser Ser Arg Leu Arg Val

195 200 205

Ser Ala Thr Phe Trp His Asn Pro Arg Asn His Phe Arg Cys Gln Val

210 215 220

Gln Phe His Gly Leu Ser Glu Glu Asp Lys Trp Pro Glu Gly Ser Pro

225 230 235 240

Lys Pro Val Thr Gln Asn Ile Ser Ala Glu Ala Trp Gly Arg Ala Asp

245 250 255

Cys Gly Ile Thr Ser Ala Ser Tyr His Gln Gly Val Leu Ser Ala Thr

260 265 270

Ile Leu Tyr Glu Ile Leu Leu Gly Lys Ala Thr Leu Tyr Ala Val Leu

275 280 285

Val Ser Gly Leu Val Leu Met Ala Met Val Lys Lys Lys Asn Ser

290 295 300

<210> 8

<211> 909

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 8

atgggctcca ggctgctctg ttgggtgctg ctttgtctcc tgggagcagg cccagtaaag 60

gctggagtca ctcaaactcc aagatatctg atcaaaacga gaggacagca agtgacactg 120

agctgctccc ctatctctgg gcataggagt gtatcctggt accaacagac cccaggacag 180

ggccttcagt tcctctttga atacttcagt gagacacaga gaaacaaagg aaacttccct 240

ggtcgattct cagggcgcca gttctctaac tctcgctctg agatgaatgt gagcaccttg 300

gagctggggg actcggccct ttatctttgc aaaaatagcc ggactaacta tggctacacc 360

ttcggttcgg ggaccaggtt aaccgttgta gaggatctga gaaacgtgac cccccccaag 420

gtgtccctgt tcgagcctag caaggccgag atcgccaaca aacagaaagc caccctcgtg 480

tgcctggcca gaggcttctt ccccgaccac gtggaactgt cttggtgggt caacggcaaa 540

gaggtgcaca gcggcgtgtc caccgatccc caggcctaca aagagagcaa ctacagctac 600

tgcctgagca gcaggctgcg ggtgtccgcc accttctggc acaacccccg gaaccacttc 660

agatgccagg tgcagtttca cggcctgagc gaagaggaca agtggcccga gggaagcccc 720

aagcccgtga cacagaatat cagcgccgaa gcctggggca gagccgactg tggaatcacc 780

agcgccagct atcaccaggg cgtgctgagc gccacaatcc tgtacgagat cctgctgggc 840

aaggccaccc tgtacgccgt gctggtgtct ggcctggtgc tgatggccat ggtcaagaag 900

aagaacagc 909

<210> 9

<211> 9

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 9

Ala Leu Ile Val Phe Trp Lys Lys Arg

1 5

<210> 10

<211> 7

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 10

Thr Ser Glu Ser Asp Tyr Tyr

1 5

<210> 11

<211> 8

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 11

Gln Glu Ala Tyr Lys Gln Gln Asn

1 5

<210> 12

<211> 17

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 12

Cys Ala Tyr Arg Ser Phe Arg Gln Asp Ser Gly Asn Thr Pro Leu Val

1 5 10 15

Phe

<210> 13

<211> 5

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 13

Ser Gly His Arg Ser

1 5

<210> 14

<211> 6

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 14

Tyr Phe Ser Glu Thr Gln

1 5

<210> 15

<211> 12

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 15

Cys Lys Asn Ser Arg Thr Asn Tyr Gly Tyr Thr Phe

1 5 10

<210> 16

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 16

accagtgaga gtgattatta t 21

<210> 17

<211> 24

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 17

caagaagctt ataagcaaca gaat 24

<210> 18

<211> 51

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 18

tgtgcttata ggagcttccg ccaggattca ggaaacacac ctcttgtctt t 51

<210> 19

<211> 15

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 19

tctgggcata ggagt 15

<210> 20

<211> 18

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 20

tacttcagtg agacacag 18

<210> 21

<211> 36

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 21

tgcaaaaata gccggactaa ctatggctac accttc 36

<210> 22

<211> 822

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 22

atgggggcag gtgccaccgg ccgcgccatg gacgggccgc gcctgctgct gttgctgctt 60

ctgggggtgt cccttggagg tgccaaggag gcatgcccca caggcctgta cacacacagc 120

ggtgagtgct gcaaagcctg caacctgggc gagggtgtgg cccagccttg tggagccaac 180

cagaccgtgt gtgagccctg cctggacagc gtgacgttct ccgacgtggt gagcgcgacc 240

gagccgtgca agccgtgcac cgagtgcgtg gggctccaga gcatgtcggc gccgtgcgtg 300

gaggccgacg acgccgtgtg ccgctgcgcc tacggctact accaggatga gacgactggg 360

cgctgcgagg cgtgccgcgt gtgcgaggcg ggctcgggcc tcgtgttctc ctgccaggac 420

aagcagaaca ccgtgtgcga ggagtgcccc gacggcacgt attccgacga ggccaaccac 480

gtggacccgt gcctgccctg caccgtgtgc gaggacaccg agcgccagct ccgcgagtgc 540

acacgctggg ccgacgccga gtgcgaggag atccctggcc gttggattac acggtccaca 600

cccccagagg gctcggacag cacagccccc agcacccagg agcctgaggc acctccagaa 660

caagacctca tagccagcac ggtggcaggt gtggtgacca cagtgatggg cagctcccag 720

cccgtggtga cccgaggcac caccgacaac ctcatccctg tctattgctc catcctggct 780

gctgtggttg tgggccttgt ggcctacata gccttcaaga gg 822

<210> 23

<211> 2691

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 23

atgggggcag gtgccaccgg ccgcgccatg gacgggccgc gcctgctgct gttgctgctt 60

ctgggggtgt cccttggagg tgccaaggag gcatgcccca caggcctgta cacacacagc 120

ggtgagtgct gcaaagcctg caacctgggc gagggtgtgg cccagccttg tggagccaac 180

cagaccgtgt gtgagccctg cctggacagc gtgacgttct ccgacgtggt gagcgcgacc 240

gagccgtgca agccgtgcac cgagtgcgtg gggctccaga gcatgtcggc gccgtgcgtg 300

gaggccgacg acgccgtgtg ccgctgcgcc tacggctact accaggatga gacgactggg 360

cgctgcgagg cgtgccgcgt gtgcgaggcg ggctcgggcc tcgtgttctc ctgccaggac 420

aagcagaaca ccgtgtgcga ggagtgcccc gacggcacgt attccgacga ggccaaccac 480

gtggacccgt gcctgccctg caccgtgtgc gaggacaccg agcgccagct ccgcgagtgc 540

acacgctggg ccgacgccga gtgcgaggag atccctggcc gttggattac acggtccaca 600

cccccagagg gctcggacag cacagccccc agcacccagg agcctgaggc acctccagaa 660

caagacctca tagccagcac ggtggcaggt gtggtgacca cagtgatggg cagctcccag 720

cccgtggtga cccgaggcac caccgacaac ctcatccctg tctattgctc catcctggct 780

gctgtggttg tgggccttgt ggcctacata gccttcaaga gggagggcag aggaagtctg 840

ctaacatgcg gtgacgtcga ggagaatcct ggcccagtcg acatgggctc caggctgctc 900

tgttgggtgc tgctttgtct cctgggagca ggcccagtaa aggctggagt cactcaaact 960

ccaagatatc tgatcaaaac gagaggacag caagtgacac tgagctgctc ccctatctct 1020

gggcatagga gtgtatcctg gtaccaacag accccaggac agggccttca gttcctcttt 1080

gaatacttca gtgagacaca gagaaacaaa ggaaacttcc ctggtcgatt ctcagggcgc 1140

cagttctcta actctcgctc tgagatgaat gtgagcacct tggagctggg ggactcggcc 1200

ctttatcttt gcaaaaatag ccggactaac tatggctaca ccttcggttc ggggaccagg 1260

ttaaccgttg tagaggatct gagaaacgtg acccccccca aggtgtccct gttcgagcct 1320

agcaaggccg agatcgccaa caaacagaaa gccaccctcg tgtgcctggc cagaggcttc 1380

ttccccgacc acgtggaact gtcttggtgg gtcaacggca aagaggtgca cagcggcgtg 1440

tccaccgatc cccaggccta caaagagagc aactacagct actgcctgag cagcaggctg 1500

cgggtgtccg ccaccttctg gcacaacccc cggaaccact tcagatgcca ggtgcagttt 1560

cacggcctga gcgaagagga caagtggccc gagggaagcc ccaagcccgt gacacagaat 1620

atcagcgccg aagcctgggg cagagccgac tgtggaatca ccagcgccag ctatcaccag 1680

ggcgtgctga gcgccacaat cctgtacgag atcctgctgg gcaaggccac cctgtacgcc 1740

gtgctggtgt ctggcctggt gctgatggcc atggtcaaga agaagaacag cggcagcggc 1800

gccaccaact ttagcctgct gaaacaggcc ggcgacgtgg aagagaaccc tggccccacg 1860

cgtatggcat gccctggctt cctgtgggca cttgtgatct ccacctgtct tgaatttagc 1920

atggctcaga cagtcactca gtctcaacca gagatgtctg tgcaggaggc agagaccgtg 1980

accctgagct gcacatatga caccagtgag agtgattatt atttattctg gtacaagcag 2040

cctcccagca ggcagatgat tctcgttatt cgccaagaag cttataagca acagaatgca 2100

acagagaatc gtttctctgt gaacttccag aaagcagcca aatccttcag tctcaagatc 2160

tcagactcac agctggggga tgccgcgatg tatttctgtg cttataggag cttccgccag 2220

gattcaggaa acacacctct tgtctttgga aagggcacaa gactttctgt gattgcaaac 2280

atccagaacc ctgagccagc cgtgtaccag ctgaaggacc ccagaagcca ggacagcacc 2340

ctgtgcctgt tcaccgactt cgacagccag atcaacgtgc ccaagaccat ggaaagcggc 2400

accttcatca ccgacaagac agtgctggat atgaaggcca tggacagcaa gagcaacggc 2460

gccattgcct ggtccaatca gacaagcttc acatgccagg acatcttcaa agagacaaac 2520

gccacctacc ccagcagcga cgtgccctgt gatgccaccc tgaccgagaa gtccttcgag 2580

acagacatga acctgaattt ccagaacctg tccgtgatgg gcctgagaat cctgctgctg 2640

aaggtggccg gcttcaacct gctgatgacc ctgagactgt ggtccagctg a 2691

Claims

1.一种T细胞受体，其特征在于，所述T细胞受体（TCR）由TCR α链和TCR β链所组成；其中，TCR α链可变域3个互补决定区(CDR) αCDR1、αCDR2和αCDR3的氨基酸序列分别如SEQ IDNO：10～12所示；TCR β链可变域3个互补决定区(CDR) βCDR1、βCDR2和βCDR3的氨基酸序列分别如SEQ ID NO：13～15所示。

2.根据权利要求1所述的T细胞受体，其特征在于，其具有结合CT83抗原短肽CT83_14-22 /HLA-A*11：01复合物的性质，其中所述CT83抗原短肽CT83_14-22氨基酸序列如SEQ ID NO：9所示。

3.根据权利要求1或2所述的T细胞受体，其特征在于，TCR α链可变域的氨基酸序列如SEQ ID NO：1所示。

4.根据权利要求3所述的T细胞受体，其特征在于，TCR α链的氨基酸序列如SEQ ID NO：3所示。

5.根据权利要求1或2所述的T细胞受体，其特征在于，TCR β链可变域的氨基酸序列如SEQ ID NO：5所示。

6.根据权利要求5所述的T细胞受体，其特征在于，TCR β链的氨基酸序列如SEQ ID NO：7 所示。

7.一种核酸分子，其特征在于，所述核酸分子编码如权利要求 1～6 任一项所述的 T细胞受体。

8.根据权利要求7所述的核酸分子，其特征在于，所述核酸分子包含SEQ ID NO：2所示的编码TCR α链可变域的核苷酸序列和/或SEQ ID NO：6所示的编码TCR β链可变域的核苷酸序列。

9.根据权利要求7所述的核酸分子，其特征在于，所述核酸分子包含SEQ ID NO：4所示的编码TCR α链的核苷酸序列和/或SEQ ID NO：8所示的编码TCR β链的核苷酸序列。

10.一种表达载体，其特征在于，所述表达载体用于表达权利要求1所述的T细胞受体，并且，所述表达载体包含权利要求7所述的核酸分子。

11.根据权利要求10所述的表达载体，其特征在于，所述表达载体是病毒载体。

12.一种核酸分子改造的宿主细胞，其特征在于，包含权利要求 1～6 中任一项所述的 T 细胞受体，权利要求 7～9 中任一项所述的核酸分子，或权利要求 10～11 中任一项所述的表达载体。

13.权利要求 1～6 中任一项所述的 T 细胞受体，权利要求 7～9 中任一项所述的核酸分子，或权利要求 10～11中任一项所述的表达载体在制备靶向表达癌症睾丸抗原CT83和HLA-A*11:01分子的恶性肿瘤治疗药物中的应用。

14.根据权利要求13所述的应用，其特征在于，所述恶性肿瘤为胃癌、肺癌、肝癌、食道癌、膀胱癌、前列腺癌、乳腺癌、结直肠癌、卵巢癌、宫颈癌、多发性骨髓瘤、恶性黑色素瘤、脑胶质瘤、软组织肉瘤、睾丸癌、胰腺癌、头颈鳞状细胞癌、子宫内膜癌、胆管癌、肾嫌色细胞癌、肾透明细胞癌、甲状腺癌。