CN110357952B

CN110357952B - 识别人乳头瘤病毒hpv16-e7抗原的tcr

Info

Publication number: CN110357952B
Application number: CN201910647771.2A
Authority: CN
Inventors: 王明军; 陈磊; 董莲花
Original assignee: Shenzhen Innovation Immunotechnology Co ltd; Shenzhen Innovation Conversion Medical Science Research Institute
Current assignee: Shenzhen Innovation Immunotechnology Co ltd; Shenzhen Innovation Conversion Medical Science Research Institute
Priority date: 2019-07-17
Filing date: 2019-07-17
Publication date: 2022-03-22
Anticipated expiration: 2039-07-17
Also published as: CN110357952A

Abstract

本发明涉及T细胞抗原受体技术领域，具体涉及能特异性识别并结合人乳头瘤病毒抗原HPV16‑E7的TCR，以及包含编码所述TCR的核苷酸序列或其互补序列的核酸分子，以及含有所述核酸分子的载体，以及转导所述核酸分子或所述载体的细胞，以及包含所述TCR、核酸分子、载体或细胞作为活性成分的药物组合物，以及所述TCR、核酸分子、载体、细胞、药物组合物分别用于制备治疗肿瘤或病毒感染的药物的用途。

Description

识别人乳头瘤病毒HPV16-E7抗原的TCR

技术领域

本发明涉及T细胞抗原受体技术领域，尤其涉及能特异性识别并结合人乳头瘤病毒抗原HPV16-E7的TCR，以及包含编码所述TCR的核苷酸序列或其互补序列的核酸分子，以及含有所述核酸分子的载体，以及转导所述核酸分子或所述载体的细胞，以及包含所述TCR、核酸分子、载体或细胞作为活性成分的药物组合物，以及所述TCR、核酸分子、载体、细胞、药物组合物的用途。

背景技术

人乳头瘤病毒(Human papillomavirus，HPV)是一种小型的双链DNA病毒。根据HPV的致病性差异，可将HPV分为高危型和低危型两类。研究证实高危型HPV(包括HPV-16、18、31、33以及45)的持续性感染是导致多种恶性肿瘤的诱因。例如：HPV-16及HPV-18的感染可诱发宫颈癌及头颈癌；此外，约70％的直肠癌以及超过75％的舌根和扁桃体癌也均与HPV-16感染相关。尽管接种HPV疫苗可有效预防HPV感染所引发的癌症，然而对于已经感染HPV的肿瘤患者，尤其是晚期肿瘤患者，手术、放疗、化疗等常规疗法对患者病情的缓解均收效甚微。

高危型HPV病毒对细胞的感染和转化使得肿瘤细胞内表达HPV特异的肿瘤抗原，如癌蛋白E6及E7。这些抗原在正常人体组织中并无表达，是理想的T淋巴细胞识别并杀伤肿瘤细胞的靶点。然而，研究显示在宫颈癌患者的外周血中没有或仅存在数量稀少的HPV16-E7_11-19特异性的T细胞。T细胞受体基因修饰的T淋巴细胞过继免疫疗法(Adoptive celltransfer，ACT)通过将可识别病毒/肿瘤抗原的TCR基因整合至患者T细胞中，使得原本不具备抗原特异性的患者T细胞可识别并杀伤肿瘤细胞，从而达到治疗肿瘤的效用(Jin，B.Y.，et al.2018，JCI insight，3(8)：e99488)。临床研究显示T细胞受体基因转导的T细胞用于治疗12例HPV阳性晚期肿瘤患者，(包括6例宫颈癌、4例直肠癌、1例口咽癌和1例阴道癌)，所有患者均未产生自身免疫、细胞因子释放等毒副作用，显示出该疗法良好的安全性和耐受性。此外，2名患者的肿瘤转移病灶消退，且分别获得3个月和6个月的持续性病情缓解(Hinrichs，C.S.，et al.2017，American Society of Clinical Oncology，35：3009-3009.)。

分离并鉴定得到特异性、亲和力良好的TCR是实施TCR基因修饰T细胞免疫治疗的基础。不同TCR分子的特性赋予了TCR-T产品不同的效用功能。

发明内容

本发明的目的在于提供一种能识别并结合HLA-A2-HPV16-E7_11-19抗原复合物的TCR，以及包含编码所述TCR的核苷酸序列或其互补序列的核酸分子，以及含有所述核酸分子的载体，以及转导所述核酸分子或所述载体的细胞，以及包含所述TCR、核酸分子、载体或细胞作为活性成分的药物组合物，以及所述TCR、核酸分子、载体、细胞、药物组合物的用途。

所述HLA-A2-HPV16-E7_11-19抗原复合物由人白细胞表面抗原HLA-A2及HPV16-E7_11-19短肽(YMLDLQPET)组成，表达于目标靶细胞表面。

为实现上述目的，本发明采用以下技术方案。

本发明的第一方面，提供一种识别人乳头瘤病毒HPV16-E7抗原的TCR，所述TCR具有结合HLA—A2-HPV16-E7_11-19抗原复合物的特性，所述TCR包含TCR α链可变区和TCR β链可变区；

所述TCR α链可变区的CDR3氨基酸序列为CAVLYGNNRLAF(SEQ ID NO：7)，

和/或所述TCR β链可变区的CDR3氨基酸序列为CASSLAWRGGSYNEQFF(SEQ ID NO：10)。

优选的，所述TCRα链可变区的3个互补决定区氨基酸序列为：

α CDR1：SEQ ID NO：5，

α CDR2：SEQ ID NO：6，

α CDR3：SEQ ID NO：7。

更优选的，所述TCR α链可变区的3个互补决定区核苷酸序列为：

α CDR1：SEQ ID NO：11，

α CDR2：SEQ ID NO：12，

α CDR3：SEQ ID NO：13。

优选的，所述TCR β链可变区的3个互补决定区氨基酸序列为：

β CDR1：SEQ ID NO：8，

β CDR2：SEQ ID NO：9，

β CDR3：SEQ ID NO：10。

更优选的，所述TCR β链可变区的3个互补决定区核苷酸序列为：

β CDR1：SEQ ID NO：14，

β CDR2：SEQ ID NO：15，

β CDR3：SEQ ID NO：16。

优选的，以上所述的识别人乳头瘤病毒HPV16-E7抗原的TCR，所述TCR α链可变区的氨基酸序列为与SEQ ID NO：1具有至少90％序列相同性的氨基酸序列。

优选的，以上所述的识别人乳头瘤病毒HPV16-E7抗原的TCR，所述TCR β链可变区的氨基酸序列为与SEQ ID NO：2具有至少90％序列相同性的氨基酸序列。

本发明的另一方面，提供一种核酸分子，所述核酸分子包含编码以上任一所述TCR的核苷酸序列或其互补序列。

优选的，所述核酸分子包含编码TCR α链可变区的核苷酸序列SEQ ID NO：3，和/或包含编码TCR β链可变区的核苷酸序列SEQ ID NO：4。

本发明的另一方面，提供一种载体，所述载体含有以上任一所述的核酸分子。

优选的，所述载体为病毒载体。

更优选的，所述载体为逆转录病毒载体或慢病毒载体。

本发明的另一方面，提供一种细胞，所述细胞转导以上任一所述核酸分子或以上任一所述载体，该细胞可表达结合HLA-A2-HPV16-E7_11-19抗原复合物的特异性TCR。

优选的，所述细胞为T细胞或干细胞。

本发明的另一方面，提供一种药物组合物，所述药物组合物包含以上任一所述的TCR、以上任一所述的核酸分子、以上任一所述的载体或以上任一所述的细胞作为活性成分。

本发明的另一方面，以上任一所述的TCR、以上任一所述的核酸分子、以上任一所述的载体、以上任一所述的细胞、以上任一所述的药物组合物用于制备治疗肿瘤或病毒感染的药物。

优选的，以上任一所述的TCR、任一所述的核酸分子、任一所述的载体、任一所述的细胞、任一所述的药物组合物分别用于制备治疗HPV阳性的各类恶性肿瘤的药物；进一步地，用于制备治疗宫颈癌、头颈癌、直肠癌、阴道癌的药物。

与现有技术相比，本发明的有益效果是：

本发明提供了能特异性识别并结合HLA-A2-HPV16-E7_11-19抗原复合物的TCR，以及包含编码所述TCR的核苷酸序列或其互补序列的核酸分子，以及含有所述核酸分子的载体，以及转导所述核酸分子或所述载体的细胞，以及包含所述TCR、核酸分子、载体或细胞作为活性成分的药物组合物，以及所述TCR、核酸分子、载体、细胞、药物组合物分别用于制备治疗肿瘤或病毒感染的药物的用途。

附图说明

图1为插入逆转录病毒载体的TCR序列元件示意图；

图2流式细胞术检测HLA-A2-HPV16-E7_11-19特异性TCR(G8)基因修饰T细胞(TCR-T细胞)的转导效率；

图3为流式细胞术检测G8TCR-T细胞与靶细胞共培养后释放细胞因子(IFN-γ及IL-2)及发挥细胞毒性功能(CD107a表达)的能力；

图4为ELISA检测G8TCR-T细胞与人宫颈癌细胞系(HLA-A2阳性且HPV16-E7抗原阳性)共培养后，特异性释放细胞因子的能力。

具体实施方式

为了更充分的理解本发明的技术内容，下面结合具体实施例对本发明的技术方案作进一步介绍和说明。对于本领域的技术人员来说，通过阅读本说明书公开的内容，本发明的特征、有益效果和优点将变得显而易见。以下实施例的主要目的是用于进一步介绍本发明方法的具体实施过程，不代表本发明方法仅能按以下实施例实现。

实施例1：HLA-A2-HPV16-E7_11-19特异性T细胞的克隆及测序

利用化学合成的短肽YMLDLQPET(生工生物工程(上海)股份有限公司)体外刺激来源于HLA-A2基因型且HPV阳性宫颈癌患者的外周血单个核细胞(PBMC)。经过2轮多肽刺激后，将多克隆T细胞(1×10⁵)与1×10⁵负载YMLDLQPET短肽(靶细胞)或非目标短肽的T2细胞(对照细胞)于37℃共培养过夜。第二天检测培养上清中细胞因子IFN-r的释放量。将阳性多克隆T细胞(靶细胞OD₄₅₀-对照细胞OD₄₅₀＞1.0)进行有限稀释克隆，14天后ELISA检测有限稀释后各孔T细胞与靶细胞的反应性。挑取阳性单克隆T细胞进行快速扩增。快速扩增14天后，用鼠抗人CD8抗体(BD Biosciences)及HLA-A2-HPV16-E7_11-19四聚体染色(MBL)对T细胞进行染色，经流式细胞仪分选出CD8阳性且四聚体染色阳性的目标T细胞(克隆G8)。

分选后的T细胞(2-5×10⁶)经离心去除上清后重悬于1mL Trizol(RNeasy Plusuniversal Mini Kit，QIAGEN)，液氮速冻后送测序(免疫组库测序，苏州金唯智生物科技有限公司)。根据测序结果将测得频率最高的TCRα链及TCRβ链进行配对，PCR构建包含恒定区的全长TCR(TCR序列的元件示意图如图1所示)并插入逆转录病毒载体中。

其中，TCRα链可变区氨基酸序列为SEQ ID NO：1。

TCR α链可变区的3个互补决定区氨基酸序列为：

α CDR1：TSGFNG(SEQ ID NO：5)，

α CDR2：NVLDGL(SEQ ID NO：6)，

α CDR3：CAVLYGNNRLAF(SEQ ID NO：7)。

TCRα链可变区核苷酸序列为SEQ ID NO：3。

TCR α链可变区的3个互补决定区核苷酸序列为：

α CDR1：acatctgggt tcaacggg(SEQ ID NO：11)，

α CDR2：aatgttctgg atggtttg(SEQ ID NO：12)，

α CDR3：tgtgctgtcc tctatgggaa caacagactc gctttt(SEQ ID NO：13)。

TCRβ链可变区氨基酸序列为SEQ ID NO：2。

TCR β链可变区的3个互补决定区氨基酸序列为：

β CDR1：SGHDT(SEQ ID NO：8)，

β CDR2：YYEEEE(SEQ ID NO：9)，

β CDR3：CASSLAWRGGSYNEQFF(SEQ ID NO：10)。

TCRβ链可变区核苷酸序列为SEQ ID NO：4。

TCR β链可变区的3个互补决定区核苷酸序列为：

β CDR1：tctgggcatg acact(SEQ ID NO：14)，

β CDR2：tattatgagg aggaagag(SEQ ID NO：15)，

β CDR3：tgtgccagca gcttggcgtg gcgggggggc tcctacaatg agcagttctt c(SEQID NO：16)。

实施例2：制备HLA-A2-HPV16-E7_11-19特异性TCR基因修饰的T细胞

将目标TCR克隆至逆转录病毒载体pMSGV1中(addgene)构建pMSGV1-G8 TCR载体。转染病毒包装细胞系293GP细胞pMSGV1-G8 TCR及pVSV-G质粒，制备逆转录病毒并采用病毒上清转导T细胞。

转染操作如下：第0天将293GP细胞接种至6孔板(6×10⁵/孔)；第1天，pMSGV1-G8TCR及pVSV-G质粒转染293GP细胞(2μg pMSGV1-G8TCR及1.4μg pVSV-G/孔)，同一天，采用抗人CD3抗体(OKT3)活化健康人的PBMC；第3天，收集含病毒上清的培养液，并添加新鲜的培养液(含10％胎牛血清的DMEN)至293GP细胞中；用收集的病毒上清离心转染活化后的T细胞；第4天采用同样的方法第二次转染活化的T细胞；第5天将转染后的T细胞收集至T25培养瓶中进行培养(培养液为含10％胎牛血清及300U/mL IL2的X-VIVO(Lonza))。第10天流式检测目标TCR的表达水平，如图2所示，TCR的转导效率(四聚体染色的阳性率)为39％。

实施例3：HLA-A2-HPV16-E7_11-19特异性TCR基因修饰T细胞的体外功能验证

流式细胞术检测：靶细胞的制备如下，将负载目标HPV16-E7_11-19多肽及对照多肽CMV-pp65_495-503的T2细胞(HLA-A2⁺)与TCR-T细胞于37℃共培养4小时后，流式细胞术检测T细胞细胞毒性功能标志物CD107a的表达、细胞因子IFN-γ及IL-2的表达，如图3所示，HLA-A2-HPV16-E7_11-19特异性TCR基因修饰T细胞可特异性识别靶细胞释放细胞因子并发挥细胞毒性效用。

ELISA检测：将HLA-A2⁺且HPV⁺的人宫颈癌细胞系CaSki(ATCC)分别与CD4⁺以及CD8⁺G8TCR-T细胞进行共培养(37℃，16h)，取培养上清检测IFN-γ的释放量，如图4所示，CD4⁺以及CD8⁺的对照T细胞均不识别CaSki靶细胞，而TCR基因修饰后的CD4⁺以及CD8⁺T细胞均可特异性识别靶细胞并释放细胞因子，表明该TCR发挥功能不依赖于CD8分子，具有较高的亲和力。

以上所述仅以实施例来进一步说明本发明的技术内容，以便于读者更容易理解，但不代表本发明的实施方式仅限于此，任何依本发明所做的技术延伸或再创造，均受本发明的保护。

序列表

<110> 深圳因诺免疫有限公司；深圳市因诺转化医学研究院

<120> 识别人乳头瘤病毒HPV16-E7抗原的TCR

<130> 20190624

<141> 2019-07-17

<160> 16

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 109

<212> PRT

<213> 人( Homo sapiens)

<400> 1

Gly Gln Asn Ile Asp Gln Pro Thr Glu Met Thr Ala Thr Glu Gly Ala

1 5 10 15

Ile Val Gln Ile Asn Cys Thr Tyr Gln Thr Ser Gly Phe Asn Gly Leu

20 25 30

Phe Trp Tyr Gln Gln His Ala Gly Glu Ala Pro Thr Phe Leu Ser Tyr

35 40 45

Asn Val Leu Asp Gly Leu Glu Glu Lys Gly Arg Phe Ser Ser Phe Leu

50 55 60

Ser Arg Ser Lys Gly Tyr Ser Tyr Leu Leu Leu Lys Glu Leu Gln Met

65 70 75 80

Lys Asp Ser Ala Ser Tyr Leu Cys Ala Val Leu Tyr Gly Asn Asn Arg

85 90 95

Leu Ala Phe Gly Lys Gly Asn Gln Val Val Val Ile Pro

100 105

<210> 2

<211> 116

<212> PRT

<213> 人( Homo sapiens)

<400> 2

Asp Ala Gly Val Thr Gln Ser Pro Thr His Leu Ile Lys Thr Arg Gly

1 5 10 15

Gln Gln Val Thr Leu Arg Cys Ser Pro Lys Ser Gly His Asp Thr Val

20 25 30

Ser Trp Tyr Gln Gln Ala Leu Gly Gln Gly Pro Gln Phe Ile Phe Gln

35 40 45

Tyr Tyr Glu Glu Glu Glu Arg Gln Arg Gly Asn Phe Pro Asp Arg Phe

50 55 60

Ser Gly His Gln Phe Pro Asn Tyr Ser Ser Glu Leu Asn Val Asn Ala

65 70 75 80

Leu Leu Leu Gly Asp Ser Ala Leu Tyr Leu Cys Ala Ser Ser Leu Ala

85 90 95

Trp Arg Gly Gly Ser Tyr Asn Glu Gln Phe Phe Gly Pro Gly Thr Arg

100 105 110

Leu Thr Val Leu

115

<210> 3

<211> 327

<212> DNA

<213> 人( Homo sapiens)

<400> 3

ggacaaaaca ttgaccagcc cactgagatg acagctacgg aaggtgccat tgtccagatc 60

aactgcacgt accagacatc tgggttcaac gggctgttct ggtaccagca acatgctggc 120

gaagcaccca catttctgtc ttacaatgtt ctggatggtt tggaggagaa aggtcgtttt 180

tcttcattcc ttagtcggtc taaagggtac agttacctcc ttttgaagga gctccagatg 240

aaagactctg cctcttacct ctgtgctgtc ctctatggga acaacagact cgcttttggg 300

aaggggaacc aagtggtggt catacca 327

<210> 4

<211> 348

<212> DNA

<213> 人( Homo sapiens)

<400> 4

gacgctggag tcacccaaag tcccacacac ctgatcaaaa cgagaggaca gcaagtgact 60

ctgagatgct ctcctaagtc tgggcatgac actgtgtcct ggtaccaaca ggccctgggt 120

caggggcccc agtttatctt tcagtattat gaggaggaag agagacagag aggcaacttc 180

cctgatcgat tctcaggtca ccagttccct aactatagct ctgagctgaa tgtgaacgcc 240

ttgttgctgg gggactcggc cctctatctc tgtgccagca gcttggcgtg gcgggggggc 300

tcctacaatg agcagttctt cgggccaggg acacggctca ccgtgcta 348

<210> 5

<211> 6

<212> PRT

<213> 人(Homo sapiens)

<400> 5

Thr Ser Gly Phe Asn Gly

1 5

<210> 6

<211> 6

<212> PRT

<213> 人(Homo sapiens)

<400> 6

Asn Val Leu Asp Gly Leu

1 5

<210> 7

<211> 12

<212> PRT

<213> 人(Homo sapiens)

<400> 7

Cys Ala Val Leu Tyr Gly Asn Asn Arg Leu Ala Phe

1 5 10

<210> 8

<211> 5

<212> PRT

<213> 人(Homo sapiens)

<400> 8

Ser Gly His Asp Thr

1 5

<210> 9

<211> 6

<212> PRT

<213> 人(Homo sapiens)

<400> 9

Tyr Tyr Glu Glu Glu Glu

1 5

<210> 10

<211> 17

<212> PRT

<213> 人(Homo sapiens)

<400> 10

Cys Ala Ser Ser Leu Ala Trp Arg Gly Gly Ser Tyr Asn Glu Gln Phe

1 5 10 15

Phe

<210> 11

<211> 18

<212> DNA

<213> 人(Homo sapiens)

<400> 11

acatctgggt tcaacggg 18

<210> 12

<211> 18

<212> DNA

<213> 人(Homo sapiens)

<400> 12

aatgttctgg atggtttg 18

<210> 13

<211> 36

<212> DNA

<213> 人(Homo sapiens)

<400> 13

tgtgctgtcc tctatgggaa caacagactc gctttt 36

<210> 14

<211> 15

<212> DNA

<213> 人(Homo sapiens)

<400> 14

tctgggcatg acact 15

<210> 15

<211> 18

<212> DNA

<213> 人(Homo sapiens)

<400> 15

tattatgagg aggaagag 18

<210> 16

<211> 51

<212> DNA

<213> 人(Homo sapiens)

<400> 16

tgtgccagca gcttggcgtg gcgggggggc tcctacaatg agcagttctt c 51

Claims

1.一种识别人乳头瘤病毒HPV16-E7抗原的TCR，其特征在于，所述TCR具有结合HLA-A2-HPV16-E7_11-19抗原复合物的特性，所述TCR包含TCR α链可变区和TCR β链可变区；

所述TCR α链可变区的3个互补决定区氨基酸序列为：

α CDR1：TSGFNG（SEQ ID NO：5），

α CDR2：NVLDGL（SEQ ID NO：6），

α CDR3：CAVLYGNNRLAF（SEQ ID NO：7）；

所述TCR β链可变区的3个互补决定区氨基酸序列为：

β CDR1：SGHDT（SEQ ID NO：8），

β CDR2：YYEEEE（SEQ ID NO：9），

β CDR3：CASSLAWRGGSYNEQFF（SEQ ID NO：10）；

其中，所述HLA-A2-HPV16-E7_11-19抗原复合物由人白细胞表面抗原HLA-A2及HPV16-E7_11-19短肽组成，表达于目标靶细胞表面。

2.一种核酸分子，其特征在于，所述核酸分子包含编码权利要求1所述TCR的核苷酸序列。

3.根据权利要求2所述的核酸分子，其特征在于，所述核酸分子包含编码TCR α链可变区的核苷酸序列SEQ ID NO：3，和包含编码TCR β链可变区的核苷酸序列SEQ ID NO：4。

4.一种载体，其特征在于，所述载体含有权利要求2-3任一项所述的核酸分子。

5.一种T细胞，其特征在于，所述T细胞转导权利要求2-3任一项所述的核酸分子或权利要求4所述的载体，该T细胞可表达结合HLA-A2-HPV16-E7_11-19抗原复合物的特异性TCR。

6.一种药物组合物，其特征在于，所述药物组合物包含权利要求1所述的TCR、权利要求2-3任一项所述的核酸分子、权利要求4所述的载体或权利要求5所述的T细胞作为活性成分。

7.权利要求1所述的TCR、权利要求2-3任一项所述的核酸分子、权利要求4所述的载体、权利要求5所述的T细胞或权利要求6所述的药物组合物在制备用于治疗宫颈癌或HPV病毒感染的药物中的应用。