CN117402233A - 抗原短肽用于筛选治疗与hpv相关的疾病的药物中的用途及其筛选的tcr - Google Patents

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Abstract

本申请公开了抗原短肽用于筛选治疗与HPV相关的疾病的药物中的用途及其筛选的TCR，所述抗原短肽的氨基酸序列如SEQ ID NO:1所示。本申请所述的抗原短肽能够筛选特异性的T细胞受体(TCR)，同时转导了所述TCR的T细胞能够被特异性激活并且对表达A1101和HPV的肿瘤细胞具有很强的杀伤作用，可以用于宫颈癌等HPV阳性的肿瘤的免疫治疗，并且转导了本申请所述TCR的T细胞对表达E7的细胞系有很强的激活反应，对不表达E7的细胞系没有激活反应，并且对表达E7的细胞系有很强的杀伤功能，并能够有效抑制E7阳性肿瘤的生长。

Description

抗原短肽用于筛选治疗与HPV相关的疾病的药物中的用途及 其筛选的TCR
本申请是申请日为2022年5月10日、申请号为202210503907.4、发明名称为“抗原短肽用于筛选治疗与HPV相关的疾病的药物中的用途及其筛选的TCR”的中国专利申请的分案申请。
技术领域
本申请涉及医药技术领域，尤其涉及抗原短肽用于筛选治疗与HPV相关的疾病的药物中的用途及其筛选的TCR。
背景技术
人类乳头瘤病毒(Human Papillomavirus，HPV)是一种DNA病毒，属于乳头瘤病毒科乳头瘤病毒属。该类病毒感染人体的表皮与黏膜组织，目前约有170种类型的HPV被判别出来，有些时候HPV入侵人体后会引起疣甚至癌症，但大多数时候则没有任何临床症状。
HPV导致癌症的一个重要因素是高危型HPV的持续感染，如HPV16、HPV18等。由高风险HPV编码的E6和E7蛋白可以分别抑制抑癌基因p53和Rb蛋白的活性，从而导致细胞周期异常，发生癌变。高危型HPV与90％的宫颈癌和肛门癌，40％至60％的阴道癌和阴茎癌有关，同时根据地理特性，还可能与60％的口咽癌相关。
宫颈癌是最常见的女性生殖道恶性肿瘤，全球发病率在女性恶性肿瘤中居第二位，且发展中国家的宫颈癌发病率显著高于高达国家。尽管对于早期宫颈癌，手术和放化疗治疗效果较好，但是一半以上的患者初次就诊即被诊断为局部晚期宫颈癌。30％-70％的局部晚期宫颈癌患者会出现复发及(或)远处转移，而对于局部进展期和转移性宫颈癌，传统治疗的疗效十分有限，其五年生存率仅为57.1％和17.3％。
特异性T细胞免疫治疗是指利用针对肿瘤抗原的特异性T细胞来杀伤肿瘤细胞的方法，是一种高度个性化的肿瘤免疫治疗方法。由于肿瘤局部免疫抑制微环境的存在，病人体内的自身T细胞杀伤肿瘤的功能有限。因此，人们试图通过对T细胞进行基因改造的方法提高其杀伤肿瘤的能力。TCR-T和CAR-T均为基因修饰过的细胞治疗药物，通过转入的T细胞受体(T cell receptor,TCR)或嵌合抗原受体(CAR)基因与相应靶点结合后，即可激活T细胞，利用T细胞释放的颗粒酶、穿孔素、细胞因子等清除肿瘤细胞；但TCR-T和CAR-T的显著的不同点在于：CAR-T的靶点是细胞表面的膜蛋白，而TCR-T的靶点则是抗原短肽-MHC复合物(peptide-major histocompatibility complex,pMHC)。
HPV相关蛋白是宫颈癌最理想的T细胞免疫治疗靶点。TCR识别的靶点是“抗原短肽-MHC分子复合物”。TCR同时具有MHC限制性，理论上一个TCR分子仅能够特异性识别某一特定MHC递呈的短肽。MHC具有多态性，目前已发现的人类MHC(又称为人类白细胞抗原，human leukocyte antigen,HLA)等位基因数量超过15000个，且特定HLA在不同人群中的出现频率有很大差异，中国人群中最常见的HLA类型为HLA-A1101。HLAI类分子呈递的短肽长度为8-11个氨基酸，HLA II类分子呈递的短肽长度为12-24个氨基酸，这些抗原短肽的发现及鉴定是TCR-T治疗的前提。尽管短肽是否与HLA结合可以通过亲和力预测、HLA结合力测定等获得，但是该短肽能否被表达HPV的肿瘤细胞天然递呈，才是决定该短肽特异性的TCR能否用于肿瘤治疗的关键。
因此，本领域技术人员致力于寻找A1101限制性HPV抗原短肽，以及将发现的抗原短肽用于筛选可以特异性识别HPV阳性肿瘤细胞的TCR，从而使他们在T细胞免疫治疗中发挥作用。
发明内容
本申请的目的在于提供一种抗原短肽用于筛选治疗与HPV相关的疾病的药物中的用途以及所筛选的T细胞受体(TCR)，所述抗原短肽筛选特异性T细胞抗体，转录了所述TCR的T细胞能够被特异性激活并且对表达A1101和HPV的肿瘤细胞具有很强的杀伤作用。
本申请具体技术方案如下：
1.抗原短肽用于筛选治疗与HPV相关的疾病的药物中的用途，所述抗原短肽的氨基酸序列如SEQ ID NO:1所示。
2.根据项1所述的用途，其中，所述与HPV相关的疾病为宫颈癌、头颈癌、肛门癌、阴茎癌、阴道癌或外阴癌。
3.抗原短肽用于筛选治疗宫颈癌、头颈癌、肛门癌、阴茎癌、阴道癌或外阴癌的药物中的用途，所述抗原短肽的氨基酸序列如SEQ ID NO:1所示。
4.根据项1-3中任一项所述的用途，其中，所述药物为用于与包含所述抗原短肽的抗原短肽-HLA-A1101复合物结合的T细胞受体(TCR)。
5.一种T细胞受体(TCR)，其中，所述TCR包含含有可变区的α链和/或含有可变区的β链，α链的可变区包含氨基酸序列为如SEQ ID NO:2、SEQ ID NO:8或SEQ ID NO:14所示的互补决定区1(CDR1)；和/或
氨基酸序列为如SEQ ID NO:3、SEQ ID NO:9或SEQ ID NO:15所示的互补决定区2(CDR2)。
6.根据项5所述的T细胞受体(TCR)，其中，所述β链的可变区包含氨基酸序列为如SEQ ID NO:5、SEQ ID NO:11或SEQ ID NO:17所示的互补决定区1(CDR1)；和/或
氨基酸序列为如SEQ ID NO:6、SEQ ID NO:12或SEQ ID NO:18所示的互补决定区2(CDR2)。
7.根据项5或6所述的T细胞受体(TCR)，其中，所述α链的可变区包含含有氨基酸序列为如SEQ ID NO:4、SEQ ID NO:10或SEQ ID NO:16所示的互补决定区3(CDR3)；和/或
所述β链的可变区包含含有氨基酸序列为如SEQ ID NO:7、SEQ ID NO:13或SEQ IDNO:19所示的互补决定区3(CDR3)。
8.根据项5-7中任一项所述的T细胞受体(TCR)，所述α链的可变区还包括第一先导序列；和/或
所述β链的可变区还包括第二先导序列。
9.根据项5-8中任一项所述的T细胞受体(TCR)，其中，所述α链可变区的氨基酸序列如SEQ ID NO:26、SEQ ID NO:28或SEQ ID NO:30所示或者与SEQ ID NO:26、SEQ ID NO:28或SEQ ID NO:30具有至少90％序列相同性的氨基酸序列，和/或所述β链的可变区的氨基酸序列如SEQ ID NO:27、SEQ ID NO:29或SEQ ID NO:31所示或者与SEQ ID NO:27、SEQ IDNO:29或SEQ ID NO:31具有至少90％序列相同性的氨基酸序列。
10.根据项5-9中任一项所述的T细胞受体(TCR)，其中，所述α链还包含α恒定区和/或所述β链还包含β恒定区，优选地，所述恒定区为小鼠恒定区或人恒定区。
11.根据项5-10中任一项所述的T细胞受体(TCR)，其中，所述TCR是分离的或纯化的或者是重组的。
12.根据项5-11中任一项所述的T细胞受体(TCR)，其中，所述TCR是人的。
13.根据项5-12中任一项所述的T细胞受体(TCR)，其中，所述TCR是单克隆的。
14.根据项5-13中任一项所述的T细胞受体(TCR)，其中，所述TCR是单链。
15.根据项5-14中任一项所述的T细胞受体(TCR)，其中，所述TCR包含两条链。
16.根据项5-15中任一项所述的T细胞受体(TCR)，其中，所述TCR为细胞结合的形式或为可溶的形式，优选为可溶的形式。
17.根据项5-16中任一项所述的T细胞受体(TCR)，其中，所述TCR与抗原短肽-HLA-A1101复合物结合，优选地，所述抗原短肽的氨基酸序列如SEQ ID NO:1所示。
18.一种核酸分子，其中，所述核酸分子包含编码项5-17中任一项所述的TCR或者所述TCR的α链或β链。
19.根据项18所述的核酸分子，其中编码α链的核苷酸序列包含如SEQ ID NO:34、SEQ ID NO:36或SEQ ID NO:38所示的核苷酸序列；和/或
编码β链的核苷酸序列包含如SEQ ID NO:35、SEQ ID NO:37或SEQ ID NO:39所示的核苷酸序列。
20.一种载体，其中，所述载体包含项18或19所述的核酸分子。
21.根据项20所述的载体，其中，所述载体为表达载体。
22.根据项20或21所述的载体，其中，所述载体为病毒载体，优选为逆转录病毒载体。
23.根据项22所述的载体，其中，所述病毒载体为慢病毒载体。
24.一种工程化细胞，其包含项5-17中任一项所述的TCR、项18-19中任一项所述的核酸分子或者项20-23中任一项所述的载体。
25.根据项24所述的工程化细胞，其中，所述TCR对所述细胞是异源的。
26.根据项24或25所述的工程化细胞，其中，所述工程化细胞是细胞系。
27.根据项24-26中任一项所述的工程化细胞，其中，所述工程化细胞是获自受试者的原代细胞，优选地，所述受试者为哺乳动物受试者，优选为人。
28.根据项24-27中任一项所述的工程化细胞，其中，所述工程化细胞是T细胞或NK细胞，优选地，所述T细胞是从外周血分离的T细胞。
29.根据项28所述的工程化细胞，其中，所述T细胞为CD8+或CD4+。
30.一种生产项24-29中任一项所述的工程化细胞的方法，其包括在体外或离体地将项18-19中任一项所述的核酸分子或者项20-23中任一项所述的载体引入细胞中。
31.根据项30所述的方法，其中，所述载体为病毒载体，并且所述引入是通过转导进行的。
32.一种药物组合物，其包含项5-17中任一项所述的T细胞受体(TCR)、项18-19任一项所述的核酸分子、项20-23中任一项所述的载体或者项24-29中任一项所述的工程化细胞。
33.根据项32所述的药物组合物，其还包含药学上可接受的载体或佐剂。
34.项5-17中任一项所述的T细胞受体(TCR)、项18-19中任一项所述的核酸分子、项20-23中任一项所述的载体、项24-29中任一项所述的工程化细胞或者项32-33中任一项所述的药物组合物在制备治疗与HPV相关的疾病的药物中的用途。
35.根据项34所述的用途，其中，与HPV相关的疾病为HPV慢性感染、宫颈上皮内瘤样病变、宫颈癌、头颈癌、肛门癌、阴茎癌、阴道癌或外阴癌。
发明的效果
本申请所述的抗原短肽能够筛选特异性的T细胞受体(TCR)，同时转导了所述TCR的T细胞能够被特异性激活并且对表达A1101和HPV的肿瘤细胞具有很强的杀伤作用，可以用于宫颈癌等HPV阳性的肿瘤的免疫治疗。
并且转导了本申请所述TCR的T细胞对表达E7的细胞系有很强的激活反应，对不表达E7的细胞系没有激活反应，并且对表达E7的细胞系有很强的杀伤功能，并能够有效抑制E7阳性肿瘤的生长。
附图说明
图1是实施例1中克隆IVCPICSQK抗原短肽特异性T细胞的示意图。
图2是实施例3中使用流式细胞仪鉴定转染阳性率的示意图。
图3是实施例3中转导本申请所述的TCR的T细胞对负载IVCPICSQK抗原短肽的靶细胞起反应的NFAT的表达的示意图。
图4是实施例4中使用流式细胞仪鉴定转染阳性率的示意图。
图5是实施例4中转导本申请所述的TCR的T细胞的细胞增殖的细胞指数的示意图。
图6是实施例5中接种转导本申请所述的TCR的T细胞后肿瘤体积的示意图，其中，图6A是接种T细胞后肿瘤体积随时间变化的示意图，图6B是接种含有不同TCR的T细胞后肿瘤重量的柱状图。
具体实施方式
下面结合附图所描述的实施方式对本申请做以详细说明，其中所有附图中相同的数字表示相同的特征。虽然附图中显示了本申请的具体实施例，然而应当理解，可以以各种形式实现本申请而不应被这里阐述的实施例所限制。相反，提供这些实施例是为了能够更透彻地理解本申请，并且能够将本申请的范围完整的传达给本领域的技术人员。
需要说明的是，在说明书及权利要求当中使用了某些词汇来指称特定组件。本领域技术人员应可以理解，技术人员可能会用不同名词来称呼同一个组件。本说明书及权利要求并不以名词的差异作为区分组件的方式，而是以组件在功能上的差异作为区分的准则。如在通篇说明书及权利要求当中所提及的“包含”或“包括”为开放式用语，故应解释成“包含但不限定于”。说明书后续描述为实施本申请的较佳实施方式，然而所述描述乃以说明书的一般原则为目的，并非用以限定本申请的范围。本申请的保护范围当视所附权利要求所界定者为准。
本申请提供了抗原短肽用于筛选治疗与HPV相关的疾病的药物中的用途，所述抗原短肽的氨基酸序列如SEQ ID NO:1所示。
SEQ ID NO:1的序列如下：IVCPICSQK。
在一个实施方案中，所述与HPV相关的疾病为宫颈癌、头颈癌、肛门癌、阴茎癌、阴道癌或外阴癌等。
本申请提供了抗原短肽用于筛选治疗宫颈癌、头颈癌、肛门癌、阴茎癌、阴道癌或外阴癌的药物中的用途，所述抗原短肽的氨基酸序列如SEQ ID NO:1所示。
在一个实施方案中，所述药物为用于与包含所述抗原短肽的抗原短肽-HLA-A1101复合物结合的T细胞受体(TCR)。
即所述T细胞受体是通过所述抗原短肽的筛选得到，所述T细胞受体(TCR)与与IVCPICSQK-HLA-A1101复合物结合。
所述T细胞受体或TCR是呈递在主组织相容性复合体(MHC)上的特异性抗原肽的唯一受体，在免疫系统中，通过抗原特异性的TCR与pMHC复合物的结合引发T细胞与抗原呈递细胞(APC)直接的物理接触，然后T细胞及APC两者的其他细胞表面分子就发生相互作用，这就引起了一系列后续的细胞信号传递和其他生理反应，从而使得不同抗原特异性的T细胞对靶细胞发挥免疫效应
所述TCR是含有可变α和β链或可变γ和δ链的分子，并且所述分子能够结合至MHC分子的肽特异性结合，在一些实施方案中，TCR呈αβ形式。通常，以αβ和γδ形式存在的TCR在结构上总体上相似，但是表达它们的T细胞可以具有不同的解剖学位置或功能，TCR可以在细胞表面上发现或以可溶形式发现。通常，在T细胞(T淋巴细胞)的表面上发现TCR，在此处它通常负责识别结合至主要组织相容性复合物(MHC)分子的抗原。
TCR的可变结构域含有互补决定区(CDR)，其通常是肽、MHC和/或MHC-肽复合物的抗原识别以及结合能力和特异性的主要贡献者，TCR的CDR或其组合形成给定TCR分子的全部或基本上全部的抗原结合位点，TCR的可变区内的各个CDR通常由框架区(FR)隔开。其中，CDR3是负责抗原结合或特异性的主要CDR，或者在给定TCR可变区上在三个CDR中对于抗原识别和/或对于与肽-MHC复合物的经加工肽部分的相互作用最重要，在一些情况下，α链的CDR1可以与某些抗原肽的N末端部分相互作用；在一些情况下，β链的CDR1可以与某些抗原肽的C末端部分相互作用；在一些情况下，CDR2对于MHC-肽复合物的MHC部分的相互作用或识别具有最强的作用或者是主要的负责CDR；在一些情况下，β链的可变区抗原含有其他高变区(CDR4或HVR4)，其通常参与超抗原结合而非抗原识别。
所述-IVCPICSQK-HLA-A1101复合物是指HLA-A1101和抗原短肽IVCPICSQK结合的复合物，蛋白质在细胞中被蛋白酶体降解为不同长度的多肽，一部分多肽与HLA结合形成复合物被递呈至细胞表面。所述TCR识别的IVCPICSQK-HLA-A1101复合物可以表达于细胞膜上，也可以以可溶性蛋白的形式存在于溶液中。
所述HLAA1101的氨基酸序列如SEQ ID NO:40所示，其氨基酸序列为：
MAVMAPRTLLLLLSGALALTQTWAGSHSMRYFYTSVSRPGRGEPRFIAVGYVDDTQFVRFDSDAASQRMEPRAPWIEQEGPEYWDQET
RNVKAQSQTDRVDLGTLRGYYNQSEDGSHTIQIMYGCDVGPDGRFLRGYRQDAYDGKDYIALNEDLRSWTAADMAAQITKRKWEAAHAAE
QQRAYLEGRCVEWLRRYLENGKETLQRTDPPKTHMTHHPISDHEATLRCWALGFYPAEITLTWQRDGEDQTQDTELVETRPAGDGTFQKWA
AVVVPSGEEQRYTCHVQHEGLPKPLTLRWELSSQPTIPIVGIIAGLVLLGAVITGAVVAAVMWRRKSSDRKGGSYTQAASSDSAQGSDVSLTA
CKVSR
本申请提供了一种T细胞受体(TCR)，其中，所述TCR包含含有可变区的α链和/或含有可变区的β链，α链的可变区包含氨基酸序列为如SEQ ID NO:2、SEQ ID NO:8或SEQ IDNO:14所示的互补决定区1(CDR1)；和/或
氨基酸序列为如SEQ ID NO:3、SEQ ID NO:9或SEQ ID NO:15所示的互补决定区2(CDR2)。
SEQ ID NO:2的氨基酸序列为：TSDPSYG
SEQ ID NO:8所示的氨基酸序列为：DSVNN
SEQ ID NO:14所示的氨基酸序列为：NYSPAY
SEQ ID NO:3所示的氨基酸序列为：QGSYDQQN
SEQ ID NO:9所示的氨基酸序列为：IPSGT
SEQ ID NO:15所示的氨基酸序列为：IRENEKE
在一个实施方案中，所述β链的可变区包含氨基酸序列为如SEQ ID NO:5、SEQ IDNO:11或SEQ ID NO:17所示的互补决定区1(CDR1)；和/或
氨基酸序列为如SEQ ID NO:6、SEQ ID NO:12或SEQ ID NO:18所示的互补决定区2(CDR2)。
SEQ ID NO:5所示的氨基酸序列为：LNHNV
SEQ ID NO:11所示的氨基酸序列为：MNHEY
SEQ ID NO:17所示的氨基酸序列为：GTSNPN
SEQ ID NO:6所示的氨基酸序列为：YYDKDF
SEQ ID NO:12所示的氨基酸序列为：SMNVEV
SEQ ID NO:18所示的氨基酸序列为：SVGIG
在一个实施方案中，所述α链的可变区包含含有氨基酸序列为如SEQ ID NO:4、SEQID NO:10或SEQ ID NO:16所示的互补决定区3(CDR3)；和/或
所述β链的可变区包含含有氨基酸序列为如SEQ ID NO:7、SEQ ID NO:13或SEQ IDNO:19所示的互补决定区3(CDR3)。
SEQ ID NO:4所示的氨基酸序列为：AMRIDAGGTSYGKLT
SEQ ID NO:10所示的氨基酸序列为：AVEGDNAGGTSYGKLT
SEQ ID NO:16所示的氨基酸序列为：ALAGYQKVT
SEQ ID NO:7所示的氨基酸序列为：ATSRDRVNTGELF
SEQ ID NO:13所示的氨基酸序列为：ASSWSTSYGYT
SEQ ID NO:19所示的氨基酸序列为：AWSLRTSGSEQF。
在一个实施方案中，所述TCR能够与所述TCR能够与抗原短肽-HLA-A1101复合物结合，优选地，所述抗原短肽的氨基酸序列如SEQ ID NO:1所示。
抗原短肽-HLA-A1101复合物是指HLA-A1101和抗原短肽结合的复合物。蛋白质在细胞中被蛋白酶体降解为不同长度的多肽，一部分多肽与HLA结合形成复合物被递呈至细胞表面。所述TCR识别的抗原短肽-HLA-A1101复合物可以表达于细胞膜上，也可以以可溶性蛋白的形式存在于溶液中。
在一个实施方案中，所述α链的可变区还包括第一先导序列；和/或
所述β链的可变区还包括第二先导序列。
所述α链的可变区的第一先导序列和所述β链的可变区的第二先导序列是本领域技术人员公知的，例如所述α链的可变区的第一先导序列可以使用氨基酸序列如SEQ IDNO:20、SEQ ID NO:22或SEQ ID NO:24所示的先导序列，所述β链的可变区的第二先导序列可以使用氨基酸序列如SEQ ID NO:21、SEQ ID NO:23或SEQ ID NO:25所示的先导序列。
SEQ ID NO:20所示的氨基酸序列为：MSLSSLLKVVTASLWLGPGI
SEQ ID NO:22所示的氨基酸序列为：MKRILGALLGLLSAQVCCVR
SEQ ID NO:24所示的氨基酸序列为：MESFLGGVLLILWLQVDWVK
SEQ ID NO:21所示的氨基酸序列为：MGPGLLHWMALCLLGTGHG
SEQ ID NO:23所示的氨基酸序列为：MGPQLLGYVVLCLLGAGPL
SEQ ID NO:25所示的氨基酸序列为：MLCSLLALLLGTFFGVR
在一个实施方案中，所述α链可变区的氨基酸序列如SEQ ID NO:26、SEQ ID NO:28或SEQ ID NO:30所示或者与SEQ ID NO:26、SEQ ID NO:28或SEQ ID NO:30具有至少90％序列相同性的氨基酸序列，和/或所述β链的可变区的氨基酸序列如SEQ ID NO:27、SEQ IDNO:29或SEQ ID NO:31所示或者与SEQ ID NO:27、SEQ ID NO:29或SEQ ID NO:31具有至少90％序列相同性的氨基酸序列。
SEQ ID NO:26所示的氨基酸序列为：
MSLSSLLKVVTASLWLGPGIAQKITQTQPGMFVQEKEAVTLDCTYDTSDPSYGLFWYKQPSSGEMIFLIYQGSYDQQNATEGRYSLNFQKARKSANLVISASQLGDSAMYFCAMRIDAGGTSYGKLTFGQGTILTVHPN
SEQ ID NO:27所示的氨基酸序列为：
MGPGLLHWMALCLLGTGHGDAMVIQNPRYQVTQFGKPVTLSCSQTLNHNVMYWYQQKSSQAPKLLFHYYDKDFNNEADTPDNFQSRRPNTSFCFLDIRSPGLGDAAMYLCATSRDRVNTGELFFGEGSRLTVL
SEQ ID NO:28所示的氨基酸序列为：
MKRILGALLGLLSAQVCCVRGIQVEQSPPDLILQEGANSTLRCNFSDSVNNLQWFHQNPWGQLINLFYIPSGTKQNGRLSATTVATERYSLLYISSSQTTDSGVYFCAVEGDNAGGTSYGKLTFGQGTILTVHPN
SEQ ID NO:29所示的氨基酸序列为：
MGPQLLGYVVLCLLGAGPLEAQVTQNPRYLITVTGKKLTVTCSQNMNHEYMSWYRQDPGLGLRQIYYSMNVEVTDKGDVPEGYKVSRKEKRNFPLILESPSPNQTSLYFCASSWSTSYGYTFGSGTRLTIV
SEQ ID NO:30所示的氨基酸序列为：
MESFLGGVLLILWLQVDWVKSQKIEQNSEALNIQEGKTATLTCNYTNYSPAYLQWYRQDPGRGPVFLLLIRENEKEKRKERLKVTFDTTLKQSLFHITASQPADSATYLCALAGYQKVTFGTGTKLQVIPN
SEQ ID NO:31所示的氨基酸序列为：
MLCSLLALLLGTFFGVRSQTIHQWPATLVQPVGSPLSLECTVEGTSNPNLYWYRQAAGRGLQLLFYSVGIGQISSEVPQNLSASRPQDRQFILSSKKLLLSDSGFYLCAWSLRTSGSEQFFGPGTRLTVL
所述α链可变区的氨基酸序列与SEQ ID NO:26、SEQ ID NO:28或SEQ ID NO:30具有至少90％序列相同性的氨基酸序列如可以是与SEQ ID NO:26、SEQ ID NO:28或SEQ IDNO:30具有90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％序列相同性的氨基酸序列；
所述β链的可变区的氨基酸序列与SEQ ID NO:27、SEQ ID NO:29或SEQ ID NO:31具有至少90％序列相同性的氨基酸序列可以是与SEQ ID NO:27、SEQ ID NO:29或SEQ IDNO:31具有90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％序列相同性的氨基酸序列。
在一个实施方案中，所述TCR的α链可变区的氨基酸序列如SEQ ID NO:26且β链可变区的氨基酸序列如SEQ ID NO:27所示，或者α链可变区的氨基酸序列如SEQ ID NO:28且β链可变区的氨基酸序列如SEQ ID NO:29所示，或者α链可变区的氨基酸序列如SEQ ID NO:30且β链可变区的氨基酸序列如SEQ ID NO:31所示。
在一个实施方案中，所述α链还包含α恒定区和/或所述β链还包含β恒定区，优选地，所述恒定区为小鼠恒定区或人恒定区，
例如，小鼠α恒定区的氨基酸序列如SEQ ID NO:32所示；和/或
小鼠β恒定区的氨基酸序列如SEQ ID NO:33所示。
SEQ ID NO:32所示的氨基酸序列为：
IQNPEPAVYQLKDPRSQDSTLCLFTDFDSQINVPKTMESGTFITDKCVLDMKAMDSKSNGAIAWSNQTSFTCQDIFKETNATYPSSDVPCDATLTEKSFETDMNLNFQNLSVMGLRILLLKVAGFNLLMTLRLWSS
SEQ ID NO:33所示的氨基酸序列为：
EDLRNVTPPKVSLFEPSKAEIANKQKATLVCLARGFFPDHVELSWWVNGKEVHSGVCTDPQAYKESNYSYCLSSRLRVSATFWHNPRNHFRCQVQFHGLSEEDKWPEGSPKPVTQNISAEAWGRADCGITSASYHQGVLSATILYEILLGKATLYAVLVSGLVLMAMVKKKNS
所述TCR的恒定区可以含有短连接序列，其中半胱氨酸残基形成二硫键，从而连接TCR的两条链。TCR可以在α和β链中的每一个中具有另外的半胱氨酸残基，使得TCR在恒定区中含有两个二硫键。
在一个实施方案中，所述TCR的α链和β链恒定区的残基之间引入人工二硫键，可以引入的二硫键的位置是本领域技术人员公知的。
在一个实施方案中，所述TCR是分离的或纯化的或者是重组的。
在一个实施方案中，所述TCR是人的。
在一个实施方案中，所述TCR是单克隆的。
在一个实施方案中，所述TCR是单链。
在一个实施方案中，所述TCR包含两条链。
TCR可以从生物来源获得，如来自细胞(如来自T细胞(例如细胞毒性T细胞))、T细胞杂交瘤或其他公众可获得的资源，例如，TCR可以源自多个动物物种之一，如人、小鼠、大鼠或其他哺乳动物，如通常来自人。
在一些实施方案中，所述TCR可以是细胞结合的形式的或为可溶形式，优选为可溶的形式。
所述TCR为可溶的形式指的是在其疏水芯区域发生突变的TCR，这些疏水芯区域的突变优选为能够使本申请可溶性TCR的稳定性提高的突变。
本申请提供了一种核酸分子，所述核酸分子包含编码上述所述的TCR或者TCR的α链或β链。
在一个实施方案中，其中编码α链的核苷酸序列包含SEQ ID NO:34、SEQ ID NO:36或SEQ ID NO:38所示的核苷酸序列；和/或
编码β链的核苷酸序列包含如SEQ ID NO:35、SEQ ID NO:37或SEQ ID NO:39所示的核苷酸序列。
其中，SEQ ID NO:34所示的核苷酸序列为：
ATGTCACTTTCTAGCCTGCTGAAGGTGGTCACAGCTTCACTGTGGCTAGGACCTGGCATTGCCCAGAAGATAACTCAAACCCAACCAGGAATGTTCGTGCAGGAAAAGGAGGCTGTGACTCTGGACTGCACATATGACACCAGTGATCCAAGTTATGGTCTATTCTGGTACAAGCAGCCCAGCAGTGGGGAAATGATTTTTCTTATTTATCAGGGGTCTTATGACCAGCAAAATGCAACAGAAGGTCGCTACTCATTGAATTTCCAGAAGGCAAGAAAATCCGCCAACCTTGTCATCTCCGCTTCACAACTGGGGGACTCAGCAATGTACTTCTGTGCAATGAGAATTGATGCTGGTGGTACTAGCTATGGAAAGCTGACATTTGGACAAGGGACCATCTTGACTGTCCATCCAAATATCCAGAATCCAGAGCCCGCCGTGTATCAGCTGAAGGACCCAAGGAGCCAGGATTCCACCCTGTGCCTGTTCACAGACTTTGATAGCCAGATCAACGTGCCCAAGACCATGGAGTCCGGCACCTTCATCACAGACAAGTGCGTGCTGGATATGAAGGCCATGGACTCTAAGAGCAACGGCGCCATCGCCTGGAGCAATCAGACCTCCTTCACATGCCAGGATATCTTTAAGGAGACCAATGCCACATATCCTTCCTCTGACGTGCCATGTGATGCCACCCTGACAGAGAAGTCCTTCGAGACCGACATGAACCTGAATTTTCAGAACCTGTCTGTGATGGGCCTGCGCATCCTGCTGCTGAAGGTGGCCGGCTTCAATCTGCTGATGACCCTGAGGCTGTGGAGCTCC
SEQ ID NO:35所示的核苷酸序列为：
ATGGGTCCTGGGCTTCTCCACTGGATGGCCCTTTGTCTCCTTGGAACAGGTCATGGGGATGCCATGGTCATCCAGAACCCAAGATACCAGGTTACCCAGTTTGGAAAGCCAGTGACCCTGAGTTGTTCTCAGACTTTGAACCATAACGTCATGTACTGGTACCAGCAGAAGTCAAGTCAGGCCCCAAAGCTGCTGTTCCACTACTATGACAAAGATTTTAACAATGAAGCAGACACCCCTGATAACTTCCAATCCAGGAGGCCGAACACTTCTTTCTGCTTTCTTGACATCCGCTCACCAGGCCTGGGGGACGCAGCCATGTACCTGTGTGCCACCAGCAGAGATAGGGTCAACACCGGGGAGCTGTTTTTTGGAGAAGGCTCTAGGCTGACCGTACTGGAGGATCTGAGGAACGTGACACCCCCTAAGGTGTCTCTGTTCGAGCCCAGCAAGGCCGAGATCGCCAATAAGCAGAAGGCCACCCTGGTGTGCCTGGCAAGGGGCTTCTTTCCTGATCACGTGGAGCTGTCTTGGTGGGTGAACGGCAAGGAGGTGCACAGCGGCGTGTGCACCGACCCACAGGCCTACAAGGAGTCCAATTACTCTTATTGTCTGAGCTCCCGGCTGAGAGTGTCCGCCACATTTTGGCACAACCCTAGAAATCACTTCAGGTGCCAGGTGCAGTTTCACGGCCTGAGCGAGGAGGATAAGTGGCCAGAGGGATCCCCAAAGCCTGTGACCCAGAACATCTCTGCCGAGGCATGGGGAAGGGCAGACTGTGGAATCACATCCGCCTCTTATCACCAGGGCGTGCTGAGCGCCACCATCCTGTACGAGATCCTGCTGGGCAAGGCCACACTGTATGCCGTGCTGGTGAGCGGCCTGGTGCTGATGGCCATGGTGAAGAAGAAGAACTCC
SEQ ID NO:36所示的核苷酸序列为：
ATGAAGAGGATATTGGGAGCTCTGCTGGGGCTCTTGAGTGCCCAGGTTTGCTGTGTGAGAGGAATACAAGTGGAGCAGAGTCCTCCAGACCTGATTCTCCAGGAGGGAGCCAATTCCACGCTGCGGTGCAATTTTTCTGACTCTGTGAACAATTTGCAGTGGTTTCATCAAAACCCTTGGGGACAGCTCATCAACCTGTTTTACATTCCCTCAGGGACAAAACAGAATGGAAGATTAAGCGCCACGACTGTCGCTACGGAACGCTACAGCTTATTGTACATTTCCTCTTCCCAGACCACAGACTCAGGCGTTTATTTCTGTGCTGTGGAGGGGGATAATGCTGGTGGTACTAGCTATGGAAAGCTGACATTTGGACAAGGGACCATCTTGACTGTCCATCCAAATATCCAGAATCCAGAGCCCGCCGTGTATCAGCTGAAGGACCCAAGGAGCCAGGATTCCACCCTGTGCCTGTTCACAGACTTTGATAGCCAGATCAACGTGCCCAAGACCATGGAGTCCGGCACCTTCATCACAGACAAGTGCGTGCTGGATATGAAGGCCATGGACTCTAAGAGCAACGGCGCCATCGCCTGGAGCAATCAGACCTCCTTCACATGCCAGGATATCTTTAAGGAGACCAATGCCACATATCCTTCCTCTGACGTGCCATGTGATGCCACCCTGACAGAGAAGTCCTTCGAGACCGACATGAACCTGAATTTTCAGAACCTGTCTGTGATGGGCCTGCGCATCCTGCTGCTGAAGGTGGCCGGCTTCAATCTGCTGATGACCCTGAGGCTGTGGAGCTCC
SEQ ID NO:37所示的核苷酸序列为：
ATGGGCCCCCAGCTCCTTGGCTATGTGGTCCTTTGCCTTCTAGGAGCAGGCCCCCTGGAAGCCCAAGTGACCCAGAACCCAAGATACCTCATCACAGTGACTGGAAAGAAGTTAACAGTGACTTGTTCTCAGAATATGAACCATGAGTATATGTCCTGGTATCGACAAGACCCAGGGCTGGGCTTAAGGCAGATCTACTATTCAATGAATGTTGAGGTGACTGATAAGGGAGATGTTCCTGAAGGGTACAAAGTCTCTCGAAAAGAGAAGAGGAATTTCCCCCTGATCCTGGAGTCGCCCAGCCCCAACCAGACCTCTCTGTACTTCTGTGCCAGCAGTTGGTCGACCTCCTATGGCTACACCTTCGGTTCGGGGACCAGGTTAACCATTGTAGAGGATCTGAGGAACGTGACACCCCCTAAGGTGTCTCTGTTCGAGCCCAGCAAGGCCGAGATCGCCAATAAGCAGAAGGCCACCCTGGTGTGCCTGGCAAGGGGCTTCTTTCCTGATCACGTGGAGCTGTCTTGGTGGGTGAACGGCAAGGAGGTGCACAGCGGCGTGTGCACCGACCCACAGGCCTACAAGGAGTCCAATTACTCTTATTGTCTGAGCTCCCGGCTGAGAGTGTCCGCCACATTTTGGCACAACCCTAGAAATCACTTCAGGTGCCAGGTGCAGTTTCACGGCCTGAGCGAGGAGGATAAGTGGCCAGAGGGATCCCCAAAGCCTGTGACCCAGAACATCTCTGCCGAGGCATGGGGAAGGGCAGACTGTGGAATCACATCCGCCTCTTATCACCAGGGCGTGCTGAGCGCCACCATCCTGTACGAGATCCTGCTGGGCAAGGCCACACTGTATGCCGTGCTGGTGAGCGGCCTGGTGCTGATGGCCATGGTGAAGAAGAAGAACTCC
SEQ ID NO:38所示的核苷酸序列为：
ATGGAGTCATTCCTGGGAGGTGTTTTGCTGATTTTGTGGCTTCAAGTGGACTGGGTGAAGAGCCAAAAGATAGAACAGAATTCCGAGGCCCTGAACATTCAGGAGGGTAAAACGGCCACCCTGACCTGCAACTATACAAACTATTCCCCAGCATACTTACAGTGGTACCGACAAGATCCAGGAAGAGGCCCTGTTTTCTTGCTACTCATACGTGAAAATGAGAAAGAAAAAAGGAAAGAAAGACTGAAGGTCACCTTTGATACCACCCTTAAACAGAGTTTGTTTCATATCACAGCCTCCCAGCCTGCAGACTCAGCTACCTACCTCTGTGCTCTCGCGGGTTACCAGAAAGTTACCTTTGGAACTGGAACAAAGCTCCAAGTCATCCCAAATATCCAGAATCCAGAGCCCGCCGTGTATCAGCTGAAGGACCCAAGGAGCCAGGATTCCACCCTGTGCCTGTTCACAGACTTTGATAGCCAGATCAACGTGCCCAAGACCATGGAGTCCGGCACCTTCATCACAGACAAGTGCGTGCTGGATATGAAGGCCATGGACTCTAAGAGCAACGGCGCCATCGCCTGGAGCAATCAGACCTCCTTCACATGCCAGGATATCTTTAAGGAGACCAATGCCACATATCCTTCCTCTGACGTGCCATGTGATGCCACCCTGACAGAGAAGTCCTTCGAGACCGACATGAACCTGAATTTTCAGAACCTGTCTGTGATGGGCCTGCGCATCCTGCTGCTGAAGGTGGCCGGCTTCAATCTGCTGATGACCCTGAGGCTGTGGAGCTCC
SEQ ID NO:39所示的核苷酸序列为：
ATGCTCTGCTCTCTCCTTGCCCTTCTCCTGGGCACTTTCTTTGGGGTCAGATCTCAGACTATTCATCAATGGCCAGCGACCCTGGTGCAGCCTGTGGGCAGCCCGCTCTCTCTGGAGTGCACTGTGGAGGGAACATCAAACCCCAACCTATACTGGTACCGACAGGCTGCAGGCAGGGGCCTCCAGCTGCTCTTCTACTCCGTTGGTATTGGCCAGATCAGCTCTGAGGTGCCCCAGAATCTCTCAGCCTCCAGACCCCAGGACCGGCAGTTCATCCTGAGTTCTAAGAAGCTCCTTCTCAGTGACTCTGGCTTCTATCTCTGTGCCTGGAGTCTCCGGACTAGCGGGAGCGAGCAGTTCTTCGGGCCAGGGACACGGCTCACCGTGCTAGAGGATCTGAGGAACGTGACACCCCCTAAGGTGTCTCTGTTCGAGCCCAGCAAGGCCGAGATCGCCAATAAGCAGAAGGCCACCCTGGTGTGCCTGGCAAGGGGCTTCTTTCCTGATCACGTGGAGCTGTCTTGGTGGGTGAACGGCAAGGAGGTGCACAGCGGCGTGTGCACCGACCCACAGGCCTACAAGGAGTCCAATTACTCTTATTGTCTGAGCTCCCGGCTGAGAGTGTCCGCCACATTTTGGCACAACCCTAGAAATCACTTCAGGTGCCAGGTGCAGTTTCACGGCCTGAGCGAGGAGGATAAGTGGCCAGAGGGATCCCCAAAGCCTGTGACCCAGAACATCTCTGCCGAGGCATGGGGAAGGGCAGACTGTGGAATCACATCCGCCTCTTATCACCAGGGCGTGCTGAGCGCCACCATCCTGTACGAGATCCTGCTGGGCAAGGCCACACTGTATGCCGTGCTGGTGAGCGGCCTGGTGCTGATGGCCATGGTGAAGAAGAAGAACTCC
所述核酸分子可以包括包含天然和/或非天然存在的核苷酸和碱基的那些，例如包括具有骨架修饰的那些，所述核酸分子指的是核苷酸的聚合物，核苷酸的此类聚合物可以含有天然和/或非天然核苷酸，并且包括但不限于DNA、RNA和PNA。核苷酸序列指的是构成核酸分子的线性序列。
在一些情况下，核酸分子含有cDNA，在一些情况下，可以修饰核酸分子以用于本申请所述的构建体中，如用于密码子优化。在一些情况下，出于克隆到载体的目的，可以将序列设计为含有末端限制性位点序列。
在一些情况下，编码TCR的核酸分子可以从多种来源获得，如通过一种或多种给定细胞内的或从所述一种或多种给定细胞中分离的编码核酸的聚合酶链式反应(PCR)扩增获得。
在一个实施方案中，编码α链的核苷酸序列和/或编码β链的核苷酸序列是经密码子优化的。通常，密码子优化涉及使所选择的密码子的百分比与已公开的人类转移RNA的丰度平衡，使得没有一者过载或受限。在一些情况下，这可能是必要的，因为大多数氨基酸由超过一种密码子编码，并且密码子使用因生物而异。经转染的基因与宿主细胞之间的密码子使用差异可能会影响核酸构建体的蛋白质表达和免疫原性。通常，对于密码子优化，选择密码子以选择与人类使用频率平衡的那些密码子。通常，氨基酸密码子的冗余度使得不同的密码子编码一种氨基酸。在一些实施方案中，在选择用于置换的密码子时，可能需要所得突变是沉默突变，使得密码子改变不影响氨基酸序列。通常，密码子的最后一个核苷酸可以保持不变而不会影响氨基酸序列。
本申请提供了一种载体，所述载体包含上述所述的核酸分子。
例如，将编码上述TCR的一条或两条链的一种或多种核酸克隆到合适的一种或多种表达载体中，表达载体可以是任何合适的重组表达载体，并且可以用于转化或转染任何合适的宿主。合适的载体包括设计用于繁殖和扩增或用于表达或用于两者的那些，如质粒和病毒。
所述载体可以含有调节序列(如转录和翻译起始和终止密码子)，其对待引入载体的宿主的类型(例如，细菌、真菌、植物或动物)具有特异性，酌情并考虑载体是基于DNA还是基于RNA。载体也可以含有与编码TCR的核苷酸序列可操作连接的非天然启动子。所述启动子可以是非病毒启动子或病毒启动子，如巨细胞病毒(CMV)启动子、SV40启动子、RSV启动子和在鼠干细胞病毒的长末端重复序列中发现的启动子，也考虑了熟练技术人员已知的其他启动子。
在一个实施方案中，所述载体为表达载体。
在一个实施方案中，所述载体为病毒载体，优选为逆转录病毒载体。
在一个实施方案中，所述病毒载体为慢病毒载体。
本申请提供了一种包含这种核酸的宿主细胞，为了重组产生TCR，可以将编码TCR的核酸分离，并且将其插入一种或多种载体中，以在宿主细胞中进一步克隆/或表达。可以使用常规技术(例如，通过使用能够与编码TCR的α链和β链的基因特异性结合的寡核苷酸探针)容易地分离和测序这种核酸。在一些实施方案中，提供了制备TCR的方法，其中，所述方法包括在适合于表达TCR分子的条件下培养如上提供的包含编码TCR的核酸的宿主细胞，以及任选地从宿主细胞(或宿主细胞培养基)回收TCR。
所述宿主细胞是指已引入外源核酸的细胞，包括此类细胞的后代。宿主细胞包括转化体和转化细胞，其包括原代转化细胞和源自其的后代，不考虑传代次数。后代在核酸含量上可能与亲代细胞不完全相同，但可能含有突变。
本申请提供了一种工程化细胞，其包含上述所述的TCR、上述所述的核酸分子或者上述所述的载体。
在一个实施方案中，所述TCR对所述细胞是异源的。
在一个实施方案中，所述工程化细胞是细胞系。
在一个实施方案中，所述工程化细胞是获自受试者的原代细胞，优选地，所述受试者为哺乳动物受试者，优选为人。
在一个实施方案中，所述工程化细胞是T细胞，优选是从外周血分离的T细胞。
在一个实施方案中，所述T细胞为CD8+或CD4+。
所述工程化细胞例如可以是细胞群体或者表达TCR的基因工程化细胞，该细胞通常是真核细胞，如哺乳动物细胞，并且通常是人细胞。在一些实施方案中，细胞源自血液、骨髓、淋巴或淋巴器官，是免疫系统的细胞，如先天免疫或适应性免疫的细胞，例如骨髓或淋巴样细胞(包括淋巴细胞，通常是T细胞和/或NK细胞)。其他示例性细胞包括干细胞，如多潜能干细胞和多能干细胞，包括诱导多能干细胞(iPSC)。细胞通常是原代细胞，如直接从受试者分离和/或从受试者分离并冷冻的那些。在一些实施方案中，细胞包括T细胞或其他细胞类型的一个或多个子集，如整个T细胞群、CD+细胞、CD8+细胞及其亚群。
T细胞和/或CD+和/或CD8+T细胞的亚型和亚群包括幼稚T(TN)细胞、效应T细胞(TEFF)、记忆T细胞及其亚型(如干细胞记忆T(TSCM)、中枢记忆T(TCM)、效应记忆T(TEM)或终末分化的效应记忆T细胞)、肿瘤浸润淋巴细胞(TIL)、未成熟T细胞、成熟T细胞、辅助T细胞、细胞毒性T细胞、粘膜相关恒定T(MAIT)细胞、天然存在和适应性调节T(Treg)细胞等。
在一些实施方案中，细胞是自然杀伤(NK)细胞。在一些实施方案中，细胞是单核细胞或粒细胞，例如骨髓细胞、巨噬细胞、嗜中性粒细胞、树突细胞、肥大细胞、嗜酸性粒细胞和/或嗜碱性粒细胞。
本申请提供了一种生产上述所述的工程化细胞的方法，其包括在体外或离体地将上述所述的核酸分子或者上述所述的载体引入细胞中。
在一个实施方案中，所述载体为病毒载体，并且所述引入是通过转导进行的。
本申请提供了一种药物组合物，其包含上述所述的T细胞受体(TCR)、上述所述的核酸分子、上述所述的载体或者上述所述的工程化细胞。
在一个实施方案中，其还包含药学上可接受的载体或佐剂。
所述药学上可接受的载体或佐剂是指药物组合物中除了活性成分之外对受试者无毒的成分。药学上可接受的载体或佐剂包括但不限于缓冲液、赋形剂、稳定剂或防腐剂。
所述药物组合物可以利用定时释放、延迟释放和持续释放递送系统，使得所述组合物的递送发生在待治疗部位的致敏之前并且有足够的时间引起致敏。许多类型的释放递送系统是可用的并且是已知的。此类系统可用避免重复给予所述组合物，从而增加受试者和医生的便利性。
本申请提供了上述所述的T细胞受体(TCR)、上述所述的核酸分子、上述所述的载体、上述所述的工程化细胞或者上述所述的药物组合物在制备治疗与HPV相关的疾病的药物中的用途。
在一个实施方案中，与HPV相关的疾病为HPV慢性感染、宫颈上皮内瘤样病变、宫颈癌、头颈癌、肛门癌、阴茎癌、阴道癌或外阴癌等。
本申请所述的TCR能够与HPV阳性肿瘤细胞的抗原短肽特异性结合，转导了所述TCR的T细胞能够被特异性激活并且对靶细胞具有很强的杀伤作用，所述的TCR可以用于宫颈癌等HPV阳性的肿瘤的免疫治疗。
实施例
本申请对试验中所用到的材料以及试验方法进行一般性和/或具体的描述，在下面的实施例中，如果无其他特别的说明，％表示wt％，即重量百分数。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可以通过市购获得的常规试剂产品。
实施例1：克隆IVCPICSQK抗原短肽特异性T细胞
利用合成短肽IVCPICSQK(SEQ ID NO:1，江苏金斯瑞生物科技有限公司)刺激来自于基因型为HLA-A*11:01的健康志愿者的外周血淋巴细胞。将IVCPICSQK短肽与带有生物素标记的HLA-A*11:01复性，制备pHLA单体。这些单体与用PE标记的链霉亲和素(BD公司，目录号554061)组合成PE标记的四聚体，流式检测该四聚体及CD8双阳性细胞。pHLA单体和四聚 体的制作方法参照NIH Tetramer Core Facility公开的protocol，具体步骤见网页 https://tetramer.yerkes.emory.edu/support/protocols#1，其制备方法如下：
(1)试剂
试验培养基：10％FBS(赛默飞公司(ThermoFisher)，目录号10099-044)，RPMI1640(赛默飞公司(ThermoFisher)，目录号C11875500BT)，10％HS(Gemni，目录号100512)，TexMACS(美天旎(Mitenyi)，目录号170-076-309)
(2)方法
通过密度梯度离心法从健康志愿者的外周血中分出PBMC。从PBMC中分出CD14阳性细胞，用于诱导树突状细胞(dendritic cell,DC)。CD14阳性细胞在培养基(1640+10％AuFBS+1％PS+800IU/ml GM-CSF+500IU/ml IL-4)中培养至第三天补1ml培养基(含1600IU/ml GM-CSF+1000IU/ml IL-4)，第五天加入DC成熟诱导因子10ng/ml IL-1β，10ng/ml IL-6，10ng/ml TNF-α，1ug/ml PGE2，继续培养两天，即可获得成熟的DC。用成熟的DC负载IVCPICSQK短肽，终浓度为20μg/ml，然后去刺激从PBMC中分出的CD8阳性T细胞(培养基TexMACS+10％HS+1％PS+60ng/ml IL21+10IU/ml IL2/7/15)。经过三轮刺激后，用流式细胞分选仪分选出四聚体及CD8双阳性的T细胞，此即抗原特异性T细胞。
(3)结果
通过如上所述方案克隆IVCPICSQK抗原短肽特异性T细胞，利用流式细胞术分析克隆出的抗原短肽特异性T细胞。经过IVCPICSQK抗原短肽二轮刺激和三轮刺激后的T细胞流式检测结果如图1所示。
从图1可以看出成功克隆IVCPICSQK抗原短肽特异性T细胞。
实施例2：IVCPICSQK抗原短肽特异性TCR慢病毒载体构建及慢病毒包装
(1)TCR慢病毒载体构建
将实施例1中CD8和四聚体双阳性的细胞进行流式分选获得单细胞，将分选获得的单细胞用一步法RT-PCR试剂盒(QIAGEN凯杰，目录号210212)分别扩增TCRα链及β链，将PCR产物测序。将测序结果与IMGT(国际免疫遗传学信息系统)的公开数据库中的序列进行比对，即可以获得TCRα链可变区序列及β链可变区的核苷酸序列及其CDR1、CDR2、CDR3的信息，得到3个TCR(TCR074，TCR095和TCR123)的α链可变区序列及β链可变区的核苷酸序列及其CDR1、CDR2、CDR3的信息，其分别如下所示：
TCR074的α链可变区序列的核苷酸序列如SEQ ID NO:41所示，
ATGTCACTTTCTAGCCTGCTGAAGGTGGTCACAGCTTCACTGTGGCTAGGACCTGGCATTGCCCAGAAGATAACTCAAACCCAACCA
GGAATGTTCGTGCAGGAAAAGGAGGCTGTGACTCTGGACTGCACATATGACACCAGTGATCCAAGTTATGGTCTATTCTGGTACAAGCA
GCCCAGCAGTGGGGAAATGATTTTTCTTATTTATCAGGGGTCTTATGACCAGCAAAATGCAACAGAAGGTCGCTACTCATTGAATTTCCA
GAAGGCAAGAAAATCCGCCAACCTTGTCATCTCCGCTTCACAACTGGGGGACTCAGCAATGTACTTCTGTGCAATGAGAATTGATGCTG
GTGGTACTAGCTATGGAAAGCTGACATTTGGACAAGGGACCATCTTGACTGTCCATCCAAAT
β链可变区的核苷酸序列如SEQ ID NO:42所示：
ATGGGTCCTGGGCTTCTCCACTGGATGGCCCTTTGTCTCCTTGGAACAGGTCATGGGGATGCCATGGTCATCCAGAACCCAAGATAC
CAGGTTACCCAGTTTGGAAAGCCAGTGACCCTGAGTTGTTCTCAGACTTTGAACCATAACGTCATGTACTGGTACCAGCAGAAGTCAAG
TCAGGCCCCAAAGCTGCTGTTCCACTACTATGACAAAGATTTTAACAATGAAGCAGACACCCCTGATAACTTCCAATCCAGGAGGCCGA
ACACTTCTTTCTGCTTTCTTGACATCCGCTCACCAGGCCTGGGGGACGCAGCCATGTACCTGTGTGCCACCAGCAGAGATAGGGTCAACA
CCGGGGAGCTGTTTTTTGGAGAAGGCTCTAGGCTGACCGTACTG
α链的互补决定区1(CDR1)的氨基酸序列如SEQ ID NO:2所示：TSDPSYG
互补决定区2(CDR2)的氨基酸序列如SEQ ID NO:3所示：QGSYDQQN
互补决定区3(CDR3)的氨基酸序列如SEQ ID NO:4所示：AMRIDAGGTSYGKLT
β链的互补决定区1(CDR1)的氨基酸序列如SEQ ID NO:5所示：LNHNV
互补决定区2(CDR2)的氨基酸序列如SEQ ID NO:6所示：YYDKDF
互补决定区3(CDR3)的氨基酸序列如SEQ ID NO:7所示：ATSRDRVNTGELF
TCR095的α链可变区序列的核苷酸序列如SEQ ID NO:43所示，
ATGAAGAGGATATTGGGAGCTCTGCTGGGGCTCTTGAGTGCCCAGGTTTGCTGTGTGAGAGGAATACAAGTGGAGCAGAGTCCTCC
AGACCTGATTCTCCAGGAGGGAGCCAATTCCACGCTGCGGTGCAATTTTTCTGACTCTGTGAACAATTTGCAGTGGTTTCATCAAAACCC
TTGGGGACAGCTCATCAACCTGTTTTACATTCCCTCAGGGACAAAACAGAATGGAAGATTAAGCGCCACGACTGTCGCTACGGAACGCT
ACAGCTTATTGTACATTTCCTCTTCCCAGACCACAGACTCAGGCGTTTATTTCTGTGCTGTGGAGGGGGATAATGCTGGTGGTACTAGCT
ATGGAAAGCTGACATTTGGACAAGGGACCATCTTGACTGTCCATCCAAAT
β链可变区的核苷酸序列如SEQ ID NO:44所示：
ATGGGCCCCCAGCTCCTTGGCTATGTGGTCCTTTGCCTTCTAGGAGCAGGCCCCCTGGAAGCCCAAGTGACCCAGAACCCAAGATA
CCTCATCACAGTGACTGGAAAGAAGTTAACAGTGACTTGTTCTCAGAATATGAACCATGAGTATATGTCCTGGTATCGACAAGACCCAG
GGCTGGGCTTAAGGCAGATCTACTATTCAATGAATGTTGAGGTGACTGATAAGGGAGATGTTCCTGAAGGGTACAAAGTCTCTCGAAAA
GAGAAGAGGAATTTCCCCCTGATCCTGGAGTCGCCCAGCCCCAACCAGACCTCTCTGTACTTCTGTGCCAGCAGTTGGTCGACCTCCTAT
GGCTACACCTTCGGTTCGGGGACCAGGTTAACCATTGTA
α链的互补决定区1(CDR1)的氨基酸序列如SEQ ID NO:8所示：DSVNN
互补决定区2(CDR2)的氨基酸序列如SEQ ID NO:9所示：IPSGT
互补决定区3(CDR3)的氨基酸序列如SEQ ID NO:10所示：AVEGDNAGGTSYGKLT
β链的互补决定区1(CDR1)的氨基酸序列如SEQ ID NO:11所示：MNHEY
互补决定区2(CDR2)的氨基酸序列如SEQ ID NO:12所示：SMNVEV
互补决定区3(CDR3)的氨基酸序列如SEQ ID NO:13所示：ASSWSTSYGYT
TCR123的α链可变区序列的核苷酸序列如SEQ ID NO:45所示，
ATGGAGTCATTCCTGGGAGGTGTTTTGCTGATTTTGTGGCTTCAAGTGGACTGGGTGAAGAGCCAAAAGATAGAACAGAATTCCGA
GGCCCTGAACATTCAGGAGGGTAAAACGGCCACCCTGACCTGCAACTATACAAACTATTCCCCAGCATACTTACAGTGGTACCGACAAG
ATCCAGGAAGAGGCCCTGTTTTCTTGCTACTCATACGTGAAAATGAGAAAGAAAAAAGGAAAGAAAGACTGAAGGTCACCTTTGATAC
CACCCTTAAACAGAGTTTGTTTCATATCACAGCCTCCCAGCCTGCAGACTCAGCTACCTACCTCTGTGCTCTCGCGGGTTACCAGAAAGT
TACCTTTGGAACTGGAACAAAGCTCCAAGTCATCCCAAAT
β链可变区的核苷酸序列如SEQ ID NO:46所示：
ATGCTCTGCTCTCTCCTTGCCCTTCTCCTGGGCACTTTCTTTGGGGTCAGATCTCAGACTATTCATCAATGGCCAGCGACCCTGGTGC
AGCCTGTGGGCAGCCCGCTCTCTCTGGAGTGCACTGTGGAGGGAACATCAAACCCCAACCTATACTGGTACCGACAGGCTGCAGGCAGG
GGCCTCCAGCTGCTCTTCTACTCCGTTGGTATTGGCCAGATCAGCTCTGAGGTGCCCCAGAATCTCTCAGCCTCCAGACCCCAGGACCGG
CAGTTCATCCTGAGTTCTAAGAAGCTCCTTCTCAGTGACTCTGGCTTCTATCTCTGTGCCTGGAGTCTCCGGACTAGCGGGAGCGAGCAG
TTCTTCGGGCCAGGGACACGGCTCACCGTGCTA
α链的互补决定区1(CDR1)的氨基酸序列如SEQ ID NO:14所示：NYSPAY
互补决定区2(CDR2)的氨基酸序列如SEQ ID NO:15所示：IRENEKE
互补决定区3(CDR3)的氨基酸序列如SEQ ID NO:16所示：ALAGYQKVT
β链的互补决定区1(CDR1)的氨基酸序列如SEQ ID NO:17所示：GTSNPN
互补决定区2(CDR2)的氨基酸序列如SEQ ID NO:18所示：SVGIG
互补决定区3(CDR3)的氨基酸序列如SEQ ID NO:19所示：AWSLRTSGSEQF
将IVCPICSQK TCRα和β链可变区序列克隆至基于pLKO的表达质粒(Addgene)，通过多片段重组克隆试剂盒(诺唯赞生物科技公司，目录号C113)标准方法将α或β可变结构域克隆到含有鼠α或β恒定区的基于PLKO的表达质粒中，将连接的质粒转化到感受态大肠杆菌菌株Stbl3细胞(上海唯地生物技术有限公司)中并接种于含有100μg/ml氨苄青霉素的LB/琼脂平板上。在37℃下过夜孵育之后，挑取单个菌落并在37℃下在10ml的含有100μg/ml氨苄青霉素的LB中振荡过夜生长。使用小提中量试剂盒(天根生化科技公司(TIANGEN)目录号#DP118-02)纯化克隆的质粒并且对质粒进行测序得到IVCPICSQK TCR(即TCR074，TCR095，TCR123)。
(2)慢病毒包装
试验培养基：10％FBS(Lonsera，目录号S711-001)，DMEM(思拓凡公司(cytiva)，目录号SH30243.01)
准备293T细胞(保藏机构为美国典型培养物保藏中心即ATCC，保藏目录号为CRL-1573)在10cm皿中培养，在不超过80％满度的时候开始质粒转染，病毒包装质粒和IVCPICSQK TCR质粒的比例为1:1，共10μg。将上述质粒加在无血清的DMEM培养基中的与PEI(polyethylenimine，聚乙烯亚胺)混合，然后将加质粒的混合液加到293T细胞中，37度培养。72h后，将细胞的上清用100kd超滤管浓缩收集病毒载体。
实施例3：表达IVCPICSQK抗原短肽特异性TCR的Jurkat细胞系构建及功能鉴定
活化T细胞核因子(NFAT)报告基因表达方法
进行以下试验以证明TCR转导的T细胞对靶细胞特异性的激活反应。利用流式细胞分析技术检测NFAT表达量作为T细胞激活的读出值。
(1)试剂
试验培养基：10％FBS(Lonsera，目录号S711-001)，RPMI1640(赛默飞公司(ThermoFisher)，目录号C11875500BT)
(2)方法
靶细胞制备
本实验中所用的靶细胞为T2-A11细胞(T2细胞保藏于ATCC，保藏目录号为CRL-1992，T2-A11细胞是参考Cancer Biology&Therapy,8:21,2025-2032在T2细胞基础上构建的)。在实验培养基中制备靶细胞，靶细胞浓度调至1.6×106个/毫升，每孔取50微升从而得80000个细胞/孔。
效应细胞制备
本实验的效应细胞为转导了本申请TCR的Jurkat-CD8-NFAT(JK8NF)细胞，并以未转染本申请TCR的JK8NF细胞作为对照组。
将JK8NF细胞(Jurkat细胞保藏于ATCC，保藏目录号为TIB-152，JK8NF细胞是参考Cancer Res 2006；66(23):11455-61，Front.Immunol.11:633.在Jurkat细胞基础上构建的)按MOI(感染复数)＝10加入实施例2中获得的携带本申请TCR基因的慢病毒，72小时后用流式细胞仪鉴定转染阳性率100％左右(其结果如图2所示)，将扩大培养后的效应细胞浓度调至1.6×106个/毫升，每孔取50微升从而得80000个细胞/孔。
短肽溶液制备
将原浓度5mg/ml短肽(IVCPICSQK)浓度稀释为400μg/ml，然后按10倍比例依次往下稀释成40μg/ml、4μg/ml、0.4μg/ml、0.04μg/ml、0.004μg/ml、0.0004μg/ml。
每孔取50微升使短肽在96孔板中的终浓度分别为100μg/ml、10μg/ml、1μg/ml、0.1μg/ml、0.01μg/ml、0.001μg/ml、0.0001μg/ml。
最终每孔加50μl靶细胞，50μl效应细胞，50μl相应浓度短肽稀释液和50μl培养基于96孔平底板中，与37度细胞培养箱中孵育12h。
(3)结果
通过如上所述方法检验本申请TCR转导的T细胞对负载IVCPICSQK抗原短肽的靶细胞起反应的NFAT的表达。利用Graphpad prism8绘制NFAT的表达水平曲线，其结果如图3所示。
从图3可以看出，转导本申请TCR的T细胞对负载其特异的短肽的靶细胞有很好的激活反应。
实施例4：表达IVCPICSQK抗原短肽特异性TCR的原代T细胞构建及功能鉴定
实时监测靶细胞增殖方案
(1)试剂
试验培养基：10％FBS(赛默飞公司(ThermoFisher)，目录号10099-044)，RPMI1640(赛默飞公司公司(ThermoFisher)，目录号C11875500BT)
(2)方法
效应T细胞制备
本实验的效应细胞(T细胞)为转导了本申请TCR的T细胞，并以同一志愿者未转染本申请TCR的T细胞作为对照组。
将志愿者的外周血经过密度梯度离心，获得外周血单个核细胞，将外周血单个核细胞按照24孔板每孔5.0×105/500μl置于孔中，共收集1x106细胞，用抗CD3/CD28磁珠刺激T细胞后置于37℃，5％ CO2培养箱中培养。24h后观察细胞成团情况，按MOI(感染复数)＝2加入实施例2中获得的TCR(TCR074、TCR095和TCR123)基因的慢病毒转导后，在含有200IU/mlIL-2的含10％FBS的1640培养基扩增直至转导后3-4天后，用流式细胞仪鉴定TCR转染效率(其如图4所示)。将扩大培养后的效应细胞浓度调至5.0×104个阳性细胞/毫升，每孔取100微升从而得5000个阳性细胞/孔。
靶细胞制备
本实验中所用的靶细胞为SK-MEL-28-E7，SK-MEL-28(保藏于ATCC)的基因型为A*11:01，但是本身不表达E7，因此通过慢病毒载体过表达E7基因构建SK-MEL-28-E7细胞作为靶细胞。将在实验培养基中制备靶细胞，靶细胞浓度调至5.0×104个/毫升，每孔取100微升从而得5000个细胞/孔。
RTCA x Celligence系统监测靶细胞增殖
于E-plate中加入上述准备好的100微升T细胞与100微升靶细胞，然后将E-plate安装到RTCA分析仪，与37℃，5％ CO2培养箱中静置培养90h，观察靶细胞实时增殖曲线。
(3)结果
通过实时监测靶细胞增殖实验(如上所述)检验本申请TCR转导的T细胞的功能。利用Graphpad prism8绘制各孔中细胞增殖的细胞指数。实验结果如图5所示。
从图5可以看出，表达IVCPICSQK-A*11:01抗原短肽特异性TCR的T细胞对表达E7的细胞系有很强的杀伤功能。
实施例5：表达IVCPICSQK抗原短肽特异性TCR的原代T细胞体内抑制肿瘤生长功能鉴定
进行以下试验以证明TCR转导的T细胞对肿瘤生长的抑制作用。观察肿瘤的体积变化评估T细胞杀伤肿瘤的功能。体外实验显示三个TCR杀伤肿瘤的效果类似，因此仅选取TCR095和TCR123作为代表，进行体内抑制肿瘤生长功能鉴定。
(1)试剂与小鼠
试验培养基：10％FBS(赛默飞公司(ThermoFisher)，目录号10099-044)，RPMI1640(赛默飞公司公司(ThermoFisher)，目录号C11875500BT)
NCG小鼠：购买于集萃药康公司，雌性，4-6周龄，基因型是(prkdc)ko/ko，(Il2rg雌)ko/ko。
(2)方法
肿瘤细胞皮下接种
本实验用到的肿瘤细胞是SK-MEL-28-E7。将在生理盐水中制备肿瘤细胞，肿瘤细胞浓度调至5.0×107个/毫升，每只小鼠皮下接种200微升从而得1.0×107个细胞/只，待肿瘤体积长到约100立方毫米，接种效应T细胞。
效应T细胞制备
本实验的效应细胞(T细胞)为转导了本申请TCR的T细胞，并以同一志愿者未转染本申请TCR的T细胞作为对照组。每组5只小鼠。
将志愿者的外周血经过密度梯度离心，获得外周血单个核细胞，将外周血单个核细胞按照24孔板每孔5.0×105/500μl置于孔中，共收集4x106细胞，用抗CD3/CD28磁珠刺激T细胞后置于37℃，5％ CO2培养箱中培养。24h后观察细胞成团情况，按MOI(感染复数)＝2加入实施例2中获得的TCR(TCR095和TCR123)慢病毒转导后，在含有200IU/ml IL-2的含10％FBS的1640培养基扩增直至转导后3-4天后，用流式细胞仪鉴定TCR转染效率。将扩大培养后的效应细胞浓度调至5.0×107个阳性细胞/毫升，每只小鼠通过眼静脉注射200微升剂量从而得1.0×107个阳性细胞/只。
(3)结果
观察记录接种T细胞后肿瘤的体积，根据肿瘤体积的大小变化评估表达本申请的TCR的原代T细胞治疗肿瘤的效果。利用Graphpad prism8绘制肿瘤的生长曲线，实验结果如图6A和图6B所示，其中，图6A是接种T细胞后肿瘤体积随时间变化的示意图，图6B是接种含有不同TCR的T细胞后肿瘤重量的柱状图。
从图6A和图6B可以看出，表达IVCPICSQK-A*11:01抗原短肽特异性TCR的T细胞能有效抑制E7阳性肿瘤的生长。
综上所述，本申请转达所述TCR的T细胞能够被特异性激活并且对表达A1101和HPV的肿瘤细胞具有很强的杀伤作用。
所述T细胞对表达E7的细胞系有很强的杀伤功能，并能够有效抑制E7阳性肿瘤的生长。
以上所述，仅是本申请的较佳实施例而已，并非是对本申请作其它形式的限制，任何熟悉本专业的技术人员可能利用上述揭示的技术内容加以变更或改型为等同变化的等效实施例。但是凡是未脱离本申请技术方案内容，依据本申请的技术实质对以上实施例所作的任何简单修改、等同变化与改型，仍属于本申请技术方案的保护范围。

Claims (14)

1.一种T细胞受体(TCR)，其中，所述TCR包含含有可变区的α链和/或含有可变区的β链，α链的可变区包含氨基酸序列为如SEQ ID NO:2、SEQ ID NO:8或SEQ ID NO:14所示的互补决定区1(CDR1)；和/或
氨基酸序列为如SEQ ID NO:3、SEQ ID NO:9或SEQ ID NO:15所示的互补决定区2(CDR2)。
2.根据权利要求1所述的T细胞受体(TCR)，其中，所述β链的可变区包含氨基酸序列为如SEQ ID NO:5、SEQ ID NO:11或SEQ ID NO:17所示的互补决定区1(CDR1)；和/或
氨基酸序列为如SEQ ID NO:6、SEQ ID NO:12或SEQ ID NO:18所示的互补决定区2(CDR2)。
3.根据权利要求1或2所述的T细胞受体(TCR)，其中，所述α链的可变区包含含有氨基酸序列为如SEQ ID NO:4、SEQ ID NO:10或SEQ ID NO:16所示的互补决定区3(CDR3)；和/或
所述β链的可变区包含含有氨基酸序列为如SEQ ID NO:7、SEQ ID NO:13或SEQ ID NO:19所示的互补决定区3(CDR3)；
优选地，所述α链的可变区还包括第一先导序列；和/或
所述β链的可变区还包括第二先导序列；
优选地，所述α链可变区的氨基酸序列如SEQ ID NO:26、SEQ ID NO:28或SEQ ID NO:30所示或者与SEQ ID NO:26、SEQ ID NO:28或SEQ ID NO:30具有至少90％序列相同性的氨基酸序列，和/或所述β链的可变区的氨基酸序列如SEQ ID NO:27、SEQ ID NO:29或SEQ IDNO:31所示或者与SEQ ID NO:27、SEQ ID NO:29或SEQ ID NO:31具有至少90％序列相同性的氨基酸序列；
优选地，所述α链还包含α恒定区和/或所述β链还包含β恒定区，优选地，所述恒定区为小鼠恒定区或人恒定区。
4.根据权利要求1-3中任一项所述的T细胞受体(TCR)，其中，所述TCR是分离的或纯化的或者是重组的；
优选地，所述TCR是人的；
优选地，所述TCR是单克隆的；
优选地，所述TCR是单链；
优选地，所述TCR包含两条链；
优选地，所述TCR为细胞结合的形式或为可溶的形式，优选为可溶的形式；
优选地，所述TCR与抗原短肽-HLA-A1101复合物结合，优选地，所述抗原短肽的氨基酸序列如SEQ ID NO:1所示。
5.一种核酸分子，其中，所述核酸分子包含编码权利要求1-4中任一项所述的TCR或者所述TCR的α链或β链。
6.根据权利要求5所述的核酸分子，其中编码α链的核苷酸序列包含如SEQ ID NO:34、SEQ ID NO:36或SEQ ID NO:38所示的核苷酸序列；和/或
编码β链的核苷酸序列包含如SEQ ID NO:35、SEQ ID NO:37或SEQ ID NO:39所示的核苷酸序列。
7.一种载体，其中，所述载体包含权利要求5或6所述的核酸分子。
8.根据权利要求7所述的载体，其中，所述载体为表达载体；
优选地，所述载体为病毒载体，优选为逆转录病毒载体；
优选地，所述病毒载体为慢病毒载体。
9.一种工程化细胞，其包含权利要求1-4中任一项所述的TCR、权利要求5-6中任一项所述的核酸分子或者权利要求7-8中任一项所述的载体。
10.根据权利要求9所述的工程化细胞，其中，所述TCR对所述细胞是异源的；
优选地，所述工程化细胞是细胞系；
优选地，所述工程化细胞是获自受试者的原代细胞，优选地，所述受试者为哺乳动物受试者，优选为人；
优选地，所述工程化细胞是T细胞或NK细胞，优选地，所述T细胞是从外周血分离的T细胞；
优选地，所述T细胞为CD8+或CD4+。
11.一种生产权利要求9-10中任一项所述的工程化细胞的方法，其包括在体外或离体地将权利要求5-6中任一项所述的核酸分子或者权利要求7-8中任一项所述的载体引入细胞中。
12.根据权利要求11所述的方法，其中，所述载体为病毒载体，并且所述引入是通过转导进行的。
13.一种药物组合物，其包含权利要求1-4中任一项所述的T细胞受体(TCR)、权利要求5-6任一项所述的核酸分子、权利要求7-8中任一项所述的载体或者权利要求9-10中任一项所述的工程化细胞；
优选地，其还包含药学上可接受的载体或佐剂。
14.权利要求1-4中任一项所述的T细胞受体(TCR)、权利要求5-6中任一项所述的核酸分子、权利要求7-8中任一项所述的载体、权利要求9-10中任一项所述的工程化细胞或者权利要求13所述的药物组合物在制备治疗与HPV相关的疾病的药物中的用途；
优选地，与HPV相关的疾病为HPV慢性感染、宫颈上皮内瘤样病变、宫颈癌、头颈癌、肛门癌、阴茎癌、阴道癌或外阴癌。
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