JP2023508608A - 強化されたt細胞受容体star及びその用途 - Google Patents
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Abstract
【選択図】 なし
Description
第1の定常領域は、天然のT細胞受容体のα鎖の定常領域と比較して、i)N末端改変、ii)システイン置換;及び/若しくはiii)疎水性アミノ酸置換を含む、天然のT細胞受容体のα鎖の定常領域のバリアントであり、及び/又は
第2の定常領域は、天然のT細胞受容体のβ鎖の定常領域と比較して、i)N末端改変、及びii)システイン置換を含む、天然のT細胞受容体のβ鎖の定常領域のバリアントである。
第2の定常領域は、マウスT細胞受容体のβ鎖定常領域に由来し、N末端の位置1~6のアミノ酸は、天然のマウスT細胞受容体のβ鎖定常領域と比較して欠失しており、N末端の位置7~25のアミノ酸は、天然のヒトT細胞受容体のβ鎖定常領域の対応するアミノ酸で置換されており、位置56のセリンはシステインに変異しており、位置56のシステインはシステインに変異しており、アミノ酸番号は配列番号15を参照している。
ここで第1の定常領域は、天然のT細胞受容体のα鎖定常領域又は本明細書に開示される天然のT細胞受容体のα鎖定常領域のバリアントであり、第2の定常領域は、天然のT細胞受容体のβ鎖定常領域又は本明細書に開示される天然のT細胞受容体のβ鎖定常領域のバリアントであり、
第1の抗原結合領域及び第2の抗原結合領域は、異なる標的抗原又は同一の標的抗原の異なる領域に特異的に結合する。
1.1 STARのプロトタイプの設計
B細胞によって産生される分泌型抗体(Ab)又はB細胞受容体(BCR)は、遺伝子構造、タンパク質構造及び空間的配座の点で、T細胞受容体(TCR)との類似性が非常に大きい。抗体及びTCRは両方とも、可変領域及び定常領域から構成され、可変領域は抗原認識及び結合に役割を果たし、定常領域ドメインは構造的相互作用及びシグナル伝達に役割を果たす。TCRα及びβ鎖(又はTCRγ及びδ鎖)の可変領域を抗体の重鎖可変領域(VH)及び軽鎖可変領域(VL)に置き換えることにより、合成T細胞受容体及び抗体受容体(STAR)と呼ばれる合成キメラ分子を構築することができ、その構造は図1に示されている。
STARのプロトタイプの設計には、ヒト起源のTCRα/β鎖(又はTCRγ及びδ鎖)の定常領域配列を使用する。ヒト、霊長類及びマウスのTCRα/β鎖の定常領域配列(マウスTCRaC-WT、配列番号2及びマウスTCRbC-WT(配列番号15)(又はTCRγ及びδ鎖)は、機能保存性が高く、重要なアミノ酸配列が同一であるため、互いに置換可能である。
STAR分子の設計をさらに最適化するためにSTAR分子内の特定の配列を改変したが、1つの改変スキームは、STAR分子の定常領域のN末端を欠失させたことである。TCRα鎖定常領域のN末端の18アミノ酸を欠失させ(このマウス配列は配列番号3のDIQNPEPAVYQLKDPRSQである)(生成された定常領域配列はマウスTCRaC-N.DLT、配列番号4である)、TCRβ鎖定常領域のN末端の25アミノ酸を欠失させた(このマウス配列は配列番号16のDLRNVTPPKVSLFEPSKAEIANKQKである)(生成された定常領域配列はマウスTCRbC-N.DLT、配列番号17である)。これらの2つの領域は定常領域のN末端に位置し、Ig様C1型ドメインには属さず、分子内ジスルフィド結合形成にも関与しないが、主としてヒンジとして機能し、異なる欠失スキームが設計されているSTARの機能に影響を及ぼす。本発明によれば、より良い効果を得るために、定常領域の特定の配列を再編成させた。再編成は、部分配列が欠失し、部分配列にヒト化変異が加えられたことを意味する。この領域改変は以下の利点を有する:第1に、ヒンジ領域の機能的最適化により、STAR及び内因性TCRの誤対合を減少させることができ、第2に、最適化されたSTAR分子のサイズが天然のTCRのサイズにより類似していることで、共刺激分子の結合、免疫シナプスの形成及び安定化、T細胞のその後のエフェクター機能が促進される。
図3は、マウスTCRα鎖定常領域のN末端での18アミノ酸のヒト配列とのアラインメントを示しており、UserSeq1はヒト配列であり、UserSeq2はマウス配列である。アミノ酸特性分析を通じて、マウス由来配列及びヒト由来配列はいずれもE6D、K13R、R16K、Q18S部位で同一の性質のアミノ酸置換に属し、P15S部位では極性アミノ酸に置換される非極性アミノ酸に属するため、この部位付近のタンパク質の性質は保存されず、機能に影響を及ぼさずに改変が可能であることが見出された。結論として、マウスTCRα鎖定常領域のN末端の位置1~14のアミノ酸配列は保持されてヒト化され、位置15~18のアミノ酸を欠失させて、マウスTCRaC-N.Rec-4、配列番号5が生成された。
図4は、マウスTCRβ鎖定常領域のN末端での25アミノ酸のヒト配列とのアラインメントを示しており、UserSeq1はヒト配列であり、UserSeq2はマウス配列である。アミノ酸特性分析を通じて、マウス由来配列及びヒト由来配列はR3KとL12V部位とでのみ同一特性のアミノ酸置換に属し、T6F、K8E、D11A、K17E、A21S、N22H、K23T部位ではすべて異なるアミノ酸特性の置換に属しており、その結果、これらの部位付近のタンパク質の特性は保存されず、機能に影響を及ぼさずに改変が可能であることが見出された。結論として、マウスTCRβ鎖定常領域のN末端の位置1~16のアミノ酸配列は保持されてヒト化され、位置17及び21~25のアミノ酸を欠失させて、生成された定常領域配列はマウスTCRbC-N.Rec-4(配列番号18)である。
本発明では、マウスTCRα鎖定常領域のC末端の15アミノ酸を欠失させて、その結果、その定常領域配列はマウスTCRaC-C.DLT(配列番号42)である。
STAR分子の設計をさらに最適化するために、STAR分子の特定の配列を改変し、1つの改変スキームは、STAR分子の2つの鎖間の対合を強化して内因性TCRとの誤対合を減少させる目的で分子間ジスルフィド結合を導入するために、STAR分子にシステイン点変異を実施することであった。具体的なスキームを以下に示す。
STAR分子の設計をさらに最適化するために、本発明は、STAR分子内の特定の配列を改変する。1つの改変スキームは、STAR分子の安定性を高め、STAR分子がより長く機能するのを助けるために、STAR分子の膜貫通領域において疎水性アミノ酸置換を実施することである。具体的なスキームは以下の通りである。
本発明者らは、上述のN末端改変、システイン改変及び膜貫通領域改変を組み合わせて、マウスTCRaC-Cys-N.Rec-1(配列番号11)、マウスTCRaC-TM9-N.Rec-1(配列番号12)、マウスTCRaC-Cys-TM9(配列番号10)、マウスTCRaC-Cys-TM9-N.Rec-1(配列番号13)、及びマウスTCRbC-Cys-N.Rec-1(配列番号21)を設計した。
STAR分子は、可変領域ドメイン及び定常領域ドメインという2つの部分に分けることができる。可変領域ドメインは、抗原認識能力を有するアミノ酸配列からなり、一般に、以下の分子クラスで構成される:抗体軽鎖可変領域、抗体重鎖可変領域、単鎖抗体(scFv)、リガンド受容体結合領域、ナノボディなど。定常領域ドメインは、TCR定常領域、又はCD3サブユニットと統合する能力を有する関連配列からなり、典型的には、TCRα、β、γ及びδ鎖の定常領域を含む。
1)標的選択
STARの標的選択は、主として遺伝子発現のバンクによって達成され、一般に、好適なSTAR標的の発現レベルは、通常の細胞と比較して、疾患又は関連細胞上で概ね高い発現又は特異的発現を有する。好適な標的が決定された後、標的を認識するための抗原認識ドメインは、一般に抗体、SCFV、VHH又は抗原に対応する受容体などである。重鎖可変領域(VH)、軽鎖可変領域(VL)、アルパカ単鎖抗体(VHH)、並びに抗体の受容体及びリガンドは、マウス、アルパカ、配列決定又は公表された配列の免疫処置によって得ることができる。得られたマウス由来又はアルパカ配列は、一般に、ヒト細胞における発現及び機能にとってより有益であるように、ヒト化及びコドン最適化を受ける必要がある。好適な配列が得られた後に、得られた配列をレンチウイルスベクター又はレトロウイルスベクターに連結し、ベクター構築が正しいか否かを配列決定法によって検出した後に、ウイルスのパッケージング及び感染を介してベクターを体細胞において発現させ、タグタンパク質RFP、GFP、MYC、HISなどを使用してSTARタンパク質の発現、膜ローディング、抗原結合などを検出する。有用な標的としては、GPC3、EGFR VIII、CD22、CD20、MSLN、GD2、LIRB4、ROR1、クローディン18.2、CD7、CD47及びCD24が挙げられるが、これらに限定されない。
本発明では、STARの機能を説明するために複数の標的細胞株を使用し、標的細胞が遺伝子工学的手段を介してルシフェラーゼ遺伝子を得たことから、in vitro機能検出が容易になった。ルシフェラーゼは、細胞機能を研究するための一般的な物質であり、この酵素活性は系にルシフェラーゼ基質を添加することによって判定され、ルシフェラーゼ活性は標的遺伝子の発現、結合強度、細胞数などと密接に関連している。本発明では、ルシフェラーゼを安定に発現させるための標的細胞株を樹立して、標的細胞の量をルシフェラーゼの量によって示し、その結果、機能性細胞の死滅機能が示された。具体的な細胞は以下の通りであった:
抗原認識ドメインは、抗原を認識する抗体、抗体の単鎖可変領域、可変領域、ナノボディ、抗原認識のための受容体などに由来し得る。STARの設計において、ウイルスはT細胞形質転換のための主要な経路であり、レンチウイルス又はレトロウイルスのパッケージングはパッケージングのサイズに関連するため、より小さい抗体認識単位が好まれ、例えば、抗体単鎖可変領域及びナノボディはサイズの点でより良い選択である。同一抗原を目標とする場合、従来の抗体は、先行技術として抗体認識ドメインを広くスクリーニングする方法の1つであるが、一方、ファージライブラリー、アフィニティー最適化、マウスハイブリドーマのスクリーニング、アルパカモノクローナル抗体のスクリーニング、ヒト化などによる完全ヒト化抗体ライブラリーの構築の手法によって、抗原を認識する全く新しい抗体が得られた。さらに、抗原を認識し得る特異的分子としての抗原の受容体は、抗原認識ドメインの主要な選択肢の1つである。
1)プラスミドの供給源
レンチウイルスベクター、レトロウイルスベクター、タンパク質発現ベクター、ファージミド、レンチウイルスパッケージングプラスミド、レトロウイルスパッケージングプラスミドなどを含む、本発明に使用されるベクターはすべて、営利会社から購入されるか、又は営利会社によって合成され、ベクターの完全長配列が得られており、明確な酵素切断部位が公知である。
本発明に採用される遺伝子セグメントは、シグナルペプチド、抗体結合領域、ヒンジ領域、TCR定常領域、タグタンパク質などを含み、これらはすべて、営利会社によって合成された。対応する機能的配列は、プライマー合成PCR様式で1つ又は複数の標的断片を連結することによって得られた。
本方法に使用したレンチウイルスベクターはpHAGE-EF1a-GFPであり、pHAGR-EF1A-WPRE-AMPベクターは、制限エンドヌクレアーゼNot I/Cla Iを介して得られ、断片遺伝子は合成及びPCR法を介して得られ、完全なベクターは、Gibsson/NEBuilder及び他の組換え酵素の作用の下での相同組換え法を介して得られた。レトロウイルスベクターRVKM-CMV-GFPから制限酵素Xho I/BamH Iによってベクター断片が得られ、一方、挿入断片遺伝子は合成及びPCR法によって得て、ベクター及び断片を相同組換え法によって連結した。原核生物発現ベクターはpET-28aベクターとし、使用する制限エンドヌクレアーゼ部位はXhoI及びNcolとし、真核生物発現ベクターはPVRC8400とし、使用する制限エンドヌクレアーゼ部位はXhoI及びXbaIとして、プライマーをヒト抗原遺伝子に従って設計し、制限エンドヌクレアーゼ消化部位をプライマーの2つの末端に付加し、抗原細胞外セグメント及びCセグメントの切り詰められたhisタグを、標的細胞ウェル遺伝子から増幅させて、その後の精製に使用した。プライマーは付着末端PCRを使用して、酵素消化産物の付着末端のセンス鎖及びアンチセンス鎖に従ってそれぞれ設計し、プライマーをそれぞれ、酵素消化後にベクターとの一段階組換え連結に供されることになるPCRに供し、連結産物の5μLを形質転換のための連結後に50μLのDH5αコンピテント細胞に添加し、37℃インキュベーター中で転置して12~16時間培養した。
プラスミド抽出のためにアルカリ溶解法を採用し、プラスミド抽出の後に、260nm光吸収によりプラスミド濃度を検出した。一次配列決定結果が正しいプラスミドの形質転換を行って、抽出に供せられるモノクライン(monocline)を選択する必要があり、プラスミドが正しいか否かは酵素消化によって同定された。
1)プラスミドpHAGE-ルシフェラーゼ-GFPの構築
レンチウイルスベクターとしてのpHAGEは、標的遺伝子を標的細胞ゲノムに安定に挿入することができ、安定な細胞株を構築するための重要な方法である。ルシフェラーゼは触媒活性を有する酵素であり、基質を触媒して化学的自己発光を発生させることができ、標的細胞がルシフェラーゼを安定に発現して基質を添加した後に、標的細胞の数を示すことができるため、標的細胞に対する機能性細胞の影響が反映される。PHAGE-EF1Aベクターは制限酵素Not I/Cla I制限酵素切断部位を保有しており、この2つの酵素を使用することによってベクターを切断し、NCBIからルシフェラーゼ及びGFP配列を入手して、営利会社であるRuibiotechにより断片を合成させ、Overlap PCR法を使用してルシフェラーゼ遺伝子及びGFP遺伝子を組み合わせた後に、相同組換え法を使用することによってルシフェラーゼ-GFP断片をpHAGEベクター中に連結させ、EF1A及びWPREでそれぞれ順方向及び逆方向プライマーを設計し、配列決定を行って、ベクター構築が成功したか否かを判定した。
ルシフェラーゼ及びGFPを使用したレンチウイルスベクターの構築に成功した後、レンチウイルスをLentix-293Tによってパッケージングし、レンチウイルス溶液をPEG8000濃縮法によって濃縮し、勾配希釈法を使用してウイルス力価を測定し、続いて標的細胞を感染させたが、これには以下の表の細胞株が含まれるが、これらに限定されない:
TCRの構造及び配列特性に基づいて、α鎖及びβ鎖の定常領域にガイド配列を設計し、TCRα-β-Jurkat細胞株を構築した。TCRのα鎖及びβ鎖の定常領域エクソン配列をそれぞれNCBIで入手し、α鎖及びβ鎖の定常領域エクソン1配列を、ガイド配列を設計するためにtools.genome-engineering.orgのウェブサイトに提出して、その結果に従ってオリゴ配列を合成した。続いて、sgRNA-LentiCRISPRレンチウイルスベクターを構築し、CRISPRレンチウイルスベクターをBsmBI制限酵素で消化して、フィルター配列を除去し、連結末端を露出させて、自己連結を減少させるためにプラスミドを37℃で1時間アルカリホスファターゼで処理した。酵素消化に供した系をゲル回収のためアガロースゲル電気泳動に供したところ、標的断片のプラスミド骨格は約11500bpであり、一方、切断されたフィルターバンドは-2000bpの位置に存在した;合成されたガイド配列のオリゴ単鎖をin vitroでT4リガーゼ及びT4 PNKを使用することによって処理し、2本鎖にアニーリングさせて、連結のために末端にリン酸基を付加した;アニールした2本鎖ガイド配列を水で200倍に希釈して、LentiCRISPRと連結させてBsmBI酵素消化に供し、Stbl3大腸菌(Escherichia coli)への形質転換を行って、プラスミドをウイルスコーティング感染のために抽出した。α鎖のガイド配列はLentiCRISPR-puroにリンクし、β鎖のガイド配列はLentiCRISPR-BSDにリンクしていた。sgRNA-LentiCRISPRレンチウイルスのパッケージング及び濃縮は、以下のステップを含む:あらかじめ10cm皿にHEK-293Tを播種し、細胞が80%~90%に増殖した時点でトランスフェクション系を調製し、トランスフェクション系をHEK-293Tに添加し、細胞を37℃インキュベーターに戻して培養し、時間を0時間として記録する;トランスフェクション後12時間で、新鮮な10%FBS-DMEMに交換する;トランスフェクションの48時間後及び72時間後にウイルスを収集する;ウイルス含有培地の遠心分離及び濾過を行い、PEG8000を添加して均一に混合し、4℃で12時間以上静置し、3500rpmで30分間遠心分離する;上清を廃棄し、好適な量の培地で再懸濁沈殿を行う;-80℃での凍結保存を実施するか、又は直接使用を行う。Jurkat T細胞の感染、薬物死滅スクリーニング、及びモノクローナル細胞株の同定には、Jurkat T細胞を12ウェル又は24ウェルのプレートに接種するステップを含めた;細胞密度は大きすぎてはならない;α鎖及びβ鎖のsgRNA-LentiCRISPRウイルスを同時に適量添加し、ポリブレン(合計容積に応じて1:1000で添加)を添加して均一に混合した;1000rpmでの遠心感染を実施し、32℃の遠心分離を90分間実施し、細胞を取り出して37℃のインキュベーターに入れ、時間を0時間として記録した;10~12時間後に溶液を交換した;48時間後に、ピューロマイシン及びブラスチシジンを適切な最終濃度で添加したところ、薬物死滅の48時間後に、非感染対照群の細胞はすべて死滅した。生存細胞を吸引除去し、遠心分離後に完全培地で培養してTCRα-β-Jurkat細胞ライブラリーを得た;TCRα-β-Jurkat細胞ライブラリーの単一細胞をフロー型Ariaを使用して96ウェルプレートに分取し、培養を2週間行い、増殖した単一細胞を吸引して、拡大培養を行った;TCRα鎖及びTCRβ鎖のそれぞれの抗体を使用してモノクローナル細胞株を同定し、この2つの鎖が欠損している細胞株を増幅して、内因性TCRがノックアウトされたJurkat T細胞株を得た。
1)レンチウイルス系及びパッケージング方法(異なる世代)
Lentix-293T細胞を、5×105/mLに従って10cm培養皿に接種し、37℃で5% CO2インキュベーター中で培養し、細胞密度が約80%に達した時点でトランスフェクトした(顕微鏡下で観察)。3つのプラスミドを500uLの無血清DMEMと、PMD2.G:PSPAX:伝達プラスミドの比を1:2:3として十分に混合した。54uLのPEI-maxを500uLの無血清DMEMと十分に混合し、室温で5分間放置した(プラスミドに対するPEI-Maxの体積対質量比は3:1であった)。プラスミド混合溶液にPEI-max混合溶液をゆっくりと加え、均一になるようにブロー及び撹拌を少し行って、室温で15分間放置した。最終的な混合溶液を培地にゆっくりと添加して十分に均一に混合した後、混合溶液をインキュベーターに戻して12~16時間連続培養し、6% FBS DMEM培地に移して連続培養して、48時間及び72時間のウイルス溶液を採取した。
Jurkat-C5細胞を5×105/mLに従って平底96ウェルプレートに接種し、10% FBSを含有する100uLの1640培地及び0.2uLの1000×ポリブレンを各ウェルに添加した。ウイルスを希釈する場合には、1640完全培地を使用することによって10倍希釈を実施し、ウイルスがウイルス原液である場合には第1のウェルのウイルス量は100uLとし、ウイルスが濃縮液である場合には第1のウェルのウイルス量は1uLとした;希釈した細胞を100uL/ウェルでウイルスウェルに添加して混合し、32℃、1500rpmで90分間の遠心分離を実施し、5% CO2インキュベーター中で37℃、72時間の培養を行った。96ウェル平底プレート上の細胞を丸底96ウェルプレート上に吸引し、4℃、1800rpmで5分間遠心分離して、上清を廃棄した。200uLの1×PBSを添加した後、4℃、1800rpmで5分間の遠心分離を実施し、上清を廃棄した。4%組織固定液を200uL添加し、暗所での保存を実施して、フローサイトメーターへのローディングを実施した。フローサイトメーターを使用することによって感染効率を測定し、力価を計算する場合には感染率2%~30%のウェルを選択し、計算式は力価(TU/mL)=1.5×104×陽性率/ウイルス体積(uL)×1000とした。
1)Jurkat T細胞株の培養方法
Jurkat T細胞株を、10% FBSを含有するRPMI1640培地で培養した。培養密度は3×105/ml、最大でも3×106/mlを超えないこととし、継代は1日~2日毎に行い、細胞を計数し、必要な量の細胞を採取して、密度を調整するために培地を補充して、細胞をCO2培養ボックスに入れて培養した。
本方法は、細胞を計数し、遠心分離及び液体交換のために1×106/mlの細胞を採取し、10% FBSを含有する1 mlのRPMI1640培地を使用して再懸濁し、24ウェルプレートに添加し、好適な量のウイルス液を添加し、1500rpmで90分間遠心分離し、CO2インキュベーター中で培養するというステップを含む。感染の12時間後に、液体を10% FBSを含有する新鮮なRPMI1640培地で完全に交換し、陽性率を72時間後に検出した。
初代T細胞はFicoll分離法により入手し、10% FBS及び100 IU/ml IL-2を含むX-VIVO培地中で培養し、CD3及びレトロネクチンr-フィブロネクチン(最終濃度5ug/ml)をプレコートしたプレートに添加し、初期培養密度は1×106/mlとした。その後の培養密度は5×105/ml、最大でも3×106/mlを超えないこととし、継代は1日~2日毎に行った。
初代T細胞を48時間培養した後、ウイルス液を添加し、MOI=20として1500rpmで90分間の遠心分離を実施し、細胞をCO2インキュベーターに入れて培養した。感染の24時間後に、10% FBS及び100 IU/ml IL-2を含有するX-VIVO培地を補充し、十分な移行を行い、感染効率を72時間後にタグタンパク質又は抗体を介して検出した。
感染の72時間後、細胞に均等にブローを行って計数し、遠心分離のために5×105/mlを採取して、上清を廃棄し、染色溶液をPBS+2% FBS+2mM EDTAとし、対応する抗体をインキュベーションのために添加し、インキュベーションを30分間実施し、続いて洗浄のためにPBSを2回添加し、検出のためローディングを実施した。
遺伝子形質転換によるT細胞形質転換過程において、標的遺伝子の発現、膜ローディング、及び細胞表面での分布はT細胞の機能に影響を及ぼすため、蛍光タンパク質を介してウイルス感染効率を検出し、STARのN末端にmyc抗体を連結させることによって、フロー抗体を介してSTARの膜ローディング効率を検出した。STARの構造はTCRに由来するため、STARが内因性TCRと誤対合するかどうかは無傷STARの発現量に影響し、誤対合効率はRFP陽性比とSTAR myc陽性比とを比較することによって評価した。
構築したpHAGE-EF1A-myc-STAR-IRES-RFPプラスミドをLentix-293Tによるウイルスパッケージングに供し、ウイルス濃度及び力価検出を行い、続いてJurkatC5及び初代T細胞を感染させ、感染の72時間後に感染細胞を収集し、FITC-抗myc抗体及びAPC-抗mTCR-β抗体で染色を行い、フローサイトメーター(BD Fortessa)を使用してRFP/FITC/APC蛍光チャネルを検出した。FITC又はAPCが明らかな陽性細胞集団を有する場合には、STARの膜ローディング発現が可能であり、FITC及びAPCの両方が発現しない場合には、STARは膜ローディングを実現しないことが示された。
構築されたpHAGE-EF1A-myc-STAR-IRES-RFPプラスミドをLentix-293Tによるウイルスパッケージングに供し、ウイルス濃度及び力価検出を実施し、続いてJurkat及び初代T細胞を感染させ、感染の72時間後に感染細胞を収集し、FITC-抗myc抗体及びAPC-抗-mTCR-β抗体を使用することによって染色を行い、フローサイトメーター(BD Fortessa f4)を使用することによってフローRFP/FITC/APC蛍光チャネルを検出した。RFP陽性率とFITC又はAPC陽性率との間に差が検出された。
1)T細胞と標的細胞とのin vitro共培養方法
T細胞はT細胞株Jurkat C5、Jurkatを含み、初代細胞株は懸濁細胞であり、標的細胞は異なる抗原及び細胞株に従って懸濁細胞及び接着細胞に分けることができ、RAJIなどの懸濁標的細胞をT細胞と共培養し、RAJIなどの懸濁標的細胞及びT細胞を共培養する場合には、対応する数の細胞を同時に採取し、細胞を遠心培養用の標的細胞培地と均一に混合した。また、細胞が接着性の標的細胞である場合には、あらかじめ1日前に標的細胞を接種する必要があるとし、続いて一定数のT細胞を添加したが、本方法は、パッケージング及び精製されたSTARウイルスを使用することによってT細胞株又は初代T細胞を感染させ、共培養の1日前に感染効率に関するフロー型検出を実施し、機能細胞と標的細胞との比を一般に10:1、5:1及び1:1の比を使用して決定し、感染効率に応じてT細胞の総数を計算するステップを含み、ここで標的細胞の使用量は一般に4E5/ウェル(24ウェルプレート)とした。
適用の標的は一般に細胞表面タンパク質であり、抗原は、T細胞の機能を検出するためにT細胞の活性化のために直接使用することができ、典型的には、5μg/mlの抗原(1×コーティング緩衝液希釈、一例として24ウェルプレートを採用する場合)の300マイクロリットルを一晩ウェルプレートをコーティングするために使用し、続いて抗原を廃棄し、陽性T細胞の1E6/ウェルを添加し、T細胞の機能を検出するために6、12及び24時間の遠心活性化の後にT細胞を収集した。
T細胞は活性化の過程で多数のサイトカイン(一般的な例としては、TNF-α、IFN-γ及びIL-2が挙げられる)を放出して、T細胞が標的細胞を死滅させること、又はT細胞自身の増殖を促進することの一助とする。標的細胞又は抗原によって刺激された後に、T細胞を収集して遠心分離し、上清を採取した。TNF-α、IFN-γ及びIL-2 ELISAキットには、それぞれヒトIL-2 Uncoated ELISA、ヒトTNF-α Uncoated ELISA及びヒトIFN-γ Uncoated ELISA(物品番号88-7025、88-7346、88-7316)を使用した。具体的なステップは以下の通りである:10×コーティング緩衝液をddH2Oで1Xに希釈し、コーティング抗体(250×)を添加して均一に混合し、続いて混合物を1ウェル当たり100μlで96ウェルプレート(ELISA専用)に添加した。4℃で一晩静置するために保存フィルムで密封した後、96ウェルプレートを1×PBST(洗浄緩衝液とも呼ばれ、0.05% Tween20が1×PBSに添加されている)を各回1ウェル当たり260μl用いて3回洗浄した;5×ELISA/ELISPOT希釈剤をddH2Oで1×に希釈した;産物を1ウェル当たり200μlで96ウェルプレートに添加した;96ウェルプレートを室温で1時間静置した。96ウェルプレートをPBSTで1回洗浄し、希釈して標準曲線(その範囲はそれぞれ2~250、4~500、4~500であった)を得た;試料を1×希釈液で20~50倍に希釈した。試料及び標準曲線に1ウェル当たり100μl及び2つのマルチポアを添加した;常温で2時間インキュベートした後、96ウェルプレートをPBSTで3回洗浄した;1×希釈剤で希釈した検出抗体を1時間のインキュベーションのために添加し、続いて96ウェルプレートをPBSTで3回洗浄した;続いて、1×希釈剤で希釈したHRPを添加して30分間インキュベートし、続いて96ウェルプレートを6回洗浄した;現像用にTMBを添加し、現像時間は15分を超えないこととした;現像を停止するために2N H2SO4を添加した;450nmでの光吸収を行うことによって光吸収を検出した。
24時間の共培養の後、細胞懸濁液をわずかに均一にブローし、各ウェルから150μLの細胞懸濁液を採取して、白色の96ウェルプレートに添加した;各ウェルから2つのマルチポアを選択した;ルシフェラーゼ基質(promega)を添加した。振盪(低速)を、10分間のコインキュベーションのために実施した;続いて、ゲインを100に固定したマルチモードリーダーを使用して化学ルミネセンス値を検出した。細胞死滅の計算:死滅効率=100%-(エフェクター細胞-標的化細胞ウェルの値/対照細胞-標的化細胞ウェルの値)。
1)実験動物モデル
この実験にはモデルとしてNSG免疫不全マウスを使用した。このマウスは、NOD-Prkdcem26Il2rgem26/Njuの遺伝型を有し、T細胞、B細胞及びNK細胞が欠損している;このマウスはマクロファージ及び樹状細胞にも欠陥がある。NSGマウスは、最も完全な免疫不全を示すマウス系統に属し、移植腫瘍及びT細胞に対する拒絶反応を示さず、T細胞治療の前臨床研究に広く応用されている。この実験では、6~8週齢の雌性NSGマウスを使用した。各バッチの実験におけるマウス間の体重差を2g以内に制御した。マウスは、病原体汚染を防ぐために、特定病原体が除去された(SPF)クリーングレードバリア下にて個別に換気されたケージ内で飼育され、通常の食餌及びわずかに酸性のpHの飲料水を与えられた。
本発明はSTAR-T細胞の機能を検証するために様々な腫瘍モデルを使用しており、その結果、STAR-T細胞の効果の普遍性が検証された。血液腫瘍モデルの構築において、この実験には異種移植のためにヒトバーキットリンパ腫細胞株のRaji細胞を使用した。Raji細胞は、レンチウイルスベクターを介してルシフェラーゼ遺伝子を発現させるための細胞株であり、ルシフェリンの化学発光及び生体イメージングの様式で、マウスにおけるRaji腫瘍の発生及び変化をリアルタイムでモニターする。本モデルでは、種々の用量(一般に約1~3×106個の細胞)のRaji-ルシフェラーゼ細胞を、6~8週齢の雌NSGマウスに尾静脈再注入によって接種した。3日後にマウスにルシフェリンカリウム塩溶液を腹腔内注射し、体内の腫瘍細胞の蛍光シグナルを生体イメージング様式で検出した。Raji細胞はマウスの中で急速に増殖し、血液を介して全身に分布しており、その結果、臓器に感染して固形腫瘍を形成し、マウスの体重減少などの症状を引き起こす確率が一定程度ある;治療的処置を行わない場合、Raji腫瘍負荷は約30~40日後にマウスを死亡させる。
実験動物としてのマウスに対する操作方法は、捕獲、固定、番号付け、麻酔、剃毛、投与、採血、殺処理及び解剖を含み、この実験において使用される番号付け方法は、足指クリップ法、耳標法及び毛色マーキング法を含む。この実験において、使用される麻酔方法は、イソフルランの吸入麻酔及びアベルチン又はペントバルビタールの注射麻酔を含む。剃毛方法は、マウスの局所部位をハサミ又はカミソリで剃毛することを含む。投与方法は、腹腔内注射、尾静脈注射、皮下注射、眼窩静脈叢注射、頭蓋内注射などを含む。採血方法は、眼窩採血、眼球摘出による採血、尾静脈採血などを含む。殺処理方法は、頸部牽引による殺処理、炭酸ガスによる殺処理などを含む。すべての操作は、実験動物の研究及び使用の計画(動物プロトコール)の承認後に実施した。
この実験は、主として2つの方法で腫瘍増殖を検出する。第1のものはin vivo蛍光イメージング法であり、ルシフェラーゼ遺伝子を有する腫瘍細胞をコロニー形成のために動物に注入した。マウスにルシフェリンカリウム塩溶液を腹腔内注射して、基質が酵素の作用下で放射する特定の波長の光を、体内の腫瘍細胞の蛍光シグナルを、生体イメージング機器に装着された敏感なCCD装置で検出した。さらに、専用ソフトウェアを使用して、蛍光シグナルを定量的に分析し、熱画像を描出して、腫瘍の増殖を直感的且つ定量的に反映させることもできる。第2の方法は皮下腫瘍のサイズを測定することであり、各腫瘍の長さ、幅及び高さをノギスにより測定し、各体積値を特別な計算式によって明らかにする。一般的な計算式は、体積=長さ×幅×高さ、体積=3×長さ×幅×高さなどである。
体内でのT細胞の生存性及び増殖条件は、T細胞の最終的な抗腫瘍効果に直接関連する。動物におけるT細胞の生存性及び増殖条件を検出するために、この実験ではマウスから定期的に血液を採取し、末梢血中のSTAR-T細胞の比率、細胞状態及び細胞分類を分析した。具体的な操作は以下の通りである:約1週間毎にマウスをイソフルランで麻酔し、約100μlの量で眼窩血の採取を行った。血液試料を抗凝固、血漿採取、赤血球溶解などに供した後に、残りの細胞をフロー染色に供し、CD4/CD8比、及びCCR7、CD45RA、PD-1、LAG-3、TIM-3などの分子を検出して、T細胞サブセットの分析及び細胞状態の分析を行った。一方、フローサイトメーター及びデジタルPCRによる計数法により、各マウスの末梢血中のSTAR-T細胞の絶対量値を求めた。さらに、実験の最後にマウスを解剖して、マウスの他の免疫器官におけるT細胞の比率を検出した。
STAR-T細胞の細胞毒性及び安全性を評価するために、細胞が実験動物に副作用を起こしたか否かを検出することができる。マウスの行動状態を観察すること、マウスの病理学的分析を実施すること、分析のためにマウスの重要臓器をスライスすること、及び他の様式により、再注入したT細胞が有意な細胞毒性を有するか否かを評価することができる。一方、マウスの非腫瘍組織におけるT細胞浸潤分析により、T細胞が非腫瘍組織に対してオフターゲット死滅効果を有するか否かをさらに判定することが可能である。さらに、各マウスの血中サイトカイン(IL-2、IFN-γ、TNFα又はIL-6など)のレベルを検出することによって、T細胞が全身性サイトカインストームを引き起こすか否かを判定することができる。
T細胞が腫瘍に浸潤する能力は、固形腫瘍に対処する上で中心となる能力である。T細胞の浸潤能力を検出するために、腫瘍組織を分離し、消化して、単一細胞を得るために細かく粉砕し、腫瘍組織中のT細胞の割合をフロー染色により検出した。一方、腫瘍細胞、腫瘍間質細胞及び免疫細胞を、密度勾配遠心法(Percoll勾配及びFicoll勾配など)によって腫瘍懸濁液からさらに分離して、精製された腫瘍浸潤T細胞を得た;精製された腫瘍浸潤T細胞の特性(ケモカイン受容体発現及びT細胞消耗度を含む)を、シークエンシング法などを使用することによって詳細に分析した。
10.1.抗EGFR STAR受容体の構築
(1)EGFRを標的とする抗体の配列に関する決定
抗体重鎖可変領域(抗EGFR Cetux-VH、配列番号22)及び抗体軽鎖可変領域(抗EGFR Cetux-VL、配列番号23)により、センツキシマブ(略してCetux)が選択された。コドンを最適化して配列を合成した。
STARは2つのポリペプチド鎖を含有した;抗EGFR Cetux-VLをマウスTCRbC-WT鎖に融合させて、第1のポリペプチド断片を形成させた;抗EGFR Cetux-VHをマウスTCRaC-WT鎖に融合させて、第2のポリペプチド断片を形成させた。この2つの鎖には両方ともGM-CSFシグナルペプチドを使用した。このSTARの遺伝子配列は、フューリン-SGSG-p2Aプロテアーゼ切断部位でポリペプチドセグメントを介して連結された;2本のポリペプチド鎖は共に転写され、翻訳され、タンパク質として発現されると考えられる;続いてこのタンパク質はフューリン及びp2Aに対応するプロテアーゼによって切断されて、2つの独立したタンパク質鎖を形成する。T細胞の2つのタンパク質鎖及び内因性CD3サブユニット(ε、δ、γ、ζ)は複合体を形成し、GM-CSFシグナルペプチドの誘導下でこの複合体は細胞膜に移行して提示された(図1に示す通り)。
遺伝子合成及びクローニングの様式を通して、4つの断片「抗EGFR Cetux-VL」、「マウスTCRbC-WT」、「抗EGFR Cetux-VH」及び「マウスTCRaC-WT」が得られた。各プライマー対は、前方及び次の塩基に相同な25bp塩基を有していた;4つの断片をGibson Assembly法によってさらに組み換えて、レンチウイルスベクターpHAGEに連結させ、それによってSTARが得られた。
Gibson Assemblyの産物をDH5α株に形質転換導入し、アンピシリンを含有するLBプレート上で一晩増殖させた。モノクローナル細菌を配列決定のために選択し、配列決定用プライマーにはpHAGEベクター上のseq-pHAGE-F及びseq-pHAGE-Rプライマーを選択した。
正しいことが配列決定された細菌をLB液体培地に接種して一晩培養した。プラスミドの抽出には、エンドトキシン除去機能を有するキットを使用した。プラスミドの濃度をNanodropで測定したところ、プラスミドの最終濃度は約1000ng/ulであり、A260/A280値は1.8よりも大きかった。このようにして、マウスTCRa/bC-WTの定常領域を有し、EGFRを標的とする、STARプラスミドpHAGE-EF1A-Cetux-VL-TCRaC-P2A-VH-TCRbC-IRES-RFPが得られた。
10.2.抗EGFR STAR受容体の定常領域のN末端改変及び再編成変異体の機能
1)STARの定常領域のN末端の特定の配列を欠失させて、STARの機能を失わせた。
phge-EF1A-IRES-RFPベクターを使用することによって、Gibsson Assemblyにより、マウスTCRa/bC-C.DLT STARベクターを組み換えて構築した;Lentix-293T細胞を使用してウイルスをパッケージングし、パッケージングプラスミドはpSPAX及びPMD2.Gとし、トランスファープラスミドとpSPAXとPMD2.Gとのパッケージング比を3:2:1とした;10cm培養皿のそれぞれに合計18μgのプラスミドが存在し、各培養皿におけるプラスミドとPEI-MAXとの比は1:3であり、すなわち54μLのPEIを使用した;トランスフェクションの12時間後に培地を交換し、48時間後及び72時間後にウイルス溶液を回収した;20000rpm、4℃で2時間の遠心分離の後、再懸濁のために無血清培地を使用した;ウイルスを100倍に濃縮して、ウイルス力価を検出した。Jurkat C5及び初代T細胞を感染した;初代T細胞におけるウエスタンブロット法、RFP及びEGFR-his-APC染色から、マウスTCRa/bC-C.DLTはタンパク質発現を有するが、膜形成を受けないことが見出された;このことは、マウスTCRa/bC-C.DLTから欠失した配列がSTARの機能にとって鍵であり、STARの再編成はランダムではないことを物語る。
phge-EF1A-IRES-RFPベクターを使用することによって、Gibsson Assemblyにより、マウスTCRa/bC-N.Rec-1 STAR、マウスTCRa/bC-N.Rec-2 STAR、マウスTCRa/bC-N.Rec-3 STAR、マウスTCRa/bC-N.Rec-4 STAR、及びマウスTCRa/bC-WT STARベクターを組み換えて構築した;Lentix-293T細胞を使用してウイルスをパッケージングし、パッケージングプラスミドはpSPAX及びPMD2.Gとし、トランスファープラスミドとpSPAXとPMD2.Gとのパッケージング比を3:2:1とした;10cm培養皿のそれぞれに合計18μgのプラスミドが存在し、各培養皿のプラスミドとPEI-MAXとの比は1:3とし、すなわち54μLのPEIを使用した;トランスフェクションの12時間後に培地を交換し、48時間後及び72時間後にウイルス溶液を回収した;20000rpm、4℃で2時間の遠心分離の後、再懸濁のために無血清培地を使用した;ウイルスを100倍に濃縮して、ウイルス力価を検出した。結果は、ウイルス力価に明らかな差はないことが示されている。Jurkat C5及び初代T細胞の感染から、感染効率に有意差はないことが見出された。初代T細胞におけるRFP及びEGFR-his-APC染色から、マウスTCRa/bC-WT STARと比較して、マウスTCRa/bC-N.Rec-1は内因性TCRとのミスマッチの点でミスマッチ比が低いことが見出された。標的細胞A431、B16-tEGFR及びA549との共培養から、マウスTCRa/bC-N.Rec-1は、マウスTCRa/bC-WT STARよりも強い標的細胞死滅能力を有することが見出された。配列分析では、マウスTCRa/bC-N.Rec-1が、マウスTCRa/bC-WT STARよりも配列のヒト起源においてより高度であることが示されている。免疫原性予測分析では、マウスTCRa/bC-N.RecがマウスTCRa/bC-WT STARよりも免疫原性が低いことが示されている。一方、マウスTCRa/bC-N.Rec-2 STAR、マウスTCRa/bC-N.Rec-3 STAR及びマウスTCRa/bC-N.Rec-4 STARの欠失は、STARの機能を失わせた。
4)STARの定常領域のN末端の再編成は配列特異性を有し、他の再編成様式は無効である。
STAR受容体にシステイン点変異がある場合には、追加のジスルフィド結合が付加されて、複合体のマッチングを高めて安定化する効果を発揮することができる。phge-EF1A-IRES-RFPベクターを使用することによって、Gibsson Assemblyにより、マウスTCRa/bC-Cys STAR及びマウスTCRa/bC-WT STARベクターを組み換えて構築した;Lentix-293T細胞を使用してウイルスをパッケージングし、パッケージングプラスミドをpSPAX及びPMD2.Gとし、トランスファープラスミドとpSPAXとPMD2.Gとのパッケージング比を3:2:1とした;10cm培養皿のそれぞれに合計18μgのプラスミドが存在し、各培養皿のプラスミドとPEI-MAXとの比は1:3とし、すなわち54μLのPEIを使用した;トランスフェクションの12時間後に培地を交換し、48時間後及び72時間後にウイルス溶液を回収した;20000rpm、4℃で2時間の遠心分離の後、再懸濁のために無血清培地を使用した;ウイルスを100倍に濃縮して、ウイルス力価を検出した。結果は、ウイルス力価に明らかな差はないことが示されている。Jurkat C5及び初代T細胞の感染から、感染効率に有意差はないことが見出された。初代T細胞におけるRFP及びEGFR-his-APC染色から、マウスTCRa/bC-WTと比較して、マウスTCRa/bC-Cysは内因性TCRとのミスマッチの点でミスマッチ比が有意に低下していることが見出された。標的細胞A431、B16-tEGFR及びA549との共培養から、マウスTCRa/bC-CysはマウスTCRa/bC-WTよりも強い標的細胞死滅能力を有することが見出された。マウスTCRa/bC-Cysは、EGFR抗原による刺激後のサイトカインIL-2、TNFα、IFNγの分泌レベルがより高かった。
STAR受容体の膜貫通領域の特定部位での疎水性アミノ酸置換は、重要な役割を果たす。STAR受容体にシステイン点変異がある場合には、追加的なジスルフィド結合が付加されて、複合体のマッチングを高めて安定化する効果を発揮することができる。phge-EF1A-IRES-RFPベクターを使用することによって、Gibsson Assemblyにより、マウスTCRa/bC-TM9 STAR及びマウスTCRa/bC-WT STARベクターを組み換えて構築した;Lentix-293T細胞を使用してウイルスをパッケージングし、パッケージングプラスミドはpSPAX及びPMD2.Gとし、トランスファープラスミドとpSPAXとPMD2.Gとのパッケージング比は3:2:1とした;10cm培養皿のそれぞれに合計18μgのプラスミドが存在し、各培養皿のプラスミドとPEI-MAXとの比は1:3とし、すなわち54μLのPEIを使用した;トランスフェクションの12時間後に培地を交換し、48時間後及び72時間後にウイルス溶液を回収した;20000rpm、4℃で2時間の遠心分離の後、再懸濁のために無血清培地を使用した;ウイルスを100倍に濃縮して、ウイルス力価を検出した。結果は、ウイルス力価に明らかな差はないことが示されている。Jurkat C5及び初代T細胞の感染から、感染効率に有意差はないことが見出された。初代T細胞におけるRFP及びEGFR-his-APC染色から、マウスTCRa/bC-WTと比較して、マウスTCRa/bC-TM9は内因性TCRとのミスマッチの点でミスマッチ比が有意に低下していることが見出された。標的細胞A431、B16-tEGFR及びA549との共培養から、マウスTCRa/bC-TM9は、マウスTCRa/bC-WTよりも強い標的細胞死滅能力を有することが見出された。マウスTCRa/bC-Cysは、EGFR抗原による刺激後のサイトカインIL-2、TNFα、及びIFNγの分泌レベルがより高かった。
定常領域の改変戦略(N末端改変、Cys置換、膜貫通領域の疎水性改変)の3つの組合せ、対での組合せ、及び単一改変の効果を比較するために、phge-EF1A-IRES-RFPベクターを使用することによって、Gibsson Assemblyにより、下表のすべてのSTARベクターを組み換えて構築した;Lentix-293T細胞を使用してウイルスをパッケージングし、パッケージングプラスミドはpSPAX及びPMD2.Gとし、トランスファープラスミドとpSPAXとPMD2.Gとのパッケージング比は3:2:1とした;10cm培養皿のそれぞれに合計18μgのプラスミドが存在し、各培養皿のプラスミドとPEI-MAXとの比は1:3とし、すなわち54μLのPEIを使用した;トランスフェクションの12時間後に培地を交換し、48時間後及び72時間後にウイルス溶液を回収した;20000rpm、4℃で2時間の遠心分離の後、再懸濁のために無血清培地を使用した;ウイルスを100倍に濃縮して、ウイルス力価を検出した。Jurkat C5及び初代T細胞の感染から、T細胞を同じMOIで感染させた後に、感染効率(すなわち、RFP陽性率)に有意差はないことが見出された。RFP及びEGFR-his-APC抗体染色から、対の変異組合せのミスマッチ比は単一変異戦略のものよりも有意に低いことが見出された。同じRFP陽性細胞の場合に、標的細胞A431、B16-htEGFR及びA549に対する、対の変異におけるSTAR-T細胞の死滅能力は単一変異戦略のものよりも有意に高かった;サイトカインIL-2、TNFα、IFNγの分泌レベルはさらに高い。しかし、3つの変異戦略を同時に組み合わせた場合には、最も低いミスマッチ比、同時での標的細胞に対するより強い死滅能力、及びサイトカインのより高い分泌レベルが示されている。全体の結果を図6に示す。
実施形態1における変異戦略に基づき、本発明は、定常領域の配列切詰め、再編成及びC末端再編成などの最適化ソリューションを実施した。GPC3については、抗体配列はGPC3を目標とするモノクローナル抗体GC33を選択した;抗体重鎖可変領域(抗GPC3 GC33-VH、配列番号25)及び抗体軽鎖可変領域(抗GPC3 GC33-VL、配列番号24)にphage-EF1A-IRES-RFPベクターを使用した;Gibsson Assemblyにより、マウスGC33-VH TCRa-GC33-VL TCRbC-N.DLT STAR、マウスGC33-VH TCRa-GC33-VL TCRbC-C.DLT STAR、マウスGC33-VH TCRa-GC33-VL TCRbC-N.Rec-1 STAR、マウスGC33-VH TCRa-GC33-VL TCRbC-N.Rec-2 STAR、マウスGC33-VH TCRa-GC33-VL TCRbC-N.Rec-3 STAR、マウスGC33-VH TCRa-GC33-VL TCRbC-N.Rec-4 STAR、マウスGC33-VH TCRa-GC33-VL TCRbC-WT STARなどのベクターを組み換えて構築した。Lentix-293T細胞を使用してウイルスをパッケージングし、パッケージングプラスミドをpSPAX及びPMD2.Gとし、トランスファープラスミドとpSPAXとPMD2.Gとのパッケージング比は3:2:1とした;10cm培養皿のそれぞれに合計18μgのプラスミドが存在し、各培養皿のプラスミドとPEI-MAXとの比は1:3とし、すなわち54μLのPEIを使用した;トランスフェクションの12時間後に培地を交換し、48時間後及び72時間後にウイルス溶液を回収した;20000rpm、4℃で2時間の遠心分離の後、再懸濁のために無血清培地を使用した;ウイルスを100倍に濃縮して、ウイルス力価を検出した。結果を図7に示す。
1)STARの定常領域のN末端での特定の配列の切詰めは、STARの機能を失わせた。
Jurkat C5及び初代T細胞を感染させた;初代T細胞におけるRFP及びGPC3-FITC染色から、マウスGC33-VH TCRa-GC33-VL TCRbC-C.DLTは膜形成を受けることができないことが見出された;このことは、マウスGC33-VH TCRa-GC33-VL TCRbC-C.DLTから欠失した配列がSTARの機能にとって鍵であり、STARの再編成はランダムではなかったことを物語っていた。標的細胞Huh-7とHepG2細胞との共培養から、マウスGC33-VH TCRa-GC33-VL TCRbC-C.DLTは死滅機能を有していないことが見出された。
Jurkat C5及び初代T細胞の感染から、感染効率に有意差はないことが見出された。初代T細胞におけるRFP及びEGFR-his-APC染色から、マウスGC33-VH TCRa-GC33-VL TCRbC-WT STAR、マウスGC33-VH TCRa-GC33-VL TCRbC-N.Rec-1と比較して、内因性TCRとのミスマッチの点でミスマッチ比が低いことが見出された。標的細胞Huh-7とHepG2細胞との共培養から、マウスGC33-VH TCRa-GC33-VL TCRbC-N.Rec-1は、マウスGC33-VH TCRa-GC33-VL TCRbC-WT STARよりも強い標的細胞死滅能力を有することが見出された。配列分析により、マウスGC33-VH TCRa-GC33-VL TCRbC-N.Rec-1が、マウスGC33-VH TCRa-GC33-VL TCRbC-WT STARよりも配列のヒト起源においてより高度であることが示されている。免疫原性予測分析からは、マウスGC33-VH TCRa-GC33-VL TCRbC-N.Recが、マウスGC33-VH TCRa-GC33-VL TCRbC-WT STARよりも免疫原性が低いことが示されている。一方、マウスGC33-VH TCRa-GC33-VL TCRbC-N.Rec-2 STAR、マウスGC33-VH TCRa-GC33-VL TCRbC-N.Rec-3 STAR及びマウスGC33-VH TCRa-GC33-VL TCRbC-N.Rec-4 STARの欠失は、STARの機能を失わせた。
初代T細胞におけるRFP及びEGFR-his-APC染色から、マウスGC33-VH TCRa-GC33-VL TCRbC-N.Rec-1と比較して、GC33-VH TCRa-GC33-VL TCRbC-N.rRec、GC33 scFvは膜形成を受けることができないことが見出された。標的細胞Huh-7とHepG2細胞との共培養から、マウスGC33-VH TCRa-GC33-VL TCRbC-N.rRecの死滅機能は失われており、マウスGC33-VH TCRa-GC33-VL TCRbC-N.Rec STARTの機能よりもはるかに不良であることが見出された。
STAR受容体にシステイン点変異がある場合には、追加のジスルフィド結合が付加されて、複合体のマッチングを高めて安定化する効果を発揮することができる。phage-EF1A-IRES-RFPベクターを使用することによって、Gibsson Assemblyにより、マウスGC33-VH TCRa-GC33-VL TCRbC-Cys STAR及びマウスGC33-VH TCRa-GC33-VL TCRbC-WT STARベクターを組み換えて構築した;Lentix-293T細胞を使用してウイルスをパッケージングし、パッケージングプラスミドはpSPAX及びPMD2.Gとし、トランスファープラスミドとpSPAXとPMD2.Gとのパッケージング比は3:2:1とした;10cm培養皿のそれぞれに合計18μgのプラスミドが存在し、各培養皿のプラスミドとPEI-MAXとの比は1:3とし、すなわち54μLのPEIを使用した;トランスフェクションの12時間後に培地を交換し、48時間後及び72時間後にウイルス溶液を回収した;20000rpm、4℃で2時間の遠心分離の後、再懸濁のために無血清培地を使用した;ウイルスを100倍に濃縮して、ウイルス力価を検出した。結果は、ウイルス力価に明らかな差はないことが示されている。Jurkat C5及び初代T細胞の感染から、感染効率に有意差はないことが見出された。初代T細胞におけるRFP及びGPC3-FITC染色から、マウスGC33-VH TCRa-GC33-VL TCRbC-WTと比較して、マウスGC33-VH TCRa-GC33-VL TCRbC-Cysは、内因性TCRとのミスマッチの点でミスマッチ比が有意に低下していることが見出された。標的細胞Huh-7とHepG2細胞との共培養から、マウスGC33-VH TCRa-GC33-VL TCRbC-Cysは、マウスGC33-VH TCRa-GC33-VL TCRbC-WTよりも強い標的細胞死滅能力を有することが見出された。
STAR受容体の膜貫通領域の特定部位での疎水性アミノ酸置換は、重要な役割を果たす。STAR受容体にシステイン点変異がある場合には、追加的なジスルフィド結合が付加されて、複合体のマッチングを高めて安定化する効果を発揮することができる。phage-EF1A-IRES-RFPベクターを使用することによって、Gibsson Assemblyにより、マウスGC33-VH TCRa-GC33-VL TCRbC-TM9 STAR及びマウスGC33-VH TCRa-GC33-VL TCRbC-WT STARベクターを組み換えて構築した;Lentix-293T細胞を使用してウイルスをパッケージングし、パッケージングプラスミドはpSPAX及びPMD2.Gとし、トランスファープラスミドとpSPAXとPMD2.Gとのパッケージング比は3:2:1とした;10cm培養皿のそれぞれに合計18μgのプラスミドが存在し、各培養皿のプラスミドとPEI-MAXとの比は1:3とし、すなわち54μLのPEIを使用した;トランスフェクションの12時間後に培地を交換し、48時間後及び72時間後にウイルス溶液を回収した;20000rpm、4℃で2時間の遠心分離の後、再懸濁のために無血清培地を使用した;ウイルスを100倍に濃縮して、ウイルス力価を検出した。結果は、ウイルス力価に明らかな差はないことが示されている。Jurkat C5及び初代T細胞の感染から、感染効率に有意差はないことが見出された。初代T細胞におけるRFP及びGPC3-FITCタンパク質染色から、マウスGC33-VH TCRa-GC33-VL TCRbC-WTと比較して、マウスGC33-VH TCRa-GC33-VL TCRbC-TM9は内因性TCRとのミスマッチの点でミスマッチ比が有意に低下していることが見出された。標的細胞Huh-7とHepG2細胞との共培養から、マウスGC33-VH TCRa-GC33-VL TCRbC-TM9は、マウスGC33-VH TCRa-GC33-VL TCRbC-WTよりも強い標的細胞死滅能力を有することが見出された。
改変戦略の3つの組合せ、対での組合せ、及び単一改変の効果を比較するために、phage-EF1A-IRES-RFPベクターを使用することによって、Gibsson Assemblyにより、以下の表のすべてのSTARベクターを組み換えて構築した;Lentix-293T細胞を使用してウイルスをパッケージングし、パッケージングプラスミドはpSPAX及びPMD2.Gとし、トランスファープラスミドとpSPAXとPMD2.Gとのパッケージング比は3:2:1とした;10cm培養皿のそれぞれに合計18μgのプラスミドが存在し、各培養皿のプラスミドとPEI-MAXとの比は1:3とし、すなわち54μLのPEIを使用した;トランスフェクションの12時間後に培地を交換し、48時間後及び72時間後にウイルス溶液を回収した;20000rpm、4℃で2時間の遠心分離の後、再懸濁のために無血清培地を使用した;ウイルスを100倍に濃縮して、ウイルス力価を検出した。Jurkat C5及び初代T細胞の感染から、T細胞を同じMOIで感染させた後に、感染効率(すなわち、RFP陽性率)に有意差はないことが見出された。RFP及びGPC3-FITCタンパク質染色から、対の変異組合せの膜形成効率は、単一変異戦略のものよりも有意に高いことが見出された。同じRFP陽性細胞の場合に、標的細胞Huh-7及びHepG2細胞に対する、対の変異におけるSTAR-T細胞の死滅能力は単一変異戦略のものよりも有意に高かった;しかし、3つの変異戦略を同時に組み合わせた場合には、最も低いミスマッチ率、同時での標的細胞に対するより強い死滅能力、及びサイトカインのより高い分泌レベルが示された。具体的な結果を図7に示す。
本発明者は、CGMCC No.17095の保存番号を有するハイブリドーマ細胞(2019年1月21日に、China General Microbiological Culture Collection Center of Institute of Microbiology,Chinese Academy of Sciences with an address of No.3,Courtyard No.1,Beichen Western Road,Chaoyang district of Beijingに保存)から産生された、CD19を標的とする新規なモノクローナル抗体334を入手している。この抗体は、抗CD19 334 VL(配列番号27)及び抗CD19 334 VH(配列番号26)を含有し、抗CD19 334 VHは、配列番号28として示される重鎖CDR1、配列番号29として示される重鎖CDR2、及び配列番号30として示される重鎖CDR3を含有する。抗CD19 334 VLは、配列番号31として示される軽鎖CDR1、配列番号32として示される軽鎖CDR2、及び配列番号33として示される軽鎖CDR3を含有する。
ELISA法を使用することによって、標的抗原CD19及び非標的抗原CD20に対する抗体334の認識能力を同定した;トランスフェクション試薬PEIを使用することによって、抗体334を発現するプラスミドを293T細胞に形質転換導入した;72時間後に細胞上清を採取し、ELISA法を使用することによって抗原-抗体の特異的結合能力を検出した。実験結果から、抗体334が標的抗原CD19に有意に特異的に結合し、非標的抗原CD20に対する結合能力を有していないことが示されている。
ヒトリンパ腫細胞株においてRaji細胞(CD19抗体に関して高度の陽性発現)を通常通りに培養した;90%の細胞が融合した後に、6cm培養皿の懸濁細胞を採取して遠心分離を行い、細胞沈殿物を1.5mLの遠心管に収集した。200μLの総タンパク質抽出溶解試薬(RIPA)を添加して十分に撹拌して均一に混合した後、氷上で15分間溶解を行わせた。4℃に予冷した低温冷却遠心機に遠心管を入れて、4℃、12000rpmで15分間遠心分離し、上清を収集した。5×ローディング緩衝液を添加して、100℃で5分間タンパク質を変性させた。試料を氷上で20分間予冷した後に遠心分離に供し、続いてWB電気泳動に供した(CD19陰性対照群の細胞としてのヒト直腸がん細胞株M62と共に)。
(2)WB電気泳動:4%スペーサーゲルを調製し、分離ゲルは10% SDS-PAGEランニングゲルとした。抽出したCD19陽性タンパク質試料の40μL及び抽出したCD19陰性タンパク質試料の40μLを各ウェルに添加した。電気泳動は80Vで20分間実施した。電圧を120Vに調整し、電気泳動を40~60分間行った。
(3)膜転写:半乾燥転写システムを使用して、標的タンパク質を0.45μmのPVDF膜に転写させた。膜転写条件は15V及び1時間とした。
(4)閉鎖:転写された後のPVDF膜を、閉鎖のために5%脱脂乳粉末中に置き、振盪器によって室温で1時間振盪した。
(5)一次抗体のインキュベーション:PVDF膜上の残留粉乳をPBSTで清浄に洗い流し、残留緩衝液を濾紙を使用することによって吸って乾燥させ、PVDF膜を、CD19抗体ハイブリドーマ上清(5~8mL)を含有する一次抗体インキュベーションボックスに入れた。インキュベーションは4℃で一晩行った。
(6)PBSTすすぎ洗い:5分間×3回。
(7)二次抗体のインキュベーション:PVDFを、HRPで標識した抗マウス(1:20000)モノクローナル抗体の中に入れた。室温で1時間インキュベーションを行った。
(8)PBSTすすぎ洗い:5分間×3回。
(9)ゲルイメージャーを使用して現像及び写真撮影を行った。
ヒトリンパ腫細胞株においてRaji細胞(CD19抗体に関して高度の陽性発現)を通常通りに培養した;90%の細胞が融合した後に、6cm培養皿の懸濁細胞を採取して遠心分離を行い、細胞沈殿物を1.5mL遠心管に収集した;細胞沈殿物をPBSで再懸濁させ、細胞密度を5×106個/mLに調整した。
myc-Cys-N.Rec-1-TM9-STAR-334抗CD19 STAR構造を、pHAGE-IRES-RFPベクターをベースとして構築した。使用した抗体結合配列は抗CD19 334 VL(配列番号27)及び抗CD19 334 VH(配列番号26)であり、抗CD19 334 VHは、配列番号28として示される重鎖CDR1、配列番号29として示される重鎖CDR2、及び配列番号30として示される重鎖CDR3を含有する。抗CD19 334 VLは、配列番号31として示される軽鎖CDR1、配列番号32として示される軽鎖CDR2、及び配列番号33として示される軽鎖CDR3を含有する。ウイルスを第2世代パッケージングプラスミドによってパッケージングした後に、Jurkat C5細胞を感染させた。フローサイトメトリーの結果から、STARは正常な膜形成に供することができ、標的細胞Raji及び抗体CD19タンパク質に結合することによって、CD69及びCD25などの活性化分子の発現を促進し得ることが見出された。初代T細胞をウイルスに感染させた後に、T細胞を標的細胞Raji、Jeko-1などと共培養すると、明らかにT細胞がIL-2、TNF-α、及びIFNγを分泌するように刺激され、T細胞を標的細胞を死滅させるように誘導することができる。一方、T細胞はさらに免疫抑制分子PD1、TIM3、LAG3などを発現し、このことはT細胞が活性化されて殺細胞機能を発揮することを物語る。Raji細胞を有するNSGマウスにおいてリンパ腫モデルを樹立した。抗CD19 STAR T細胞を使用して担がんマウスに作用させた;続いて対照群と比較して、抗CD19 STAR T細胞は明らかに腫瘍を死滅させる効果を有する可能性がある。結果を図8に示す。
STARの構造において、Cα及びCβはscFvのVH及びVLに連結させることができ、さらに異なるscFvに連結させることができる;したがって、これは二重標的又は単一標的での二重認識部位の態様において可能である。myc-Cys-N.Rec-1-TM9-STAR-抗CD19/CD20 STAR構造をpHAGE-IRES-RFPベクターをベースとして構築し、ここで標的にはCD19に対するFMC63モノクローナル抗体(FMC63 VH、配列番号44、FMC63 VL、配列番号45)及びCD20に対する2C6モノクローナル抗体(2C6 VH、配列番号46、2C6 VL、配列番号47)を選択した。myc-Cys-N.Rec-1-TM9-STAR-FMC63-2C6構造を構築した;ウイルスを第2世代パッケージングプラスミドによってパッケージングした後に、Jurkat C5細胞を感染させた。フローサイトメトリーの結果から、STARは正常な膜形成に供し得ることが見出された。初代T細胞をウイルスに感染させた後に、標的細胞Raji、Raji-CD19 KO及びRaji-CD20 KOをT細胞と共培養すると、明らかにT細胞がIL-2、TNF-α及びIFNγを分泌するように刺激され、T細胞を標的細胞を死滅させるように誘導することができ、このことは、FMC63-2C6 STARが2つの両方の標的に対して良好な死滅能力を有しており、2つの標的のうちの一方の喪失によって引き起こされる腫瘍の再発が臨床的に回避され得ることを物語る。腫瘍担持モデルを、90% Raji+5% Raji-CD19 KO+5% Raji-CD20 KO細胞を使用して、NSGマウスにおいて樹立した;FMC63-2C6 STAR細胞を使用して担がんマウスに作用させた後に、対照群と比較して、FMC63-2C6 STAR細胞は明らかに腫瘍を完全に除去した可能性があり、このことはFMC63-2C6 STAR細胞が両方の標的に対して死滅作用を有することをさらに証明している。結果を図9に示す。
STARの構造において、Cα及びCβはscFvのVHとVLに連結させることができ、さらに異なるscFvに連結させることができる;したがって、これは二重標的又は単一標的での二重認識部位の態様において可能である。myc-Cys-N.Rec-1-TM9-STAR-抗CD19/CD22 STAR構造を、pHAGE-IRES-RFPベクターをベースとして構築し、ここで標的にはCD19に対する334モノクローナル抗体(334 VH、配列番号26、334 VL、配列番号27)及びCD22に対するM971モノクローナル抗体(M971 VH、配列番号48、2 M971 VL、配列番号49)を選択した。myc-Cys-N.Rec-1-TM9-STAR-334-M971構造を構築した;ウイルスを第2世代パッケージングプラスミドによってパッケージングした後に、Jurkat C5細胞を感染させた。フローサイトメトリーの結果から、STARは正常な膜形成に供し得ることが見出された。初代T細胞をウイルスに感染させた後に、標的細胞Raji、Raji-CD19 KO及びRaji-CD22 KOをT細胞と共培養すると、T細胞がIL-2、TNF-α及びIFNγを分泌するように明らかに刺激され、T細胞を標的細胞を死滅させるように誘導することができ、このことは、334-M971 STARが2つの両方の標的に対して良好な死滅能力を有しており、2つの標的のうちの一方の喪失によって引き起こされる腫瘍の再発が臨床的に回避され得ることを物語る。腫瘍担持モデルを、90% Raji+5% Raji-CD19 KO+5% Raji-CD22 KO細胞を使用してNSGマウスにおいて樹立した;334-M971 STAR細胞を使用して担がんマウスに作用させた後に、対照群と比較して、FMC63-2C6 STAR細胞は明らかに腫瘍を完全に除去した可能性があり、このことはFMC63-2C6 STAR細胞が両方の標的に対して死滅作用を有することをさらに証明している。結果を図10に示す。
配列番号1 ヒトT細胞受容体(ヒトTCRaC-WT)のα鎖の定常領域
DIQNPDPAVYQLRDSKSSDKSVCLFTDFDSQTNVSQSKDSDVYITDKTVLDMRSMDFKSNSAVAWSNKSDFACANAFNNSIIPEDTFFPSPESSCDVKLVEKSFETDTNLNFQNLSVIGFRILLLKVAGFNLLMTLRLWSS
配列番号2 マウスT細胞受容体のα鎖の定常領域(マウスTCRaC-WT)
DIQNPEPAVYQLKDPRSQDSTLCLFTDFDSQINVPKTMESGTFITDKTVLDMKAMDSKSNGAIAWSNQTSFTCQDIFKETNATYPSSDVPCDATLTEKSFETDMNLNFQNLSVMGLRILLLKVAGFNLLMTLRLWSS
配列番号3 マウスT細胞受容体のα鎖の定常領域のN末端から欠失した配列
DIQNPEPAVYQLKDPRSQ
配列番号4 N末端改変を含有するマウスT細胞受容体のα鎖の定常領域(マウスTCRaC-N.DLT)
DSTLCLFTDFDSQINVPKTMESGTFITDKTVLDMKAMDSKSNGAIAWSNQTSFTCQDIFKETNATYPSSDVPCDATLTEKSFETDMNLNFQNLSVMGLRILLLKVAGFNLLMTLRLWSS
配列番号5 N末端改変を含有するマウスT細胞受容体のα鎖の定常領域(マウスTCRaC-N.Rec-4)
DIQNPDPAVYQLRDDSTLCLFTDFDSQINVPKTMESGTFITDKTVLDMKAMDSKSNGAIAWSNQTSFTCQDIFKETNATYPSSDVPCDATLTEKSFETDMNLNFQNLSVMGLRILLLKVAGFNLLMTLRLWSS
配列番号6 システイン置換を含有するヒトT細胞受容体のα鎖の定常領域(ヒトTCRaC-Cys)
DIQNPDPAVYQLRDSKSSDKSVCLFTDFDSQTNVSQSKDSDVYITDKCVLDMRSMDFKSNSAVAWSNKSDFACANAFNNSIIPEDTFFPSPESSCDVKLVEKSFETDTNLNFQNLSVIGFRILLLKVAGFNLLMTLRLWSS
配列番号7 システイン置換を含有するマウスT細胞受容体のα鎖の定常領域(マウスTCRaC-Cys)
DIQNPEPAVYQLKDPRSQDSTLCLFTDFDSQINVPKTMESGTFITDKCVLDMKAMDSKSNGAIAWSNQTSFTCQDIFKETNATYPSSDVPCDATLTEKSFETDMNLNFQNLSVMGLRILLLKVAGFNLLMTLRLWSS
配列番号8 疎水性アミノ酸置換を含有するマウスT細胞受容体のα鎖の定常領域の膜貫通領域
LLVIVLRIL
配列番号9 疎水性アミノ酸置換を含有するマウスT細胞受容体のα鎖の定常領域(マウスTCRaC-TM9)
DIQNPEPAVYQLKDPRSQDSTLCLFTDFDSQINVPKTMESGTFITDKTVLDMKAMDSKSNGAIAWSNQTSFTCQDIFKETNATYPSSDVPCDATLTEKSFETDMNLNFQNLLVIVLRILLLKVAGFNLLMTLRLWSS
配列番号10 マウスTCRaC-Cys-M9
DIQNPEPAVYQLKDPRSQDSTLCLFTDFDSQINVPKTMESGTFITDKCVLDMKAMDSKSNGAIAWSNQTSFTCQDIFKETNATYPSSDVPCDATLTEKSFETDMNLNFQNLLVIVLRILLLKVAGFNLLMTLRLWSS
配列番号11 マウスTCRaC-Cys-N.Rec-1
PDPAVYQLRDSKSSDSTLCLFTDFDSQINVPKTMESGTFITDKCVLDMKAMDSKSNGAIAWSNQTSFTCQDIFKETNATYPSSDVPCDATLTEKSFETDMNLNFQNLSVMGLRILLLKVAGFNLLMTLRLWSS
配列番号12 マウスTCRaC-Cys-N.Rec-1
PDPAVYQLRDSKSSDSTLCLFTDFDSQINVPKTMESGTFITDKTVLDMKAMDSKSNGAIAWSNQTSFTCQDIFKETNATYPSSDVPCDATLTEKSFETDMNLNFQNLLVIVLRILLLKVAGFNLLMTLRLWSS
配列番号13 マウスTCRaC-Cys-TM9-N.Rec-1
PDPAVYQLRDSKSSDSTLCLFTDFDSQINVPKTMESGTFITDKCVLDMKAMDSKSNGAIAWSNQTSFTCQDIFKETNATYPSSDVPCDATLTEKSFETDMNLNFQNLLVIVLRILLLKVAGFNLLMTLRLWSS
配列番号14 ヒトT細胞受容体(ヒトTCRbC-WT)のβ鎖の定常領域
DLKNVFPPEVAVFEPSEAEISHTQKATLVCLATGFFPDHVELSWWVNGKEVHSGVSTDPQPLKEQPALNDSRYCLSSRLRVSATFWQNPRNHFRCQVQFYGLSENDEWTQDRAKPVTQIVSAEAWGRADCGFTSVSYQQGVLSATILYEILLGKATLYAVLVSALVLMAMVKRKDF
配列番号15 マウスT細胞受容体のβ鎖の定常領域(マウスTCRbC-WT)
DLRNVTPPKVSLFEPSKAEIANKQKATLVCLARGFFPDHVELSWWVNGKEVHSGVSTDPQAYKESNYSYCLSSRLRVSATFWHNPRNHFRCQVQFHGLSEEDKWPEGSPKPVTQNISAEAWGRADCGITSASYQQGVLSATILYEILLGKATLYAVLVSTLVVMAMVKRKNS
配列番号16 マウスT細胞受容体のβ鎖の定常領域のN末端から欠失した配列
DLRNVTPPKVSLFEPSKAEIANKQK
配列番号17 N末端欠失を含有するマウスT細胞受容体のβ鎖の定常領域(マウスTCRbC-N.DLT)
ATLVCLARGFFPDHVELSWWVNGKEVHSGVSTDPQAYKESNYSYCLSSRLRVSATFWHNPRNHFRCQVQFHGLSEEDKWPEGSPKPVTQNISAEAWGRADCGITSASYQQGVLSATILYEILLGKATLYAVLVSTLVVMAMVKRKNS
配列番号18 N末端改変を含有するマウスT細胞受容体のβ鎖の定常領域(マウスTCRbC-N-Rec-4)
DLKNVFPPEVAVFEPSAEIATLVCLARGFFPDHVELSWWVNGKEVHSGVSTDPQAYKESNYSYCLSSRLRVSATFWHNPRNHFRCQVQFHGLSEEDKWPEGSPKPVTQNISAEAWGRADCGITSASYQQGVLSATILYEILLGKATLYAVLVSTLVVMAMVKRKNS
配列番号19 システイン置換を含有するヒトT細胞受容体のβ鎖の定常領域(ヒトTCRbC-Cys)
DLKNVFPPEVAVFEPSEAEISHTQKATLVCLATGFFPDHVELSWWVNGKEVHSGVCTDPQPLKEQPALNDSRYCLSSRLRVSATFWQNPRNHFRCQVQFYGLSENDEWTQDRAKPVTQIVSAEAWGRADCGFTSVSYQQGVLSATILYEILLGKATLYAVLVSALVLMAMVKRKDF
配列番号20 システイン置換を含有するマウスT細胞受容体のβ鎖の定常領域(マウスTCRbC-Cys)
DLRNVTPPKVSLFEPSKAEIANKQKATLVCLARGFFPDHVELSWWVNGKEVHSGVCTDPQAYKESNYSYCLSSRLRVSATFWHNPRNHFRCQVQFHGLSEEDKWPEGSPKPVTQNISAEAWGRADCGITSASYQQGVLSATILYEILLGKATLYAVLVSTLVVMAMVKRKNS
配列番号21 N末端改変及びシステイン置換を含有するマウスT細胞受容体のβ鎖の定常領域(マウスTCRbC-Cys-N-Rec-1)
PPEVAVFEPSEAEISHTQKATLVCLARGFFPDHVELSWWVNGKEVHSGVCTDPQAYKESNYSYCLSSRLRVSATFWHNPRNHFRCQVQFHGLSEEDKWPEGSPKPVTQNISAEAWGRADCGITSASYQQGVLSATILYEILLGKATLYAVLVSTLVVMAMVKRKNS
配列番号22 抗EGFR Cetux-VH
QVQLKQSGPGLVQPSQSLSITCTVSGFSLTNYGVHWVRQSPGKGLEWLGVIWSGGNTDYNTPFTSRLSINKDNSKSQVFFKMNSLQSNDTAIYYCARALTYYDYEFAYWGQGTLVTVSAASTKG
配列番号23 抗EGFR Cetux-VL
DILLTQSPVILSVSPGERVSFSCRASQSIGTNIHWYQQRTNGSPRLLIKYASESISGIPSRFSGSGSGTDFTLSINSVESEDIADYYCQQNNNWPTTFGAGTKLELKRTVA
配列番号24 抗GPC3 GC33 VL
DVVMTQSPLSLPVTPGEPASISCRSSQSLVHSNRNTYLHWYLQKPGQSPQLLIYKVSNRFSGVPDRFSGSGSGTDFTLKISRVEAEDVGVYYCSQNTHVPPTFGQGTKLEIKR
配列番号25 抗GPC3 GC33 VH
QVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASGYTFTDYEMHWVRQAPGQGLEWMGALDPKTGDTAYSQKFKGRVTLTADESTSTAYMELSSLRSEDTAVYYCTRFYSYTYWGQGTLVTVSS
配列番号26 抗CD19 334 VH
QVQLQQSGAELVRPGASVKLSCKALGFIFTDYEIHWVKQTPVHGLEWIGAFHPGSGGSAYNQKFKGKATLTADKSSSTAYMELSSLTFEDSAVYHCTRQLGPDWGQGTLVTVS
配列番号27 抗CD19 334 VL
DVVMTQTPLTLSVTIGQPASISCKSSQSLLESDGKTYLNWLLQRPGQSPKRLIYLVSKLDSGVPDRFTGSGSGTDFTLRISRVEAEDLGVYYCWQGTQFPWTFGGGTKLEIK
配列番号28 抗CD19 334重鎖CDR1
GFIFTDYE
配列番号29 抗CD19 334重鎖CDR2
FHPGSGGS
配列番号30 抗CD19 334重鎖CDR3
TRQLGPD
配列番号31 抗CD19 334軽鎖CDR1
QSLLESDGKTY
配列番号32 抗CD19 334軽鎖CDR2
LVS
配列番号33 抗CD19 334軽鎖CDR3
WQGTQFPWT
配列番号34 TCRaC-N・Rec-1
PDPAVYQLRDSKSSDSTLCLFTDFDSQINVPKTMESGTFITDKTVLDMKAMDSKSNGAIAWSNQTSFTCQDIFKETNATYPSSDVPCDATLTEKSFETDMNLNFQNLSVMGLRILLLKVAGFNLLMTLRLWSS
配列番号35 TCRaC-N・Rec-2
VYQLRDSKSSDSTLCLFTDFDSQINVPKTMESGTFITDKTVLDMKAMDSKSNGAIAWSNQTSFTCQDIFKETNATYPSSDVPCDATLTEKSFETDMNLNFQNLSVMGLRILLLKVAGFNLLMTLRLWSS
配列番号36 TCRaC-N・Rec-3
RDSKSSDSTLCLFTDFDSQINVPKTMESGTFITDKTVLDMKAMDSKSNGAIAWSNQTSFTCQDIFKETNATYPSSDVPCDATLTEKSFETDMNLNFQNLSVMGLRILLLKVAGFNLLMTLRLWSS
配列番号37 TCRbC-N・Rec-1
PPEVAVFEPSEAEISHTQKATLVCLARGFFPDHVELSWWVNGKEVHSGVSTDPQAYKESNYSYCLSSRLRVSATFWHNPRNHFRCQVQFHGLSEEDKWPEGSPKPVTQNISAEAWGRADCGITSASYQQGVLSATILYEILLGKATLYAVLVSTLVVMAMVKRKNS
配列番号38 TCRbC-N・Rec-2
FEPSEAEISHTQKATLVCLARGFFPDHVELSWWVNGKEVHSGVSTDPQAYKESNYSYCLSSRLRVSATFWHNPRNHFRCQVQFHGLSEEDKWPEGSPKPVTQNISAEAWGRADCGITSASYQQGVLSATILYEILLGKATLYAVLVSTLVVMAMVKRKNS
配列番号39 TCRbC-N.Rec-3
EISHTQKATLVCLARGFFPDHVELSWWVNGKEVHSGVSTDPQAYKESNYSYCLSSRLRVSATFWHNPRNHFRCQVQFHGLSEEDKWPEGSPKPVTQNISAEAWGRADCGITSASYQQGVLSATILYEILLGKATLYAVLVSTLVVMAMVKRKNS
配列番号40 N末端に18アミノ酸のランダムな再編成を伴うマウスTCRaC-N.rRec
NQSVDPDEQLIPYRKAQPDSTLCLFTDFDSQINVPKTMESGTFITDKTVLDMKAMDSKSNGAIAWSNQTSFTCQDIFKETNATYPSSDVPCDATLTEKSFETDMNLNFQNLSVMGLRILLLKVAGFNLLMTLRLWSS
配列番号41 N末端に25アミノ酸のランダムな再編成を伴うマウスTCRbC-N.rRec
PEKREKSVAPAVKKLNLITFQDSPNATLVCLARGFFPDHVELSWWVNGKEVHSGVSTDPQAYKESNYSYCLSSRLRVSATFWHNPRNHFRCQVQFHGLSEEDKWPEGSPKPVTQNISAEAWGRADCGITSASYQQGVLSATILYEILLGKATLYAVLVSTLVVMAMVKRKNS
配列番号42 マウスTCRのα鎖の定常領域のC末端に15アミノ酸の欠失を伴うマウスTCRaC-C.DLT
DIQNPEPAVYQLKDPRSQDSTLCLFTDFDSQINVPKTMESGTFITDKTVLDMKAMDSKSNGAIAWSNQTSFTCQDIFKETNATYPSSDVPCDATLTEKSFETDMNLNFQNLSVMGLRILLLK
配列番号43 マウスTCRのβ鎖の定常領域のC末端に15アミノ酸の欠失を伴うマウスTCRbC-C.DLT
DLRNVTPPKVSLFEPSKAEIANKQKATLVCLARGFFPDHVELSWWVNGKEVHSGVSTDPQAYKESNYSYCLSSRLRVSATFWHNPRNHFRCQVQFHGLSEEDKWPEGSPKPVTQNISAEAWGRADCGITSASYQQGVLSATILYEILLGKATLYAVL
配列番号44 抗CD19 FMC63 VH
AVQLVESGGGLVQPGRSLRLSCAASGFTFGDYTMHWVRQAPGKGLEWVSGISWNSGSIGYADSVKGRFTISRDNAKNSLYLQMNSLRAEDTALYYCTKDNQYGSGSTYGLGVWGQGTLVTVSS
配列番号45 抗CD19 FMC63 VL
EIVLTQSPATLSLSPGERATLSCRASQSVSSYLAWYQQKPGQAPRLLIYDASNRATGIPARFSGSGSGTDFTLTISSLEPEDFAVYYCQQRSNWPLTFGGGTKVEIK
配列番号46 抗CD20 2C6 VH
AVQLVESGGGLVQPGRSLRLSCAASGFTFGDYTMHWVRQAPGKGLEWVSGISWNSGSIGYADSVKGRFTISRDNAKNSLYLQMNSLRAEDTALYYCTKDNQYGSGSTYGLGVWGQGTLVTVSS
配列番号47 抗CD20 2C6 VL
EIVLTQSPATLSLSPGERATLSCRASQSVSSYLAWYQQKPGQAPRLLIYDASNRATGIPARFSGSGSGTDFTLTISSLEPEDFAVYYCQQRSNWPLTFGGGTKVEIK
配列番号48 抗CD22 M971 VH
QVQLQQSGPGLVKPSQTLSLTCAISGDSVSSNSAAWNWIRQSPSRGLEWLGRTYYRSKWYNDYAVSVKSRITINPDTSKNQFSLQLNSVTPEDTAVYYCAREVTGDLEDAFDIWGQGTMVTVSS
配列番号49 抗CD22 M971 VL
DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASQTIWSYLNWYQQRPGKAPNLLIYAASSLQSGVPSRFSGRGSGTDFTLTISSLQAEDFATYYCQQSYSIPQTFGQGTKLEIK
Claims (42)
- 第1の抗原結合領域及び第1の定常領域を含有するα鎖、並びに第2の抗原結合領域及び第2の定常領域を含有するβ鎖であるα鎖及びβ鎖を含有する、合成T細胞受容体及び抗原受容体(STAR)であって、
前記第1の定常領域が、天然のT細胞受容体のα鎖の定常領域のバリアントであり、天然のT細胞受容体のα鎖の定常領域と比較して、i)N末端改変、ii)システイン置換、及び/若しくはiii)疎水性アミノ酸置換を含有し、並びに/又は
前記第2の定常領域が、天然のT細胞受容体のβ鎖の定常領域のバリアントであり、天然のT細胞受容体のβ鎖の定常領域と比較して、i)N末端改変、及び/若しくはii)システイン置換を含有する、
合成T細胞受容体及び抗原受容体。 - 前記第1の定常領域が、ヒトT細胞受容体のα鎖の定常領域、非ヒト霊長類のT細胞受容体のα鎖の定常領域、又はマウスなどの齧歯類のT細胞受容体のα鎖の定常領域に由来し、好ましくは、前記第1の定常領域がマウスT細胞受容体のα鎖の定常領域に由来する、請求項1に記載の合成T細胞受容体及び抗原受容体。
- 前記第1の定常領域が、天然のT細胞受容体のα鎖の定常領域と比較して、N末端の18アミノ酸以内に改変を含有する、請求項1又は2に記載の合成T細胞受容体及び抗原受容体。
- 前記第1の定常領域がマウスT細胞受容体のα鎖の定常領域に由来し、天然のマウスT細胞受容体のα鎖の定常領域と比較して、N末端からのX個の連続したアミノ酸が欠失によって改変されており、及び/又はN末端の位置(X+1)~位置18のアミノ酸が、天然のヒトT細胞受容体のα鎖の定常領域における対応するアミノ酸によって置換されており、Xが0、1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17又は18である、請求項1~3のいずれか一項に記載の合成T細胞受容体及び抗原受容体。
- 前記第1の定常領域がマウスT細胞受容体のα鎖の定常領域に由来し、天然のマウスT細胞受容体のα鎖の定常領域と比較して、N末端の位置1~4のアミノ酸が欠失しており、N末端の位置5~位置18のアミノ酸が、天然のヒトT細胞受容体のα鎖の定常領域の対応するアミノ酸によって置換されており、且つアミノ酸の番号が配列番号2を参照している、請求項1~4のいずれか一項に記載の合成T細胞受容体及び抗原受容体。
- 天然のT細胞受容体のα鎖の定常領域と比較して、前記第1の定常領域が位置48にシステイン置換を含有し、アミノ酸の番号が配列番号2を参照している、請求項1~5のいずれか一項に記載の合成T細胞受容体及び抗原受容体。
- 天然のT細胞受容体のα鎖の定常領域と比較して、前記第1の定常領域において位置48のトレオニンがシステインに変異しており、アミノ酸の番号が配列番号2を参照している、請求項1~6のいずれか一項に記載の合成T細胞受容体及び抗原受容体。
- 天然のT細胞受容体のα鎖の定常領域と比較して、前記第1の定常領域が膜貫通領域において疎水性アミノ酸置換を含有し、膜貫通領域が、例えば、位置111~位置119のアミノ酸配列を含み、アミノ酸の番号が配列番号2を参照している、請求項1~7のいずれか一項に記載の合成T細胞受容体及び抗原受容体。
- 天然のT細胞受容体のα鎖の定常領域と比較して、前記第1の定常領域が、位置112、位置114及び/又は位置115に疎水性アミノ酸置換を含有し、アミノ酸の番号が配列番号2を参照している、請求項1~8のいずれか一項に記載の合成T細胞受容体及び抗原受容体。
- 天然のT細胞受容体のα鎖の定常領域と比較して、前記第1の定常領域において、位置112のセリンがロイシンによって置換されており、位置114のメチオニンがイソロイシンによって置換されており、及び/又は位置115のグリシンがバリンによって置換されており、アミノ酸の番号が配列番号2を参照している、請求項1~9のいずれか一項に記載の合成T細胞受容体及び抗原受容体。
- 前記第1の定常領域が、配列番号8として示される膜貫通領域を含有する、請求項1~10のいずれか一項に記載の合成T細胞受容体及び抗原受容体。
- 前記第1の定常領域が、配列番号6~7、配列番号9~13及び配列番号34~36として示されるアミノ酸配列から選択されるアミノ酸配列を含む、請求項1~11のいずれか一項に記載の合成T細胞受容体及び抗原受容体。
- 前記第2の定常領域が、ヒトT細胞受容体のβ鎖の定常領域、非ヒト霊長類のT細胞受容体のβ鎖の定常領域、及びマウスなどの齧歯類のT細胞受容体のβ鎖の定常領域に由来し、好ましくは、前記第1の定常領域が、マウスT細胞受容体のβ鎖の定常領域に由来する、請求項1~12のいずれか一項に記載の合成T細胞受容体及び抗原受容体。
- 前記第2の定常領域が、天然のT細胞受容体のβ鎖の定常領域と比較して、N末端の25アミノ酸以内に改変を含有する、請求項1~13のいずれか一項に記載の合成T細胞受容体及び抗原受容体。
- 前記第2の定常領域がマウスT細胞受容体のβ鎖の定常領域に由来し、天然のマウスT細胞受容体のβ鎖の定常領域と比較して、N末端からX個の連続したアミノ酸が欠失によって改変されており、及び/又はN末端の位置(X+1)~位置25のアミノ酸が、天然のヒトT細胞受容体のβ鎖の定常領域における対応するアミノ酸によって置換されており、Xが0、1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24又は25である、請求項1~14のいずれか一項に記載の合成T細胞受容体及び抗原受容体。
- 前記第2の定常領域がマウスT細胞受容体のβ鎖の定常領域に由来し、天然のマウスT細胞受容体のβ鎖の定常領域と比較して、N末端の位置1~6のアミノ酸が欠失しており、N末端の位置7~位置25のアミノ酸が、天然のヒトT細胞受容体のβ鎖の定常領域の対応するアミノ酸によって置換されており、且つアミノ酸の番号が配列番号15を参照している、請求項1~15のいずれか一項に記載の合成T細胞受容体及び抗原受容体。
- 天然のT細胞受容体のβ鎖の定常領域と比較して、前記第2の定常領域において、位置56のセリンがシステインに変異しており、アミノ酸の番号が配列番号15を参照している、請求項1~16のいずれか一項に記載の合成T細胞受容体及び抗原受容体。
- 前記第2の定常領域が、配列番号19~21として示されるアミノ酸配列から選択されるアミノ酸配列を含む、請求項1~17のいずれか一項に記載の合成T細胞受容体及び抗原受容体。
- i)前記第1の定常領域が配列番号34として示されるアミノ酸配列を含み、前記第2の定常領域が配列番号37として示されるアミノ酸配列を含有する、
ii)前記第1の定常領域が配列番号7として示されるアミノ酸配列を含み、前記第2の定常領域が配列番号20として示されるアミノ酸配列を含有する、
iii)前記第1の定常領域が配列番号9として示されるアミノ酸配列を含み、前記第2の定常領域が配列番号15として示されるアミノ酸配列を含有する、
iv)前記第1の定常領域が配列番号11として示されるアミノ酸配列を含み、前記第2の定常領域が配列番号21として示されるアミノ酸配列を含有する、
v)前記第1の定常領域が配列番号12として示されるアミノ酸配列を含み、前記第2の定常領域が配列番号37として示されるアミノ酸配列を含有する、
vi)前記第1の定常領域が配列番号10として示されるアミノ酸配列を含み、前記第2の定常領域が配列番号20として示されるアミノ酸配列を含有する、又は
vii)前記第1の定常領域が配列番号13として示されるアミノ酸配列を含み、前記第2の定常領域が配列番号21として示されるアミノ酸配列を含有する、
請求項1~18のいずれか一項に記載の合成T細胞受容体及び抗原受容体。 - 前記第1の抗原結合領域及び前記第2の抗原結合領域が、独立的に又は組み合わせて標的抗原に特異的に結合する、請求項1~19のいずれか一項に記載の合成T細胞受容体及び抗原受容体。
- 標的抗原が疾患関連抗原、好ましくはがん関連抗原であり、例えば、以下のがん関連抗原:CD16、CD64、CD78、CD96、CLL1、CD116、CD117、CD71、CD45、CD71、CD123、CD138、ErbB2(HER2/neu)、がん胎児性抗原(CEA)、上皮細胞接着分子(EpCAM)、上皮増殖因子受容体(EGFR)、EGFRバリアントIII(EGFRvIII)、CD19、CD20、CD30、CD40、ジシアリルガングリオシドGD2、導管上皮ムチン、gp36、TAG-72、スフィンゴ糖脂質、神経膠腫関連抗原、β-ヒト絨毛性ゴナドトロピン、αフェトプロテイン(AFP)、レクチン反応性AFP、サイログロブリン、RAGE-1、MN-CA IX、ヒトテロメラーゼ逆転写酵素、RU1、RU2(AS)、腸カルボキシルエステラーゼ、mut hsp70-2、M-CSF、プロスターゼ、プロスターゼ特異的抗原(PSA)、PAP、NY-ESO-1、LAGA-1a、p53、プロステイン、PSMA、生存及びテロメラーゼ、前立腺がん腫瘍抗原-1(PCTA-1)、MAGE、ELF2M、好中球エラスターゼ、エフリンB2、CD22、インスリン様増殖因子(IGF1)-I、IGF-II、IGF-1受容体、メソテリン、腫瘍特異的ペプチドエピトープを提示する主要組織適合性複合体(MHC)分子、5T4、ROR1、Nkp30、NKG2D、腫瘍間質抗原、フィブロネクチンの外部ドメインA(EDA)及び外部ドメインB(EDB)、テネイシン-C A1ドメイン(TnC A1)、線維芽細胞関連タンパク質(FAP)、CD3、CD4、CD8、CD24、CD25、CD33、CD34、CD133、CD138、Foxp3、B7-1(CD80)、B7-2(CD86)、GM-CSF、サイトカイン受容体、内皮因子、主要組織適合性複合体(MHC)分子、BCMA(CD269、TNFRSF17)、TNFRSF17(UNIPROT Q02223)、SLAMF7(UNIPROT Q9NQ25)、GPRC5D(UNIPROT Q9NZD1)、FKBP11(UNIPROT Q9NYL4)、KAMP3、ITGA8(UNIPROT P53708)及びFCRL5(UNIPROT Q68SN8)から選択される、請求項20に記載の合成T細胞受容体及び抗原受容体。
- 前記第1の抗原結合領域が前記標的抗原に特異的に結合する抗体の重鎖可変領域を含有し、前記第2の抗原結合領域が前記抗体の軽鎖可変領域を含有する、又は第1の抗原結合領域が標的抗原に特異的に結合する軽抗体の軽鎖可変領域を含有し、前記第2の抗原結合領域が抗体の重鎖可変領域を含有する、請求項1~21のいずれか一項に記載の合成T細胞受容体及び抗原受容体。
- 前記第1の抗原結合領域が、配列番号22として示されるアミノ酸配列を含み、前記第2の抗原結合領域が、配列番号23として示されるアミノ酸配列を含む、若しくは第1の抗原結合領域が配列番号23として示されるアミノ酸配列を含み、前記第2の抗原結合領域が、配列番号22として示されるアミノ酸配列を含み、それ故に前記STARがEGFRに特異的に結合する、又は
前記第1の抗原結合領域が、配列番号44として示されるアミノ酸配列を含み、前記第2の抗原結合領域が、配列番号45として示されるアミノ酸配列を含む、若しくは第1の抗原結合領域が配列番号45として示されるアミノ酸配列を含み、前記第2の抗原結合領域が、配列番号44として示されるアミノ酸配列を含み、それ故に前記STARがCD19に特異的に結合する、又は
前記第1の抗原結合領域が、配列番号46として示されるアミノ酸配列を含み、前記第2の抗原結合領域が、配列番号47として示されるアミノ酸配列を含む、若しくは第1の抗原結合領域が配列番号47として示されるアミノ酸配列を含み、前記第2の抗原結合領域が、配列番号46として示されるアミノ酸配列を含み、それ故に前記STARがCD20に特異的に結合する、又は
前記第1の抗原結合領域が、配列番号48として示されるアミノ酸配列を含み、前記第2の抗原結合領域が、配列番号49として示されるアミノ酸配列を含む、若しくは第1の抗原結合領域が配列番号49として示されるアミノ酸配列を含み、前記第2の抗原結合領域が、配列番号48として示されるアミノ酸配列を含み、それ故に前記STARがCD22に特異的に結合する、又は
前記第1の抗原結合領域が、配列番号24として示されるアミノ酸配列を含み、前記第2の抗原結合領域が、配列番号25として示されるアミノ酸配列を含む、若しくは第1の抗原結合領域が配列番号25として示されるアミノ酸配列を含み、前記第2の抗原結合領域が、配列番号24として示されるアミノ酸配列を含み、それ故に前記STARがGPC3に特異的に結合する、又は
前記第1の抗原結合領域が、CD19に特異的に結合する抗体の重鎖可変領域を含有し、重鎖可変領域が、配列番号28として示される重鎖CDR1、配列番号29として示される重鎖CDR2、及び配列番号30として示される重鎖CDR3を含有し、前記第2の抗原結合領域が、CD19に特異的に結合する抗体の軽鎖可変領域を含有し、前記軽鎖可変領域が、配列番号31として示される軽鎖CDR1、配列番号32として示される軽鎖CDR2、及び配列番号33として示される軽鎖CDR3を含有する、若しくは前記第1の抗原結合領域が、CD19に特異的に結合する抗体の軽鎖可変領域を含有し、前記軽鎖可変領域が、配列番号31として示される軽鎖CDR1、配列番号32として示される軽鎖CDR2、及び配列番号33として示される軽鎖CDR3を含有し、前記第2の抗原結合領域が、CD19に特異的に結合する抗体の重鎖可変領域を含有し、前記重鎖可変領域が、配列番号28として示される重鎖CDR1、配列番号29として示される重鎖CDR2、及び配列番号30として示される重鎖CDR3を含有し、それ故に前記STARがCD19に特異的に結合する、又は
前記第1の抗原結合領域が、配列番号26として示されるアミノ酸配列を含み、前記第2の抗原結合領域が、配列番号27として示されるアミノ酸配列を含み、若しくは前記第1の抗原結合領域が、配列番号27として示されるアミノ酸配列を含み、前記第2の抗原結合領域が、配列番号26として示されるアミノ酸配列を含み、それ故に前記STARがCD19に特異的に結合する、
請求項1~22のいずれか一項に記載の合成T細胞受容体及び抗原受容体。 - 前記第1の抗原結合領域が、前記標的抗原に特異的に結合する単鎖抗体(scFvなど)又は単一ドメイン抗体(ラクダ抗体など)を含有し、及び/又は前記第2の抗原結合領域が、前記標的抗原に特異的に結合する単鎖抗体(scFvなど)又は単一ドメイン抗体(ラクダ抗体など)を含有する、請求項1~22のいずれか一項に記載の合成T細胞受容体及び抗原受容体。
- 前記第1の抗原結合領域及び前記第2の抗原結合領域が、同一の標的抗原に結合する、請求項24に記載の合成T細胞受容体及び抗原受容体。
- 前記第1の抗原結合領域及び前記第2の抗原結合領域が、同じ標的抗原の異なる領域(異なるエピトープなど)に結合する、請求項24に記載の合成T細胞受容体及び抗原受容体。
- 前記第1の抗原結合領域及び前記第2の抗原結合領域が、異なる標的抗原に結合し、例えば、前記2つの抗原結合領域が、それぞれCD19及びCD20、又はそれぞれCD19及びCD22、又はそれぞれCD38及びBCMA、又はそれぞれPDL1及びEGFRに結合し得る、請求項24に記載の合成T細胞受容体及び抗原受容体。
- 第1の抗原結合領域及び第1の定常領域を含有するα鎖、並びに第2の抗原結合領域及び第2の定常領域を含有するβ鎖であるα鎖及びβ鎖を含有する、合成T細胞受容体及び抗原受容体(STAR)であって、
前記第1の定常領域が、天然のT細胞受容体のα鎖の定常領域、又は請求項1~19のいずれか一項に記載の天然のT細胞受容体のα鎖の定常領域のバリアントであり、前記第2の定常領域が、天然のT細胞受容体のβ鎖の定常領域、又は請求項1~19のいずれか一項に記載の天然のT細胞受容体のβ鎖の定常領域のバリアントであり、且つ
前記第1の抗原結合領域及び第2の抗原結合領域が、異なる標的抗原又は同一の標的抗原の異なる領域に特異的に結合する、
合成T細胞受容体及び抗原受容体。 - 前記第1の抗原結合領域及び/又は前記第2の抗原結合領域が、前記標的抗原に特異的に結合する単鎖抗体(scFvなど)又は単一ドメイン抗体(ラクダ抗体など)を含有する、請求項28に記載の合成T細胞受容体及び抗原受容体。
- 前記第1の抗原結合領域若しくは前記第2の抗原結合領域に含有される単鎖抗体が、配列番号22として示されるアミノ酸配列及び配列番号23として示されるアミノ酸配列を含み、それ故に前記第1の抗原結合領域若しくは前記第2の抗原結合領域がEGFRに特異的に結合する、又は
第1の抗原結合領域若しくは第2の抗原結合領域に含有される単鎖抗体が、配列番号44として示されるアミノ酸配列及び配列番号45として示されるアミノ酸配列を含み、それ故に第1の抗原結合領域若しくは第2の抗原結合領域がCD19に特異的に結合する、又は
前記第1の抗原結合領域若しくは前記第2の抗原結合領域に含有される単鎖抗体が、配列番号46として示されるアミノ酸配列及び配列番号47として示されるアミノ酸配列を含み、それ故に前記第1の抗原結合領域若しくは前記第2の抗原結合領域がCD20に特異的に結合する、又は
前記第1の抗原結合領域若しくは前記第2の抗原結合領域に含有される単鎖抗体が、配列番号48として示されるアミノ酸配列及び配列番号49として示されるアミノ酸配列を含み、それ故に前記第1の抗原結合領域若しくは前記第2の抗原結合領域がCD22に特異的に結合する、又は
前記第1の抗原結合領域若しくは前記第2の抗原結合領域に含有される単鎖抗体が、配列番号24として示されるアミノ酸配列及び配列番号25として示されるアミノ酸配列を含み、それ故に前記第1の抗原結合領域若しくは前記第2の抗原結合領域がGPC3に特異的に結合する、又は
前記第1の抗原結合領域若しくは前記第2の抗原結合領域に含有される単鎖抗体が重鎖可変領域及び軽鎖可変領域を含有し、前記重鎖可変領域が配列番号28で示される重鎖CDR1、配列番号29で示される重鎖CDR2、及び配列番号30で示される重鎖CDR3を含有し、且つ前記軽鎖可変領域が配列番号31で示される軽鎖CDR1、配列番号32で示される軽鎖CDR2、及び配列番号33で示される軽鎖CDR3を含有し、それ故に前記第1の抗原結合領域若しくは前記第2の抗原結合領域がCD19に特異的に結合する、又は
前記第1の抗原結合領域若しくは前記第2の抗原結合領域に含有される単鎖抗体が、配列番号26として示されるアミノ酸配列及び配列番号27として示されるアミノ酸配列を含み、それ故に前記第1の抗原結合領域若しくは前記第2の抗原結合領域がCD19に特異的に結合する、
請求項29に記載の合成T細胞受容体及び抗原受容体。 - 前記2つの抗原結合領域が、それぞれCD19及びCD20、又はそれぞれCD19及びCD22、又はそれぞれCD38及びBCMA、又はそれぞれPDL1及びEGFRに結合する、請求項29又は30に記載の合成T細胞受容体及び抗原受容体。
- 請求項1~31のいずれか一項に記載の合成T細胞受容体及び抗原受容体(STAR)のα鎖及び/又はβ鎖をコードするヌクレオチド配列を含む、単離されたポリヌクレオチド。
- 同一のリーディングフレーム内に、i)α鎖をコードするヌクレオチド配列、ii)β鎖をコードするヌクレオチド配列、及びiii)i)とii)との間にある自己切断ペプチドをコードするヌクレオチド配列を含む、請求項32に記載のポリヌクレオチド。
- 前記自己切断ペプチドが、2Aポリペプチド、例えばP2Aポリペプチドである、請求項33に記載のポリヌクレオチド。
- 調節配列に作動可能に連結された、請求項32~34のいずれか一項に記載のポリヌクレオチドを含む、発現ベクター。
- ウイルスベクター、例えばレンチウイルスベクターである、請求項35に記載の発現ベクター。
- 治療用T細胞を調製する方法であって、請求項1~31のいずれか一項に記載の合成T細胞受容体及び抗原受容体(STAR)をT細胞において発現させるステップを含む、方法。
- 請求項32~34のいずれか一項に記載のポリヌクレオチド又は請求項35又は36に記載の発現ベクターをT細胞に導入するステップを含む、請求項37に記載の方法。
- 請求項1~31のいずれか一項に記載の合成T細胞受容体及び抗原受容体(STAR)を含むか、又は請求項37若しくは38に記載の方法によって得られる、治療用T細胞。
- 請求項39に記載の治療用T細胞及び薬学的に許容できる担体を含む、薬学的組成物。
- 対象における疾患、例えば、がんを治療するための医薬を調製するための、請求項39に記載の治療用T細胞又は請求項40に記載の医薬組成物の使用。
- 前記がんが、肺がん、卵巣がん、結腸がん、直腸がん、黒色腫、腎臓がん、膀胱がん、乳がん、肝臓がん、リンパ腫、血液悪性腫瘍、頭頸部がん、神経膠腫、胃がん、鼻咽頭がん、咽喉がん、子宮頸がん、子宮体部腫瘍、骨肉腫、骨がん、膵臓がん、皮膚がん、前立腺がん、子宮がん、肛門がん、精巣がん、卵管がん、子宮内膜がん、膣がん、外陰がん、ホジキン病、非ホジキンリンパ腫、食道がん、小腸がん、内分泌系がん、甲状腺がん、副甲状腺がん、副腎がん、軟部組織肉腫、尿道がん、陰茎がん、慢性又は急性白血病(急性骨髄性白血病、慢性骨髄性白血病、急性リンパ性白血病、及び慢性リンパ性白血病を含む)、小児固形腫瘍、リンパ球性リンパ腫、膀胱がん、腎臓又は尿管がん、腎盂腎がん、中枢神経系(CNS)腫瘍、原発性CNSリンパ腫、腫瘍血管新生、脊髄腫瘍、脳幹神経膠腫、下垂体腺腫、カポジ肉腫、表皮癌、扁平上皮癌、T細胞リンパ腫、及びアスベスト誘発がんを含む環境誘発がん、並びにこれらのがんの組合せからなる群から選択される、請求項41に記載の使用。
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