TW202026006A

TW202026006A - 使用融合蛋白進行tcr再程式化之組成物及方法

Info

Publication number: TW202026006A
Application number: TW108131439A
Authority: TW
Inventors: 派崔克亞歷山大拜奧雷; 羅伯特赫夫梅斯特; 丁健; 凡尼雅艾希米諾娃; 麥可羅夫葛恩
Original assignee: 美商Ｔｃｒ２療法股份有限公司
Priority date: 2018-08-30
Filing date: 2019-08-30
Publication date: 2020-07-16
Also published as: US20210253666A1; AU2019327569A1; CN113039209A; CA3110565A1; JP2021536432A; SG11202101811VA; WO2020047501A1; MX2021002225A; KR20210069048A; AR116048A1; EP3844192A1; EA202190573A1; BR112021003416A2

Abstract

本文提供對一種以上腫瘤細胞相關抗原具有特異性之T細胞受體(TCR)融合蛋白(TFP)、經工程改造成表現一或多種TFP之T細胞，以及使用其治療包括癌症在內之疾病的方法。

Description

使用融合蛋白進行TCR再程式化之組成物及方法

大多數患有血液惡性病或晚期實體腫瘤之患者皆無法用標準療法治癒。此外，傳統的治療選擇通常具有嚴重的副作用。已經作出多種嘗試來使患者之免疫系統排斥癌細胞，此類方法統稱為癌症免疫療法。然而，存在的若干問題使得很難實現臨床效用。儘管已經鑑別出數百種所謂的腫瘤抗原，但該等抗原通常係來源於自身，並因此會使癌症免疫療法針對健康組織，或者具有不良免疫原性。此外，癌細胞使用了多種機制來使其自身不可見或抵抗癌症免疫療法免疫攻擊的起始及傳播。

近期有關使用嵌合抗原受體(CAR)修飾之自體T細胞療法的研究在利用免疫系統之能力治療癌症方面顯示出頗具前景的結果，該療法依賴於將基因工程改造之T細胞重定向至癌細胞上之適合細胞表面分子。舉例而言，由利用B細胞成熟抗原(BCMA)特異性CAR T細胞正在進行之試驗得到的臨床結果已在一些多發性骨髓瘤患者中顯示出部分緩解(一項此類試驗可經由clinicaltrials.gov標識符NCT02215967找到)。一種替代方法係使用所選針對腫瘤相關肽抗原之T細胞受體(TCR) α及β鏈對自體T細胞進行基因工程改造。該等TCR鏈將形成完整的TCR複合物並使含TCR之T細胞具有另一種指定的特異性。在患有滑膜癌瘤之患者中，利用工程改造成表現NY-ESO-1特異性TCR α及β鏈之自體T細胞獲得了振奮人心的結果。

除基因修飾成表現CAR或第二TCR之T細胞在活體外/離體識別並破壞各別目標細胞的能力外，利用經工程改造之T細胞的成功患者療法還需要T細胞能夠較強活化、擴增、隨時間持續存在，且在復發性疾病之情況下，實現『記憶』反應。CAR T細胞之較高且可管理之臨床功效當前侷限於間皮素陽性B細胞惡性病及表現NY-ESO-1-肽且表現HLA-A2之滑膜肉瘤患者。顯然，需要改良經基因工程改造之T細胞以使其更廣泛地作用於各種人類惡性病。本文描述由包括CD3ε、CD3γ及CD3δ在內之TCR次單元，以及具有細胞表面抗原特異性結合結構域之TCRα及TCRβ鏈構成的新穎融合蛋白，該等融合蛋白能夠克服現有方法之缺點。本文描述比CAR更有效地殺滅目標細胞，但釋放之促炎性細胞介素量相當或更少的新穎融合蛋白。該等融合蛋白及其使用方法表示TFP相對於CAR之優勢，因為該等細胞介素之水準升高與過繼性CAR-T療法之劑量限制性毒性有關。

本文提供對超過一個目標具有特異性之結合蛋白，以及包含此類雙特異性結合蛋白之抗體及T細胞受體(TCR)融合蛋白(TFP)。此外，亦提供工程改造成表現一或多種TFP之T細胞及使用該等T細胞治療疾病之方法。該等TFP可對單一分子或在單一工程改造之TCR中具有雙重特異性；或者，雙重特異性可來自於混合包含該等TFP的兩個工程改造之T細胞群，或用兩種不同病毒轉導單一T細胞群。

因此，在一個態樣中，提供一種組成物，其包含：編碼第一T細胞受體複合物(TCR)融合蛋白(TFP)的經分離之重組核酸分子，該第一TFP包括：包含TCR細胞外結構域之至少一部分、跨膜結構域及細胞內結構域之TCR次單元，該細胞內結構域包含來自細胞內信號傳導結構域之刺激性結構域，該細胞內信號傳導結構域僅來源於選自由以下組成之群的TCR次單元：TCR α鏈、TCR β鏈、TCR γ鏈、TCR δ鏈、CD3 γ鏈、CD3 δ鏈及CD3 ε鏈；及包含抗MUC16結合結構域之鼠類、人類或人類化抗體結構域，其中該TCR次單元與該抗MUC16結合結構域係可操作地連接，其中該第一TFP當在T細胞中表現時與TCR功能性相互作用或併入TCR中；以及編碼第二TFP之第二重組核酸序列，該第二TFP包括含TCR次單元細胞外結構域之至少一部分、跨膜結構域及(iii) TCR細胞內結構域之TCR次單元，該TCR細胞內結構域包含來自細胞內信號傳導結構域之刺激性結構域，該細胞內信號傳導結構域僅來源於選自由以下組成之群的TCR次單元：TCR α鏈、TCR β鏈、TCR γ鏈、TCR δ鏈、CD3 γ鏈、CD3 δ鏈及CD3 ε鏈；及(b)包含抗間皮素(MSLN)結合結構域之鼠類、人類或人類化抗體結構域，其中該TCR次單元與該抗MSLN結合結構域係可操作地連接，其中該第二TFP當在該T細胞中表現時與TCR功能性相互作用或併入TCR中。

在另一態樣中，提供一種組成物，其包含編碼第一T細胞受體(TCR)融合蛋白(TFP)之第一重組核酸序列，該第一TFP包括：包含TCR細胞外結構域之至少一部分、跨膜結構域及TCR細胞內結構域之TCR次單元，該TCR細胞內結構域包含來自細胞內信號傳導結構域之刺激性結構域，該細胞內信號傳導結構域僅來源於選自由以下組成之群的TCR次單元：TCR α鏈、TCR β鏈、TCR γ鏈、TCR δ鏈、CD3 γ鏈、CD3 δ鏈及CD3 ε鏈；及包含抗MUC16結合結構域之第一人類或人類化抗體結構域及包含抗MSLN結合結構域之第二人類或人類化抗體結構域，其中該TCR次單元、該第一抗體結構域與該第二抗體結構域係可操作地連接，且其中該第一TFP當在T細胞中表現時與TCR功能性相互作用或併入TCR中。

在另一態樣中，提供一種包含經分離之重組核酸分子的組成物，該重組核酸分子編碼：第一T細胞受體(TCR)融合蛋白(TFP)，該第一TFP包括TCR次單元、包含第一抗原結合結構域之第一人類或人類化抗體結構域，該第一抗原結合結構域係抗MUC16結合結構域；及第二T細胞受體(TCR)融合蛋白(TFP)，該第二TFP包括TCR次單元、包含第二抗原結合結構域之第二人類或人類化抗體結構域，該第二抗原結合結構域係抗MSLN結合結構域，其中該第一TFP之TCR次單元與該第一抗體結構域係可操作地連接且該第二TFP之TCR次單元與該第二抗體結構域係可操作地連接。

在另一態樣中，提供一種包含經分離之重組核酸分子的組成物，該重組核酸分子編碼第一T細胞受體(TCR)融合蛋白(TFP)，該TFP包括TCR複合物次單元、包含作為抗MUC16結合結構域之第一抗原結合結構域的第一人類或人類化抗體結構域以及包含作為抗MSLN結合結構域之第二抗原結合結構域之第二人類或人類化抗體結構域，其中該第一TFP之TCR次單元、該第一抗體結構域及該第二抗體結構域係可操作地連接。

在一個實施例中，該第一TFP中所編碼之TCR次單元的細胞外結構域、跨膜結構域及細胞內信號傳導結構域僅來源於選自由以下組成之群的TCR次單元：TCR α鏈、TCR β鏈、TCR γ鏈、TCR δ鏈、CD3 γ鏈、CD3 δ鏈及CD3 ε鏈。在另一個實施例中，該第二TFP中該TCR次單元之細胞外結構域、跨膜結構域及細胞內信號傳導結構域僅來源於選自由以下組成之群的TCR次單元：TCR α鏈、TCR β鏈、TCR γ鏈、TCR δ鏈及TCR ε鏈。在另一個實施例中，該第一TFP中該TCR次單元之細胞外結構域、跨膜結構域及細胞內信號傳導結構域僅來源於TCR α鏈。在另一個實施例中，該第一TFP中該TCR次單元之細胞外結構域、跨膜結構域及細胞內信號傳導結構域僅來源於TCR β鏈。在另一個實施例中，該第一TFP中該TCR次單元之細胞外結構域、跨膜結構域及細胞內信號傳導結構域僅來源於TCR γ鏈。在另一個實施例中，該第一TFP中該TCR次單元之細胞外結構域、跨膜結構域及細胞內信號傳導結構域僅來源於TCR δ鏈。在另一個實施例中，該第一TFP中該TCR次單元之細胞外結構域、跨膜結構域及細胞內信號傳導結構域僅來源於CD3 γ鏈。在另一個實施例中，該第一TFP中該TCR次單元之細胞外結構域、跨膜結構域及細胞內信號傳導結構域僅來源於CD3 δ鏈。在另一個實施例中，該第一TFP中該TCR次單元之細胞外結構域、跨膜結構域及細胞內信號傳導結構域僅來源於CD3 ε鏈。

在另一個實施例中，該第二TFP中該TCR次單元之細胞外結構域、跨膜結構域及細胞內信號傳導結構域僅來源於TCR α鏈。在另一個實施例中，該第二TFP中該TCR次單元之細胞外結構域、跨膜結構域及細胞內信號傳導結構域僅來源於TCR β鏈。在另一個實施例中，該第二TFP中該TCR次單元之細胞外結構域、跨膜結構域及細胞內信號傳導結構域僅來源於TCR γ鏈。在另一個實施例中，該第二TFP中該TCR次單元之細胞外結構域、跨膜結構域及細胞內信號傳導結構域僅來源於TCR δ鏈。在另一個實施例中，該第二TFP中該TCR次單元之細胞外結構域、跨膜結構域及細胞內信號傳導結構域僅來源於CD3 γ鏈。在另一個實施例中，該第二TFP中該TCR次單元之細胞外結構域、跨膜結構域及細胞內信號傳導結構域僅來源於CD3 δ鏈。在另一個實施例中，該第二TFP中該TCR次單元之細胞外結構域、跨膜結構域及細胞內信號傳導結構域僅來源於CD3 ε鏈。

在一個實施例中，該第一TFP、該第二TFP或二者當在T細胞中表現時併入TCR中或與TCR功能性相互作用。在另一個實施例中，該第一TFP、該第二TFP或二者當在T細胞中表現時併入TCR中或與TCR功能性相互作用。在另一個實施例中，該編碼之第一抗原結合結構域藉由第一連接子序列連接至該第一TFP之TCR細胞外結構域，該編碼之第二抗原結合結構域藉由第二連接子序列連接至該第二TFP之TCR細胞外結構域，或該第一抗原結合結構域藉由該第一連接子序列連接至該第一TFP之TCR細胞外結構域且該編碼之第二抗原結合結構域藉由該第二連接子序列連接至該第二TFP之TCR細胞外結構域。在另一個實施例中，該第一連接子序列及該第二連接子序列包含(G₄ S)_n ，其中n=1至4 (SEQ ID NO: 100)。在另一個實施例中，該第一TFP之TCR次單元、該第二TFP之TCR次單元或二者包含TCR細胞外結構域。在另一個實施例中，該第一TFP之TCR次單元、該第二TFP之TCR次單元或二者包含TCR跨膜結構域。在另一個實施例中，該第一TFP之TCR次單元、該第二TFP之TCR次單元或二者包含TCR細胞內結構域。在另一個實施例中，該第一TFP之TCR次單元、該第二TFP之TCR次單元或二者包含(i) TCR細胞外結構域、(ii) TCR跨膜結構域及(iii) TCR細胞內結構域，其中(i)、(ii)及(iii)中至少兩個係來自同一TCR次單元。在另一個實施例中，該第一TFP之TCR次單元、該第二TFP之TCR次單元或二者包含TCR細胞內結構域，其包含選自以下之刺激性結構域：CD3 ε、CD3 γ或CD3 δ之細胞內信號傳導結構域，或其具有至少一個修飾之胺基酸序列。在另一個實施例中，該第一TFP之TCR次單元、該第二TFP之TCR次單元或二者包含細胞內結構域，其包含選自以下之刺激性結構域：4-1BB之功能性信號傳導結構域及/或CD3 ξ之功能性信號傳導結構域，或其具有至少一個修飾之胺基酸序列。

在一個實施例中，該第一人類或人類化抗體結構域、該第二人類或人類化抗體結構域或二者包含抗體片段。在另一個實施例中，該第一人類或人類化抗體結構域、該第二人類或人類化抗體結構域或二者包含scFv或V_H 結構域。在另一個實施例中，該組成物包含重組核酸分子，其編碼(i)含與表2之輕鏈序列具有70-100%序列一致性之輕鏈結合結構域胺基酸序列的輕鏈(LC) CDR1、LC CDR2及LC CDR3，及/或(ii)含表2之重鏈序列的重鏈(HC) CDR1、HC CDR2及HC CDR3。在一個實施例中，該重組核酸編碼輕鏈可變區，其中該輕鏈可變區包含在表2之輕鏈可變區胺基酸序列中具有至少一個但不超過30個修飾之胺基酸序列，或與表2之輕鏈可變區胺基酸序列具有95-99%一致性之序列。在另一個實施例中，該組成物包含重組核酸分子，其編碼重鏈可變區，其中該重鏈可變區包含在表2之重鏈可變區胺基酸序列中具有至少一個但不超過30個修飾之胺基酸序列，或與表2之重鏈可變區胺基酸序列具有95-99%一致性之序列。在一個實施例中，該編碼之第一TFP、該編碼之第二TFP或二者包括TCR次單元之細胞外結構域，該細胞外結構域包含選自由以下組成之群之蛋白質的細胞外結構域或其部分：TCRα鏈、TCRβ鏈、CD3ε TCR次單元、CD3γ TCR次單元、CD3δ TCR次單元、其功能片段，及其具有至少一個但不超過20個修飾之胺基酸序列。在另一個實施例中，該編碼之第一TFP及該編碼之第二TFP包括跨膜結構域，該跨膜結構域包含選自由以下組成之群之蛋白質的跨膜結構域：TCRα鏈、TCRβ鏈、CD3ε TCR次單元、CD3γ TCR次單元、CD3δ TCR次單元、其功能片段，及其具有至少一個但不超過20個修飾之胺基酸序列。

在一個實施例中，該編碼之第一TFP及該編碼之第二TFP包括跨膜結構域，該跨膜結構域包含選自由以下組成之群之蛋白質的跨膜結構域：TCR α鏈、TCR β鏈、TCR ζ鏈、CD3ε TCR次單元、CD3 γ TCR次單元、CD3 δ TCR次單元、CD45、CD4、CD5、CD8、CD9、CD16、CD22、CD33、CD28、CD37、CD64、CD80、CD86、CD134、CD137、CD154、其功能片段，及其具有至少一個但不超過20個修飾之胺基酸序列。在另一個實施例中，該重組核酸包含編碼共刺激結構域之序列。在另一個實施例中，該共刺激結構域係自選自由以下組成之群之蛋白質獲得的功能性信號傳導結構域：OX40、CD2、CD27、CD28、CDS、ICAM-1、LFA-1 (CD11a/CD18)、ICOS (CD278)及4-1BB (CD137)，及其具有至少一個但不超過20個修飾之胺基酸序列。在另一個實施例中，該重組核酸包含編碼細胞內信號傳導結構域之序列。在另一個實施例中，該重組核酸包含編碼前導序列之序列。在另一個實施例中，該重組核酸包含編碼蛋白酶裂解位點之序列。在一個實施例中，其至少一個但不超過20個修飾包含介導細胞信號傳導之胺基酸修飾，或響應於配位體結合至該第一TFP、該第二TFP或二者而磷酸化的胺基酸修飾。

在一個實施例中，該經分離之重組核酸分子係mRNA。

在一個實施例中，該第一TFP、該第二TFP或二者包括TCR次單元之免疫受體酪胺酸活化基元(ITAM)，該ITAM包含選自由以下組成之群之蛋白質的ITAM或其部分：CD3ζ TCR次單元、CD3ε TCR次單元、CD3γ TCR次單元、CD3δ TCR次單元、TCR ζ鏈、Fcε受體1鏈、Fcε受體2鏈、Fcγ受體1鏈、Fcγ受體2a鏈、Fcγ受體2b1鏈、Fcγ受體2b2鏈、Fcγ受體3a鏈、Fcγ受體3b鏈、Fcβ受體1鏈、TYROBP (DAP12)、CD5、CD16a、CD16b、CD22、CD23、CD32、CD64、CD79a、CD79b、CD89、CD278、CD66d、其功能片段，及其具有至少一個但不超過20個修飾之胺基酸序列。

在另一個實施例中，該ITAM替代CD3γ、CD3δ或CD3ε之ITAM。在另一個實施例中，該ITAM選自由以下組成之群：CD3ζ TCR次單元、CD3ε TCR次單元、CD3γ TCR次單元及CD3δ TCR次單元，並替代選自由以下組成之群的不同ITAM：CD3ζ TCR次單元、CD3ε TCR次單元、CD3γ TCR次單元及CD3δ TCR次單元。在一個實施例中，該編碼之重組核酸進一步包含前導序列。

在另一個態樣中，提供一種包含由本文所述核酸分子中之任一個所編碼之多肽分子的組成物。在一個實施例中，該多肽包含由第一核酸分子編碼之第一多肽及由第二核酸分子編碼之第二多肽。

在另一個態樣中，提供一種包含由本文所述核酸分子中之任一個所編碼之重組TFP分子的組成物。

在另一個態樣中，提供一種包含編碼本文所述之多肽或重組TFP分子的組成物。在一個實施例中，該載體包括a)含編碼第一TFP之第一核酸分子的第一載體；及b)含編碼該第二TFP之第二核酸分子之第二載體。在另一個實施例中，該載體包含第一TFP及第二TFP，其中編碼該第一TFP之序列與編碼該第二TFP之序列係由裂解位點分隔開。該載體係選自由以下組成之群：DNA、RNA、質體、慢病毒載體、腺病毒載體、勞斯肉瘤病毒(Rous sarcoma viral，RSV)載體或逆轉錄病毒載體。在一個實施例中，該載體包含啟動子。在一個實施例中，該載體係在活體外轉錄之載體。在一個實施例中，該載體中之核酸序列進一步編碼多聚(A)尾。在另一個實施例中，該載體中之核酸序列進一步編碼3’UTR。在另一個實施例中，該載體中之核酸序列進一步編碼蛋白酶裂解位點。

在一個實施例中，該組成物進一步包含編碼抑制性分子之核酸，該抑制性分子包括與含來自細胞內信號傳導結構域之陽性信號的第二多肽締合之含抑制性分子之至少一部分的第一多肽。在另一個實施例中，該抑制性分子包括含PD1之至少一部分的第一多肽以及含共刺激結構域及一級信號傳導結構域之第二多肽。

在另一個態樣中，提供一種載體，其包含本文所揭示之重組核酸序列。在一個實施例中，該載體包含第一重組核酸序列。在另一個實施例中，該載體包含第二重組核酸序列。

在另一態樣中，提供一種細胞，其包括含本文所揭示的經分離之重組核酸分子、載體或多肽中之任一種的組成物。在一個實施例中，該細胞係人類T細胞。在另一個實施例中，該T細胞係CD8+或CD4+ T細胞。在一個實施例中，該細胞包含編碼抑制性分子之核酸，該抑制性分子包括與含來自細胞內信號傳導結構域之陽性信號的第二多肽締合之含抑制性分子之至少一部分的第一多肽。在一個實施例中，該抑制性分子包括含PD1之至少一部分的第一多肽以及含共刺激結構域及一級信號傳導結構域之第二多肽。

在另一個態樣中，提供一種人類CD8+或CD4+ T細胞，其包含至少兩種TFP分子，該等TFP分子包含抗MUC16結合結構域、抗MSLN結合結構域、TCR細胞外結構域、跨膜結構域及細胞內結構域，其中該TFP分子能夠與在該人類CD8+或CD4+ T細胞之表面中、其表面處及/或其表面上的內源性TCR複合物及/或至少一種內源性TCR多肽功能性相互作用。在另一個實施例中係一種蛋白質複合物，其包括含抗MUC16結合結構域、TCR細胞外結構域、跨膜結構域及細胞內結構域之第一TFP分子；含抗MSLN結合結構域、TCR細胞外結構域、跨膜結構域及細胞內結構域之第二TFP分子；及至少一種內源性TCR次單元或內源性TCR複合物。

在另一個態樣中，提供一種蛋白質複合物，其包括：含抗MUC16結合結構域、TCR細胞外結構域、跨膜結構域及細胞內結構域之TFP分子；以及至少一種內源性TCR次單元或內源性TCR複合物。

在另一個態樣中，提供一種蛋白質複合物，其包括含抗MSLN結合結構域、TCR細胞外結構域、跨膜結構域及細胞內結構域之TFP分子；以及至少一種內源性TCR次單元或內源性TCR複合物。

在一個實施例中，該蛋白質複合物中之TCR包含選自由以下組成之群之蛋白質的細胞外結構域或其部分：TCR α鏈、TCR β鏈、CD3ε TCR次單元、CD3γ TCR次單元及CD3δ TCR次單元。在一個實施例中，該抗MUC16結合結構域、該抗MSLN結合結構域或二者藉由連接子序列連接至TCR細胞外結構域。在一個實施例中，連接子區包含(G₄ S)_n ，其中n=1至4 (SEQ ID NO: 100)。

在另一個態樣中，提供一種人類CD8+或CD4+ T細胞，該細胞包含每一本文所描述之蛋白質複合物至少兩種不同的TFP蛋白。在另一個態樣中，提供一種人類CD8+或CD4+ T細胞，該細胞包含至少兩個由本文所揭示之經分離之核酸分子中之任一種所編碼的不同TFP分子。

在另一個態樣中，提供一種人類CD8+或CD4+ T細胞群，其中該群之T細胞個別地或共同地包含至少兩種TFP分子，該等TFP分子包含抗MUC16結合結構域或抗MSLN結合結構域或抗MUC16結合結構域及抗MSLN結合結構域、TCR細胞外結構域、跨膜結構域及細胞內結構域，其中該TFP分子能夠與在該人類CD8+或CD4+ T細胞表面中、該表面處及/或該表面上的內源性TCR複合物及/或至少一種內源性TCR多肽功能性相互作用。

在另一個態樣中，提供一種人類CD8+或CD4+ T細胞群，其中該群之T細胞個別地或共同地包含至少兩個由本文所揭示之經分離之重組核酸分子所編碼的TFP分子。在另一個態樣中，提供一種醫藥組成物，其包含有效量的本文所揭示之組成物、載體、細胞或蛋白質，及醫藥學上可接受之賦形劑。

在另一個態樣中，提供一種治療患有與MSLN或MUC16表現相關之疾病之哺乳動物的方法，其包括向該哺乳動物投與有效量的本文所揭示之組成物中之任一種。在一個實施例中，該與MUC16或MSLN表現相關之疾病係選自由以下組成之群：增生性疾病、癌症、惡性病、骨髓發育不良、骨髓發育不良症候群、白血病前期、與MUC16表現相關之非癌症相關適應症、與MSLN表現相關之非癌症相關適應症、乳癌、前列腺癌、卵巢癌、子宮頸癌、皮膚癌、胰臟癌、結腸直腸癌、腎癌、肝癌、腦癌、淋巴瘤、白血病、肺癌、食道癌、胃癌及伴隨復發或難治性疾病之不可切除型卵巢癌。在另一個實施例中，該疾病係選自由以下組成之群之血液癌症：B細胞急性淋巴性白血病(B-ALL)、T細胞急性淋巴性白血病(T-ALL)、急性淋巴母細胞白血病(ALL)；慢性骨髓性白血病(CML)、慢性淋巴球性白血病(CLL)、B細胞幼淋巴球性白血病、母細胞性漿細胞樣樹突狀細胞瘤、伯基特氏淋巴瘤(Burkitt’s lymphoma)、彌漫性大B細胞淋巴瘤、濾泡性淋巴瘤、毛細胞白血病、小細胞-濾泡性淋巴瘤、大細胞-濾泡性淋巴瘤、惡性淋巴組織增生疾病、MALT淋巴瘤、套細胞淋巴瘤、邊緣區淋巴瘤、多發性骨髓瘤、脊髓發育不良、脊髓發育不良綜合症、非霍奇金氏淋巴瘤(non-Hodgkin’s lymphoma)、漿母細胞性淋巴瘤、漿細胞樣樹突狀細胞瘤、瓦爾登斯特侖氏巨球蛋白血症(Waldenstrom macroglobulinemia)、白血病前期、與MUC16或MSLN表現有關之疾病，及其組合。在另一個實施例中，將表現第一TFP分子及第二TFP分子之細胞或細胞群與增加表現該第一TFP分子及該第二TFP分子之細胞或細胞群之功效的劑組合投與。在一個實施例中，該哺乳動物體內細胞介素之釋放量低於投與有效量的表現抗MSLN嵌合抗原受體(CAR)、抗MUC16 CAR、抗MSLN CAR及抗MUC16 CAR；或其組合之T細胞的哺乳動物。在一個實施例中，將表現該第一TFP分子及第二TFP分子之細胞與改善與投與表現該第一TFP分子及該第二TFP分子之細胞有關之一或多種副作用的劑組合投與。在另一個實施例中，該第一TFP分子及該第二TFP分子係與治療與MSLN或MUC16相關之疾病的劑組合投與。以引用的方式併入

本說明書中所提到的所有出版物、專利及專利申請案均以引用的方式併入本文中，其引用程度就如同具體且個別地指示每一個別出版物、專利或專利申請案以引用的方式併入本文中一般。

交叉引用

本申請案主張2018年8月30提交之美國臨時申請案第 62/725,098號之權益，該案以引用之方式完整地併入本文中。序列表 本申請案包含序列表，該序列表呈ASCII格式以電子方式提交，並以引用之方式完整地併入本文中。該ASCII文檔創作於2019年10月15日，名為48538-725_601_SL.txt，大小為140,602位元組。

本文提供使用雙特異性T細胞受體(TCR)融合蛋白或雙特異性T細胞群之物質組成物以及使用其治療諸如癌症之類疾病的方法。如本文所使用，「T細胞受體(TCR)融合蛋白」或「TFP」包括來源於包含TCR之各種多肽的重組多肽，該TCR一般能夠i)結合至目標細胞上之表面抗原；及ii)典型地當共定位於T細胞表面中或表面上時與完整TCR複合物之其他多肽組分相互作用。如本文所提供，TFP提供比嵌合抗原受體顯著的益處。術語「嵌合抗原受體」或替代地「CAR」係指包含呈scFv形式之細胞外抗原結合結構域、跨膜結構域及細胞質信號傳導結構域(在本文中又稱為「細胞內信號傳導結構域」)的重組多肽，該細胞質信號傳導結構域包含來源於如下所定義之刺激性分子的功能性信號傳導結構域。一般而言，CAR之中心細胞內信號傳導結構域係來源於通常發現與TCR複合物相關聯的CD3ζ鏈。CD3ζ信號傳導結構域可以與來源於至少一個共刺激分子，諸如4-1BB (亦即，CD137)、CD27及/或CD28的一或多個功能性信號傳導結構域融合。

在一個態樣中，本文提供一種組成物，其包含(I)編碼第一T細胞受體(TCR)融合蛋白(TFP)之第一重組核酸序列，該第一TFP包含(a) TCR次單元，其包含(i) TCR細胞外結構域之至少一部分、(ii)跨膜結構域，及(iii) TCR細胞內結構域，其包含來自細胞內信號傳導結構域之刺激性結構域，該細胞內信號傳導結構域僅來源於選自由以下組成之群的TCR次單元：TCR α鏈、TCR β鏈、CD3 γ鏈、CD3 δ鏈及CD3 ε鏈；及(b)包含抗MUC16結合結構域之人類或人類化抗體結構域，其中該TCR次單元與該抗MUC16結合結構域係可操作地連接，其中該第一TFP當在該T細胞中表現時與TCR功能性相互作用或併入TCR中；以及(II)編碼第二TFP之第二重組核酸序列，該第二TFP包含(a) TCR次單元，其包含(i) TCR細胞外結構域之至少一部分、(ii)跨膜結構域，及(iii) TCR細胞內結構域，其包含來自細胞內信號傳導結構域之刺激性結構域，該細胞內信號傳導結構域僅來源於選自由以下組成之群的TCR次單元：TCR α鏈、TCR β鏈、CD3 γ鏈、CD3 δ鏈及CD3 ε鏈；及(b)包含抗間皮素(MSLN)結合結構域之人類或人類化抗體結構域，其中該TCR次單元與該抗MSLN結合結構域係可操作地連接，其中該第二TFP當在該T細胞中表現時與TCR功能性相互作用或併入TCR中。

在一個態樣中，提供一種組成物，其包含(I)編碼第一T細胞受體(TCR)融合蛋白(TFP)之第一重組核酸序列，該第一TFP包括含TCR細胞外結構域之至少一部分、跨膜結構域及TCR細胞內結構域之TCR次單元，該TCR細胞內結構域包含來自細胞內信號傳導結構域之刺激性結構域，該細胞內信號傳導結構域僅來源於選自由以下組成之群的TCR次單元：TCR α鏈、TCR β鏈、CD3 γ鏈、CD3 δ鏈及CD3 ε鏈；以及包含抗MUC16結合結構域之第一人類或人類化抗體結構域及包含抗MSLN結合結構域之第二人類或人類化抗體結構域，其中該TCR次單元、該第一抗體結構域與該第二抗體結構域係可操作地連接，且其中該第一TFP當在T細胞中表現時與TCR功能性相互作用或併入TCR中。

在一個態樣中，本文提供一種包含重組核酸分子之組成物，該重組核酸分子編碼：包括TCR次單元、包含第一抗原結合結構域之第一人類或人類化抗體結構域之第一T細胞受體(TCR)融合蛋白(TFP)，該第一抗原結合結構域係抗MUC16結合結構域；及包括TCR次單元、包含第二抗原結合結構域之第二人類或人類化抗體結構域之第二T細胞受體(TCR)融合蛋白(TFP)，該第二抗原結合結構域係抗MSLN結合結構域，其中該第一TFP之TCR次單元與該第一抗體結構域係可操作地連接且該第二TFP之TCR次單元與該第二抗體結構域係可操作地連接。

在一個態樣中，本文提供一種包含重組核酸分子之組成物，該重組核酸分子編碼：第一T細胞受體(TCR)融合蛋白(TFP)，該第一TFP包括TCR複合物次單元、包含作為抗MUC16結合結構域之第一抗原結合結構域的第一人類或人類化抗體結構域以及包含作為抗MSLN結合結構域之第二抗原結合結構域之第二人類或人類化抗體結構域；且其中該第一TFP之TCR次單元、該第一抗體結構域及該第二抗體結構域係可操作地連接。

在一些實施例中，該第一TFP中該TCR次單元之細胞外結構域、跨膜結構域及細胞內信號傳導結構域僅來源於選自由以下組成之群的TCR次單元：TCR α鏈、TCR β鏈、CD3 γ鏈、CD3 δ鏈及CD3 ε鏈。

在一些實施例中，該第二TFP中該TCR次單元之細胞外結構域、跨膜結構域及細胞內信號傳導結構域僅來源於選自由以下組成之群的TCR次單元：TCR α鏈、TCR β鏈、TCR γ鏈、TCR δ鏈及TCR ε鏈。

在一些實施例中，該第一TFP中該TCR次單元之細胞外結構域、跨膜結構域及細胞內信號傳導結構域僅來源於TCR α鏈。

在一些實施例中，該第一TFP中該TCR次單元之細胞外結構域、跨膜結構域及細胞內信號傳導結構域僅來源於TCR β鏈。

在一些實施例中，該第一TFP中該TCR次單元之細胞外結構域、跨膜結構域及細胞內信號傳導結構域僅來源於TCR γ鏈。

在一些實施例中，該第一TFP中該TCR次單元之細胞外結構域、跨膜結構域及細胞內信號傳導結構域僅來源於TCR δ鏈。

在一些實施例中，該第一TFP中該TCR次單元之細胞外結構域、跨膜結構域及細胞內信號傳導結構域僅來源於CD3 γ鏈。

在一些實施例中，該第一TFP中該TCR次單元之細胞外結構域、跨膜結構域及細胞內信號傳導結構域僅來源於CD3 δ鏈。

在一些實施例中，該第一TFP中該TCR次單元之細胞外結構域、跨膜結構域及細胞內信號傳導結構域僅來源於CD3 ε鏈。

在一些實施例中，該第二TFP中該TCR次單元之細胞外結構域、跨膜結構域及細胞內信號傳導結構域僅來源於TCR α鏈。

在一些實施例中，該第二TFP中該TCR次單元之細胞外結構域、跨膜結構域及細胞內信號傳導結構域僅來源於TCR β鏈。

在一些實施例中，該第二TFP中該TCR次單元之細胞外結構域、跨膜結構域及細胞內信號傳導結構域僅來源於TCR γ鏈。

在一些實施例中，該第二TFP中該TCR次單元之細胞外結構域、跨膜結構域及細胞內信號傳導結構域僅來源於TCR δ鏈。

在一些實施例中，該第二TFP中該TCR次單元之細胞外結構域、跨膜結構域及細胞內信號傳導結構域僅來源於CD3 γ鏈。

在一些實施例中，該第二TFP中該TCR次單元之細胞外結構域、跨膜結構域及細胞內信號傳導結構域僅來源於CD3 δ鏈。

在一些實施例中，該第二TFP中該TCR次單元之細胞外結構域、跨膜結構域及細胞內信號傳導結構域僅來源於CD3 ε鏈。

在一些實施例中，該第一TFP、該第二TFP或二者當在T細胞中表現時併入TCR中或與TCR功能性相互作用。

在一些實施例中，該編碼之第一抗原結合結構域藉由第一連接子序列連接至該第一TFP之TCR細胞外結構域，該編碼之第二抗原結合結構域藉由第二連接子序列連接至該第二TFP之TCR細胞外結構域，或該第一抗原結合結構域藉由該第一連接子序列連接至該第一TFP之TCR細胞外結構域且該編碼之第二抗原結合結構域藉由該第二連接子序列連接至該第二TFP之TCR細胞外結構域。

在一些實施例中，該第一連接子序列及該第二連接子序列包含(G4S)n，其中n=1至4 (SEQ ID NO: 100)。

在一些實施例中，該第一TFP之TCR次單元、該第二TFP之TCR次單元或二者包含TCR細胞外結構域。

在一些實施例中，該第一TFP之TCR次單元、該第二TFP之TCR次單元或二者包含TCR跨膜結構域。

在一些實施例中，該第一TFP之TCR次單元、該第二TFP之TCR次單元或二者包含TCR細胞內結構域。

在一些實施例中，該第一TFP之TCR次單元、該第二TFP之TCR次單元或二者包含(i) TCR細胞外結構域、(ii) TCR跨膜結構域及(iii) TCR細胞內結構域，其中(i)、(ii)及(iii)中至少兩個係來自同一TCR次單元。

在一些實施例中，該第一TFP之TCR次單元、該第二TFP之TCR次單元或二者包含TCR細胞內結構域，其包含選自以下之刺激性結構域：CD3 ε、CD3 γ或CD3 δ之細胞內信號傳導結構域，或其具有至少一個修飾之胺基酸序列。

在一些實施例中，該第一TFP之TCR次單元、該第二TFP之TCR次單元或二者包含細胞內結構域，其包含選自以下之刺激性結構域：4-1BB之功能性信號傳導結構域及/或CD3 ξ之功能性信號傳導結構域，或其具有至少一個修飾之胺基酸序列。

在一些實施例中，該第一人類或人類化抗體結構域、該第二人類或人類化抗體結構域或二者包含抗體片段。

在一些實施例中，該第一人類或人類化抗體結構域、該第二人類或人類化抗體結構域或二者包含scFv或VH結構域。

在一些實施例中，該組成物編碼(i)含與表2之輕鏈序列具有70-100%序列一致性之輕鏈結合結構域胺基酸序列的輕鏈(LC) CDR1、LC CDR2及LC CDR3，及/或(ii)含表2之重鏈序列的重鏈(HC) CDR1、HC CDR2及HC CDR3。

在一些實施例中，該組成物編碼輕鏈可變區，其中該輕鏈可變區包含在表2之輕鏈可變區胺基酸序列中具有至少一個但不超過30個修飾之胺基酸序列，或與表2之輕鏈可變區胺基酸序列具有95-99%一致性之序列。

在一些實施例中，該組成物編碼重鏈可變區，其中該重鏈可變區包含在表2之重鏈可變區胺基酸序列中具有至少一個但不超過30個修飾之胺基酸序列，或與表2之重鏈可變區胺基酸序列具有95-99%一致性之序列。

在一些實施例中，該編碼之第一TFP、該編碼之第二TFP或二者包括TCR次單元之細胞外結構域，該細胞外結構域包含選自由以下組成之群之蛋白質的細胞外結構域或其部分：TCRα鏈、TCRβ鏈、CD3ε TCR次單元、CD3γ TCR次單元、CD3δ TCR次單元、其功能片段，及其具有至少一個但不超過20個修飾之胺基酸序列。

在一些實施例中，該編碼之第一TFP及該編碼之第二TFP包括跨膜結構域，該跨膜結構域包含選自由以下組成之群之蛋白質的跨膜結構域：TCRα鏈、TCRβ鏈、CD3ε TCR次單元、CD3γ TCR次單元、CD3δ TCR次單元、其功能片段，及其具有至少一個但不超過20個修飾之胺基酸序列。

在一些實施例中，該編碼之第一TFP及該編碼之第二TFP包括跨膜結構域，該跨膜結構域包含選自由以下組成之群之蛋白質的跨膜結構域：TCR α鏈、TCR β鏈、TCR ζ鏈、CD3ε TCR次單元、CD3 γ TCR次單元、CD3 δ TCR次單元、CD45、CD4、CD5、CD8、CD9、CD16、CD22、CD33、CD28、CD37、CD64、CD80、CD86、CD134、CD137、CD154、其功能片段，及其具有至少一個但不超過20個修飾之胺基酸序列。

在一些實施例中，該組成物進一步包含編碼共刺激結構域之序列。

在一些實施例中，該共刺激結構域係自選自由以下組成之群之蛋白質獲得的功能性信號傳導結構域：OX40、CD2、CD27、CD28、CDS、ICAM-1、LFA-1 (CD11a/CD18)、ICOS (CD278)及4-1BB (CD137)，及其具有至少一個但不超過20個修飾之胺基酸序列。

在一些實施例中，該組成物進一步包含編碼細胞內信號傳導結構域之序列。

在一些實施例中，該組成物進一步包含前導序列。

在一些實施例中，該組成物進一步包含蛋白酶裂解位點。

在一些實施例中，其至少一個但不超過20個修飾包含介導細胞信號傳導之胺基酸修飾，或響應於配位體結合至該第一TFP、該第二TFP或二者而磷酸化的胺基酸修飾。

在一些實施例中，經分離之核酸分子係mRNA。

在一些實施例中，該第一TFP、該第二TFP或二者包括TCR次單元之免疫受體酪胺酸活化基元(ITAM)，該ITAM包含選自由以下組成之群之蛋白質的ITAM或其部分：CD3ζ TCR次單元、CD3ε TCR次單元、CD3γ TCR次單元、CD3δ TCR次單元、TCR ζ鏈、Fcε受體1鏈、Fcε受體2鏈、Fcγ受體1鏈、Fcγ受體2a鏈、Fcγ受體2b1鏈、Fcγ受體2b2鏈、Fcγ受體3a鏈、Fcγ受體3b鏈、Fcβ受體1鏈、TYROBP (DAP12)、CD5、CD16a、CD16b、CD22、CD23、CD32、CD64、CD79a、CD79b、CD89、CD278、CD66d、其功能片段，及其具有至少一個但不超過20個修飾之胺基酸序列。

在一些實施例中，該ITAM替代CD3γ、CD3δ或CD3ε之ITAM。

在一些實施例中，該ITAM選自由以下組成之群：CD3ζ TCR次單元、CD3ε TCR次單元、CD3γ TCR次單元及CD3δ TCR次單元，並替代選自由以下組成之群的不同ITAM：CD3ζ TCR次單元、CD3ε TCR次單元、CD3γ TCR次單元及CD3δ TCR次單元。

在一些實施例中，該組成物進一步包含前導序列。

在一個態樣中，本文提供一種包含多肽分子之組成物，該多肽分子係由本文所述之組成物中之核酸分子編碼。

在一些實施例中，該多肽包含由第一核酸分子編碼之第一多肽及由第二核酸分子編碼之第二多肽。

在一個態樣中，本文提供一種包含重組TFP分子之組成物，該重組TFP分子係由本文所述之組成物中之核酸分子編碼。

在一個態樣中，本文提供一種包含載體之組成物，該載體包含編碼本文所述之多肽或重組TFP分子之核酸分子。

在一些實施例中，該載體包括a)含編碼第一TFP之第一核酸分子的第一載體；及b)含編碼該第二TFP之第二核酸分子之第二載體。

在一些實施例中，該載體選自由以下組成之群：DNA、RNA、質體、慢病毒載體、腺病毒載體、勞斯肉瘤病毒(RSV)載體或逆轉錄病毒載體。

在一些實施例中，該載體進一步包含啟動子。

在一些實施例中，該載體係在活體外轉錄之載體。

在一些實施例中，該載體中之核酸序列進一步編碼多聚(A)尾。

在一些實施例中，該載體中之核酸序列進一步編碼3’UTR。

在一些實施例中，該載體中之核酸序列進一步編碼蛋白酶裂解位點。

在一個態樣中，本文提供一種包含細胞之組成物，該細胞包含本文所述之組成物。

在一些實施例中，該細胞係人類T細胞。

在另一些實施例中，該T細胞係CD8+或CD4+ T細胞。

在一些實施例中，該組成物進一步包含編碼抑制性分子之核酸，該抑制性分子包括與含來自細胞內信號傳導結構域之陽性信號的第二多肽締合之含抑制性分子之至少一部分的第一多肽。

在一些實施例中，該抑制性分子包括含PD1之至少一部分的第一多肽以及含共刺激結構域及一級信號傳導結構域之第二多肽。

在一個態樣中，本文提供一種治療患有與MSLN或MUC16表現相關之疾病之哺乳動物的方法，其包括向該哺乳動物投與有效量的本文所述之組成物。

在一些實施例中，該與MUC16或MSLN表現相關之疾病係選自由以下組成之群：增生性疾病、癌症、惡性病、骨髓發育不良、骨髓發育不良症候群、白血病前期、與MUC16表現相關之非癌症相關適應症、與MSLN表現相關之非癌症相關適應症、乳癌、前列腺癌、卵巢癌、子宮頸癌、皮膚癌、胰臟癌、結腸直腸癌、腎癌、肝癌、腦癌、淋巴瘤、白血病、肺癌、食道癌、胃癌及伴隨復發或難治性疾病之不可切除型卵巢癌。

在一些實施例中，該疾病係選自由以下組成之群之血液癌症：B細胞急性淋巴性白血病(B-ALL)、T細胞急性淋巴性白血病(T-ALL)、急性淋巴母細胞性白血病(ALL)；慢性骨髓性白血病(CML)、慢性淋巴球性白血病(CLL)、B細胞幼淋巴球性白血病、母細胞性漿細胞樣樹突狀細胞瘤、伯基特氏淋巴瘤、彌漫性大B細胞淋巴瘤、濾泡性淋巴瘤、毛細胞白血病、小細胞-濾泡性淋巴瘤、大細胞-濾泡性淋巴瘤、惡性淋巴組織增生疾病、MALT淋巴瘤、套細胞淋巴瘤、邊緣區淋巴瘤、多發性骨髓瘤、脊髓發育不良、脊髓發育不良症候群、非霍奇金氏淋巴瘤、漿母細胞性淋巴瘤、漿細胞樣樹突狀細胞瘤、瓦爾登斯特侖氏巨球蛋白血症、白血病前期、與MUC16或MSLN表現有關之疾病，及其組合。

在一些實施例中，將表現第一TFP分子及第二TFP分子之細胞與增加表現該第一TFP分子及該第二TFP分子之細胞之功效的劑組合投與。

在一些實施例中，該哺乳動物體內細胞介素之釋放量低於投與有效量的表現抗MSLN嵌合抗原受體(CAR)、抗MUC16 CAR、抗MSLN CAR及抗MUC16 CAR；或其組合之T細胞的哺乳動物。

在一些實施例中，將表現該第一TFP分子及第二TFP分子之細胞與改善與投與表現該第一TFP分子及該第二TFP分子之細胞有關之一或多種副作用的劑組合投與。

在一些實施例中，表現該第一TFP分子及第二TFP分子之細胞係與治療與MSLN或MUC16相關之疾病的劑組合投與。

在一個態樣中，本文描述一種編碼T細胞受體(TCR)融合蛋白(TFP)之經分離之核酸分子，該TFP包括TCR次單元以及包含諸如抗BCMA、抗CD19、抗CD20、抗CD22、抗MUC16、抗MSLN等抗腫瘤抗原結合結構域的人類或人類化抗體結構域。在一些實施例中，TCR次單元包含TCR細胞外結構域。在其他實施例中，TCR次單元包含TCR跨膜結構域。在又其他實施例中，TCR次單元包含TCR細胞內結構域。在其他實施例中，TCR次單元包含(i) TCR細胞外結構域；(ii) TCR跨膜結構域；及(iii) TCR細胞內結構域，其中(i)、(ii)及(iii)中至少兩個係來自同一TCR次單元。在又其他實施例中，TCR次單元包括含刺激性結構域之TCR細胞內結構域，該刺激性結構域選自CD3ε、CD3γ或CD3δ之細胞內信號傳導結構域，或其具有至少一個、兩個或三個修飾之胺基酸序列。在又其他實施例中，TCR次單元包括含刺激性結構域之細胞內結構域，該刺激性結構域選自4-1BB之功能性信號傳導結構域及/或CD3ζ之功能性信號傳導結構域，或其具有至少一個、兩個或三個修飾之胺基酸序列。

在一些實施例中，該人類或人類化抗體結構域包含抗體片段。在一些實施例中，該人類或人類化抗體結構域包含scFv或V_H 結構域。

在一些實施例中，該經分離之核酸分子包括(i)含本文所提供之任何抗腫瘤相關抗原輕鏈結合結構域胺基酸序列的輕鏈(LC) CDR1、LC CDR2及LC CDR3，及/或(ii)含本文所提供之任何抗腫瘤相關抗原重鏈結合結構域胺基酸序列的重鏈(HC) CDR1、HC CDR2及HC CDR3。

在一些實施例中，輕鏈可變區包含在本文所提供之輕鏈可變區的胺基酸序列中具有至少一個、兩個或三個修飾但不超過30、20或10個修飾之胺基酸序列，或與本文所提供之胺基酸序列具有95-99%一致性的序列。在其他實施例中，重鏈可變區包含在本文所提供之重鏈可變區的胺基酸序列中具有至少一個、兩個或三個修飾但不超過30、20或10個修飾之胺基酸序列，或與本文所提供之胺基酸序列具有95-99%一致性的序列。

在一些實施例中，TFP包括TCR次單元之細胞外結構域，該細胞外結構域包含選自由以下組成之群之蛋白質的細胞外結構域或其部分：T細胞受體之α或β鏈、CD3δ、CD3ε或CD3γ，或其功能片段，或其具有至少一個、兩個或三個修飾但不超過20、10或5個修飾之胺基酸序列。在其他實施例中，編碼之TFP包括跨膜結構域，該跨膜結構域包含選自由以下組成之群之蛋白質的跨膜結構域：TCR之α、β鏈、或TCR次單元CD3ε、CD3γ及CD3δ，或其功能片段，或其具有至少一個、兩個或三個修飾但不超過20、10或5個修飾之胺基酸序列。

在一些實施例中，編碼之TFP包括跨膜結構域，該跨膜結構域包含選自由以下組成之群之蛋白質的跨膜結構域：TCR α、β或ζ鏈，或CD3ε、CD3γ及CD3δ CD45、CD4、CD5、CD8、CD9、CD16、CD22、CD33、CD28、CD37、CD64、CD80、CD86、CD134、CD137及CD154，或其功能片段，或其具有至少一個、兩個或三個修飾但不超過20、10或5個修飾之胺基酸序列。

在一些實施例中，編碼之抗腫瘤相關抗原結合結構域藉由連接子序列連接至TCR細胞外結構域。在一些情形中，編碼之連接子序列包含(G₄ S)_n ，其中n=1至4 (SEQ ID NO: 100)。在一些情形中，編碼之連接子序列包含(G₄ S)_n ，其中n=2至4 (SEQ ID NO: 101)。在一些情形中，編碼之連接子序列包含(G₄ S)_n ，其中n=1至3 (SEQ ID NO: 102)。

在一些實施例中，經分離之核酸分子進一步包含編碼共刺激結構域之序列。在一些情形中，該共刺激結構域係自選自由以下組成之群之蛋白質獲得的功能性信號傳導結構域：OX40、CD2、CD27、CD28、CDS、ICAM-1、LFA-1 (CD11a/CD18)、ICOS (CD278)及4-1BB (CD137)，及其具有至少一個、兩個或三個修飾但不超過20、10或5個修飾之胺基酸序列。

在一些實施例中，經分離之核酸分子進一步包含前導序列。

本文還提供由先前所描述之核酸分子中之任一種所編碼的經分離之多肽分子。

在另一態樣中，本文亦提供經分離之T細胞受體融合蛋白(TFP)分子，其包含人類或人類化抗腫瘤相關抗原結合結構域、TCR細胞外結構域、跨膜結構域及細胞內結構域。在一些實施例中，該經分離之TFP分子包括含人類或人類化抗腫瘤相關抗原結合結構域、TCR細胞外結構域、跨膜結構域及細胞內結構域之抗體或抗體片段。

在一些實施例中，該抗腫瘤相關抗原結合結構域係scFv或V_H 結構域。在其他實施例中，該抗腫瘤相關抗原結合結構域包含輕鏈及重鏈，該輕鏈及重鏈具有本文所提供之胺基酸序列，或其功能片段，或在本文所提供之輕鏈可變區胺基酸序列中具有至少一個、兩個或三個修飾但不超過30、20或10個修飾之胺基酸序列，或與本文所提供之胺基酸序列具有95-99%一致性的序列。在一些實施例中，經分離之TFP分子包含TCR細胞外結構域，該細胞外結構域包含選自由以下組成之群之蛋白質的細胞外結構域或其部分：T細胞受體之α或β鏈、CD3δ、CD3ε或CD3γ，或其具有至少一個、兩個或三個修飾但不超過20、10或5個修飾之胺基酸序列。

在一些實施例中，抗腫瘤相關抗原結合結構域藉由連接子序列連接至TCR細胞外結構域。在一些情形中，連接子區包含(G₄ S)_n ，其中n=1至4 (SEQ ID NO: 100)。在一些情形中，連接子序列包含(G₄ S)_n ，其中n=2至4 (SEQ ID NO: 101)。在一些情形中，連接子序列包含(G₄ S)_n ，其中n=1至3 (SEQ ID NO: 102)。

在一些實施例中，經分離之TFP分子進一步包含編碼共刺激結構域之序列。在其他實施例中，經分離之TFP分子進一步包含編碼細胞內信號傳導結構域之序列。在又其他實施例中，經分離之TFP分子進一步包含前導序列。

本文還提供載體，其包含編碼先前所描述之TFP分子中之任一種的核酸分子。在一些實施例中，該載體選自由以下組成之群：DNA、RNA、質體、慢病毒載體、腺病毒載體或逆轉錄病毒載體。在一些實施例中，該載體進一步包含啟動子。在一些實施例中，該載體係在活體外轉錄之載體。在一些實施例中，該載體中之核酸序列進一步包含多聚(A)尾。在一些實施例中，該載體中之核酸序列進一步包含3’UTR。

本文亦提供包含所述載體中之任一種的細胞。在一些實施例中，該細胞係人類T細胞。在一些實施例中，該細胞係CD8+或CD4+ T細胞。在其他實施例中，該等細胞進一步包含編碼抑制性分子之核酸，該抑制性分子包括與含來自細胞內信號傳導結構域之陽性信號的第二多肽締合之含抑制性分子之至少一部分的第一多肽。在一些情形中，該抑制性分子包括含PD1之至少一部分的第一多肽以及含共刺激結構域及一級信號傳導結構域之第二多肽。

在另一態樣中，本文提供經分離之TFP分子，其包含人類或人類化抗腫瘤相關抗原結合結構域、TCR細胞外結構域、跨膜結構域及細胞內結構域，其中該TFP分子能夠與內源性TCR複合物及/或至少一種內源性TCR多肽功能性相互作用。

在另一態樣中，本文提供經分離之TFP分子，其包含人類或人類化抗腫瘤相關抗原結合結構域、TCR細胞外結構域、跨膜結構域及細胞內信號傳導結構域，其中該TFP分子能夠功能性整合至內源性TCR複合物中。

在另一態樣中，本文提供人類CD8+或CD4+ T細胞，其包含至少兩種TFP分子，該等TFP分子包含人類或人類化抗腫瘤相關抗原結合結構域、TCR細胞外結構域、跨膜結構域及細胞內結構域，其中該TFP分子能夠與人類CD8+或CD4+ T細胞表面中、其表面處及/或其表面上之內源性TCR複合物及/或至少一種內源性TCR多肽功能性相互作用。

在另一態樣中，本文提供蛋白質複合物，其包括i)含人類或人類化抗腫瘤相關抗原結合結構域、TCR細胞外結構域、跨膜結構域及細胞內結構域之TFP分子；以及ii)至少一種內源性TCR複合物。

在一些實施例中，該TCR包含選自由以下組成之群之蛋白質的細胞外結構域或其部分：T細胞受體之α或β鏈、CD3δ、CD3ε或CD3γ。在一些實施例中，抗腫瘤相關抗原結合結構域藉由連接子序列連接至TCR細胞外結構域。在一些情形中，連接子區包含(G₄ S)_n ，其中n=1至4 (SEQ ID NO: 100)。在一些情形中，連接子序列包含(G₄ S)_n ，其中n=2至4 (SEQ ID NO: 101)。在一些情形中，連接子序列包含(G₄ S)_n ，其中n=1至3 (SEQ ID NO: 102)。

本文亦提供人類CD8+或CD4+ T細胞，其在每一所述蛋白質複合物中之任一種中包含至少兩種不同的TFP蛋白。

在另一態樣中，本文提供一種人類CD8+或CD4+ T細胞群，其中該群之T細胞個別地或共同地包含至少兩種TFP分子，該等TFP分子包含人類或人類化抗腫瘤相關抗原結合結構域、TCR細胞外結構域、跨膜結構域及細胞內結構域，其中該TFP分子能夠與該人類CD8+或CD4+ T細胞表面中、其表面處及/或其表面上之內源性TCR複合物及/或至少一種內源性TCR多肽功能性相互作用。

在另一態樣中，本文提供一種人類CD8+或CD4+ T細胞群，其中該群之T細胞個別地或共同地包含至少兩個由本文所提供之經分離之核酸分子所編碼的TFP分子。

在另一態樣中，本文提供製備細胞之方法，其包括用所述載體中之任一種轉導T細胞。

在另一態樣中，本文提供一種產生經RNA工程改造之細胞群的方法，其包括將活體外轉錄之RNA或合成RNA引入細胞中，其中該RNA包含編碼所述TFP分子中之任一種的核酸。

在另一態樣中，本文提供在哺乳動物中提供抗腫瘤免疫性之方法，其包括向該哺乳動物投與有效量的表現所述TFP分子中之任一種的細胞。在一些實施例中，該細胞係自體T細胞。在一些實施例中，該細胞係同種異體T細胞。在一些實施例中，該乳動物係人類。

在另一態樣中，本文提供治療患有與腫瘤相關抗原表現有關之疾病之哺乳動物的方法，其包括向該哺乳動物投與有效量的包含所述TFP分子中之任一種的細胞。在一些實施例中，該與腫瘤相關抗原表現有關之疾病選自增生性疾病，諸如癌症或惡性病，或癌前病況，諸如骨髓發育不良、骨髓發育不良症候群或白血病前期，或係與腫瘤相關抗原表現有關的非癌症相關適應症。在一些實施例中，該疾病係選自由以下組成之群的血液癌症：一種或多種急性白血病，包括但不限於B細胞急性淋巴性白血病(「B-ALL」)、T細胞急性淋巴性白血病(「T-ALL」)、急性淋巴母細胞白血病(ALL)；一種或多種慢性白血病，包括但不限於慢性骨髓性白血病(CML)、慢性淋巴球性白血病(CLL)；額外的血液癌症或血液病況，包括但不限於B細胞幼淋巴球性白血病、母細胞性漿細胞樣樹突狀細胞瘤、伯基特氏淋巴瘤、彌漫性大B細胞淋巴瘤、濾泡性淋巴瘤、毛細胞白血病、小細胞或大細胞濾泡性淋巴瘤、惡性淋巴組織增生疾病、MALT淋巴瘤、套細胞淋巴瘤、邊緣區淋巴瘤、多發性骨髓瘤、冒煙型多發性骨髓瘤、孤立性漿細胞瘤、淋巴漿細胞性淋巴瘤、漿細胞白血病、骨髓發育不良及骨髓發育不良症候群、非霍奇金氏淋巴瘤、漿母細胞性淋巴瘤、漿細胞樣樹突狀細胞瘤、瓦爾登斯特侖氏巨球蛋白血症，以及「白血病前期」(伴有無效產生骨髓血細胞(或發育不良)之一組多樣性血液病況)，且與腫瘤相關抗原表現有關之疾病包括但不限於表現腫瘤相關抗原之非典型性及/或非經典癌症、惡性病、癌前病況或增生性疾病；及其組合。

在一些實施例中，表現所述TFP分子中之任一種的細胞係與改善與投與表現TFP分子之細胞有關之一種或多種副作用的劑組合投與。在一些實施例中，表現所述TFP分子中之任一種的細胞係與治療與腫瘤相關抗原有關之疾病的劑組合投與。

本文亦提供用作劑的所述經分離之核酸分子中之任一種、所述經分離之多肽分子中之任一種、所述經分離之TFP中之任一種、所述蛋白質複合物中之任一種、所述載體中之任一種或所述細胞中之任一種。1. 定義

除非另作定義，否則本文中所使用之所有技術及科學術語均具有與本發明所屬領域之普通技術人員通常所瞭解相同的含義。

術語「一個(種)」係指一個(種)或多於一個(種)(亦即，至少一個(種))該冠詞之語法賓語。舉例而言，「一個(種)要素」意思指一個(種)要素或多於一個(種)要素。

如本文所使用，「約」可以取決於狀況以及熟習此項技術者所瞭解或可瞭解而表示加或減小於1%或1%、2%、3%、4%、5%、6%、7%、8%、9%、10%、11%、12%、13%、14%、15%、16%、17%、18%、19%、20%、25%、30%或超過30%。

如本說明書中所使用，「受試者」或「個體」可以包括但不限於哺乳動物，諸如人類或非人類哺乳動物，例如家畜、農業動物或野生動物，以及鳥類及水生動物。「患者」係罹患疾病、病症或病況，或有發展疾病、病症或病況之風險，或另外需要本文所提供之組成物及方法的受試者。

如本文所使用，「治療」係指成功治療或改善疾病或病況之任何指征。治療可以包括例如減輕、延遲或緩解疾病或病況之一或多種症狀的嚴重程度，或者其可以包括降低患者所經歷之疾病、缺陷、病症或不良狀況及類似情形之症狀的頻率。如本文所使用，「治療或預防」有時在本文中用於指在一定程度上治療或改善疾病或病況之方法，且涵蓋指向該目的之一系列結果，包括但不限於完全預防該病況。

如本文所使用，「預防」係指患者疾病或病況，例如腫瘤形成之預防。舉例而言，若用本發明之方法治療有發展腫瘤或其他形式癌症之風險的個體且後續未發展該腫瘤或其他形式癌症，則至少在一段時間內該疾病在該個體中得到預防。

如本文所使用，「治療有效量」係足以向投與組成物之個體提供有益作用或以其他方式減少有害的非有益事件之組成物或其活性化合物的量。「治療有效劑量」在本文中意思指由於其投與而產生一或多種所希望或期望(例如有益)作用之劑量，該投與在指定時間段內實行一次或多次。確切劑量將取決於治療目的，且可以由熟習此項技術者使用已知技術確定(參見例如Lieberman, Pharmaceutical Dosage Forms (第1-3卷, 1992)；Lloyd,The Art, Science and Technology of Pharmaceutical Compounding (1999)；及Pickar,Dosage Calculations (1999))。

如本文所使用，「T細胞受體(TCR)融合蛋白」或「TFP」包括來源於包含TCR之各種多肽的重組多肽，該TCR一般能夠i)結合至目標細胞上之表面抗原；及ii)典型地當共定位於T細胞表面中或表面上時與完整TCR複合物之其他多肽組分相互作用。

如本文所使用，術語「抗體」係指來源於免疫球蛋白分子的特異性結合至抗原之蛋白質或多肽序列。抗體可以為多株或單株來源之完整免疫球蛋白，或其片段，且可以來源於天然來源或重組來源。

術語「抗體片段」或「抗體結合結構域」係指含有抗原結合結構域，亦即，完整抗體之抗原決定可變區的抗體之至少一部分，或其重組變異體，其足以使抗體片段識別並特異性結合目標，諸如抗原及其指定抗原決定基。抗體片段之實例包括但不限於Fab、Fab’、F(ab’)₂ 及Fv片段、單鏈(sc)Fv (「scFv」)抗體片段、線性抗體、單結構域抗體(縮寫「sdAb」) (V_L 或V_H )、駱駝V_HH 結構域，及由抗體片段形成之多特異性抗體。

術語「scFv」係指包括至少一個含輕鏈可變區之抗體片段及至少一個含重鏈可變區之抗體片段的融合蛋白，其中該輕鏈及重鏈可變區藉由短可撓性多肽連接子連續地連接，且能夠表現為單一多肽鏈之形式，且其中該scFv保持作為其來源之完整抗體的特異性。

就抗體而言，「重鏈可變區」或「V_H 」(或在單結構域抗體，例如奈米抗體情況下為「V_HH 」)係指在稱為構架區之側接伸長之間雜有三個CDR的重鏈片段，該等構架區之保守性一般高於CDR且形成支架以支撐CDR。

除非具體說明，否則如本文所使用，scFv可以具有例如關於多肽之N末端及C末端呈任一次序之V_L 及V_H 區，該scFv可包含V_L -連接子-V_H 或者可包含V_H -連接子-V_L 。

本發明之TFP組成物中包含抗體或其片段自部分可以多種形式存在，其中抗原結合結構域係表現作為連續多肽鏈之一部分，包括例如單結構域抗體片段(sdAb)或重鏈抗體HCAb 242:423-426)。在一個態樣中，本發明之TFP組成物的抗原結合結構域包含抗體片段。在另一態樣中，TFP包括含scFv或sdAb之抗體片段。

術語「抗體重鏈」係指呈天然存在之構象的抗體分子中存在之兩類多肽鏈中的較大鏈，且通常決定抗體所屬之類別。

術語「抗體輕鏈」係指呈天然存在之構象的抗體分子中存在之兩類多肽鏈中的較小鏈。κ及λ輕鏈係指兩種主要的抗體輕鏈同型。

術語「重組抗體」係指使用重組DNA技術產生之抗體，諸如由噬菌體或酵母表現系統表現之抗體。該術語亦應解釋為指藉由合成編碼抗體之DNA分子而產生的抗體且該DNA分子表現抗體蛋白，或藉由合成指定該抗體之胺基酸序列產生的抗體，其中該DNA或胺基酸序列係使用此項技術中可用且熟知之重組DNA或胺基酸序列技術獲得。

術語「抗原」或「Ag」係指能夠經抗體特異性結合，或以其他方式激發免疫反應之分子。該免疫反應可能參與抗體產生，或特定免疫活性細胞之活化，或兩種。

熟練技術人員應瞭解，任何大分子，包括實際上所有蛋白質或肽在內，皆可用作抗原。另外，抗原可以來源於重組或基因組DNA。熟練技術人員應瞭解，包含編碼引起免疫反應之蛋白質之核苷酸序列或部分核苷酸序列的任何DNA因此編碼「抗原」，該術語如本文所使用。另外，熟習此項技術者應瞭解，抗原無需僅由基因之全長核苷酸序列編碼。易於顯而易見的是，本發明包括但不限於，使用超過一個基因之部分核苷酸序列且該等核苷酸序列以各種組合形式佈置以編碼引起所希望之免疫反應的多肽。此外，熟練技術人員還應瞭解，抗原不必完全由「基因」編碼。很顯然，抗原可以為合成產生的，或者可以來源於生物樣品，或者可能為除多肽外的大分子。此類生物樣品可以包括但不限於組織樣品、腫瘤樣品、細胞或含其他生物組分之流體。

術語「抗腫瘤作用」係指可以藉由各種方式展現之生物作用，包括但不限於，例如腫瘤體積減小、腫瘤細胞數量減少、轉移數量減少、期望壽命增加、腫瘤細胞增殖減少、腫瘤細胞存活率降低，或與癌症病況相關之各種生理症狀改善。「抗腫瘤作用」亦可由本發明之肽、聚核苷酸、細胞及抗體首先在防止腫瘤發生方面之能力來展現。

術語「自體」係指來源於個體之任何材料稍後將再引入該個體中。

術語「同種異體」係指任何材料來源於與引入該材料之個體相同物種之不同動物或不同患者。當在一或多個基因座處之基因不同時，認為兩個或兩個以上體彼此為同種異體的。在一些態樣中，來自同一物種之各個體的同種異體材料在基因上的不同可能足以發生抗原相互作用。

術語「異種」係指來源於不同物種之動物的移植物。

術語「癌症」係指以異常細胞之快速且不受控制之生長為特徵的疾病。癌細胞可以局部擴散或經由血流及淋巴系統擴散至身體之其他部分。本文中描述多種癌症之實例，且其包括但不限於乳癌、前列腺癌、卵巢癌、子宮頸癌、皮膚癌、胰臟癌、結腸直腸癌、腎癌、肝癌、腦癌、淋巴瘤、白血病、肺癌、食道癌、胃癌、伴隨復發或難治性疾病的不可切除型卵巢癌，及類似癌症。

術語「保守性序列修飾」係指不會明顯影響或改變含有該胺基酸序列之抗體或抗體片段之結合特徵的胺基酸修飾。該等保守修飾包括胺基酸取代、添加及缺失。修飾可以藉由此項技術中已知之標準技術，諸如定點突變誘發及PCR介導之突變誘發而引入本發明之抗體或抗體片段中。保守胺基酸取代係胺基酸殘基經具有類似側鏈之胺基酸殘基置換的取代。具有類似側鏈之胺基酸殘基的家族在此項技術中已有定義。該等家族包括具有鹼性側鏈之胺基酸(例如離胺酸、精胺酸、組胺酸)、具有酸性側鏈之胺基酸(例如天冬胺酸、麩胺酸)、具有不帶電荷極性側鏈之胺基酸(例如甘胺酸、天冬醯胺、麩醯胺酸、絲胺酸、蘇胺酸、酪胺酸、半胱胺酸)、具有非極性側鏈之胺基酸(例如丙胺酸、纈胺酸、白胺酸、異白胺酸、脯胺酸、苯丙胺酸、甲硫胺酸)、具有β-分支側鏈之胺基酸(例如蘇胺酸、纈胺酸、異白胺酸)及具有芳族側鏈之胺基酸(例如酪胺酸、苯丙胺酸、色胺酸、組胺酸)。因此，在本發明之TFP內的一或多個胺基酸殘基可以經來自相同側鏈家族之其他胺基酸殘基置換，且改變之TFP可以使用本文所描述之功能檢定進行測試。

術語「刺激」係指由刺激性結構域或刺激性分子(例如TCR/CD3複合物)與其同源配位體結合，由此介導信號轉導事件，諸如但不限於，經由TCR/CD3複合物進行之信號轉導所誘導的主要反應。刺激可以介導某些分子表現之改變，及/或細胞骨架結構之重新組織等。

術語「刺激性分子」或「刺激性結構域」係指T細胞所表現的提供一或多個初級細胞質信號傳導序列之分子或其部分，一或多個初級細胞質信號傳導序列以刺激T細胞信號傳導路徑之至少某一態樣之方式調控TCR複合物之初次活化。在一個態樣中，初級信號係由例如TCR/CD3複合物與肽上裝載之MHC分子結合起始，並由此介導T細胞反應，包括但不限於增殖、活化、分化及類似反應。以刺激方式作用的初級細胞質信號傳導序列(又稱為「初級信號傳導結構域」)可以含有信號傳導基元，該基元稱為免疫受體酪胺酸活化基元或「ITAM」。特別適用於本發明中的含有初級細胞質信號傳導序列之ITAM的實例包括但不限於來源於TCRζ、FcRγ、FcRβ、CD3γ、CD3δ、CD3ε、CD5、CD22、CD79a、CD79b、CD278(又稱為「ICOS」)及CD66d。

術語「抗原呈現細胞」或「APC」係指在表面上展示外來抗原與主要組織相容性複合物(MHC)之複合物的免疫系統細胞，諸如輔助細胞(例如B細胞、樹突狀細胞及類似細胞)。T細胞可以使用T細胞受體(TCR)識別該等複合物。APC加工抗原並將其呈現至T細胞上。

如本文所使用之術語「細胞內信號傳導結構域」係指分子之細胞內部分。細胞內信號傳導結構域產生促進含TFP之細胞，例如表現TFP之T細胞之免疫效應功能的信號。免疫效應功能，例如在表現TFP之T細胞中之免疫效應功能的實例包括細胞溶解活性及T輔助細胞活性，包括細胞介素之分泌。在一個實施例中，細胞內信號傳導結構域可以包含初級細胞內信號傳導結構域。例示性初級細胞內信號傳導結構域包括來源於負責初次刺激或抗原依賴性刺激之分子的那些。在一個實施例中，細胞內信號傳導結構域可以包含共刺激細胞內結構域。例示性共刺激細胞內信號傳導結構域包括來源於負責共刺激信號或不依賴於抗原之刺激之分子的共刺激細胞內信號傳導結構域。

初級細胞內信號傳導結構域可以包含ITAM(「免疫受體酪胺酸活化基元」)。含有ITAM之初級細胞質信號傳導序列之實例包括但不限於，來源於CD3ζ、FcRγ、FcRβ、CD3γ、CD3δ、CD3ε、CD5、CD22、CD79a、CD79b以及CD66d DAP10及DAP12的初級細胞質信號傳導序列。

術語「共刺激分子」係指在T細胞上與共刺激配位體特異性結合，由此介導T細胞之共刺激反應，諸如但不限於增殖之同源結合搭配物。共刺激分子係高效免疫反應所需的除抗原受體或其配位體外之細胞表面分子。共刺激分子包括但不限於，1類MHC分子、BTLA及鐸配位體受體，以及OX40、CD2、CD27、CD28、CDS、ICAM-1、LFA-1 (CD11a/CD18)及4-1BB (CD137)。共刺激細胞內信號傳導結構域可以係共刺激分子之細胞內部分。共刺激分子可以由以下蛋白質家族代表：TNF受體蛋白、免疫球蛋白樣蛋白、細胞介素受體、整合素、信號傳導淋巴細胞活化分子(SLAM蛋白)及活化NK細胞受體。該等分子之實例包括CD27、CD28、4-1BB (CD137)、OX40、GITR、CD30、CD40、ICOS、BAFFR、HVEM、淋巴細胞功能相關抗原-1 (LFA-1)、CD2、CD7、LIGHT、NKG2C、SLAMF7、NKp80、CD160、B7-H3，以及與CD83特異性結合之配位體，及類似分子。細胞內信號傳導結構域可以包含作為該結構域之來源之分子的整個細胞內部分，或整個天然細胞內信號傳導結構域，或其功能片段。術語「4-1BB」係指具有如GenBank登錄號AAA62478.2所提供之胺基酸序列或來自非人類物種，例如小鼠、囓齒動物、猴、猿及類似物種之等效殘基的TNFR超家族成員；且「4-1BB共刺激結構域」定義為GenBank登錄號AAA62478.2之胺基酸殘基214-255，或來自非人類物種，例如小鼠、囓齒動物、猴、猿及類似物種之等效殘基。

術語「編碼」係指聚核苷酸，諸如基因、cDNA或mRNA中特定核苷酸序列之固有特性，該等核苷酸序列在生物過程中用作合成具有指定核苷酸序列(例如rRNA、tRNA及mRNA)或指定胺基酸序列及由此引起之生物特性的其他聚合物及大分子之模板。因此，若對應於一個基因之mRNA在細胞或其他生物系統中轉錄並轉譯產生蛋白質，則該基因、cDNR或RNA編碼該蛋白質。核苷酸序列與mRNA序列相同且通常被提供於序列表中之編碼鏈，以及用作基因或cDNA之轉錄模板的非編碼鏈，可以稱為編碼該基因或cDNA之蛋白質或其他產物。

除非另外說明，否則「編碼胺基酸序列之核苷酸序列」包括彼此互為簡併形式且編碼相同胺基酸序列的所有核苷酸序列。就編碼蛋白質之核苷酸序列的一些形式可能含有一或多個內含子而言，短語編碼蛋白質或RNA之核苷酸序列亦可包括內含子。

術語「有效量」或「治療有效量」在本文中可互換使用，且指有效實現特定生物或治療結果的如本文所述之化合物、調配物、材料或組成物之量。

術語「內源性」係指來自生物體、細胞、組織或系統，或在生物體、細胞、組織或系統內產生的任何材料。

術語「外源性」係指自生物體、細胞、組織或系統引入，或在生物體、細胞、組織或系統外部產生的任何材料。

術語「表現」係指由啟動子驅動之特定核苷酸序列的轉錄及/或轉譯。

術語「轉移載體」係指包含經分離之核酸且可以用於將該經分離之核酸遞送至細胞內部的物質組成物。此項技術中已知多種載體，包括但不限於線性聚核苷酸、與離子性或兩性化合物締合之聚核苷酸、質體及病毒。因此，術語「轉移載體」包括自主複製之質體或病毒。該術語亦應解釋為進一步包括有助於核酸轉移至細胞中的非質體及非病毒化合物，諸如聚離胺酸化合物、脂質體及類似物。病毒轉移載體之實例包括但不限於腺病毒載體、腺相關病毒載體、逆轉錄病毒載體、慢病毒載體及類似載體。

術語「表現載體」係指包含重組聚核苷酸之載體，該重組聚核苷酸包含可操作地連接至待表現之核苷酸序列的表現控制序列。表現載體包含足夠實現表現之順式作用元件；其他表現元件可以由宿主細胞或活體外表現系統提供。表現載體包括此項技術中已知的併入重組聚核苷酸之所有表現載體，包括黏接質體、質體(例如裸質體或包含在脂質體中)及病毒(例如慢病毒、逆轉錄病毒、腺病毒及腺相關病毒)。

術語「慢病毒」係指逆轉錄病毒科之一個屬。慢病毒係獨特的逆轉錄病毒，能夠感染非分裂細胞；該等病毒能夠將大量的遺傳信息遞送至宿主細胞DNA中，由此其係基因遞送載體的最高效方法之一。HIV、SIV及FIV係慢病毒的所有實例。

術語「慢病毒載體」係指來源於至少一部分慢病毒基因組之載體，包括特別是如Milone等人, Mol. Ther. 17(8): 1453-1464 (2009)中所提供之自滅活慢病毒載體。可以用於臨床的其他慢病毒載體之實例包括但不限於，例如Oxford BioMedica之LENTIVECTOR^TM 基因遞送技術、Lentigen之LENTIMAX^TM 載體系統及類似技術。非臨床型慢病毒載體亦可使用且係熟習此項技術者所知的。

術語「同源」或「一致性」係指兩個聚合物分子之間，例如兩個核酸分子，諸如兩個DNA分子或兩個RNA分子之間，或兩個多肽分子之間的次單元序列一致性。當兩個分子中之次單元位置係由相同單體次單元佔據時；例如，若兩個DNA分子各自之位置均由腺嘌呤佔據，則該兩個分子在該位置處同源或一致。兩個序列之間之同源性與匹配或同源位置的數量直接相關；例如，若兩個序列中之半數位置(例如長度係十個次單元之聚合物中的五個位置)係同源的，則該兩個序列50%同源；若90%之位置(例如10個中的9個)係匹配或同源的，則該兩個序列90%同源。

非人類(例如鼠類)抗體之人類化形式係含有來源於非人類免疫球蛋白之最小序列的嵌合免疫球蛋白、免疫球蛋白鏈或其片段(諸如Fv、Fab、Fab’、F(ab’)₂ ，或抗體之其他抗原結合子序列)。在很大程度上，人類化抗體及其抗體片段係來自接受體互補決定區(CDR)之殘基經來自具有所需特異性、親和力及能力之非人類物種(供體抗體；諸如小鼠、大鼠或兔)之CDR之殘基置換的人類免疫球蛋白(接受體抗體或抗體片段)。在一些情形中，人類免疫球蛋白之Fv構架區(FR)殘基經相應非人類殘基置換。此外，人類化抗體/抗體片段亦可包含在接受體抗體及引入之CDR或構架序列中均未發現的殘基。該等修飾可以進一步改善並優化抗體或抗體片段之效能。一般而言，人類化抗體或其抗體片段將包含至少一個且典型地兩個可變結構域之實質上全部，其中所有或實質上所有CDR區均與非人類免疫球蛋白之CDR區對應且所有或實質上所有FR區均為人類免疫球蛋白序列之FR區。人類化抗體或抗體片段亦可包含免疫球蛋白恆定區(Fc)之至少一部分，典型地係人類免疫球蛋白恆定區之至少一部分。有關其他詳情，參見Jones等人, Nature, 321: 522-525, 1986；Reichmann等人, Nature, 332: 323-329, 1988；Presta, Curr. Op. Struct. Biol., 2: 593-596, 1992。

「人類」或「完全人類」係指這樣一種免疫球蛋白，諸如抗體或抗體片段，在該免疫球蛋白中，整個分子均為人類來源的或者由與該抗體或免疫球蛋白之人類形式相同的胺基酸序列組成。

術語「經分離」意思指自天然狀態改變或取出的。舉例而言，活體動物中天然存在之核酸或肽並非「經分離」的，但與其天然狀態之共存材料部分或完全分離之肽係「經分離」的。經分離之核酸或蛋白質可以呈實質上純化之形式存在，或者可以存在於非天然環境，諸如宿主細胞中。

在本發明之上下文中，使用以下常見核酸鹼基縮寫。「A」係指腺苷，「C」係指胞嘧啶，「G」係指鳥苷，「T」係指胸苷，且「U」係指尿苷。

術語「可操作地連接」或「轉錄控制」係指調控序列與異源核酸序列之間引起異源核酸序列之表現的功能性連接。舉例而言，當第一核酸序列與第二核酸序列呈功能關係時，該第一核酸序列與該第二核酸序列可操作地連接。舉例而言，若啟動子影響編碼序列之轉錄或表現，則該啟動子可操作地連接至該編碼序列。可操作地連接之DNA序列可以彼此相鄰，且例如在需要接合兩個蛋白質編碼區時係處於同一閱讀框中。

術語「非經腸」投與免疫原性組成物包括例如皮下(s.c.)、靜脈內(i.v.)、肌肉內(i.m.)或胸骨內注射、腫瘤內或輸注技術。

術語「核酸」或「聚核苷酸」係指呈單股或雙股形式之脫氧核糖核酸(DNA)或核糖核酸(RNA)及其聚合物。除非明確限制，否則該術語涵蓋含有天然核苷酸之已知類似物的核酸，該等核酸之結合特性與參考核酸類似且以與天然存在之核苷酸類似的方式代謝。除非另外指示，否則特定核酸序列亦隱含地包含其保守修飾變異體(例如簡併密碼子取代)、對偶基因、直系同源物、SNP及互補序列，以及明確指明之序列。確切地說，可以藉由產生一或多個所選(或所有)密碼子之第三個位置經混合鹼基及/或脫氧肌苷殘基取代的序列來實現簡併密碼子取代(Batzer等人, Nucleic Acid Res. 19:5081 (1991)；Ohtsuka等人, J. Biol. Chem. 260:2605-2608 (1985)；及Rossolini等人, Mol. Cell. Probes 8:91-98 (1994))。

術語「肽」、「多肽」及「蛋白質」可互換使用，且指包含藉由肽鍵共價連接之胺基酸殘基的化合物。蛋白質或肽必須含有至少兩個胺基酸，且對可以構成蛋白質或肽序列之胺基酸的最大數量沒有限制。多肽包括含藉由肽鍵彼此接合之兩個或兩個以上胺基酸的任何肽或蛋白質。如本文所使用，該術語係指在此項技術中通常又稱為肽、寡肽及寡聚物的短鏈，以及在此項技術中一般稱為蛋白質之較長鏈，該等蛋白質存在許多類型。「多肽」包括例如生物活性片段、實質上同源之多肽、寡肽、同二聚體、異二聚體、多肽變異體、修飾之多肽、衍生物、類似物、融合蛋白及類似物。多肽包括天然肽、重組肽或其組合。

術語「啟動子」係指由細胞之轉錄機器，或引入之合成機器識別的DNA序列，其係起始聚核苷酸序列之特定轉錄所需的。

術語「啟動子/調控序列」係指表現可操作地連接至啟動子/調控序列之基因產物所需的核酸序列。在一些情形中，該序列可以為核心啟動子序列，且在其他情形中，該序列亦可包括增強子序列及表現基因產物所需之其他調控元件。啟動子/調控序列可以為例如以組織特異性方式表現基因產物之序列。

術語「組成性」啟動子係指當與編碼或指定基因產物之聚核苷酸可操作地連接時使基因產物能夠在細胞中在大多數或所有細胞生理條件下產生的核苷酸序列。

術語「誘導性」啟動子係指當與編碼或指定基因產物之聚核苷酸可操作地連接時使基因產物實質上僅在對應於啟動子之誘導子存在於該細胞中時才在細胞中產生的核苷酸序列。

術語「組織特異性」啟動子係指這樣一種核苷酸序列，該核苷酸序列當與基因編碼或指定之聚核苷酸可操作地連接時，實質上僅在細胞係對應於該啟動子之組織類型之細胞時才在該細胞中產生基因產物

在scFv之情形中使用的術語「連接子」及「可撓性多肽連接子」係指由胺基酸，諸如單獨或組合使用之甘胺酸及/或絲胺酸殘基組成的用以將可變重鏈區與可變輕鏈區連接在一起的肽連接子。在一個實施例中，可撓性多肽連接子係Gly/Ser連接子且包含胺基酸序列(Gly-Gly-Gly-Ser)_n ，其中n係等於或大於1的正整數(SEQ ID NO: 106)。舉例而言，n=1、n=2、n=3、n=4、n=5、n=6、n=7、n=8、n=9及n=10。在一個實施例中，可撓性多肽連接子包括但不限於，(Gly₄ Ser)₄ (SEQ ID NO: 104)或(Gly₄ Ser)₃ (SEQ ID NO: 105)。在另一實施方案中，連接子包括(Gly₂ Ser)、(GlySer)或(Gly₃ Ser) (SEQ ID NO: 106)之多個重複序列。本發明之範圍內還包括WO2012/138475(以引用的方式併入本文中)中所描述之連接子。在一些情形中，連接子序列包含(G₄ S)_n ，其中n=2至4 (SEQ ID NO: 101)。在一些情形中，連接子序列包含(G₄ S)_n ，其中n=1至3 (SEQ ID NO: 102)。

如本文所使用，5’帽(又稱為RNA帽、RNA 7-甲基鳥苷帽或RNA m7G帽)係在開始轉錄後不久即添加至真核生物信使RNA「前部」或5’端的經修飾之鳥嘌呤核苷酸。5’帽由連接至第一個轉錄之核苷酸的末端基團組成。其存在對於核糖體識別以及防止RNA酶作用至關重要。帽的添加與轉錄相結合，且係共轉錄地發生的，由此彼此相互影響。在開始轉錄後不久，所合成之mRNA的5’端即經與RNA聚合酶締合之帽合成複合物結合。該酶複合物催化mRNA戴帽所需之化學反應。合成係以多步驟生物化學反應進行的。戴帽部分可經修飾以調節mRNA之功能，諸如其穩定性或轉譯效率。

如本文所使用，「活體外轉錄之RNA」係指在活體外合成之RNA，較佳地為mRNA。一般而言，活體外轉錄之RNA係由活體外轉錄載體產生的。活體外轉錄載體包含用於產生活體外轉錄之RNA的模板。

如本文所使用，「多聚(A)」係藉由聚腺苷酸化連接至mRNA之一系列腺苷。在用於短暫表現之構築體的較佳實施例中，多聚A係介於50與5000個之間(SEQ ID NO: 107)，較佳地超過64個，更佳地超過100個，最佳地超過300或400個。多聚(A)序列可以藉由化學方式或酶方式修飾以調節mRNA功能，諸如定位、穩定性或轉譯效率。

如本文所使用，「聚腺苷酸化」係指聚腺苷醯基部分，或其修飾變異體與信使RNA分子之共價鍵聯。在真核生物體中，大多數信使RNA (mRNA)分子在3’端處聚腺苷酸化。3’多聚(A)尾係經由酶，即聚腺苷酸化聚合酶之作用添加至前體mRNA中的較長腺嘌呤核苷酸序列(通常數百個腺嘌呤核苷酸)。在高級真核生物中，多聚(A)尾係添加至含有特定序列，即聚腺苷酸化信號之轉錄物上。多聚(A)尾及其所結合之蛋白質有助於保護mRNA免於經歷外切核酸酶降解。聚腺苷酸化對於轉錄終止、mRNA自核輸出以及轉譯亦很重要。聚腺苷酸化係在DNA轉錄成RNA之後立即在核中發生，但另外亦可稍後在細胞質中發生。在轉錄終止後，mRNA鏈在與RNA聚合酶相連之內切核酸酶複合物作用下裂解。裂解位點通常以裂解位點附近存在鹼基序列AAUAAA(SEQ ID NO:98)為特徵。在mRNA裂解後，腺苷殘基經添加至裂解位點處之游離3’端。

如本文所使用，「短暫」係指在數小時、數天或數週時間內非整合性轉殖基因之表現，其中該表現時間段小於該基因在整合至宿主細胞中之基因組中或包含在穩定質體複製子內時表現所持續的時間段。

術語「信號轉導路徑」係指在信號自細胞之一部分傳播至細胞另一部分中起作用的多個信號轉導分子之間之生物化學關係。短語「細胞表面受體」包括能夠跨細胞膜接收信號並傳播信號之分子及分子複合物。

術語「受試者」意圖包括能夠被引起免疫反應之活生物體(例如哺乳動物、人類)。

術語「實質上純化的」細胞係指基本上不含其他細胞類型之細胞。實質上純化之細胞亦指已經與在其天然存在狀態下通常與其相連之其他細胞類型分離的細胞。在一些情形中，實質上純化之細胞群係指同源細胞群。在其他情形中，該術語簡單地指已經與在其天然狀態下天然相連之細胞分離的細胞。在一些態樣中，細胞係在活體外培養的。在其他態樣中，細胞並非在活體外培養的。

如本文所使用，術語「治療性(therapeutic)」意思指治療(treatment)。治療作用係藉由減輕、抑制、緩解或根除疾病狀態獲得。

如本文所使用，術語「預防」意思指疾病或疾病狀態之預防或防護性治療。

在本發明的上下文中，「腫瘤抗原」或「過度增生性病症抗原」或「與過度增生性病症有關之抗原」係指特定過度增生性病症共有之抗原。在某些態樣中，本發明之過度增生性病症抗原係來源於癌症，包括但不限於原發性或轉移性黑素瘤、胸腺瘤、淋巴瘤、肉瘤、肺癌、肝癌、NHL、白血病、子宮癌、子宮頸癌、膀胱癌、腎癌，以及腺癌諸如乳癌、前列腺癌、卵巢癌、子宮頸癌、皮膚癌、胰臟癌、結腸直腸癌、腎癌、肝癌、腦癌、淋巴瘤、白血病、肺癌、食道癌、胃癌、伴隨復發或難治性疾病的不可切除型卵巢癌。

術語「轉染」或「轉型」或「轉導」係指將外源性核酸轉移或引入宿主細胞中的方法。「轉染」或「轉型」或「轉導」之細胞係經外源性核酸轉染、轉型或轉導的細胞。細胞包括原代受試者細胞及其後代。

術語「特異性結合」係指識別並結合樣品中存在之同源結合搭配物(例如BCMA)，但未必且實質上不識別或結合樣品中之其他分子的抗體、抗體片段或特定配位體。

範圍：在本揭示案通篇，本發明之各個態樣可以範圍格式提供。應瞭解，以範圍格式描述僅為了便利及簡潔起見，而不應解釋為對本發明範圍之固定限制。因此，對範圍之描述應視為具體地揭示所有可能之子範圍以及在該範圍內的個別數字值。舉例而言，對範圍諸如自1至6之描述應視為具體地揭示子範圍，諸如自1至3、自1至4、自1至5、自2至4、自2至6、自3至6等，以及在該範圍內之個別數字，例如1、2、2.7、3、4、5、5.3及6。作為另一實例，一個範圍，諸如95-99%一致性，包括具有95%、96%、97%、98%或99%一致性的事物，且包括諸如96-99%、96-98%、96-97%、97-99%、97-98%及98-99%一致性之類子範圍。無論範圍寬度如何，此均適用。2. T 細胞受體 (TCR) 融合蛋白 (TFP)

本發明涵蓋編碼TFP之重組DNA構築體，其中該TFP包含特異性結合至BCMA，例如人類BCMA之抗體片段，其中該抗體片段之序列與編碼TCR次單元或其部分之核酸序列相鄰且在同一閱讀框中。本文提供之TFP能夠與一或多個內源性TCR次單元(或替代地，一或多個外源性TCR次單元，或內源性TCR次單元與外源性TCR次單元之組合)締合以便形成功能性TCR複合物。

在一個態樣中，本發明之TFP包含目標特異性結合元件，又稱為抗原結合結構域。部分之選擇取決於界定目標細胞表面之目標抗原的類型及數量。舉例而言，所選抗原結合結構域可識別在與特定疾病狀態有關之目標細胞上充當細胞表面標記物的目標抗原。因此，可充當本發明TFP中之抗原結合結構域之目標抗原的細胞表面標記物之實例包括與病毒、細菌及寄生蟲感染；自身免疫疾病；及癌性疾病(例如惡性病)有關的之標記物。

在一個態樣中，藉由將抗原結合結構域工程改造至特異性結合所需抗原之TFP中，可以使TFP介導之T細胞反應針對所關注抗原。

在一個態樣中，TFP中包含抗原結合結構域之部分包含靶向BCMA之抗原結合結構域。在一個態樣中，該抗原結合結構域靶向人類BCMA。

該抗原結合結構域可以為結合至該抗原之任何結構域，包括但不限於單株抗體、多株抗體、重組抗體、人類抗體、人類化抗體及其功能片段，包括但不限於單結構域抗體，諸如重鏈可變結構域(V_H )、輕鏈可變結構域(V_L )及駱駝源性奈米抗體之可變結構域(V_HH )，以及此項技術中已知可用作抗原結合結構域之替代性支架，諸如重組纖連蛋白結構域、抗運載蛋白(anticalin)、DARPIN及類似物。同樣，特異性識別並結合目標抗原之天然或合成配位體亦可用作TFP之抗原結合結構域。在一些情形中，抗原結合結構域宜來源於與最終將使用TFP相同之物種。舉例而言，對用於人類來說，TFP之抗原結合結構域在抗體或抗體片段之抗原結合結構域中包含人類或人類化殘基可能係有益的。

因此，在一個態樣中，抗原結合結構域包含人類化或人類抗體或抗體片段，或者鼠類抗體或抗體片段。在一個實施例中，人類化或人類抗BCMA結合結構域包含本文所述之人類化或人類抗BCMA結合結構域的一或多個(例如全部三個)輕鏈互補決定區1 (LC CDR1)、輕鏈互補決定區2 (LC CDR2)及輕鏈互補決定區3 (LC CDR3)，及/或本文所述之人類化或人類抗BCMA結合結構域的一或多個(例如全部三個)重鏈互補決定區1 (HC CDR1)、重鏈互補決定區2 (HC CDR2)及重鏈互補決定區3 (HC CDR3)，例如人類化或人類抗BCMA結合結構域包含一或多個，例如全部三個LC CDR以及一或多個，例如全部三個HC CDR。在一個實施例中，人類化或人類抗BCMA結合結構域包含本文所述之人類化或人類抗BCMA結合結構域的一或多個(例如全部三個)重鏈互補決定區1 (HC CDR1)、重鏈互補決定區2 (HC CDR2)及重鏈互補決定區3 (HC CDR3)，例如該人類化或人類抗腫瘤相關抗原結合結構域具有兩個可變重鏈區，其各自包含本文所述之HC CDR1、HC CDR2及HC CDR3。在一個實施例中，人類化或人類抗腫瘤相關抗原結合結構域包含本文所述之人類化或人類輕鏈可變區及/或本文所述之人類化或人類重鏈可變區。在一個實施例中，人類化或人類抗腫瘤相關抗原結合結構域包含本文所述之人類化重鏈可變區，例如至少兩個本文所述之人類化或人類重鏈可變區。在一個實施例中，抗腫瘤相關抗原結合結構域係scFv，該scFv包括含本文所提供之胺基酸序列的輕鏈及重鏈。在一個實施例中，該抗腫瘤相關抗原結合結構域(例如scFv或V_H H nb)包含：包含在本文所提供之輕鏈可變區胺基酸序列中具有至少一個、兩個或三個修飾(例如取代)但不超過30、20或10個修飾(例如取代)的胺基酸序列，或與本文所提供之胺基酸序列具有95-99%一致性之序列的輕鏈可變區；及/或包含在本文所提供之重鏈可變區胺基酸序列中具有至少一個、兩個或三個修飾(例如取代)但不超過30、20或10個修飾(例如取代)的胺基酸序列，或與本文所提供之胺基酸序列具有95-99%一致性之序列的重鏈可變區。在一個實施例中，人類化或人類抗腫瘤相關抗原結合結構域係scFv，且包含本文所述之胺基酸序列的輕鏈可變區經由連接子，例如本文所述之連接子連接至包含本文所述之胺基酸序列的重鏈可變區。在一個實施例中，人類化抗腫瘤相關抗原結合結構域包括(Gly₄ -Ser)_n 連接子，其中n係1、2、3、4、5或6，較佳為3或4 (SEQ ID NO: 108)。scFv之輕鏈可變區及重鏈可變區可以例如呈以下取向中之任一種：輕鏈可變區-連接子-重鏈可變區，或重鏈可變區-連接子-輕鏈可變區。在一些情形中，連接子序列包含(G₄ S)_n ，其中n=2至4 (SEQ ID NO: 101)。在一些情形中，連接子序列包含(G₄ S)_n ，其中n=1至3 (SEQ ID NO: 102)。

在一些態樣中，當抗體之特定序列或區域經修飾成使得與人體中天然產生之抗體或其片段類似性增加時，非人類抗體經人類化。在一個態樣中，抗原結合結構域經人類化。

人類化抗體可以使用此項技術中已知之眾多技術產生，包括但不限於CDR移植(參見例如歐洲專利第EP 239,400號；國際公開案第WO 91/09967號；以及美國專利第5,225,539號、第5,530,101號及第5,585,089號，各自以全文引用的方式併入本文中)、鑲飾或表面重塑(參見例如歐洲專利第EP 592,106號及第EP 519,596號；Padlan, 1991, Molecular Immunology, 28(4/5):489-498；Studnicka等人, 1994, Protein Engineering, 7(6):805-814；以及Roguska等人, 1994, PNAS, 91:969-973，各自以全文引用的方式併入本文中)、鏈改組(參見例如美國專利第5,565,332號，以全文引用的方式併入本文中)，以及例如美國專利申請公開案第US2005/0042664號、美國專利申請公開案第US2005/0048617號、美國專利第6,407,213號、美國專利第5,766,886號、國際公開案第WO 9317105號；Tan等人, J. Immunol., 169:1119-25 (2002)；Caldas等人, Protein Eng., 13(5):353-60 (2000)；Morea等人, Methods, 20(3):267-79 (2000)；Baca等人, J. Biol. Chem., 272(16):10678-84 (1997)；Roguska等人, Protein Eng., 9(10):895-904 (1996)；Couto等人, Cancer Res., 55 (23增刊):5973s-5977s (1995)；Couto等人, Cancer Res., 55(8):1717-22 (1995)；Sandhu J S, Gene, 150(2):409-10 (1994)，以及Pedersen等人, J. Mol. Biol., 235(3):959-73 (1994)中所揭示之技術，各自以全文引用的方式併入本文中。通常，構架區中之構架殘基將經來自CDR供體抗體之相應殘基取代，以改變，例如改善抗原結合。該等構架取代係藉由此項技術中熟知之方法鑑別，例如藉由建立CDR與構架殘基相互作用之模型以鑑別對於抗原結合很重要之構架殘基以及進行序列比較以鑑別在特定位置處之不常見構架殘基(參見例如Queen等人, 美國專利第5,585,089號；及Riechmann等人, 1988, Nature, 332:323，以全文引用的方式併入本文中)。

人類化抗體或抗體片段保留有一或多個來自非人類來源之胺基酸殘基。該等非人類胺基酸殘基通常稱為「輸入」殘基，該等殘基典型地係自「輸入」可變結構域獲得。如本文所提供，人類化抗體或抗體片段包含一或多個來自非人類免疫球蛋白分子之CDR，以及構架區，其中構成該構架之胺基酸殘基完全或主要來源於人類生殖系。用於使抗體或抗體片段人類化的多種技術係此項技術中熟知的且基本上可以遵循Winter及同事之方法(Jones等人, Nature, 321:522-525 (1986)；Riechmann等人, Nature, 332:323-327 (1988)；Verhoeyen等人, Science, 239:1534-1536 (1988))，藉由用囓齒動物之CDR或CDR序列取代人類抗體之相應序列，亦即，CDR移植進行(EP 239,400；PCT公開案第WO 91/09967號；以及美國專利第4,816,567號、第6,331,415號、第5,225,539號、第5,530,101號、第5,585,089號、第6,548,640號，其內容以全文引用的方式併入本文中)。在此類人類化抗體及抗體片段中，實質上少於完整之人類可變結構域經來自非人類物種之相應序列取代。人類化抗體通常為一些CDR殘基且可能一些構架(FR)殘基經來自囓齒動物抗體中類似位點之殘基取代的人類抗體。亦可藉由鑲飾或表面重塑(EP 592,106；EP 519,596；Padlan, 1991, Molecular Immunology, 28(4/5):489-498；Studnicka等人, Protein Engineering, 7(6):805-814 (1994)；以及Roguska等人, PNAS, 91:969-973 (1994))或鏈改組(美國專利第5,565,332號)使抗體及抗體片段人類化，該等文獻之內容以全文引用的方式併入本文中。

選擇用於製備人類化抗體之人類輕鏈及重鏈可變結構域應降低抗原性。根據所謂的「最佳配合」方法，針對已知人類可變結構域序列之完整文庫篩選囓齒動物抗體可變結構域之序列。最接近囓齒動物序列之人類序列則被接受作為人類化抗體之人類構架(FR)(Sims等人, J. Immunol., 151:2296 (1993)；Chothia等人, J. Mol. Biol., 196:901 (1987)，其內容以全文引用的方式併入本文中)。另一方法使用來源於具有特定輕鏈或重鏈亞組之所有人類抗體之共同序列的特定構架。該構架可以用於若干不同的人類化抗體(參見例如Nicholson等人, Mol. Immun. 34 (16-17): 1157-1165 (1997)；Carter等人, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 89:4285 (1992)；Presta等人, J. Immunol., 151:2623 (1993)，其內容以全文引用的方式併入本文中)。在一些實施例中，重鏈可變區之構架區，例如全部四個構架區係來源於V_H 4-4-59生殖系序列。在一個實施例中，該構架區可以例如在相應鼠類序列之胺基酸中包含一個、兩個、三個、四個或五個修飾，例如取代。在一些實施例中，輕鏈可變區之構架區，例如全部四個構架區係來源於VK3-1.25生殖系序列。在一個實施例中，該構架區可以例如在相應鼠類序列之胺基酸中包含一個、兩個、三個、四個或五個修飾，例如取代。

在一些態樣中，本發明之TFP組成物中包含抗體片段之部分經人類化，同時保持對目標抗原之高親和力及其他有利的生物特性。根據本發明之一個態樣，人類化抗體及抗體片段係藉由使用親本及人類化序列之三維模型分析親本序列及各種概念性人類化產物的方法來製備。三維免疫球蛋白模型通常係可得的且為熟習此項技術者所熟悉的。可用電腦程式說明並展示所選候選免疫球蛋白序列可能的三維構形結構。檢查該等展示允許分析殘基在候選免疫球蛋白序列功能中之可能作用，例如分析影響候選免疫球蛋白結合目標抗原之能力的殘基。以此方式，可以自接受體序列及輸入序列中選出FR殘基並組合，以獲得所希望之抗體或抗體片段特徵，諸如增加對目標抗原之親和力。一般而言，CDR殘基直接且最充分地參與影響抗原結合。

在一個態樣中，抗腫瘤相關抗原結合結構域係片段，例如單鏈可變片段(scFv)或駱駝重鏈V_H H)。在一個態樣中，抗腫瘤相關抗原結合結構域係Fv、Fab、(Fab’)₂ 或雙功能(例如雙特異性)雜合抗體(例如Lanzavecchia等人, Eur. J. Immunol. 17, 105 (1987))。在一個態樣中，本發明之抗體及其片段以野生型或增強之親和力結合腫瘤相關抗原蛋白。

本文亦提供用於獲得目標抗原(例如BCMA或本文別處關於融合物部分結合結構域之目標所描述的任何目標抗原)特異性抗體抗原結合結構域的方法，該方法包括藉由在本文所陳述之V_H (或V_H H)結構域胺基酸序列中添加、缺失、取代或插入一或多個胺基酸來提供作為該V_H 結構域之胺基酸序列變異體的V_H 結構域，視情況將由此提供的V_H 結構域與一或多個V_L 結構域組合，並測試V_H 結構域或者一或多個V_H /V_L 組合以鑑別對所關注之目標抗原(例如BCMA)具有特異性且視情況具有一或多種所希望之特性的特異性結合成員或抗體抗原結合結構域。

在一些情形中，V_H 結構域及scFv可以根據此項技術中已知之方法製備(參見例如Bird等人(1988) Science 242:423-426和Huston等人, (1988) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85:5879-5883)。scFv分子可以藉由使用可撓性多肽連接子連接V_H 區與V_L 區產生。scFv分子包含具有最佳長度及/或胺基酸組成的連接子(例如Ser-Gly連接子)。連接子長度會明顯影響scFv可變區摺疊及相互作用情況。事實上，若使用較短的多肽連接子(例如在5-10個胺基酸之間)，則防止鏈內摺疊。鏈間摺疊亦係使兩個可變區連在一起形成功能性抗原決定基結合位點所需的。在一些情形中，連接子序列包含(G₄ S)_n ，其中n=2至4 (SEQ ID NO: 101)。在一些情形中，連接子序列包含(G₄ S)_n ，其中n=1至3 (SEQ ID NO: 102)。關於連接子取向及大小之實例，參見例如Hollinger等人, 1993 Proc Natl Acad. Sci. U.S.A. 90:6444-6448；美國專利申請公開案第2005/0100543號、第2005/0175606號、第2007/0014794號；以及PCT公開案第WO2006/020258號及第WO2007/024715號，以引用之方式併入本文中。

scFv可以在其V_L 區與V_H 區之間包含約10、11、12、13、14、15或超過15個殘基之連接子。該連接子序列可以包含任何天然存在之胺基酸。在一些實施例中，該連接子序列包含胺基酸甘胺酸及絲胺酸。在另一實施例中，該連接子序列包含數組甘胺酸及絲胺酸重複序列，諸如(Gly₄ Ser)_n ，其中n係等於或大於1之正整數(SEQ ID NO: 109)。在一個實施例中，連接子可以為(Gly₄ Ser)₄ (SEQ ID NO: 104)或(Gly₄ Ser)₃ (SEQ ID NO: 105)。改變連接子長度可以保持或增強活性，由此在活性研究中產生優良功效。在一些情形中，連接子序列包含(G₄ S)_n ，其中n=2至4 (SEQ ID NO: 101)。在一些情形中，該連接子序列包含(G₄ S)_n ，其中n=1至3 (SEQ ID NO: 102)。3. 穩定性及突變

可以參照習知對照scFv分子或全長抗體之生物物理特性(例如熱穩定性)評價抗腫瘤相關抗原結合結構域，例如scFv分子(例如可溶性scFv)之穩定性。在一個實施例中，人類化或人類scFv在所描述之測定中的熱穩定性比親本scFv高約0.1℃、約0.25℃、約0.5℃、約0.75℃、約1℃、約1.25℃、約1.5℃、約1.75℃、約2℃、約2.5℃、約3℃、約3.5℃、約4℃、約4.5℃、約5℃、約5.5℃、約6℃、約6.5℃、約7℃、約7.5℃、約8℃、約8.5℃、約9℃、約9.5℃、約10℃、約11℃、約12℃、約13℃、約14℃或約15℃。

抗腫瘤相關抗原結合結構域，例如scFv的改善之熱穩定性隨後被賦予完整腫瘤相關抗原-TFP構築體，由此改善抗腫瘤相關抗原TFP構築體之治療特性。相較於習知抗體，抗腫瘤相關抗原結合結構域，例如scFv之熱穩定性可以有至少約2℃或3℃之改善。在一個實施例中，相較於習知抗體，抗腫瘤相關抗原結合結構域，例如scFv之熱穩定性有1℃之改善。在另一實施例中，相較於習知抗體，抗腫瘤相關抗原結合結構域，例如scFv之熱穩定性有2℃之改善。在另一實施例中，相較於習知抗體，scFv之熱穩定性有4℃、5℃、6℃、7℃、8℃、9℃、10℃、11℃、12℃、13℃、14℃或15℃之改善。比較可以例如在本文所揭示之scFv分子與作為scFv V_H 及V_L 來源之抗體的scFv分子或Fab片段之間進行。熱穩定性可以使用此項技術中已知之方法量測。舉例而言，在一個實施例中，可以量測T_M 。用於量測T_M 之方法以及測定蛋白質穩定性之其他方法於下文更詳細地描述。

scFv中之突變(經由可溶性scFv之人類化或直接突變誘發引起)改變scFv之穩定性且改善scFv及抗腫瘤相關抗原TFP構築體之總體穩定性。使用諸如T_M 、變性溫度及聚集溫度之類量測值來比較人類化scFv與鼠類scFv之穩定性。在一個實施例中，抗腫瘤相關抗原結合結構域，例如scFv包含至少一個由人類化過程產生之突變，由此突變之scFv賦予抗腫瘤相關抗原TFP構築體改善之穩定性。在另一實施例中，抗腫瘤相關抗原結合結構域，例如scFv包含至少1、2、3、4、5、6、7、8、9、10個由人類化過程引起之突變，由此突變之scFv賦予抗腫瘤相關抗原-TFP構築體改善之穩定性。

在一個態樣中，TFP之抗原結合結構域包含與本文所述之抗原結合結構域胺基酸序列同源的胺基酸序列，且該抗原結合結構域保持本文所述之抗腫瘤相關抗原抗體片段所希望之功能特性。在一個具體態樣中，本發明之TFP組成物包含抗體片段。在另一態樣中，該抗體片段包含scFv。

在各種態樣中，藉由修飾一個或兩個可變區(例如V_H 及/或V_L )內，例如一或多個CDR區內及/或一或多個構架區內的一或多個胺基酸殘基來對TFP之抗原結合結構域進行工程改造。在一個具體態樣中，本發明之TFP組成物包含抗體片段。在另一態樣中，該抗體片段包含scFv。

一般熟習此項技術者應瞭解，本發明之抗體或抗體片段可進一步修飾以使其胺基酸序列改變(例如相對於野生型)，但不改變所希望之活性。舉例而言，可以對該蛋白質進行額外核苷酸取代，由此在「非必需」胺基酸殘基處進行胺基酸取代。舉例而言，一個分子中之非必需胺基酸殘基可以經來自同一側鏈家族之另一胺基酸殘基置換。在另一實施例中，一連串胺基酸可以經結構類似但側鏈家族成員之次序及/或組成不同的序列置換，例如可以進行保守取代，其中胺基酸殘基經具有類似側鏈之胺基酸殘基置換。

具有類似側鏈之胺基酸殘基家族在此項技術中已有定義，包括鹼性側鏈(例如離胺酸、精胺酸、組胺酸)、酸性側鏈(例如天冬胺酸、麩胺酸)、不帶電荷極性側鏈(例如甘胺酸、天冬醯胺酸、麩醯胺酸、絲胺酸、蘇胺酸、酪胺酸、半胱胺酸)、非極性側鏈(例如丙胺酸、纈胺酸、白胺酸、異白胺酸、脯胺酸、苯丙胺酸、甲硫胺酸、色胺酸)、β-分支側鏈(例如蘇胺酸、纈胺酸、異白胺酸)及芳族側鏈(例如酪胺酸、苯丙胺酸、色胺酸、組胺酸)。

在兩個或兩個以上核酸或多肽序列之情形中，一致性百分比係指相同的兩個或兩個以上序列。當在比較窗或指定區內比較且對準以達到最大對應性時，如使用以下序列比較算法之一或藉由手動對準及目測檢查所量測，若兩個序列具有指定百分比之胺基酸殘基或核苷酸相同(例如在指定區內，或在未指定時在整個序列內具有60%一致性，視情況70%、71% 、72%、73%、74%、75%、76%、77%、78%、79%、80%、81%、82%、83%、84%、85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%一致性)，則兩個序列「實質上一致」。視情況，一致性存在於長度為至少約50個核苷酸(或10個胺基酸)之區域內，或更佳地存在於長度為100至500或1000或更多個核苷酸(或20、50、200或更多個胺基酸)之區域內。

為進行序列比較，典型地一個序列充當參考序列，以與測試序列相比較。當使用序列比較算法時，將測試序列及參考序列輸入電腦，必要時指定子序列座標，且指定序列算法程式參數。可以使用預設程式參數，或者可以指定替代性參數。接著，序列比較算法基於程式參數計算測試序列相對於參考序列之序列一致性百分比。供比較序列之對準方法係此項技術中熟知的。可以利用Smith及Waterman (1970) Adv. Appl. Math. 2:482c之局部同源算法；Needleman及Wunsch, (1970) J. Mol. Biol. 48:443之同源比對算法；Pearson及Lipman, (1988) Proc. Nat’l. Acad. Sci. USA 85:2444之相似性搜索方法；該等算法之電腦執行(Wisconsin Genetics軟體包中之GAP、BESTFIT、FASTA及TFASTA，Genetics Computer Group, 575 Science Dr., Madison, Wis)；或者人工對準及目測檢查(參見例如Brent等人, (2003) Current Protocols in Molecular Biology)，來進行供比較序列之最佳對準。適用於測定序列一致性及序列相似性百分比之算法的兩個實例係BLAST及BLAST 2.0算法，分別描述於Altschul等人, (1977) Nuc. Acids Res. 25:3389-3402；及Altschul等人, (1990) J. Mol. Biol. 215:403-410中。執行BLAST分析之軟體經由National Center for Biotechnology Information公開可得。

在一個態樣中，本發明涵蓋起始抗體或片段(例如scFv)胺基酸序列之修飾，該等修飾產生功能等效之分子。舉例而言，TFP中包含的抗腫瘤相關抗原結合結構域，例如scFv的V_H 或V_L 可經修飾以與抗腫瘤相關抗原結合結構域，例如scFv之起始V_H 或V_L 構架區保持至少約70%、71%、72%、73%、74%、75%、76%、77%、78%、79%、80%、81%、82%、83%、84%、85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%一致性。為了產生功能等效之分子，本發明涵蓋完整TFP構築體之修飾，例如在TFP構築體各種結構域之一或多個胺基酸序列中的修飾。TFP構築體可經修飾以與起始TFP構築體保持至少約70%、71%、72%、73%、74%、75%、76%、77%、78%、79%、80%、81%、82%、83%、84%、85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%一致性。4. 細胞外結構域

細胞外結構域可以來源於天然來源或重組來源。在該來源係天然來源之情況下，該結構域可以來源於任何蛋白質，而且特別是膜結合蛋白或跨膜蛋白。在一個態樣中，細胞外結構域能夠與跨膜結構域締合。特別適用於本發明中的細胞外結構域可以至少包括例如T細胞受體α、β或ζ鏈，或CD3ε、CD3γ或CD3δ，或在替代實施例中CD28、CD45、CD4、CD5、CD8、CD9、CD16、CD22、CD33、CD37、CD64、CD80、CD86、CD134、CD137、CD154的細胞外區域。5. 跨膜結構域

一般而言，TFP序列含有由單一基因組序列編碼的細胞外結構域及跨膜結構域。在替代性實施例中，TFP可以設計成包含與TFP細胞外結構域不同源之跨膜結構域。跨膜結構域可以包括與跨膜區鄰近的一或多個額外胺基酸，例如與作為跨膜蛋白來源之蛋白質之細胞外區域相連的一或多個胺基酸(例如細胞外區域之至少1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30個或更多個胺基酸)及/或與作為跨膜蛋白來源之蛋白質之細胞內區域相連的一或多個額外胺基酸(例如細胞內區域之1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30個或更多個胺基酸)。在一些情形中，跨膜結構域可包括細胞外區域之至少30、35、40、45、50、55、60個或更多個胺基酸。在一些情形中，跨膜結構域可包括細胞內區域之至少30、35、40、45、50、55、60個或更多個胺基酸。在一個態樣中，跨膜結構域係與所用TFP之其他結構域之一相連的跨膜結構域。在一些情形中，跨膜結構域可以經選擇或藉由胺基酸取代進行修飾以避免此類結構域結合至相同或不同表面膜蛋白之跨膜結構域，例如以使與受體複合物之其他成員的相互作用減到最少。在一個態樣中，跨膜結構域能夠與TFP T細胞表面上之另一TFP發生同二聚化。在一個不同態樣中，跨膜結構域之胺基酸序列可以經修飾或取代，由此使與該TFP中存在之天然結合搭配物之結合結構域的相互作用減到最少。

跨膜結構域可以來源於天然來源或重組來源。在該來源係天然來源之情況下，該結構域可以來源於任何膜結合蛋白或跨膜蛋白。在一個態樣中，跨膜結構域能夠向細胞內結構域進行信號傳導，只要TFP結合至目標。特別適用於本發明中之跨膜結構域可以至少包括例如T細胞受體α、β或ζ鏈、CD28、CD3ε、CD45、CD4、CD5、CD8、CD9、CD16、CD22、CD33、CD37、CD64、CD80、CD86、CD134、CD137、CD154之跨膜區。

在一些情形中，跨膜結構域可以經由鉸鏈，例如來自人類蛋白質之鉸鏈連接至TFP之細胞外區域，例如TFP之抗原結合結構域。舉例而言，在一個實施例中，鉸鏈可以為人類免疫球蛋白(Ig)鉸鏈，例如IgG4鉸鏈，或CD8a鉸鏈。6. 連接子

視情況，長度介於2與10個胺基酸之間的短寡肽或多肽連接子可以在TFP之跨膜結構域與細胞質區域之間形成連接。甘胺酸-絲胺酸雙鏈體提供特別適合之連接子。舉例而言，在一個態樣中，連接子包含胺基酸序列GGGGSGGGGS (SEQ ID NO: 116)。在一些實施例中，連接子係由核苷酸序列GGTGGCGGAGGTTCTGGAGGTGGAGGTTCC (SEQ ID NO: 111)編碼。7. 細胞質結構域

若TFP含有CD3γ、δ或ε多肽，則TFP之細胞質結構域可以包括細胞內信號傳導結構域；TCRα及TCRβ次單元一般沒有信號傳導結構域。細胞內信號傳導結構域一般引起引入了TFP之免疫細胞之至少一種正常效應功能的活化。術語「效應功能」係指細胞之特有功能。T細胞之效應功能可以例如為細胞溶解活性或輔助活性，包括細胞介素之分泌。因此，術語「細胞內信號傳導結構域」係指蛋白質中轉導效應功能信號並引導細胞執行特有功能的部分。儘管通常可以採用完整的細胞內信號傳導結構域，但在許多情況下，不必使用完整鏈。就使用細胞內信號傳導結構域之截短部分而言，可以使用此截短部分替代完整鏈，只要該截短部分轉導效應功能信號即可。因此，術語細胞內信號傳導結構域意圖包括足以轉導效應功能信號的細胞內信號傳導結構域之任何截短部分。

用於本發明之TFP中的細胞內信號傳導結構域之實例包括T細胞受體(TCR)及一起作用以在抗原受體接合後起始信號轉導之輔助受體的細胞質序列，以及該等序列之任何衍生物或變異體，及具有相同功能能力之任何重組序列。

已知由單獨TCR產生之信號不足以完全活化天然T細胞且需要二次信號及/或共刺激信號。因此，原生T細胞活化可以被認為係由兩類截然不同的細胞質信號傳導序列介導：經由TCR起始抗原依賴性初級活化之序列(初級細胞內信號傳導結構域)以及以不依賴於抗原之方式作用以提供二次或共刺激信號的序列(二級細胞質結構域，例如共刺激結構域)。

初級信號傳導結構域以刺激方式或以抑制性方式調控TCR複合物之初次活化。以刺激方式作用的初級細胞內信號傳導結構域可以含有信號傳導基元，稱為免疫受體酪胺酸活化基元(ITAM)。

特別適用於本發明中的含有ITAM之初級細胞質信號傳導序列的實例包括CD3ζ、FcRγ、FcRβ、CD3γ、CD3δ、CD3ε、CD5、CD22、CD79a、CD79b以及CD66d的該等信號傳導序列。在一個實施例中，本發明之TFP包含細胞內信號傳導結構域，例如CD3ε之初級信號傳導結構域。在一個實施例中，初級信號傳導結構域包含修飾之ITAM結構域，例如活性相較於天然ITAM結構域有所改變(例如增加或降低)的突變之ITAM結構域。在一個實施例中，初級信號傳導結構域包括含修飾之ITAM的初級細胞內信號傳導結構域，例如含優化及/或截短之ITAM的初級細胞內信號傳導結構域。在一個實施例中，初級信號傳導結構域包含一個、兩個、三個、四個或更多個ITAM基元。

TFP之細胞內信號傳導結構域包含CD3ζ信號傳導結構域本身，或者該結構域可以與可用於本發明之TFP情形中的任何其他所希望之細胞內信號傳導結構域組合。舉例而言，TFP之細胞內信號傳導結構域可以包含CD3ε鏈部分及共刺激信號傳導結構域。共刺激信號傳導結構域係指TFP中包含共刺激分子細胞內結構域之部分。共刺激分子係淋巴細胞針對抗原高效反應所需的除抗原受體或其配位體外的細胞表面分子。該等分子之實例包括CD27、CD28、4-1BB (CD137)、OX40、CD30、CD40、PD1、ICOS、淋巴細胞功能相關抗原-1 (LFA-1)、CD2、CD7、LIGHT、NKG2C、B7-H3及與CD83特異性結合之配位體，及類似物。舉例而言，經展示，CD27共刺激可在活體外增強人類TFP-T細胞之擴增、效應功能及存活，且在活體內加強人類T細胞存留時間及抗腫瘤活性(Song等人, Blood. 2012; 119(3):696-706)。

在本發明TFP之細胞質部分內的細胞內信號傳導序列可以按隨機或指定次序相互連接。視情況，長度在例如2與10個胺基酸之間(例如2、3、4、5、6、7、8、9或10個胺基酸)的短寡肽或多肽連接子可以在細胞內信號傳導序列之間形成連接。

在一個實施例中，可以使用甘胺酸-絲胺酸對作為適合連接子。在一個實施例中，可以使用單一胺基酸，例如丙胺酸、甘胺酸，作為適合連接子。

在一個態樣中，本文所描述的表現TFP之細胞還可包含第二TFP，例如包括針對例如相同目標(例如MUC16或MSLN)或不同目標(例如MUC16或MSLN)之不同抗原結合結構域的第二TFP在一個實施例中，當表現TFP之細胞包含兩種或兩種以上不同TFP時，該等不同TFP之抗原結合結構域可以使得該等抗原結合結構域不會彼此相互作用。舉例而言，表現第一及第二TFP之細胞可以具有呈例如片段形式(例如scFv)之第一TFP的抗原結合結構域，該抗原結合結構域不與該第二TFP之抗原結合結構域締合，例如該第二TFP之抗原結合結構域係V_HH 。

在另一態樣中，本文所述的表現TFP之細胞還可以表現另一劑，例如增強表現TFP之細胞之活性的劑。舉例而言，在一個實施例中，該劑可以為對抑制性分子進行抑制之劑。在一些實施例中，抑制性分子，例如PD1，可以降低表現TFP之細胞產生免疫效應反應的能力。抑制性分子之實例包括PD1、PD-L1、CTLA4、TIM3、LAG3、VISTA、BTLA、TIGIT、LAIR1、CD160、2B4及TGFRβ。在一個實施例中，對抑制性分子進行抑制之劑包含與向細胞提供陽性信號之第二多肽，例如本文所述之細胞內信號傳導結構域締合之第一多肽，例如抑制性分子。在一個實施例中，該劑包含第一多肽，例如抑制性分子，諸如PD1、LAG3、CTLA4、CD160、BTLA、LAIR1、TIM3、2B4及TIGIT，或該等分子中之任一個的片段(例如該等分子中之任一個之細胞外結構域的至少一部分)；以及第二多肽，即本文所述之細胞內信號傳導結構域(例如包含共刺激結構域(例如4-1BB、CD27或CD28，例如本文所描述)及/或初級信號傳導結構域(例如本文所述之CD3ζ信號傳導結構域)。在一個實施例中，該劑包含第一多肽PD1或其片段(例如PD1細胞外結構域之至少一部分)，以及第二多肽，即本文所述之細胞內信號傳導結構域(例如本文所述之CD28信號傳導結構域及/或本文所述之CD3ζ信號傳導結構域)。PD1係CD28受體家族之抑制性成員，該家族亦包括CD28、CTLA-4、ICOS及BTLA。PD-1在活化B細胞、T細胞及骨髓細胞上表現(Agata等人, 1996 Int. Immunol 8:765-75)。經顯示，PD1之兩個配位體PD-L1及PD-L2當結合至PD1時使T細胞活化下調(Freeman等人, 2000 J Exp Med 192:1027-34；Latchman等人, 2001 Nat Immunol 2:261-8；Carter等人, 2002 Eur J Immunol 32:634-43)。PD-L1在人類癌症中含量豐富(Dong等人, 2003 J Mol Med 81:281-7；Blank等人, 2005 Cancer Immunol. Immunother 54:307-314；Konishi等人, 2004 Clin Cancer Res 10:5094)。藉由抑制PD1與PD-L1之局部相互作用可以保持免疫抑制。

在一個實施例中，該劑包含抑制性分子之細胞外結構域(ECD)，例如計劃性死亡蛋白1 (PD1)可以與跨膜結構域以及視情況細胞內信號傳導結構域諸如41BB及CD3ζ融合(在本文中又稱為PD1 TFP)。在一個實施例中，PD1 TFP當與本文所述之抗腫瘤抗原TFP組合使用時，改善T細胞之存留時間。在一個實施例中，該TFP下包含PD 1細胞外結構域之PD1 TFP。或者，提供含有特異性結合至計劃性死亡配位體1(PD-L1)或計劃性死亡配位體2 (PD-L2)之抗體或抗體片段諸如scFv的TFP。

在另一態樣中，本發明提供表現TFP之T細胞(例如TFP-T細胞)群。在一些實施例中，該表現TFP之T細胞群包含表現不同TFP之細胞的混合物。舉例而言，在一個實施例中，該TFP-T細胞群可以包括：第一細胞，其表現具有本文所述之抗腫瘤相關抗原結合結構域的TFP；以及第二細胞，其表現具有不同抗腫瘤相關抗原結合結構域，例如不同於第一細胞所表現之TFP中之抗腫瘤相關抗原結合結構域的本文所述之抗腫瘤相關抗原結合結構域的TFP。作為另一個實施例，該TFP-T細胞群可以包括：第一細胞，其表現包括例如本文所述之抗腫瘤相關抗原結合結構域的TFP；以及第二細胞，其表現包括針對除腫瘤相關抗原外之目標(例如另一腫瘤相關抗原)之抗原結合結構域的TFP。

在另一態樣中，本發明提供一種細胞群，其中該細胞群中至少一個細胞表現具有本文所述之抗腫瘤相關抗原結構域的TFP，且另一細胞表現另一劑，例如增強表現TFP之細胞之活性的劑。舉例而言，在一個實施例中，該劑可以為對抑制性分子進行抑制之劑。在一些實施例中，抑制性分子例如可以降低表現TFP之細胞產生免疫效應反應的能力。抑制性分子之實例包括PD1、PD-L1、PD-L2、CTLA4、TIM3、LAG3、VISTA、BTLA、TIGIT、LAIR1、CD160、2B4及TGFRβ。在一個實施例中，對抑制性分子進行抑制之劑包含與向細胞提供陽性信號之第二多肽，例如本文所述之細胞內信號傳導結構域締合之第一多肽，例如抑制性分子。

本文揭示用於產生活體外轉錄的編碼TFP之RNA的方法。本發明亦包括編碼TFP之RNA構築體，其可以直接轉染至細胞中。產生用於轉染之mRNA的方法可以涉及在活體外轉錄(IVT)帶有專門設計之引子的模板，隨後添加多聚A，以產生含有3’及5’不轉譯序列(「UTR」)、5’帽及/或內部核糖體進入位點(IRES)、待表現之核酸以及長度典型地為50-2000個鹼基之多聚A尾的構築體(SEQ ID NO: 103)。由此產生的RNA可以高效地轉染不同種類之細胞。在一個態樣中，該模板包括TFP之序列。

在一個態樣中，抗腫瘤相關抗原TFP係由信使RNA (mRNA)編碼。在一個態樣中，將編碼抗腫瘤相關抗原TFP之mRNA引入T細胞中以產生TFP-T細胞。在一個實施例中，活體外轉錄之RNA TFP可以短暫轉染形式引入細胞中。該RNA係使用聚合酶鏈反應(PCR)產生之模板，藉由活體外轉錄而產生。來自任何來源的所關注DNA均可藉由PCR直接轉化成模板，以使用適當引子及RNA聚合酶在活體外合成mRNA。DNA之來源可以為例如基因組DNA、質體DNA、噬菌體DNA、cDNA、合成DNA序列或任何其他適當之DNA來源。適於活體外轉錄之模板係本發明之TFP。在一個實施例中，打算用於PCR之DNA含有開放閱讀框。該DNA可以來自生物體基因組的天然存在之DNA序列。在一個實施例中，核酸可以包括5’及/或3’不轉譯區(UTR)之一部分或全部。該核酸可以包括外顯子及內含子。在一個實施例中，打算用於PCR之DNA係人類核酸序列。在另一實施例中，打算用於PCR之DNA係包括5’及3’ UTR之人類核酸序列。該DNA可以替代地為通常不在天然存在之生物體中表現的人工DNA序列。例示性人工DNA序列係含有連接在一起形成編碼融合蛋白之開放閱讀框之基因部分的序列。連接在一起之DNA部分可以來自單一生物體或來自多種生物體。

使用PCR產生模板以在活體外轉錄用於轉染之mRNA。用於執行PCR的方法係此項技術中熟知的。用於PCR中之引子係設計成具有與用作PCR模板之DNA區域實質上互補的區域。如本文所使用，「實質上互補」係指在核苷酸序列中，引子序列中之大部分或所有鹼基皆互補，或者一或多個鹼基不互補，或錯配。實質上互補之序列能夠與預定DNA目標在用於PCR之黏接條件下黏接或雜交。引子可以設計成與DNA模板之任何部分實質上互補。舉例而言，引子可以設計成擴增核酸中通常在細胞中轉錄之部分(開放閱讀框)，包括5’及3’ UTR。引子亦可設計成擴增核酸中編碼所關注之特定結構域的一部分。在一個實施例中，引子係設計成擴增人類cDNA之編碼區，包括5’及3’ UTR之全部或部分。可用於PCR之引子可以藉由此項技術中熟知之合成方法產生。「正向引子」係位於待擴增DNA序列上游的含有與DNA模板上之核苷酸實質上互補之核苷酸區域的引子「上游」在本文中用於指相對於編碼股，位於待擴增DNA序列之5位。「反向引子」係位於待擴增DNA序列下游的含有與雙股DNA模板實質上互補之核苷酸區域的引子。「下游」在本文中用於指相對於編碼鏈，位於待擴增DNA序列之3’位。

可用於PCR之任何DNA聚合酶均可用於本文所揭示之方法中。試劑及聚合酶可購自眾多來源。

亦可使用能夠促進穩定性及/或轉譯效率之化學結構。RNA較佳地具有5’及3’ UTR。在一個實施例中，5’ UTR之長度在一個與3,000個核苷酸之間。打算添加至編碼區中的5’及3’ UTR序列之長度可以藉由不同方法改變，包括但不限於設計出黏接至不同UTR區域之PCR引子。使用此方法，一般熟習此項技術者可以改變在經轉錄RNA轉染後獲得最佳轉譯效率所需的5’及3’ UTR長度。

5’及3’ UTR可以為所關注核酸的天然存在之內源性5’及3’ UTR。或者，可以藉由將UTR序列併入正向及反向引子中或藉由任何其他模板修飾來添加並非所關注核酸之內源序列的UTR序列。使用並非所關注核酸之內源性UTR序列的UTR序列可用於改變RNA之穩定性及/或轉譯效率。舉例而言，已知3’ UTR序列中富含AU之元件可以降低mRNA之穩定性。因此，3’ UTR可以基於此項技術中熟知之UTR特性進行選擇或設計成增加轉錄之RNA的穩定性。

在一個實施例中，5’ UTR可以含有內源性核酸之Kozak序列。或者，當藉由如上文所述之PCR添加並非所關注核酸之內源序列的5’ UTR時，可以藉由添加該5’ UTR序列重新設計共同Kozak序列。Kozak序列可以增加某些RNA轉錄物之轉譯效率，但看來並非所有RNA皆需要該序列才能夠高效轉譯。需要Kozak序列之許多mRNA係此項技術中已知的。在其他實施例中，5’ UTR可以為RNA基因組在細胞中穩定的RNA病毒之5’ UTR。在其他實施例中，可以在3’或5’ UTR中使用各種核苷酸類似物以阻止外切核酸酶降解mRNA。

為了在不需要基因選殖情況下能由DNA模板合成RNA，轉錄啟動子應連接至DNA模板中待轉錄序列之上游。當將用作RNA聚合酶啟動子之序列添加至正向引子之5’端時，RNA聚合酶啟動子經併入PCR產物中，在待轉錄之開放閱讀框的上游。在一個較佳實施例中，啟動子係T7聚合酶啟動子，如本文別處所描述。其他有用的啟動子包括但不限於，T3及SP6 RNA聚合酶啟動子。T7、T3及SP6啟動子之共同核苷酸序列係此項技術中已知的。

在一個較佳實施例中，mRNA具有5’端帽及3’多聚(A)尾，由此決定核糖體結合、轉譯起始以及細胞中mRNA之穩定性。在環狀DNA模板，例如質體DNA上，RNA聚合酶產生不適於在真核細胞中表現的較長連接產物。在3’ UTR端處線性化的質體DNA轉錄產生正常大小的mRNA，該mRNA不能有效轉染真核細胞，即使它在轉錄之後進行聚腺苷酸化。

在線性DNA模板上，噬菌體T7 RNA聚合酶可以使轉錄物之3’端延伸超過模板之最後一個鹼基(Schenborn及Mierendorf, Nuc Acids Res., 13:6223-36 (1985)；Nacheva及Berzal-Herranz, Eur. J. Biochem., 270:1485-65 (2003)。

將多聚A/T鏈段整合至DNA模板中的習知方法係分子選殖。不過，整合至質體DNA中的多聚A/T序列可能使質體不穩定，由此導致自細菌細胞獲得的質體DNA模板通常大量摻雜有缺失及其他異常。這使得選殖程序不僅繁雜耗時，而且通常不可靠。此係允許構築含多聚A/T 3’鏈段之DNA模板的方法特別不希望選殖之原因。

轉錄DNA模板之多聚A/T區段可以在PCR期間，藉由使用含多聚T尾，諸如有100個T之尾(SEQ ID NO: 112) (大小可以為50-5000個T (SEQ ID NO: 113))之反向引子產生，或在PCR之後，藉由任何其他方法，包括但不限於DNA連接或活體外重組產生。多聚(A)尾亦使RNA穩定並減少其降解。一般而言，多聚(A)尾之長度與轉錄之RNA的穩定性呈正相關。在一個實施例中，多聚(A)尾係在100與5000個之間的腺苷(SEQ ID NO: 114)。

RNA之多聚(A)尾可以在活體外轉錄之後，使用多聚(A)聚合酶，諸如大腸桿菌多聚A聚合酶(E-PAP)進一步延伸。在一個實施例中，將多聚(A)尾之長度自100個核苷酸增加至在300與400個核苷酸之間將使RNA之轉譯效率增加約兩倍。另外，將不同化學基團連接至3’端亦可增加mRNA之穩定性。此連接可以含有修飾/人工核苷酸、適體及其他化合物。舉例而言，可以使用多聚(A)聚合酶將ATP類似物併入多聚(A)尾中。ATP類似物可以進一步增加RNA之穩定性。

5’帽亦使RNA分子穩定。在一個較佳實施例中，由本文所揭示之方法產生的RNA包括5’帽。5’帽係使用此項技術中已知且本文所描述之技術提供(Cougot等人, Trends in Biochem. Sci., 29:436-444 (2001)；Stepinski等人, RNA, 7:1468-95 (2001)；Elango等人, Biochim. Biophys. Res. Commun., 330:958-966 (2005))。

由本文所揭示之方法產生的RNA亦可含有內部核糖體進入位點(IRES)序列。IRES序列可以為起始不依賴於帽之核糖體與mRNA結合並促進轉譯起始的任何病毒序列、染色體序列或人工設計之序列。可以包括適於細胞電穿孔之任何溶質，該等溶質可以含有促進細胞滲透性及活力之因子，諸如糖、肽、脂質、蛋白質、抗氧化劑以及界面活性劑。

RNA可以使用多種不同之方法引入目標細胞中，例如可商購之方法，包括但不限於，電穿孔(Amaxa Nucleofector-II (Amaxa Biosystems, Cologne, Germany))、(ECM 830 (BTX) (Harvard Instruments, Boston, Mass.)或Gene Pulser II (BioRad, Denver, Colo.)、Multiporator (Eppendort, Hamburg Germany)、使用脂質轉染進行的陽離子脂質體介導之轉染、聚合物包覆、肽介導之轉染，或生物射彈粒子(biolistic particle)遞送系統，諸如「基因槍」 (參見例如Nishikawa等人, Hum Gene Ther., 12(8):861-70 (2001)。8. 編碼 TFP 之核酸構築體

本發明亦提供編碼一或多種本文所述之TFP構築體的核酸分子。在一個態樣中，該核酸分子係以信使RNA轉錄物之形式提供。在一個態樣中，該核酸分子係以DNA構築體之形式提供。

編碼所希望分子之核酸序列可以使用此項技術中已知之重組方法獲得，諸如藉由篩選由表現該基因之細胞構成的文庫；藉由自已知包括該基因之載體得到該基因；或藉由使用標準技術直接自含有該基因之細胞及組織分離。或者，可以藉由合成而非選殖產生所關注基因。

本發明亦提供插入本發明之DNA的載體。來源於諸如慢病毒之類逆轉錄病毒的載體係實現長期基因轉移之適合工具，因為該等載體能夠長期、穩定地整合轉殖基因並在其子代細胞中繁殖。相對於來源於致癌逆轉錄病毒諸如鼠類白血病病毒之載體，慢病毒載體之附加益處在於，該等載體可以轉導非增殖性細胞，諸如肝細胞。該等載體還具有低免疫原性之附加益處。

在另一實施例中，包含編碼所需本發明TFP之核酸的載體係腺病毒載體(A5/35)。在另一實施例中，編碼TFP之核酸可以使用轉座子，諸如sleeping beauty、crisper、CAS9及鋅指核酸酶進行表現(參見例如June等人, 2009 Nature Reviews Immunol. 9.10: 704-716，以引用之方式併入本文中)。

亦可使用本發明之表現構築體，使用標準基因遞送方案進行核酸免疫接種及基因療法。基因遞送方法係此項技術中已知的(參見例如美國專利第5,399,346號、第5,580,859號、第5,589,466號，以全文引用的方式併入本文中)。在另一實施例中，本發明提供基因療法載體。

可以將核酸選殖至多種類型之載體中。舉例而言，可以將核酸選殖至載體中，包括但不限於質體、噬菌粒、噬菌體衍生物、動物病毒及黏接質體。特別值得關注的載體包括表現載體、複製載體、探針產生載體及測序載體。

另外，表現載體可以呈病毒載體形式提供至細胞中。病毒載體技術係此項技術中熟知的且描述於例如Sambrook等人, 2012, Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 第1-4卷, Cold Spring Harbor Press, NY)以及其他病毒學及分子生物學手冊中。可用作載體之病毒包括但不限於，逆轉錄病毒、腺病毒、腺相關病毒、疱疹病毒及慢病毒。一般而言，適合的載體含有在至少一種生物體中起作用之複製起點、啟動子序列、便利限制性內切核酸酶位點，以及一或多種選擇性標記物(例如WO 01/96584、WO 01/29058，以及美國專利第6,326,193號)。

已開發出多種病毒類系統用於將基因轉移至哺乳動物細胞中。舉例而言，逆轉錄病毒為基因遞送系統提供一個適宜的平台。所選基因可以使用此項技術中已知之技術插入載體中並包裝於逆轉錄病毒粒子中。重組病毒接著可以經分離並在活體內或離體遞送至受試者之細胞中。此項技術中已知多種逆轉錄病毒系統。在一些實施例中，使用腺病毒載體。此項技術中已知多種腺病毒載體。在一個實施例中，使用慢病毒載體。

其他的啟動子元件，例如增強子，調控轉錄起始之頻率。典型地，該等元件均位於起始位點上游30-110 bp之區域中，不過，經顯示，很多啟動子還在起始位點之下游含有功能元件。啟動子元件之間的間距通常很靈活，因此當各元件相對於彼此倒轉或移動時，啟動子之功能得到保持。在胸苷激酶(tk)啟動子中，啟動子元件之間的間距在活性開始下降前可以增加至間隔50 bp。取決於啟動子，看來個別元件可以協同或獨立作用以活化轉錄。

能夠在哺乳動物T細胞中表現TFP轉殖基因之啟動子的實例係EF1a啟動子。天然的EF1a啟動子驅動伸長因子-1複合物α次單元之表現，該複合物負責將胺醯基tRNA經酶遞送至核糖體中。EF1a啟動子已廣泛用於哺乳動物表現質體中，且經顯示，該啟動子可有效驅動選殖至慢病毒載體中之轉殖基因表現TFP(參見例如Milone等人, Mol. Ther. 17(8): 1453-1464 (2009))。啟動子之另一個實例係立即早期巨細胞病毒(CMV)啟動子序列。該啟動子序列係能夠驅動與其可操作地連接的任何聚核苷酸序列高水準表現的強組成性啟動子序列。不過，亦可使用其他組成性啟動子序列，包括但不限於猿猴病毒40 (SV40)早期啟動子、小鼠乳腺腫瘤病毒(MMTV)、人免疫缺陷病毒(HIV)長末端重複(LTR)啟動子、MoMuLV啟動子、禽白血病病毒啟動子、愛-巴二氏病毒(Epstein-Barr virus)立即早期啟動子、勞斯肉瘤病毒啟動子，以及人類基因啟動子，諸如但不限於肌動蛋白啟動子、肌球蛋白啟動子、伸長因子-1a啟動子、血紅蛋白啟動子以及肌酸激酶啟動子。另外，本發明不應侷限於組成性啟動子的使用。亦涵蓋誘導性啟動子作為本發明之一部分。誘導性啟動子之使用提供一個分子開關，該分子開關能夠在希望該啟動子可操作地連接的聚核苷酸表現時開啟此表現，或在不希望表現時關閉該表現。誘導性啟動子之實例包括但不限於金屬硫蛋白啟動子、糖皮質激素啟動子、孕酮啟動子及四環素調控之啟動子。

為了評估TFP多肽或其部分之表現，打算引入細胞中的表現載體亦可含有選擇性標記物基因或報告子基因或兩者，以幫助自打算用病毒載體轉染或感染之細胞群中鑑別及選出表現細胞。在其他態樣中，選擇性標記物可以攜帶於獨立DNA片段上並用於共轉染程序中。選擇性標記物及報告子基因均可側接適當的調控序列以便能在宿主細胞中表現。有用的選擇性標記物包括例如抗生素抗性基因，諸如neo及類似基因。

報告子基因係用於鑑別可能經轉染之細胞以及評價調控序列之功能。一般而言，報告子基因係不存在於接受體生物體或組織中或由接受體生物體或組織表現的基因，且該基因編碼之多肽的表現係藉由一些容易偵測之特性，例如酶活性表現出來。報告子基因的表現係在DNA引入接受體細胞中之後的適合時間檢定。適合報告子基因可以包括編碼螢光素酶、β-半乳糖苷酶、氯黴素乙醯轉移酶、分泌型鹼性磷酸酶之基因或綠色螢光蛋白基因(例如Ui-Tei等人, 2000 FEBS Letters 479: 79-82)。適合表現系統係眾所周知的且可以使用已知技術製備或在市面上獲得。一般而言，將帶有最小5’側接區且顯示最高報告子基因表現水準之構築體鑑別為啟動子。此類啟動子區可以連接至報告子基因且用於評價能夠調節啟動子驅動之轉錄的劑。

將基因引入細胞中並進行表現之方法係此項技術中已知的。在表現載體之情況下，該載體可以藉由此項技術中之任何方法容易地引入宿主細胞，例如哺乳動物、細菌、酵母或昆蟲細胞中。舉例而言，表現載體可以藉由物理、化學或生物方式轉移至宿主細胞中。

用於將聚核苷酸引入宿主細胞中之物理方法包括磷酸鈣沈澱法、脂質轉染法、粒子轟擊法、顯微注射法、電穿孔法及類似方法。用於產生包含載體及/或外源性核酸之細胞的方法係此項技術中熟知的(參見例如Sambrook等人, 2012, Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 第1-4卷, Cold Spring Harbor Press, NY)。用於將聚核苷酸引入宿主細胞中的一種方法係磷酸鈣轉染法。

用於將所關注聚核苷酸引入宿主細胞中之生物方法包括使用DNA及RNA載體。病毒載體，尤其是逆轉錄病毒載體，已經成為將基因插入哺乳動物，例如人類細胞中的最常用方法。其他病毒載體可以來源於慢病毒、痘病毒、單純疱疹病毒I、腺病毒及腺相關病毒及類似物(參見例如美國專利第5,350,674號及第5,585,362號)。

用於將聚核苷酸引入宿主細胞中的化學方式包括膠體分散系統，諸如大分子複合物、奈米膠囊、微球、珠粒以及基於脂質之系統，包括水包油乳液、微胞、混合微胞及脂質體。在活體外及活體內用作遞送媒劑之例示性膠體系統係脂質體(例如人工膜囊泡)。現有技術靶向遞送核酸之其他方法係可用的，諸如用靶向奈米粒子或其他適合的亞微米大小之遞送系統遞送聚核苷酸。

在利用非病毒遞送系統之情況下，例示性遞送媒劑係脂質體。涵蓋使用脂質體調配物將核酸引入宿主細胞中(活體外、離體或活體內)。在另一態樣中，核酸可以與脂質締合。與脂質締合之核酸可以經包封於脂質體之水性內部中、散佈於脂質體之脂質雙層內、經由同時與脂質體及寡聚核苷酸締合之連接分子連接至脂質體、包埋於脂質體中、與脂質體形成複合物、分散於含有脂質之溶液中、與脂質混合、與脂質組合、包含在脂質中呈懸浮液形式、包含在微胞中或與微胞形成複合物，或以其他方式與脂質締合。脂質、脂質/DNA或脂質/表現載體相關組成物不限於在溶液中之任何特定結構。舉例而言，其可以存在於雙層結構中、呈微胞形式，或具有「塌縮」之結構。其亦可簡單地散佈於溶液中，可能形成大小或形狀不均一的聚集體。脂質係脂肪物質，其可以為天然存在或合成的脂質。舉例而言，脂質包括天然存在於細胞質中之脂肪小滴，以及含有長鏈脂肪烴及其衍生物，諸如脂肪酸、醇、胺、胺基醇及醛的化合物類別。

適合使用的脂質可以自商業來源獲得。舉例而言，二棕櫚醯基磷脂醯膽鹼(「DMPC」)可以自Sigma(St. Louis, Mo.)獲得；磷酸二鯨蠟酯(「DCP」)可以自K & K Laboratories (Plainview, N.Y.)獲得；膽固醇(「Choi」)可以自Calbiochem-Behring獲得；二棕櫚醯基磷脂醯甘油(「DMPG」)及其他脂質可以自Avanti Polar Lipids, Inc. (Birmingham, Ala.)獲得。脂質於氯仿或氯仿/甲醇中之儲備液可以在約-20℃儲存。氯仿因比甲醇更易蒸發而被用作唯一溶劑。「脂質體」係涵蓋藉由產生封閉之脂質雙層或聚集體所形成的多種單層及多層脂質媒劑的通用術語。脂質體之特徵可在於具有含磷脂雙層膜及內部水性介質的囊泡結構。多層脂質體具有由水性介質分隔之多個脂質層。其係在磷脂懸浮於過量水溶液中時自發形成的。脂質組分經歷自我重排，隨後形成密閉結構並將水及溶解之溶質截留在脂質雙層之間(Ghosh等人, 1991 Glycobiology 5: 505-10)。不過，亦涵蓋在溶液中之結構不同於正常囊泡結構的組成物。舉例而言，脂質可以呈現微胞結構或僅以不均一脂質分子聚集體形式存在。還涵蓋脂轉染胺(lipofectamine)-核酸複合物。

不管用於將外源性核酸引入宿主細胞或以其他方式使細胞暴露於本發明抑制劑的方法如何，為了確定宿主細胞中重組DNA序列之存在，可以進行多種檢定。此類檢定包括例如熟習此項技術者熟知的「分子生物學」檢定，諸如南方(Southern)墨點法及北方墨點法(Northern blotting)、RT-PCR及PCR；「生物化學」檢定，如例如藉由免疫方式(ELISA及西方墨點法(western blot))，或藉由本文所描述的用於鑑別在本發明範圍內之劑的檢定偵測特定肽之存在或不存在。

本發明進一步提供一種載體，該載體包含編碼TFP之核酸分子。在一個態樣中，TFP載體可以直接轉導至細胞，例如T細胞中。在一個態樣中，載體係選殖或表現載體，例如包括但不限於一或多種質體(例如表現質體、選殖載體、小環分子、微型載體、雙微染色體)、逆轉錄病毒及慢病毒載體構築體的載體。在一個態樣中，載體能夠在哺乳動物T細胞中表現TFP構築體。在一個態樣中，哺乳動物T細胞係人類T細胞。9. T 細胞源

在進行擴增及基因修飾之前，自受試者獲得T細胞源。術語「受試者」意圖包括能夠被引起免疫反應之活生物體(例如哺乳動物)。受試者之實例包括人類、犬、貓、小鼠、大鼠及其轉殖基因物種。T細胞可以自多種來源獲得，包括末梢血單核細胞、骨髓、淋巴結組織、臍血、胸腺組織、來自感染部位之組織、腹水、胸膜積液、脾組織及腫瘤。在本發明之某些態樣中，可以使用此項技術中可得到的多種T細胞株。在本發明之某些態樣中，T細胞可以使用熟練技術人員已知之多種技術，諸如Ficoll^TM 分離法自受試者收集的一單位血液獲得。在一個較佳態樣中，藉由析離術自個體之循環血獲得細胞。析離術產物典型地含有淋巴細胞，包括T細胞、單核細胞、粒細胞、B細胞、其他有核白細胞、紅細胞及血小板。在一個態樣中，可以對藉由析離術收集的細胞進行洗滌以去除血漿部分並將細胞放入適當緩衝液或介質中用於後續加工步驟。在本發明之一個態樣中，用磷酸鹽緩衝生理食鹽水(PBS)洗滌細胞。在一個替代性態樣中，洗滌溶液不含鈣且可以不含鎂或可以不含許多(若非完全不含)二價陽離子。在無鈣存在下的初始活化步驟可以引起活化放大。一般熟習此項技術者應易於理解，洗滌步驟可以藉由熟習此項技術者已知之方法實現，諸如根據製造商之說明書，使用半自動「流通」離心管(例如COBE® 2991細胞處理器、Baxter CytoMate®或Haemonetics® Cell Saver® 5)實現。洗滌後，可以將細胞再懸浮於多種生物相容性緩衝液，諸如無鈣、無鎂PBS、PlasmaLyte® A，或者含或不含緩衝劑之其他生理食鹽水溶液中。或者，可以去除析離術樣品中不想要的組分並將細胞直接再懸浮於培養基中。

在一個態樣中，藉由將紅細胞溶解並例如經PERCOLL^TM 梯度離心或逆流離心淘選耗盡單核細胞，自末梢血液淋巴細胞分離出T細胞。特定T細胞亞群，諸如CD3+、CD28+、CD4+、CD8+、CD45RA+及CD45RO+ T細胞可以藉由陽性或陰性選擇技術進一步分離。舉例而言，在一個態樣中，T細胞藉由與抗CD3/抗CD28(例如3×28)結合珠粒，諸如DYNABEADS^TM M-450 CD3/CD28 T一起培育一段足以對所希望之T細胞進行陽性選擇的時間來分離。在一個態樣中，該時間段係約30分鐘。在另一態樣中，該時間段在30分鐘至36小時或更長以及其間任何整數值之範圍內。在另一態樣中，該時間段係至少1、2、3、4、5或6小時。在又另一較佳態樣中，該時間段係10至24小時。在一個態樣中，培育時間段係24小時。在T細胞比其他細胞類型少的任何情況下，諸如在自腫瘤組織或自免疫力低下之個體分離腫瘤浸潤淋巴細胞(TIL)時，可以使用較長培育時間來分離T細胞。另外，使用較長培育時間可以增加捕捉CD8+ T細胞之效率。因此，藉由簡單地縮短或延長使T細胞能夠結合至CD3/CD28珠粒之時間及/或藉由增加或減小珠粒與T細胞之比率(如本文另外描述)，可以在培養起始或該過程期間之其他時間點關於或針對T細胞亞群進行優先選擇。另外，藉由增加或減小珠粒或其他表面上抗CD3及/或抗CD28抗體之比率，可以在培養起始或其他所希望的時間點關於或針對T細胞亞群進行優先選擇。熟練技術人員將認識到，在本發明之情況下亦可使用多輪選擇。在某些態樣中，可能希望執行選擇程序且在活化及擴增過程中使用「未選擇」之細胞。「未選擇」之細胞亦可再經歷其他數輪選擇。

藉由陰性選擇來富集T細胞群可以用針對陰性選擇之細胞獨有之表面標記物的抗體組合實現。一種方法係經由負磁性免疫吸附或流式細胞測量術進行的細胞分選及/或選擇，該方法使用針對陰性選擇之細胞上存在之細胞表面標記物的單株抗體混合液。舉例而言，為了能藉由陰性選擇富集CD4+細胞，單株抗體混合液典型地包括針對CD14、CD20、CD11b、CD16、HLA-DR及CD8之抗體。在某些態樣中，可能希望富集或陽性選擇典型地表現CD4+、CD25+、CD62Lhi、GITR+及FoxP3+之調節T細胞。或者，在某些態樣中，藉由抗C25結合珠粒或其他類似選擇方法耗盡T調節細胞。

在一個實施例中，可以選出表現以下一或多種之T細胞群：IFN-γ、TNF-α、IL-17A、IL-2、IL-3、IL-4、GM-CSF、IL-10、IL-13、顆粒酶B及穿孔素，或其他適當的分子，例如其他細胞介素。針對細胞表現進行篩選之方法可以例如藉由PCT公開案第WO 2013/126712號中所描述之方法確定。

對於藉由陽性或陰性選擇來分離所希望之細胞群，細胞濃度及表面(例如粒子，諸如珠粒)可以變化。在某些態樣中，可能希望明顯減小珠粒與細胞混合在一起的體積(例如增加細胞濃度)以確保細胞與珠粒的最大接觸。舉例而言，在一個態樣中，使用2×10⁹ 個細胞/毫升之濃度。在一個態樣中，使用1×10⁹ 個細胞/毫升之濃度。在又一態樣中，使用超過1×10⁸ 個細胞/毫升。在又一態樣中，使用10、15、20、25、30、35、40、45或50×10⁶ 個細胞/毫升的濃度。在另一態樣中，使用75、80、85、90、95或100×10⁶ 個細胞/毫升之濃度。在其他態樣中，使用125或150×10⁶ 個細胞/毫升之濃度。使用較高濃度可以引起細胞產率增加、細胞活化及細胞擴增。另外，使用較高細胞濃度允許更高效地捕捉可能較弱地表現所關注目標抗原之細胞，諸如CD28陰性T細胞，或自存在許多腫瘤細胞之樣品(例如白血病之血液、腫瘤組織等)捕捉細胞。此類細胞群可能具有治療價值且係希望獲得的。舉例而言，使用較高細胞濃度允許更高效地選擇通常具有較弱CD28表現的CD8+ T細胞。

在一個相關態樣中，可能希望使用較低的細胞濃度。藉由明顯稀釋T細胞與表面(例如粒子，諸如珠粒)之混合物，使粒子與細胞之間的相互作用減到最小。由此選出表現大量有待結合至粒子之所需抗原的細胞。舉例而言，相較於CD8+ T細胞，在較稀濃度下，CD4+ T細胞高水準表現CD28且更高效地被捕捉。在一個態樣中，所用細胞之濃度係5×10⁶ 個/毫升。在其他態樣中，所用濃度可以為約1×10⁵ 個/毫升至1×10⁶ 個/毫升，及其間任何整數值。在其他態樣中，細胞可以在2-10℃或在室溫下，在旋轉器上以不同速度培育不同時間長度。

供刺激用的T細胞亦可在洗滌步驟之後冷凍。不希望受理論束縛，冷凍及後續解凍步驟藉由去除細胞群中的粒細胞以及在一定程度上去除單核細胞而提供更均一的產物。在洗滌步驟去除血漿及血小板之後，可以將細胞懸浮於冷凍溶液中。此項技術中已知許多冷凍溶液及參數且均可用於此情形中，而一種方法涉及使用含20% DMSO及8%人血清白蛋白之PBS，或含10%葡聚糖40及5%右旋糖、20%人血清白蛋白及7.5% DMSO，或31.25% Plasmalyte-A、31.25%右旋糖5%、0.45% NaCl、10%葡聚糖40及5%右旋糖、20%人血清白蛋白及7.5% DMSO的培養基，或含有例如Hespan®及PlasmaLyte® A之其他適合細胞冷凍介質，細胞接著以1℃/分鐘的速率冷凍至-80℃並儲存於液氮儲罐之氣相中。可以使用其他控制性冷凍方法以及在-20℃或液氮中不受控制地急速冷凍。在某些態樣中，將低溫保存之細胞解凍並如本文所描述進行洗滌，並使其在室溫下保持一小時，隨後使用本發明之方法活化。

在本發明之上下文中還涵蓋在可能需要如本文所述之擴增細胞之前一段時間，自受試者收集血液樣品或析離術產物。因此，待擴增細胞之來源可以在任何所需時間點收集，並將所希望之細胞，諸如T細胞分離並冷凍以便稍後用於針對多種疾病或病況之T細胞療法中，該等疾病或病況將得益於T細胞療法，諸如本文所描述之疾病或病況。在一個態樣中，血液樣品或單採血液成分係自大體上健康之受試者取得。在某些態樣中，血液樣品或單採血液成分係自有發生疾病之風險但尚未發展該疾病的大體上健康之受試者取得，且分離所關注細胞並冷凍待用。在某些態樣中，T細胞可以經擴增、冷凍並在稍後時間使用。在某些態樣中，在如本文所述診斷出特定疾病之後不久但在進行任何治療之前自患者收集樣品。在另一態樣中，細胞係在多種相關治療措施之前自來自受試者的血液樣品或單採血液成分分離，該等治療措施包括但不限於用諸如那他珠單抗(natalizumab)、依法珠單抗(efalizumab)之類劑、抗病毒劑、化學療法、放射、免疫抑制劑諸如環孢黴素(cyclosporin)、硫唑嘌呤(azathioprine)、甲胺蝶呤(methotrexate)、黴芬酸酯(mycophenolate)及他克莫司(tacrolimus)(FK506)、抗體，或其他免疫消融劑諸如CAMPATH、抗CD3抗體、環磷醯胺、氟達拉濱(fludarabine)、環孢黴素、雷帕黴素(rapamycin)、黴芬酸、類固醇、羅米地辛(romidepsin)(先前稱為FR901228)，以及照射治療。

在本發明之另一態樣中，T細胞係在向受試者投與功能性T細胞的治療之後立即自患者獲得。就這一點而言，據觀察在某些癌症治療之後，特別是在用破壞免疫系統之藥物治療之後，在治療後不久且患者自治療正常恢復期間，所獲得的T細胞之品質可能為最佳的或其離體擴增之能力得到改善。同樣，在使用本文所述之方法離體操作時，該等細胞可以處於移植增強及活體內擴增之較佳狀態。因此，在本發明之情形內涵蓋在此恢復期間收集血液細胞，包括T細胞、樹突狀細胞或造血細胞系之其他細胞。另外，在某些態樣中，可以使用調動(例如用GM-CSF調動)及調理方案在受試者體內建立有利於特定細胞類型再增殖、再循環、再生及/或擴增之條件，尤其是在治療之後的指定時間範圍內。示例性細胞類型包括T細胞、B細胞、樹突狀細胞以及其他免疫系統細胞。10. T 細胞活化及擴增

T細胞可以大體上使用例如美國專利第6,352,694號、第6,534,055號、第6,905,680號、第6,692,964號、第5,858,358號、第6,887,466號、第6,905,681號、第7,144,575號、第7,067,318號、第7,172,869號、第7,232,566號、第7,175,843號、第5,883,223號、第6,905,874號、第6,797,514號、第6,867,041號；以及美國專利申請公開案第20060121005號中所描述之方法活化及擴增。

一般而言，本發明之T細胞可以藉由接觸連接有刺激CD3/TCR複合物相關信號之劑及刺激T細胞表面上之共刺激分子之配位體的表面來進行擴增。確切地說，可以如本文所述，諸如藉由接觸固定在表面上的抗CD3抗體或其抗原結合片段，或抗CD2抗體，或藉由接觸蛋白質激酶C活化劑(例如苔蘚抑素)與鈣離子載體來刺激T細胞群。對於共刺激T細胞表面上之輔助分子，使用結合該輔助分子之配位體。舉例而言，可以使T細胞群與抗CD3抗體及抗CD28抗體在適於刺激T細胞增殖之條件下接觸。為了刺激CD4+ T細胞或CD8+ T細胞增殖，使用抗CD3抗體及抗CD28抗體。抗CD28抗體的實例包括9.3、B-T3，可以使用XR-CD28 (Diaclone, Besancon, France)以及此項技術中通常所瞭解的其他方法(Berg等人, Transplant Proc. 30(8):3975-3977, 1998；Haanen等人, J. Exp. Med. 190(9):13191328, 1999；Garland等人, J. Immunol. Meth. 227(1-2):53-63, 1999)。

暴露不同刺激時間之T細胞可以展現不同的特徵。舉例而言，典型的血液或單採血液成分得到的末梢血單核細胞產物具有的輔助T細胞群(TH, CD4+)多於細胞毒性或抑制性T細胞群(TC, CD8+)。藉由刺激CD3及CD28受體離體擴增T細胞產生這樣一種T細胞群，該細胞群在約第8-9天前主要由TH細胞組成，而在約第8-9天之後，該T細胞群包含大量增加之TC細胞群。因此，取決於治療目的，向受試者輸注主要包含TH細胞之T細胞群可能為有利的。類似地，若分離出抗原特異性TC細胞亞群，則可能有利於此亞群擴增達到較高程度。

另外，除CD4及CD8標記物外，其他表型標記物明顯不同，但在較大程度上，在細胞擴增過程期間可再現。因此，此再現性使得能針對特定目的定製活化之T細胞產物。

一旦構築出抗腫瘤相關抗原TFP，即可使用多種檢定評價該分子之活性，諸如但不限於，在抗原刺激後擴增T細胞、在無再刺激存在下持續T細胞擴增之能力，以及在適當活體外及動物模型中之抗癌活性。評價抗腫瘤相關抗原TFP之作用的檢定將於下文更詳細地描述。

可以針對原代T細胞中之TFP表現使用西方墨點分析以偵測單體及二聚體之存在(參見例如Milone等人, Molecular Therapy 17(8): 1453-1464 (2009))。簡言之，在活體外擴增表現TFP之T細胞(CD4⁺ T細胞與CD8⁺ T細胞之1:1混合物)超過10天，隨後溶解並在還原條件下進行SDS-PAGE。使用針對TCR鏈之抗體，藉由西方墨點法偵測TFP。使用該等T細胞亞群在非還原條件下進行SDS-PAGE分析以評價共價二聚體之形成。

TFP⁺ T細胞在抗原刺激後之活體外擴增情況可以用流式細胞測量術量測。舉例而言，用αCD3/αCD28及APC刺激CD4⁺ T細胞與CD8⁺ T細胞之混合物，隨後用在待分析啟動子控制下表現GFP之慢病毒載體轉導。例示性啟動子包括CMV IE基因、EF-1α、泛素C或甘油磷酸激酶(PGK)啟動子。在培養第6天，利用流式細胞測量術評價CD4+及/或CD8+ T細胞亞群中之GFP螢光(參見例如Milone等人, Molecular Therapy 17(8): 1453-1464 (2009))。或者，在第0天利用塗有αCD3/αCD28之磁珠刺激CD4+和CD8+ T細胞混合物，並在第1天，使用表現TFP及eGFP之雙順反子慢病毒載體，利用2A核糖體跳躍序列，用TFP進行轉導。

亦可測量在無再刺激存在下TFP+ T細胞之持續擴增情況(參見例如Milone等人, Molecular Therapy 17(8):1453-1464 (2009))。簡言之，在第0天用塗有αCD3/αCD28之磁珠刺激並在第1天用指定TFP轉導之後，在培養第8天，使用Coulter Multisizer III粒子計數器量測平均T細胞容積(fl)。

亦可使用動物模型量測TFP-T活性。舉例而言，使用人類BCMA特異性TFP+ T細胞治療免疫缺陷小鼠之癌症的異種移植模型(參見例如Milone等人, Molecular Therapy 17(8): 1453-1464 (2009))。簡言之，在確定癌症之後，將小鼠隨機分入治療組。將不同數量的工程改造之T細胞以1:1比率共注射至帶有癌症之NOD/SCID/γ-/-小鼠中。在T細胞注射後的各種時間點，評價來自小鼠之脾DNA中每個載體之複本數。每週評估動物之癌症。量測經注射α腫瘤相關抗原-ζ TFP+ T細胞或模擬轉導之T細胞的小鼠中末梢血液腫瘤相關抗原+癌細胞數量。使用對數秩檢驗比較各組的存活率曲線。此外，亦可在T細胞注射後4週，分析NOD/SCID/γ-/-小鼠中之絕對末梢血液CD4+和CD8+ T細胞數量。對小鼠注射癌細胞並在3週後，注射經編碼連接至eGFP之TFP的雙順反子慢病毒載體工程改造成表現TFP的T細胞。T細胞藉由與模擬轉導之細胞混合，隨後注射而正規化至45-50%輸入GFP+ T細胞，並利用流式細胞測量術確定。以1週之時間間隔評估動物之癌症。使用對數秩檢驗比較TFP+ T細胞組之存活率曲線。

可以評價劑量依賴性TFP治療反應(參見例如Milone等人, Molecular Therapy 17(8):1453-1464 (2009))。舉例而言，在確定癌症之後35-70天，自第21天注射TFP T細胞、等量模擬轉導之T細胞或未注射T細胞的小鼠獲得末梢血液。對來自各組之小鼠隨機抽血以測定末梢血液+癌細胞數量，接著在第35天及第49天將其殺死。在第57天及第70天評價其餘動物。

先前例如在Milone等人, Molecular Therapy 17(8): 1453-1464 (2009)中已描述有關細胞增殖及細胞介素產生之評估。簡言之，在微量滴定盤中，藉由將洗滌過的T細胞與表現BCMA或CD32及CD137之細胞(KT32-BBL)以2:1的最終T細胞:表現BCMA之細胞比率混合來評估TFP介導之增殖情況。在使用前，用γ放射線照射表現BCMA之細胞。將抗CD3(純系OKT3)及抗CD28(純系9.3)單株抗體添加至含KT32-BBL細胞之培養物中以用作刺激T細胞增殖之陽性對照物，因為該等信號支持長期離體CD8+ T細胞擴增。根據製造商之描述，使用CountBright^TM 螢光珠粒(Invitrogen)及流式細胞測量術對培養物中之T細胞進行計數。使用經表現eGFP-2A連接之TFP的慢病毒載體工程改造之T細胞，藉由GFP表現來鑑別TFP+ T細胞。對於不表現GFP之TFP+ T細胞，用生物素化重組BCMA蛋白及二次抗生物素蛋白-PE結合物偵測TFP+ T細胞。另外，用特定單株抗體(BD Biosciences)同時偵測T細胞上之CD4+及CD8+表現。對根據製造商之說明書，使用人TH1/TH2細胞介素細胞量測珠檢定套組(BD Biosciences)量測再刺激後24小時收集到的上清液中之細胞介素。使用FACScalibur™流式細胞儀評估螢光度，並根據製造商之說明書分析資料。

可以利用標準⁵¹ Cr釋放檢定評估細胞毒性(參見例如Milone等人, Molecular Therapy 17(8): 1453-1464 (2009))。簡言之，在37℃下，在頻繁攪動下向目標細胞中裝載⁵¹ Cr (呈NaCrO₄ 形式，New England Nuclear)，保持2小時，在完全RPMI中洗滌兩次並塗鋪於微量滴定盤中。在各孔中的完全RPMI中將效應T細胞與目標細胞以不同的效應細胞:目標細胞(E:T)比率混合。另外，製備僅含培養基(自發釋放，SR)或含1% triton-X 100清潔劑溶液(總釋放，TR)之額外孔。在37℃下培育4小時後，自各孔收集上清液。接著，使用γ粒子計數器(Packard Instrument Co., Waltham, Mass.)量測⁵¹ Cr之釋放量。每一條件一式三份執行，並使用下式計算溶解百分含量：溶解%=(ER-SR)/(TR-SR)，其中ER表示每一實驗條件之平均⁵¹ Cr釋放量。

可以使用成像技術評價荷瘤動物模型中TFP之具體運輸及增殖情況。此類檢定描述於例如Barrett等人, Human Gene Therapy 22:1575-1586 (2011)中。簡言之，在電穿孔放入TFP構築體後4小時，向NOD/SCID/γc-/- (NSG)小鼠靜脈內注射癌細胞，7天後注射T細胞。用慢病毒構築體穩定轉染T細胞以使其表現螢火蟲螢光素酶，並獲取小鼠之生物發光圖像。或者，可以如下所述，在癌症異種移植模型中量測單次注射TFP+ T細胞之治療功效及特異性：向NSG小鼠注射經轉導成穩定表現螢火蟲螢光素酶之癌細胞，隨後，在7天後，單次尾靜脈注射經電穿孔放入BCMA TFP之T細胞。在注射後之各種時間點，獲取動物圖像。舉例而言，可以在第5天(治療前2天)及第8天(TFP+ PBL後24小時)，生成代表性小鼠中螢火蟲螢光素酶陽性癌症之光子密度熱圖。

亦可使用其他檢定，包括本文實例部分中所描述之檢定以及此項技術中已知之檢定，評價本發明之抗BCMA TFP構築體。11. 治療應用 腫瘤抗原相關疾病或病症

用針對腫瘤細胞上一個目標，例如BCMA、CD19、CD20、CD22、CD123、MUC16、MSLN等之癌症治療劑治療的許多癌症因逃逸機制，諸如替代信號傳導路徑及反饋循環之活化而隨時間具有耐受性。雙特異性治療劑試圖藉由組合通常彼此替代作為逃逸途徑之目標來解決此問題。具有特異性針對多種腫瘤相關抗原之TCR的治療性T細胞群係頗具前景的組合治療劑。在一些實施例中，將雙特異性TFP T細胞與額外抗癌劑一起投與；在一些實施例中，該抗癌劑係抗體或其片段、另一TFP T細胞、CAR T細胞或小分子。例示性腫瘤相關抗原包括但不限於癌胚抗原(例如在胎兒組織中及在癌變體細胞中表現之抗原)、致癌病毒抗原(例如由腫瘤發生轉型病毒編碼之抗原、過度表現/積累之抗原(例如由正常及贅生性組織表現之抗原，其表現水準在贅瘤中明顯升高)、睾丸癌抗原(例如僅由癌細胞及成體生殖組織諸如睾丸及胎盤表現之抗原)、譜系限制性抗原(例如主要由單一癌症組織型表現之抗原)、突變之抗原(例如由基因突變或轉錄改變引起之癌症表現的抗原)、轉譯後改變之抗原(例如糖基化等發生腫瘤相關改變之抗原)及抗獨特型抗原(例如來自高度多態性之基因的抗原，其中腫瘤細胞表現特定純系型，例如在因純系異常而出現在B細胞、T細胞淋巴瘤/白血病中)。例示性腫瘤相關抗原包括但不限於以下抗原：α-輔肌動蛋白-4、ARTC1、α胎蛋白(AFP)、BCR-ABL融合蛋白(b3a2)、B-RAF、CASP-5、CASP-8、β-連環蛋白、Cdc27、CDK4、CDK12、CDKN2A、CLPP、COA-1、CSNK1A1、CD79、CD79B、dek-can融合蛋白、EFTUD2、伸長因子2、ETV6-AML1融合蛋白、FLT3-ITD、FNDC3B、FN1、GAS7、GPNMB、HAUS3、HSDL1、LDLR-岩藻糖基轉移酶AS融合蛋白、HLA-A2d、HLA-A11d、hsp70-2、MART2、MATN、ME1、MUM-1f、MUM-2、MUM-3、neo-PAP、肌球蛋白I類、NFYC、OGT、OS-9、p53、pml-RARα融合蛋白、PPP1R3B、PRDX5、PTPRK、K-ras、N-ras、RBAF600、SIRT2、SNRPD1、SYT-SSX1或-SSX2融合蛋白、TGF-βRII、磷酸丙糖異構酶、BAGE-1、D393-CD20n、週期素-A1、GAGE-1、GAGE-2、GAGE-8、GAGE-3、GAGE-4、GAGE-5、GAGE-6、GAGE-7、GnTVf、HERV-K-MEL、KK-LC-1、KM-HN-1、LAGE-1、LY6K、MAGE-A1、MAGE-A2、MAGE-A3、MAGE-A4、MAGE-A6、MAGE-A9、MAGE-A10、MAGE-A12 m、MAGE-C1、MAGE-C2、黏蛋白k、NA88-A、NY-ESO-1/LAGE-2、SAGE、Sp17、SSX-2、SSX-4、TAG-1、TAG-2、TRAG-3、TRP2-INT2g、XAGE-1b/GAGED2a、基因/蛋白質、CEA、gp100/Pmel17、乳腺珠蛋白-A、Melan-A / MART-1、NY-BR-1、OA1、PAP、PSA、RAB38/NY-MEL-1、TRP-1/gp75、TRP-2、酪胺酸酶、脂肪分化相關蛋白、AIM-2、ALDH1A1、BCLX (L)、BING-4、CALCA、CD45、CD274、CPSF、週期素D1、DKK1、ENAH (hMena)、EpCAM、EphA3、EZH2、FGF5、磷脂醯蛋白聚糖-3、G250/MN/CAIX、HER-2/neu、HLA-DOB、Hepsin、IDO1、IGF2B3、IL13Rα2、腸羧基酯酶、α-胎蛋白、血管舒緩素(Kallikrein) 4、KIF20A、Lengsin、M-CSF、MCSP、mdm-2、Meloe、Midkine、MMP-2、MMP-7、MUC1、MUC5AC、p53、PAX5、PBF、PRAME、PSMA、RAGE-1、RGS5、RhoC、RNF43、RU2AS、分泌粒蛋白(secernin) 1、SOX10、STEAP1、存活素(survivin)、端粒酶、TPBG、VEGF及WT1。

在一個態樣中，本發明提供用於治療與至少一種腫瘤相關抗原表現有關之疾病的方法。在一個態樣中，本發明提供用於治療疾病之方法，其中部分腫瘤對腫瘤相關抗原呈陰性且部分腫瘤對腫瘤相關抗原呈陽性。舉例而言，本發明之抗體或TFP可用於治療經歷該腫瘤抗原表現升高相關疾病之治療的受試者，其中經歷針對腫瘤相關抗原水準升高之治療的受試者展現與腫瘤相關抗原水準升高有關之疾病。

在一個態樣中，本發明係關於一種載體，該載體包含可操作地連接至供在哺乳動物T細胞中表現之啟動子的抗腫瘤相關抗原抗體或TFP。在一個態樣中，本發明提供一種表現腫瘤相關抗原TFP之重組T細胞，該TFP用於治療表現腫瘤相關抗原之腫瘤，其中該表現腫瘤相關抗原TFP之重組T細胞稱為腫瘤相關抗原TFP-T。在一個態樣中，本發明之腫瘤相關抗原TFP-T能夠使腫瘤細胞與其表面上表現之至少一種本發明之腫瘤相關抗原TFP接觸，由此使TFP-T靶向腫瘤細胞並抑制腫瘤細胞生長。

在一個態樣中，本發明係關於一種抑制表現腫瘤相關抗原之腫瘤細胞生長的方法，該方法包括使腫瘤細胞與本發明之腫瘤相關抗原抗體或TFP T細胞接觸，由此使TFP-T響應於抗原而活化並靶向癌細胞，其中腫瘤之生長受到抑制。

在一個態樣中，本發明係關於一種治療受試者之癌症的方法。該方法包括向受試者投與本發明之腫瘤相關抗原抗體、雙特異性抗體或TFP T細胞，由此治療受試者之癌症。能用本發明之腫瘤相關抗原TFP T細胞治療之癌症的實例係與腫瘤相關抗原表現有關之癌症。在一個態樣中，癌症係骨髓瘤。在一個態樣中，癌症係淋巴瘤。在一個態樣中，癌症係結腸癌。

在一些實施例中，腫瘤相關抗原抗體或TFP療法可與一或多種額外療法組合使用。在一些情形中，此類額外療法包含化學治療劑，例如環磷醯胺。在一些情形中，此類額外療法包含手術切除或放射療法。

在一個態樣中，本文揭示一種細胞治療之方法，其中T細胞經基因修飾成表現TFP且表現TFP之T細胞經輸注至有需要之接受者中。輸注之細胞能夠殺死接受者體內之腫瘤細胞。與抗體療法不同，表現TFP之T細胞能夠在活體內複製，實現長期存留，由此可以引起持續之腫瘤控制。在各種態樣中，在將T細胞投與患者之後，投與患者之T細胞，或其子代在患者體內持續存在至少四個月、五個月、六個月、七個月、八個月、九個月、十個月、十一個月、十二個月、十三個月、十四個月、十五個月、十六個月、十七個月、十八個月、十九個月、二十個月、二十一個月、二十二個月、二十三個月、兩年、三年、四年或五年。

在一些情形中，本文揭示一類細胞療法，其中T細胞藉由例如活體外轉錄之RNA修飾成短暫地表現TFP且表現TFP之T細胞經輸注至有需要之接受者中。輸注之細胞能夠殺死接受者體內之腫瘤細胞。因此，在各種態樣中，在將T細胞投與患者之後，投與患者之T細胞存在不到一個月，例如三週、兩週或一週。

不希望受任何特定理論束縛，由表現TFP之T細胞引起的抗腫瘤免疫反應可以為主動或被動免疫反應，或替代地，可以歸於直接與間接免疫反應。在一個態樣中，TFP轉導之T細胞響應於表現腫瘤相關抗原之人類癌細胞而展現特異性促炎性細胞介素分泌及強效細胞溶解活性，抵抗可溶性腫瘤相關抗原抑制，介導旁觀者殺滅作用及/或介導確定之人類腫瘤的消退。舉例而言，在表現腫瘤相關抗原之腫瘤之異質區內的低抗原腫瘤細胞可能易於被先前針對相鄰抗原陽性癌細胞起反應的腫瘤相關抗原重定向之T細胞間接破壞。

在一個態樣中，本發明的人類TFP修飾之T細胞可以為用於哺乳動物離體免疫接種及/或活體內療法的一類疫苗。在一個態樣中，該哺乳動物係人類。

就離體免疫接種而言，在將細胞投與哺乳動物之前，以下至少一種在活體外發生：i)細胞擴增；ii)將編碼TFP之核酸引入細胞中；或iii)低溫保存細胞。

離體程序係此項技術中熟知且在下文更完整地論述。簡言之，自哺乳動物(例如人類)分離細胞並用表現本文所揭示之TFP的載體進行基因修飾(亦即，在活體外轉導或轉染)。可以將TFP修飾之細胞投與哺乳動物接受者以提供治療益處。哺乳動物接受者可以為人類且TFP修飾之細胞可關於該接受者為自體的。或者，細胞可以關於接受者為同種異體細胞、同基因細胞或異種細胞。

離體擴增造血幹細胞及祖細胞之程序描述於以引用之方式併入本文中的美國專利第5,199,942號中，該程序可以用於本發明之細胞。其他適合的方法係此項技術中已知的，因此本發明不限於任何特定的離體細胞擴增方法。簡言之，T細胞之離體培養及擴增包括：(1)藉由採集末梢血液或骨髓外植體，自哺乳動物收集CD34+造血幹細胞及祖細胞；及(2)離體擴增該等細胞。除美國專利第5,199,942號中所描述之細胞生長因子外，亦可使用其他因子諸如flt3-L、IL-1、IL-3及c-kit配位體培養並擴增細胞。

就離體免疫接種而言，除使用基於細胞之疫苗外，本發明亦提供用於活體內免疫接種以引起針對患者體內抗原之免疫反應的組成物及方法。

一般而言，可以用如本文所述活化並擴增的細胞治療及預防在免疫力低下個體中產生之疾病。確切地說，使用本發明的TFP修飾之T細胞治療與腫瘤相關抗原表現有關之疾病、病症及病況。在某些態樣中，使用本發明之細胞來治療有發展與腫瘤相關抗原表現有關之疾病、病症及病況風險的患者。因此，本發明提供用於治療或預防與腫瘤相關抗原表現有關之疾病、病症及病況的方法，該等方法包括向有需要之受試者投與治療有效量的本發明之TFP修飾之T細胞。

在一個態樣中，本發明之抗體或TFP-T細胞可用於治療增生性疾病，諸如癌症或惡性病，或癌前病況。在一個態樣中，癌症係骨髓瘤。在一個態樣中，癌症係淋巴瘤。在一個態樣中，癌症係結腸癌。另外，與腫瘤相關抗原表現有關之疾病包括但不限於例如與腫瘤相關抗原表現有關之非典型性及/或非經典癌症、惡性病、癌前病況或增生性疾病。與C腫瘤相關抗原表現有關之非癌症相關適應症包括但不限於例如感染性疾病、自身免疫性疾病(例如狼瘡)、發炎性病症(過敏及哮喘)及移植。

本發明的TFP修飾之T細胞可以單獨投與，或與稀釋劑及/或與諸如IL-2或IL-12或其他細胞介素或細胞群之類其他組分組合以醫藥組成物形式投與。

本發明亦提供用於抑制表現腫瘤相關抗原之細胞群之增殖或減少表現腫瘤相關抗原之細胞群的方法，該等方法包括使包含表現腫瘤相關抗原之細胞的細胞群與結合至該表現腫瘤相關抗原之細胞的本發明之抗腫瘤相關抗原TFP-T細胞接觸。在一個特定態樣中，本發明提供用於抑制表現腫瘤相關抗原之癌細胞群之增殖或減少表現腫瘤相關抗原之癌細胞群的方法，該等方法包括使表現腫瘤相關抗原之癌細胞群與結合至該表現腫瘤相關抗原之細胞的本發明之抗腫瘤相關抗原抗體或TFP-T細胞接觸。在一個態樣中，本發明提供用於抑制表現腫瘤相關抗原之癌細胞群之增殖或減少表現腫瘤相關抗原之癌細胞群的方法，該等方法包括使表現腫瘤相關抗原之癌細胞群與結合至該表現腫瘤相關抗原之細胞的本發明之抗腫瘤相關抗原抗體或TFP-T細胞接觸。在某些態樣中，相對於陰性對照，本發明之抗腫瘤相關抗原抗體或TFP-T細胞使患有多發性骨髓瘤或與表現腫瘤相關抗原之細胞有關之另一癌症的受試者或動物模型中細胞及/或癌細胞之數量、數目、量或百分比減少至少25%、至少30%、至少40%、至少50%、至少65%、至少75%、至少85%、至少95%或至少99%。在一個態樣中，受試者係人類。

本發明亦提供用於預防、治療及/或管理與表現腫瘤相關抗原之細胞有關之疾病(例如表現腫瘤相關抗原之癌症)的方法，該等方法包括向有需要之受試者投與結合至表現腫瘤相關抗原之細胞的本發明之抗腫瘤相關抗原抗體或TFP-T細胞。在一個態樣中，受試者係人類。與表現腫瘤相關抗原之細胞有關之病症的非限制性實例包括自身免疫性病症(諸如狼瘡)、發炎性病症(諸如過敏及哮喘)及癌症(諸如血液癌症或表現腫瘤相關抗原之非典型性癌症)。

本發明亦提供用於預防、治療及/或管理與表現腫瘤相關抗原之細胞有關之疾病的方法，該等方法包括向有需要之受試者投與結合至表現腫瘤相關抗原之細胞的本發明之抗腫瘤相關抗原抗體或TFP-T細胞。在一個態樣中，受試者係人類。

本發明提供用於預防與表現腫瘤相關抗原之細胞有關之癌症復發的方法，該等方法包括向有需要之受試者投與結合至表現腫瘤相關抗原之細胞的本發明之抗腫瘤相關抗原抗體或TFP-T細胞。在一個態樣中，該等方法包括向有需要之受試者投與有效量的本文所述之結合至表現腫瘤相關抗原之細胞的本發明之抗腫瘤相關抗原抗體或TFP-T細胞以及有效量之另一療法。12. 組合療法

本文所述的表現TFP之細胞可以與其他已知劑及療法組合使用。如本文所使用，「組合」投與意味著在受試者患病過程期間，向該受試者遞送兩種(或兩種以上)不同治療，例如在受試者經診斷患有病症之後且在該病症經治癒或消除或者出於其他原因停止治療之前，遞送兩種或兩種以上治療。在一些實施例中，一種治療之遞送在開始遞送另一種治療時仍然繼續，由此在投與方面存在重疊。此在本文中有時稱為「同時」或「共同遞送」。在其他實施例中，一種治療之遞送在另一種治療之遞送開始之前已結束。在任一情形之一些實施例中，治療因組合投與而更有效。舉例而言，相較於在無第一種治療存在下投與第二種治療時所見到的情形或利用第一種治療所見到的類似狀況，該第二種治療更有效，例如利用較少第二種治療見到等效作用，或第二種治療在較高程度上減少症狀。在一些實施例中，遞送使得症狀減輕程度，或與病症相關之其他參數高於在無另一種治療存在下遞送一種治療所觀察到的情形。該兩種治療之作用可以為部分加和、完全加和或超過加和作用的。該遞送可以使得在遞送第二種治療時仍能偵測到所遞送之第一種治療的作用。

在一些實施例中，「至少一種額外治療劑」包括表現TFP之細胞。亦提供表現結合至相同或不同目標抗原，或同一目標抗原上之相同或不同抗原決定基之多個TFP的T細胞。亦提供T細胞群，其中第一T細胞亞群表現第一TFP，且第二T細胞亞群表現第二TFP。

本文所描述的表現TFP之細胞及該至少一種額外治療劑可以呈相同或獨立組成物形式同時或依序投與。對於依序投與，可以先投與本文所述的表現TFP之細胞，再投與該額外劑，或投與次序可以顛倒。

在其他態樣中，本文所述的表現TFP之細胞可以與手術、化學療法、放射、免疫抑制劑諸如環孢黴素、硫唑嘌呤、甲胺蝶呤、黴酚酸酯及他克莫司、抗體，或其他免疫消融劑如阿侖單抗、抗CD3抗體或其他抗體療法、環磷醯胺、氟達拉濱、環孢黴素、他克莫司、雷帕黴素、黴芬酸、類固醇、羅米地辛、細胞介素以及照射、肽疫苗(諸如Izumoto等人, 2008 J Neurosurg 108:963-971中所述)組合用於治療方案中。

在一個實施例中，可以向受試者投與減少或改善與投與表現TFP之細胞有關之副作用的劑。與投與表現TFP之細胞有關的副作用包括但不限於細胞介素釋放症候群(CRS)，以及噬血細胞性淋巴組織細胞增多症(HLH)，又稱為巨噬細胞活化症候群(MAS)。CRS之症狀包括高燒、噁心、短暫性低血壓、組織缺氧及類似症狀。因此，本文所述之方法可以包括向受試者投與本文所述的表現TFP之細胞以及另外投與管理由表現TFP之細胞治療引起之可溶性因子水準升高的劑。在一個實施例中，受試者體內增多之可溶性因子係以下一或多種：IFN-γ、TNFα、IL-2及IL-6。因此，投與用於治療此副作用之劑可以為中和一或多種該等可溶性因子之劑。該等劑包括但不限於類固醇、TNFα抑制劑以及IL-6抑制劑。TNFα抑制劑之一個實例係依那西普(etanercept)(以名稱ENBREL®銷售)。IL-6抑制劑之一個實例係托珠單抗(tocilizumab)(以名稱ACTEMRA®銷售)。

在一個實施例中，可以向受試者投與增強表現TFP之細胞之活性的劑。舉例而言，在一個實施例中，該劑可以為對抑制性分子進行抑制之劑。在一些實施例中，抑制性分子，例如計劃性死亡1(PD1)，可以降低表現TFP之細胞產生免疫效應反應的能力。抑制性分子之實例包括PD1、PD-L1、CTLA4、TIM3、LAG3、VISTA、BTLA、TIGIT、LAIR1、CD160、2B4及TGFRβ。藉由例如在DNA、RNA或蛋白質層面上抑制來進行抑制性分子之抑制可以優化表現TFP之細胞的效能。在實施例中，可以使用抑制性核酸，例如抑制性核酸，例如dsRNA，例如siRNA或shRNA來抑制表現TFP之細胞中抑制性分子的表現。在一個實施例中，該抑制劑係shRNA。在一個實施例中，表現TFP之細胞內的抑制性分子受到抑制。在該等實施例中，抑制該等抑制性分子之表現的dsRNA分子係連接至編碼TFP之組分，例如TFP之所有組分的核酸。在一個實施例中，抑制性信號之抑制劑可以為例如結合至抑制性分子之抗體或抗體片段。舉例而言，該劑可以為結合至PD1、PD-L1、PD-L2或CTLA4之抗體或抗體片段(例如伊匹單抗(又稱為MDX-010及MDX-101，且以YERVOY^TM 銷售；Bristol-Myers Squibb；曲美木單抗(tremelimumab) (可購自Pfizer之IgG2單株抗體，先前稱為替西木單抗(ticilimumab)，CP-675,206))。在一個實施例中，該劑係結合至T細胞免疫球蛋白及含黏蛋白結構域分子3 (TIM3)之抗體或抗體片段。在一個實施例中，該劑係結合至淋巴細胞活化基因3 (LAG3)之抗體或抗體片段。

在一些實施例中，增強表現TFP之細胞之活性的劑可以為例如包含第一結構域及第二結構域之融合蛋白，其中該第一結構域係抑制性分子或其片段，且該第二結構域係與陽性信號相連之多肽，例如包含如本文所述之細胞內信號傳導結構域的多肽。在一些實施例中，與陽性信號相連之多肽可以包括CD28、CD27、ICOS之共刺激結構域，例如CD28、CD27及/或ICOS之細胞內信號傳導結構域，及/或例如CD3ζ之初級信號傳導結構域，例如本文所描述。在一個實施例中，該融合蛋白係由與該表現TFP之細胞表現。在另一實施例中，該融合蛋白係由不表現抗腫瘤相關抗原TFP之細胞，例如T細胞表現。13. 醫藥組成物

本發明之醫藥組成物可以包含如本文所述的表現TFP之細胞，例如多個表現TFP之細胞，以及一或多種醫藥學上或生理上可接受之載劑、稀釋劑或賦形劑。該等組成物可以包含緩衝劑，諸如中性緩衝生理食鹽水、磷酸鹽緩衝生理食鹽水及類似物；碳水化合物，諸如葡萄糖、甘露糖、蔗糖或葡聚糖、甘露糖醇；蛋白質；多肽或胺基酸，諸如甘胺酸；抗氧化劑；螯合劑，諸如EDTA或麩胱甘肽；佐劑(例如氫氧化鋁)；以及防腐劑。在一個態樣中，本發明之組成物係調配用於靜脈內投與。

本發明之醫藥組成物可以藉由適於待治療(或待預防)疾病之方式投與。投與之量及頻率將由諸如患者之狀況以及患者疾病之類型及嚴重程度之類因素決定，不過適當劑量可以由臨床試驗確定。

在一個實施例中，該醫藥組成物實質上不含，例如不存在可偵測水準之污染物，該污染物例如選自由以下組成之群：內毒素、支原體、有複製能力之慢病毒(RCL)、p24、VSV-G核酸、HIV gag、殘留的塗有抗CD3/抗CD28之珠粒、小鼠抗體、彙集之人血清、牛血清白蛋白、牛血清、培養基組分、載體包裝細胞或質體組分、細菌以及真菌。在一個實施例中，細菌係選自由以下組成之群的至少一種：糞產鹼菌(Alcaligenes faecalis)、白色念珠菌(Candida albicans)、大腸桿菌(Escherichia coli)、流感嗜血桿菌(Haemophilus influenza)、腦膜炎奈瑟菌(Neisseria meningitides)、綠膿桿菌(Pseudomonas aeruginosa)、金黃色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)、肺炎鏈球菌(Streptococcus pneumonia)以及A群化膿性鏈球菌(Streptococcus pyogenes group A)。

當指示「免疫有效量」、「抗腫瘤有效量」、「腫瘤抑制有效量」或「治療量」時，打算投與的本發明組成物之精確量可以由醫師考慮個體年齡、體重、腫瘤大小、感染或轉移之程度以及患者(受試者)狀況之差異來決定。一般可以確定，包含本文所述之T細胞的醫藥組成物之投與劑量可以為每公斤體重10⁴ 至10⁹ 個細胞，在一些情形中每公斤體重10⁵ 至10⁶ 個細胞，包括該等範圍內之所有整數值。T細胞組成物亦可按該等劑量多次投與。該等細胞可以使用免疫療法中通常瞭解之輸注技術投與(參見例如Rosenberg等人, New Eng. J. of Med. 319:1676, 1988)。

在某些態樣中，可能希望向受試者投與活化T細胞，且接著再抽血(或執行單採血液成分術)，根據本發明活化由此得到的T細胞，並向患者回輸該等經活化且擴增之T細胞。此方法可以每數週進行多次。在某些態樣中，可以使抽取的10 cc至400 cc血液中之T細胞活化。在某些態樣中，使抽取的20 cc、30 cc、40 cc、50 cc、60 cc、70 cc、80 cc、90 cc或100 cc血液中之T細胞活化。

主題組成物之投與可以藉由任何便利的方式進行，包括氣霧劑吸入、注射、攝取、輸注、植入或移植。本文所述之組成物可以經動脈、皮下、皮內、腫瘤內、結內、髓內、肌肉內、藉由靜脈內(i.v.)注射或經腹膜內投與患者。在一個態樣中，本發明之T細胞組成物係藉由皮內或皮下注射投與患者。在一個態樣中，本發明之T細胞組成物係藉由靜脈內注射投與。T細胞組成物可以直接注射至腫瘤、淋巴結或注射部位中。

在一個特定的例示性態樣中，受試者可能經歷白細胞去除術，其中白細胞經收集，增濃或離體耗盡，以選出及/或分離所關注細胞，例如T細胞。該等T細胞分離株可以藉由此項技術中已知之方法擴增並處理，由此可以引入一或多個本發明之TFP構築體，從而產生本發明的表現TFP之T細胞。有需要之受試者隨後可以經歷用高劑量化學療法進行之標準治療，之後經歷末梢血液幹細胞移植。在某些態樣中，在移植之後或同時，受試者接受經擴增的本發明之TFP T細胞輸注。在額外態樣中，擴增之細胞係在手術之前或之後投與。

打算投與患者的以上治療之劑量將隨所治療病況之確切性質以及治療之接受者而變化。投與人類之劑量的範圍可以根據此項技術公認之實踐執行。舉例而言，對於成年患者，阿侖單抗(CAMPATH®)之劑量一般在1至約100 mg範圍內，通常每天投與，持續在1與30天之間的時間段。較佳日劑量係每天1至10 mg，不過在一些情形中，每天可以使用多達40 mg之較大劑量(如美國專利第6,120,766號中所述)。

在一個實施例中，使用例如活體外轉錄將TFP引入T細胞中，且受試者(例如人類)接受本發明之TFP T細胞的初次投與，以及本發明之TFP T細胞的一或多次後續投與，其中該一或多次後續投與係在前一次投與之後不到15天，例如14天、13天、12天、11天、10天、9天、8天、7天、6天、5天、4天、3天或2天投與。在一個實施例中，每週向受試者(例如人類)投與超過一次本發明之TFP T細胞，例如每週投與2、3或4次本發明之TFP T細胞。在一個實施例中，受試者(例如人類受試者)每週投與超過一次TFP T細胞(例如每週投與2、3或4次)(在本文中又稱為一個週期)，隨後一週不投與TFP T細胞，且接著向受試者再投與一或多次TFP T細胞(例如每週投與超過一次TFP T細胞)。在另一實施例中，受試者(例如人類受試者)接受超過一個週期的TFP T細胞，且每個週期之間之時間少於10、9、8、7、6、5、4或3天。在一個實施例中，每隔一天投與TFP T細胞，每週投與3次。在一個實施例中，投與本發明之TFP T細胞至少兩週、三週、四週、五週、六週、七週、八週或更長時間。

在一個態樣中，腫瘤相關抗原TFP T細胞係使用慢病毒載體，諸如慢病毒產生的。以此方式產生的TFP-T細胞將穩定表現TFP。

在一個態樣中，TFP T細胞在轉導後短暫地表現TFP載體達4天、5天、6天、7天、8天、9天、10天、11天、12天、13天、14天、15天。TFP之短暫表現可以藉由RNA TFP載體遞送實現。在一個態樣中，藉由電穿孔將TFP RNA轉導至T細胞中。

使用短暫表現TFP之T細胞(特別是帶有TFP T細胞之鼠類scFv)治療患者可能引起的潛在問題係在多次治療之後的過敏反應。

不受此理論束縛，咸信此種過敏反應可能係由患者發展體液抗TFP反應，亦即具有抗IgE同型之抗TFP抗體引起。據悉，當有十至十四天暫停暴露於抗原時，患者之產抗體細胞經歷自IgG同型(不會引起過敏反應)向IgE同型之類別轉換。

若患者在短暫TFP療法(諸如藉由RNA轉導產生者)過程期間產生抗TFP抗體反應的風險較高，則暫停TFP T細胞輸注不應持續超過十至十四天。實例

參照以下實驗實例進一步詳細描述本發明。除非另外具體說明，否則該等實例僅出於說明之目的提供，且不打算作限制。因此，本發明不應當以任何方式解釋為侷限於以下實例，而應當解釋為涵蓋由於本文所提供之傳授內容而變得顯而易見的任何及所有變化。若不作進一步描述，咸信一般熟習此項技術者可以使用前述描述及以下示例性實例製備及利用本發明之化合物並實踐所主張之方法。以下操作實例具體地指出本發明之各種態樣，且不應解釋為以任何方式限制本揭示案之其餘內容。

以下實例描述對癌細胞上之多種目標抗原具有特異性的經工程改造之T細胞受體；亦描述產生T細胞群之方法，該等T細胞群具有對該細胞中或細胞組合中之多種抗原具特異性之TCR。在一個實施例中，製得在單一TCR次單元上具有串聯之兩個結合結構域(例如scFv、sdAb等)的TFP構築體。在一個實施例中，製得在單一TCR中具有兩個結合結構域之TFP構築體，其中在兩個TCR次單元，例如兩個ε次單元、ε次單元及γ次單元等上各一個結合結構域。在另一個實施例中，在單獨慢病毒載體上獨立地製備TFP構築體，並用兩種病毒轉導目標T細胞群。實例揭示抗MSLN TFP及抗MUC16 TFP之組合及/或對抗MSLN及MUC16具有特異性之TFP，及/或混合T細胞群，其中該等T細胞係經抗MSLN TFP轉導之T細胞與經抗MUC16 TFP轉導之T細胞的混合物。如上文所述，本文所揭示之抗MSLN及抗MUC16構築體僅為例示性的且不意圖解釋為限制。本發明之方法中涵蓋具有抗腫瘤抗原抗體之多種組合的構築體。實例 1 ： TFP 構築體

藉由將用編碼連接子之DNA序列連接至CD3或TCR DNA片段之抗間皮素結合結構域(例如sdAb、scFv或其片段)DNA片段選殖至例如p510載體((System Biosciences (SBI))中XbaI及EcoR1位點處，對抗間皮素TFP構築體進行工程改造，該連接子具有序列(G₄ S)_n ，其中n=1-4 (SEQ ID NO: 100)。亦可使用其他適合載體。

產生的抗間皮素TFP構築體係p510_抗間皮素_TCRα (抗間皮素–連接子-人類全長T細胞受體α鏈)、p510_抗間皮素_TCR αC (抗間皮素-連接子-人類T細胞受體α恆定結構域鏈)、p510_抗間皮素_TCRβ (抗間皮素–連接子-人類全長T細胞受體β鏈)、p510_抗間皮素_TCRβC (抗間皮素–連接子-人類T細胞受體β恆定結構域鏈)、p510_抗間皮素_TCRγ (抗間皮素–連接子-人類全長T細胞受體γ鏈)、p510_抗間皮素_TCR γC (抗間皮素-連接子-人類T細胞受體γ恆定結構域鏈)、p510_抗間皮素_TCRδ (抗間皮素– 連接子-人類全長T細胞受體δ鏈)、p510_抗間皮素_TCRδC (抗間皮素–連接子-人類T細胞受體β恆定結構域鏈)、p510_抗間皮素_CD3γ (抗間皮素–連接子-人類CD3γ鏈)、p510_抗間皮素_CD3δ (抗間皮素–連接子-人類CD3δ鏈)及p510_抗間皮素__CD3ε (抗間皮素 –連接子-人類CD3ε鏈)。

藉由將編碼抗間皮素、部分CD28細胞外結構域、CD28跨膜結構域、CD28細胞內結構域及CD3ζ之合成DNA選殖至p510載體之XbaI及EcoR1位點處來產生抗間皮素CAR構築體p510_抗間皮素_28ζ。在其他實施例中，使用4-1BBζ結構域產生抗間皮素CAR構築體。

可藉由將用編碼連接子之DNA序列連接至CD3或TCR DNA片段之抗MUC16結合結構域(例如sdAb、scFv或其片段)DNA片段選殖至p510載體((System Biosciences® (SBI))中XbaI及EcoR1位點處，對抗MUC16 TFP構築體進行工程改造，該連接子具有序列(G4S)n，其中n=1-4 (SEQ ID NO: 100)。亦可使用其他載體，例如pLRPO載體。

抗MUC16 TFP構築體之實例包括p510_抗MUC16_TCRα (抗MUC16 - 連接子 - 人類全長T細胞受體α鏈)、p510_抗MUC16_TCR αC (抗MUC16 - 連接子 - 人類T細胞受體α恆定結構域鏈)、p510_抗MUC16_TCRβ (抗MUC16 - 連接子 - 人類全長T細胞受體β鏈)、p510_抗MUC16_TCRβC (抗MUC16 - 連接子 - 人類T細胞受體β恆定結構域鏈)、p510_抗MUC16_TCRγ (抗MUC16 - 連接子 - 人類全長T細胞受體γ鏈)、p510_抗MUC16_TCR γC (抗MUC16 - 連接子 - 人類T細胞受體γ恆定結構域鏈)、p510_抗MUC16_TCRδ (抗MUC16 - 連接子 - 人類全長T細胞受體δ鏈)、p510_抗MUC16_TCRδC (抗MUC16 - 連接子 - 人類T細胞受體β恆定結構域鏈)、p510_抗muc16_CD3γ (抗MUC16 - 連接子 - 人類CD3γ鏈)、p510_抗MUC16_CD3δ (抗MUC16 - 連接子 - 人類CD3δ鏈)及p510_抗MUC16_CD3ε (抗MUC16 - 連接子 - 人類CD3ε鏈)。本文使用之抗MUC16可為人類MUC16特異性scFv，例如4H11。

可藉由將編碼抗MUC16、部分CD28細胞外結構域、CD28跨膜結構域、CD28細胞內結構域及CD3ζ的合成DNA選殖至p510載體之XbaI及EcoR1位點處來產生抗MUC16 CAR構築體p510_抗MUC16_28ζ。在其他實施例中，使用4-1BBζ結構域產生抗MUC16 CAR構築體。由 TCR 結構域及結合結構域產生 TFP

可使用連接子序列，諸如G₄ S (SEQ ID NO: 109)、(G₄ S)₂ (SEQ ID NO: 116)、(G₄ S)₃ (SEQ ID NO: 105)或(G₄ S)₄ (SEQ ID NO: 104)將MUC16結合結構域(例如單結構域抗體、scFv或其片段)重組連接至CD3-ε或其他TCR次單元。若使用scFv，則可使用各種連接子及scFv組態。TCRα與TCRβ、或TCRγ與TCRδ鏈可用於產生呈全長多肽形式或僅其恆定結構域形式之TFP。TCRα與TCRβ/TCRγ與TCRδ鏈之任何可變序列均適於製備TFP。 TFP 表現載體

提供的表現載體包括：啟動子(巨細胞病毒(CMV)增強子-啟動子)、實現分泌之信號序列、聚腺苷酸化信號及轉錄終止子(牛生長激素(BGH)基因)、允許游離型複製及在原核生物中複製之元件(例如SV40起點及ColE1或此項技術中已知之其他元件)以及允許選擇之元件(胺比西林(ampicillin)抗性基因及博萊黴素(zeocin)標記物)。

較佳地，將編碼TFP之核酸構築體選殖至慢病毒表現載體中並基於抗MUC16-TFP轉導之T細胞響應於MUC16+目標細胞之效應T細胞反應的數量及品質來驗證表現。效應T細胞反應包括但不限於細胞擴增、增殖、倍增、細胞介素產生以及目標細胞溶解或細胞溶解活性(亦即，脫粒)。

可使用TFP.MUC16慢病毒轉移載體產生包裝於VSV-G假型慢病毒粒子中之基因組材料。將慢病毒轉移載體DNA與VSV-G、gag/pol及rev三種包裝組分以及Lipofectamine®試劑混合以將其一起轉染至HEK-293細胞(胚腎細胞，ATCC® CRL-1573™)中。24及48小時後，收集培養基，過濾並藉由超速離心濃縮。所得病毒製劑將在-80℃下儲存。可在Sup-T1 (T細胞淋巴母細胞性淋巴瘤，ATCC® CRL-1942™)細胞上藉由滴定測定轉導單元之數量。藉由用例如抗CD3抗CD28珠粒活化新鮮的原生T細胞24小時，且接著添加適當數量之轉導單元以獲得所希望百分比之經轉導T細胞，由此產生重定向之TFP.MUC16 T細胞。使該等經修飾之T細胞擴增，直至該等細胞休止且大小減小，此時將其低溫保存以待分析。使用Coulter Multisizer™ III量測細胞數量及大小。在低溫保存之前，利用流式細胞測量分析來測定經轉導細胞(在細胞表面上表現TFP.MUC16)之百分比以及該表現之相對螢光強度。根據柱形圖，可藉由比較轉導之百分比與其相對螢光強度來檢查TFP之相對表現量。

在一些實施例中，藉由用多種病毒載體轉導T細胞來引入多個TFP。 有關人類化 TFP 重定向 T 細胞之細胞溶解活性、增殖能力及細胞介素分泌的評價

可使用此項技術中已知之檢定測定TFP.MUC16 T細胞產生細胞表面表現之TFP以及殺滅目標腫瘤細胞的功能能力。

用人類介白素-2 (IL-2)處理人類末梢血液單核細胞(PBMC，例如來自正常進行單採血液成分之供體的血液，該供體之原生T細胞可藉由針對T細胞、CD4+及CD8+淋巴細胞陰性選擇來獲得)，接著在37℃、5% CO₂ 下，例如在10% RPMI中用抗CD3×抗CD28珠粒活化，隨後用編碼TFP之慢病毒載體轉導。可使用流式細胞測量檢定，諸如藉由抗FLAG抗體或抗鼠類可變結構域抗體確定細胞表面TFP之存在。可使用ELISA或其他檢定量測細胞介素(例如IFN-γ)產生。 TCR 次單元之來源

人類T細胞受體(TCR)複合物之次單元均含有細胞外結構域、跨膜結構域及細胞內結構域。人類TCR複合物含有CD3-ε多肽、CD3-γ多肽、CD3-δ多肽、CD3-ζ多肽、TCRα鏈多肽及TCRβ鏈多肽。人類CD3-ε多肽經典序列係UniProt登錄號P07766。人類CD3-γ多肽經典序列係UniProt登錄號P09693。人類CD3-δ多肽經典序列係UniProt登錄號P043234。人類CD3-ζ多肽經典序列係UniProt登錄號P20963。人類TCRα鏈經典序列係UniProt登錄號Q6ISU1。人類TCRβ鏈C區經典序列係UniProt登錄號P01850，人類TCRβ鏈V區序列係P04435。由 TCR 結構域及 scFv 產生 TFP

使用連接子序列，諸如G₄ S (SEQ ID NO: 109)、(G₄ S)₂ (SEQ ID NO: 116)、(G₄ S)₃ (SEQ ID NO: 105)或(G₄ S)₄ (SEQ ID NO: 104)，將間皮素 scFv重組連接至CD3-ε或其他TCR次單元(參見1C)。利用各種連接子及scFv組態。使用TCRα及TCRβ鏈產生呈全長多肽或僅恆定結構域形式之TFP。TCRα及TCRβ鏈之任何可變序列均能用於製備TFP。 TFP 表現載體

提供的表現載體包括：啟動子(巨細胞病毒(CMV)增強子-啟動子)、實現分泌之信號序列、聚腺苷酸化信號及轉錄終止子(牛生長激素(BGH)基因)、允許游離型複製及在原核生物中複製之元件(例如SV40起點及ColE1或此項技術中已知之其他元件)以及允許選擇之元件(胺比西林抗性基因及博萊黴素標記物)。

較佳地，將編碼TFP之核酸構築體選殖至慢病毒表現載體中並基於抗MSLN TFP T細胞響應於間皮素+目標細胞之效應T細胞反應的數量及品質來驗證表現。效應T細胞反應包括但不限於細胞擴增、增殖、倍增、細胞介素產生以及目標細胞溶解或細胞溶解活性(亦即，脫粒)。

可使用TFP.間皮素慢病毒轉移載體產生包裝於VSV-G假型慢病毒粒子中之基因組材料。將慢病毒轉移載體DNA與VSV-G、gag/pol及rev三種包裝組分以及Lipofectamine®試劑混合以將其一起轉染至HEK-293細胞(胚腎細胞，ATCC® CRL-1573™)中。24及48小時後，收集培養基，過濾並藉由超速離心濃縮。在-80℃下儲存所得病毒製劑。在Sup-T1 (T細胞淋巴母細胞性淋巴瘤，ATCC® CRL-1942™)細胞上藉由滴定測定轉導單元之數量。藉由用例如抗CD3抗CD28珠粒活化新鮮的原生T細胞24小時，且接著添加適當數量之轉導單元以獲得所希望百分比之經轉導T細胞，由此產生重定向之TFP.間皮素T細胞。使該等經修飾之T細胞擴增，直至該等細胞休止且大小減小，此時將其低溫保存以待分析。使用Coulter Multisizer™ III量測細胞數量及大小。在低溫保存之前，利用流式細胞測量分析來測定經轉導細胞(在細胞表面上表現TFP.間皮素)之百分比以及該表現之相對螢光強度。根據柱形圖，藉由比較轉導之百分比與其相對螢光強度來檢查TFP之相對表現量。

在一些實施例中，藉由用多種病毒載體轉導T細胞來引入多個TFP。有關 TFP 重定向 T 細胞之細胞溶解活性、增殖能力及細胞介素分泌的評價

使用此項技術中已知之檢定測定抗MSLN TFP T細胞產生細胞表面表現之TFP以及殺滅目標腫瘤細胞的功能能力。

用人類介白素2 (IL-2)處理人類末梢血液單核細胞(PBMC，例如來自正常進行單採血液成分之供體的血液，該供體之原生T細胞係藉由針對T細胞、CD4+及CD8+淋巴細胞陰性選擇來獲得)，接著在37℃、5% CO₂ 下，例如在10% RPMI中用抗CD3×抗CD28珠粒活化，隨後用編碼TFP之慢病毒載體轉導。使用流式細胞測量檢定，諸如藉由抗FLAG抗體或抗鼠類可變結構域抗體確定細胞表面TFP之存在。使用ELISA或其他檢定量測細胞介素(例如IFN-γ)產生。實例 2 ：抗體序列 產生抗體序列

人類間皮素多肽經典序列係UniProt登錄號Q13421 (或Q13421-1)。提供能夠特異性結合至人類間皮素多肽及其片段或結構域之抗體多肽。抗間皮素抗體可以使用多種技術產生(參見例如Nicholson等人, 1997)。若使用於小鼠、駱駝或其他物種中製得抗間皮素抗體作為起始物質，則執行人類化。舉例而言，在臨床環境中需要使鼠類抗間皮素抗體人類化，其中鼠類特異性殘基可能在接受T細胞受體(TCR)融合蛋白(TFP)治療，亦即用經抗MSLN/抗MUC16 TFP構築體轉導之T細胞治療的受試者中誘導人類抗小鼠抗原(HAMA)反應。藉由將來自非人類抗間皮素抗體之CDR區移植至適當人類生殖系接受體構架上，視情況包括針對CDR及/或構架區之其他修飾，來實現人類化。如本文所提供，抗體及抗體片段殘基編號遵循Kabat (Kabat E. A.等人, 1991；Chothia等人, 1987)。產生 scFv

使用人類或人類化抗間皮素IgG產生TFP構築體之scFv序列。獲得編碼人類或人類化V_L 及V_H 結構域之DNA序列，並視情況針對在來自智人之細胞中表現來優化該等構築體之密碼子。scFv中V_L 及V_H 結構域出現的次序係不同的(亦即，V_L -V_H 或V_H -V_L 取向)，並將三個「G4S」(SEQ ID NO: 109)或「G₄ S」(SEQ ID NO: 109)次單元複本(G₄ S)₃ (SEQ ID NO: 105)連接至可變結構域以產生scFv結構域。抗間皮素或抗MUC16 scFv質體構築體可具有可選的Flag、His或其他親和標籤，並藉由電穿孔放入HEK293或其他適合的人類或哺乳動物細胞株中，且經歷純化。驗證檢定包括藉由FACS進行之結合分析、使用Proteon®之動力學分析以及對間皮素表現細胞染色。

例示性抗間皮素V_L 及V_H 結構域、CDR以及編碼其之核苷酸序列可為美國專利第9,272,002號、第8,206,710號、第9,023,351號、第7,081,518號、第8,911,732號、第9,115,197號及第9,416,190號；亦即美國專利公開案第20090047211號中描述者。其他例示性抗間皮素V_L 及V_H 結構域、CDR以及編碼其之核苷酸序列可分別為以下單株抗體之序列：大鼠抗間皮素抗體420411、大鼠抗間皮素抗體420404、小鼠抗間皮素抗體MN-1、小鼠抗間皮素抗體MB-G10、小鼠抗間皮素抗體ABIN233753、兔抗間皮素抗體FQS3796(3)、兔抗間皮素抗體TQ85、小鼠抗間皮素抗體TA307799、大鼠抗間皮素抗體295D、大鼠抗間皮素抗體B35、小鼠抗間皮素抗體5G157、小鼠抗間皮素抗體129588、兔抗間皮素抗體11C187、小鼠抗間皮素抗體5B2、兔抗間皮素抗體SP74、兔抗間皮素抗體D4X7M、小鼠抗間皮素抗體C-2、小鼠抗間皮素抗體C-3、小鼠抗間皮素抗體G-1、小鼠抗間皮素抗體G-4、小鼠抗間皮素抗體K1、小鼠抗間皮素抗體B-3、小鼠抗間皮素抗體200-301-A87、小鼠抗間皮素抗體200-301-A88、兔抗間皮素抗體EPR2685(2)、兔抗間皮素抗體EPR4509或兔抗間皮素抗體PPI-2e(IHC)。

在一些實施例中，使用單結構域(V_HH )結合物，諸如SEQ ID NO 52-54 (分別為SD1、SD4及SD6)中所述者。

使用人類或人類化抗MUC16 IgG產生TFP構築體之scFv序列。獲得編碼人類或人類化V_L 及V_H 結構域之DNA序列，並視情況針對在來自智人之細胞中表現來優化該等構築體之密碼子。scFv中V_L 及V_H 結構域出現的次序係不同的(亦即，V_L -V_H 或V_H -V_L 取向)，並將三個「G4S」(SEQ ID NO: 109)或「G₄ S」(SEQ ID NO: 109)次單元複本(G₄ S)₃ (SEQ ID NO: 105)連接至可變結構域以產生scFv結構域。抗MUC16 scFv質體構築體可具有可選的Flag、His或其他親和標籤，並藉由電穿孔放入HEK293或其他適合的人類或哺乳動物細胞株中，且經歷純化。驗證檢定包括藉由FACS進行之結合分析、使用Proteon之動力學分析以及對MUC16表現細胞染色。

可用於本文所述之組成物及方法的抗MUC16結合結構域，包括V_L 結構域、V_H 結構域及CDR之實例可在一些出版物及/或商業來源中。舉例而言，WO 2007/001851中已揭示某些抗MUC16抗體，包括3A5及11D10，該案內容以引用之方式併入。藉由OVCAR-3 Scatchard分析測定，3A5單株抗體以433 pM親和力結合MUC16多肽之多個位點。抗MUC16 VL及VH結構域、CDR以及編碼其之核苷酸序列的其他實例可分別為以下單株抗體之序列：GTX10029、GTX21107、MA5-124525、MA5-11579、25450002、ABIN1584127、ABIN93655、112889、120204、LS-C356195、LS-B6756、TA801241、TA801279、V3494、V3648、666902、666904、HPA065600、AMAb91056。

人類MUC16多肽經典序列對應於UniProt登錄號Q8WXI7。提供能夠特異性結合至人類MUC16多肽及其片段或結構域之抗體多肽。抗MUC16抗體可以使用多種技術產生(參見例如Nicholson等人, 1997)。當使用鼠類抗MUC16抗體作為起始物質時，在臨床環境中需要使鼠類抗MUC16抗體人類化，其中鼠類特異性殘基可能在接受T細胞受體(TCR)融合蛋白(TFP)治療，亦即用經TFP.MUC16構築體轉導之T細胞治療的受試者中誘導人類抗小鼠抗原(HAMA)反應。藉由將來自鼠類抗MUC16抗體之CDR區移植至適當人類生殖系接受體構架上，視情況包括針對CDR及/或構架區之其他修飾，來實現人類化。如本文所提供，抗體及抗體片段殘基編號遵循Kabat (Kabat E. A.等人, 1991；Chothia等人, 1987)。 單結構域結合物

亦可使用駱駝或其他單結構域抗體產生抗MUC16 TFP構築體。可使用V_HH 結構域與各種TCR次單元融合。在一些實施例中，使用單結構域(例如V_HH )結合物，諸如表2中所述者(SEQ ID NO:14、SEQ ID NO:19、SEQ ID NO:24、SEQ ID NO:29、SEQ ID NO:34、SEQ ID NO:39、SEQ ID NO:43及SEQ ID NO:47)。抗hMUC16駱駝抗體之製備於實例3中進一步描述。由 TCR 結構域及 scFv 產生 TFP

可使用連接子序列，諸如G₄ S (SEQ ID NO: 109)、(G₄ S)₂ (SEQ ID NO: 116)、(G₄ S)₃ (SEQ ID NO: 105)或(G₄ S)₄ (SEQ ID NO: 104)，將MUC16 scFv重組連接至CD3-ε或其他TCR次單元。可利用各種連接子及scFv組態。可使用TCRα及TCRβ鏈產生呈全長多肽或僅恆定結構域形式之TFP。TCRα及TCRβ鏈之任何可變序列均能用於製備TFP。 TFP 表現載體

較佳地，將編碼TFP之核酸構築體選殖至慢病毒表現載體中並基於抗TFP.MUC16轉導之T細胞(「MUC16.TFP」或「MUC16.TFP T細胞」或「TFP.MUC16」或「TFP.MUC16 T細胞」)響應於MUC16+目標細胞之效應T細胞反應的數量及品質來驗證表現。效應T細胞反應包括但不限於細胞擴增、增殖、倍增、細胞介素產生以及目標細胞溶解或細胞溶解活性(亦即，脫粒)。

可使用TFP.MUC16慢病毒轉移載體產生包裝於VSV-G假型慢病毒粒子中之基因組材料。將慢病毒轉移載體DNA與VSV-G、gag/pol及rev三種包裝組分以及Lipofectamine®試劑混合以將其一起轉移至HEK-293細胞(胚腎細胞，ATCC® CRL-1573™)中。24及48小時後，收集培養基，過濾並藉由超速離心濃縮。所得病毒製劑將在-80℃下儲存。在Sup-T1 (T細胞淋巴母細胞性淋巴瘤，ATCC® CRL-1942™)細胞上藉由滴定測定轉導單元之數量。藉由用例如抗CD3抗CD28珠粒活化新鮮的原生T細胞24小時，且接著添加適當數量之轉導單元以獲得所希望百分比之經轉導T細胞，由此產生重定向之TFP.MUC16 T細胞。使該等經修飾之T細胞擴增，直至該等細胞休止且大小減小，此時將其低溫保存以待分析。使用Coulter Multisizer™ III量測細胞數量及大小。在低溫保存之前，利用流式細胞測量分析來測定經轉導細胞(在細胞表面上表現TFP.MUC16)之百分比以及該表現之相對螢光強度。根據柱形圖，可藉由比較轉導之百分比與其相對螢光強度來檢查TFP之相對表現量。

用人類介白素-2 (IL-2)處理人類末梢血液單核細胞(PBMC，例如來自正常進行單採血液成分之供體的血液，該供體之原生T細胞係藉由針對T細胞、CD4+及CD8+淋巴細胞陰性選擇來獲得)，接著在37℃、5% CO₂ 下，例如在10% RPMI中用抗CD3×抗CD28珠粒活化，隨後用編碼TFP之慢病毒載體轉導。可使用流式細胞測量檢定，諸如藉由抗FLAG抗體或抗鼠類可變結構域抗體確定細胞表面TFP之存在。可使用ELISA或其他檢定量測細胞介素(例如IFN-γ)產生。 TCR 次單元之來源

使用連接子序列，諸如G₄ S (SEQ ID NO: 109)、(G₄ S)₂ (SEQ ID NO: 116)、(G₄ S)₃ (SEQ ID NO: 105)或(G₄ S)₄ (SEQ ID NO: 104)，將間皮素scFv重組連接至CD3-ε或其他TCR次單元(參見1C)。利用各種連接子及scFv組態。使用TCRα及TCRβ鏈產生呈全長多肽或僅恆定結構域形式之TFP。TCRα及TCRβ鏈之任何可變序列均能用於製備TFP。 TFP 表現載體

用人類介白素2 (IL-2)處理人類末梢血液單核細胞(PBMC，例如來自正常進行單採血液成分之供體的血液，該供體之原生T細胞係藉由針對T細胞、CD4+及CD8+淋巴細胞陰性選擇來獲得)，接著在37℃、5% CO₂ 下，例如在10% RPMI中用抗CD3×抗CD28珠粒活化，隨後用編碼TFP之慢病毒載體轉導。使用流式細胞測量檢定，諸如藉由抗FLAG抗體或抗鼠類可變結構域抗體確定細胞表面TFP之存在。使用ELISA或其他檢定量測細胞介素(例如IFN-γ)產生。實例 3 ：多工 TFP 多肽之展示亦即多工人類化 TFP 重定向 T 細胞之用途

本文所提供之TFP多肽能夠與內源性TCR次單元多肽功能性締合，形成功能性TCR複合物。此處，使用帶有多個TFP之慢病毒載體來轉導T細胞以便產生功能性、多工重組TCR複合物。舉例而言，提供一種T細胞，該T細胞包括i)含來自例如CD3-ε多肽之細胞外結構域、跨膜結構域及細胞內結構域，以及間皮素特異性scFv抗體片段之第一TFP；及ii)含來自CD3-γ多肽之細胞外結構域、跨膜結構域及細胞內結構域，以及間皮素特異性scFv抗體片段之第二TFP。第一TFP與第二TFP能夠彼此相互作用並與內源性TCR次單元多肽相互作用，由此形成功能性TCR複合物。

可在實體腫瘤中展示該等多工人類化抗MSLN、抗MUC16 TFP T細胞之用途。實例 4 ：製備經 TFP 轉導之 T 細胞 慢病毒之產生

編碼適當構築體之慢病毒製備如下。將5×10⁶ 個HEK-293FT細胞接種於100 mm培養皿中並使其達到70-90%匯合過夜。在0.5 mL無血清DMEM或Opti-MEM® I培養基中稀釋2.5 μg指定DNA質體及20 µL慢病毒包裝混合液(ALSTEM，目錄號VP100)並輕柔地混合。在一個獨立試管中，在0.5 mL無血清DMEM或Opti-MEM® I培養基中稀釋30 μL NanoFect®轉染試劑(ALSTEM，目錄號NF100)並輕柔地混合。接著，將NanoFect/DMEM與DNA/DMEM溶液混合在一起並渦旋10-15秒，隨後在室溫下培育DMEM-質體-NanoFect混合物15分鐘。將來自前一步驟之完全轉染複合物逐滴添加至細胞盤中並搖動以使轉染複合物均勻地分散於該盤中。接著，在含5% CO₂ 之潮濕恆溫箱中，在37℃下培育該盤過夜。次日，用10 mL新鮮培養基更換上清液並補充20 μL ViralBoost (500x，ALSTEM，目錄號VB100)。接著，在37℃下再培育該盤24小時。接著，將含慢病毒之上清液收集至50 mL帶蓋之無菌錐形離心管中並放在冰上。在4℃下以3000 rpm離心15分鐘之後，用低蛋白質結合0.45 μm無菌過濾器過濾澄清上清液，且隨後藉由在4℃下以25,000 rpm超速離心(Beckmann, L8-70M) 1.5小時來分離病毒。取出糰粒並將其再懸浮於DMEM培養基中，且使用Lenti-X^TM qRT-PCR滴定套組(Clontech®；目錄號631235)，藉由定量RT-PCR確定慢病毒濃度/滴度。藉由用DNA酶I處理來去除任何殘留的質體DNA。病毒儲備製劑被立即用於感染或經等分並在-80℃下儲存待用。PBMC 分離

由全血或膚色血球層製備末梢血液單核細胞(PBMC)。將全血收集於10 mL肝素真空採血管(vacutainer)中且立即處理或在4℃下儲存。在50 mL錐形離心管中，將約10 mL抗凝全血與無菌磷酸鹽緩衝生理食鹽水(PBS)緩衝液混合，總體積係20 mL(PBS，pH 7.4，不含Ca²⁺ /Mg²⁺ )。接著，將20 mL此血液/PBS混合物輕柔地塗鋪至15 mL Ficoll-Paque® PLUS (GE Healthcare®, 17-1440-03)之表面上，隨後在室溫下在不施加制動情況下以400g離心30-40分鐘。

膚色血球層係購自Research Blood Components (Boston, MA)。藉由添加15 mL Ficoll-Paque® (GE Health Care)來準備Leucosep®管(Greiner bio-one)並以1000g離心1分鐘。在PBS (pH 7.4，不含Ca²⁺ 或Mg²⁺ )中以1:3稀釋膚色血球層。將稀釋之膚色血球層轉移至Leucosep管中並在不施加制動情況下以1000g離心15分鐘。小心地取出在稀釋之血漿/Ficoll界面處見到的含有PBMC之細胞層以使Ficoll引起之污染減到最少。接著，藉由用40 mL PBS洗滌PBMC三次，隨後在室溫下以200g離心10分鐘以去除殘留Ficoll、血小板及血漿蛋白質。接著，用血球計對細胞計數。用CAR-T培養基(AIM V-AlbuMAX® (BSA) (Life Technologies)，含5% AB血清及1.25 µg/mL兩性黴素B (amphotericin B) (Gemini Bio-products, Woodland, CA)、100 U/mL青黴素及100 µg/mL鏈黴素)洗滌經洗滌之PBMC一次。或者，將經洗滌之PBMC轉移至隔離小瓶中並在-80℃下冷凍24小時，隨後在液氮中儲存待用。T 細胞活化

用抗人類CD28及CD3抗體結合之磁珠刺激由全血或膚色血球層製備之PBMC，保持24小時，隨後進行病毒轉導。在不含huIL-2之CAR-T培養基(AIM V-AlbuMAX (BSA) (Life Technologies)，含5% AB血清及1.25 µg/mL兩性黴素B (Gemini Bioproducts)、100 U/mL青黴素以及100 µg/mL鏈黴素)中洗滌新鮮分離之PBMC一次，隨後將其以1×10⁶ 個細胞/毫升之最終濃度再懸浮於含300 IU/mL人類IL-2(來自1000×儲備液；Invitrogen)的CAR-T培養基中。若先前已冷凍PBMC，則將其解凍並在10% FBS、100 U/mL青黴素及100 µg/mL鏈黴素存在下，以1×10⁷ 個細胞/毫升再懸浮於9 mL預先加溫(37℃)之cDMEM培養基(Life Technologies)中，濃度係1×10⁶ 個細胞/毫升，隨後如上所述，在CAR-T培養基中洗滌一次，以1×10⁶ 個細胞/毫升再懸浮於CAR-T培養基中，並添加IL-2。

在活化之前，用1 mL無菌1x PBS (pH7.4)洗滌抗人類CD28及CD3抗體結合之磁珠(購自例如Invitrogen、Life Technologies)三次，使用磁力架將珠粒自溶液分離，隨後再懸浮於含300 IU/mL人類IL-2之CAR-T培養基中，達到4×10⁷ 個珠粒/毫升之最終濃度。接著，藉由將25 µL珠粒(1×10⁶ 個珠粒)轉移至1 mL PBMC中，以1:1珠粒比細胞比率混合PBMC及珠粒。接著，將所希望數量之等分試樣分配於12孔低吸附或非處理細胞培養盤之各個孔中，並在37℃及5% CO₂ 下培育24小時，隨後進行病毒轉導。T 細胞轉導 / 轉染及擴增

PBMC活化後，在37℃、5% CO₂ 下培育細胞48小時。在冰上使慢病毒解凍，並將5×10⁶ 個慢病毒以及每毫升培養基2 µL Transplus™ (Alstem)(最終稀釋度為1:500)添加至含1×10⁶ 個細胞的每個孔中。將細胞再培育24小時，隨後重複添加病毒。或者，在冰上使慢病毒解凍，並在5 µg/mL聚凝胺(polybrene；Sigma)存在下，添加5或50 MOI各別病毒。在室溫下，以100g低速離心病毒接種細胞，保持100分鐘。接著使細胞在300 IU/mL人類IL-2持續存在下生長6-14天時間(總培育時間取決於所需CAR-T細胞之最終數量)。每2-3天分析細胞濃度，並在該時間添加培養基以維持1×10⁶ 個細胞/毫升之細胞懸浮液。

在一些情形中，藉由電穿孔將活體外轉錄(IVT)之mRNA放入活化之PBMC中。在一個實施例中，在300 IU/ml重組人類IL-2 (R&D Systems) (可使用其他刺激試劑，諸如來自Milyeni Biotec之TransAct® T細胞試劑)存在下，用Dynabeads® (Thermo Fisher Scientific®)以1:1比率刺激人類PBMC3天。在電穿孔之前，取出珠粒。洗滌細胞並將其以2.5×10⁷ 個細胞/毫升之濃度再懸浮於OPTI-MEM培養基(Thermo Fisher Scientific)中。將200 µL細胞懸浮液(5×10⁶ 個細胞)轉移至2 mm間隙之Electroporation Cuvettes Plus™ (Harvard Apparatus® BTX)中並在冰上預冷卻。將10 µg IVT TFP mRNA添加至細胞懸浮液中。接著，使用ECM® 830 Electro Square Wave Porator (Harvard Apparatus BTX)，在200 V下電穿孔放入mRNA/細胞混合物，保持20毫秒。在電穿孔之後，立即將細胞轉移至新鮮細胞培養基(AIM V AlbuMAX® (BSA)無血清培養基 + 5%人類AB血清 + 300 IU/ml IL-2)中並在37℃下培育。藉由細胞染色驗證 TFP 表現

在慢病毒轉導或電穿孔放入mRNA後，藉由流式細胞測量術，使用抗小鼠Fab抗體偵測鼠類抗間皮素或MUC16來確定抗間皮素或MUC16 TFP之表現。在3 mL染色緩衝液(PBS，4% BSA)中洗滌T細胞三次，並將其以1×10⁶ 個細胞/孔再懸浮於PBS中。為去除死細胞，將細胞與LIVE/DEAD® Aqua可固定死細胞染色劑(Invitrogen)一起在冰上培育30分鐘。用PBS洗滌細胞兩次並將其再懸浮於50 µL染色緩衝液中。為阻斷Fc受體，將1 µL 1:100稀釋之正常山羊lgG (BD Bioscience)添加至每個管中並在冰中培育10分鐘。將1.0 mL FACS緩衝液添加至各管中，充分混合並藉由以300g離心5分鐘使細胞集結成團。藉由Zenon® R-藻紅蛋白標記之人類MSLN IgG1 Fc或人類IgG1同型對照偵測scFv TFP之表面表現。將1 µg抗體添加至各別樣品中並在冰上培育30分鐘。接著洗滌細胞兩次，並使用來自BD® bioscience之抗CD3 APC (純系UCHT1)、抗CD4-太平洋藍(純系RPA-T4)、抗CD8 APCCy7(純系SK1)針對表面標記物染色。使用LSRFortessaTM X20 (BD Biosciences)執行流式細胞測量術並使用FACSDiva®軟體獲取資料，且用FlowJo® (Treestar, Inc. Ashland, OR)進行分析。實例 5 ： 藉由流式細胞測量術進行細胞毒性測定

用螢光染料羧基螢光素二乙酸琥珀醯亞胺酯(CFSE)標記對間皮素或MUC16呈陽性或陰性之目標細胞。將該等目標細胞與未經轉導、經對照CAR-T構築體轉導或經TFP轉導之效應T細胞混合。在指定培育時間之後，藉由流式細胞測量術測定各效應細胞/目標細胞培養物中死亡CFSE標記目標細胞相對於活CFSE標記目標細胞及陰性對照目標細胞之百分比。相對於僅含目標細胞之孔計算各T細胞陽性目標細胞培養物中目標細胞之存活率百分比。

藉由在共培育效應細胞及目標細胞之後，使用流式細胞測量術比較不存在或存在效應T細胞情況下目標細胞中存活目標細胞之數量，來量測效應T細胞之細胞毒性活性。在用間皮素.MUC16 TFP或CAR-T細胞進行之實驗中，目標細胞係間皮素或MUC16陽性細胞，而用作陰性對照之細胞係間皮素或MUC16陰性細胞。

洗滌目標細胞一次，並將其以1×10⁶ 個細胞/毫升再懸浮於PBS中。將螢光染料羧基螢光素二乙酸琥珀醯亞胺酯(CFSE) (Thermo Fisher Scientific®)以0.03 μM濃度添加至細胞懸浮液中並在室溫下培育細胞20分鐘。藉由向細胞懸浮液中添加體積為反應體積5倍的完全細胞培養基(RPMI®-1640 + 10% HI-FBS)來停止標記反應，並在室溫下再培育細胞兩分鐘。藉由離心使細胞集結成團並將其以2×10⁵ 個細胞/毫升再懸浮於細胞毒性培養基(不含酚紅之RPMI-1640 (Invitrogen®)加5% AB血清(Gemini Bio-products)中。向96孔U形底盤(Corning® Life Sciences)各孔中添加五十微升CFSE標記之目標細胞懸浮液(相當於10,000個細胞)。

洗滌用TFP構築體轉導之效應T細胞以及作為陰性對照的未轉導之T細胞並以2×10⁶ 個細胞/毫升或1×10⁶ 個細胞/毫升懸浮於細胞毒性培養基中。將50 µL效應T細胞懸浮液(相當於100,000或50,000個細胞)添加至塗鋪之目標細胞中，分別達到10:1或5:1的效應細胞與目標細胞比率，總體積係100 µL。接著，混合細胞，短暫離心並在37℃及5% CO₂ 下培育四小時。在該培育之後，立即根據製造商的推薦，將7AAD (7-胺基放線菌素D) (BioLegend®)添加至培養之細胞中，並用BD LSRFortessa® X-20 (BD® Biosciences)執行流式細胞測量術。使用FlowJo®軟體(TreeStar, Inc.)對流式細胞測量術資料進行分析。

藉由用含效應T細胞及目標細胞之樣品中存活目標細胞(CFSE+7-AAD-)之數量除以僅含目標細胞之樣品中存活(CFSE+7-AAD-)細胞之數量來計算目標細胞之存活率百分比。以目標細胞殺滅之百分比計算效應細胞之細胞毒性=100% - 細胞存活率百分比。

當與未經轉導或經非間皮素或MUC16特異性CAR對照轉導之T細胞相比較時，用抗MSLN.MUC16 28ζ CAR構築體或抗MSLN抗MUC16 BBζ CAR構築體轉導之T細胞可展示針對間皮素表現細胞或MUC16表現細胞之細胞毒性。然而，經抗間皮素-CD3ε及抗MUC16-CD3ε轉導之T細胞誘導的針對目標之細胞毒性比抗間皮素CAR對照有效。抗間皮素-CD3γ及抗MUC16-CD3γ TFP亦可介導穩固細胞毒性，該細胞毒性高於利用效應子:目標比率介於5與10:1之間的抗間皮素及抗MUC16-CAR所觀察到的細胞毒性。利用以替代性鉸鏈區構築之TFP可獲得類似結果。再次，抗間皮素-CD3ε及抗MUC16-CD3ε或抗間皮素-CD3γ及抗MUC16-CD3γ TFP轉導之T細胞針對間皮素或MUC16表現目標細胞之細胞毒性可高於利用抗間皮素-及抗MUC16-CAR轉導之T細胞。

電穿孔放入編碼對間皮素及MUC16具有特異性之TFP之mRNA的T細胞亦可展示針對間皮素表現細胞之穩固細胞毒性。利用對照或抗間皮素及抗MUC16 TFP構築體未觀察到對間皮素陰性細胞之顯著殺滅作用，而利用經抗間皮素及抗MUC16-CD3ε、或抗間皮素-及抗MUC16 CD3γ TFP轉導之T細胞可觀察到對間皮素或MUC16表現細胞之間皮素或MUC16特異性殺滅。實例 6 ： 藉由實時細胞毒性檢定測定細胞毒性

TFP亦可在實時細胞毒性檢定(RTCA)形式中展示優於CAR之優良細胞毒性。RTCA檢定實時量測專用96孔盤各孔中黏附目標細胞單層之電阻抗，並以數值形式呈現最終讀數，稱為細胞指數。細胞指數之改變指示目標細胞單層由於目標細胞經共培育之T細胞效應物殺滅而破壞。因此，可以根據同時含目標細胞及效應T細胞之孔的細胞指數相較於僅含目標細胞之孔的細胞指數變化來評價效應T細胞之細胞毒性。

在DMEM、10% FBS、1%抗生素-抗黴素(Life Technologies)中培養黏附目標細胞。為了製備RTCA，將例如50 µL DMEM培養基添加至E-板(ACEA Biosciences®, Inc，目錄號：JL-10-156010-1A)之適當孔中。接著，將板放入RTCA MP儀器(ACEA Biosciences, Inc.)中並如製造商手冊中所述，將適當板佈置及檢定方案輸入RTCA 2.0軟體中。每15分鐘進行基線量測，總計100次量測。接著，將1×10⁴ 個目標細胞/100 µL體積添加至每個檢定孔中並使細胞沈降15分鐘。將板放回讀取器中並再次讀數。

次日，洗滌效應T細胞並將其再懸浮於細胞毒性培養基(不含酚紅之RPMI1640 (Invitrogen®)加5% AB血清(Gemini Bio-products; 100-318)中。接著，自儀器中取出板並將懸浮於細胞毒性培養基(不含酚紅之RPMI®-1640 + 5% AB血清)中之效應T細胞以100,000個細胞或50,000個細胞添加至各孔中，以分別達到10:1或5:1之效應物與目標比率。接著，將板放回儀器中。每2分鐘進行量測，得到100個量測值，且接著每15分鐘量測，得到1,000個量測值。

在RTCA檢定中，如在添加效應細胞後細胞指數相對於單獨細胞或與經對照CAR構築體轉導之T細胞共培育之細胞存在時間依賴性降低所展示，藉由用抗間皮素-28ζ及抗MUC16-28ζCAR轉導之T細胞，或抗間皮素-BBζ及抗MUC16 BBζ CAR轉導之構築體可觀察到TFP轉導細胞之殺滅。然而，TFP表現T細胞之目標細胞殺滅作用可比利用CAR觀察到的更深且更快。舉例而言，在添加經TFP轉導之T細胞的4小時裏，間皮素或MUC16表現性目標細胞可基本上完全殺滅。利用經含其他CD3之TFP構築體及TCR構築體轉導之T細胞觀察到極低或無殺滅作用。利用以替代性鉸鏈區構築之TFP可獲得類似結果。TFP轉導之T細胞針對間皮素轉導之目標細胞的細胞毒性可高於CAR轉導之T細胞。

TFP轉導之T細胞的細胞毒性活性關於用於轉導之病毒的量(MOI)可具有劑量依賴性。利用遞增之TFP慢病毒MOI可觀察到間皮素陽性細胞之殺滅作用增加，由此進一步增強TFP轉導與細胞毒性活性之間的關係。實例 7 ：在具有高或低目標密度之細胞中進行的基於螢光素酶之細胞毒性檢定

基於螢光素酶之細胞毒性檢定藉由間接地量測在共培養後殘留存活目標細胞中螢光素酶之酶活性來評估TFP T細胞之細胞毒性。

使用人類腫瘤細胞株K562作為共培養用之目標細胞株。藉由用編碼人類MSLN、編碼人類MUC16胞外結構域之慢病毒或依序用兩種病毒轉導，產生不表現目標(「DN」)、表現MSLN (「MSLN+」)、表現MUC16 (「MUC16+」)或表現MSLN及MUC16 (「DP」)之K562細胞。藉由施加與慢病毒編碼之殘留基因相配的抗生素，選出穩定表現所需目標抗原之目標細胞。該等目標細胞經由用編碼螢火蟲螢光素酶之慢病毒轉導而進一步修飾成過度表現螢火蟲螢光素酶，且隨後抗生素選擇以產生穩定細胞株。

在典型細胞毒性檢定中，將目標細胞以每孔5000個細胞塗鋪於96孔盤中。將TFP T或對照細胞以一系列效應物與目標比添加至目標細胞中。接著，在37℃及5% CO₂ 下培養細胞混合物24或48小時，隨後藉由Bright-Glo®螢光素酶檢定系統(Promega®，目錄號E2610)量測存活目標細胞中螢光素酶之酶活性。對細胞離心以使其集結成團，並再懸浮於含有螢光素酶受質之培養基中。接著，用下式計算腫瘤細胞殺滅百分比：細胞毒性% = 100% × [1 – RLU (腫瘤細胞 + T細胞) / RLU (腫瘤細胞)]。實例 8 ： 如藉由 T 細胞上 CD69 或 CD25 上調所量測之活化

使用MSLN+或MUC16+及MSLN-或MUC16-細胞使表現CAR及TFP構築體之T細胞活化。如以上所描述，用50 MOI LV轉導活化之PBMC連續兩天，並擴增。轉導後第8天，將PBMC與目標細胞以1:1之E:T比率(每種細胞類型0.2 × 10⁶ 個)一起共培養於細胞毒性培養基(不含酚紅之RPMI1640 (Invitrogen®)加5% AB血清(Gemini Bio-products; 100-318))中。可使用過度表現BCMA之細胞作為陰性對照。開始共培養後24小時，收集細胞，用PBS洗滌三次並在冰上用Live/Dead Aqua染色30分鐘。為阻斷Fc受體，添加人類Fc阻斷劑(BD)並在室溫下培育10分鐘。隨後，用來自BD® Biosciences之抗CD3 APC (純系UCHT1)、抗CD8 APCcy7(純系SK1)、抗CD69-Alexa Fluor® 700 (純系FN50)以及抗CD25-PE (純系BC96, eBioscience®)對細胞染色。洗滌細胞兩次並藉由BD LSRII-Fortessa®進行分析。如上文所述，使用FlowJo®分析軟體(Tree star, Inc.)分析資料。

可使用MSLN-或MUC16-細胞及MSLN+或MUC16+細胞在未轉導之T細胞或經陽性對照結合物轉導之T細胞中進行類似實驗。

可藉由分析顆粒酶B產生，以類似方式評估T細胞活化。如上文所述培養T細胞並擴增，且根據製造商之套組說明書(Gemini Bio-products; 100-318)，針對顆粒酶B進行細胞內染色。收集細胞，用PBS洗滌三次並用人類Fc阻斷劑阻斷10分鐘。在4℃下，用抗CD3 APC (純系UCHT1)及抗CD8 APCcy7(純系SK1)對細胞中之表面抗原染色，保持30分鐘。接著，在4C下用固定/透性化溶液(BD Cytofix/Cytoperm®固定/透性化套組，目錄號554714)固定細胞20分鐘，隨後用BD Perm/Wash®緩衝液洗滌。隨後用抗顆粒酶B Alexafluor700® (純系GB11)使細胞染色，用BD Perm/Wash緩衝液洗滌兩次並使其再懸浮於FACS緩衝液中。在BD LSRII-Fortessa®上獲取資料並使用FlowJo® (Tree star Inc.)分析。實例 9 ：藉由 ELISA 進行細胞介素分泌之比較定量

與帶有同源抗原之細胞識別有關的效應T細胞活化及增殖的另一量度係效應細胞介素，諸如介白素-2 (IL-2)及干擾素-γ (IFN-γ)之產生。

粒細胞-巨噬細胞集落刺激因子(GM-CSF)及腫瘤壞死因子α (TNF-α)。

使用U-PLEX®生物標記物群I(hu)檢定(Meso Scale Diagnostics®, LLC, 目錄號：K15067L-4)，量測自共培養T細胞與各種基於K562之目標細胞後48小時收集的上清液中單特異性TFP T細胞及雙特異性TFP T細胞之目標特異性細胞介素產生，包括IL-2、IFN-γ、GM-CSF及TNF-α。

相對於未經轉導或經CAR轉導之對照T細胞，用TFP轉導之T細胞當與內源性表現間皮素或MUC16之細胞或經間皮素或MUC16轉導之細胞共培養時可產生較高量的IL-2及IFN-γ。相比之下，與間皮素或MUC16陰性細胞或未經轉導之細胞共培養可使TFP轉導之T細胞極少釋放或不釋放細胞介素。與先前的細胞毒性資料一致，用替代性鉸鏈區構築之TFP在與帶有間皮素或MUC16之目標細胞共培養後可產生類似結果。實例 10 ：對人類 MUC16 肽具有特異性之奈米抗體的產生及鑑別 材料及方法 使用人類 MUC16 肽 NFSPLARRVDRVAIYEEFLRMTRNGTQLQNFTLDRSSVLVDGYSPNRNEPLTGNSDLP (SEQ ID NO:92)轉型、再選殖及表現 V_HH 用重組pMECS GG轉型非抑制子菌株(例如WK6)

選殖於pMECS GG載體中之奈米抗體在N末端處含有PelB信號序列且在C末端處含有HA標籤及His₆ 標籤(SEQ ID NO: 117) (PelB前導序列-奈米抗體-HA-His₆ (SEQ ID NO: 117))。PelB前導序列將該奈米抗體引導至大腸桿菌之周質空間且HA及His₆ 標籤(SEQ ID NO: 117)可用於純化及偵測奈米抗體(例如利用ELISA、西方墨點法等)。

在pMECS GG載體中，His₆ 標籤(SEQ ID NO: 117)之後為琥珀終止密碼子(TAG)且該琥珀終止密碼子之後係M13噬菌體之基因III。在抑制性大腸桿菌菌株(例如TG1)中，琥珀終止密碼子讀為麩醯胺酸且因此，奈米抗體表現為具有該噬菌體之蛋白質III的融合蛋白，由此允許將奈米抗體展示於噬菌體衣殼上以供淘選。在非抑制性大腸桿菌菌株(例如WK6)中，琥珀終止密碼子讀為終止密碼子且因此，所得奈米抗體未與蛋白質III融合。

為了表現並純化選殖於pMECS GG載體中之奈米抗體，製備出含所關注奈米抗體之基因的pMECS GG載體並使用此質體轉型非抑制性菌株(例如WK6)。使用MP057引子(5’-TTATGCTTCCGGCTCGTATG-3’ (SEQ ID NO:99))對所得純系之奈米抗體測序以驗證該純系之屬性。藉由ELISA或任何其他適合檢定再測試抗原結合能力。含有帶奈米抗體基因之重組pMECS GG載體的非抑制性菌株(例如WK6)可用於表現及純化奈米抗體。將來自 pMECS GG 之奈米抗體再選殖至 pHEN6c 載體中

引子序列 ： -引子A6E (5’ GAT GTG CAG CTG CAG GAG TCT GGR GGA GG 3’) (SEQ ID NO:94)。 - 引子PMCF (5’ CTA GTG CGG CCG CTG AGG AGA CGG TGA CCT GGG T 3’) (SEQ ID NO:95)。 - 通用反向引子(5’ TCA CAC AGG AAA CAG CTA TGA C 3’) (SEQ ID NO:96)。 - 通用正向引子(5 CGC CAG GGT TTT CCC AGT CAC GAC 3’) (SEQ ID NO:97)。

藉由PCR，使用含帶有奈米抗體基因作為模板以及引子A6E及PMCF之重組pMECS GG的大腸桿菌擴增奈米抗體基因(約30個PCR循環，每個循環由在94℃下30秒、在55℃下30秒及在72℃下45秒，隨後在PCR結束時在72℃下延伸10分鐘組成)。使約400 bp之片段擴增。接著，純化PCR產物(例如藉由來自Qiagen®之QiaQuick® PCR純化套組)並用PstI消化過夜。

純化PCR產物並用BstEII(或用來自Fermentas Life Sciences®之Eco91I)消化過夜。如上所述純化PCR產物並用PstI消化pHEN6c載體3小時；如上所述純化經消化之載體且接著用BstEII消化2至3小時。使消化之載體在1%瓊脂糖凝膠上跑膠，切下凝膠中之載體譜帶並純化(例如藉由來自Qiagen之QIAQuick凝膠提取套組)。將PCR產物與載體連接在一起。用連接反應轉型電轉感受態WK6細胞。使用LB/瓊脂/胺比西林(100 μg/ml)/葡萄糖(1-2%)板選擇轉型株。奈米抗體之表現及純化 ：

使用新鮮轉型之WK6集落接種10-20 ml LB + 胺比西林 (100 µg/ml) + 葡萄糖(1%)並在37℃下，在200-250 rpm振盪下培育過夜。將1ml此預培養物添加至330 ml補充有100 µg/ml胺比西林、2mM MgCl₂ 及0.1%葡萄糖之TB培養基中，並使其在37℃下，在振盪(200-250 rpm)下生長直至達到OD₆₀₀ 為0.6-0.9。藉由添加IPTG達到1 mM最終濃度來誘導奈米抗體表現，並在28℃下，振盪培育培養物過夜(約16-18小時；過夜培育後，OD₆₀₀ 理想地應在25與30之間)。

以8000 rpm離心培養物8分鐘並將1公升培養物中之糰粒再懸浮於12 ml TES (Sigma-Aldrich®)中並在冰上振盪1小時。每使用12 ml TES，添加18 ml TES/4並在冰上再培育一小時(在振盪下)且接著在4℃下以8000 rpm離心30分鐘。上清液含有自周質空間提取之蛋白質。藉由 IMAC 純化

用PBS平衡His-select：每單位量來源於1公升培養物之周質空間，將1 ml樹脂添加(約2 ml His-select溶液)至50 ml falcon管中，添加PBS達到最終50 ml體積並混合，且接著以2000 rpm離心2分鐘，並丟棄上清液。用PBS洗滌樹脂兩次且接著添加周質提取物，並在室溫下，在輕柔振盪下培育30分鐘至1小時(較長培育時間可能引起非特異性結合)。

將樣品裝載至在底部帶有過濾器之PD-10管柱(GE healthcare，目錄號17-0435-01)上，並用50至100 ml PBS(每1 ml樹脂使用50-100 ml PBS)洗滌。執行3次溶離，每次使用1 ml PBS/0.5 M咪唑/1 ml樹脂，並在4℃下，針對PBS(截止值3500道爾頓)透析合併之溶離液過夜以去除咪唑。

此時，可藉由溶離樣品之OD₂₈₀ 量測值估計蛋白質之量。可藉由ProtParam工具，在Expasy蛋白質組伺服器上依據一級結構測定每個純系之消光係數。可藉由不同方法實現奈米抗體之進一步純化。舉例而言，可藉由在4℃下以2000 rpm離心直至獲得適於裝載至Superdex® 75 16/60上之體積(最多4 ml)，對樣品進行濃縮(Vivaspin® 5000 MW截止值，Vivascience®)。接著，將濃縮之樣品裝載至用PBS平衡之Superdex 75 16/60管柱上。彙集峰溶離份並在OD₂₈₀ 下量測樣品以進行定量。等分試樣以約1 mg/ml濃度儲存於-20℃。免疫接種

在第0天、第7天、第14天、第21天、第28天及第35天，對美洲駝皮下注射結合至KLH 之人類MUC16肽(hMUC16)(NFSPLARRVDRVAIYEEFLRMTRNGTQLQNFTLDRSSVLVDGYSPNRNEPLTGNSDLP-C-KLH) (SEQ ID NO:93)及/或在C末端生物素化之人類MUC16肽(NFSPLARRVDRVAIYEEFLRMTRNGTQLQNFTLDRSSVLVDGYSPNRNEPLTGNSDLP-C-生物素) (SEQ ID NO: 110)及/或在N末端生物素化之人類MUC16肽(生物素-NFSPLARRVDRVAIYEEFLRMTRNGTQLQNFTLDRSSVLVDGYSPNRNEPLTGNSDLP) (SEQ ID NO: 92)。將生物素化肽與中性抗生物素蛋白混合，隨後注射。所用佐劑係GERBU佐劑P(GERBU Biotechnik GmbH)。在第40天，自美洲駝收集約100 ml抗凝血液以製備淋巴細胞。VHH 文庫之構築

由美洲駝淋巴細胞構築VHH文庫以篩選抗原特異性奈米抗體之存在。為此，使用來自末梢血液淋巴細胞之總RNA作為利用寡聚(dT)引子合成第一股cDNA之模板。使用此cDNA，藉由PCR擴增VHH編碼序列，用SAPI消化，並選殖至噬菌粒載體pMECS-GG之SAPI位點中。由此獲得的VHH文庫稱為Core 93GG。該文庫由約10⁸ 個獨立轉型體組成，其中約87%之轉型體帶有適當插入序列大小之載體。人類 MUC16 肽特異性奈米抗體之分離

針對在C末端或N末端生物素化之hMUC16肽NFSPLARRVDRVAIYEEFLRMTRNGTQLQNFTLDRSSVLVDGYSPNRNEPLTGNSDLP (SEQ ID NO:92)(bio-hMUC16)淘選Core 93GG文庫，持續4輪。使bio-hMUC16肽與塗有抗生蛋白鏈菌素之盤相互作用，之後將來自文庫之噬菌體添加至該盤中。在每輪淘選之後，藉由將自塗有抗原之孔溶離之噬菌粒顆粒的數量與自陰性對照孔(塗有抗生蛋白鏈菌素並阻斷，而且不含肽)溶離之噬菌粒顆粒的數量相比較來評估抗原特異性噬菌體之富集情況。該等實驗表明，在第2輪之後，噬菌體群富集抗原特異性噬菌體約2倍。在第1輪、第3輪及第4輪後未觀察到富集。總體而言，隨機選出380個集落(190個來自第3輪，190個來自第4輪)並藉由ELISA分析其周質提取物(ELISA使用包括可溶性奈米抗體之粗周質提取物)中抗原特異性奈米抗體之存在。用於ELISA篩選之肽與用於淘選之肽相同，使用不含肽的經阻斷之塗有抗生蛋白鏈菌素之孔作為陰性對照。在該380個集落中，有34個集落在此檢定中評為陽性。基於陽性集落之序列資料，辨別出6種不同的全長奈米抗體，屬於2個不同的CDR3群(B細胞譜系)(參見Excel文件)。屬於同一CDR3群(同一B細胞譜系)之奈米抗體極其類似且其胺基酸序列表明，其來自因體細胞高頻突變而純系相關之B細胞或來自同一B細胞但因在文庫構築期間RT及/或PCR誤差而不同。屬於同一CDR3群之奈米抗體識別同一抗原決定基，但其他特徵(例如親和力、效力、穩定性、表現量等)可能不同。由該等淘選得到的純系在其名稱中帶有以下代碼：MU。hMUC16 肽特異性奈米抗體之流式細胞測量分析 奈米抗體及細胞

以與上述關於初始ELISA篩選所進行相同之方式產生各抗hMUC16肽Nb之周質提取物。將來自各細胞株(SKOV3 Muc16 Luc、OVCAR 3 Muc16 Luc、Expi-293及Jurkat)之細胞解凍，洗滌並計數。將來自每一Nb純系之周質提取物與約2×10⁵ 個細胞一起培育。在洗滌後，將細胞與小鼠抗HA標籤抗體及抗小鼠PE之混合物一起培育。再次洗滌後，將To-pro® (Thermo Fisher Scientific®)作為活細胞/死細胞染色劑添加至各樣品中並在流式細胞儀上分析該等細胞。使用基於SKOV3 Muc16 Luc及OVCAR 3 Muc16 Luc之人類抗Muc16-4h11 (+ 抗人類IgG-PE + To-pro)作為陽性對照Mab。使用以下各細胞株作為陰性對照：含不相關Nb (BCII10 – 細菌β內醯胺酶特異性)之樣品、含有偵測Mab之樣品、僅含二次抗小鼠PE Mab之樣品及僅含細胞(含及不含To-pro)之樣品。實例 11 ： 基於流式細胞測量術的 Jurkat 人類 T 細胞株中 MSLN 及 MUC16 特異性 TFP 偵測

先使用流式細胞測量術評價Jurkat人類T細胞株中MSLN及MUC16雙特異性TFP之表現。使用編碼MSLN特異性TFP、MUC16特異性TFP或雙特異性TFP(MSLN TFP及MUC16 TFP藉由T2A序列連接於單一慢病毒載體中)之慢病毒製劑轉導Jurkat細胞。

慢病毒轉導之後四十八小時，收集經轉導之Jurkat細胞及未經轉導(NT)之對照細胞並分析表面MSLN特異性及MUC16特異性TFP之表現。藉由Fc_MSLN，即帶有Fc標籤之人類間皮素/MSLN (296-580)蛋白質(AcroBiosystems，目錄號：MSN-H526x)偵測MSLN特異性TFP。用Zenon™別藻藍蛋白人類IgG標記套組(ThermoFisher Scientific，目錄號：Z25451)標記蛋白質並以每份樣品1μg用於染色。

藉由MUC16-生物素肽(UniProtKB: Q8WXI7，aa 14319-14438，在New England Peptide合成)，隨後用抗生蛋白鏈菌素-PE(BD Bioscience，目錄號：554061)偵測MUC16特異性TFP。MUC16肽係以40皮莫耳/樣品使用。所有Jurkat細胞(NT、MSLN TFP、MUC16 TFP及雙特異性TFP)均先同時用經標記Fc_MSLN及MUC16-生物素染色，接著用抗生蛋白鏈菌素-PE染色。

在經編碼MSLN TFP之慢病毒轉導的Jurkat細胞上偵測到MSLN特異性TFP之表現，但未偵測到MUC16 TFP之表現(圖3B)。此外，在經編碼MUC16 TFP之慢病毒轉導的Jurkat細胞上偵測到MUC16 TFP，但未偵測到MSLN TFP(圖3C)。對於經編碼雙特異性TFP之慢病毒轉導的Jurkat細胞，在同一群經轉導Jurkat細胞之表面上同時偵測到MSLN TFP及MUC16 TFP(圖3D)。在NT Jurkat細胞中未偵測到MSLN TFP或MUC16 TFP(圖3A)。實例 13 ：雙特異性 TFP Jurkat 細胞中目標特異性細胞介素之產生

量測在將Jurkat細胞與不表現目標(「DN」)、表現MSLN (「MSLN+」)、表現MUC16 (「MUC16+」)或表現MSLN及MUC16 (「DP」)的各種基於K562之目標細胞共培養之後24小時收集的上清液中非特異性TFP Jurkat細胞及雙特異性TFP Jurkat細胞之目標特異性細胞介素產生。使用Meso Scale Discovery Technology (MesoScale Diagnostic, LLC)，利用U-PLEX生物標記物I群(hu)檢定(目錄號K15067L-4)分析上清液中人類IL-2之水準。

NT Jurkat細胞在與任何目標腫瘤細胞之共培養物中均不產生任何可偵測之IL-2(圖4)。單特異性TFP Jurkat細胞僅在與表現相配目標之目標細胞(亦即，與表現或過度表現MSLN之K562細胞共培養之MSLN TFP Jurkat細胞，及與表現或過度表現MUC16之K562細胞共培養之MUC16 TFP Jurkat細胞)的共培養物中產生IL-2。MSLN TFP Jurkat細胞在與MSLN+目標細胞或DP目標細胞之共培養物中產生IL-2，但在與DN或MUC16+目標細胞之共培養物中不產生。MUC16 TFP Jurkat細胞在與MUC16+目標細胞或DP目標細胞之共培養物中產生IL-2，但在與DN或MSLN+目標細胞之共培養物中不產生。雙特異性TFP Jurkat細胞響應於表現目標、僅表現MSLN(MSLN+)、僅表現MUC16 (MUC16+)或表現兩種目標(DP)之目標細胞而產生IL-2，展示出比兩種單特異性TFP Jurkat細胞更寬的反應性(圖4)。在與不表現目標(DN)之目標細胞之共培養物中不產生IL-2確定雙特異性TFP之特異性。實例 14 ： 基於流式細胞測量術的原代人類 T 細胞中 MSLN 及 MUC16 雙特異性 TFP 偵測

NT、MSLN TFP、MUC16 TFP及雙特異性TFP T細胞係藉由用編碼單特異性或雙特異性TFP之慢病毒轉導,由健康供體T細胞產生。自健康供體PBMC純化出T細胞並在第0天，在優質級人類IL-7 (Miltenyi Biotech，目錄號：130-095-364)及優質級人類IL-15 (Miltenyi Biotech，目錄號：130-095-766)存在下，藉由MACS GMP T Cell TransAct® (Miltenyi® Biotech，目錄號：130-019-011)活化。第1天，用慢病毒轉導活化T細胞並藉由每2天補充新鮮培養基，使細胞擴增10天。

第10天，收集T細胞並如上文所述，藉由流式細胞測量術，用Fc_MSLN及MUC16-生物素肽染色以測定單特異性或雙特異性TFP之表面表現。除配位體外，亦使用MonoRab®兔抗駱駝VHH抗體[iFluor488] (GenScript®，目錄號：A01862)偵測TFP。

與使用Jurkat細胞之檢定所觀察到的結果類似，偵測到MSLN TFP T細胞中MSLN特異性TFP之表現(圖5C)，但未偵測到MUC16 TFP表現(圖5D)；此外，偵測到MUC16 TFP T中MUC16 TFP之表現(圖5F)，但未偵測到MSLN TFP表現(圖5E)。對於雙特異性TFP T細胞，在經轉導細胞之表面上偵測到MSLN TFP及MUC16 TFP(圖5G及5H)。在NT T細胞中未偵測到MSLN TFP或MUC16 TFP(圖5A及5B)。實例 15 ： 雙特異性 TFP T 細胞之目標特異性腫瘤細胞殺滅作用

使用活體外細胞毒性檢定，使用根據實例14製備之原代人類T細胞評價單特異性及雙特異性TFP T細胞之目標特異性腫瘤細胞殺滅作用。穩定地轉導不表現目標(DN)、表現MSLN (MSLN+)、表現MUC16 (MUC16+)或表現MSLN及MUC16 (DP)之腫瘤細胞株(如實例13中所述)以表現螢火蟲螢光素酶作為報告子。在與NT或TFP T細胞共培養四十八小時之後，利用Bright-Glo^TM 螢光素酶檢定系統(Promega®，目錄號E2610)測定作為活腫瘤細胞標記物的共培養之細胞之螢光素酶活性。接著，用下式計算腫瘤細胞殺滅百分比：細胞毒性% = 100% × [1 – RLU (腫瘤細胞+ T細胞) / RLU (腫瘤細胞)]。

正如預期，NT T細胞顯示未偵測到針對任何目標細胞之殺滅作用(圖6)。單特異性TFP T細胞僅殺滅表現相配目標之目標細胞。MSLN TFP T細胞明顯殺滅MSLN+目標細胞或DP目標細胞，但不殺滅DN或MUC16+目標細胞。MUC16 TFP T細胞完全殺滅MUC16+目標細胞或DP目標細胞，但不殺滅DN或MSLN+目標細胞。雙特異性TFP T細胞明顯殺滅表現目標、僅表現MSLN (MSLN+)、僅表現MUC16 (MUC16+)或表現兩種目標(DP)之目標細胞，展示出比兩種單特異性TFP T細胞更寬的反應性(圖6)。缺乏針對不表現目標(DN)之目標細胞的殺滅作用確定雙特異性TFP T細胞之特異性。實例 17 ： 雙特異性 TFP T 細胞產生目標特異性細胞因子

藉由先前實例中所述之方法製備並轉導原代人類T細胞。使用U-PLEX®生物標記物群I(hu)檢定(Meso Scale Diagnostics®, LLC, 目錄號：K15067L-4)，量測自共培養T細胞與各種基於K562之目標細胞後48小時收集的上清液中單特異性TFP T細胞及雙特異性TFP T細胞之目標特異性細胞介素產生，包括IFN-γ、GM-CSF及TNF-α。

所有TFP T細胞當與表現相配目標之腫瘤細胞共培養時均產生大量IFN-γ (圖7A)。與缺乏針對具有不相配目標表現之腫瘤細胞的殺滅作用及其特異性相符，在與MUC16+目標細胞一起培養之MSLN TFP T細胞或在與MSLN+目標細胞一起培養之MUC16 TFP T細胞中未觀察到細胞介素產生。相反，觀察到雙特異性TFP T細胞具有比任一單特異性TFP T細胞廣泛之反應性，且在與MSLN+、MUC16+或DP目標細胞共培養後觀察到大量IFN-γ產生(圖7A)。

在單特異性TFP T細胞及雙特異性TFP T細胞中觀察到大量產生GM-CSF (圖7B)及TNF-α (圖7C)，且針對腫瘤細胞具有類似反應模式。MSLN TFP及MUC16 TFP T細胞當與目標相配之腫瘤細胞共培養時僅產生細胞介素，但與目標不相配之細胞共培養時沒有產生細胞介素。雙特異性TFP T細胞對表現一種或兩種目標之目標細胞起反應。實例 18 ：臨床研究

招錄患有伴隨復發或難治性疾病之不可切除型卵巢癌的患者進行表現MSLN-MUC16-TFP之T細胞的臨床研究。初始研究將探索表現MSLN-MUC16-TFP之T細胞的安全型態並探索細胞動力學及藥效學結果。該等結果將獲悉用於進一步研究之劑量選擇，接著將該等劑量投與一大組患有不可切除型卵巢癌之患者以確定表現MSLN-MUC16-TFP之T細胞的功效型態。實例 19 ：藉由流式細胞測量術測定 CD107a 暴露

有關T細胞活化之另一檢定係CD107a之表面表現，CD107a係位於休止細胞中細胞質細胞溶解顆粒膜中之溶酶體相關膜蛋白(LAMP-1)。效應T細胞脫粒，作為細胞溶解活性之先決條件，使CD107a在活化誘導之顆粒胞吐之後經調動至細胞表面。因此，除細胞介素產生外，CD107a暴露亦提供有關T細胞活化之額外量度，此與細胞毒性密切相關。

分開洗滌目標細胞及效應細胞並將其再懸浮於細胞毒性培養基(RPMI+5%人類AB血清 + 1%抗生素抗黴素)。該檢定係藉由以下方式執行：在每孔0.5 µL PE/Cy7標記之抗人類CD107a (LAMP-1)抗體(純系H4A3, BD® Biosciences)存在下，在U形底96孔盤(Corning)中，將2×10⁵ 個效應細胞與2×10⁵ 個目標細胞組合，最終體積為100 µL。接著，在37℃、5% CO₂ 下，將培養物培育一小時。在此培育之後，在不破壞細胞的情況下，立即向各孔中小心地添加10 µL分泌抑制劑莫能黴素(monensin)之1:10稀釋液(1000x溶液，BD GolgiStop^TM )。接著，在37℃、5% CO₂ 下，再培育盤2.5小時。在此培育之後，用APC抗人類CD3抗體(純系UCHT1, BD Biosciences)、PerCP/Cy5.5抗人類CD8抗體(純系SK1, BD Biosciences)及太平洋藍抗人類CD4抗體(純系RPA-T4, BD Biosciences)對細胞染色，且接著在37℃、5% CO₂ 下培育30分鐘。接著，用FACS緩衝液洗滌細胞2次，並在分析之前，將其再懸浮於100 µL FACS緩衝液及100 µl IC固定緩衝液中。

藉由流式細胞測量術偵測T細胞表面上CD107a之暴露情況。流式細胞測量術係使用LSRFortessa^® X20 (BD Biosciences)執行並使用FlowJo®軟體(Treestar, Inc. Ashland, OR)分析流式細胞測量術資料。測定各效應細胞/目標細胞培養物中CD3閘控內呈CD107 +ve之CD8+效應細胞的百分比。

與先前的細胞毒性及細胞介素資料相符，共培養腫瘤相關抗原表現目標細胞與經抗腫瘤相關抗原28ζ CAR轉導之效應T細胞可誘導表面CD107a表現相對於與腫瘤相關抗原陰性目標細胞一起培育之效應物增加。比較而言，在相同條件下，抗腫瘤相關抗原-CD3ε LL或抗腫瘤相關抗原-CD3γ LL TFP表現效應物可展現對CD107a表現之5至7倍誘導作用。用替代性鉸鏈區構築之抗腫瘤相關抗原TFP在與帶有腫瘤相關抗原之目標細胞共培養後可產生類似的結果。實例 20 ： 活體內小鼠功效研究

為了評估用抗腫瘤相關抗原TFP轉導之效應T細胞在活體內實現抗腫瘤反應之能力，將用抗腫瘤相關抗原-28ζ CAR、抗腫瘤相關抗原-CD3ε TFP或抗腫瘤相關抗原-CD3γ TFP轉導之效應T細胞過繼轉移至先前接種有腫瘤相關抗原+人類癌細胞株之NOD/SCID/IL-2Rγ −/− (NSG-JAX)小鼠中。

在開始研究前，自Jackson Laboratory (庫存號005557)獲得至少6週齡的雌性NOD/SCID/IL-2Rγ−/− (NSG-JAX)小鼠，並在用於實驗之前，使其適應3天。將接種用人類腫瘤相關抗原表現細胞株維持在對數期培養，隨後收集並用台盼藍計數以確定活細胞數量。在腫瘤激發當天，以300g離心細胞5分鐘並將其以0.5-1×10⁶ 個細胞/100µL再懸浮於預先加溫之無菌PBS中。製備未經轉導或者經抗腫瘤相關抗原-28ζ CAR、抗腫瘤相關抗原-CD3ε TFP或抗CD3γ TFP構築體轉導之T細胞進行過繼轉移。在研究第0天，用0.5-1×10⁶ 個腫瘤相關抗原表現細胞經靜脈內激發每個實驗組之10隻動物。3天後，將5×10⁶ 個效應T細胞群用100 µL無菌PBS經靜脈內轉移至各動物中。每天記錄下有關動物之詳細臨床觀察結果，直至實施安樂死。每週量測所有動物之體重，直至死亡或實施安樂死。在過繼轉移測試物及對照物之後35天，對所有動物實施安樂死。由研究主管與獸醫商議對研究期間看起來瀕死之任何動物實施安樂死。

相對於未經轉導之T細胞，過繼轉移經抗腫瘤相關抗原-28ζ CAR、抗腫瘤相關抗原-CD3ε TFP或抗腫瘤相關抗原-CD3γ TFP轉導之T細胞可延長荷瘤小鼠中間皮素表現細胞株之存活期，且可指示抗腫瘤相關抗原CAR及TFP轉導之T細胞能夠介導目標細胞殺滅，並相應地增加該等小鼠模型之存活期。總體而言，該等資料可指示，TFP表示用於工程改造嵌合受體之替代性平台，該等嵌合受體在活體外及活體內展示針對第一代CAR之優良抗原特異性殺滅作用。表 2 – 例示性序列

SEQ ID NO.	名稱	序列
1.	(G₄ S)₃ 連接子	GGGGSGGGGSGGGGSLE
2.	(G₄ S)₄ 連接子	GGGSGGGGSGGGGSGGGGSLE
3.	人類CD3-ε	MQSGTHWRVLGLCLLSVGVWGQDGNEEMGGITQTPYKVSISGTTVILTCPQYPGSEILWQHNDKNIGGDEDDKNIGSDEDHLSLKEFSELEQSGYYVCYPRGSKPEDANFYLYLRARVCENCMEMDVMSVATIVIVDICITGGLLLLVYYWSKNRKAKAKPVTRGAGAGGRQRGQNKERPPPVPNPDYEPIRKGQRDLYSGLNQRRI
4.	人類CD3-γ	MEQGKGLAVLILAIILLQGTLAQSIKGNHLVKVYDYQEDGSVLLTCDAEAKNITWFKDGKMIGFLTEDKKKWNLGSNAKDPRGMYQCKGSQNKSKPLQVYYRMCQNCIELNAATISGFLFAEIVSIFVLAVGVYFIAGQDGVRQSRASDKQTLLPNDQLYQPLKDREDDQYSHLQGNQLRRN
5.	人類CD3-δ	MEHSTFLSGLVLATLLSQVSPFKIPIEELEDRVFVNCNTSITWVEGTVGTLLSDITRLDLGKRILDPRGIYRCNGTDIYKDKESTVQVHYRMCQSCVELDPATVAGIIVTDVIATLLLALGVFCFAGHETGRLSGAADTQALLRNDQVYQPLRDRDDAQYSHLGGNWARNKS
6.	人類CD3-ζ	MKWKALFTAAILQAQLPITEAQSFGLLDPKLCYLLDGILFIYGVILTALFLRVKFSRSADAPAYQQGQNQLYNELNLGRREEYDVLDKRRGRDPEMGGKPQRRKNPQEGLYNELQKDKMAEAYSEIGMKGERRRGKGHDGLYQGLSTATKDTYDALHMQALPPR
7.	人類TCR α鏈	MAGTWLLLLLALGCPALPTGVGGTPFPSLAPPIMLLVDGKQQMVVVCLVLDVAPPGLDSPIWFSAGNGSALDAFTYGPSPATDGTWTNLAHLSLPSEELASWEPLVCHTGPGAEGHSRSTQPMHLSGEASTARTCPQEPLRGTPGGALWLGVLRLLLFKLLLFDLLLTCSCLCDPAGPLPSPATTTRLRALGSHRLHPATETGGREATSSPRPQPRDRRWGDTPPGRKPGSPVWGEGSYLSSYPTCPAQAWCSRSALRAPSSSLGAFFAGDLPPPLQAGA
8.	人類TCR α鏈C區	PNIQNPDPAVYQLRDSKSSDKSVCLFTDFDSQTNVSQSKDSDVYITDKTVLDMRSMDFKSNSAVAWSNKSDFACANAFNNSIIPEDTFFPSPESSCDVKLVEKSFETDTNLNFQNLSVIGFRILLLKVAGFNLLMTLRLWSS
9.	人類TCR α鏈V區CTL-L17	MAMLLGASVLILWLQPDWVNSQQKNDDQQVKQNSPSLSVQEGRISILNCDYTNSMFDYFLWYKKYPAEGPTFLISISSIKDKNEDGRFTVFLNKSAKHLSLHIVPSQPGDSAVYFCAAKGAGTASKLTFGTGTRLQVTL
10.	人類TCR β鏈C區	EDLNKVFPPEVAVFEPSEAEISHTQKATLVCLATGFFPDHVELSWWVNGKEVHSGVSTDPQPLKEQPALNDSRYCLSSRLRVSATFWQNPRNHFRCQVQFYGLSENDEWTQDRAKPVTQIVSAEAWGRADCGFTSVSYQQGVLSATILYEILLGKATLYAVLVSALVLMAMVKRKDF
11.	人類TCR β鏈V區CTL-L17	MGTSLLCWMALCLLGADHADTGVSQNPRHNITKRGQNVTFRCDPISEHNRLYWYRQTLGQGPEFLTYFQNEAQLEKSRLLSDRFSAERPKGSFSTLEIQRTEQGDSAMYLCASSLAGLNQPQHFGDGTRLSIL
12.	人類TCR β鏈V區YT35	MDSWTFCCVSLCILVAKHTDAGVIQSPRHEVTEMGQEVTLRCKPISGHNSLFWYRQTMMRGLELLIYFNNNVPIDDSGMPEDRFSAKMPNASFSTLKIQPSEPRDSAVYFCASSFSTCSANYGYTFGSGTRLTVV
13.	編碼單結構域抗MUC16結合物1 (SD1)之核酸序列	caggtgcagctgcaggagtctgggggaggattggtgcaggctgggggctctctgagactctcctgtgcagcctctggacgcaccgtcagtagcttgttcatgggctggttccgccaagctccagggaaggagcgtgaacttgtagcagccattagccggtatagtctatatacatactatgcagactccgtgaagggccgattcaccatctccgcagacaacgccaagaacgcggtatatctgcaaatgaacagcctgaaacctgaggacacggccgtttattactgtgcatcaaagttggaatatacttctaatgactatgactcctggggccaggggacccaggtcaccgtctcctca
14.	單結構域抗MUC16結合物R3MU4	QVQLQESGGGLVQAGGSLRLSCAASGRTVSSLF MGWFRQAPGKERELVAAISRYSLYT YYADSVKGRFTISADNAKNAVYLQMNSLKPEDTAVYYCASKLEYTSNDYDS WGQGTQVTVSS
15.	R3MU4CDR1	GRTVSSLF
16.	R3MU4 CDR2	ISRYSLYT
17.	R3MU4 CDR3	ASKLEYTSNDYDS
18.	編碼單結構域抗MUC16 R3MU29之核酸序列	caggtgcagctgcaggagtctgggggaggattggtgcaggctggggactctctgagactctcctgtgcagcctctggacgcgccgtcagtagcttgttcatgggctggttccgccgagctccagggaaggagcgtgaacttgtagcagccattagccggtatagtctatatacatactatgcagactccgtgaagggccgattcaccatctccgcagacaacgccaagaacgcggtatatctgcaaatgaacagcctaaaacctgaggacacggccgtttattactgtgcatcaaagttggaatatacttctaatgactatgactcctggggccaggggacccaggtcaccgtctcctca
19.	單結構域抗MUC16 R3MU29	QVQLQESGGGLVQAGDSLRLSCAASGRAVSSLF MGWFRRAPGKERELVAAISRYSLYT YYADSVKGRFTISADNAKNAVYLQMNSLKPEDTAVYYCASKLEYTSNDYDS WGQGTQVTVSS
20.	R3MU29 CDR1	GRAVSSLF
21.	R3MU29 CDR2	ISRYSLYT
22.	R3MU29 CDR3	ASKLEYTSNDYDS
23.	編碼單結構域抗MUC16 R3MU63之核酸序列	caggtgcagctgcaggagtctgggggaggattggtgcaggctggggactctctgagactctcctgtgcagcctctggacgcaccgtcagtagcttgttcatggggtggttccgccgagctccagggaaggagcgtgaacttgtagcagccattagccggtatagtctatatacatactatgcagactccgtgaagggccgattcaccatctccgcagacaacgccaagaacgcggtatatctgcaaatgaacagcctgaaacctgaggacacggccgtttattactgtgcatcaaagttggaatatacttctaatgactatgactcctggggccaggggacccaggtcaccgtctcctca
24.	單結構域抗MUC16 R3MU63	QVQLQESGGGLVQAGDSLRLSCAASGRTVSSLF MGWFRRAPGKERELVAAISRYSLYT YYADSVKGRFTISADNAKNAVYLQMNSLKPEDTAVYYCASKLEYTSNDYDS WGQGTQVTVSS
25.	R3MU63 CDR1	GRTVSSLF
26.	R3MU63 CDR2	ISRYSLYT
27.	R3MU63 CDR3	ASKLEYTSNDYDS
28.	編碼單結構域抗MUC16 R3MU119之核酸序列	caggtgcagctgcaggagtctgggggaggtttggtgcagcctggggattctatgagactctcctgtgcagccgagggggactctttggatggttatgtagtaggttggttccgccaggccccagggaaggagcgccagggggtctcaagtattagtggcgatggcagtatgcgatacgttgctgactccgtgaaggggcgattcaccatctcccgagacaacgccaagaacacggtgtatctgcaaatgatcgacctgaaacctgaggacacaggcgtttattactgtgcagcagacccacccacttgggactactggggtcaggggacccaggtcaccgtctcctca
29.	單結構域抗MUC16 R3MU119	QVQLQESGGGLVQPGDSMRLSCAAEGDSLDGYV VGWFRQAPGKERQGVSSISGDGSMR YVADSVKGRFTISRDNAKNTVYLQMIDLKPEDTGVYYCAADPPTWDY WGQGTQVTVSS
30.	R3MU119 CDR1	GDSLDGYV
31.	R3MU119 CDR2	ISGDGSMR
32.	R3MU119 CDR3	AADPPTWDY
33.	編碼單結構域抗MUC16 R3MU150之核酸序列	caggtgcagctgcaggagtctgggggaggcttggtgcagcctggggggtctctgagactctcctgtgcagcctctggacgcaccgtcagtagcttgttcatgggctggttccgccgagctccagggaaggagcgtgaacttgtagcagccattagccggtatagtctatatacatactatgcagactccgtgaagggccgattcaccatctccgcagacaacgccaagaacgcggtatatctgcaaatgaacagcctgaaacctgaggacacggccgtttattactgtgcatcaaagttggaatatacttctaatgactatgactcctggggccaggggacccaggtcaccgtctcctca
34.	單結構域抗MUC16 R3MU150	QVQLQESGGGLVQPGGSLRLSCAASGRTVSSLF MGWFRRAPGKERELVAAISRYSLY TYYADSVKGRFTISADNAKNAVYLQMNSLKPEDTAVYYCASKLEYTSNDYDS WGQGTQVTVSS
35.	R3MU150 CDR1	GRTVSSLF
36.	R3MU150 CDR2	ISRYSLYT
37.	R3MU150 CDR3	ASKLEYTSNDYDS
38.	編碼單結構域抗MUC16 R3MU147之核酸序列	caggtgcagctgcaggagtctgggggaggattggtgcaggctggggagtctctgagactctcctgtgcagcctctggacgcaccgtcagtagcttgttcatgggctggttccgccgagctccagggaaggagcgtgaacttgtagcagccattagccggtatagtctatatacatactatgcagactccgtgaagggccgattcaccatctccgcagacaacgccaagaacgcggtatatctgcaaatgaacagcctgaaacctgaggacacggccgtttattactgtgcatcaaagttggaatatacttctaatgactatgactcctggggccaggggacccaggtcaccgtctcctca
39.	單結構域抗MUC16 R3MU147	QVQLQESGGGLVQAGESLRLSCAASGRTVSSLF MGWFRRAPGKERELVAAISRYSLYT YYADSVKGRFTISADNAKNAVYLQMNSLKPEDTAVYYCASKLEYTSNDYDS WGQGTQVTVSS
40.	R3MU147 CDR1	GRTVSSLF
41.	R3MU147 CDR2	ISRYSLYT
42.	R3MU147 CDR3	ASKLEYTSNDYDS
43.	R3MU29h15 (98.9%人類)	E VQLV ESGGGLVQP GG SLRLSCAASGRAVSSLF MGWV RQ APGKGL EW VS AISRYSLYT YYADSVKGRFTISR DNAKNTL YLQMNSLR PEDTAVYYCASKLEYTSNDYDS WGQGTL VTVSS
44.	R3MU29h14 (97.8%人類)	E VQLV ESGGGLVQP GG SLRLSCAASGRAVSSLF MGWFRQ APGKGL EW VS AISRYSLYT YYADSVKGRFTISR DNAKNTL YLQMNSLR PEDTAVYYCASKLEYTSNDYDS WGQGTL VTVSS
45.	R3MU29h13 (96.7%人類)	E VQLV ESGGGLVQP GG SLRLSCAASGRAVSSLF MGWFRQ APGKGL ELVS AISRYSLYT YYADSVKGRFTISR DNAKNTL YLQMNSLR PEDTAVYYCASKLEYTSNDYDS WGQGTL VTVSS
46.	R3MU4h13 (98.9%人類)	E VQLV ESGGGLVQP GGSLRLSCAASGRTVSSLF MGWV RQAPGKGL EW VS AISRYSLYT YYADSVKGRFTISR DNAKNTL YLQMNSLR PEDTAVYYCASKLEYTSNDYDS WGQGTL VTVSS
47.	R3MU4h12 (97.8%人類)	E VQLV ESGGGLVQP GGSLRLSCAASGRTVSSLF MGWFRQAPGKGL EW VS AISRYSLYT YYADSVKGRFTISR DNAKNTL YLQMNSLR PEDTAVYYCASKLEYTSNDYDS WGQGTL VTVSS
48.	R3MU4h11 (96.7%人類)	E VQLV ESGGGLVQP GGSLRLSCAASGRTVSSLF MGWFRQAPGKGL ELVS AISRYSLYT YYADSVKGRFTISR DNAKNTL YLQMNSLR PEDTAVYYCASKLEYTSNDYDS WGQGTL VTVSS
49.	MSLN DNA Seq.	acgcgtgtagtcttatgcaatactcttgtagtcttgcaacatggtaacgatgagttagcaacatgccttacaaggagagaaaaagcaccgtgcatgccgattggtggaagtaaggtggtacgatcgtgccttattaggaaggcaacagacgggtctgacatggattggacgaaccactgaattgccgcattgcagagatattgtatttaagtgcctagctcgatacaataaacgggtctctctggttagaccagatctgagcctgggagctctctggctaactagggaacccactgcttaagcctcaataaagcttgccttgagtgcttcaagtagtgtgtgcccgtctgttgtgtgactctggtaactagagatccctcagacccttttagtcagtgtggaaaatctctagcagtggcgcccgaacagggacctgaaagcgaaagggaaaccagagctctctcgacgcaggactcggcttgctgaagcgcgcacggcaagaggcgaggggcggcgactggtgagtacgccaaaaattttgactagcggaggctagaaggagagagatgggtgcgagagcgtcagtattaagcgggggagaattagatcgcgatgggaaaaaattcggttaaggccagggggaaagaaaaaatataaattaaaacatatagtatgggcaagcagggagctagaacgattcgcagttaatcctggcctgttagaaacatcagaaggctgtagacaaatactgggacagctacaaccatcccttcagacaggatcagaagaacttagatcattatataatacagtagcaaccctctattgtgtgcatcaaaggatagagataaaagacaccaaggaagctttagacaagatagaggaagagcaaaacaaaagtaagaccaccgcacagcaagcggccactgatcttcagacctggaggaggagatatgagggacaattggagaagtgaattatataaatataaagtagtaaaaattgaaccattaggagtagcacccaccaaggcaaagagaagagtggtgcagagagaaaaaagagcagtgggaataggagctttgttccttgggttcttgggagcagcaggaagcactatgggcgcagcctcaatgacgctgacggtacaggccagacaattattgtctggtatagtgcagcagcagaacaatttgctgagggctattgaggcgcaacagcatctgttgcaactcacagtctggggcatcaagcagctccaggcaagaatcctggctgtggaaagatacctaaaggatcaacagctcctggggatttggggttgctctggaaaactcatttgcaccactgctgtgccttggaatgctagttggagtaataaatctctggaacagattggaatcacacgacctggatggagtgggacagagaaattaacaattacacaagcttaatacactccttaattgaagaatcgcaaaaccagcaagaaaagaatgaacaagaattattggaattagataaatgggcaagtttgtggaattggtttaacataacaaattggctgtggtatataaaattattcataatgatagtaggaggcttggtaggtttaagaatagtttttgctgtactttctatagtgaatagagttaggcagggatattcaccattatcgtttcagacccacctcccaaccccgaggggacccgacaggcccgaaggaatagaagaagaaggtggagagagagacagagacagatccattcgattagtgaacggatctcgacggtatcggttaacttttaaaagaaaaggggggattggggggtacagtgcaggggaaagaatagtagacataatagcaacagacatacaaactaaagaattacaaaaacaaattacaaaattcaaaattttatcgatactagtattatgcccagtacatgaccttatgggactttcctacttggcagtacatctacgtattagtcatcgctattaccatggtgatgcggttttggcagtacatcaatgggcgtggatagcggtttgactcacggggatttccaagtctccaccccattgacgtcaatggga 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50.	MSLN胺基酸序列：人類間皮素序列(UniProt登錄號Q13421)	MALPTARPLLGSCGTPALGSLLFLLFSLGWVQPSRTLAGETGQEAAPLDGVLANPPNISSLSPRQLLGFPCAEVSGLSTERVRELAVALAQKNVKLSTEQLRCLAHRLSEPPEDLDALPLDLLLFLNPDAFSGPQACTRFFSRITKANVDLLPRGAPERQRLLPAALACWGVRGSLLSEADVRALGGLACDLPGRFVAESAEVLLPRLVSCPGPLDQDQQEAARAALQGGGPPYGPPSTWSVSTMDALRGLLPVLGQPIIRSIPQGIVAAWRQRSSRDPSWRQPERTILRPRFRREVEKTACPSGKKAREIDESLIFYKKWELEACVDAALLATQMDRVNAIPFTYEQLDVLKHKLDELYPQGYPESVIQHLGYLFLKMSPEDIRKWNVTSLETLKALLEVNKGHEMSPQVATLIDRFVKGRGQLDKDTLDTLTAFYPGYLCSLSPEELSSVPPSSIWAVRPQDLDTCDPRQLDVLYPKARLAFQNMNGSEYFVKIQSFLGGAPTEDLKALSQQNVSMDLATFMKLRTDAVLPLTVAEVQKLLGPHVEGLKAEERHRPVRDWILRQRQDDLDTLGLGLQGGIPNGYLVLDLSMQEALSGTPCLLGPGPVLTVLALLLASTLA
51.	p510_抗MSLN_SS1_CD3ε DNA	acgcgtgtagtcttatgcaatactcttgtagtcttgcaacatggtaacgatgagttagcaacatgccttacaaggagagaaaaagcaccgtgcatgccgattggtggaagtaaggtggtacgatcgtgccttattaggaaggcaacagacgggtctgacatggattggacgaaccactgaattgccgcattgcagagatattgtatttaagtgcctagctcgatacaataaacgggtctctctggttagaccagatctgagcctgggagctctctggctaactagggaacccactgcttaagcctcaataaagcttgccttgagtgcttcaagtagtgtgtgcccgtctgttgtgtgactctggtaactagagatccctcagacccttttagtcagtgtggaaaatctctagcagtggcgcccgaacagggacctgaaagcgaaagggaaaccagagctctctcgacgcaggactcggcttgctgaagcgcgcacggcaagaggcgaggggcggcgactggtgagtacgccaaaaattttgactagcggaggctagaaggagagagatgggtgcgagagcgtcagtattaagcgggggagaattagatcgcgatgggaaaaaattcggttaaggccagggggaaagaaaaaatataaattaaaacatatagtatgggcaagcagggagctagaacgattcgcagttaatcctggcctgttagaaacatcagaaggctgtagacaaatactgggacagctacaaccatcccttcagacaggatcagaagaacttagatcattatataatacagtagcaaccctctattgtgtgcatcaaaggatagagataaaagacaccaaggaagctttagacaagatagaggaagagcaaaacaaaagtaagaccaccgcacagcaagcggccactgatcttcagacctggaggaggagatatgagggacaattggagaagtgaattatataaatataaagtagtaaaaattgaaccattaggagtagcacccaccaaggcaaagagaagagtggtgcagagagaaaaaagagcagtgggaataggagctttgttccttgggttcttgggagcagcaggaagcactatgggcgcagcctcaatgacgctgacggtacaggccagacaattattgtctggtatagtgcagcagcagaacaatttgctgagggctattgaggcgcaacagcatctgttgcaactcacagtctggggcatcaagcagctccaggcaagaatcctggctgtggaaagatacctaaaggatcaacagctcctggggatttggggttgctctggaaaactcatttgcaccactgctgtgccttggaatgctagttggagtaataaatctctggaacagattggaatcacacgacctggatggagtgggacagagaaattaacaattacacaagcttaatacactccttaattgaagaatcgcaaaaccagcaagaaaagaatgaacaagaattattggaattagataaatgggcaagtttgtggaattggtttaacataacaaattggctgtggtatataaaattattcataatgatagtaggaggcttggtaggtttaagaatagtttttgctgtactttctatagtgaatagagttaggcagggatattcaccattatcgtttcagacccacctcccaaccccgaggggacccgacaggcccgaaggaatagaagaagaaggtggagagagagacagagacagatccattcgattagtgaacggatctcgacggtatcggttaacttttaaaagaaaaggggggattggggggtacagtgcaggggaaagaatagtagacataatagcaacagacatacaaactaaagaattacaaaaacaaattacaaaattcaaaattttatcgatactagtattatgcccagtacatgaccttatgggactttcctacttggcagtacatctacgtattagtcatcgctattaccatggtgatgcggttttggcagtacatcaatgggcgtggatagcggtttgactcacggggatttccaagtctccaccccattgacgtcaatgggagtttgttttggcaccaaaatcaacgggactttccaaaatgtcgtaacaactccgccccattgacgcaaatgggcggtaggcgtgtacggtgggaggtttatataagcagagctcgtttagtgaaccgtcagatcgcctggagacgccatccacgctgttttgacctccatagaagattctagagccgccaccatgcttctcctggtgacaagccttctgctctgtgagttaccacacccagcattcctcctgatcccagacattcagcaggtccagctccagcagtctggccctgaactcgaaaaacctggcgctagcgtgaaaatttcctgtaaagcctccggctactcttttactggctacacaatgaattgggtgaaacagtctcacggcaaatccctcgaatggatcggactcatcacaccctacaatggcgcctcttcctacaaccagaaattccggggcaaggcaacactcactgtggacaaatcatcctctaccgcctacatggatctgctctccctcacatctgaggactccgctgtctacttttgtgcccgaggaggatacgacggacgaggattcgattactggggacagggaacaactgtgaccgtgtctagtggcggcggagggagtggaggcggaggatcttctggcgggggatccgatattgaactcacacagtctcccgctatcatgtctgcttctcccggcgagaaagtgactatgacttgctctgcttcctcttctgtgtcctacatgcactggtaccagcagaaatctggcacatcccctaaacggtggatctacgatactagcaaactggcatccggcgtgcctgggcgattctctggctctggctctggcaactcttactctctcacaatctcatctgtcgaggctgaggacgatgccacatactactgtcagcagtggtctaaacacccactcacattcggcgctggcactaaactggaaataaaagcggccgcaggtggcggcggttctggtggcggcggttctggtggcggcggttctctcgaggatggtaatgaagaaatgggtggtattacacagacaccatataaagtctccatctctggaaccacagtaatattgacatgccctcagtatcctggatctgaaatactatggcaacacaatgataaaaacataggcggtgatgaggatgataaaaacataggcagtgatgaggatcacctgtcactgaaggaattttcagaattggagcaaagtggttattatgtctgctaccccagaggaagcaaaccagaagatgcgaacttttatctctacctgagggcaagagtgtgtgagaactgcatggagatggatgtgatgtcggtggccacaattgtcatagtggacatctgcatcactgggggcttgctgctgctggtttactactggagcaagaatagaaaggccaaggccaagcctgtgacacgaggagcgggtgctggcggcaggcaaaggggacaaaacaaggagaggccaccacctgttcccaacccagactatgagcccatccggaaaggccagcgggacctgtattctggcctgaatcagagacgcatctgataagaattcgatccgcggccgcgaaggatctgcgatcgctccggtgcccgtcagtgggcagagcgcacatcgcccacagtccccgagaagttggggggaggggtcggcaattgaacgggtgcctagagaaggtggcgcggggtaaactgggaaagtgatgtcgtgtactggctccgcctttttcccgagggtgggggagaaccgtatataagtgcagtagtcgccgtgaacgttctttttcgcaacgggtttgccgccagaacacagctgaagcttcgaggggctcgcatctctccttcacgcgcccgccgccctacctgaggccgccatccacgccggttgagtcgcgttctgccgcctcccgcctgtggtgcctcctgaactgcgtccgccgtctaggtaagtttaaagctcaggtcgagaccgggcctttgtccggcgctcccttggagcctacctagactcagccggctctccacgctttgcctgaccctgcttgctcaactctacgtctttgtttcgttttctgttctgcgccgttacagatccaagctgtgaccggcgcctacgctagatgaccgagtacaagcccacggtgcgcctcgccacccgcgacgacgtccccagggccgtacgcaccctcgccgccgcgttcgccgactaccccgccacgcgccacaccgtcgatccggaccgccacatcgagcgggtcaccgagctgcaagaactcttcctcacgcgcgtcgggctcgacatcggcaaggtgtgggtcgcggacgacggcgccgcggtggcggtctggaccacgccggagagcgtcgaagcgggggcggtgttcgccgagatcggcccgcgcatggccgagttgagcggttcccggctggccgcgcagcaacagatggaaggcctcctggcgccgcaccggcccaaggagcccgcgtggttcctggccaccgtcggcgtctcgcccgaccaccagggcaagggtctgggcagcgccgtcgtgctccccggagtggaggcggccgagcgcgccggggtgcccgccttcctggagacctccgcgccccgcaacctccccttctacgagcggctcggcttcaccgtcaccgccgacgtcgaggtgcccgaaggaccgcgcacctggtgcatgacccgcaagcccggtgcctgagtcgacaatcaacctctggattacaaaatttgtgaaagattgactggtattcttaactatgttgctccttttacgctatgtggatacgctgctttaatgcctttgtatcatgctattgcttcccgtatggctttcattttctcctccttgtataaatcctggttgctgtctctttatgaggagttgtggcccgttgtcaggcaacgtggcgtggtgtgcactgtgtttgctgacgcaacccccactggttggggcattgccaccacctgtcagctcctttccgggactttcgctttccccctccctattgccacggcggaactcatcgccgcctgccttgcccgctgctggacaggggctcggctgttgggcactgacaattccgtggtgttgtcggggaaatcatcgtcctttccttggctgctcgcctgtgttgccacctggattctgcgcgggacgtccttctgctacgtcccttcggccctcaatccagcggaccttccttcccgcggcctgctgccggctctgcggcctcttccgcgtcttcgccttcgccctcagacgagtcggatctccctttgggccgcctccccgcctggtacctttaagaccaatgacttacaaggcagctgtagatcttagccactttttaaaagaaaaggggggactggaagggctaattcactcccaacgaaaataagatctgctttttgcttgtactgggtctctctggttagaccagatctgagcctgggagctctctggctaactagggaacccactgcttaagcctcaataaagcttgccttgagtgcttcaagtagtgtgtgcccgtctgttgtgtgactctggtaactagagatccctcagacccttttagtcagtgtggaaaatctctagcagtagtagttcatgtcatcttattattcagtatttataacttgcaaagaaatgaatatcagagagtgagaggaacttgtttattgcagcttataatggttacaaataaagcaatagcatcacaaatttcacaaataaagcatttttttcactgcattctagttgtggtttgtccaaactcatcaatgtatcttatcatgtctggctctagctatcccgcccctaactccgcccagttccgcccattctccgccccatggctgactaattttttttatttatgcagaggccgaggccgcctcggcctctgagctattccagaagtagtgaggaggcttttttggaggcctagacttttgcagagacggcccaaattcgtaatcatggtcatagctgtttcctgtgtgaaattgttatccgctcacaattccacacaacatacgagccggaagcataaagtgtaaagcctggggtgcctaatgagtgagctaactcacattaattgcgttgcgctcactgcccgctttccagtcgggaaacctgtcgtgccagctgcattaatgaatcggccaacgcgcggggagaggcggtttgcgtattgggcgctcttccgcttcctcgctcactgactcgctgcgctcggtcgttcggctgcggcgagcggtatcagctcactcaaaggcggtaatacggttatccacagaatcaggggataacgcaggaaagaacatgtgagcaaaaggccagcaaaaggccaggaaccgtaaaaaggccgcgttgctggcgtttttccataggctccgcccccctgacgagcatcacaaaaatcgacgctcaagtcagaggtggcgaaacccgacaggactataaagataccaggcgtttccccctggaagctccctcgtgcgctctcctgttccgaccctgccgcttaccggatacctgtccgcctttctcccttcgggaagcgtggcgctttctcatagctcacgctgtaggtatctcagttcggtgtaggtcgttcgctccaagctgggctgtgtgcacgaaccccccgttcagcccgaccgctgcgccttatccggtaactatcgtcttgagtccaacccggtaagacacgacttatcgccactggcagcagccactggtaacaggattagcagagcgaggtatgtaggcggtgctacagagttcttgaagtggtggcctaactacggctacactagaaggacagtatttggtatctgcgctctgctgaagccagttaccttcggaaaaagagttggtagctcttgatccggcaaacaaaccaccgctggtagcggtggtttttttgtttgcaagcagcagattacgcgcagaaaaaaaggatctcaagaagatcctttgatcttttctacggggtctgacgctcagtggaacgaaaactcacgttaagggattttggtcatgagattatcaaaaaggatcttcacctagatccttttaaattaaaaatgaagttttaaatcaatctaaagtatatatgagtaaacttggtctgacagttaccaatgcttaatcagtgaggcacctatctcagcgatctgtctatttcgttcatccatagttgcctgactccccgtcgtgtagataactacgatacgggagggcttaccatctggccccagtgctgcaatgataccgcgagacccacgctcaccggctccagatttatcagcaataaaccagccagccggaagggccgagcgcagaagtggtcctgcaactttatccgcctccatccagtctattaattgttgccgggaagctagagtaagtagttcgccagttaatagtttgcgcaacgttgttgccattgctacaggcatcgtggtgtcacgctcgtcgtttggtatggcttcattcagctccggttcccaacgatcaaggcgagttacatgatcccccatgttgtgcaaaaaagcggttagctccttcggtcctccgatcgttgtcagaagtaagttggccgcagtgttatcactcatggttatggcagcactgcataattctcttactgtcatgccatccgtaagatgcttttctgtgactggtgagtactcaaccaagtcattctgagaatagtgtatgcggcgaccgagttgctcttgcccggcgtcaatacgggataataccgcgccacatagcagaactttaaaagtgctcatcattggaaaacgttcttcggggcgaaaactctcaaggatcttaccgctgttgagatccagttcgatgtaacccactcgtgcacccaactgatcttcagcatcttttactttcaccagcgtttctgggtgagcaaaaacaggaaggcaaaatgccgcaaaaaagggaataagggcgacacggaaatgttgaatactcatactcttcctttttcaatattattgaagcatttatcagggttattgtctcatgagcggatacatatttgaatgtatttagaaaaataaacaaataggggttccgcgcacatttccccgaaaagtgccacctgacgtctaagaaaccattattatcatgacattaacctataaaaataggcgtatcacgaggccctttcgtctcgcgcgtttcggtgatgacggtgaaaacctctgacacatgcagctcccggagacggtcacagcttgtctgtaagcggatgccgggagcagacaagcccgtcagggcgcgtcagcgggtgttggcgggtgtcggggctggcttaactatgcggcatcagagcagattgtactgagagtgcaccatatgcggtgtgaaataccgcacagatgcgtaaggagaaaataccgcatcaggcgccattcgccattcaggctgcgcaactgttgggaagggcgatcggtgcgggcctcttcgctattacgccagctggcgaaagggggatgtgctgcaaggcgattaagttgggtaacgccagggttttcccagtcacgacgttgtaaaacgacggccagtgccaagctg
52.	p510_抗MSLN_SS1_CD3ε胺基酸	MLLLVTSLLLCELPHPAFLLIPDIQQVQLQQSGPELEKPGASVKISCKASGYSFTGYTMNWVKQSHGKSLEWIGLITPYNGASSYNQKFRGKATLTVDKSSSTAYMDLLSLTSEDSAVYFCARGGYDGRGFDYWGQGTTVTVSSGGGGSGGGGSSGGGSDIELTQSPAIMSASPGEKVTMTCSASSSVSYMHWYQQKSGTSPKRWIYDTSKLASGVPGRFSGSGSGNSYSLTISSVEAEDDATYYCQQWSKHPLTFGAGTKLEIKAAAGGGGSGGGGSGGGGSLEDGNEEMGGITQTPYKVSISGTTVILTCPQYPGSEILWQHNDKNIGGDEDDKNIGSDEDHLSLKEFSELEQSGYYVCYPRGSKPEDANFYLYLRARVCENCMEMDVMSVATIVIVDICITGGLLLLVYYWSKNRKAKAKPVTRGAGAGGRQRGQNKERPPPVPNPDYEPIRKGQRDLYSGLNQRRI*
53.	抗MSLN輕鏈胺基酸(MHC1445LC.1)	DVVMTQTPLSLPVSLGDQASISCRSSQSLVHSNGNTYLHWYLQKPGQSPKLLIYKVSNRFSGVPDRFSGSGSGTDFTLKITRVEAEDLGVFFCSQSTHVPFTFGSGTKLEIK
54.	抗MSLN輕鏈DNA (MHC1445LC.1)	gatgttgtgatgacccaaactccactctccctgcctgtcagtcttggagatcaagcctccatctcttgcagatctagtcagagccttgtacacagtaatggaaacacctatttacattggtacctgcagaagccaggccagtctccaaagctcctgatctacaaagtttccaaccgattttctggggtcccagacaggttcagtggcagtggatcagggactgatttcacactcaagatcaccagagtggaggctgaggatctgggagtttttttctgctctcaaagtacacatgttccattcacgttcggctcggggacaaagttggaaataaaa
55.	抗MSLN 重鏈胺基酸(MHC1445HC.1)	QVQLQQSGAELVRPGASVTLSCKASGYTFFDYEMHWVKQTPVHGLEWIGAIDPEIDGTAYNQKFKGKAILTADKSSSTAYMELRSLTSEDSAVYYCTDYYGSSYWYFDVWGTGTTVTVSS
56.	抗MSLN 重鏈DNA (MHC1445HC.1)	caggttcaactgcagcagtctggggctgagctggtgaggcctggggcttcagtgacgctgtcctgcaaggcttcgggctacacattttttgactatgaaatgcactgggtgaagcagacacctgtgcatggcctggaatggattggagctattgatcctgaaattgatggtactgcctacaatcagaagttcaagggcaaggccatactgactgcagacaaatcctccagcacagcctacatggagctccgcagcctgacatctgaggactctgccgtctattactgtacagattactacggtagtagctactggtacttcgatgtctggggcacagggaccacggtcaccgtctcctc
57.	抗MSLN輕鏈胺基酸(MHC1446LC.1)	DVMMTQTPLSLPVSLGDQASISCRSSQSLVHSNGNTYLHWFLQKPGQSPKLLIYKVSNRFSGVPDRFSGSGSGTDFTLKISRVEAEDLGVYFCSQTTHVPLTFGAGTKLELK
58.	抗MSLN輕鏈DNA (MHC1446LC.1)	gatgttatgatgacccaaactccactctccctgcctgtcagtcttggagatcaagcctccatctcttgcagatctagtcagagccttgtacacagtaatggaaacacctatttacattggttcctgcagaagccaggccagtctccaaagctcctgatctacaaagtttccaaccgattttctggggtcccagacaggttcagtggcagtggatcagggacagatttcacactcaagatcagcagagtggaggctgaggatctgggagtttatttctgctctcaaactacacatgttccgctcacgttcggtgctgggaccaagctggagctgaaa
59.	抗MSLN重鏈胺基酸(MHC1446HC.3)	QVQLQQSGAELVRPGASVTLSCKASGYTFTDYEMHWVKQTPVHGLEWIGAIDPEIAGTAYNQKFKGKAILTADKSSSTAYMELRSLTSEDSAVYYCSRYGGNYLYYFDYWGQGTTLTVSS
60.	抗MSLN重鏈DNA (MHC1446HC.3)	caggttcaactgcagcagtctggggctgagctggtgaggcctggggcttcagtgacgctgtcctgcaaggcttcgggctacacttttactgactatgaaatgcactgggtgaagcagacacctgtccatggcctggaatggattggagctattgatcctgaaattgctggtactgcctacaatcagaagttcaagggcaaggccatactgactgcagacaaatcctccagcacagcctacatggagctccgcagcctgacatctgaggactctgccgtctattactgttcaagatacggtggtaactacctttactactttgactactggggccaaggcaccactctcacagtctcctca
61.	抗MSLN輕鏈胺基酸(MHC1447LC.5)	DVLMTQIPLSLPVSLGDQASISCRSSQNIVYSNGNTYLEWYLQKPGQSPKLLIYKVSNRFSGVPDRFSGSGSGTDFTLKISRVEAEDLGVYYCFQGSHVPFTFGSGTKLEIK
62.	抗MSLN輕鏈DNA (MHC1447LC.5)	gatgttttgatgacccaaattccactctccctgcctgtcagtcttggagatcaagcctccatctcttgcagatctagtcagaacattgtgtatagtaatggaaacacctatttagagtggtacctgcagaaaccaggccagtctccaaagctcctgatctacaaagtttccaaccgattttctggggtcccagacaggttcagtggcagtggatcagggacagatttcacactcaagatcagcagagtggaggctgaggatctgggagtttattactgctttcaaggttcacatgttccattcacgttcggctcggggacaaagttggaaataaaa
63.	抗MSLN重鏈胺基酸(MHC1447HC.5)	QVQLQQSGAELVRPGASVTLSCKASGYTFTDYEMHWVKQTPVHGLEWIGAIDPEIGGSAYNQKFKGRAILTADKSSSTAYMELRSLTSEDSAVYYCTGYDGYFWFAYWGQGTLVTVSS
64.	抗MSLN重鏈DNA (MHC1447HC.5)	caggttcaactgcagcagtccggggctgagctggtgaggcctggggcttcagtgacgctgtcctgcaaggcttcgggctacacatttactgactatgaaatgcactgggtgaagcagacacctgtgcatggcctggaatggattggagctattgatcctgaaattggtggttctgcctacaatcagaagttcaagggcagggccatattgactgcagacaaatcctccagcacagcctacatggagctccgcagcctgacatctgaggactctgccgtctattattgtacgggctatgatggttacttttggtttgcttactggggccaagggactctggtcactgtctcttca
65.	抗MSLN輕鏈胺基酸(MHC1448LC.4)	ENVLTQSPAIMSASPGEKVTMTCSASSSVSYMHWYQQKSSTSPKLWIYDTSKLASGVPGRFSGSGSGNSYSLTISSMEAEDVATYYCFQGSGYPLTFGSGTKLEIK
66.	抗MSLN輕鏈DNA (MHC1448LC.4)	gaaaatgttctcacccagtctccagcaatcatgtccgcatctccaggggaaaaggtcaccatgacctgcagtgctagctcaagtgtaagttacatgcactggtaccagcagaagtcaagcacctcccccaaactctggatttatgacacatccaaactggcttctggagtcccaggtcgcttcagtggcagtgggtctggaaactcttactctctcacgatcagcagcatggaggctgaagatgttgccacttattactgttttcaggggagtgggtacccactcacgttcggctcggggacaaagttggaaataaaa
67.	抗MSLN重鏈胺基酸(MHC1448HC.3)	QVQLQQSGAELVRPGASVTLSCKASGYTFTDYEMHWVKQTPVHGLEWIGGIDPETGGTAYNQKFKGKAILTADKSSSTAYMELRSLTSEDSAVYYCTSYYGSRVFWGTGTTVTVSS
68.	抗MSLN重鏈DNA (MHC1448HC.3)	caggttcaactgcagcagtctggggctgagctggtgaggcctggggcttcagtgacgctgtcctgcaaggcttcgggctacacatttactgactatgaaatgcactgggtgaaacagacacctgtgcatggcctggaatggattggaggtattgatcctgaaactggtggtactgcctacaatcagaagttcaagggtaaggccatactgactgcagacaaatcctccagcacagcctacatggagctccgcagcctgacatctgaggactctgccgtctattactgtacaagttactatggtagtagagtcttctggggcacagggaccacggtcaccgtctcctca
69.	抗MSLN輕鏈胺基酸(MHC1449LC.3)	QIVLSQSPAILSAFPGEKVTMTCRASSSVSYMHWYQQKPGSSPKPWIYATSNLASGVPARFSGSGSGTSYSLTISSVEAEDAATYYCQQWSSNPPTLTFGAGTKLELK
70.	抗MSLN輕鏈DNA (MHC1449LC.3)	caaattgttctctcccagtctccagcaatcctgtctgcatttccaggggagaaggtcactatgacttgcagggccagctcaagtgtaagttacatgcactggtaccagcagaagccaggatcctcccccaaaccctggatttatgccacatccaacctggcttctggagtccctgctcgcttcagtggcagtgggtctgggacctcttactctctcacaatcagcagtgtggaggctgaagatgctgccacttattactgccagcagtggagtagtaacccacccacgctcacgttcggtgctgggaccaagctggagctgaaa
71.	抗MSLN重鏈胺基酸(MHC1449HC.3)	QVQLQQSGAELARPGASVKLSCKASGYTFTSYGISWVKQRTGQGLEWIGEIYPRSGNTYYNESFKGKVTLTADKSSGTAYMELRSLTSEDSAVYFCARWGSYGSPPFYYGMDYWGQGTSVTVSS
72.	抗MSLN重鏈DNA (MHC1449HC.3)	caggttcagctgcagcagtctggagctgagctggcgaggcctggggcttcagtgaagctgtcctgcaaggcttctggctacaccttcacaagctatggtataagctgggtgaagcagaggactggacagggccttgagtggattggagagatttatcctagaagtggtaatacttactacaatgagagcttcaagggcaaggtcacactgaccgcagacaaatcttccggcacagcgtacatggagctccgcagcctgacatctgaggactctgcggtctatttctgtgcaagatggggctcctacggtagtccccccttttactatggtatggactactggggtcaaggaacctcagtcaccgtctcctca
73.	抗MSLN輕鏈胺基酸(MHC1450LC.3)	DVLMTQTPLSLPVSLGNQASISCRSSQSIVHSSGSTYLEWYLQKPGQSPKLLIYKVSNRFSGVPDRFSGSGSGTDFTLKISRVEAEDLGVYYCFQGSHVPYTFGGGTKLEIK
74.	抗MSLN輕鏈DNA (MHC1450LC.3)	gatgttttgatgacccaaactccactctccctgcctgtcagtcttggaaatcaagcctccatctcttgcagatctagtcagagcattgtacatagtagtggaagcacctatttagaatggtacctgcagaaaccaggccagtctccaaagctcctgatctacaaagtttccaaccgattttctggggtcccagacaggttcagtggcagtggatcagggacagatttcacactcaagatcagcagagtggaggctgaggatctgggagtttattactgctttcaaggctcacatgttccatacacgttcggaggggggaccaagctggaaataaaa
75.	抗MSLN重鏈胺基酸(MHC1450HC.5)	QVQLQQSGAELARPGTSVKVSCKASGYTFTSYGISWVKQRIGQGLEWIGEIHPRSGNSYYNEKIRGKATLTADKSSSTAYMELRSLISEDSAVYFCARLITTVVANYYAMDYWGQGTSVTVSS
76.	抗MSLN重鏈DNA (MHC1450HC.5)	caggttcagctgcagcagtctggagctgagctggcgaggcctgggacttcagtgaaggtgtcctgcaaggcttctggctataccttcacaagttatggtataagctgggtgaagcagagaattggacagggccttgagtggattggagagattcatcctagaagtggtaatagttactataatgagaagatcaggggcaaggccacactgactgcagacaaatcctccagcacagcgtacatggagctccgcagcctgatatctgaggactctgcggtctatttctgtgcaaggctgattactacggtagttgctaattactatgctatggactactggggtcaaggaacctcagtcaccgtctcctca
77.	抗MSLN輕鏈胺基酸(MHC1451LC.1)	DIVMSQSPSSLAVSAGEKVTMSCKSSQSLLNSRTRKNYLAWYQQKPGQSPKLLIYWASTRESGVPDRFTGSGSGTDFTLTISSVQAEDLAVYYCKQSYNLVTFGAGTKLELK
78.	抗MSLN輕鏈DNA (MHC1451LC.1)	gacattgtgatgtcacagtctccatcctccctggctgtgtcagcaggagagaaggtcactatgagctgcaaatccagtcagagtctgctcaacagtagaacccgaaagaactacttggcttggtaccagcagaaaccagggcagtctcctaaactgctgatctactgggcatccactagggaatctggggtccctgatcgcttcacaggcagtggatctgggacagatttcactctcaccatcagcagtgtgcaggctgaagacctggcagtttattactgcaaacaatcttataatctggtcacgttcggtgctgggaccaagctggagctgaaa
79.	抗MSLN重鏈胺基酸(MHC1451HC.2)	QVQLQQSGAELVRPGASVTLSCKASGYTFFDYEMHWVKQTPVHGLEWIGAIDPEIDGTAYNQKFKGKAILTADKSSSTAYMELRSLTSEDSAVYYCTDYYGSSYWYFDVWGTGTTVTVSS
80.	抗MSLN重鏈DNA (MHC1451HC.2)	caggttcaactgcagcagtctggggctgagctggtgaggcctggggcttcagtgacgctgtcctgcaaggcttcgggctacacattttttgactatgaaatgcactgggtgaagcagacacctgtgcatggcctggaatggattggagctattgatcctgaaattgatggtactgcctacaatcagaagttcaagggcaaggccatactgactgcagacaaatcctccagcacagcctacatggagctccgcagcctgacatctgaggactctgccgtctattactgtacagattactacggtagtagctactggtacttcgatgtctggggcacagggaccacggtcaccgtctcctc
81.	抗MSLN輕鏈胺基酸(MHC1452LC.1)	QIVLTQSPAIMSASPGEKVTISCSASSSVSYMYWYQQKPGSSPKPWIYRTSNLASGVPARFSGSGSGTSYSLTISSMEAEDAATYYCQQYHSYPLTFGAGTKLELK
82.	抗MSLN輕鏈DNA (MHC1452LC.1)	caaattgttctcacccagtctccagcaatcatgtctgcatctccaggggagaaggtcaccatatcctgcagtgccagctcaagtgtaagttacatgtactggtaccagcagaagccaggatcctcccccaaaccctggatttatcgcacatccaacctggcttctggagtccctgctcgcttcagtggcagtgggtctgggacctcttactctctcacaatcagcagcatggaggctgaagatgctgccacttattactgccagcagtatcatagttacccactcacgttcggtgctgggaccaagctggagctgaaa
83.	抗MSLN輕鏈胺基酸(MHC1452LC.6)	QIVLTQSPAIMSASPGERVTMTCSASSSVSSSYLYWYQQKSGSSPKLWIYSISNLASGVPARFSGSGSGTSYSLTINSMEAEDAATYYCQQWSSNPQLTFGAGTKLELK
84.	抗MSLN輕鏈DNA (MHC1452LC.6)	caaattgttctcacccagtctccagcaatcatgtctgcatctcctggggaacgggtcaccatgacctgcagtgccagctcaagtgtaagttccagctacttgtactggtaccagcagaagtcaggatcctccccaaaactctggatttatagcatatccaacctggcttctggagtcccagctcgcttcagtggcagtgggtctgggacctcttactctctcacaatcaacagcatggaggctgaagatgctgccacttattactgccagcagtggagtagtaacccacagctcacgttcggtgctgggaccaagctggagctgaaa
85.	抗MSLN重鏈胺基酸(MHC1452HC.2)	QVQLKQSGAELVKPGASVKISCKASGYTFTDYYINWVKQRPGQGLEWIGKIGPGSGSTYYNEKFKGKATLTADKSSSTAYMQLSSLTSEDSAVYFCARTGYYVGYYAMDYWGQGTSVTVSS
86.	抗MSLN重鏈DNA (MHC1452HC.2)	caggtccagctgaagcagtctggagctgagctggtgaagcctggggcttcagtgaagatatcctgcaaggcttctggctacaccttcactgactactatataaactgggtgaagcagaggcctggacagggccttgagtggattggaaagattggtcctggaagtggtagtacttactacaatgagaagttcaagggcaaggccacactgactgcagacaaatcctccagcacagcctacatgcagctcagcagcctgacatctgaggactctgcagtctatttctgtgcaagaactggttactacgttggttactatgctatggactactggggtcaaggaacctcagtcaccgtctcctca
87.	抗MSLN重鏈胺基酸(MHC1452HC.4)	QVQLQQSGAELARPGASVKLSCKASGYTFTIYGISWVKQRTGQGLEWIGEIYPRSDNTYYNEKFKGKATLTADKSSSTAYMELRSLTSEDSAVYFCARWYSFYAMDYWGQGTSVTVSS
88.	抗MSLN重鏈DNA (MHC1452HC.4)	caggttcagctgcagcagtctggagctgagctggcgaggcctggggcttcagtgaagctgtcctgcaaggcttctggctacaccttcacaatctatggtataagctgggtgaaacagagaactggacagggccttgagtggattggagagatttatcctagaagtgataatacttactacaatgagaagttcaagggcaaggccacactgactgcagacaaatcctccagcacagcgtacatggagctccgcagcctgacatctgaggactctgcggtctatttctgtgcaagatggtactcgttctatgctatggactactggggtcaaggaacctcagtcaccgtctcctca
89.	單結構域抗MSLN結合物1 (SD1)	EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGGDWSANFMYWYRQAPGKQRELVARISGRGVVDYVESVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCAVASYWGQGTLVTVSS
90.	單結構域抗MSLN結合物4 (SD4)	EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGSTSSINTMYWYRQAPGKERELVAFISSGGSTNVRDSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCNTYIPYGGTLHDFWGQGTLVTVSS
91.	單結構域抗MSLN結合物6 (SD6)	QVQLVESGGGVVQAGGSLRLSCAASGSTFSIRAMRWYRQAPGTERDLVAVIYGSSTYYADAVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCNADTIGTARDYWGQGTLVTVSS
92.	MUC16免疫肽	NFSPLARRVDRVAIYEEFLRMTRNGTQLQNFTLDRSSVLVDGYSPNRNEPLTGNSDLP
93.	經修飾之MUC16免疫肽	NFSPLARRVDRVAIYEEFLRMTRNGTQLQNFTLDRSSVLVDGYSPNRNEPLTGNSDLPC
94.	引子A6E	GATGTGCAGCTGCAGGAGTCTGGRGGAGG
95.	引子PMCF	CTAGTGCGGCCGCTGAGGAGACGGTGACCTGGGT
96.	通用反向引子	TCACACAGGAAACAGCTATGAC
97.	通用正向因子	CGCCAGGGTTTTCCCAGTCACGAC
98.	RNA聚合酶裂解位點	AAUAAA
99.	MP057引子	TTATGCTTCCGGCTCGTATG

尾注

儘管本文中已顯示並描述本發明之較佳實施例，但熟習此項技術者將顯而易見，該等實施例僅僅作為舉例提供。在不偏離本發明之情況下，熟習此項技術者現可以進行多種變更、改變及取代。應瞭解，本文所述的本發明實施例之各種替代方案均可用於實踐本發明。預期以下申請專利範圍將界定本發明之範圍，且在該等申請專利範圍及其等效物範圍內之方法及結構皆涵蓋於其中。

圖 1 係顯示本文所揭示的雙重靶向癌細胞之一些方法的圖。腫瘤細胞抗原目標MUC16及MSLN係例示性抗原。

圖 2 描繪蛋白質序列(SEQ ID NO: 92)，顯示抗MUC16抗體R3MU4及R3MU29之MUC16胞內結構域序列上之結合抗原決定基與所報導的另一抗體4H11之抗原決定基的比較。

圖 3 係由對未經轉導(圖3A，「NT」)、經抗間皮素TFP轉導(圖3B，「MSLN TFP」)、經抗MUC16 TFP轉導(圖3C，「MUC16 TFP」)或經雙特異性TFP轉導(圖3D)之Jurkat細胞進行FACS分析得到的一系列圖像。所有Jurkat細胞(NT、MSLN TFP、MUC16 TFP及雙特異性TFP)均先同時用經標記Fc_MSLN及MUC16-生物素染色，接著用抗生蛋白鏈菌素-PE染色。

圖 4 係顯示未經轉導或經MSLN TFP、MUC16 TFP或雙特異性TFP轉導且與K562細胞(「DN」，圓形)、表現MSLN之K562細胞(「MSLN+」，正方形)、表現MUC16之K562細胞(「MUC16+」，向上箭頭)及表現兩種蛋白質之K562(「DP」，向下箭頭)共培養之Jurkat細胞中IL-2產量之量測值的圖。

圖 5 係由對各種構築體轉導之原代人類T細胞進行FACS分析得到的一系列圖像。NT (未經轉導)、MSLN TFP、MUC16 TFP及雙特異性TFP T細胞係藉由用編碼單特異性或雙特異性TFP之慢病毒轉導健康供體T細胞產生。使細胞擴增並如關於圖3所描述進行染色。偵測到MSLN TFP T細胞中MSLN特異性TFP之表現(圖5C)，但未偵測到MUC16 TFP表現(圖5D)；此外，偵測到MUC16 TFP T中MUC16 TFP之表現(圖5F)，但未偵測到MSLN TFP表現(圖5E)。對於雙特異性TFP T細胞，在經轉導細胞之表面上偵測到MSLN TFP及MUC16 TFP(圖5G及5H)。在NT Jurkat細胞中未偵測到MSLN TFP或MUC16 TFP(圖5A及5B)。

圖 6 係顯示未經轉導或經MSLN TFP、MUC16 TFP或雙特異性TFP轉導且與K562細胞(「DN」，圓形)、表現MSLN之K562細胞(「MSLN+」，正方形)、表現MUC16之K562細胞(「MUC16+」，向上箭頭)及表現兩種蛋白質之K562(「DP」，向下箭頭)共培養之原代人類T細胞之細胞毒性量測值(佔總數之百分比)的圖。

圖 7A-C 係顯示未經轉導或經MSLN TFP、MUC16 TFP或雙特異性TFP轉導且與K562細胞(「DN」，圓形)、表現MSLN之K562細胞(「MSLN+」，正方形)、表現MUC16之K562細胞(「MUC16+」，向上箭頭)及表現兩種蛋白質之K562(「DP」，向下箭頭)共培養之原代人類T細胞中目標特異性細胞介素產生的一系列圖。所量測之細胞介素係IFN-γ (圖7A)、GM-CSF (圖7B)及TNF-α (圖7C)。

Claims

一種組成物，該組成物包含： (I) 編碼第一T細胞受體(TCR)融合蛋白(TFP)之第一重組核酸序列，該第一TFP包含 (a) TCR次單元，其包含 (i) TCR細胞外結構域之至少一部分， (ii) 跨膜結構域，及 (iii) TCR細胞內結構域，其包含來自細胞內信號傳導結構域之刺激性結構域，該細胞內信號傳導結構域僅來源於選自由以下組成之群的TCR次單元：TCR α鏈、TCR β鏈、TCR γ鏈、TCR δ鏈、CD3 γ鏈、CD3 δ鏈及CD3 ε鏈；及 (b) 包含抗MUC16結合結構域之鼠類、人類或人類化抗體結構域，其中該TCR次單元與該抗MUC16結合結構域係可操作地連接，其中該第一TFP當在該T細胞中表現時與TCR功能性相互作用或併入TCR中；及 (II) 編碼第二TFP之第二重組核酸序列，該第二TFP包含 (a) TCR次單元，其包含 (i) TCR細胞外結構域之至少一部分， (ii) 跨膜結構域，及 (iii) TCR細胞內結構域，其包含來自細胞內信號傳導結構域之刺激性結構域，該細胞內信號傳導結構域僅來源於選自由以下組成之群的TCR次單元：TCR α鏈、TCR β鏈、TCR γ鏈、TCR δ鏈、CD3 γ鏈、CD3 δ鏈及CD3 ε鏈；及 (b) 包含抗間皮素(MSLN)結合結構域之鼠類、人類或人類化抗體結構域，其中該TCR次單元與該抗MSLN結合結構域係可操作地連接，其中該第二TFP當在T細胞中表現時與TCR功能性相互作用或併入TCR中。
一種組成物，該組成物包含： (I) 編碼第一T細胞受體(TCR)融合蛋白(TFP)之第一重組核酸序列，該第一TFP包含 (a) TCR次單元，其包含 (i) TCR細胞外結構域之至少一部分， (ii) 跨膜結構域，及 (iii) TCR細胞內結構域，其包含來自細胞內信號傳導結構域之刺激性結構域，該細胞內信號傳導結構域僅來源於選自由以下組成之群的TCR次單元：TCR α鏈、TCR β鏈、TCR γ鏈、TCR δ鏈、CD3 γ鏈、CD3 δ鏈及CD3 ε鏈；及 (b) 包含抗MUC16結合結構域之第一人類或人類化抗體結構域及包含抗MSLN結合結構域之第二人類或人類化抗體結構域；其中該TCR次單元、該第一抗體結構域與該第二抗體結構域係可操作地連接，且其中該第一TFP當在T細胞中表現時與TCR功能性相互作用或併入TCR中。
一種包含重組核酸分子之組成物，該重組核酸分子編碼： (a) 第一T細胞受體(TCR)融合蛋白(TFP)，其包括TCR次單元、包含第一抗原結合結構域之第一人類或人類化抗體結構域，該第一抗原結合結構域係抗MUC16結合結構域；及 (b) 第二T細胞受體(TCR)融合蛋白(TFP)，其包括TCR次單元、包含第二抗原結合結構域之第二人類或人類化抗體結構域，該第二抗原結合結構域係抗MSLN結合結構域，其中該第一TFP中該TCR次單元與該第一抗體結構域係可操作地連接且該第二TFP中該TCR次單元與該第二抗體結構域係可操作地連接。
一種包含重組核酸分子之組成物，該重組核酸分子編碼： (a) 第一T細胞受體(TCR)融合蛋白(TFP)，其包括TCR次單元、包含作為抗MUC16結合結構域之第一抗原結合結構域的第一人類或人類化抗體結構域以及包含作為抗MSLN結合結構域之第二抗原結合結構域之第二人類或人類化抗體結構域；且其中該第一TFP中該TCR次單元、該第一抗體結構域及該第二抗體結構域係可操作地連接。
如申請專利範圍第1項至第4項中任一項之組成物，其中該第一TFP中該TCR次單元之該等細胞外結構域、跨膜結構域及細胞內信號傳導結構域僅來源於選自由以下組成之群的TCR次單元：TCR α鏈、TCR β鏈、CD3 γ鏈、CD3 δ鏈及CD3 ε鏈。
如申請專利範圍第1項至第5項中任一項之組成物，其中該第二TFP中該TCR次單元之該等細胞外結構域、跨膜結構域及細胞內信號傳導結構域僅來源於選自由以下組成之群的TCR次單元：TCR α鏈、TCR β鏈、TCR γ鏈、TCR δ鏈及TCR ε鏈。
如申請專利範圍第5項或第6項之組成物，其中該第一TFP中該TCR次單元之該等細胞外結構域、跨膜結構域及細胞內信號傳導結構域僅來源於TCR α鏈。
如申請專利範圍第5項或第6項之組成物，其中該第一TFP中該TCR次單元之該等細胞外結構域、跨膜結構域及細胞內信號傳導結構域僅來源於TCR β鏈。
如申請專利範圍第5項或第6項之組成物，其中該第一TFP中該TCR次單元之該等細胞外結構域、跨膜結構域及細胞內信號傳導結構域僅來源於CD3 γ鏈。
如申請專利範圍第5項或第6項之組成物，其中該第一TFP中該TCR次單元之該等細胞外結構域、跨膜結構域及細胞內信號傳導結構域僅來源於CD3 δ鏈。
如申請專利範圍第5項或第6項之組成物，其中該第一TFP中該TCR次單元之該等細胞外結構域、跨膜結構域及細胞內信號傳導結構域僅來源於CD3 ε鏈。
如申請專利範圍第5項至第11項中任一項之組成物，其中該第二TFP中該TCR次單元之該等細胞外結構域、跨膜結構域及細胞內信號傳導結構域僅來源於TCR α鏈。
如申請專利範圍第5項至第11項中任一項之組成物，其中該第二TFP中該TCR次單元之該等細胞外結構域、跨膜結構域及細胞內信號傳導結構域僅來源於TCR β鏈。
如申請專利範圍第5項至第11項中任一項之組成物，其中該第二TFP中該TCR次單元之該等細胞外結構域、跨膜結構域及細胞內信號傳導結構域僅來源於CD3 γ鏈。
如申請專利範圍第5項至第11項中任一項之組成物，其中該第二TFP中該TCR次單元之該等細胞外結構域、跨膜結構域及細胞內信號傳導結構域僅來源於CD3 δ鏈。
如申請專利範圍第5項至第11項中任一項之組成物，其中該第二TFP中該TCR次單元之該等細胞外結構域、跨膜結構域及細胞內信號傳導結構域僅來源於CD3 ε鏈。
如申請專利範圍第5項至第11項中任一項之組成物，其中該第二TFP中該TCR次單元之該等細胞外結構域、跨膜結構域及細胞內信號傳導結構域僅來源於TCR γ鏈。
如申請專利範圍第5項至第11項中任一項之組成物，其中該第二TFP中該TCR次單元之該等細胞外結構域、跨膜結構域及細胞內信號傳導結構域僅來源於TCR δ鏈。
如申請專利範圍第3項至第16項中任一項之組成物，其中該第一TFP、該第二TFP或兩者當在T細胞中表現時併入TCR中或與TCR功能性相互作用。
如申請專利範圍第3項至第19項中任一項之組成物，其中該第一TFP、該第二TFP或兩者當在T細胞中表現時併入TCR中或與TCR功能性相互作用。
如申請專利範圍第1項至第20項中任一項之組成物，其中該編碼之第一抗原結合結構域藉由第一連接子序列連接至該第一TFP中該TCR細胞外結構域，該編碼之第二抗原結合結構域藉由第二連接子序列連接至該第二TFP中該TCR細胞外結構域，或該第一抗原結合結構域藉由該第一連接子序列連接至該第一TFP中該TCR細胞外結構域且該編碼之第二抗原結合結構域藉由該第二連接子序列連接至該第二TFP中該TCR細胞外結構域。
如申請專利範圍第21項之組成物，其中該第一連接子序列及該第二連接子序列包含(G₄ S)_n ，其中n=1至4 (SEQ ID NO: 100)。
如申請專利範圍第1項至第22項中任一項之組成物，其中該第一TFP中該TCR次單元、該第二TFP中該TCR次單元或二者包含TCR細胞外結構域。
如申請專利範圍第1項至第23項中任一項之組成物，其中該第一TFP中該TCR次單元、該第二TFP中該TCR次單元或二者包含TCR跨膜結構域。
如申請專利範圍第1項至第24項中任一項之組成物，其中該第一TFP中該TCR次單元、該第二TFP中該TCR次單元或二者包含TCR細胞內結構域。
如申請專利範圍第1項至第25項中任一項之組成物，其中該第一TFP中該TCR次單元、該第二TFP中該TCR次單元或二者包含(i) TCR細胞外結構域、(ii) TCR跨膜結構域及(iii) TCR細胞內結構域，其中(i)、(ii)及(iii)中至少兩個係來自同一TCR次單元。
如申請專利範圍第1項至第26項中任一項之組成物，其中該第一TFP中該TCR次單元、該第二TFP中該TCR次單元或二者包含TCR細胞內結構域，該TCR細胞內結構域包含選自以下之刺激性結構域：CD3 ε、CD3 γ或CD3 δ之細胞內信號傳導結構域，或其具有至少一個修飾之胺基酸序列。
如申請專利範圍第1項至第27項中任一項之組成物，其中該第一TFP中該TCR次單元、該第二TFP中該TCR次單元或二者包含細胞內結構域，該細胞內結構域包含選自以下之刺激性結構域：4-1BB之功能性信號傳導結構域及/或CD3 ξ之功能性信號傳導結構域，或其具有至少一個修飾之胺基酸序列。
如申請專利範圍第1項至第28項中任一項之組成物，其中該第一人類或人類化抗體結構域、該第二人類或人類化抗體結構域或二者包含抗體片段。
如申請專利範圍第1項至第29項中任一項之組成物，其中該第一人類或人類化抗體結構域、該第二人類或人類化抗體結構域或二者包含scFv或V_H 結構域。
如申請專利範圍第1項至第30項中任一項之組成物，該組成物編碼(i)含與表2之輕鏈序列具有70-100%序列一致性之輕鏈結合結構域胺基酸序列的輕鏈(LC) CDR1、LC CDR2及LC CDR3，及/或(ii)含表2之重鏈序列的重鏈(HC) CDR1、HC CDR2及HC CDR3。
如申請專利範圍第1項至第31項中任一項之組成物，該組成物編碼輕鏈可變區，其中該輕鏈可變區包含在表2之輕鏈可變區胺基酸序列中具有至少一個但不超過30個修飾之胺基酸序列，或與表2之輕鏈可變區胺基酸序列具有95-99%一致性之序列。
如申請專利範圍第1項至第32項中任一項之組成物，該組成物編碼重鏈可變區，其中該重鏈可變區包含在表2之重鏈可變區胺基酸序列中具有至少一個但不超過30個修飾之胺基酸序列，或與表2之重鏈可變區胺基酸序列具有95-99%一致性之序列。
如申請專利範圍第1項至第33項中任一項之組成物，其中該編碼之第一TFP、該編碼之第二TFP或二者包括TCR次單元之細胞外結構域，該細胞外結構域包含選自由以下組成之群之蛋白質的細胞外結構域或其部分：TCR α鏈、TCR β鏈、CD3ε TCR次單元、CD3 γ TCR次單元、CD3 δ TCR次單元、其功能片段，及其具有至少一個但不超過20個修飾之胺基酸序列。
如申請專利範圍第1項至第34項中任一項之組成物，其中該編碼之第一TFP及該編碼之第二TFP包括跨膜結構域，該跨膜結構域包含選自由以下組成之群之蛋白質的跨膜結構域：TCR α鏈、TCR β鏈、CD3 ε TCR次單元、CD3γ TCR次單元、CD3δ TCR次單元、其功能片段，及其具有至少一個但不超過20個修飾之胺基酸序列。
如申請專利範圍第1項至第35項中任一項之組成物，其中該編碼之第一TFP及該編碼之第二TFP包括跨膜結構域，該跨膜結構域包含選自由以下組成之群之蛋白質的跨膜結構域：TCR α鏈、TCR β鏈、TCR ζ鏈、CD3ε TCR次單元、CD3 γ TCR次單元、CD3 δ TCR次單元、CD45、CD4、CD5、CD8、CD9、CD16、CD22、CD33、CD28、CD37、CD64、CD80、CD86、CD134、CD137、CD154、其功能片段，及其具有至少一個但不超過20個修飾之胺基酸序列。
如申請專利範圍第1項至第36項中任一項之組成物，該組成物進一步包含編碼共刺激結構域之序列。
如申請專利範圍第37項之組成物，其中該共刺激結構域係自選自由以下組成之群之蛋白質獲得的功能性信號傳導結構域：OX40、CD2、CD27、CD28、CDS、ICAM-1、LFA-1 (CD11a/CD18)、ICOS (CD278)及4-1BB (CD137)，及其具有至少一個但不超過20個修飾之胺基酸序列。
如申請專利範圍第1項至第38項中任一項之組成物，該組成物進一步包含編碼細胞內信號傳導結構域之序列。
如申請專利範圍第1項至第39項中任一項之組成物，該組成物進一步包含前導序列。
如申請專利範圍第1項至第40項中任一項之組成物，該組成物進一步包含蛋白酶裂解位點。
如申請專利範圍第1項至第41項中任一項之組成物，其中其至少一個但不超過20個修飾包含介導細胞信號傳導之胺基酸修飾，或響應於配位體結合至該第一TFP、該第二TFP或二者而磷酸化的胺基酸修飾。
如申請專利範圍第1項至第42項中任一項之組成物，其中該經分離之核酸分子係mRNA。
如申請專利範圍第1項至第43項中任一項之組成物，其中該第一TFP、該第二TFP或二者包括TCR次單元之免疫受體酪胺酸活化基元(ITAM)，該ITAM包含選自由以下組成之群之蛋白質的ITAM或其部分：CD3 ζ TCR次單元、CD3 ε TCR次單元、CD3γ TCR次單元、CD3 δ TCR次單元、TCR ζ鏈、Fcε受體1鏈、Fcε受體2鏈、Fcγ受體1鏈、Fcγ受體2a鏈、Fcγ受體2b1鏈、Fcγ受體2b2鏈、Fcγ受體3a鏈、Fcγ受體3b鏈、Fcβ受體1鏈、TYROBP (DAP12)、CD5、CD16a、CD16b、CD22、CD23、CD32、CD64、CD79a、CD79b、CD89、CD278、CD66d、其功能片段，及其具有至少一個但不超過20個修飾之胺基酸序列。
如申請專利範圍第44項之組成物，其中該ITAM替代CD3γ、CD3δ或CD3ε之ITAM。
如申請專利範圍第44項之組成物，其中該ITAM選自由以下組成之群：CD3ζ TCR次單元、CD3ε TCR次單元、CD3γ TCR次單元及CD3δ TCR次單元，並且替代選自由以下組成之群的不同ITAM：CD3ζ TCR次單元、CD3ε TCR次單元、CD3γ TCR次單元及CD3δ TCR次單元。
如申請專利範圍第1項至第46項中任一項之經分離核酸分子，該經分離核酸分子進一步包含前導序列。
一種包含多肽分子之組成物，該多肽分子係由如申請專利範圍第1項至第47項中任一項之組成物之核酸分子編碼。
如申請專利範圍第48項之組成物，其中該多肽包含由第一核酸分子編碼之第一多肽及由第二核酸分子編碼之第二多肽。
一種包含重組TFP分子之組成物，該重組TFP分子係由如申請專利範圍第1項至第47項中任一項之組成物之核酸分子編碼。
一種包含載體之組成物，該載體包含編碼申請專利範圍第48項至第50項中任一項之多肽或重組TFP分子之核酸分子。
如申請專利範圍第51項之組成物，其中該載體包括a)含編碼第一TFP之第一核酸分子的第一載體；及b)含編碼第二TFP之第二核酸分子之第二載體。
如申請專利範圍第51項或第52項之組成物，其中該載體選自由以下組成之群：DNA、RNA、質體、慢病毒載體、腺病毒載體、勞斯肉瘤病毒(Rous sarcoma viral，RSV)載體或逆轉錄病毒載體。
如申請專利範圍第51項至第53項中任一項之組成物，該組成物進一步包含啟動子。
如申請專利範圍第51項至第54項中任一項之組成物，其中該載體係在活體外轉錄之載體。
如申請專利範圍第51項至第55項中任一項之組成物，其中該載體中之該核酸分子進一步編碼多聚(A)尾。
如申請專利範圍第51項至第56項中任一項之組成物，其中該載體中之該核酸分子進一步編碼3’UTR。
如申請專利範圍第51項至第57項中任一項之組成物，其中該載體中之該核酸分子進一步編碼蛋白酶裂解位點。
一種包含細胞之組成物，該細胞包含如申請專利範圍第1項至第58項中任一項之組成物。
如申請專利範圍第59項之組成物，其中該細胞係人類T細胞。
如申請專利範圍第60項之組成物，其中該T細胞係CD8+或CD4+ T細胞。
如申請專利範圍第59項至第61項中任一項之組成物，該組成物進一步包含編碼抑制性分子之核酸，該抑制性分子包括與含來自細胞內信號傳導結構域之陽性信號的第二多肽締合之含抑制性分子之至少一部分的第一多肽。
如申請專利範圍第62項之組成物，其中該抑制性分子包括含PD1之至少一部分的第一多肽及含共刺激結構域及一級信號傳導結構域之第二多肽。
一種包含申請專利範圍第1項至第63項中任一項之重組核酸序列的載體。
一種包含申請專利範圍第1項或第2項之第一重組核酸序列的載體。
一種包含申請專利範圍第1項或第2項之第二重組核酸序列的載體。
一種包含如申請專利範圍第1項至第63項中任一項之組成物或如申請專利範圍第64項至第66項中任一項之載體的細胞。
一種包含如申請專利範圍第65項之載體的細胞。
一種包含如申請專利範圍第66項之載體的細胞。
如申請專利範圍第67項至第69項中任一項之細胞，其中該細胞係人類T細胞。
如申請專利範圍第70項之細胞，其中該T細胞係CD8+或CD4+ T細胞。
如申請專利範圍第67項至第71項中任一項之細胞，該細胞進一步包含編碼抑制性分子之核酸，該抑制性分子包括與含來自細胞內信號傳導結構域之陽性信號的第二多肽締合之含抑制性分子之至少一部分的第一多肽。
如申請專利範圍第72項之細胞，其中該抑制性分子包括含PD1之至少一部分的第一多肽及含共刺激結構域及一級信號傳導結構域之第二多肽。
一種人類CD8+或CD4+ T細胞，其包含至少兩種TFP分子，該等TFP分子包含抗MUC16結合結構域、抗MSLN結合結構域、TCR細胞外結構域、跨膜結構域及細胞內結構域，其中該TFP分子能夠與在該人類CD8+或CD4+ T細胞之表面中、其表面處及/或其表面上的內源性TCR複合物及/或至少一種內源性TCR多肽功能性相互作用。
一種蛋白質複合物，該蛋白質複合物包含： i) 第一TFP分子，其包含抗MUC16結合結構域、TCR細胞外結構域、跨膜結構域及細胞內結構域； ii) 第二TFP分子，其包含抗MSLN結合結構域、TCR細胞外結構域、跨膜結構域及細胞內結構域；及 iii) 至少一種內源性TCR次單元或內源性TCR複合物。
一種蛋白質複合物，該蛋白質複合物包含： i) TFP分子，其包含抗MUC16結合結構域、TCR細胞外結構域、跨膜結構域及細胞內結構域；及 ii) 至少一種內源性TCR次單元或內源性TCR複合物。
一種蛋白質複合物，該蛋白質複合物包含： i) TFP分子，其包含抗MSLN結合結構域、TCR細胞外結構域、跨膜結構域及細胞內結構域；及 ii) 至少一種內源性TCR次單元或內源性TCR複合物。
如申請專利範圍第75項至第77項中任一項之蛋白質複合物，其中該TCR包含選自由以下組成之群之蛋白質的細胞外結構域或其部分：TCR α鏈、TCR β鏈、CD3ε TCR次單元、CD3γ TCR次單元及CD3δ TCR次單元。
如申請專利範圍第76項至第78項中任一項之蛋白質複合物，其中該抗MUC16結合結構域、該抗MSLN結合結構域或二者藉由連接子序列連接至該TCR細胞外結構域。
如申請專利範圍第79項之蛋白質複合物，其中該連接子區包含(G₄ S)_n ，其中n=1至4 (SEQ ID NO: 100)。
一種人類CD8+或CD4+ T細胞，其包含每一種如申請專利範圍第75項至第79項中任一項之蛋白質複合物至少兩種不同的TFP蛋白質。
一種人類CD8+或CD4+ T細胞，其包含至少兩種不同的由申請專利範圍第1項至第63項中任一項之經分離之核酸分子編碼的TFP分子。
一種人類CD8+或CD4+ T細胞群，其中該群之T細胞個別地或共同地包含至少兩種TFP分子，該等TFP分子包含抗MUC16結合結構域或抗MSLN結合結構域，或抗MUC16結合結構域及抗MSLN結合結構域二者，TCR細胞外結構域、跨膜結構域及細胞內結構域，其中該TFP分子能夠與在該人類CD8+或CD4+ T細胞表面中、該表面處及/或該表面上的內源性TCR複合物及/或至少一種內源性TCR多肽功能性相互作用。
一種人類CD8+或CD4+ T細胞群，其中該群之T細胞個別地或共同地包含至少兩種由申請專利範圍第1項至第63項中任一項之重組核酸分子編碼的TFP分子。
一種醫藥組成物，其包含有效量的如申請專利範圍第1項至第63項中任一項之組成物、如申請專利範圍第64項至第66項中任一項之載體、如申請專利範圍第67項至第69項中任一項之細胞或如申請專利範圍第75項至第80項中任一項之蛋白質複合物，及醫藥學上可接受之賦形劑。
一種醫藥組成物，其包含有效量的如申請專利範圍第68項之細胞、如申請專利範圍第69項之細胞及醫藥學上可接受之賦形劑。
一種治療患有與MSLN或MUC16表現相關之疾病之哺乳動物的方法，其包括向該哺乳動物投與有效量的如申請專利範圍第1項至第63項中任一項之組成物。
如申請專利範圍第87項之方法，其中該與MSLN或MUC16表現相關之疾病係選自由以下組成之群：增生性疾病、癌症、惡性病、骨髓發育不良、骨髓發育不良症候群、白血病前期、與MUC16表現相關之非癌症相關適應症、與MSLN表現相關之非癌症相關適應症、乳癌、前列腺癌、卵巢癌、子宮頸癌、皮膚癌、胰臟癌、結腸直腸癌、腎癌、肝癌、腦癌、淋巴瘤、白血病、肺癌、食道癌、胃癌及伴隨復發或難治性疾病之不可切除型卵巢癌。
如申請專利範圍第87項之方法，其中該疾病係選自由以下組成之群的血液癌症：B細胞急性淋巴性白血病(B-ALL)、T細胞急性淋巴性白血病(T-ALL)、急性淋巴母細胞性白血病(ALL)；慢性骨髓性白血病(CML)、慢性淋巴球性白血病(CLL)、B細胞幼淋巴球性白血病、母細胞性漿細胞樣樹突狀細胞瘤、伯基特氏淋巴瘤(Burkitt’s lymphoma)、瀰漫性大B細胞淋巴瘤、濾泡性淋巴瘤、毛細胞白血病、小細胞-濾泡性淋巴瘤、大細胞-濾泡性淋巴瘤、惡性淋巴組織增生疾病、MALT淋巴瘤、套細胞淋巴瘤、邊緣區淋巴瘤、多發性骨髓瘤、骨髓發育不良、骨髓發育不良症候群、非霍奇金氏淋巴瘤(non-Hodgkin’s lymphoma)、漿母細胞性淋巴瘤、漿細胞樣樹突狀細胞瘤、瓦爾登斯特侖氏巨球蛋白血症(Waldenstrom macroglobulinemia)、白血病前期、與MUC16或MSLN表現有關之疾病，及其組合。
如申請專利範圍第87項之方法，其中將表現第一TFP分子及第二TFP分子之細胞與增加表現該第一TFP分子及該第二TFP分子之細胞之功效的劑組合投與。
如申請專利範圍第87項至第90項中任一項之方法，其中該哺乳動物中細胞介素之釋放量低於投與有效量的表現以下之T細胞的哺乳動物： (a) 抗MSLN嵌合抗原受體(CAR)； (b) 抗MUC16 CAR； (c) 抗MSLN CAR及抗MUC16 CAR；或 (d) 其組合。
如申請專利範圍第87項至第91項中任一項之方法，其中將表現該第一TFP分子及第二TFP分子之該等細胞與改善與投與表現該第一TFP分子及該第二TFP分子之細胞有關之一或多種副作用的劑組合投與。
如申請專利範圍第87項至第92項中任一項之方法，其中將表現該第一TFP分子及第二TFP分子之該等細胞與治療該MSLN或MUC16相關之疾病之劑組合投與。