CN113549157A - 双靶向嵌合抗原受体及其应用 - Google Patents

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Abstract

本发明提供一种双靶向嵌合抗原受体，其抗原结合域包括串联的抗BCMA scFv和抗CD38scFv。本发明结果表明，这种串联双抗原靶向策略代表了一种有效的抗肿瘤疗法，并可能最终为采用T细胞疗法治疗由BCMA或者CD38抗原逃逸导致的MM提供有效保障。

Description

双靶向嵌合抗原受体及其应用
技术领域
本发明涉及肿瘤的细胞免疫治疗领域，具体涉及双靶向嵌合抗原受体及其应用。
背景技术
多发性骨髓瘤(MM)是全球第二大最常见的血液系统恶性肿瘤，仅2019年造成全球113,474人死亡。作为一种浆细胞癌症，MM的特征是恶性浆细胞在骨髓中浸润，并伴有血液和/或血清中单克隆免疫球蛋白或轻链(M蛋白)过度生成。近年来，针对MM微环境的药物，如蛋白酶体抑制剂硼替佐米和免疫调节药物(IMiD)沙利度胺和来那度胺，已被用于MM的初始、巩固、维持和抢救治疗，显著改善了患者的治疗效果和生存率。然而，由于耐药性和难治性疾病的发生，MM在很大程度上仍然无法治愈。
嵌合抗原受体T细胞(CAR-T)疗法已经成为一种新型的免疫疗法，对一些血液系统恶性肿瘤的长期疾病控制具有巨大的潜力，这鼓励了CAR-T细胞治疗MM的发展，特别是针对复发/难治性多发性骨髓瘤。在几种CAR-T细胞疗法中，针对B细胞成熟抗原(BCMA)的CAR-T细胞的发展受到的关注最多，目前已有20多项早期临床研究正在进行。值得注意的是，蓝鸟生物公司的bb2121抗BCMA CAR-T细胞(idecabtagene vicleucel，ide-cel)于2021年3月26日被美国食品和药物管理局(FDA)批准作为第一个BCMA CAR-T细胞，用于治疗复发或难治性MM的成年患者。然而，多项临床试验报告显示，MM患者复发涉及肿瘤细胞BCMA抗原丢失或表达下调，低于CAR-T细胞激活所需的阈值，减弱了CAR-T细胞的治疗效果。
人CD38抗原(45kDa)是一种单链的II型跨膜糖蛋白，MM患者中，90％以上的恶性浆细胞表面表达CD38。此外，CD38在多种免疫细胞中均有表达，包括T细胞、B细胞、NK细胞、巨噬细胞和树突状细胞，但其表达水平低于MM细胞。因此，CD38被认为是治疗MM的一个可行的靶标，多项研究已证明CD38单克隆抗体在临床应用中的有效性和安全性。早在2015年9月，一种抗CD38的单克隆抗体(Daratumumab)已被FDA批准用于治疗RRMM。基于此，许多研究人员探讨了开发针对CD38分子的CAR-T细胞疗法的可行性。早期的临床前研究表明，CD38CAR-T细胞能够在体内有效的增殖，产生细胞因子以及消除CD38+骨髓瘤细胞。最近，几个关于抗CD38 CAR-T细胞治疗MM的临床试验正在进行中(NCT03464916，NCT03754764)。我们在前期研究中也发现，CD38 CAR-T细胞可在体内外有效的扩增且对骨髓瘤细胞表现出明显的治疗作用。
发明内容
为了解决上述问题，本发明提供一种表达双特异性CAR分子的T细胞，也被称为“Tan CAR-T细胞”，这种方法通过增加效应细胞的特异性以抵消抗原逃逸。Tan CAR的设计是基于“OR”门控的信号计算，当两个不同的抗原中的任何一个出现在靶细胞上时，T细胞就会被激活，因此肿瘤细胞若要逃避T细胞识别则必须同时失去两个表面抗原，这使得肿瘤细胞产生抗原逃逸的可能性大大降低。在本发明中，我们选择了2个在MM细胞表面广泛表达且已经过临床验证的抗原：BCMA，CD38，设计将抗BCMA及CD38的Scfv区串联，构建Tan CAR，将其转导人原代T细胞后，通过体内外实验检测其对多发性骨髓瘤细胞的治疗作用。
在一种实施方式中，本发明提供一种双靶向嵌合抗原受体，其抗原结合域包括串联的抗BCMA scFv和抗CD38 scFv。
在一种实施方式中，本发明的双靶向嵌合抗原受体的抗原结合域由抗BCMA scFv和抗CD38 scFv通过柔性的连接肽串联组成，所述柔性的连接肽优选的是(Gly4Ser)4。
在一种实施方式中，本发明的双靶向嵌合抗原受体的抗原结合域依次是抗BCMAscFv-(Gly4Ser)4-抗CD38 scFv或者抗CD38 scFv-(Gly4Ser)4-BCMA scFv。
在一种实施方式中，抗BCMA scFv氨基酸序列是是SEQ ID NO：1，和抗CD38 scFv氨基酸序列是是SEQ ID NO：2；
SEQ ID NO：1：DIVLTQSPPSLAMSLGKRATISCRASESVTILGSHLIHWYQQKPGQPPTLLIQLASNVQTGVPARFSGSGSRTDFTLTIDPVEEDDVAVYYCLQSRTIPRTFGGGTKLEIKGSTSGSGKPGSGEGSTKGQIQLVQSGPELKKPGETVKISCKASGYTFTDYSINWVKRAPGKGLKWMGWINTETREPAYAYDFRGRFAFSLETSASTAYLQINNLKYEDTATYFCALDYSYAMDYWGQGTSVTVSSAAA；
SEQ ID NO：2：SQVQLVQSGGGLVQPGRSLRLPCAASGFTFDDYAMHWVRQAPGKGLEWVSGISWNSGSIAYADSVKGRFTISRDNAKNSLYLQMNSLRAEDTAVYYCAREGGSGSYYNPFYYYGMDVWGQGTTVTVSSGGGGSGGGGSGGGGSQAVLTQPPSASGTPGQRVTISCSGSSSNIGGNTVAWYQQLPGTAPKLLIYNYSQRPSGVPDRFSGSKSGTSSSLAIGGLQSEDEADYYCAAWDDSLNGVVFGGGTKLTVLG。
在一种实施方式中，该受体包括依次串联的上游的信号肽和用于检测的myc标签；包含重链可变区与轻链可变区的双靶向的BCMA-OR-CD38 Tan-CAR或CD38-OR-BCMA Tan-CAR的嵌合抗原结合域；CD8跨膜及铰链区；CD28或4-1BB共刺激信号域以及CD3ζ胞内信号域。
在一种实施方式中，提供一种双靶向的BCMA-OR-CD38 Tan-CAR或CD38-OR-BCMATan-CAR的嵌合抗原受体T细胞，其表达上述的嵌合抗原受体。
在一种实施方式中，提供一种治疗肿瘤的药物，其含有上述的嵌合抗原受体T细胞。
在一种实施方式中，提供一种上述嵌合抗原受体在制备嵌合抗原受体T细胞及其在肿瘤治疗中的应用。
在一种实施方式中，所述肿瘤是多发性骨髓瘤。
在一种实施方式中，提供上述嵌合抗原受体的应用，将编码所述嵌合抗原受体的基因片段插入病毒表达载体，包装成病毒载体颗粒，感染人T细胞，制备得到嵌合抗原受体T细胞，用于表面CD38阳性的肿瘤治疗。
在本发明中描述了两种新型的Tan CARs疗法，其Scfv区由抗CD38和抗BCMA scFv串联组成，此外，还包括CD28信号刺激域和CD3ζ胞内信号域。在我们的研究结果中，我们发现当BCMA或CD38存在于靶细胞上时，Tan-CAR T细胞可以引发强大的T细胞介导的细胞毒性和细胞因子的产生。此外，当同时遇到BCMA和CD38抗原时，这些Tan-CAR-T细胞的细胞毒性和增殖能力明显高于单靶向的CAR-T细胞。值得注意的是，BCMA-OR-CD38 Tan CAR-T细胞比CD38-OR-BCMA Tan CAR-T细胞表现出更强的抗肿瘤和增殖活性。因此，我们在后续的实验进一步评估了BCMA-OR-CD38 Tan CAR-T细胞对多发性骨髓瘤细胞的体内治疗作用。结果显示，BCMA-OR-CD38 Tan CAR-T细胞对多发性骨髓瘤荷瘤小鼠有明显的治疗作用，在第二次注射Tan-CAR T细胞四天后可以实现肿瘤的完全清除。因此，本发明结果表明，这种串联双抗原靶向策略代表了一种有效的抗肿瘤疗法，并可能最终为采用T细胞疗法治疗由BCMA抗原逃逸导致的MM提供有效保障。
Tan CAR的双靶向特异性是通过在一个CAR分子中插入双抗原识别结构域实现的。除了Tan CAR，还有多种方法可以实现双特异性的信号识别，如在一个T细胞中同时表达两个靶向不同肿瘤抗原的完整的CAR分子(称为双CAR)，或混合两个靶向不同肿瘤抗原的CAR-T细胞系。与双CAR相比，Tan CAR的基因载荷要小得多(减少约40％的DNA长度)，这导致了更有效的病毒载体包装，更高的转导效率。这些因素都有利于临床T细胞的生产和CAR-T细胞的基因改造。两个靶向不同肿瘤抗原的CAR-T细胞系的惯序输注策略虽避免了转导效率低下的问题，但需要制造两个CAR-T产品，这大大增加了治疗成本，并降低了在较短临床时间内成功生产T细胞的概率。更重要的是，两个CAR-T细胞群可能会争夺血液中有限的营养物质和稳态细胞因子。CD38也在T细胞表面表达，当CD38 CAR转导T细胞并输注入体内后，可能会导致T细胞的自杀。因此，共同施用BCMA和CD38 CAR-T细胞群可能会导致CD38 CAR-T以牺牲BCMA CAR-T细胞为代价而不成比例地扩张，从而影响Tan CAR的设计初衷，即通过抵销BCMA抗原逃逸来治疗RRMM。出于这个原因，在本发明中选择通过在一个CAR分子上附加两个串联的scFv域来设计能够识别双抗原的Tan CAR。我们的数据表明，Tan-CAR T细胞确实对靶细胞上BCMA的丢失不敏感，并且在受到BCMA或CD38抗原刺激时均可产生强大的对靶细胞的杀伤作用。
在本发明中，我们设计了两个Tan CAR，其抗原识别域来自BCMA scFv和CD38scFv，通过一种长而灵活的连接肽，甘氨酸和丝氨酸残基串联在一起，这种连接肽由于具有较低的免疫原性而被广泛使用。这两种Tan CAR的区别在于scFv结构域的顺序改变。利用PG13逆转录病毒载体生产细胞系中收获的逆转录病毒载体对刺激后的T细胞进行转导，TanCAR-T细胞的转导效率均超过70％。我们通过体内和体外实验评估了Tan CAR-T对BCMA和CD38的特异性靶向作用。结果显示，Tan-CAR T细胞在受到BCMA或CD38的刺激后均可引发明显的T细胞介导的细胞毒性和细胞因子的产生。此外，当与同时表达BCMA和CD38抗原的靶细胞共孵育时，结果显示Tan-CAR-T细胞的细胞毒性和增殖能力明显高于单靶向的CAR-T细胞。值得注意的是，BCMA-OR-CD38 Tan CAR-T细胞与BCMA-K562、CD38-Raji或RPMI-Luc细胞共孵育时，显示出比CD38-OR-BCMA Tan CAR-T细胞更强的抗肿瘤和增殖活性。因此，我们通过尾静脉注射RPMI-Luc肿瘤细胞系建立异种肿瘤移植模型，研究了BCMA-OR-CD38 Tan CART细胞的体内治疗效果。结果显示，BCMA-OR-CD38 Tan CAR-T细胞可以实现对骨髓瘤细胞的完全清除，且实验期内没有观察到肿瘤复发，但与单靶向的CAR T细胞相比治疗效果没有明显区别。Kaplan-Meier生存曲线显示，BCMA-OR-CD38 Tan CAR-T细胞的安全性与单靶向CAR-T细胞相似。
BCMA抗原逃逸导致的MM复发在BCMA CAR-T细胞疗法的多个临床试验中都有观察到。基于此，本发明提出了一种新型的BCMA-OR-CD38 Tan CAR T细胞，可以在体外和体内有力地消除MM细胞，可能为BCMA抗原逃逸提供一个有效的、适用于临床的解决方案。值得一提的是，BCMA-OR-CD38 Tan CAR-T细胞的生产过程与目前临床级抗CD19-CAR T细胞的生产过程一致，导入的外源基因长度适中，不会给病毒包装和T细胞转导产生额外负担，可进一步扩大生产以验证其临床治疗效果。
因此，我们认为同时靶向BCMA和CD38的Tan CAR-T细胞，即利用了BCMA靶向的治疗效果，又可防止因BCMA丢失而导致的肿瘤逃逸，提高了CAR-T细胞疗法的疗效。
附图说明
为了更清楚地说明本申请实施例中的技术方案，下面将对实施例中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本申请中记载的一些实施例，对于本领域普通技术人员来说，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其它的附图。
图1是逆转录病毒载体的构建和产生示意图，其中图1A是第二代单靶向CAR(BCMA-CAR或CD38-CAR)的示意图；图1B是双特异性、“OR”门控、串联CAR的示意图；图1C是含有scFv结构域排序变化的两个Tan CAR示意图，CD8是铰链和跨膜结构域，CD28是共刺激结构域；图1D是逆转录病毒载体包装过程示意图；图1E是通过Q-PCR检测双嗜性逆转录病毒载体的滴度结果图。亲嗜性逆转录病毒载体转导PG13后，每隔24小时收获CD38-CAR、BCMA-CAR或Tan-CAR的双嗜性逆转录病毒载体上清液，连续收获5天，命名为H0、H1、H2、H3和H4；图1F是Q-PCR检测CAR分子的拷贝数结果图；图1G是CAR分子转导人原代T细胞的转导效率分析结果图。
图2是Tan CAR-T细胞在抗原刺激后的特异性细胞毒性结果图，其中图2A是单靶向的CAR-T和Tan CAR-T细胞与BCMA-K562、CD38-Raji或1:1混合的BCMA-K562+CD38-Raji细胞以不同的效应细胞-靶细胞比率共孵育8小时后对靶细胞的细胞毒性结果图；图2B用两种不同的方法：Annexin-V细胞凋亡检测(左图)和荧光素酶检测(右图)，检测单靶向CAR-T或TanCAR-T细胞与RPMI-Luc共同培养8小时后的细胞毒性；图2C是Tan CAR-T细胞对BCMA-K562和CD38-Raji细胞的特异性细胞毒性结果图，将BCMA-K562:CD38-Raji细胞1:1混合后与单靶向CAR-T或Tan CAR-T细胞共培养48小时，测定BCMA-K562及CD38-Raji细胞的存活率；图2D是Tan-CAR T细胞与靶细胞共孵育8小时后，细胞因子释放检测结果图，评估的细胞因子包括IL-6、IL-10、TNF-α、IFN-γ和Granzyme B，所示数据为平均值±标准差(SD)，结果通过双因素方差分析，误差线用SD表示，*p<0.05，**p<0.01；
图3是T细胞增殖检测结果图，其中图3A是将CFSE标记的CAR-T细胞与BCMA K562:CD38 Raji 1:1混合的细胞或PRMI-Luc细胞以1:1的比例共培养24小时，用流式细胞仪测定CFSE荧光强度；图3B是使用自动细胞计数器每2天对分离和激活的人原代T细胞进行计数，绘制的细胞生长和存活率曲线图。
图4是BCMA-OR-CD38 Tan CAR-T细胞对多发性骨髓瘤细胞的体内治疗作用结果图，图4A是BCMA-OR-CD38 Tan CAR-T细胞对异种移植肿瘤模型体内治疗方案概要；图4B是特定时间点的荷瘤小鼠活体呈像，由生物发光辐射度表示肿瘤大小的结果图(每组8只小鼠)；结果来自两个独立的重复实验，CAR-T细胞是用从两个健康志愿者获得的PBMCs制备的；图4C是小鼠BM(骨髓)、肝脏、脾脏、血液和肿瘤细胞用抗人CD38 APC染色，评估CAR-T细胞输注后小鼠体内是否仍有残留的RPMI-Luc细胞的结果图；和图4D是用外周血中CD3+T细胞的百分比来评价CAR-T细胞的体内扩增情况的结果图。
具体实施方式
为了使本领域技术领域人员更好地理解本申请中的技术方案，下面将结合实施例对本发明作进一步说明，显然，所描述的实施例仅仅是本申请一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本申请中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其它实施例，都应当属于本申请保护的范围。
实施例
应该理解到披露的本发明不仅仅限于描述的特定的方法、方案和物质，因为这些均可变化。还应理解这里所用的术语仅仅是为了描述特定的实施方式方案的目的，而不是意欲限制本发明的范围，本发明的范围仅受限于所附的权利要求。
实施例一质粒的构建和重组逆转录病毒载体的生产
本研究中使用的串联CARs重组逆转录病毒载体从5′端到3′端由以下部分组成：来自小鼠Ig-H(免疫球蛋白重链)的信号肽序列、人c-Myc标签、来自C11D5.3的单克隆抗体(mAb)的抗BCMA-scFv，抗CD38 scFv，CD8分子的铰链和跨膜区，CD28的共刺激结构域，以及CD3ζ信号结构。抗CD38和抗BCMA scFv片段通过overlap-PCR组装，并克隆到MFG(逆转录病毒载体)重组逆转录病毒骨架上，该骨架被称为BCMA-OR-CD38 Tan-CAR或CD38-OR-BCMATan-CAR重组逆转录病毒载体。我们还制备了名为CD38-CAR和BCMA-CAR的单scFv结构域重组逆转录病毒载体，它们与之前描述的载体的区别仅在于它们的抗原识别结构域由单一的scFv构成，而质粒的其他结构与Tan CAR质粒相同。Tan CAR和单靶向CAR逆转录病毒载体的生产过程与现有技术描述的临床级抗CD19-CAR逆转录病毒载体的生产过程一致。稳定的逆转录病毒载体生产者细胞系是用两种不同的包装细胞系建立的。首先将编码这些CAR基因的质粒导入人源性亲嗜性逆转录病毒载体包装细胞系Phoenix-ECO，收获这些转染细胞瞬时产生的逆转录病毒载体上清液，然后将其稳定地整合到鼠源性双嗜性包装细胞系PG13的基因组DNA中，参见图1D。每隔24小时收集PG13细胞产生的逆转录病毒载体上清液，共收集5天。收集的样品被称为H0、H1、H2、H3和H4，并被用于转导人类原代T细胞。
实施例二细胞系的来源及培养条件
K562细胞来自北京协和医学院的细胞资源中心(中国北京)。Raji细胞是一种CD38+人B淋巴细胞系，购自美国典型培养物保藏中心(ATCC，美国)。BCMA+GFP+-K562细胞由中国农业大学吴教授赠送。GFP-Luc(荧光素酶)-RPMI8226细胞是CD38+BCMA+骨髓瘤细胞系，购自ATCC。PG13长臂猿白血病病毒包装细胞系和人类亲嗜性包装细胞系Phoenix ECO均购自ATCC。K562、Raji和RPMI细胞使用RPMI-1640完全培养基(Gibco，美国)进行培养，含有10％胎牛血清(FBS；Gibco，美国)和1％青霉素-链霉素(P/S)溶液(Gibco，美国)。PG13和PhoenixECO细胞在含有10％FBS和1％P/S的DMEM(Gibco，美国)完全培养基中培养。所有细胞都在37℃和5％二氧化碳的培养箱(Thermo Fisher，美国)中培养。所有的细胞系都定期进行支原体检测，结果显示均是阴性的，这些细胞系的相关细胞表面标志物通过流式细胞仪进行验证。
实施例三CAR-T细胞的制备
使用LymphoprepTM(STEMCELL Technologies，加拿大)通过梯度离心法从健康的志愿者身上分离出外周血单核细胞(PBMCs)。人PBMCs的使用经北京中医药大学伦理委员会批准，所有志愿者均知情同意。用100ng/mL的抗CD3单克隆抗体OKT3(购买于北京义翘神州生物技术有限公司)和100U/mL的IL-2(购买于北京义翘神州生物技术有限公司)刺激这些PBMCs，48小时后，用逆转录病毒载体转导这些T细胞。转导效率用流式细胞仪测定。所有的T细胞都在AIM V完全培养基(Gibco，美国)中培养，该培养基含有10％的FBS，1％的P/S，每48小时补充一次IL2(100U/mL)。
实施例四实时定量PCR(Q-PCR)
使用Q-PCR检测PG13产生的逆转录病毒载体的滴度。使用QIAamp Viral RNA MiniKit(QIAGEN，德国)提取逆转录病毒载体(H0、H1、H2、H3和H4)的RNA，并使用QuantiNovaReverse Transcription Kit(QIAGEN，德国)进行逆转录，所有操作均按照说明书操作规程进行。以CAR质粒拷贝数(10 4、105、106、107、108拷贝数)为横坐标，拷贝数对应的CT值为纵坐标，绘制标准曲线，并通过绝对定量法计算这些逆转录病毒载体的拷贝数。使用正向引物(5′-GACACCAGACTAAGAACCTAGAAC-3′)和反向引物(5′-AGCTGCGATGCCGTCTACTTTGAG-3′)扩增了MFG逆转录病毒骨架部分的95bp DNA片段。
CAR基因的拷贝数通过Q-PCR进行定量。使用QIAamp DNA Mini和Blood Mini试剂盒(Qiagen，德国)提取转导后48小时的PBMCs的基因组DNA。为了控制背景信号，将100ng的非转导的T细胞基因组DNA掺入含有不同拷贝数的CAR质粒(104、105、106、107、108拷贝数CAR质粒)，绘制其与对应的CT值的线性回归曲线。GAPDH扩增做为内部控制，用于标准化基因组DNA数量。使用的CAR转基因正向引物是5'-ATCGCTCACAACCAGTCG-3'；反向引物是5'-GGTCAGGGAAGTTTACAAGG-3'。使用QuantStudioTM 6Flex实时PCR系统(Life technologies,美国)进行Q-PCR，每个反应中使用100ng基因组DNA做为模板。
实施例五流式细胞仪
为了测定T细胞的转导效率和逆转录病毒载体的滴度，收获100万个CAR-T细胞或PG13细胞，用人c-Myc PE抗体(R&D System,美国)在4℃下染色30-60分钟。用PBS(磷酸盐缓冲液)(Gibco，美国)洗去未结合的抗体溶液。使用CytoFLEX(Beckman，美国)检测荧光信号并在CytoFLEX分析软件中进行数据分析。
实施例六细胞毒性试验
将BCMA-K562、CD38-Raji、BCMA-K562:CD38-Raji 1:1混合细胞或RPMI-Luc靶细胞以8×104细胞/孔的比例接种在96孔板中，Pan-T(未转化的T细胞)、CD38 CAR-T、BCMA CAR-T、BCMA-OR-CD38 Tan CAR-T或CD38-OR-BCMA Tan CAR-T细胞以不同的效应细胞-靶细胞比例(1:16,1:8,1:4,1:2和1:1)同时接种于96孔板中，进行共培养。效应细胞的接种密度是基于CAR+细胞的计数。共孵育8小时后收获细胞，用CD3-BV421(BD，美国)染色60分钟。然后用PBS清洗细胞，用Annexin V-Alexa Fluor 647(Bio Friend，中国)在室温下染色30分钟。随后，立即用CytoFLEX流式细胞仪进行分析。
BCMA-K562:CD38-Raji细胞1:1混合细胞与Pan-T和CAR-T细胞以不同的效应细胞-靶细胞比例共培养后，分析BCMA-K562及CD38-Raji细胞的存活率。培养48小时后，收获细胞，用CD3-BV421以及CD38-APC(Invitrogen,美国)分别染色60分钟。使用CytoFLEX(Beckman，美国)检测荧光信号，并使用FlowJo软件(FlowJo LLC)进行分析。
对于RPMI-Luc细胞，在与CAR-T细胞共培养8小时后，使用ONE-GloTM EX荧光素酶检测系统(Promega，美国)进行荧光素酶检测，细胞与底物溶液反应3分钟，使用SpectraMaxi3x多模式微板仪(Molecular Devices，美国)测定相对发光单位(RLU)。肿瘤细胞的裂解率根据以下公式计算。
Figure BDA0003147250810000081
实施例七细胞因子释放试验
将目标细胞以8×104个细胞/孔接种在96孔板中，与Pan-T或CAR-T细胞以1:1的比例共培养8小时。收获细胞培养上清液，使用LEGENDplexTM Multi-Analyte Flow Assay Kit(人CD8/NK模块)(BioLegend，美国)检测各种细胞因子的水平。将由IL-10、IL-6、TNF-α、IFN-γ和Granzyme B组成的捕获抗体磁珠混合并与上清液样品在室温下，摇床上共培养2小时。洗涤后，依次加入检测抗体混合液和链霉菌素-赤藓素(SA-PE)。细胞因子的浓度通过同一检测中产生的标准曲线来确定。使用BD LSRFortessaTM细胞分析仪(BD，美国)检测荧光信号，使用LEGENDplexTM在线分析软件进行数据分析。
实施例八T细胞增殖试验
将BCMA-K562:CD38-Raji 1:1混合细胞或RPMI-Luc目标细胞以8×104细胞/孔的密度接种在96孔板中。Pan-T和CAR-T细胞用Carbo-xyfluorescein DiacetateSuccinimidyl Ester(CFSE)(BD，美国)在37℃下染色30-60分钟。用无血清AIM-V培养基清洗后，CAR-T细胞与靶细胞以1:1的比例进行共孵育。效应细胞的接种密度是基于CAR+细胞的计数。共培养24小时后，用CD3-APC对细胞进行染色，用CytoFLEX测定CFSE荧光强度，用FlowJo软件分析数据。每2天用CountessTM II自动细胞计数器(Thermo Fisher，美国)进行Pan-T和CAR-T细胞计数，用GraphPad Prism 7.0a软件绘制T细胞增殖和存活曲线。
实施例九体内CAR-T细胞活性检测
所有的动物实验都是在北京中医药大学动物护理和使用委员会机构的批准下进行的。6～7周大的雌性NOD.Cg-Prkdcscid Il2rgtm1Vst/Vst(NPG)小鼠购自Vitalstar生物技术有限公司。通过在第0天对NPG小鼠尾静脉注射RPMI-Luc肿瘤细胞系(2×106个细胞/小鼠)建立异种肿瘤移植模型。在肿瘤注射后第12天将这些小鼠随机分为五组(未处理组、Pan-T组、CD38 CAR-T组、BCMA CAR-T组、BCMA-OR-CD38 Tan CAR-T组和CD38-OR-BCMA TanCAR-T组)。在第12天和第19天，将CAR T细胞以1×108/kg的剂量通过尾静脉注射到荷瘤小鼠体内。从第二次CAR-T注射后的第4天开始，每3天使用MIIS活体成像系统(MolecularDevices，美国)监测肿瘤的进展。体内成像是通过在小鼠腹腔注射150mg/kg VivoGloTM荧光素酶底物(Promega，美国)，在异氟烷麻醉下使用MIIS活体成像系统进行。我们还利用流式细胞仪进一步评估这些小鼠体内是否仍有残留的肿瘤细胞。在小鼠摘眼球取血后，将其处死，分离肝脏、脾脏、骨髓以及肿瘤组织。通过小心研磨肝脏、脾脏和肿瘤组织获得肝脏、脾脏和肿瘤细胞，通过抽吸股骨和胫骨获得骨髓细胞，通过裂解红细胞分离淋巴细胞。随后，用抗人CD38-APC(BD，美国)对以上细胞进行60分钟的染色。PBS清洗后，用7-AAD(5uL/样品)(BD，美国)染色10分钟，利用流式细胞仪(BD LSRFortessaTM细胞分析仪)进行检测。同样，在CAR-T细胞输注后，用流式细胞仪评估外周血中CD3+T细胞的百分比。从尾静脉采集血液，在红细胞裂解后，根据上述方法，用抗人CD3-BV786抗体(BD，美国)和7-AAD对细胞进行染色，并使用BD LSRFortessaTM细胞分析仪进行检测。最后，当小鼠失去自主进食和运动能力时，将其处死，记录每只小鼠的生存时间，绘制Kaplan-Meier生存曲线。
在本发明中，统计分析使用GraphPad Prism 7.0a软件进行。对于两组的比较，进行双尾t检验或非参数检验。当多组比较时，根据情况采用单因素方差分析或双因素方差分析检验。使用Cox-Mantel log-rank检验来分析Kaplan-Meier生存曲线的差异的意义。P值<0.05被认为具有统计学意义。
实施例十逆转录病毒载体构建以及Tan-CAR-T细胞的生产
如图1A所示，是二代、单靶向CAR的结构示意图，包含可与单一抗原结合的抗原识别域scFv区，CD8跨膜及铰链区，CD28共刺激信号域以及CD3ζ胞内信号域；如图1B所示，是二代、“OR”门控，双靶向的BCMA-OR-CD38 Tan-CAR或CD38-OR-BCMA Tan-CAR的结构示意图，其抗原结合域是由一个抗BCMA scFv(VL-linker-VH)和一个抗CD38 scFv(VH-linker-VL)通过一个长的、柔性的连接肽(Gly4Ser)4串联组成。这两个Tan CARs的区别在于scFv结构域的顺序改变，如图1C所示，BCMA-OR-CD38 Tan-CAR的scFv结构域是抗BCMA scFv结构域在前，抗CD38 scFv结构域在后。CD38-OR-BCMA Tan-CAR的scFv结构域是抗CD38 scFv结构域在前，抗BCMA scFv结构域在后。Tan-CAR分子除scFv区之外的其他的结构与单靶向CAR一致，包括CD8跨膜及铰链区，CD28共刺激信号域以及CD3ζ胞内信号域；
抗BCMA scFv氨基酸序列(SEQ ID NO：1)：
DIVLTQSPPSLAMSLGKRATISCRASESVTILGSHLIHWYQQKPGQPPTLLIQLASNVQTGVPARFSGSGSRTDFTLTIDPVEEDDVAVYYCLQSRTIPRTFGGGTKLEIKGSTSGSGKPGSGEGSTKGQIQLVQSGPELKKPGETVKISCKASGYTFTDYSINWVKRAPGKGLKWMGWINTETREPAYAYDFRGRFAFSLETSASTAYLQINNLKYEDTATYFCALDYSYAMDYWGQGTSVTVSSAAA
抗CD38 scFv氨基酸序列(SEQ ID NO：2)：
SQVQLVQSGGGLVQPGRSLRLPCAASGFTFDDYAMHWVRQAPGKGLEWVSGISWNSGSIAYADSVKGRFTISRDNAKNSLYLQMNSLRAEDTAVYYCAREGGSGSYYNPFYYYGMDVWGQGTTVTVSSGGGGSGGGGSGGGGSQAVLTQPPSASGTPGQRVTISCSGSSSNIGGNTVAWYQQLPGTAPKLLIYNYSQRPSGVPDRFSGSKSGTSSSLAIGGLQSEDEADYYCAAWDDSLNGVVFGGGTKLTVLG
图1D是逆转录病毒载体包装过程示意图；首先，通过瞬时转染的方法，将CAR质粒导入Phoenix-eco包装细胞系中，收获亲嗜性逆转录病毒载体后将其整合到PG13包装细胞系中，产生可稳定生产双嗜性逆转录病毒载体的PG13稳转细胞系。双嗜性逆转录病毒载体可转导人原代T细胞产生CAR-T细胞。
通过Q-PCR检测PG13产生的双嗜性逆转录病毒载体的滴度。亲嗜性逆转录病毒载体转导PG13后，每隔24小时收获CD38-CAR、BCMA-CAR或Tan-CAR的双嗜性逆转录病毒载体上清液，连续收获5天，命名为H0、H1、H2、H3和H4。Tan-CAR逆转录病毒载体滴度虽低于阳性对照(CD19 CAR)、BCMA-CAR和CD38-CAR组，但也已经超过了1×108CFU/mL，属于高滴度逆转录病毒载体(BCMA-OR-CD38 CAR：3.59×108CFU/mL；CD38-OR-BCMA CAR：2.82×108CFU/mL)，如图1E所示。
利用PG13产生的双嗜性逆转录病毒载体BCMA-CAR、CD38-CAR或Tan-CAR转导人原代T细胞，并通过流式细胞仪检测c-Myc蛋白的表达来评估转导效率。所示数据为平均值±标准差(SD)。结果用t检验进行分析。误差线代表SD，*P<0.05，**P<0.01。如图1G所示，BCMA-OR-CD38 Tan-CAR转导T细胞的的转导效率为85.7％，CD38-OR-BCMA Tan-CAR转导T细胞的转导效率为74.0％，BCMA-CAR+T细胞为78.2％，CD38-CAR+T细胞为87.3％。Tan CAR的转导效率与BCMA CAR或CD38 CAR相似，这意味着靶向双抗原的CAR修饰不会影响CAR的转导效率。值得注意的是，BCMA-OR-CD38 CAR的病毒载体滴度和T细胞转导效率都高于CD38-OR-BCMATan-CAR。
转基因拷贝数或病毒载体拷贝数(VCN)，是评估CAR-T细胞产品安全性的指标之一。美国食品药品监督管理局建议，CAR分子在每一个基因组上的整合拷贝数应<5个拷贝。在我们的结果中，相应的CAR-T细胞基因组中CAR分子(BCMA-CAR、CD38-CAR或Tan-CAR)的拷贝数都小于5拷贝/CAR-T细胞，参见图1F，通过Q-PCR方法检测CAR分子拷贝数，以CAR转基因的特异性引物为扩增引物，以CAR分子转导后48小时的T细胞中提取的基因组DNA为模板。
实施例十一检测Tan CAR-T对具有不同抗原的细胞的有效靶向性
为了评估Tan-CAR T细胞对骨髓瘤细胞的特异性细胞毒性，将BCMA-OR-CD38 TanCAR-T、CD38-OR-BCMA Tan CAR-T、BCMA CAR-T、CD38 CAR-T、Pan-T细胞分别与BCMA-K562或CD38-Raji细胞共孵育8小时。使用Annexin-V细胞凋亡试剂盒测定细胞凋亡。Tan CAR-T细胞对BCMA-K652和CD38-Raji细胞表现出明显的细胞毒性，而单靶向的CAR-T细胞只对BCMA+或CD38+肿瘤细胞有毒性作用，参见图2A，2C。值得注意的是，BCMA-OR-CD38 Tan CAR-T对BCMA-K652和CD38-Raji细胞的细胞毒性明显高于CD38-OR-BCMA Tan CAR-T，参见图2A，表1-4。
表1 Tan CAR-T细胞及单靶向CAR-T细胞对肿瘤细胞K562的杀伤作用(图2A-1)
Figure BDA0003147250810000111
Figure BDA0003147250810000121
表2 Tan CAR-T细胞及单靶向CAR-T细胞对肿瘤细胞Raji-CD38的杀伤作用(图2A-2)
Figure BDA0003147250810000122
表3 Tan CAR-T细胞及单靶向CAR-T细胞对K562-BCMA细胞的杀伤作用(图2A-3)
Figure BDA0003147250810000123
表4 Tan CAR-T及单靶向CAR-T细胞对K562-BCMA+Raji-CD38细胞的杀伤作用(图2A-4)
Figure BDA0003147250810000124
通过将BCMA-K562和CD38-Raji细胞以1:1的比例混合并与CAR-T细胞共同培养，分析了Tan CAR-T细胞同时对CD38和BCMA的有效靶向性。共孵育8小时后，分别对靶细胞的凋亡及存活率进行了检测。结果显示，Tan CAR-T细胞有效地裂解了BCMA-K562和CD38-Raji细胞，且细胞毒性明显高于单靶向的CAR-T细胞，参见图2A，2C。此外，我们使用双表达CD38和BCMA的RPMI细胞做为靶细胞，进一步比较了单靶向的CAR-T细胞与Tan CAR-T细胞的治疗效果。结果显示，RPMI-Luc细胞与不同的CAR-T细胞共培养8小时后，BCMA-OR-CD38 Tan-CAR-T细胞相比于单靶向的CAR-T细胞和CD38-OR-BCMA Tan-CAR-T细胞表现出更明显的细胞毒性，参见图2B，表5-6。K562细胞不表达CD38及BCMA抗原，可作为阴性对照细胞，结果显示，Tan CAR-T及单靶向CAR-T细胞对其均没有明显的细胞毒性，参见图2A。Pan-T细胞(未经CAR分子转导的T细胞)做为阴性对照的效应T细胞，它们对肿瘤细胞的杀伤作用明显低于TanCAR-T及单靶向CAR-T细胞，参见图2A,2B,2C。
表5流式检测Tan CAR-T及单靶向CAR-T细胞对RPMI-Luc细胞的杀伤作用(图2B-1)
Figure BDA0003147250810000131
表6荧光素酶释放检测Tan CAR-T及单靶向CAR-T细胞对RPMI-Luc细胞的杀伤作用
(图2B-2)
Figure BDA0003147250810000132
表7 Tan CAR-T细胞与1:1混合的BCMA-K562+CD38-Raji细胞共孵育后BCMA-K562肿瘤细胞的存活率(图2C-1)
Figure BDA0003147250810000133
表8 Tan CAR-T细胞与1:1混合的BCMA-K562+CD38-Raji细胞共孵育后CD38-Raji肿瘤细胞的存活率(图2C-2)
Figure BDA0003147250810000141
接下来我们使用LEGENDplexTM Multi-Analyte Flow Assay Kit(人CD8/NK模块)评估了CAR-T细胞的促炎症细胞因子释放情况。将效应细胞和靶细胞共孵育8小时后，收获细胞培养上清液，用流式细胞仪测定IL-10、IL-6、TNF-α、IFN-γ和颗粒酶B的水平。结果显示，在与靶细胞共孵育后，Tan CAR T细胞释放的TNF-α、IFN-γ和Granzyme B的水平明显增加，与BCMA-CAR-T或CD38CAR-T细胞经BCMA+或CD38+肿瘤细胞刺激后产生的细胞因子水平相当，参见图2D。当CAR-T细胞与K562细胞共孵育时，Tan CAR-T细胞及单靶向CAR-T细胞也释放促炎症细胞因子，但释放量较低，参见图2D。
实施例十二Tan CAR-T细胞对CD38+和BCMA+肿瘤细胞的增殖反应
我们进行了CFSE增殖实验以确定表达特定抗原的肿瘤细胞是否能刺激CAR-T细胞增殖。首先，用CFSE标记CAR-T和Pan-T细胞，与1:1混合的BCMA K562+CD38 Raji细胞或PRMI-Luc细胞共培养，通过流式细胞仪检测CFSE荧光强度的下降来评估T细胞增殖情况。结果显示，当CAR-T细胞与靶细胞以1:1的比例共孵育时，Tan CAR-T细胞，特别是BCMA-OR-CD38 Tan CAR-T细胞，相对于单靶向CAR-T细胞，增殖明显增强，参见图3，表9-10。此外，我们还绘制了没有靶细胞刺激时T细胞的增殖和生存曲线。这些数据显示，Tan CAR-T细胞的增殖能力与单靶向的CAR-T细胞类似，参见图3B。
表9 CFSE+Tan CAR-T及单靶向CAR-T细胞与1:1混合的K562-BCMA+Raji-CD38细胞共孵育后不同时间点CFSE+CAR-T细胞的比例
Figure BDA0003147250810000142
表10 CFSE+Tan CAR-T及单靶向CAR-T细胞与RPMI-Luc细胞共孵育后不同时间点CFSE+CAR-T细胞的比例
Figure BDA0003147250810000151
实施例十三BCMA-OR-CD38 Tan CAR-T细胞对骨髓瘤细胞的体内治疗作用检测
如上所述，BCMA-OR-CD38 Tan CAR-T细胞比CD38-OR-BCMA Tan CAR-T细胞表现出更强的抗肿瘤和增殖活性。因此，我们随后利用尾静脉注射RPMI-Luc肿瘤细胞建立异种移植瘤模型，评估了BCMA-OR-CD38 Tan CAR-T细胞对多发性骨髓瘤细胞的体内治疗作用。NPG小鼠在第0天尾静脉注射2×106个RPMI-Luc细胞后，将肿瘤体积大小相近的荷瘤小鼠随机分为5组(每组8只)，在第12天和第19天通过尾静脉分别注射1×108/kg Pan-T、BCMA CAR-T、CD38CAR-T或BCMA-OR-CD38 Tan CAR-T细胞，参见图4A。从第二次CAR-T注射后的第4天开始，每3天用MIIS活体成像法检测肿瘤的生长情况。
活体成像结果显示，无论是单靶向的CAR-T细胞还是BCMA-OR-CD38 Tan CAR-T细胞，到第23天都能实现完全的肿瘤清除，参见图4B，图4B的结果来自两次独立的重复实验，CAR-T细胞是利用两个健康志愿者的PBMCs制备的。相应地，我们还通过流式细胞仪检测了小鼠骨髓(BM)、肝脏、脾脏和血液中的肿瘤细胞残留。结果显示，在接受BCMA-OR-CD38 TanCAR-T或单靶向CAR-T治疗的小鼠中，几乎没有观察到肿瘤细胞残留，参见图4C。接下来，我们通过尾静脉采集血液，用抗人CD3 BV786染色来检测外周血中CD3+T细胞的百分比，评估了CAR-T细胞在小鼠体内的扩增情况。结果显示，BCMA-OR-CD38 Tan CAR-T细胞在小鼠体内经历了比Pan-T和CD38 CAR-T细胞更明显的扩增，参见图4D。最后，我们评估了这种TanCAR-T细胞疗法的安全性，结果显示，BCMA-OR-CD38 Tan CAR-T细胞治疗组的小鼠的中位生存时间明显长于未治疗组或Pan-T组，参见图4E，表11。然而，BCMA-OR-CD38 Tan CAR-T和单靶向的CAR-T细胞相比，在肿瘤清除率或中位生存时间方面均没有明显的差异。
表11经Tan CAR-T及单靶向CAR-T细胞治疗后NPG荷瘤小鼠存活时间统计
Figure BDA0003147250810000161
本领域的技术人员还将认识到，或者能够确认使用不超过常规实验，在本文中所述的本发明的具体的实施方案的许多等价物。这些等价物也包含在所附的权利要求中。
序列表
<110> 北京中医药大学
<120> 双靶向嵌合抗原受体及其应用
<130> PF2135
<160> 2
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 249
<212> PRT
<213> 人类(Homo sapiens)
<400> 1
Asp Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Pro Ser Leu Ala Met Ser Leu Gly
1 5 10 15
Lys Arg Ala Thr Ile Ser Cys Arg Ala Ser Glu Ser Val Thr Ile Leu
20 25 30
Gly Ser His Leu Ile His Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Pro Pro
35 40 45
Thr Leu Leu Ile Gln Leu Ala Ser Asn Val Gln Thr Gly Val Pro Ala
50 55 60
Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Arg Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Asp
65 70 75 80
Pro Val Glu Glu Asp Asp Val Ala Val Tyr Tyr Cys Leu Gln Ser Arg
85 90 95
Thr Ile Pro Arg Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys Gly
100 105 110
Ser Thr Ser Gly Ser Gly Lys Pro Gly Ser Gly Glu Gly Ser Thr Lys
115 120 125
Gly Gln Ile Gln Leu Val Gln Ser Gly Pro Glu Leu Lys Lys Pro Gly
130 135 140
Glu Thr Val Lys Ile Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Asp
145 150 155 160
Tyr Ser Ile Asn Trp Val Lys Arg Ala Pro Gly Lys Gly Leu Lys Trp
165 170 175
Met Gly Trp Ile Asn Thr Glu Thr Arg Glu Pro Ala Tyr Ala Tyr Asp
180 185 190
Phe Arg Gly Arg Phe Ala Phe Ser Leu Glu Thr Ser Ala Ser Thr Ala
195 200 205
Tyr Leu Gln Ile Asn Asn Leu Lys Tyr Glu Asp Thr Ala Thr Tyr Phe
210 215 220
Cys Ala Leu Asp Tyr Ser Tyr Ala Met Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr
225 230 235 240
Ser Val Thr Val Ser Ser Ala Ala Ala
245
<210> 2
<211> 254
<212> PRT
<213> 人类(Homo sapiens)
<400> 2
Ser Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly
1 5 10 15
Arg Ser Leu Arg Leu Pro Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Asp Asp
20 25 30
Tyr Ala Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp
35 40 45
Val Ser Gly Ile Ser Trp Asn Ser Gly Ser Ile Ala Tyr Ala Asp Ser
50 55 60
Val Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn Ser Leu
65 70 75 80
Tyr Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr
85 90 95
Cys Ala Arg Glu Gly Gly Ser Gly Ser Tyr Tyr Asn Pro Phe Tyr Tyr
100 105 110
Tyr Gly Met Asp Val Trp Gly Gln Gly Thr Thr Val Thr Val Ser Ser
115 120 125
Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gln
130 135 140
Ala Val Leu Thr Gln Pro Pro Ser Ala Ser Gly Thr Pro Gly Gln Arg
145 150 155 160
Val Thr Ile Ser Cys Ser Gly Ser Ser Ser Asn Ile Gly Gly Asn Thr
165 170 175
Val Ala Trp Tyr Gln Gln Leu Pro Gly Thr Ala Pro Lys Leu Leu Ile
180 185 190
Tyr Asn Tyr Ser Gln Arg Pro Ser Gly Val Pro Asp Arg Phe Ser Gly
195 200 205
Ser Lys Ser Gly Thr Ser Ser Ser Leu Ala Ile Gly Gly Leu Gln Ser
210 215 220
Glu Asp Glu Ala Asp Tyr Tyr Cys Ala Ala Trp Asp Asp Ser Leu Asn
225 230 235 240
Gly Val Val Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Thr Val Leu Gly
245 250

Claims (10)

1.一种双靶向嵌合抗原受体，其特征在于，其抗原结合域包括串联的抗BCMA scFv和抗CD38 scFv。
2.根据权利要求1所述的嵌合抗原受体，其特征在于，其抗原结合域由抗BCMA scFv和抗CD38 scFv通过柔性的连接肽串联组成，所述柔性的连接肽优选的是(Gly4Ser)4。
3.根据权利要求2所述的嵌合抗原受体，其特征在于，其抗原结合域依次是抗BCMAscFv-(Gly4Ser)4-抗CD38 scFv或者抗CD38 scFv-(Gly4Ser)4-抗BCMA scFv。
4.根据权利要求3所述的嵌合抗原受体，其特征在于，抗BCMA scFv氨基酸序列是SEQID NO：1，和抗CD38 scFv氨基酸序列是SEQ ID NO：2；
SEQ ID NO：1：DIVLTQSPPSLAMSLGKRATISCRASESVTILGSHLIHWYQQKPGQPPTLLIQLASNVQTGVPARFSGSGSRTDFTLTIDPVEEDDVAVYYCLQSRTIPRTFGGGTKLEIKGSTSGSGKPGSGEGSTKGQIQLVQSGPELKKPGETVKISCKASGYTFTDYSINWVKRAPGKGLKWMGWINTETREPAYAYDFRGRFAFSLETSASTAYLQINNLKYEDTATYFCALDYSYAMDYWGQGTSVTVSSAAA；
SEQ ID NO：2：SQVQLVQSGGGLVQPGRSLRLPCAASGFTFDDYAMHWVRQAPGKGLEWVSGISWNSGSIAYADSVKGRFTISRDNAKNSLYLQMNSLRAEDTAVYYCAREGGSGSYYNPFYYYGMDVWGQGTTVTVSSGGGGSGGGGSGGGGSQAVLTQPPSASGTPGQRVTISCSGSSSNIGGNTVAWYQQLPGTAPKLLIYNYSQRPSGVPDRFSGSKSGTSSSLAIGGLQSEDEADYYCAAWDDSLNGVVFGGGTKLTVLG。
5.根据权利要求2所述的嵌合抗原受体，其特征在于，该受体包括依次串联的上游的信号肽和用于检测的myc标签；包含重链可变区与轻链可变区的双靶向的BCMA-OR-CD38 Tan-CAR或CD38-OR-BCMA Tan-CAR的嵌合抗原结合域；CD8跨膜及铰链区；CD28或4-1BB共刺激信号域以及CD3ζ胞内信号域。
6.一种双靶向的BCMA-OR-CD38 Tan-CAR或CD38-OR-BCMA Tan-CAR的嵌合抗原受体T细胞，其特征在于，其表达有权利要求1-5任一所述的嵌合抗原受体。
7.一种治疗肿瘤的药物，其特征在于，其含有权利要求7所述的嵌合抗原受体T细胞。
8.根据权利要求1-5任一所述的嵌合抗原受体在制备嵌合抗原受体T细胞及其在肿瘤治疗中的应用。
9.根据权利要求8所述的应用，所述肿瘤是多发性骨髓瘤。
10.根据权利要求1-5任一所述的嵌合抗原受体的应用，其特征在于，将编码所述嵌合抗原受体的基因片段插入病毒表达载体，包装成病毒载体颗粒，感染人T细胞，制备得到嵌合抗原受体T细胞，用于表面BCMA或者CD38阳性的肿瘤治疗。
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