JP2021536432A - 融合タンパク質を使用するtcr再プログラミングのための組成物及び方法 - Google Patents
融合タンパク質を使用するtcr再プログラミングのための組成物及び方法 Download PDFInfo
- Publication number
- JP2021536432A JP2021536432A JP2021509190A JP2021509190A JP2021536432A JP 2021536432 A JP2021536432 A JP 2021536432A JP 2021509190 A JP2021509190 A JP 2021509190A JP 2021509190 A JP2021509190 A JP 2021509190A JP 2021536432 A JP2021536432 A JP 2021536432A
- Authority
- JP
- Japan
- Prior art keywords
- tcr
- tfp
- domain
- cells
- chain
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Pending
Links
- 238000000034 method Methods 0.000 title claims abstract description 92
- 108020001507 fusion proteins Proteins 0.000 title claims abstract description 34
- 102000037865 fusion proteins Human genes 0.000 title claims abstract description 34
- 239000000203 mixture Substances 0.000 title claims description 128
- 230000008672 reprogramming Effects 0.000 title 1
- 108091008874 T cell receptors Proteins 0.000 claims abstract description 541
- 102000016266 T-Cell Antigen Receptors Human genes 0.000 claims abstract description 540
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 claims abstract description 279
- 108091007433 antigens Proteins 0.000 claims abstract description 180
- 102000036639 antigens Human genes 0.000 claims abstract description 180
- 239000000427 antigen Substances 0.000 claims abstract description 179
- 206010028980 Neoplasm Diseases 0.000 claims abstract description 86
- 201000011510 cancer Diseases 0.000 claims abstract description 53
- 208000037265 diseases, disorders, signs and symptoms Diseases 0.000 claims abstract description 52
- 201000010099 disease Diseases 0.000 claims abstract description 41
- 210000001744 T-lymphocyte Anatomy 0.000 claims description 209
- 230000027455 binding Effects 0.000 claims description 182
- 150000007523 nucleic acids Chemical group 0.000 claims description 145
- 239000013598 vector Substances 0.000 claims description 125
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 claims description 114
- 102000039446 nucleic acids Human genes 0.000 claims description 109
- 108020004707 nucleic acids Proteins 0.000 claims description 109
- 108090000765 processed proteins & peptides Proteins 0.000 claims description 109
- 230000004068 intracellular signaling Effects 0.000 claims description 98
- 102000004196 processed proteins & peptides Human genes 0.000 claims description 98
- 229920001184 polypeptide Polymers 0.000 claims description 91
- 125000003275 alpha amino acid group Chemical group 0.000 claims description 90
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 claims description 77
- 230000004048 modification Effects 0.000 claims description 58
- 238000012986 modification Methods 0.000 claims description 58
- 102100034922 T-cell surface glycoprotein CD8 alpha chain Human genes 0.000 claims description 55
- 102100036011 T-cell surface glycoprotein CD4 Human genes 0.000 claims description 53
- 230000014509 gene expression Effects 0.000 claims description 52
- 230000003834 intracellular effect Effects 0.000 claims description 52
- 108091028043 Nucleic acid sequence Proteins 0.000 claims description 51
- 108020004414 DNA Proteins 0.000 claims description 50
- 230000011664 signaling Effects 0.000 claims description 46
- 102000008394 Immunoglobulin Fragments Human genes 0.000 claims description 44
- 101000576802 Homo sapiens Mesothelin Proteins 0.000 claims description 43
- 101000946843 Homo sapiens T-cell surface glycoprotein CD8 alpha chain Proteins 0.000 claims description 43
- 108010021625 Immunoglobulin Fragments Proteins 0.000 claims description 43
- 102100025096 Mesothelin Human genes 0.000 claims description 43
- 150000001413 amino acids Chemical class 0.000 claims description 43
- 101000623901 Homo sapiens Mucin-16 Proteins 0.000 claims description 41
- 101000716102 Homo sapiens T-cell surface glycoprotein CD4 Proteins 0.000 claims description 41
- 102100023123 Mucin-16 Human genes 0.000 claims description 41
- 108020004999 messenger RNA Proteins 0.000 claims description 37
- 239000012634 fragment Substances 0.000 claims description 36
- 238000000338 in vitro Methods 0.000 claims description 30
- -1 CD86 Proteins 0.000 claims description 29
- 101000914514 Homo sapiens T-cell-specific surface glycoprotein CD28 Proteins 0.000 claims description 27
- 102100027213 T-cell-specific surface glycoprotein CD28 Human genes 0.000 claims description 27
- 108010019670 Chimeric Antigen Receptors Proteins 0.000 claims description 25
- 239000003795 chemical substances by application Substances 0.000 claims description 25
- 230000002401 inhibitory effect Effects 0.000 claims description 24
- 238000013518 transcription Methods 0.000 claims description 24
- 230000035897 transcription Effects 0.000 claims description 24
- 241000124008 Mammalia Species 0.000 claims description 20
- 230000000694 effects Effects 0.000 claims description 20
- 108010073807 IgG Receptors Proteins 0.000 claims description 18
- 102000009490 IgG Receptors Human genes 0.000 claims description 18
- 239000013612 plasmid Substances 0.000 claims description 17
- 239000003446 ligand Substances 0.000 claims description 16
- 108020005345 3' Untranslated Regions Proteins 0.000 claims description 15
- 101000851370 Homo sapiens Tumor necrosis factor receptor superfamily member 9 Proteins 0.000 claims description 15
- 102100036856 Tumor necrosis factor receptor superfamily member 9 Human genes 0.000 claims description 15
- 230000004936 stimulating effect Effects 0.000 claims description 15
- 108091036407 Polyadenylation Proteins 0.000 claims description 14
- 102100038080 B-cell receptor CD22 Human genes 0.000 claims description 13
- 102000004127 Cytokines Human genes 0.000 claims description 13
- 108090000695 Cytokines Proteins 0.000 claims description 13
- 101000884305 Homo sapiens B-cell receptor CD22 Proteins 0.000 claims description 13
- 102100022153 Tumor necrosis factor receptor superfamily member 4 Human genes 0.000 claims description 13
- 238000003776 cleavage reaction Methods 0.000 claims description 13
- 230000007017 scission Effects 0.000 claims description 13
- 230000000638 stimulation Effects 0.000 claims description 13
- 206010025323 Lymphomas Diseases 0.000 claims description 11
- 201000003444 follicular lymphoma Diseases 0.000 claims description 11
- 102100027207 CD27 antigen Human genes 0.000 claims description 10
- 101000914511 Homo sapiens CD27 antigen Proteins 0.000 claims description 10
- 101000917858 Homo sapiens Low affinity immunoglobulin gamma Fc region receptor III-A Proteins 0.000 claims description 10
- 101000917839 Homo sapiens Low affinity immunoglobulin gamma Fc region receptor III-B Proteins 0.000 claims description 10
- 102100029185 Low affinity immunoglobulin gamma Fc region receptor III-B Human genes 0.000 claims description 10
- 206010033128 Ovarian cancer Diseases 0.000 claims description 10
- 206010061535 Ovarian neoplasm Diseases 0.000 claims description 10
- 230000004044 response Effects 0.000 claims description 10
- 102100026122 High affinity immunoglobulin gamma Fc receptor I Human genes 0.000 claims description 9
- 101000913074 Homo sapiens High affinity immunoglobulin gamma Fc receptor I Proteins 0.000 claims description 9
- 101000934341 Homo sapiens T-cell surface glycoprotein CD5 Proteins 0.000 claims description 9
- 201000003793 Myelodysplastic syndrome Diseases 0.000 claims description 9
- 102100025244 T-cell surface glycoprotein CD5 Human genes 0.000 claims description 9
- 230000031146 intracellular signal transduction Effects 0.000 claims description 9
- 208000032839 leukemia Diseases 0.000 claims description 9
- 208000025324 B-cell acute lymphoblastic leukemia Diseases 0.000 claims description 8
- 208000010839 B-cell chronic lymphocytic leukemia Diseases 0.000 claims description 8
- 208000032791 BCR-ABL1 positive chronic myelogenous leukemia Diseases 0.000 claims description 8
- 208000010833 Chronic myeloid leukaemia Diseases 0.000 claims description 8
- 208000033761 Myelogenous Chronic BCR-ABL Positive Leukemia Diseases 0.000 claims description 8
- 230000001177 retroviral effect Effects 0.000 claims description 8
- 208000011580 syndromic disease Diseases 0.000 claims description 8
- 208000017815 Dendritic cell tumor Diseases 0.000 claims description 7
- 101000738771 Homo sapiens Receptor-type tyrosine-protein phosphatase C Proteins 0.000 claims description 7
- 101000809875 Homo sapiens TYRO protein tyrosine kinase-binding protein Proteins 0.000 claims description 7
- 208000009052 Precursor T-Cell Lymphoblastic Leukemia-Lymphoma Diseases 0.000 claims description 7
- 208000007541 Preleukemia Diseases 0.000 claims description 7
- 102100037422 Receptor-type tyrosine-protein phosphatase C Human genes 0.000 claims description 7
- 208000029052 T-cell acute lymphoblastic leukemia Diseases 0.000 claims description 7
- 102100025237 T-cell surface antigen CD2 Human genes 0.000 claims description 7
- 102100038717 TYRO protein tyrosine kinase-binding protein Human genes 0.000 claims description 7
- 101710165473 Tumor necrosis factor receptor superfamily member 4 Proteins 0.000 claims description 7
- 206010006187 Breast cancer Diseases 0.000 claims description 6
- 208000026310 Breast neoplasm Diseases 0.000 claims description 6
- 102100037904 CD9 antigen Human genes 0.000 claims description 6
- 102100025466 Carcinoembryonic antigen-related cell adhesion molecule 3 Human genes 0.000 claims description 6
- 206010008342 Cervix carcinoma Diseases 0.000 claims description 6
- 101000738354 Homo sapiens CD9 antigen Proteins 0.000 claims description 6
- 101000914337 Homo sapiens Carcinoembryonic antigen-related cell adhesion molecule 3 Proteins 0.000 claims description 6
- 101000777628 Homo sapiens Leukocyte antigen CD37 Proteins 0.000 claims description 6
- 101000934338 Homo sapiens Myeloid cell surface antigen CD33 Proteins 0.000 claims description 6
- 101000914484 Homo sapiens T-lymphocyte activation antigen CD80 Proteins 0.000 claims description 6
- 102100025390 Integrin beta-2 Human genes 0.000 claims description 6
- 208000008839 Kidney Neoplasms Diseases 0.000 claims description 6
- 102100031586 Leukocyte antigen CD37 Human genes 0.000 claims description 6
- 102100025243 Myeloid cell surface antigen CD33 Human genes 0.000 claims description 6
- 208000015914 Non-Hodgkin lymphomas Diseases 0.000 claims description 6
- 108091005804 Peptidases Proteins 0.000 claims description 6
- 239000004365 Protease Substances 0.000 claims description 6
- 206010038389 Renal cancer Diseases 0.000 claims description 6
- 241000714474 Rous sarcoma virus Species 0.000 claims description 6
- 102100027222 T-lymphocyte activation antigen CD80 Human genes 0.000 claims description 6
- 208000006105 Uterine Cervical Neoplasms Diseases 0.000 claims description 6
- 201000010881 cervical cancer Diseases 0.000 claims description 6
- 201000010982 kidney cancer Diseases 0.000 claims description 6
- 208000014018 liver neoplasm Diseases 0.000 claims description 6
- 208000020816 lung neoplasm Diseases 0.000 claims description 6
- 230000002062 proliferating effect Effects 0.000 claims description 6
- 230000000306 recurrent effect Effects 0.000 claims description 6
- 208000003174 Brain Neoplasms Diseases 0.000 claims description 5
- 208000000461 Esophageal Neoplasms Diseases 0.000 claims description 5
- 101000935040 Homo sapiens Integrin beta-2 Proteins 0.000 claims description 5
- 101000934346 Homo sapiens T-cell surface antigen CD2 Proteins 0.000 claims description 5
- 108010073816 IgE Receptors Proteins 0.000 claims description 5
- 102000009438 IgE Receptors Human genes 0.000 claims description 5
- 108010064593 Intercellular Adhesion Molecule-1 Proteins 0.000 claims description 5
- 102100037877 Intercellular adhesion molecule 1 Human genes 0.000 claims description 5
- 206010058467 Lung neoplasm malignant Diseases 0.000 claims description 5
- 208000034578 Multiple myelomas Diseases 0.000 claims description 5
- 206010030155 Oesophageal carcinoma Diseases 0.000 claims description 5
- 206010061902 Pancreatic neoplasm Diseases 0.000 claims description 5
- 206010035226 Plasma cell myeloma Diseases 0.000 claims description 5
- 206010060862 Prostate cancer Diseases 0.000 claims description 5
- 208000000236 Prostatic Neoplasms Diseases 0.000 claims description 5
- 208000000453 Skin Neoplasms Diseases 0.000 claims description 5
- 208000005718 Stomach Neoplasms Diseases 0.000 claims description 5
- 201000004101 esophageal cancer Diseases 0.000 claims description 5
- 206010017758 gastric cancer Diseases 0.000 claims description 5
- 201000007270 liver cancer Diseases 0.000 claims description 5
- 201000005202 lung cancer Diseases 0.000 claims description 5
- 230000003211 malignant effect Effects 0.000 claims description 5
- 208000015486 malignant pancreatic neoplasm Diseases 0.000 claims description 5
- 201000002528 pancreatic cancer Diseases 0.000 claims description 5
- 208000008443 pancreatic carcinoma Diseases 0.000 claims description 5
- 210000005134 plasmacytoid dendritic cell Anatomy 0.000 claims description 5
- 208000037922 refractory disease Diseases 0.000 claims description 5
- 201000000849 skin cancer Diseases 0.000 claims description 5
- 201000011549 stomach cancer Diseases 0.000 claims description 5
- 208000024893 Acute lymphoblastic leukemia Diseases 0.000 claims description 4
- 208000004736 B-Cell Leukemia Diseases 0.000 claims description 4
- 208000036170 B-Cell Marginal Zone Lymphoma Diseases 0.000 claims description 4
- 206010009944 Colon cancer Diseases 0.000 claims description 4
- 208000001333 Colorectal Neoplasms Diseases 0.000 claims description 4
- 206010061850 Extranodal marginal zone B-cell lymphoma (MALT type) Diseases 0.000 claims description 4
- 101000917826 Homo sapiens Low affinity immunoglobulin gamma Fc region receptor II-a Proteins 0.000 claims description 4
- 101000917824 Homo sapiens Low affinity immunoglobulin gamma Fc region receptor II-b Proteins 0.000 claims description 4
- 208000031671 Large B-Cell Diffuse Lymphoma Diseases 0.000 claims description 4
- 102100029204 Low affinity immunoglobulin gamma Fc region receptor II-a Human genes 0.000 claims description 4
- 201000003791 MALT lymphoma Diseases 0.000 claims description 4
- 208000025205 Mantle-Cell Lymphoma Diseases 0.000 claims description 4
- 230000005754 cellular signaling Effects 0.000 claims description 4
- 206010012818 diffuse large B-cell lymphoma Diseases 0.000 claims description 4
- 201000009277 hairy cell leukemia Diseases 0.000 claims description 4
- 201000007924 marginal zone B-cell lymphoma Diseases 0.000 claims description 4
- 208000021937 marginal zone lymphoma Diseases 0.000 claims description 4
- 208000007525 plasmablastic lymphoma Diseases 0.000 claims description 4
- 108010065816 zeta chain antigen T cell receptor Proteins 0.000 claims description 4
- 108091032973 (ribonucleotides)n+m Proteins 0.000 claims description 3
- 101000878602 Homo sapiens Immunoglobulin alpha Fc receptor Proteins 0.000 claims description 3
- 101000878605 Homo sapiens Low affinity immunoglobulin epsilon Fc receptor Proteins 0.000 claims description 3
- 102100038005 Immunoglobulin alpha Fc receptor Human genes 0.000 claims description 3
- 102100038007 Low affinity immunoglobulin epsilon Fc receptor Human genes 0.000 claims description 3
- 102100029193 Low affinity immunoglobulin gamma Fc region receptor III-A Human genes 0.000 claims description 3
- 102000012740 beta Adrenergic Receptors Human genes 0.000 claims description 3
- 108010079452 beta Adrenergic Receptors Proteins 0.000 claims description 3
- 239000008194 pharmaceutical composition Substances 0.000 claims description 3
- 239000000546 pharmaceutical excipient Substances 0.000 claims description 3
- 102100037486 Reverse transcriptase/ribonuclease H Human genes 0.000 claims 2
- 208000032852 chronic lymphocytic leukemia Diseases 0.000 claims 2
- 108010064548 Lymphocyte Function-Associated Antigen-1 Proteins 0.000 claims 1
- 208000031422 Lymphocytic Chronic B-Cell Leukemia Diseases 0.000 claims 1
- OAICVXFJPJFONN-UHFFFAOYSA-N Phosphorus Chemical compound [P] OAICVXFJPJFONN-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims 1
- 239000000556 agonist Substances 0.000 claims 1
- 229910052698 phosphorus Inorganic materials 0.000 claims 1
- 239000011574 phosphorus Substances 0.000 claims 1
- 238000011282 treatment Methods 0.000 abstract description 22
- 210000004881 tumor cell Anatomy 0.000 abstract description 8
- 238000010586 diagram Methods 0.000 abstract 1
- 102000017420 CD3 protein, epsilon/gamma/delta subunit Human genes 0.000 description 152
- 108050005493 CD3 protein, epsilon/gamma/delta subunit Proteins 0.000 description 152
- 235000018102 proteins Nutrition 0.000 description 63
- 230000000259 anti-tumor effect Effects 0.000 description 52
- 102000053602 DNA Human genes 0.000 description 49
- 235000001014 amino acid Nutrition 0.000 description 44
- 229940024606 amino acid Drugs 0.000 description 40
- 229920002477 rna polymer Polymers 0.000 description 40
- 125000003729 nucleotide group Chemical group 0.000 description 31
- 239000002773 nucleotide Substances 0.000 description 30
- 150000002632 lipids Chemical class 0.000 description 27
- 101100519207 Mus musculus Pdcd1 gene Proteins 0.000 description 21
- 102100035360 Cerebellar degeneration-related antigen 1 Human genes 0.000 description 20
- 230000006870 function Effects 0.000 description 20
- 238000003752 polymerase chain reaction Methods 0.000 description 20
- 108060003951 Immunoglobulin Proteins 0.000 description 19
- 102000018358 immunoglobulin Human genes 0.000 description 19
- 108010047041 Complementarity Determining Regions Proteins 0.000 description 18
- 102000040430 polynucleotide Human genes 0.000 description 18
- 108091033319 polynucleotide Proteins 0.000 description 18
- 239000002157 polynucleotide Substances 0.000 description 18
- DHMQDGOQFOQNFH-UHFFFAOYSA-N Glycine Chemical compound NCC(O)=O DHMQDGOQFOQNFH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 17
- 125000000539 amino acid group Chemical group 0.000 description 17
- 239000000047 product Substances 0.000 description 17
- 241000699670 Mus sp. Species 0.000 description 16
- 239000000126 substance Substances 0.000 description 16
- 238000006467 substitution reaction Methods 0.000 description 16
- 239000011324 bead Substances 0.000 description 15
- 239000002502 liposome Substances 0.000 description 15
- 210000001519 tissue Anatomy 0.000 description 15
- 241000700605 Viruses Species 0.000 description 14
- 108010008014 B-Cell Maturation Antigen Proteins 0.000 description 13
- 102000006942 B-Cell Maturation Antigen Human genes 0.000 description 13
- 108020003589 5' Untranslated Regions Proteins 0.000 description 12
- 241001465754 Metazoa Species 0.000 description 12
- 230000004913 activation Effects 0.000 description 12
- 210000004369 blood Anatomy 0.000 description 12
- 239000008280 blood Substances 0.000 description 12
- 238000013519 translation Methods 0.000 description 12
- MTCFGRXMJLQNBG-REOHCLBHSA-N (2S)-2-Amino-3-hydroxypropansäure Chemical compound OC[C@H](N)C(O)=O MTCFGRXMJLQNBG-REOHCLBHSA-N 0.000 description 11
- 208000035475 disorder Diseases 0.000 description 11
- 239000002245 particle Substances 0.000 description 11
- 241000699666 Mus <mouse, genus> Species 0.000 description 10
- 238000003556 assay Methods 0.000 description 10
- 230000001086 cytosolic effect Effects 0.000 description 10
- 239000013604 expression vector Substances 0.000 description 10
- 230000001976 improved effect Effects 0.000 description 10
- IAZDPXIOMUYVGZ-UHFFFAOYSA-N Dimethylsulphoxide Chemical compound CS(C)=O IAZDPXIOMUYVGZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 9
- 230000000295 complement effect Effects 0.000 description 9
- 241000713666 Lentivirus Species 0.000 description 8
- 102100024216 Programmed cell death 1 ligand 1 Human genes 0.000 description 8
- 108700008625 Reporter Genes Proteins 0.000 description 8
- 238000002617 apheresis Methods 0.000 description 8
- 239000012636 effector Substances 0.000 description 8
- 238000002347 injection Methods 0.000 description 8
- 239000007924 injection Substances 0.000 description 8
- 230000008569 process Effects 0.000 description 8
- 239000000523 sample Substances 0.000 description 8
- 239000000243 solution Substances 0.000 description 8
- 230000001225 therapeutic effect Effects 0.000 description 8
- 108010074708 B7-H1 Antigen Proteins 0.000 description 7
- 230000015572 biosynthetic process Effects 0.000 description 7
- 239000002299 complementary DNA Substances 0.000 description 7
- 230000028993 immune response Effects 0.000 description 7
- 230000001965 increasing effect Effects 0.000 description 7
- 230000001404 mediated effect Effects 0.000 description 7
- 238000009126 molecular therapy Methods 0.000 description 7
- 230000035755 proliferation Effects 0.000 description 7
- 238000001890 transfection Methods 0.000 description 7
- 241001430294 unidentified retrovirus Species 0.000 description 7
- HEDRZPFGACZZDS-UHFFFAOYSA-N Chloroform Chemical compound ClC(Cl)Cl HEDRZPFGACZZDS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 6
- 108090000626 DNA-directed RNA polymerases Proteins 0.000 description 6
- 102000004163 DNA-directed RNA polymerases Human genes 0.000 description 6
- 239000004471 Glycine Substances 0.000 description 6
- OKKJLVBELUTLKV-UHFFFAOYSA-N Methanol Chemical compound OC OKKJLVBELUTLKV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 6
- 241000283984 Rodentia Species 0.000 description 6
- OIRDTQYFTABQOQ-KQYNXXCUSA-N adenosine Chemical compound C1=NC=2C(N)=NC=NC=2N1[C@@H]1O[C@H](CO)[C@@H](O)[C@H]1O OIRDTQYFTABQOQ-KQYNXXCUSA-N 0.000 description 6
- 210000003719 b-lymphocyte Anatomy 0.000 description 6
- 230000009286 beneficial effect Effects 0.000 description 6
- 150000001875 compounds Chemical class 0.000 description 6
- 230000036961 partial effect Effects 0.000 description 6
- 241000894007 species Species 0.000 description 6
- 102100029822 B- and T-lymphocyte attenuator Human genes 0.000 description 5
- 101000864344 Homo sapiens B- and T-lymphocyte attenuator Proteins 0.000 description 5
- 108020004684 Internal Ribosome Entry Sites Proteins 0.000 description 5
- AGPKZVBTJJNPAG-WHFBIAKZSA-N L-isoleucine Chemical compound CC[C@H](C)[C@H](N)C(O)=O AGPKZVBTJJNPAG-WHFBIAKZSA-N 0.000 description 5
- COLNVLDHVKWLRT-QMMMGPOBSA-N L-phenylalanine Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CC1=CC=CC=C1 COLNVLDHVKWLRT-QMMMGPOBSA-N 0.000 description 5
- KZSNJWFQEVHDMF-BYPYZUCNSA-N L-valine Chemical compound CC(C)[C@H](N)C(O)=O KZSNJWFQEVHDMF-BYPYZUCNSA-N 0.000 description 5
- 108700026244 Open Reading Frames Proteins 0.000 description 5
- 108010003723 Single-Domain Antibodies Proteins 0.000 description 5
- KZSNJWFQEVHDMF-UHFFFAOYSA-N Valine Natural products CC(C)C(N)C(O)=O KZSNJWFQEVHDMF-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 5
- 230000008901 benefit Effects 0.000 description 5
- 238000010367 cloning Methods 0.000 description 5
- 239000000306 component Substances 0.000 description 5
- 230000003247 decreasing effect Effects 0.000 description 5
- 238000000684 flow cytometry Methods 0.000 description 5
- 238000001476 gene delivery Methods 0.000 description 5
- 239000005090 green fluorescent protein Substances 0.000 description 5
- 210000000987 immune system Anatomy 0.000 description 5
- 238000001727 in vivo Methods 0.000 description 5
- 238000011534 incubation Methods 0.000 description 5
- 230000001939 inductive effect Effects 0.000 description 5
- 230000000977 initiatory effect Effects 0.000 description 5
- 230000003993 interaction Effects 0.000 description 5
- AGPKZVBTJJNPAG-UHFFFAOYSA-N isoleucine Natural products CCC(C)C(N)C(O)=O AGPKZVBTJJNPAG-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 5
- 229960000310 isoleucine Drugs 0.000 description 5
- 210000004698 lymphocyte Anatomy 0.000 description 5
- 239000000693 micelle Substances 0.000 description 5
- COLNVLDHVKWLRT-UHFFFAOYSA-N phenylalanine Natural products OC(=O)C(N)CC1=CC=CC=C1 COLNVLDHVKWLRT-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 5
- 230000008488 polyadenylation Effects 0.000 description 5
- 229920000642 polymer Polymers 0.000 description 5
- 230000001105 regulatory effect Effects 0.000 description 5
- 238000002560 therapeutic procedure Methods 0.000 description 5
- 238000012546 transfer Methods 0.000 description 5
- 125000001493 tyrosinyl group Chemical group [H]OC1=C([H])C([H])=C(C([H])=C1[H])C([H])([H])C([H])(N([H])[H])C(*)=O 0.000 description 5
- 238000011144 upstream manufacturing Methods 0.000 description 5
- 239000004474 valine Substances 0.000 description 5
- 239000013603 viral vector Substances 0.000 description 5
- IJGRMHOSHXDMSA-UHFFFAOYSA-N Atomic nitrogen Chemical compound N#N IJGRMHOSHXDMSA-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 102100024263 CD160 antigen Human genes 0.000 description 4
- 102100025570 Cancer/testis antigen 1 Human genes 0.000 description 4
- 108091026890 Coding region Proteins 0.000 description 4
- 108091033380 Coding strand Proteins 0.000 description 4
- 102100039498 Cytotoxic T-lymphocyte protein 4 Human genes 0.000 description 4
- 241000702421 Dependoparvovirus Species 0.000 description 4
- 241000282412 Homo Species 0.000 description 4
- 101000761938 Homo sapiens CD160 antigen Proteins 0.000 description 4
- 101000856237 Homo sapiens Cancer/testis antigen 1 Proteins 0.000 description 4
- HNDVDQJCIGZPNO-YFKPBYRVSA-N L-histidine Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CC1=CN=CN1 HNDVDQJCIGZPNO-YFKPBYRVSA-N 0.000 description 4
- QIVBCDIJIAJPQS-VIFPVBQESA-N L-tryptophane Chemical compound C1=CC=C2C(C[C@H](N)C(O)=O)=CNC2=C1 QIVBCDIJIAJPQS-VIFPVBQESA-N 0.000 description 4
- OUYCCCASQSFEME-QMMMGPOBSA-N L-tyrosine Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CC1=CC=C(O)C=C1 OUYCCCASQSFEME-QMMMGPOBSA-N 0.000 description 4
- 108700018351 Major Histocompatibility Complex Proteins 0.000 description 4
- 108010038807 Oligopeptides Proteins 0.000 description 4
- 102000015636 Oligopeptides Human genes 0.000 description 4
- 102000035195 Peptidases Human genes 0.000 description 4
- 108700030875 Programmed Cell Death 1 Ligand 2 Proteins 0.000 description 4
- 102100024213 Programmed cell death 1 ligand 2 Human genes 0.000 description 4
- MTCFGRXMJLQNBG-UHFFFAOYSA-N Serine Natural products OCC(N)C(O)=O MTCFGRXMJLQNBG-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 108700019146 Transgenes Proteins 0.000 description 4
- QIVBCDIJIAJPQS-UHFFFAOYSA-N Tryptophan Natural products C1=CC=C2C(CC(N)C(O)=O)=CNC2=C1 QIVBCDIJIAJPQS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 238000007792 addition Methods 0.000 description 4
- 230000000139 costimulatory effect Effects 0.000 description 4
- 230000016396 cytokine production Effects 0.000 description 4
- LOKCTEFSRHRXRJ-UHFFFAOYSA-I dipotassium trisodium dihydrogen phosphate hydrogen phosphate dichloride Chemical compound P(=O)(O)(O)[O-].[K+].P(=O)(O)([O-])[O-].[Na+].[Na+].[Cl-].[K+].[Cl-].[Na+] LOKCTEFSRHRXRJ-UHFFFAOYSA-I 0.000 description 4
- 238000004520 electroporation Methods 0.000 description 4
- 238000005516 engineering process Methods 0.000 description 4
- 238000007710 freezing Methods 0.000 description 4
- 230000008014 freezing Effects 0.000 description 4
- 208000024200 hematopoietic and lymphoid system neoplasm Diseases 0.000 description 4
- HNDVDQJCIGZPNO-UHFFFAOYSA-N histidine Natural products OC(=O)C(N)CC1=CN=CN1 HNDVDQJCIGZPNO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 230000003463 hyperproliferative effect Effects 0.000 description 4
- 239000012642 immune effector Substances 0.000 description 4
- 229940121354 immunomodulator Drugs 0.000 description 4
- 230000035772 mutation Effects 0.000 description 4
- 210000005259 peripheral blood Anatomy 0.000 description 4
- 239000011886 peripheral blood Substances 0.000 description 4
- 230000002688 persistence Effects 0.000 description 4
- 239000002953 phosphate buffered saline Substances 0.000 description 4
- 102000005962 receptors Human genes 0.000 description 4
- 108020003175 receptors Proteins 0.000 description 4
- 230000009467 reduction Effects 0.000 description 4
- 230000002441 reversible effect Effects 0.000 description 4
- 230000019491 signal transduction Effects 0.000 description 4
- 230000020382 suppression by virus of host antigen processing and presentation of peptide antigen via MHC class I Effects 0.000 description 4
- 230000004083 survival effect Effects 0.000 description 4
- 238000012360 testing method Methods 0.000 description 4
- OUYCCCASQSFEME-UHFFFAOYSA-N tyrosine Natural products OC(=O)C(N)CC1=CC=C(O)C=C1 OUYCCCASQSFEME-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 241000701161 unidentified adenovirus Species 0.000 description 4
- 239000003981 vehicle Substances 0.000 description 4
- 230000003612 virological effect Effects 0.000 description 4
- 238000005406 washing Methods 0.000 description 4
- 102000006306 Antigen Receptors Human genes 0.000 description 3
- 108010083359 Antigen Receptors Proteins 0.000 description 3
- 239000002126 C01EB10 - Adenosine Substances 0.000 description 3
- 108020004705 Codon Proteins 0.000 description 3
- 241000701022 Cytomegalovirus Species 0.000 description 3
- 101100118093 Drosophila melanogaster eEF1alpha2 gene Proteins 0.000 description 3
- 108090000331 Firefly luciferases Proteins 0.000 description 3
- WQZGKKKJIJFFOK-GASJEMHNSA-N Glucose Natural products OC[C@H]1OC(O)[C@H](O)[C@@H](O)[C@@H]1O WQZGKKKJIJFFOK-GASJEMHNSA-N 0.000 description 3
- BCCRXDTUTZHDEU-VKHMYHEASA-N Gly-Ser Chemical compound NCC(=O)N[C@@H](CO)C(O)=O BCCRXDTUTZHDEU-VKHMYHEASA-N 0.000 description 3
- 108010017213 Granulocyte-Macrophage Colony-Stimulating Factor Proteins 0.000 description 3
- 102100039620 Granulocyte-macrophage colony-stimulating factor Human genes 0.000 description 3
- 102100034458 Hepatitis A virus cellular receptor 2 Human genes 0.000 description 3
- 101000889276 Homo sapiens Cytotoxic T-lymphocyte protein 4 Proteins 0.000 description 3
- 101001068133 Homo sapiens Hepatitis A virus cellular receptor 2 Proteins 0.000 description 3
- 101001138062 Homo sapiens Leukocyte-associated immunoglobulin-like receptor 1 Proteins 0.000 description 3
- 101001137987 Homo sapiens Lymphocyte activation gene 3 protein Proteins 0.000 description 3
- 101000831007 Homo sapiens T-cell immunoreceptor with Ig and ITIM domains Proteins 0.000 description 3
- 101000801255 Homo sapiens Tumor necrosis factor receptor superfamily member 17 Proteins 0.000 description 3
- 241000725303 Human immunodeficiency virus Species 0.000 description 3
- 108091092195 Intron Proteins 0.000 description 3
- ONIBWKKTOPOVIA-BYPYZUCNSA-N L-Proline Chemical compound OC(=O)[C@@H]1CCCN1 ONIBWKKTOPOVIA-BYPYZUCNSA-N 0.000 description 3
- QNAYBMKLOCPYGJ-REOHCLBHSA-N L-alanine Chemical compound C[C@H](N)C(O)=O QNAYBMKLOCPYGJ-REOHCLBHSA-N 0.000 description 3
- ROHFNLRQFUQHCH-YFKPBYRVSA-N L-leucine Chemical compound CC(C)C[C@H](N)C(O)=O ROHFNLRQFUQHCH-YFKPBYRVSA-N 0.000 description 3
- FFEARJCKVFRZRR-BYPYZUCNSA-N L-methionine Chemical compound CSCC[C@H](N)C(O)=O FFEARJCKVFRZRR-BYPYZUCNSA-N 0.000 description 3
- AYFVYJQAPQTCCC-GBXIJSLDSA-N L-threonine Chemical compound C[C@@H](O)[C@H](N)C(O)=O AYFVYJQAPQTCCC-GBXIJSLDSA-N 0.000 description 3
- ROHFNLRQFUQHCH-UHFFFAOYSA-N Leucine Natural products CC(C)CC(N)C(O)=O ROHFNLRQFUQHCH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 102100020943 Leukocyte-associated immunoglobulin-like receptor 1 Human genes 0.000 description 3
- 239000000232 Lipid Bilayer Substances 0.000 description 3
- 102100020862 Lymphocyte activation gene 3 protein Human genes 0.000 description 3
- 108010085220 Multiprotein Complexes Proteins 0.000 description 3
- 102000007474 Multiprotein Complexes Human genes 0.000 description 3
- ONIBWKKTOPOVIA-UHFFFAOYSA-N Proline Natural products OC(=O)C1CCCN1 ONIBWKKTOPOVIA-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 108020004511 Recombinant DNA Proteins 0.000 description 3
- FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M Sodium chloride Chemical compound [Na+].[Cl-] FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 3
- 102100024834 T-cell immunoreceptor with Ig and ITIM domains Human genes 0.000 description 3
- AYFVYJQAPQTCCC-UHFFFAOYSA-N Threonine Natural products CC(O)C(N)C(O)=O AYFVYJQAPQTCCC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 239000004473 Threonine Substances 0.000 description 3
- 208000033559 Waldenström macroglobulinemia Diseases 0.000 description 3
- 229960005305 adenosine Drugs 0.000 description 3
- 235000004279 alanine Nutrition 0.000 description 3
- 230000000735 allogeneic effect Effects 0.000 description 3
- 238000004458 analytical method Methods 0.000 description 3
- 238000010171 animal model Methods 0.000 description 3
- 230000001580 bacterial effect Effects 0.000 description 3
- 230000004071 biological effect Effects 0.000 description 3
- 239000000872 buffer Substances 0.000 description 3
- 238000002619 cancer immunotherapy Methods 0.000 description 3
- 230000015556 catabolic process Effects 0.000 description 3
- 230000010261 cell growth Effects 0.000 description 3
- 238000002659 cell therapy Methods 0.000 description 3
- 210000000805 cytoplasm Anatomy 0.000 description 3
- 238000006731 degradation reaction Methods 0.000 description 3
- 238000012217 deletion Methods 0.000 description 3
- 230000037430 deletion Effects 0.000 description 3
- 210000004443 dendritic cell Anatomy 0.000 description 3
- 238000001415 gene therapy Methods 0.000 description 3
- 210000004602 germ cell Anatomy 0.000 description 3
- 239000001963 growth medium Substances 0.000 description 3
- 201000005787 hematologic cancer Diseases 0.000 description 3
- 102000046935 human TNFRSF17 Human genes 0.000 description 3
- 239000003112 inhibitor Substances 0.000 description 3
- FZWBNHMXJMCXLU-BLAUPYHCSA-N isomaltotriose Chemical compound O[C@@H]1[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](CO)O[C@@H]1OC[C@@H]1[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](O)[C@@H](OC[C@@H](O)[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](O)C=O)O1 FZWBNHMXJMCXLU-BLAUPYHCSA-N 0.000 description 3
- 239000007788 liquid Substances 0.000 description 3
- 230000007774 longterm Effects 0.000 description 3
- 201000000564 macroglobulinemia Diseases 0.000 description 3
- 229920002521 macromolecule Polymers 0.000 description 3
- 238000005259 measurement Methods 0.000 description 3
- 230000007246 mechanism Effects 0.000 description 3
- 239000002609 medium Substances 0.000 description 3
- 229930182817 methionine Natural products 0.000 description 3
- 238000002156 mixing Methods 0.000 description 3
- 238000010369 molecular cloning Methods 0.000 description 3
- 210000001616 monocyte Anatomy 0.000 description 3
- 230000009870 specific binding Effects 0.000 description 3
- 208000024891 symptom Diseases 0.000 description 3
- 238000003786 synthesis reaction Methods 0.000 description 3
- 102000035160 transmembrane proteins Human genes 0.000 description 3
- 108091005703 transmembrane proteins Proteins 0.000 description 3
- 238000001262 western blot Methods 0.000 description 3
- MZOFCQQQCNRIBI-VMXHOPILSA-N (3s)-4-[[(2s)-1-[[(2s)-1-[[(1s)-1-carboxy-2-hydroxyethyl]amino]-4-methyl-1-oxopentan-2-yl]amino]-5-(diaminomethylideneamino)-1-oxopentan-2-yl]amino]-3-[[2-[[(2s)-2,6-diaminohexanoyl]amino]acetyl]amino]-4-oxobutanoic acid Chemical compound OC[C@@H](C(O)=O)NC(=O)[C@H](CC(C)C)NC(=O)[C@H](CCCN=C(N)N)NC(=O)[C@H](CC(O)=O)NC(=O)CNC(=O)[C@@H](N)CCCCN MZOFCQQQCNRIBI-VMXHOPILSA-N 0.000 description 2
- 102000040650 (ribonucleotides)n+m Human genes 0.000 description 2
- GFFGJBXGBJISGV-UHFFFAOYSA-N Adenine Chemical compound NC1=NC=NC2=C1N=CN2 GFFGJBXGBJISGV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 101710145634 Antigen 1 Proteins 0.000 description 2
- 239000004475 Arginine Substances 0.000 description 2
- DCXYFEDJOCDNAF-UHFFFAOYSA-N Asparagine Natural products OC(=O)C(N)CC(N)=O DCXYFEDJOCDNAF-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 102100022005 B-lymphocyte antigen CD20 Human genes 0.000 description 2
- 101150013553 CD40 gene Proteins 0.000 description 2
- 102100035793 CD83 antigen Human genes 0.000 description 2
- 108091033409 CRISPR Proteins 0.000 description 2
- 101100228196 Caenorhabditis elegans gly-4 gene Proteins 0.000 description 2
- 102100024423 Carbonic anhydrase 9 Human genes 0.000 description 2
- 102000014914 Carrier Proteins Human genes 0.000 description 2
- 102100025064 Cellular tumor antigen p53 Human genes 0.000 description 2
- 241000282693 Cercopithecidae Species 0.000 description 2
- 108091007741 Chimeric antigen receptor T cells Proteins 0.000 description 2
- PMATZTZNYRCHOR-CGLBZJNRSA-N Cyclosporin A Chemical compound CC[C@@H]1NC(=O)[C@H]([C@H](O)[C@H](C)C\C=C\C)N(C)C(=O)[C@H](C(C)C)N(C)C(=O)[C@H](CC(C)C)N(C)C(=O)[C@H](CC(C)C)N(C)C(=O)[C@@H](C)NC(=O)[C@H](C)NC(=O)[C@H](CC(C)C)N(C)C(=O)[C@H](C(C)C)NC(=O)[C@H](CC(C)C)N(C)C(=O)CN(C)C1=O PMATZTZNYRCHOR-CGLBZJNRSA-N 0.000 description 2
- 108010036949 Cyclosporine Proteins 0.000 description 2
- 102000004190 Enzymes Human genes 0.000 description 2
- 108090000790 Enzymes Proteins 0.000 description 2
- 241000206602 Eukaryota Species 0.000 description 2
- 108060002716 Exonuclease Proteins 0.000 description 2
- 102100037362 Fibronectin Human genes 0.000 description 2
- 238000012413 Fluorescence activated cell sorting analysis Methods 0.000 description 2
- 102100040578 G antigen 7 Human genes 0.000 description 2
- NYHBQMYGNKIUIF-UUOKFMHZSA-N Guanosine Chemical compound C1=NC=2C(=O)NC(N)=NC=2N1[C@@H]1O[C@H](CO)[C@@H](O)[C@H]1O NYHBQMYGNKIUIF-UUOKFMHZSA-N 0.000 description 2
- 101000897405 Homo sapiens B-lymphocyte antigen CD20 Proteins 0.000 description 2
- 101000946856 Homo sapiens CD83 antigen Proteins 0.000 description 2
- 101000721661 Homo sapiens Cellular tumor antigen p53 Proteins 0.000 description 2
- 101000893968 Homo sapiens G antigen 7 Proteins 0.000 description 2
- 101001109503 Homo sapiens NKG2-C type II integral membrane protein Proteins 0.000 description 2
- 101000801234 Homo sapiens Tumor necrosis factor receptor superfamily member 18 Proteins 0.000 description 2
- 101000851376 Homo sapiens Tumor necrosis factor receptor superfamily member 8 Proteins 0.000 description 2
- 101000666896 Homo sapiens V-type immunoglobulin domain-containing suppressor of T-cell activation Proteins 0.000 description 2
- 108091006905 Human Serum Albumin Proteins 0.000 description 2
- 102000008100 Human Serum Albumin Human genes 0.000 description 2
- 102100037850 Interferon gamma Human genes 0.000 description 2
- 108010074328 Interferon-gamma Proteins 0.000 description 2
- XUJNEKJLAYXESH-REOHCLBHSA-N L-Cysteine Chemical compound SC[C@H](N)C(O)=O XUJNEKJLAYXESH-REOHCLBHSA-N 0.000 description 2
- ODKSFYDXXFIFQN-BYPYZUCNSA-P L-argininium(2+) Chemical compound NC(=[NH2+])NCCC[C@H]([NH3+])C(O)=O ODKSFYDXXFIFQN-BYPYZUCNSA-P 0.000 description 2
- DCXYFEDJOCDNAF-REOHCLBHSA-N L-asparagine Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CC(N)=O DCXYFEDJOCDNAF-REOHCLBHSA-N 0.000 description 2
- CKLJMWTZIZZHCS-REOHCLBHSA-N L-aspartic acid Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CC(O)=O CKLJMWTZIZZHCS-REOHCLBHSA-N 0.000 description 2
- WHUUTDBJXJRKMK-VKHMYHEASA-N L-glutamic acid Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CCC(O)=O WHUUTDBJXJRKMK-VKHMYHEASA-N 0.000 description 2
- ZDXPYRJPNDTMRX-VKHMYHEASA-N L-glutamine Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CCC(N)=O ZDXPYRJPNDTMRX-VKHMYHEASA-N 0.000 description 2
- KDXKERNSBIXSRK-YFKPBYRVSA-N L-lysine Chemical compound NCCCC[C@H](N)C(O)=O KDXKERNSBIXSRK-YFKPBYRVSA-N 0.000 description 2
- KDXKERNSBIXSRK-UHFFFAOYSA-N Lysine Natural products NCCCCC(N)C(O)=O KDXKERNSBIXSRK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 239000004472 Lysine Substances 0.000 description 2
- 102100022430 Melanocyte protein PMEL Human genes 0.000 description 2
- 102100028389 Melanoma antigen recognized by T-cells 1 Human genes 0.000 description 2
- 102100022683 NKG2-C type II integral membrane protein Human genes 0.000 description 2
- 108010077524 Peptide Elongation Factor 1 Proteins 0.000 description 2
- 108091000080 Phosphotransferase Proteins 0.000 description 2
- 101710124239 Poly(A) polymerase Proteins 0.000 description 2
- 241001637516 Polygonia c-album Species 0.000 description 2
- 102000015623 Polynucleotide Adenylyltransferase Human genes 0.000 description 2
- 108010024055 Polynucleotide adenylyltransferase Proteins 0.000 description 2
- 208000006994 Precancerous Conditions Diseases 0.000 description 2
- RJKFOVLPORLFTN-LEKSSAKUSA-N Progesterone Chemical compound C1CC2=CC(=O)CC[C@]2(C)[C@@H]2[C@@H]1[C@@H]1CC[C@H](C(=O)C)[C@@]1(C)CC2 RJKFOVLPORLFTN-LEKSSAKUSA-N 0.000 description 2
- 108091034057 RNA (poly(A)) Proteins 0.000 description 2
- 241000700159 Rattus Species 0.000 description 2
- 239000006146 Roswell Park Memorial Institute medium Substances 0.000 description 2
- 240000004808 Saccharomyces cerevisiae Species 0.000 description 2
- 206010039491 Sarcoma Diseases 0.000 description 2
- 230000006052 T cell proliferation Effects 0.000 description 2
- 210000000662 T-lymphocyte subset Anatomy 0.000 description 2
- QJJXYPPXXYFBGM-LFZNUXCKSA-N Tacrolimus Chemical compound C1C[C@@H](O)[C@H](OC)C[C@@H]1\C=C(/C)[C@@H]1[C@H](C)[C@@H](O)CC(=O)[C@H](CC=C)/C=C(C)/C[C@H](C)C[C@H](OC)[C@H]([C@H](C[C@H]2C)OC)O[C@@]2(O)C(=O)C(=O)N2CCCC[C@H]2C(=O)O1 QJJXYPPXXYFBGM-LFZNUXCKSA-N 0.000 description 2
- IQFYYKKMVGJFEH-XLPZGREQSA-N Thymidine Chemical compound O=C1NC(=O)C(C)=CN1[C@@H]1O[C@H](CO)[C@@H](O)C1 IQFYYKKMVGJFEH-XLPZGREQSA-N 0.000 description 2
- 108060008682 Tumor Necrosis Factor Proteins 0.000 description 2
- 108060008683 Tumor Necrosis Factor Receptor Proteins 0.000 description 2
- 102000000852 Tumor Necrosis Factor-alpha Human genes 0.000 description 2
- 102100033728 Tumor necrosis factor receptor superfamily member 18 Human genes 0.000 description 2
- 102100040245 Tumor necrosis factor receptor superfamily member 5 Human genes 0.000 description 2
- 102100036857 Tumor necrosis factor receptor superfamily member 8 Human genes 0.000 description 2
- DRTQHJPVMGBUCF-XVFCMESISA-N Uridine Chemical compound O[C@@H]1[C@H](O)[C@@H](CO)O[C@H]1N1C(=O)NC(=O)C=C1 DRTQHJPVMGBUCF-XVFCMESISA-N 0.000 description 2
- 102100038282 V-type immunoglobulin domain-containing suppressor of T-cell activation Human genes 0.000 description 2
- 230000005856 abnormality Effects 0.000 description 2
- 230000002378 acidificating effect Effects 0.000 description 2
- 230000009471 action Effects 0.000 description 2
- 239000012190 activator Substances 0.000 description 2
- 238000000137 annealing Methods 0.000 description 2
- 239000002246 antineoplastic agent Substances 0.000 description 2
- 239000012736 aqueous medium Substances 0.000 description 2
- 239000007864 aqueous solution Substances 0.000 description 2
- ODKSFYDXXFIFQN-UHFFFAOYSA-N arginine Natural products OC(=O)C(N)CCCNC(N)=N ODKSFYDXXFIFQN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 125000003118 aryl group Chemical group 0.000 description 2
- 235000009582 asparagine Nutrition 0.000 description 2
- 229960001230 asparagine Drugs 0.000 description 2
- 235000003704 aspartic acid Nutrition 0.000 description 2
- OQFSQFPPLPISGP-UHFFFAOYSA-N beta-carboxyaspartic acid Natural products OC(=O)C(N)C(C(O)=O)C(O)=O OQFSQFPPLPISGP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 108091008324 binding proteins Proteins 0.000 description 2
- 239000012472 biological sample Substances 0.000 description 2
- 230000005540 biological transmission Effects 0.000 description 2
- 210000000601 blood cell Anatomy 0.000 description 2
- 210000001772 blood platelet Anatomy 0.000 description 2
- 210000001185 bone marrow Anatomy 0.000 description 2
- 239000001506 calcium phosphate Substances 0.000 description 2
- 229910000389 calcium phosphate Inorganic materials 0.000 description 2
- 235000011010 calcium phosphates Nutrition 0.000 description 2
- 230000004663 cell proliferation Effects 0.000 description 2
- HVYWMOMLDIMFJA-DPAQBDIFSA-N cholesterol Chemical compound C1C=C2C[C@@H](O)CC[C@]2(C)[C@@H]2[C@@H]1[C@@H]1CC[C@H]([C@H](C)CCCC(C)C)[C@@]1(C)CC2 HVYWMOMLDIMFJA-DPAQBDIFSA-N 0.000 description 2
- 229960001265 ciclosporin Drugs 0.000 description 2
- 229930182912 cyclosporin Natural products 0.000 description 2
- XUJNEKJLAYXESH-UHFFFAOYSA-N cysteine Natural products SCC(N)C(O)=O XUJNEKJLAYXESH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 235000018417 cysteine Nutrition 0.000 description 2
- 230000001461 cytolytic effect Effects 0.000 description 2
- OPTASPLRGRRNAP-UHFFFAOYSA-N cytosine Chemical compound NC=1C=CNC(=O)N=1 OPTASPLRGRRNAP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 230000003013 cytotoxicity Effects 0.000 description 2
- 231100000135 cytotoxicity Toxicity 0.000 description 2
- 230000001419 dependent effect Effects 0.000 description 2
- 239000003599 detergent Substances 0.000 description 2
- 238000011161 development Methods 0.000 description 2
- 230000018109 developmental process Effects 0.000 description 2
- 229940119744 dextran 40 Drugs 0.000 description 2
- 239000008121 dextrose Substances 0.000 description 2
- 238000004090 dissolution Methods 0.000 description 2
- 239000003814 drug Substances 0.000 description 2
- 229940079593 drug Drugs 0.000 description 2
- 230000002255 enzymatic effect Effects 0.000 description 2
- 210000003743 erythrocyte Anatomy 0.000 description 2
- 102000013165 exonuclease Human genes 0.000 description 2
- 239000013613 expression plasmid Substances 0.000 description 2
- 230000002349 favourable effect Effects 0.000 description 2
- IJJVMEJXYNJXOJ-UHFFFAOYSA-N fluquinconazole Chemical compound C=1C=C(Cl)C=C(Cl)C=1N1C(=O)C2=CC(F)=CC=C2N=C1N1C=NC=N1 IJJVMEJXYNJXOJ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 238000009472 formulation Methods 0.000 description 2
- 230000004927 fusion Effects 0.000 description 2
- 230000002068 genetic effect Effects 0.000 description 2
- 229930195712 glutamate Natural products 0.000 description 2
- ZDXPYRJPNDTMRX-UHFFFAOYSA-N glutamine Natural products OC(=O)C(N)CCC(N)=O ZDXPYRJPNDTMRX-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 210000003714 granulocyte Anatomy 0.000 description 2
- 210000002443 helper t lymphocyte Anatomy 0.000 description 2
- 230000005847 immunogenicity Effects 0.000 description 2
- 229940072221 immunoglobulins Drugs 0.000 description 2
- 238000007918 intramuscular administration Methods 0.000 description 2
- 239000010410 layer Substances 0.000 description 2
- 210000000265 leukocyte Anatomy 0.000 description 2
- 238000001325 log-rank test Methods 0.000 description 2
- 230000036210 malignancy Effects 0.000 description 2
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 description 2
- 239000003550 marker Substances 0.000 description 2
- 239000012528 membrane Substances 0.000 description 2
- HPNSFSBZBAHARI-UHFFFAOYSA-N micophenolic acid Natural products OC1=C(CC=C(C)CCC(O)=O)C(OC)=C(C)C2=C1C(=O)OC2 HPNSFSBZBAHARI-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 239000000178 monomer Substances 0.000 description 2
- 238000002703 mutagenesis Methods 0.000 description 2
- 231100000350 mutagenesis Toxicity 0.000 description 2
- HPNSFSBZBAHARI-RUDMXATFSA-N mycophenolic acid Chemical compound OC1=C(C\C=C(/C)CCC(O)=O)C(OC)=C(C)C2=C1C(=O)OC2 HPNSFSBZBAHARI-RUDMXATFSA-N 0.000 description 2
- 230000001613 neoplastic effect Effects 0.000 description 2
- 229910052757 nitrogen Inorganic materials 0.000 description 2
- 210000004940 nucleus Anatomy 0.000 description 2
- 230000037361 pathway Effects 0.000 description 2
- 210000003819 peripheral blood mononuclear cell Anatomy 0.000 description 2
- 150000003904 phospholipids Chemical class 0.000 description 2
- 102000020233 phosphotransferase Human genes 0.000 description 2
- 230000002265 prevention Effects 0.000 description 2
- 230000005855 radiation Effects 0.000 description 2
- 230000006798 recombination Effects 0.000 description 2
- 238000005215 recombination Methods 0.000 description 2
- 210000003289 regulatory T cell Anatomy 0.000 description 2
- 238000012216 screening Methods 0.000 description 2
- 230000028327 secretion Effects 0.000 description 2
- 238000010187 selection method Methods 0.000 description 2
- 238000002864 sequence alignment Methods 0.000 description 2
- 238000012163 sequencing technique Methods 0.000 description 2
- 239000011780 sodium chloride Substances 0.000 description 2
- 210000000952 spleen Anatomy 0.000 description 2
- 238000010561 standard procedure Methods 0.000 description 2
- 238000007920 subcutaneous administration Methods 0.000 description 2
- 239000006228 supernatant Substances 0.000 description 2
- 230000002194 synthesizing effect Effects 0.000 description 2
- 230000002103 transcriptional effect Effects 0.000 description 2
- 230000002463 transducing effect Effects 0.000 description 2
- 230000014621 translational initiation Effects 0.000 description 2
- 230000032258 transport Effects 0.000 description 2
- QORWJWZARLRLPR-UHFFFAOYSA-H tricalcium bis(phosphate) Chemical compound [Ca+2].[Ca+2].[Ca+2].[O-]P([O-])([O-])=O.[O-]P([O-])([O-])=O QORWJWZARLRLPR-UHFFFAOYSA-H 0.000 description 2
- 102000003298 tumor necrosis factor receptor Human genes 0.000 description 2
- 210000003171 tumor-infiltrating lymphocyte Anatomy 0.000 description 2
- 241001529453 unidentified herpesvirus Species 0.000 description 2
- 238000011179 visual inspection Methods 0.000 description 2
- XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N water Substances O XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 230000003442 weekly effect Effects 0.000 description 2
- DIGQNXIGRZPYDK-WKSCXVIASA-N (2R)-6-amino-2-[[2-[[(2S)-2-[[2-[[(2R)-2-[[(2S)-2-[[(2R,3S)-2-[[2-[[(2S)-2-[[2-[[(2S)-2-[[(2S)-2-[[(2R)-2-[[(2S,3S)-2-[[(2R)-2-[[(2S)-2-[[(2S)-2-[[(2S)-2-[[2-[[(2S)-2-[[(2R)-2-[[2-[[2-[[2-[(2-amino-1-hydroxyethylidene)amino]-3-carboxy-1-hydroxypropylidene]amino]-1-hydroxy-3-sulfanylpropylidene]amino]-1-hydroxyethylidene]amino]-1-hydroxy-3-sulfanylpropylidene]amino]-1,3-dihydroxypropylidene]amino]-1-hydroxyethylidene]amino]-1-hydroxypropylidene]amino]-1,3-dihydroxypropylidene]amino]-1,3-dihydroxypropylidene]amino]-1-hydroxy-3-sulfanylpropylidene]amino]-1,3-dihydroxybutylidene]amino]-1-hydroxy-3-sulfanylpropylidene]amino]-1-hydroxypropylidene]amino]-1,3-dihydroxypropylidene]amino]-1-hydroxyethylidene]amino]-1,5-dihydroxy-5-iminopentylidene]amino]-1-hydroxy-3-sulfanylpropylidene]amino]-1,3-dihydroxybutylidene]amino]-1-hydroxy-3-sulfanylpropylidene]amino]-1,3-dihydroxypropylidene]amino]-1-hydroxyethylidene]amino]-1-hydroxy-3-sulfanylpropylidene]amino]-1-hydroxyethylidene]amino]hexanoic acid Chemical compound C[C@@H]([C@@H](C(=N[C@@H](CS)C(=N[C@@H](C)C(=N[C@@H](CO)C(=NCC(=N[C@@H](CCC(=N)O)C(=NC(CS)C(=N[C@H]([C@H](C)O)C(=N[C@H](CS)C(=N[C@H](CO)C(=NCC(=N[C@H](CS)C(=NCC(=N[C@H](CCCCN)C(=O)O)O)O)O)O)O)O)O)O)O)O)O)O)O)N=C([C@H](CS)N=C([C@H](CO)N=C([C@H](CO)N=C([C@H](C)N=C(CN=C([C@H](CO)N=C([C@H](CS)N=C(CN=C(C(CS)N=C(C(CC(=O)O)N=C(CN)O)O)O)O)O)O)O)O)O)O)O)O DIGQNXIGRZPYDK-WKSCXVIASA-N 0.000 description 1
- SSOORFWOBGFTHL-OTEJMHTDSA-N (4S)-5-[[(2S)-1-[[(2S)-1-[[(2S)-1-[[(2S)-1-[[(2S)-1-[[(2S)-1-[[(2S)-1-[[(2S)-6-amino-1-[[(2S)-1-[[(2S)-1-[[(2S)-1-[[(2S)-1-[[2-[(2S)-2-[[(2S)-1-[[(2S)-1-[[(2S)-1-[[(2S)-1-[[(2S)-1-[[(2S)-1-[[(2S)-6-amino-1-[[(2S)-1-[[(2S)-1-[[(2S,3S)-1-[[(2S)-1-[[(2S)-1-[[(2S)-6-amino-1-[[(2S)-1-[[(2S)-1-[[(2S)-1-[[(2S)-1-[[(2S)-1-[[(2S)-5-amino-1-[[(2S)-1-[[(2S)-1-[[(2S)-6-amino-1-[[(2S)-6-amino-1-[[(2S)-1-[[(2S)-1-[[(2S)-5-amino-1-[[(2S)-5-carbamimidamido-1-[[(2S)-5-carbamimidamido-1-[[(1S)-4-carbamimidamido-1-carboxybutyl]amino]-1-oxopentan-2-yl]amino]-1-oxopentan-2-yl]amino]-1,5-dioxopentan-2-yl]amino]-5-carbamimidamido-1-oxopentan-2-yl]amino]-5-carbamimidamido-1-oxopentan-2-yl]amino]-1-oxohexan-2-yl]amino]-1-oxohexan-2-yl]amino]-5-carbamimidamido-1-oxopentan-2-yl]amino]-4-methyl-1-oxopentan-2-yl]amino]-1,5-dioxopentan-2-yl]amino]-4-methyl-1-oxopentan-2-yl]amino]-3-hydroxy-1-oxopropan-2-yl]amino]-3-hydroxy-1-oxopropan-2-yl]amino]-3-hydroxy-1-oxopropan-2-yl]amino]-1-oxopropan-2-yl]amino]-1-oxohexan-2-yl]amino]-3-hydroxy-1-oxopropan-2-yl]amino]-1-oxo-3-phenylpropan-2-yl]amino]-3-methyl-1-oxopentan-2-yl]amino]-3-methyl-1-oxobutan-2-yl]amino]-5-carbamimidamido-1-oxopentan-2-yl]amino]-1-oxohexan-2-yl]amino]-3-methyl-1-oxobutan-2-yl]amino]-5-carbamimidamido-1-oxopentan-2-yl]amino]-3-methyl-1-oxobutan-2-yl]amino]-4-methyl-1-oxopentan-2-yl]amino]-1-oxopropan-2-yl]amino]-5-carbamimidamido-1-oxopentan-2-yl]carbamoyl]pyrrolidin-1-yl]-2-oxoethyl]amino]-3-(1H-indol-3-yl)-1-oxopropan-2-yl]amino]-4-methyl-1-oxopentan-2-yl]amino]-1-oxo-3-phenylpropan-2-yl]amino]-5-carbamimidamido-1-oxopentan-2-yl]amino]-1-oxohexan-2-yl]amino]-3-methyl-1-oxobutan-2-yl]amino]-5-carbamimidamido-1-oxopentan-2-yl]amino]-4-methyl-1-oxopentan-2-yl]amino]-1-oxo-3-phenylpropan-2-yl]amino]-3-(1H-imidazol-4-yl)-1-oxopropan-2-yl]amino]-3-methyl-1-oxobutan-2-yl]amino]-4-methyl-1-oxopentan-2-yl]amino]-4-[[(2S)-2-[[(2S)-2-[[(2S)-2,6-diaminohexanoyl]amino]-3-methylbutanoyl]amino]propanoyl]amino]-5-oxopentanoic acid Chemical compound CC[C@H](C)[C@H](NC(=O)[C@@H](NC(=O)[C@H](CCCNC(N)=N)NC(=O)[C@H](CCCCN)NC(=O)[C@@H](NC(=O)[C@H](CCCNC(N)=N)NC(=O)[C@@H](NC(=O)[C@H](CC(C)C)NC(=O)[C@H](C)NC(=O)[C@H](CCCNC(N)=N)NC(=O)[C@@H]1CCCN1C(=O)CNC(=O)[C@H](Cc1c[nH]c2ccccc12)NC(=O)[C@H](CC(C)C)NC(=O)[C@H](Cc1ccccc1)NC(=O)[C@H](CCCNC(N)=N)NC(=O)[C@H](CCCCN)NC(=O)[C@@H](NC(=O)[C@H](CCCNC(N)=N)NC(=O)[C@H](CC(C)C)NC(=O)[C@H](Cc1ccccc1)NC(=O)[C@H](Cc1c[nH]cn1)NC(=O)[C@@H](NC(=O)[C@H](CC(C)C)NC(=O)[C@H](CCC(O)=O)NC(=O)[C@H](C)NC(=O)[C@@H](NC(=O)[C@@H](N)CCCCN)C(C)C)C(C)C)C(C)C)C(C)C)C(C)C)C(C)C)C(=O)N[C@@H](Cc1ccccc1)C(=O)N[C@@H](CO)C(=O)N[C@@H](CCCCN)C(=O)N[C@@H](C)C(=O)N[C@@H](CO)C(=O)N[C@@H](CO)C(=O)N[C@@H](CO)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@@H](CCC(N)=O)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(=O)N[C@@H](CCCCN)C(=O)N[C@@H](CCCCN)C(=O)N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(=O)N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(=O)N[C@@H](CCC(N)=O)C(=O)N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(=O)N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(=O)N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(O)=O SSOORFWOBGFTHL-OTEJMHTDSA-N 0.000 description 1
- 102100039583 116 kDa U5 small nuclear ribonucleoprotein component Human genes 0.000 description 1
- VGONTNSXDCQUGY-RRKCRQDMSA-N 2'-deoxyinosine Chemical group C1[C@H](O)[C@@H](CO)O[C@H]1N1C(N=CNC2=O)=C2N=C1 VGONTNSXDCQUGY-RRKCRQDMSA-N 0.000 description 1
- KZMAWJRXKGLWGS-UHFFFAOYSA-N 2-chloro-n-[4-(4-methoxyphenyl)-1,3-thiazol-2-yl]-n-(3-methoxypropyl)acetamide Chemical compound S1C(N(C(=O)CCl)CCCOC)=NC(C=2C=CC(OC)=CC=2)=C1 KZMAWJRXKGLWGS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- LKKMLIBUAXYLOY-UHFFFAOYSA-N 3-Amino-1-methyl-5H-pyrido[4,3-b]indole Chemical compound N1C2=CC=CC=C2C2=C1C=C(N)N=C2C LKKMLIBUAXYLOY-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 102100030310 5,6-dihydroxyindole-2-carboxylic acid oxidase Human genes 0.000 description 1
- 101710163881 5,6-dihydroxyindole-2-carboxylic acid oxidase Proteins 0.000 description 1
- 102100026802 72 kDa type IV collagenase Human genes 0.000 description 1
- 101710151806 72 kDa type IV collagenase Proteins 0.000 description 1
- 102100021222 ATP-dependent Clp protease proteolytic subunit, mitochondrial Human genes 0.000 description 1
- 108020005176 AU Rich Elements Proteins 0.000 description 1
- RZVAJINKPMORJF-UHFFFAOYSA-N Acetaminophen Chemical compound CC(=O)NC1=CC=C(O)C=C1 RZVAJINKPMORJF-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 108010085238 Actins Proteins 0.000 description 1
- 102000007469 Actins Human genes 0.000 description 1
- 206010000830 Acute leukaemia Diseases 0.000 description 1
- 229930024421 Adenine Natural products 0.000 description 1
- 208000003200 Adenoma Diseases 0.000 description 1
- QNAYBMKLOCPYGJ-UHFFFAOYSA-N Alanine Chemical compound CC([NH3+])C([O-])=O QNAYBMKLOCPYGJ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 102100040069 Aldehyde dehydrogenase 1A1 Human genes 0.000 description 1
- 102000002260 Alkaline Phosphatase Human genes 0.000 description 1
- 108020004774 Alkaline Phosphatase Proteins 0.000 description 1
- 108700028369 Alleles Proteins 0.000 description 1
- 102100032959 Alpha-actinin-4 Human genes 0.000 description 1
- 101710115256 Alpha-actinin-4 Proteins 0.000 description 1
- 102100023635 Alpha-fetoprotein Human genes 0.000 description 1
- 102100023003 Ankyrin repeat domain-containing protein 30A Human genes 0.000 description 1
- 108091023037 Aptamer Proteins 0.000 description 1
- 206010003445 Ascites Diseases 0.000 description 1
- 208000023275 Autoimmune disease Diseases 0.000 description 1
- 102100027203 B-cell antigen receptor complex-associated protein beta chain Human genes 0.000 description 1
- 102100024222 B-lymphocyte antigen CD19 Human genes 0.000 description 1
- 208000035143 Bacterial infection Diseases 0.000 description 1
- 102100021663 Baculoviral IAP repeat-containing protein 5 Human genes 0.000 description 1
- 102100026596 Bcl-2-like protein 1 Human genes 0.000 description 1
- DWRXFEITVBNRMK-UHFFFAOYSA-N Beta-D-1-Arabinofuranosylthymine Natural products O=C1NC(=O)C(C)=CN1C1C(O)C(O)C(CO)O1 DWRXFEITVBNRMK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 108060000903 Beta-catenin Proteins 0.000 description 1
- 102000015735 Beta-catenin Human genes 0.000 description 1
- 102100026189 Beta-galactosidase Human genes 0.000 description 1
- 206010005003 Bladder cancer Diseases 0.000 description 1
- 108700012439 CA9 Proteins 0.000 description 1
- 102100038078 CD276 antigen Human genes 0.000 description 1
- 101710185679 CD276 antigen Proteins 0.000 description 1
- 101150108242 CDC27 gene Proteins 0.000 description 1
- 238000010354 CRISPR gene editing Methods 0.000 description 1
- 108010021064 CTLA-4 Antigen Proteins 0.000 description 1
- 229940045513 CTLA4 antagonist Drugs 0.000 description 1
- 101100505076 Caenorhabditis elegans gly-2 gene Proteins 0.000 description 1
- 102100025588 Calcitonin gene-related peptide 1 Human genes 0.000 description 1
- OYPRJOBELJOOCE-UHFFFAOYSA-N Calcium Chemical compound [Ca] OYPRJOBELJOOCE-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 241000282836 Camelus dromedarius Species 0.000 description 1
- 102100039510 Cancer/testis antigen 2 Human genes 0.000 description 1
- 241000282472 Canis lupus familiaris Species 0.000 description 1
- 102000013392 Carboxylesterase Human genes 0.000 description 1
- 108010051152 Carboxylesterase Proteins 0.000 description 1
- 208000005623 Carcinogenesis Diseases 0.000 description 1
- 102100034357 Casein kinase I isoform alpha Human genes 0.000 description 1
- 102100038916 Caspase-5 Human genes 0.000 description 1
- 102100026548 Caspase-8 Human genes 0.000 description 1
- 108090000538 Caspase-8 Proteins 0.000 description 1
- 102000000844 Cell Surface Receptors Human genes 0.000 description 1
- 108010001857 Cell Surface Receptors Proteins 0.000 description 1
- 108010035563 Chloramphenicol O-acetyltransferase Proteins 0.000 description 1
- 108020004638 Circular DNA Proteins 0.000 description 1
- 108091062157 Cis-regulatory element Proteins 0.000 description 1
- 102000011591 Cleavage And Polyadenylation Specificity Factor Human genes 0.000 description 1
- 108010076130 Cleavage And Polyadenylation Specificity Factor Proteins 0.000 description 1
- 102100032368 Coiled-coil domain-containing protein 110 Human genes 0.000 description 1
- 108091028732 Concatemer Proteins 0.000 description 1
- 108091035707 Consensus sequence Proteins 0.000 description 1
- 102100024342 Contactin-2 Human genes 0.000 description 1
- MIKUYHXYGGJMLM-GIMIYPNGSA-N Crotonoside Natural products C1=NC2=C(N)NC(=O)N=C2N1[C@H]1O[C@@H](CO)[C@H](O)[C@@H]1O MIKUYHXYGGJMLM-GIMIYPNGSA-N 0.000 description 1
- 108010058546 Cyclin D1 Proteins 0.000 description 1
- 108010025464 Cyclin-Dependent Kinase 4 Proteins 0.000 description 1
- 108010009392 Cyclin-Dependent Kinase Inhibitor p16 Proteins 0.000 description 1
- 102100038111 Cyclin-dependent kinase 12 Human genes 0.000 description 1
- 102100036252 Cyclin-dependent kinase 4 Human genes 0.000 description 1
- 102100024458 Cyclin-dependent kinase inhibitor 2A Human genes 0.000 description 1
- CMSMOCZEIVJLDB-UHFFFAOYSA-N Cyclophosphamide Chemical compound ClCCN(CCCl)P1(=O)NCCCO1 CMSMOCZEIVJLDB-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- LXJXRIRHZLFYRP-VKHMYHEASA-N D-glyceraldehyde 3-phosphate Chemical compound O=C[C@H](O)COP(O)(O)=O LXJXRIRHZLFYRP-VKHMYHEASA-N 0.000 description 1
- NYHBQMYGNKIUIF-UHFFFAOYSA-N D-guanosine Natural products C1=2NC(N)=NC(=O)C=2N=CN1C1OC(CO)C(O)C1O NYHBQMYGNKIUIF-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 102000016928 DNA-directed DNA polymerase Human genes 0.000 description 1
- 108010014303 DNA-directed DNA polymerase Proteins 0.000 description 1
- 229920002307 Dextran Polymers 0.000 description 1
- 102100030074 Dickkopf-related protein 1 Human genes 0.000 description 1
- GZDFHIJNHHMENY-UHFFFAOYSA-N Dimethyl dicarbonate Chemical compound COC(=O)OC(=O)OC GZDFHIJNHHMENY-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 206010058314 Dysplasia Diseases 0.000 description 1
- 108050002772 E3 ubiquitin-protein ligase Mdm2 Proteins 0.000 description 1
- 102000012199 E3 ubiquitin-protein ligase Mdm2 Human genes 0.000 description 1
- 102100026245 E3 ubiquitin-protein ligase RNF43 Human genes 0.000 description 1
- 102100037238 E3 ubiquitin-protein ligase UBR4 Human genes 0.000 description 1
- 238000002965 ELISA Methods 0.000 description 1
- 102100031334 Elongation factor 2 Human genes 0.000 description 1
- 102100031780 Endonuclease Human genes 0.000 description 1
- 108010042407 Endonucleases Proteins 0.000 description 1
- 241000701867 Enterobacteria phage T7 Species 0.000 description 1
- 102000018651 Epithelial Cell Adhesion Molecule Human genes 0.000 description 1
- 108010066687 Epithelial Cell Adhesion Molecule Proteins 0.000 description 1
- 241000588724 Escherichia coli Species 0.000 description 1
- 108700024394 Exon Proteins 0.000 description 1
- 241000282326 Felis catus Species 0.000 description 1
- 102100028073 Fibroblast growth factor 5 Human genes 0.000 description 1
- 102100026545 Fibronectin type III domain-containing protein 3B Human genes 0.000 description 1
- 108010067306 Fibronectins Proteins 0.000 description 1
- 229920001917 Ficoll Polymers 0.000 description 1
- 102100039717 G antigen 1 Human genes 0.000 description 1
- 102100039699 G antigen 4 Human genes 0.000 description 1
- 101710092267 G antigen 5 Proteins 0.000 description 1
- 102100039698 G antigen 5 Human genes 0.000 description 1
- 101710092269 G antigen 6 Proteins 0.000 description 1
- 102100039713 G antigen 6 Human genes 0.000 description 1
- 102100024165 G1/S-specific cyclin-D1 Human genes 0.000 description 1
- 102100024405 GPI-linked NAD(P)(+)-arginine ADP-ribosyltransferase 1 Human genes 0.000 description 1
- 101710144640 GPI-linked NAD(P)(+)-arginine ADP-ribosyltransferase 1 Proteins 0.000 description 1
- 101710113436 GTPase KRas Proteins 0.000 description 1
- 102100039788 GTPase NRas Human genes 0.000 description 1
- 108700028146 Genetic Enhancer Elements Proteins 0.000 description 1
- 108700039691 Genetic Promoter Regions Proteins 0.000 description 1
- 102100041003 Glutamate carboxypeptidase 2 Human genes 0.000 description 1
- 108050001154 Glypican Proteins 0.000 description 1
- 102000010956 Glypican Human genes 0.000 description 1
- 108050007237 Glypican-3 Proteins 0.000 description 1
- 108060005986 Granzyme Proteins 0.000 description 1
- 102000001398 Granzyme Human genes 0.000 description 1
- 108010043121 Green Fluorescent Proteins Proteins 0.000 description 1
- 102100031493 Growth arrest-specific protein 7 Human genes 0.000 description 1
- 102100039317 HAUS augmin-like complex subunit 3 Human genes 0.000 description 1
- 102100031546 HLA class II histocompatibility antigen, DO beta chain Human genes 0.000 description 1
- 102000025850 HLA-A2 Antigen Human genes 0.000 description 1
- 108010074032 HLA-A2 Antigen Proteins 0.000 description 1
- 102000006354 HLA-DR Antigens Human genes 0.000 description 1
- 108010058597 HLA-DR Antigens Proteins 0.000 description 1
- 208000002250 Hematologic Neoplasms Diseases 0.000 description 1
- 102100029360 Hematopoietic cell signal transducer Human genes 0.000 description 1
- 102000001554 Hemoglobins Human genes 0.000 description 1
- 108010054147 Hemoglobins Proteins 0.000 description 1
- 102000004989 Hepsin Human genes 0.000 description 1
- 108090001101 Hepsin Proteins 0.000 description 1
- 241000238631 Hexapoda Species 0.000 description 1
- 102100038970 Histone-lysine N-methyltransferase EZH2 Human genes 0.000 description 1
- 241001272567 Hominoidea Species 0.000 description 1
- 101000608799 Homo sapiens 116 kDa U5 small nuclear ribonucleoprotein component Proteins 0.000 description 1
- 101000750222 Homo sapiens ATP-dependent Clp protease proteolytic subunit, mitochondrial Proteins 0.000 description 1
- 101000890570 Homo sapiens Aldehyde dehydrogenase 1A1 Proteins 0.000 description 1
- 101000757191 Homo sapiens Ankyrin repeat domain-containing protein 30A Proteins 0.000 description 1
- 101000914491 Homo sapiens B-cell antigen receptor complex-associated protein beta chain Proteins 0.000 description 1
- 101000980825 Homo sapiens B-lymphocyte antigen CD19 Proteins 0.000 description 1
- 101000765923 Homo sapiens Bcl-2-like protein 1 Proteins 0.000 description 1
- 101100165850 Homo sapiens CA9 gene Proteins 0.000 description 1
- 101000741445 Homo sapiens Calcitonin Proteins 0.000 description 1
- 101000932890 Homo sapiens Calcitonin gene-related peptide 1 Proteins 0.000 description 1
- 101000889345 Homo sapiens Cancer/testis antigen 2 Proteins 0.000 description 1
- 101000994700 Homo sapiens Casein kinase I isoform alpha Proteins 0.000 description 1
- 101000741072 Homo sapiens Caspase-5 Proteins 0.000 description 1
- 101000916489 Homo sapiens Chondroitin sulfate proteoglycan 4 Proteins 0.000 description 1
- 101000868824 Homo sapiens Coiled-coil domain-containing protein 110 Proteins 0.000 description 1
- 101000909516 Homo sapiens Contactin-2 Proteins 0.000 description 1
- 101000884345 Homo sapiens Cyclin-dependent kinase 12 Proteins 0.000 description 1
- 101000864646 Homo sapiens Dickkopf-related protein 1 Proteins 0.000 description 1
- 101000692702 Homo sapiens E3 ubiquitin-protein ligase RNF43 Proteins 0.000 description 1
- 101000807547 Homo sapiens E3 ubiquitin-protein ligase UBR4 Proteins 0.000 description 1
- 101001060267 Homo sapiens Fibroblast growth factor 5 Proteins 0.000 description 1
- 101001027128 Homo sapiens Fibronectin Proteins 0.000 description 1
- 101000913642 Homo sapiens Fibronectin type III domain-containing protein 3B Proteins 0.000 description 1
- 101000886137 Homo sapiens G antigen 1 Proteins 0.000 description 1
- 101000886678 Homo sapiens G antigen 2D Proteins 0.000 description 1
- 101000886136 Homo sapiens G antigen 4 Proteins 0.000 description 1
- 101000744505 Homo sapiens GTPase NRas Proteins 0.000 description 1
- 101000892862 Homo sapiens Glutamate carboxypeptidase 2 Proteins 0.000 description 1
- 101000923044 Homo sapiens Growth arrest-specific protein 7 Proteins 0.000 description 1
- 101001035819 Homo sapiens HAUS augmin-like complex subunit 3 Proteins 0.000 description 1
- 101000866281 Homo sapiens HLA class II histocompatibility antigen, DO beta chain Proteins 0.000 description 1
- 101000990188 Homo sapiens Hematopoietic cell signal transducer Proteins 0.000 description 1
- 101000882127 Homo sapiens Histone-lysine N-methyltransferase EZH2 Proteins 0.000 description 1
- 101001042782 Homo sapiens Inactive hydroxysteroid dehydrogenase-like protein 1 Proteins 0.000 description 1
- 101001037256 Homo sapiens Indoleamine 2,3-dioxygenase 1 Proteins 0.000 description 1
- 101001046686 Homo sapiens Integrin alpha-M Proteins 0.000 description 1
- 101001057504 Homo sapiens Interferon-stimulated gene 20 kDa protein Proteins 0.000 description 1
- 101001055144 Homo sapiens Interleukin-2 receptor subunit alpha Proteins 0.000 description 1
- 101000998120 Homo sapiens Interleukin-3 receptor subunit alpha Proteins 0.000 description 1
- 101000614481 Homo sapiens Kidney-associated antigen 1 Proteins 0.000 description 1
- 101000971538 Homo sapiens Killer cell lectin-like receptor subfamily F member 1 Proteins 0.000 description 1
- 101001027621 Homo sapiens Kinesin-like protein KIF20A Proteins 0.000 description 1
- 101000971605 Homo sapiens Kita-kyushu lung cancer antigen 1 Proteins 0.000 description 1
- 101001065550 Homo sapiens Lymphocyte antigen 6K Proteins 0.000 description 1
- 101001014223 Homo sapiens MAPK/MAK/MRK overlapping kinase Proteins 0.000 description 1
- 101000620359 Homo sapiens Melanocyte protein PMEL Proteins 0.000 description 1
- 101000578784 Homo sapiens Melanoma antigen recognized by T-cells 1 Proteins 0.000 description 1
- 101001036406 Homo sapiens Melanoma-associated antigen C1 Proteins 0.000 description 1
- 101001057156 Homo sapiens Melanoma-associated antigen C2 Proteins 0.000 description 1
- 101000628547 Homo sapiens Metalloreductase STEAP1 Proteins 0.000 description 1
- 101000946889 Homo sapiens Monocyte differentiation antigen CD14 Proteins 0.000 description 1
- 101001133056 Homo sapiens Mucin-1 Proteins 0.000 description 1
- 101000972282 Homo sapiens Mucin-5AC Proteins 0.000 description 1
- 101000588345 Homo sapiens Nuclear transcription factor Y subunit gamma Proteins 0.000 description 1
- 101000601724 Homo sapiens Paired box protein Pax-5 Proteins 0.000 description 1
- 101000619805 Homo sapiens Peroxiredoxin-5, mitochondrial Proteins 0.000 description 1
- 101000829725 Homo sapiens Phospholipid hydroperoxide glutathione peroxidase Proteins 0.000 description 1
- 101000610208 Homo sapiens Poly(A) polymerase gamma Proteins 0.000 description 1
- 101001117317 Homo sapiens Programmed cell death 1 ligand 1 Proteins 0.000 description 1
- 101001130763 Homo sapiens Protein OS-9 Proteins 0.000 description 1
- 101000877404 Homo sapiens Protein enabled homolog Proteins 0.000 description 1
- 101001067951 Homo sapiens Protein phosphatase 1 regulatory subunit 3B Proteins 0.000 description 1
- 101000842302 Homo sapiens Protein-cysteine N-palmitoyltransferase HHAT Proteins 0.000 description 1
- 101000620554 Homo sapiens Ras-related protein Rab-38 Proteins 0.000 description 1
- 101001012157 Homo sapiens Receptor tyrosine-protein kinase erbB-2 Proteins 0.000 description 1
- 101000591201 Homo sapiens Receptor-type tyrosine-protein phosphatase kappa Proteins 0.000 description 1
- 101001073409 Homo sapiens Retrotransposon-derived protein PEG10 Proteins 0.000 description 1
- 101000633784 Homo sapiens SLAM family member 7 Proteins 0.000 description 1
- 101000665150 Homo sapiens Small nuclear ribonucleoprotein Sm D1 Proteins 0.000 description 1
- 101000665250 Homo sapiens Small nuclear ribonucleoprotein Sm D2 Proteins 0.000 description 1
- 101001056234 Homo sapiens Sperm mitochondrial-associated cysteine-rich protein Proteins 0.000 description 1
- 101000648075 Homo sapiens Trafficking protein particle complex subunit 1 Proteins 0.000 description 1
- 101000664703 Homo sapiens Transcription factor SOX-10 Proteins 0.000 description 1
- 101000904724 Homo sapiens Transmembrane glycoprotein NMB Proteins 0.000 description 1
- 101000801433 Homo sapiens Trophoblast glycoprotein Proteins 0.000 description 1
- 101000795169 Homo sapiens Tumor necrosis factor receptor superfamily member 13C Proteins 0.000 description 1
- 102000003839 Human Proteins Human genes 0.000 description 1
- 108090000144 Human Proteins Proteins 0.000 description 1
- 229920001612 Hydroxyethyl starch Polymers 0.000 description 1
- 101150102264 IE gene Proteins 0.000 description 1
- 206010061598 Immunodeficiency Diseases 0.000 description 1
- 108010054477 Immunoglobulin Fab Fragments Proteins 0.000 description 1
- 102000001706 Immunoglobulin Fab Fragments Human genes 0.000 description 1
- 108010067060 Immunoglobulin Variable Region Proteins 0.000 description 1
- 102000017727 Immunoglobulin Variable Region Human genes 0.000 description 1
- 206010062016 Immunosuppression Diseases 0.000 description 1
- 102100021647 Inactive hydroxysteroid dehydrogenase-like protein 1 Human genes 0.000 description 1
- 102100040061 Indoleamine 2,3-dioxygenase 1 Human genes 0.000 description 1
- 102100022338 Integrin alpha-M Human genes 0.000 description 1
- 102100027268 Interferon-stimulated gene 20 kDa protein Human genes 0.000 description 1
- 102000003814 Interleukin-10 Human genes 0.000 description 1
- 108090000174 Interleukin-10 Proteins 0.000 description 1
- 102000003816 Interleukin-13 Human genes 0.000 description 1
- 108090000176 Interleukin-13 Proteins 0.000 description 1
- 102100020793 Interleukin-13 receptor subunit alpha-2 Human genes 0.000 description 1
- 101710112634 Interleukin-13 receptor subunit alpha-2 Proteins 0.000 description 1
- 108050003558 Interleukin-17 Proteins 0.000 description 1
- 102000013691 Interleukin-17 Human genes 0.000 description 1
- 108010002350 Interleukin-2 Proteins 0.000 description 1
- 102000000588 Interleukin-2 Human genes 0.000 description 1
- 108010002386 Interleukin-3 Proteins 0.000 description 1
- 102000000646 Interleukin-3 Human genes 0.000 description 1
- 102100033493 Interleukin-3 receptor subunit alpha Human genes 0.000 description 1
- 108090000978 Interleukin-4 Proteins 0.000 description 1
- 102000004388 Interleukin-4 Human genes 0.000 description 1
- 102100040442 Kidney-associated antigen 1 Human genes 0.000 description 1
- 102100021458 Killer cell lectin-like receptor subfamily F member 1 Human genes 0.000 description 1
- 102100037694 Kinesin-like protein KIF20A Human genes 0.000 description 1
- 102100021533 Kita-kyushu lung cancer antigen 1 Human genes 0.000 description 1
- 102100031413 L-dopachrome tautomerase Human genes 0.000 description 1
- 101710093778 L-dopachrome tautomerase Proteins 0.000 description 1
- FBOZXECLQNJBKD-ZDUSSCGKSA-N L-methotrexate Chemical compound C=1N=C2N=C(N)N=C(N)C2=NC=1CN(C)C1=CC=C(C(=O)N[C@@H](CCC(O)=O)C(O)=O)C=C1 FBOZXECLQNJBKD-ZDUSSCGKSA-N 0.000 description 1
- 108091026898 Leader sequence (mRNA) Proteins 0.000 description 1
- 102100024144 Lengsin Human genes 0.000 description 1
- 101710113750 Lengsin Proteins 0.000 description 1
- 108060001084 Luciferase Proteins 0.000 description 1
- 239000005089 Luciferase Substances 0.000 description 1
- 102100032129 Lymphocyte antigen 6K Human genes 0.000 description 1
- 102100031520 MAPK/MAK/MRK overlapping kinase Human genes 0.000 description 1
- 108010010995 MART-1 Antigen Proteins 0.000 description 1
- 108010046938 Macrophage Colony-Stimulating Factor Proteins 0.000 description 1
- 102100028123 Macrophage colony-stimulating factor 1 Human genes 0.000 description 1
- 102000005727 Mammaglobin A Human genes 0.000 description 1
- 108010031030 Mammaglobin A Proteins 0.000 description 1
- 102100030417 Matrilysin Human genes 0.000 description 1
- 108090000855 Matrilysin Proteins 0.000 description 1
- 102100039447 Melanoma-associated antigen C1 Human genes 0.000 description 1
- 102100027252 Melanoma-associated antigen C2 Human genes 0.000 description 1
- 241001482085 Meloe Species 0.000 description 1
- 108010061593 Member 14 Tumor Necrosis Factor Receptors Proteins 0.000 description 1
- 108010052285 Membrane Proteins Proteins 0.000 description 1
- 102000003735 Mesothelin Human genes 0.000 description 1
- 108090000015 Mesothelin Proteins 0.000 description 1
- 102100026712 Metalloreductase STEAP1 Human genes 0.000 description 1
- 102000003792 Metallothionein Human genes 0.000 description 1
- 108090000157 Metallothionein Proteins 0.000 description 1
- 206010027476 Metastases Diseases 0.000 description 1
- 206010027480 Metastatic malignant melanoma Diseases 0.000 description 1
- 108010092801 Midkine Proteins 0.000 description 1
- 102000016776 Midkine Human genes 0.000 description 1
- 102100035877 Monocyte differentiation antigen CD14 Human genes 0.000 description 1
- 241000713333 Mouse mammary tumor virus Species 0.000 description 1
- 102100034256 Mucin-1 Human genes 0.000 description 1
- 102100022496 Mucin-5AC Human genes 0.000 description 1
- 241000714177 Murine leukemia virus Species 0.000 description 1
- 108060008487 Myosin Proteins 0.000 description 1
- 102000003505 Myosin Human genes 0.000 description 1
- 101710204036 Myosin-1 Proteins 0.000 description 1
- 102100022913 NAD-dependent protein deacetylase sirtuin-2 Human genes 0.000 description 1
- 108091008877 NK cell receptors Proteins 0.000 description 1
- 102000010648 Natural Killer Cell Receptors Human genes 0.000 description 1
- 238000000636 Northern blotting Methods 0.000 description 1
- 102100031719 Nuclear transcription factor Y subunit gamma Human genes 0.000 description 1
- 108091005461 Nucleic proteins Proteins 0.000 description 1
- 108091034117 Oligonucleotide Proteins 0.000 description 1
- 241000283973 Oryctolagus cuniculus Species 0.000 description 1
- 240000007019 Oxalis corniculata Species 0.000 description 1
- 229910019142 PO4 Inorganic materials 0.000 description 1
- 102000036673 PRAME Human genes 0.000 description 1
- 108060006580 PRAME Proteins 0.000 description 1
- 102100037504 Paired box protein Pax-5 Human genes 0.000 description 1
- 208000030852 Parasitic disease Diseases 0.000 description 1
- 102000010292 Peptide Elongation Factor 1 Human genes 0.000 description 1
- 108010077519 Peptide Elongation Factor 2 Proteins 0.000 description 1
- 108010068204 Peptide Elongation Factors Proteins 0.000 description 1
- 102000002508 Peptide Elongation Factors Human genes 0.000 description 1
- 102000004503 Perforin Human genes 0.000 description 1
- 108010056995 Perforin Proteins 0.000 description 1
- KHGNFPUMBJSZSM-UHFFFAOYSA-N Perforine Natural products COC1=C2CCC(O)C(CCC(C)(C)O)(OC)C2=NC2=C1C=CO2 KHGNFPUMBJSZSM-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 102100022078 Peroxiredoxin-5, mitochondrial Human genes 0.000 description 1
- 102100037419 Pituitary tumor-transforming gene 1 protein-interacting protein Human genes 0.000 description 1
- 101710199379 Pituitary tumor-transforming gene 1 protein-interacting protein Proteins 0.000 description 1
- 208000002151 Pleural effusion Diseases 0.000 description 1
- 102100040153 Poly(A) polymerase gamma Human genes 0.000 description 1
- 108010039918 Polylysine Proteins 0.000 description 1
- 102100037935 Polyubiquitin-C Human genes 0.000 description 1
- 208000006664 Precursor Cell Lymphoblastic Leukemia-Lymphoma Diseases 0.000 description 1
- 102100022019 Pregnancy-specific beta-1-glycoprotein 2 Human genes 0.000 description 1
- 102100031492 Protein OS-9 Human genes 0.000 description 1
- 102100035093 Protein enabled homolog Human genes 0.000 description 1
- 102100034504 Protein phosphatase 1 regulatory subunit 3B Human genes 0.000 description 1
- 102000018471 Proto-Oncogene Proteins B-raf Human genes 0.000 description 1
- 108010091528 Proto-Oncogene Proteins B-raf Proteins 0.000 description 1
- 101800001295 Putative ATP-dependent helicase Proteins 0.000 description 1
- 101800001006 Putative helicase Proteins 0.000 description 1
- 108020005161 RNA Caps Proteins 0.000 description 1
- 108010065868 RNA polymerase SP6 Proteins 0.000 description 1
- 102100022305 Ras-related protein Rab-38 Human genes 0.000 description 1
- 102100030086 Receptor tyrosine-protein kinase erbB-2 Human genes 0.000 description 1
- 102100034089 Receptor-type tyrosine-protein phosphatase kappa Human genes 0.000 description 1
- 208000015634 Rectal Neoplasms Diseases 0.000 description 1
- 102100037421 Regulator of G-protein signaling 5 Human genes 0.000 description 1
- 101710140403 Regulator of G-protein signaling 5 Proteins 0.000 description 1
- 108020005091 Replication Origin Proteins 0.000 description 1
- 102100035844 Retrotransposon-derived protein PEG10 Human genes 0.000 description 1
- 108010083644 Ribonucleases Proteins 0.000 description 1
- 102000006382 Ribonucleases Human genes 0.000 description 1
- 102100029198 SLAM family member 7 Human genes 0.000 description 1
- 101710173693 Short transient receptor potential channel 1 Proteins 0.000 description 1
- 101710173694 Short transient receptor potential channel 2 Proteins 0.000 description 1
- 108010074687 Signaling Lymphocytic Activation Molecule Family Member 1 Proteins 0.000 description 1
- 102000008115 Signaling Lymphocytic Activation Molecule Family Member 1 Human genes 0.000 description 1
- 108010041216 Sirtuin 2 Proteins 0.000 description 1
- 102100038685 Small nuclear ribonucleoprotein Sm D2 Human genes 0.000 description 1
- 208000004346 Smoldering Multiple Myeloma Diseases 0.000 description 1
- 238000002105 Southern blotting Methods 0.000 description 1
- 102100026503 Sperm mitochondrial-associated cysteine-rich protein Human genes 0.000 description 1
- 108010002687 Survivin Proteins 0.000 description 1
- 230000006044 T cell activation Effects 0.000 description 1
- 230000005867 T cell response Effects 0.000 description 1
- 208000000389 T-cell leukemia Diseases 0.000 description 1
- 208000028530 T-cell lymphoblastic leukemia/lymphoma Diseases 0.000 description 1
- 206010042971 T-cell lymphoma Diseases 0.000 description 1
- 208000027585 T-cell non-Hodgkin lymphoma Diseases 0.000 description 1
- 101710137500 T7 RNA polymerase Proteins 0.000 description 1
- 108700019889 TEL-AML1 fusion Proteins 0.000 description 1
- 101150084279 TM gene Proteins 0.000 description 1
- 108010017842 Telomerase Proteins 0.000 description 1
- 239000004098 Tetracycline Substances 0.000 description 1
- 108091036066 Three prime untranslated region Proteins 0.000 description 1
- 102000006601 Thymidine Kinase Human genes 0.000 description 1
- 108020004440 Thymidine kinase Proteins 0.000 description 1
- 102100025256 Trafficking protein particle complex subunit 1 Human genes 0.000 description 1
- 102100037116 Transcription elongation factor 1 homolog Human genes 0.000 description 1
- 102100038808 Transcription factor SOX-10 Human genes 0.000 description 1
- 108090001012 Transforming Growth Factor beta Proteins 0.000 description 1
- 102000004887 Transforming Growth Factor beta Human genes 0.000 description 1
- 102100023935 Transmembrane glycoprotein NMB Human genes 0.000 description 1
- 229920004890 Triton X-100 Polymers 0.000 description 1
- 102100033579 Trophoblast glycoprotein Human genes 0.000 description 1
- LVTKHGUGBGNBPL-UHFFFAOYSA-N Trp-P-1 Chemical compound N1C2=CC=CC=C2C2=C1C(C)=C(N)N=C2C LVTKHGUGBGNBPL-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 102100029690 Tumor necrosis factor receptor superfamily member 13C Human genes 0.000 description 1
- 102100028785 Tumor necrosis factor receptor superfamily member 14 Human genes 0.000 description 1
- 102000003425 Tyrosinase Human genes 0.000 description 1
- 108060008724 Tyrosinase Proteins 0.000 description 1
- 102100031929 UDP-N-acetylglucosamine-peptide N-acetylglucosaminyltransferase 110 kDa subunit Human genes 0.000 description 1
- 101710117112 UDP-N-acetylglucosamine-peptide N-acetylglucosaminyltransferase 110 kDa subunit Proteins 0.000 description 1
- 108010056354 Ubiquitin C Proteins 0.000 description 1
- 108091023045 Untranslated Region Proteins 0.000 description 1
- 208000007097 Urinary Bladder Neoplasms Diseases 0.000 description 1
- 208000002495 Uterine Neoplasms Diseases 0.000 description 1
- 108010019530 Vascular Endothelial Growth Factors Proteins 0.000 description 1
- 102000005789 Vascular Endothelial Growth Factors Human genes 0.000 description 1
- 208000036142 Viral infection Diseases 0.000 description 1
- 102000040856 WT1 Human genes 0.000 description 1
- 108700020467 WT1 Proteins 0.000 description 1
- 101150084041 WT1 gene Proteins 0.000 description 1
- 241001193851 Zeta Species 0.000 description 1
- 108010017070 Zinc Finger Nucleases Proteins 0.000 description 1
- 230000002159 abnormal effect Effects 0.000 description 1
- 239000002253 acid Substances 0.000 description 1
- 150000007513 acids Chemical class 0.000 description 1
- 239000004480 active ingredient Substances 0.000 description 1
- 229960000643 adenine Drugs 0.000 description 1
- 208000009956 adenocarcinoma Diseases 0.000 description 1
- 150000003838 adenosines Chemical class 0.000 description 1
- 230000002411 adverse Effects 0.000 description 1
- 238000005054 agglomeration Methods 0.000 description 1
- 230000002776 aggregation Effects 0.000 description 1
- 150000001298 alcohols Chemical class 0.000 description 1
- 150000001299 aldehydes Chemical class 0.000 description 1
- 150000001338 aliphatic hydrocarbons Chemical class 0.000 description 1
- 108010026331 alpha-Fetoproteins Proteins 0.000 description 1
- 230000004075 alteration Effects 0.000 description 1
- 150000001412 amines Chemical class 0.000 description 1
- 150000001414 amino alcohols Chemical class 0.000 description 1
- 230000001093 anti-cancer Effects 0.000 description 1
- 230000005809 anti-tumor immunity Effects 0.000 description 1
- 229930193936 anticarin Natural products 0.000 description 1
- 210000000612 antigen-presenting cell Anatomy 0.000 description 1
- 239000003963 antioxidant agent Substances 0.000 description 1
- 239000003443 antiviral agent Substances 0.000 description 1
- 238000013459 approach Methods 0.000 description 1
- 239000000823 artificial membrane Substances 0.000 description 1
- LMEKQMALGUDUQG-UHFFFAOYSA-N azathioprine Chemical compound CN1C=NC([N+]([O-])=O)=C1SC1=NC=NC2=C1NC=N2 LMEKQMALGUDUQG-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 208000022362 bacterial infectious disease Diseases 0.000 description 1
- 108010028263 bacteriophage T3 RNA polymerase Proteins 0.000 description 1
- 108010056708 bcr-abl Fusion Proteins Proteins 0.000 description 1
- 102000004441 bcr-abl Fusion Proteins Human genes 0.000 description 1
- 108010005774 beta-Galactosidase Proteins 0.000 description 1
- IQFYYKKMVGJFEH-UHFFFAOYSA-N beta-L-thymidine Natural products O=C1NC(=O)C(C)=CN1C1OC(CO)C(O)C1 IQFYYKKMVGJFEH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- DRTQHJPVMGBUCF-PSQAKQOGSA-N beta-L-uridine Natural products O[C@H]1[C@@H](O)[C@H](CO)O[C@@H]1N1C(=O)NC(=O)C=C1 DRTQHJPVMGBUCF-PSQAKQOGSA-N 0.000 description 1
- 230000001588 bifunctional effect Effects 0.000 description 1
- 238000005842 biochemical reaction Methods 0.000 description 1
- 230000003115 biocidal effect Effects 0.000 description 1
- 239000003124 biologic agent Substances 0.000 description 1
- 238000010170 biological method Methods 0.000 description 1
- 230000031018 biological processes and functions Effects 0.000 description 1
- 230000029918 bioluminescence Effects 0.000 description 1
- 238000005415 bioluminescence Methods 0.000 description 1
- 229960002685 biotin Drugs 0.000 description 1
- 239000011616 biotin Substances 0.000 description 1
- 210000002798 bone marrow cell Anatomy 0.000 description 1
- 229960005520 bryostatin Drugs 0.000 description 1
- MJQUEDHRCUIRLF-TVIXENOKSA-N bryostatin 1 Chemical compound C([C@@H]1CC(/[C@@H]([C@@](C(C)(C)/C=C/2)(O)O1)OC(=O)/C=C/C=C/CCC)=C\C(=O)OC)[C@H]([C@@H](C)O)OC(=O)C[C@H](O)C[C@@H](O1)C[C@H](OC(C)=O)C(C)(C)[C@]1(O)C[C@@H]1C\C(=C\C(=O)OC)C[C@H]\2O1 MJQUEDHRCUIRLF-TVIXENOKSA-N 0.000 description 1
- MUIWQCKLQMOUAT-AKUNNTHJSA-N bryostatin 20 Natural products COC(=O)C=C1C[C@@]2(C)C[C@]3(O)O[C@](C)(C[C@@H](O)CC(=O)O[C@](C)(C[C@@]4(C)O[C@](O)(CC5=CC(=O)O[C@]45C)C(C)(C)C=C[C@@](C)(C1)O2)[C@@H](C)O)C[C@H](OC(=O)C(C)(C)C)C3(C)C MUIWQCKLQMOUAT-AKUNNTHJSA-N 0.000 description 1
- 239000011575 calcium Substances 0.000 description 1
- 229910052791 calcium Inorganic materials 0.000 description 1
- 239000003710 calcium ionophore Substances 0.000 description 1
- 229940112129 campath Drugs 0.000 description 1
- 230000036952 cancer formation Effects 0.000 description 1
- 231100000504 carcinogenesis Toxicity 0.000 description 1
- 150000001768 cations Chemical class 0.000 description 1
- 230000020411 cell activation Effects 0.000 description 1
- 210000000170 cell membrane Anatomy 0.000 description 1
- 239000002458 cell surface marker Substances 0.000 description 1
- 230000001413 cellular effect Effects 0.000 description 1
- 238000005119 centrifugation Methods 0.000 description 1
- 125000003636 chemical group Chemical group 0.000 description 1
- 238000006243 chemical reaction Methods 0.000 description 1
- 239000003153 chemical reaction reagent Substances 0.000 description 1
- 238000002512 chemotherapy Methods 0.000 description 1
- 235000012000 cholesterol Nutrition 0.000 description 1
- 210000000349 chromosome Anatomy 0.000 description 1
- 208000024207 chronic leukemia Diseases 0.000 description 1
- 239000013599 cloning vector Substances 0.000 description 1
- 238000001246 colloidal dispersion Methods 0.000 description 1
- 239000000084 colloidal system Substances 0.000 description 1
- 238000002648 combination therapy Methods 0.000 description 1
- 238000004590 computer program Methods 0.000 description 1
- 238000007796 conventional method Methods 0.000 description 1
- 239000013632 covalent dimer Substances 0.000 description 1
- CVSVTCORWBXHQV-UHFFFAOYSA-N creatine Chemical compound NC(=[NH2+])N(C)CC([O-])=O CVSVTCORWBXHQV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229960004397 cyclophosphamide Drugs 0.000 description 1
- 102000003675 cytokine receptors Human genes 0.000 description 1
- 108010057085 cytokine receptors Proteins 0.000 description 1
- 230000009089 cytolysis Effects 0.000 description 1
- 229940104302 cytosine Drugs 0.000 description 1
- 230000003436 cytoskeletal effect Effects 0.000 description 1
- 231100000433 cytotoxic Toxicity 0.000 description 1
- 230000001472 cytotoxic effect Effects 0.000 description 1
- 230000006378 damage Effects 0.000 description 1
- 230000007423 decrease Effects 0.000 description 1
- 230000007547 defect Effects 0.000 description 1
- 238000004925 denaturation Methods 0.000 description 1
- 230000036425 denaturation Effects 0.000 description 1
- 238000001514 detection method Methods 0.000 description 1
- 238000003745 diagnosis Methods 0.000 description 1
- 235000014113 dietary fatty acids Nutrition 0.000 description 1
- 230000004069 differentiation Effects 0.000 description 1
- 238000007865 diluting Methods 0.000 description 1
- 239000000539 dimer Substances 0.000 description 1
- BPHQZTVXXXJVHI-UHFFFAOYSA-N dimyristoyl phosphatidylglycerol Chemical compound CCCCCCCCCCCCCC(=O)OCC(COP(O)(=O)OCC(O)CO)OC(=O)CCCCCCCCCCCCC BPHQZTVXXXJVHI-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000002552 dosage form Substances 0.000 description 1
- 231100000371 dose-limiting toxicity Toxicity 0.000 description 1
- 231100000673 dose–response relationship Toxicity 0.000 description 1
- 241001493065 dsRNA viruses Species 0.000 description 1
- 210000003162 effector t lymphocyte Anatomy 0.000 description 1
- 238000010828 elution Methods 0.000 description 1
- 239000000839 emulsion Substances 0.000 description 1
- 238000005538 encapsulation Methods 0.000 description 1
- 239000003623 enhancer Substances 0.000 description 1
- 108010002591 epsilon receptor Proteins 0.000 description 1
- CJAONIOAQZUHPN-KKLWWLSJSA-N ethyl 12-[[2-[(2r,3r)-3-[2-[(12-ethoxy-12-oxododecyl)-methylamino]-2-oxoethoxy]butan-2-yl]oxyacetyl]-methylamino]dodecanoate Chemical compound CCOC(=O)CCCCCCCCCCCN(C)C(=O)CO[C@H](C)[C@@H](C)OCC(=O)N(C)CCCCCCCCCCCC(=O)OCC CJAONIOAQZUHPN-KKLWWLSJSA-N 0.000 description 1
- 210000003527 eukaryotic cell Anatomy 0.000 description 1
- 238000002474 experimental method Methods 0.000 description 1
- 210000001723 extracellular space Anatomy 0.000 description 1
- 229930195729 fatty acid Natural products 0.000 description 1
- 239000000194 fatty acid Substances 0.000 description 1
- 150000004665 fatty acids Chemical class 0.000 description 1
- 210000004700 fetal blood Anatomy 0.000 description 1
- 230000001605 fetal effect Effects 0.000 description 1
- 210000003754 fetus Anatomy 0.000 description 1
- 229960000390 fludarabine Drugs 0.000 description 1
- GIUYCYHIANZCFB-FJFJXFQQSA-N fludarabine phosphate Chemical compound C1=NC=2C(N)=NC(F)=NC=2N1[C@@H]1O[C@H](COP(O)(O)=O)[C@@H](O)[C@@H]1O GIUYCYHIANZCFB-FJFJXFQQSA-N 0.000 description 1
- 238000002825 functional assay Methods 0.000 description 1
- 239000007789 gas Substances 0.000 description 1
- 238000012215 gene cloning Methods 0.000 description 1
- 238000012239 gene modification Methods 0.000 description 1
- 238000010353 genetic engineering Methods 0.000 description 1
- 230000005017 genetic modification Effects 0.000 description 1
- 235000013617 genetically modified food Nutrition 0.000 description 1
- 239000003862 glucocorticoid Substances 0.000 description 1
- 239000008103 glucose Substances 0.000 description 1
- 230000013595 glycosylation Effects 0.000 description 1
- 238000006206 glycosylation reaction Methods 0.000 description 1
- UYTPUPDQBNUYGX-UHFFFAOYSA-N guanine Chemical class O=C1NC(N)=NC2=C1N=CN2 UYTPUPDQBNUYGX-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229940029575 guanosine Drugs 0.000 description 1
- 210000003958 hematopoietic stem cell Anatomy 0.000 description 1
- 210000003494 hepatocyte Anatomy 0.000 description 1
- 229940064366 hespan Drugs 0.000 description 1
- 210000005260 human cell Anatomy 0.000 description 1
- 238000003384 imaging method Methods 0.000 description 1
- 230000008004 immune attack Effects 0.000 description 1
- 210000002865 immune cell Anatomy 0.000 description 1
- 230000001900 immune effect Effects 0.000 description 1
- 230000003053 immunization Effects 0.000 description 1
- 238000002649 immunization Methods 0.000 description 1
- 230000002163 immunogen Effects 0.000 description 1
- 230000016784 immunoglobulin production Effects 0.000 description 1
- 230000001506 immunosuppresive effect Effects 0.000 description 1
- 229960003444 immunosuppressant agent Drugs 0.000 description 1
- 239000003018 immunosuppressive agent Substances 0.000 description 1
- 230000006872 improvement Effects 0.000 description 1
- 238000010348 incorporation Methods 0.000 description 1
- 239000000411 inducer Substances 0.000 description 1
- 208000015181 infectious disease Diseases 0.000 description 1
- 238000003780 insertion Methods 0.000 description 1
- 230000037431 insertion Effects 0.000 description 1
- 230000010354 integration Effects 0.000 description 1
- 230000004073 interleukin-2 production Effects 0.000 description 1
- 230000000968 intestinal effect Effects 0.000 description 1
- 238000001990 intravenous administration Methods 0.000 description 1
- 238000002955 isolation Methods 0.000 description 1
- 238000012886 linear function Methods 0.000 description 1
- 238000001638 lipofection Methods 0.000 description 1
- 230000004807 localization Effects 0.000 description 1
- 210000001165 lymph node Anatomy 0.000 description 1
- 210000004324 lymphatic system Anatomy 0.000 description 1
- 201000011649 lymphoblastic lymphoma Diseases 0.000 description 1
- 230000000527 lymphocytic effect Effects 0.000 description 1
- 230000002934 lysing effect Effects 0.000 description 1
- FVVLHONNBARESJ-NTOWJWGLSA-H magnesium;potassium;trisodium;(2r,3s,4r,5r)-2,3,4,5,6-pentahydroxyhexanoate;acetate;tetrachloride;nonahydrate Chemical compound O.O.O.O.O.O.O.O.O.[Na+].[Na+].[Na+].[Mg+2].[Cl-].[Cl-].[Cl-].[Cl-].[K+].CC([O-])=O.OC[C@@H](O)[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](O)C([O-])=O FVVLHONNBARESJ-NTOWJWGLSA-H 0.000 description 1
- 210000004962 mammalian cell Anatomy 0.000 description 1
- 208000021039 metastatic melanoma Diseases 0.000 description 1
- MYWUZJCMWCOHBA-VIFPVBQESA-N methamphetamine Chemical compound CN[C@@H](C)CC1=CC=CC=C1 MYWUZJCMWCOHBA-VIFPVBQESA-N 0.000 description 1
- 229960000485 methotrexate Drugs 0.000 description 1
- 238000000520 microinjection Methods 0.000 description 1
- 239000004005 microsphere Substances 0.000 description 1
- 229940014456 mycophenolate Drugs 0.000 description 1
- 229960000951 mycophenolic acid Drugs 0.000 description 1
- 239000002088 nanocapsule Substances 0.000 description 1
- 239000002105 nanoparticle Substances 0.000 description 1
- 108010069768 negative elongation factor Proteins 0.000 description 1
- 238000011275 oncology therapy Methods 0.000 description 1
- 229960005489 paracetamol Drugs 0.000 description 1
- 230000036281 parasite infection Effects 0.000 description 1
- 230000007170 pathology Effects 0.000 description 1
- 230000000149 penetrating effect Effects 0.000 description 1
- 229930192851 perforin Natural products 0.000 description 1
- 210000005105 peripheral blood lymphocyte Anatomy 0.000 description 1
- 230000035699 permeability Effects 0.000 description 1
- NBIIXXVUZAFLBC-UHFFFAOYSA-K phosphate Chemical compound [O-]P([O-])([O-])=O NBIIXXVUZAFLBC-UHFFFAOYSA-K 0.000 description 1
- 239000010452 phosphate Substances 0.000 description 1
- WTJKGGKOPKCXLL-RRHRGVEJSA-N phosphatidylcholine Chemical compound CCCCCCCCCCCCCCCC(=O)OC[C@H](COP([O-])(=O)OCC[N+](C)(C)C)OC(=O)CCCCCCCC=CCCCCCCCC WTJKGGKOPKCXLL-RRHRGVEJSA-N 0.000 description 1
- 238000000053 physical method Methods 0.000 description 1
- 230000004962 physiological condition Effects 0.000 description 1
- 210000002826 placenta Anatomy 0.000 description 1
- 229940081858 plasmalyte a Drugs 0.000 description 1
- 229920001481 poly(stearyl methacrylate) Polymers 0.000 description 1
- 238000002264 polyacrylamide gel electrophoresis Methods 0.000 description 1
- 229920000656 polylysine Polymers 0.000 description 1
- 239000013641 positive control Substances 0.000 description 1
- 230000003389 potentiating effect Effects 0.000 description 1
- 238000001556 precipitation Methods 0.000 description 1
- 210000004986 primary T-cell Anatomy 0.000 description 1
- 238000012545 processing Methods 0.000 description 1
- 239000000186 progesterone Substances 0.000 description 1
- 229960003387 progesterone Drugs 0.000 description 1
- 230000000770 proinflammatory effect Effects 0.000 description 1
- 230000001737 promoting effect Effects 0.000 description 1
- 238000011321 prophylaxis Methods 0.000 description 1
- 230000001681 protective effect Effects 0.000 description 1
- ZAHRKKWIAAJSAO-UHFFFAOYSA-N rapamycin Natural products COCC(O)C(=C/C(C)C(=O)CC(OC(=O)C1CCCCN1C(=O)C(=O)C2(O)OC(CC(OC)C(=CC=CC=CC(C)CC(C)C(=O)C)C)CCC2C)C(C)CC3CCC(O)C(C3)OC)C ZAHRKKWIAAJSAO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 238000010188 recombinant method Methods 0.000 description 1
- 238000011084 recovery Methods 0.000 description 1
- 230000007115 recruitment Effects 0.000 description 1
- 206010038038 rectal cancer Diseases 0.000 description 1
- 201000001275 rectum cancer Diseases 0.000 description 1
- 230000008929 regeneration Effects 0.000 description 1
- 238000011069 regeneration method Methods 0.000 description 1
- 230000022532 regulation of transcription, DNA-dependent Effects 0.000 description 1
- 238000007634 remodeling Methods 0.000 description 1
- 230000010076 replication Effects 0.000 description 1
- 230000001850 reproductive effect Effects 0.000 description 1
- 108091008146 restriction endonucleases Proteins 0.000 description 1
- 238000003757 reverse transcription PCR Methods 0.000 description 1
- 238000012552 review Methods 0.000 description 1
- 229960003452 romidepsin Drugs 0.000 description 1
- 235000002020 sage Nutrition 0.000 description 1
- 230000003248 secreting effect Effects 0.000 description 1
- 125000003607 serino group Chemical group [H]N([H])[C@]([H])(C(=O)[*])C(O[H])([H])[H] 0.000 description 1
- 210000002966 serum Anatomy 0.000 description 1
- 238000004904 shortening Methods 0.000 description 1
- 229960002930 sirolimus Drugs 0.000 description 1
- QFJCIRLUMZQUOT-HPLJOQBZSA-N sirolimus Chemical compound C1C[C@@H](O)[C@H](OC)C[C@@H]1C[C@@H](C)[C@H]1OC(=O)[C@@H]2CCCCN2C(=O)C(=O)[C@](O)(O2)[C@H](C)CC[C@H]2C[C@H](OC)/C(C)=C/C=C/C=C/[C@@H](C)C[C@@H](C)C(=O)[C@H](OC)[C@H](O)/C(C)=C/[C@@H](C)C(=O)C1 QFJCIRLUMZQUOT-HPLJOQBZSA-N 0.000 description 1
- 238000002741 site-directed mutagenesis Methods 0.000 description 1
- 150000003384 small molecules Chemical class 0.000 description 1
- 208000010721 smoldering plasma cell myeloma Diseases 0.000 description 1
- 238000002415 sodium dodecyl sulfate polyacrylamide gel electrophoresis Methods 0.000 description 1
- 239000002904 solvent Substances 0.000 description 1
- 210000001082 somatic cell Anatomy 0.000 description 1
- 230000002269 spontaneous effect Effects 0.000 description 1
- 238000011272 standard treatment Methods 0.000 description 1
- 150000003431 steroids Chemical class 0.000 description 1
- 238000003756 stirring Methods 0.000 description 1
- 239000011550 stock solution Substances 0.000 description 1
- 238000003860 storage Methods 0.000 description 1
- 235000000346 sugar Nutrition 0.000 description 1
- 150000008163 sugars Chemical class 0.000 description 1
- 239000000725 suspension Substances 0.000 description 1
- 206010042863 synovial sarcoma Diseases 0.000 description 1
- 238000010189 synthetic method Methods 0.000 description 1
- 229960001967 tacrolimus Drugs 0.000 description 1
- QJJXYPPXXYFBGM-SHYZHZOCSA-N tacrolimus Natural products CO[C@H]1C[C@H](CC[C@@H]1O)C=C(C)[C@H]2OC(=O)[C@H]3CCCCN3C(=O)C(=O)[C@@]4(O)O[C@@H]([C@H](C[C@H]4C)OC)[C@@H](C[C@H](C)CC(=C[C@@H](CC=C)C(=O)C[C@H](O)[C@H]2C)C)OC QJJXYPPXXYFBGM-SHYZHZOCSA-N 0.000 description 1
- 210000001550 testis Anatomy 0.000 description 1
- 229960002180 tetracycline Drugs 0.000 description 1
- 229930101283 tetracycline Natural products 0.000 description 1
- 235000019364 tetracycline Nutrition 0.000 description 1
- 150000003522 tetracyclines Chemical class 0.000 description 1
- ZRKFYGHZFMAOKI-QMGMOQQFSA-N tgfbeta Chemical compound C([C@H](NC(=O)[C@H](C(C)C)NC(=O)CNC(=O)[C@H](CCC(O)=O)NC(=O)[C@H](CCCNC(N)=N)NC(=O)[C@H](CC(N)=O)NC(=O)[C@H](CC(C)C)NC(=O)[C@H]([C@@H](C)O)NC(=O)[C@H](CCC(O)=O)NC(=O)[C@H]([C@@H](C)O)NC(=O)[C@H](CC(C)C)NC(=O)CNC(=O)[C@H](C)NC(=O)[C@H](CO)NC(=O)[C@H](CCC(N)=O)NC(=O)[C@@H](NC(=O)[C@H](C)NC(=O)[C@H](C)NC(=O)[C@@H](NC(=O)[C@H](CC(C)C)NC(=O)[C@@H](N)CCSC)C(C)C)[C@@H](C)CC)C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)O)C(=O)N[C@@H](C(C)C)C(=O)N[C@@H](CC=1C=CC=CC=1)C(=O)N[C@@H](C)C(=O)N1[C@@H](CCC1)C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)O)C(=O)N[C@@H](CC(N)=O)C(=O)N[C@@H](CCC(O)=O)C(=O)N[C@@H](C)C(=O)N[C@@H](CC=1C=CC=CC=1)C(=O)N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(=O)N[C@@H](C)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N1[C@@H](CCC1)C(=O)N1[C@@H](CCC1)C(=O)N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(=O)N[C@@H](CCC(O)=O)C(=O)N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(=O)N[C@@H](CO)C(=O)N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(O)=O)C1=CC=C(O)C=C1 ZRKFYGHZFMAOKI-QMGMOQQFSA-N 0.000 description 1
- 238000010257 thawing Methods 0.000 description 1
- 210000000115 thoracic cavity Anatomy 0.000 description 1
- 230000002992 thymic effect Effects 0.000 description 1
- 229940104230 thymidine Drugs 0.000 description 1
- 230000009258 tissue cross reactivity Effects 0.000 description 1
- 230000005026 transcription initiation Effects 0.000 description 1
- 230000005030 transcription termination Effects 0.000 description 1
- 238000010361 transduction Methods 0.000 description 1
- 230000026683 transduction Effects 0.000 description 1
- 230000009261 transgenic effect Effects 0.000 description 1
- 230000001052 transient effect Effects 0.000 description 1
- 230000010474 transient expression Effects 0.000 description 1
- 238000003146 transient transfection Methods 0.000 description 1
- 238000002054 transplantation Methods 0.000 description 1
- 241001515965 unidentified phage Species 0.000 description 1
- DRTQHJPVMGBUCF-UHFFFAOYSA-N uracil arabinoside Natural products OC1C(O)C(CO)OC1N1C(=O)NC(=O)C=C1 DRTQHJPVMGBUCF-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229940045145 uridine Drugs 0.000 description 1
- 201000005112 urinary bladder cancer Diseases 0.000 description 1
- 210000003462 vein Anatomy 0.000 description 1
- 230000035899 viability Effects 0.000 description 1
Images
Classifications
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K2239/00—Indexing codes associated with cellular immunotherapy of group A61K39/46
- A61K2239/31—Indexing codes associated with cellular immunotherapy of group A61K39/46 characterized by the route of administration
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K2239/00—Indexing codes associated with cellular immunotherapy of group A61K39/46
- A61K2239/38—Indexing codes associated with cellular immunotherapy of group A61K39/46 characterised by the dose, timing or administration schedule
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K2239/00—Indexing codes associated with cellular immunotherapy of group A61K39/46
- A61K2239/46—Indexing codes associated with cellular immunotherapy of group A61K39/46 characterised by the cancer treated
- A61K2239/59—Reproductive system, e.g. uterus, ovaries, cervix or testes
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
- A61K39/46—Cellular immunotherapy
- A61K39/461—Cellular immunotherapy characterised by the cell type used
- A61K39/4611—T-cells, e.g. tumor infiltrating lymphocytes [TIL], lymphokine-activated killer cells [LAK] or regulatory T cells [Treg]
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
- A61K39/46—Cellular immunotherapy
- A61K39/463—Cellular immunotherapy characterised by recombinant expression
- A61K39/4631—Chimeric Antigen Receptors [CAR]
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
- A61K39/46—Cellular immunotherapy
- A61K39/463—Cellular immunotherapy characterised by recombinant expression
- A61K39/4632—T-cell receptors [TCR]; antibody T-cell receptor constructs
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
- A61K39/46—Cellular immunotherapy
- A61K39/464—Cellular immunotherapy characterised by the antigen targeted or presented
- A61K39/4643—Vertebrate antigens
- A61K39/4644—Cancer antigens
- A61K39/464466—Adhesion molecules, e.g. NRCAM, EpCAM or cadherins
- A61K39/464468—Mesothelin [MSLN]
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
- A61K39/46—Cellular immunotherapy
- A61K39/464—Cellular immunotherapy characterised by the antigen targeted or presented
- A61K39/4643—Vertebrate antigens
- A61K39/4644—Cancer antigens
- A61K39/464469—Tumor associated carbohydrates
- A61K39/46447—Mucins, e.g. MUC-1
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
- A61K39/46—Cellular immunotherapy
- A61K39/464—Cellular immunotherapy characterised by the antigen targeted or presented
- A61K39/4643—Vertebrate antigens
- A61K39/4644—Cancer antigens
- A61K39/464499—Undefined tumor antigens, e.g. tumor lysate or antigens targeted by cells isolated from tumor
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P35/00—Antineoplastic agents
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
- C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
- C07K14/705—Receptors; Cell surface antigens; Cell surface determinants
- C07K14/70503—Immunoglobulin superfamily
- C07K14/7051—T-cell receptor (TcR)-CD3 complex
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
- C07K16/18—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans
- C07K16/28—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
- C07K16/18—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans
- C07K16/28—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants
- C07K16/30—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants from tumour cells
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
- C07K16/18—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans
- C07K16/28—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants
- C07K16/30—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants from tumour cells
- C07K16/3076—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants from tumour cells against structure-related tumour-associated moieties
- C07K16/3092—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants from tumour cells against structure-related tumour-associated moieties against tumour-associated mucins
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
- C12N15/09—Recombinant DNA-technology
- C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
- C12N15/79—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts
- C12N15/85—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts for animal cells
- C12N15/86—Viral vectors
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N5/00—Undifferentiated human, animal or plant cells, e.g. cell lines; Tissues; Cultivation or maintenance thereof; Culture media therefor
- C12N5/06—Animal cells or tissues; Human cells or tissues
- C12N5/0602—Vertebrate cells
- C12N5/0634—Cells from the blood or the immune system
- C12N5/0636—T lymphocytes
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
- A61K2039/505—Medicinal preparations containing antigens or antibodies comprising antibodies
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K2121/00—Preparations for use in therapy
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K2300/00—Mixtures or combinations of active ingredients, wherein at least one active ingredient is fully defined in groups A61K31/00 - A61K41/00
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
- C07K2317/20—Immunoglobulins specific features characterized by taxonomic origin
- C07K2317/22—Immunoglobulins specific features characterized by taxonomic origin from camelids, e.g. camel, llama or dromedary
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
- C07K2317/20—Immunoglobulins specific features characterized by taxonomic origin
- C07K2317/24—Immunoglobulins specific features characterized by taxonomic origin containing regions, domains or residues from different species, e.g. chimeric, humanized or veneered
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
- C07K2317/50—Immunoglobulins specific features characterized by immunoglobulin fragments
- C07K2317/56—Immunoglobulins specific features characterized by immunoglobulin fragments variable (Fv) region, i.e. VH and/or VL
- C07K2317/569—Single domain, e.g. dAb, sdAb, VHH, VNAR or nanobody®
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
- C07K2317/60—Immunoglobulins specific features characterized by non-natural combinations of immunoglobulin fragments
- C07K2317/62—Immunoglobulins specific features characterized by non-natural combinations of immunoglobulin fragments comprising only variable region components
- C07K2317/622—Single chain antibody (scFv)
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K2319/00—Fusion polypeptide
- C07K2319/01—Fusion polypeptide containing a localisation/targetting motif
- C07K2319/02—Fusion polypeptide containing a localisation/targetting motif containing a signal sequence
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K2319/00—Fusion polypeptide
- C07K2319/01—Fusion polypeptide containing a localisation/targetting motif
- C07K2319/03—Fusion polypeptide containing a localisation/targetting motif containing a transmembrane segment
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K2319/00—Fusion polypeptide
- C07K2319/30—Non-immunoglobulin-derived peptide or protein having an immunoglobulin constant or Fc region, or a fragment thereof, attached thereto
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K2319/00—Fusion polypeptide
- C07K2319/33—Fusion polypeptide fusions for targeting to specific cell types, e.g. tissue specific targeting, targeting of a bacterial subspecies
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N2510/00—Genetically modified cells
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N2830/00—Vector systems having a special element relevant for transcription
- C12N2830/50—Vector systems having a special element relevant for transcription regulating RNA stability, not being an intron, e.g. poly A signal
Landscapes
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Immunology (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Cell Biology (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- Veterinary Medicine (AREA)
- Public Health (AREA)
- Animal Behavior & Ethology (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Microbiology (AREA)
- Epidemiology (AREA)
- Pharmacology & Pharmacy (AREA)
- Mycology (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Biomedical Technology (AREA)
- Zoology (AREA)
- Biophysics (AREA)
- Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
- Oncology (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- Wood Science & Technology (AREA)
- General Engineering & Computer Science (AREA)
- Hematology (AREA)
- Toxicology (AREA)
- Gastroenterology & Hepatology (AREA)
- Virology (AREA)
- Physics & Mathematics (AREA)
- Plant Pathology (AREA)
- Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
- General Chemical & Material Sciences (AREA)
- Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
- Reproductive Health (AREA)
- Gynecology & Obstetrics (AREA)
- Pregnancy & Childbirth (AREA)
Abstract
本明細書で提供するのは、2つ以上の腫瘍細胞関連抗原に特異性を有するT細胞受容体(TCR)融合タンパク質(TFP)、1つまたは複数のTFPを発現するように操作されたT細胞、及びがんを含めた疾患の治療にそれらを使用する方法である。【選択図】図1
Description
相互参照
本出願は、2018年8月30日に出願された米国特許仮出願第62/725,098号の利益を主張するものであり、該仮出願は、参照により全体が本明細書に援用される。
本出願は、2018年8月30日に出願された米国特許仮出願第62/725,098号の利益を主張するものであり、該仮出願は、参照により全体が本明細書に援用される。
血液悪性腫瘍または末期の固形腫瘍を有するほとんどの患者は、標準的治療では治療不能である。加えて、従来の治療の選択肢には重篤な副作用があることが多い。がん細胞を退けるために患者の免疫系を関与させる数多くの試みがなされてきた。これらは総称してがん免疫療法と呼ばれる手法である、しかし、幾つかの障害によって、臨床効果を実現するのはかなり困難である。何百ものいわゆる腫瘍抗原が特定されているが、これらは自己由来であることが多く、そのためにがん免疫療法は健常組織に向けられる可能性があるか、または免疫原性が不十分である。さらに、がん細胞は、複数の機構を使用して自分自身を見えなくしたり、がん免疫療法による免疫攻撃の開始及び伝播に敵対したりする。
遺伝子操作されたT細胞をがん細胞上の適切な細胞表面分子に再指向させることに依拠する、キメラ抗原受容体(CAR)改変自己T細胞療法を使用する最近の開発は、がんを治療するために免疫系の力を利用することにおいて有望な結果を示している。例えば、B細胞成熟抗原(BCMA)特異的CAR T細胞を用いる進行中の治験からの臨床結果は、何人かの多発性骨髄腫患者における部分寛解を示している(そのような治験の1つはclinicaltrials.govから識別名NCT02215967で見出すことができる)。代替的な手法は、腫瘍関連ペプチド抗原に対して選択されたT細胞受容体(TCR)アルファ及びベータ鎖を自己T細胞の遺伝子操作に使用することである。これらのTCR鎖は、完全なTCR複合体を形成し、所定の第2の特異性のためのTCRを有するT細胞をもたらすこととなる。滑膜癌を有する患者では、NY−ESO−1特異的TCRアルファ及びベータ鎖を発現する操作された自己T細胞で有望な結果が得られた。
遺伝子改変T細胞が、CARまたは第2のTCRを発現してin vitro/ex vivoでそれぞれの標的細胞を認識し破壊することができること以外に、操作されたT細胞で患者療法を成功させるには、T細胞が強力な活性化、拡大、経時的な持続性を有することができ、再発性疾患の場合は「メモリー」応答が可能であることが必要とされる。CAR T細胞の扱いやすく高い臨床的有効性は、現在のところ、メソテリン陽性B細胞悪性腫瘍及びHLA−A2を発現するNY−ESO−1ペプチド発現滑膜肉腫患者に限られている。様々なヒト悪性腫瘍に対してより広く作用するように、遺伝子操作されたT細胞を向上させる必要があることは明らかである。本明細書に記載するのは、既存の手法の制限を克服する可能性を有する、CD3イプシロン、CD3ガンマ、及びCD3デルタを含めたTCRサブユニット、及びTCRアルファ及びTCRベータ鎖と、細胞表面抗原に対して特異的な結合ドメインとの新規融合タンパク質である。本明細書に記載するのは、CARより効率的に標的細胞を殺傷するが、同等またはそれ以下のレベルの炎症誘発性サイトカインを放出する新規融合タンパク質である。これらのサイトカインのレベルの上昇が養子CAR−T療法の用量制限毒性に関連することから、これらの融合タンパク質及びそれらを使用する方法は、CARに対するTFPの利点を示している。
本明細書で提供するのは、2つ以上の標的に特異性を有する結合タンパク質、ならびにそのような二重特異性結合タンパク質を含む抗体及びT細胞受容体(TCR)融合タンパク質(TFP)である。加えて、1つまたは複数のTFPを発現するように操作されたT細胞、及び疾患の治療にそれらを使用する方法を提供する。TFPは、単一の分子で二重特異性を有しても、または単一の操作されたTCRで二重特異性を有してもよく、あるいは、二重特異性は、TFPを含む2つの操作されたT細胞集団を混合することから生じることも、または2つの異なるウイルスでT細胞の単一の集団に形質導入することから生じることもある。
よって、一態様では、第1のT細胞受容体複合体(TCR)融合タンパク質(TFP)をコードする単離された組み換え核酸分子であって、該第1のTFPが、TCR細胞外ドメインの少なくとも一部分と、膜貫通ドメインと、TCRアルファ鎖、TCRベータ鎖、TCRガンマ鎖、TCRデルタ鎖、CD3ガンマ鎖、CD3デルタ鎖、及びCD3イプシロン鎖からなる群から選択されるTCRサブユニットのみに由来する細胞内シグナル伝達ドメインからの刺激ドメインを含む細胞内ドメインとを含むTCRサブユニット;及び抗MUC16結合ドメインを含む、マウス、ヒト、またはヒト化抗体ドメインを含み、TCRサブユニットと抗MUC16結合ドメインとが作動可能に連結され、T細胞に発現したときに、第1のTFPが、TCRと機能的に相互作用するか、またはTCRに組み込まれている、組み換え核酸分子;ならびに第2のTFPをコードする第2の組み換え核酸配列であって、該第2のTFPが、TCRサブユニット細胞外ドメインの少なくとも一部分と、膜貫通ドメインと、(iii)TCRアルファ鎖、TCRベータ鎖、TCRガンマ鎖、TCRデルタ鎖、CD3ガンマ鎖、CD3デルタ鎖、及びCD3イプシロン鎖からなる群から選択されるTCRサブユニットのみに由来する細胞内シグナル伝達ドメインからの刺激ドメインを含むTCR細胞内ドメインとを含むTCRサブユニット;及び(b)抗メソテリン(MSLN)結合ドメインを含むマウス、ヒト、またはヒト化抗体ドメインを含み、TCRサブユニットと抗MSLN結合ドメインとが作動可能に連結され、T細胞に発現したときに、第2のTFPが、TCRと機能的に相互作用するか、またはTCRに組み込まれている、第2の組み換え核酸配列を含む、組成物を提供する。
別の態様では、第1のT細胞受容体(TCR)融合タンパク質(TFP)をコードする第1の組み換え核酸配列であって、該第1のTFPが、TCR細胞外ドメインの少なくとも一部分と、膜貫通ドメインと、TCRアルファ鎖、TCRベータ鎖、TCRガンマ鎖、TCRデルタ鎖、CD3ガンマ鎖、CD3デルタ鎖、及びCD3イプシロン鎖からなる群から選択されるTCRサブユニットのみに由来する細胞内シグナル伝達ドメインからの刺激ドメインを含む、TCR細胞内ドメインとを含むTCRサブユニット;及び抗MUC16結合ドメインを含む第1のヒトまたはヒト化抗体ドメインと、抗MSLN結合ドメインを含む第2のヒトまたはヒト化抗体ドメインとを含み、TCRサブユニットと、第1の抗体ドメインと、第2の抗体ドメインとが作動可能に連結され、該第1のTFPが、T細胞に発現したときに、TCRと機能的に相互作用するか、またはTCRに組み込まれている、第1の組み換え核酸配列を含む、組成物を提供する。
別の態様では、TCRサブユニット、抗MUC16結合ドメインである第1の抗原結合ドメインを含む第1のヒトまたはヒト化抗体ドメインを含む、第1のT細胞受容体(TCR)融合タンパク質(TFP);及びTCRサブユニット、抗MSLN結合ドメインである第2の抗原結合ドメインを含む第2のヒトまたはヒト化抗体ドメインを含む、第2のT細胞受容体(TCR)融合タンパク質(TFP)をコードする単離された組み換え核酸分子を含み、第1のTFPのTCRサブユニットと第1の抗体ドメインとが作動可能に連結され、該第2のTFPのTCRサブユニットと該第2の抗体ドメインとが作動可能に連結される、組成物を提供する。
別の態様では、TCR複合体サブユニットと、抗MUC16結合ドメインである第1の抗原結合ドメインを含む第1のヒトまたはヒト化抗体ドメインと、抗MSLN結合ドメインである第2の抗原結合ドメインを含む第2のヒトまたはヒト化抗体ドメインとを含む、第1のT細胞受容体(TCR)融合タンパク質(TFP)をコードする単離された組み換え核酸分子を含み、第1のTFPのTCRサブユニットと、第1の抗体ドメインと、第2の抗体ドメインとが作動可能に連結される、組成物を提供する。
一実施形態では、コードされる第1のTFPのTCRサブユニットの細胞外、膜貫通、及び細胞内シグナル伝達ドメインは、TCRアルファ鎖、TCRベータ鎖、TCRガンマ鎖、TCRデルタ鎖、CD3ガンマ鎖、CD3デルタ鎖、及びCD3イプシロン鎖からなる群から選択されるTCRサブユニットのみに由来する。別の実施形態では、第2のTFPのTCRサブユニットの細胞外、膜貫通、及び細胞内シグナル伝達ドメインは、TCRアルファ鎖、TCRベータ鎖、TCRガンマ鎖、TCRデルタ鎖、及びTCRイプシロン鎖からなる群から選択されるTCRサブユニットのみに由来する。別の実施形態では、第1のTFPのTCRサブユニットの細胞外、膜貫通、及び細胞内シグナル伝達ドメインは、TCRアルファ鎖のみに由来する。別の実施形態では、第1のTFPのTCRサブユニットの細胞外、膜貫通、及び細胞内シグナル伝達ドメインは、TCRベータ鎖のみに由来する。別の実施形態では、第1のTFPのTCRサブユニットの細胞外、膜貫通、及び細胞内シグナル伝達ドメインは、TCRガンマ鎖のみに由来する。別の実施形態では、第1のTFPのTCRサブユニットの細胞外、膜貫通、及び細胞内シグナル伝達ドメインは、TCRデルタ鎖のみに由来する。別の実施形態では、第1のTFPのTCRサブユニットの細胞外、膜貫通、及び細胞内シグナル伝達ドメインは、CD3ガンマ鎖のみに由来する。別の実施形態では、第1のTFPのTCRサブユニットの細胞外、膜貫通、及び細胞内シグナル伝達ドメインは、CD3デルタ鎖のみに由来する。別の実施形態では、第1のTFPのTCRサブユニットの細胞外、膜貫通、及び細胞内シグナル伝達ドメインは、CD3イプシロン鎖のみに由来する。
別の実施形態では、第2のTFPのTCRサブユニットの細胞外、膜貫通、及び細胞内シグナル伝達ドメインは、TCRアルファ鎖のみに由来する。別の実施形態では、第2のTFPのTCRサブユニットの細胞外、膜貫通、及び細胞内シグナル伝達ドメインは、TCRベータ鎖のみに由来する。別の実施形態では、第2のTFPのTCRサブユニットの細胞外、膜貫通、及び細胞内シグナル伝達ドメインは、TCRガンマ鎖のみに由来する。別の実施形態では、第2のTFPのTCRサブユニットの細胞外、膜貫通、及び細胞内シグナル伝達ドメインは、TCRデルタ鎖のみに由来する。別の実施形態では、第2のTFPのTCRサブユニットの細胞外、膜貫通、及び細胞内シグナル伝達ドメインは、CD3ガンマ鎖のみに由来する。別の実施形態では、第2のTFPのTCRサブユニットの細胞外、膜貫通、及び細胞内シグナル伝達ドメインは、CD3デルタ鎖のみに由来する。別の実施形態では、第2のTFPのTCRサブユニットの細胞外、膜貫通、及び細胞内シグナル伝達ドメインは、CD3イプシロン鎖のみに由来する。
一実施形態では、第1のTFP、第2のTFP、または両方は、T細胞に発現したときに、TCRに組み込まれているか、またはTCRと機能的に相互作用する。別の実施形態では、第1のTFP、第2のTFP、または両方は、T細胞に発現したときに、TCRに組み込まれているか、またはTCRと機能的に相互作用する。別の実施形態では、コードされる第1の抗原結合ドメインは、第1のリンカー配列によって第1のTFPのTCR細胞外ドメインに接続され、コードされる第2の抗原結合ドメインは、第2のリンカー配列によって第2のTFPのTCR細胞外ドメインに接続され、または第1の抗原結合ドメインは、第1のリンカー配列によって第1のTFPのTCR細胞外ドメインに接続され、かつコードされる第2の抗原結合ドメインは、第2のリンカー配列によって第2のTFPのTCR細胞外ドメインに接続される。別の実施形態では、第1のリンカー配列及び第2のリンカー配列は、(G4S)n(式中、n=1〜4である)を含む。別の実施形態では、第1のTFPのTCRサブユニット、第2のTFPのTCRサブユニット、または両方は、TCR細胞外ドメインを含む。別の実施形態では、第1のTFPのTCRサブユニット、第2のTFPのTCRサブユニット、または両方は、TCR膜貫通ドメインを含む。別の実施形態では、第1のTFPのTCRサブユニット、第2のTFPのTCRサブユニット、または両方は、TCR細胞内ドメインを含む。別の実施形態では、第1のTFPのTCRサブユニット、第2のTFPのTCRサブユニット、または両方は、(i)TCR細胞外ドメイン、(ii)TCR膜貫通ドメイン、及び(iii)TCR細胞内ドメインを含み、(i)、(ii)、及び(iii)のうちの少なくとも2つは、同じTCRサブユニットに由来する。別の実施形態では、第1のTFPのTCRサブユニット、第2のTFPのTCRサブユニット、または両方は、CD3イプシロン、CD3ガンマ、もしくはCD3デルタの細胞内シグナル伝達ドメイン、またはそれらに対する少なくとも1つの改変を有するアミノ酸配列から選択される刺激ドメインを含むTCR細胞内ドメインを含む。別の実施形態では、第1のTFPのTCRサブユニット、第2のTFPのTCRサブユニット、または両方は、4−1BBの機能的シグナル伝達ドメイン及び/またはCD3ゼータの機能的シグナル伝達ドメイン、またはそれらに対する少なくとも1つの改変を有するアミノ酸配列から選択される刺激ドメインを含む細胞内ドメインを含む。
一実施形態では、第1のヒトまたはヒト化抗体ドメイン、第2のヒトまたはヒト化抗体ドメイン、または両方は、抗体断片を含む。別の実施形態では、第1のヒトまたはヒト化抗体ドメイン、第2のヒトまたはヒト化抗体ドメイン、または両方は、scFvまたはVHドメインを含む。別の実施形態では、組成物は、(i)表2の軽鎖配列に対して70〜100%の配列同一性を有する軽鎖結合ドメインアミノ酸配列の軽鎖(LC)CDR1、LC CDR2、及びLC CDR3、及び/または(ii)表2の重鎖配列の重鎖(HC)CDR1、HC CDR2、及びHC CDR3をコードする組み換え核酸分子を含む。一実施形態では、組み換え核酸は軽鎖可変領域をコードし、ここで、軽鎖可変領域は、表2の軽鎖可変領域アミノ酸配列の少なくとも1つであるが30以下の改変を有するアミノ酸配列、または表2の軽鎖可変領域アミノ酸配列に対して95〜99%の同一性を有する配列を含む。別の実施形態では、組成物は、重鎖可変領域をコードする組み換え核酸分子を含み、ここで、重鎖可変領域は、表2の重鎖可変領域アミノ酸配列の少なくとも1つであるが30以下の改変を有するアミノ酸配列、または表2の重鎖可変領域アミノ酸配列に対して95〜99%の同一性を有する配列を含む。一実施形態では、コードされる第1のTFP、コードされる第2のTFP、または両方は、TCRアルファ鎖、TCRベータ鎖、CD3イプシロンTCRサブユニット、CD3ガンマTCRサブユニット、CD3デルタTCRサブユニット、それらの機能的断片、及び少なくとも1つであるが20以下の改変を有するそれらのアミノ酸配列からなる群から選択されるタンパク質の細胞外ドメインまたはその一部分を含む、TCRサブユニットの細胞外ドメインを含む。別の実施形態では、コードされる第1のTFP及びコードされる第2のTFPは、TCRアルファ鎖、TCRベータ鎖、CD3イプシロンTCRサブユニット、CD3ガンマTCRサブユニット、CD3デルタTCRサブユニット、それらの機能的断片、及び少なくとも1つであるが20以下の改変を有するそれらのアミノ酸配列からなる群から選択されるタンパク質の膜貫通ドメインを含む、膜貫通ドメインを含む。
一実施形態では、コードされる第1のTFP及びコードされる第2のTFPは、TCRアルファ鎖、TCRベータ鎖、TCRゼータ鎖、CD3イプシロンTCRサブユニット、CD3ガンマTCRサブユニット、CD3デルタTCRサブユニット、CD45、CD4、CD5、CD8、CD9、CD16、CD22、CD33、CD28、CD37、CD64、CD80、CD86、CD134、CD137、CD154、それらの機能的断片、及び少なくとも1つであるが20以下の改変を有するそれらのアミノ酸配列からなる群から選択されるタンパク質の膜貫通ドメインを含む、膜貫通ドメインを含む。別の実施形態では、組み換え核酸は、共刺激ドメインをコードする配列を含む。別の実施形態では、共刺激ドメインは、OX40、CD2、CD27、CD28、CDS、ICAM−1、LFA−1(CD11a/CD18)、ICOS(CD278)、及び4−1BB(CD137)、ならびにそれらに対する少なくとも1つであるが20以下の改変を有するそれらのアミノ酸配列からなる群から選択されるタンパク質から得られる機能的シグナル伝達ドメインである。別の実施形態では、組み換え核酸は、細胞内シグナル伝達ドメインをコードする配列を含む。別の実施形態では、組み換え核酸は、リーダー配列をコードする配列を含む。別の実施形態では、組み換え核酸は、プロテアーゼ切断部位をコードする配列を含む。一実施形態では、アミノ酸配列に対する少なくとも1つであるが20以下の改変は、細胞のシグナル伝達を媒介するアミノ酸の改変、または第1のTFP、第2のTFP、もしくは両方へのリガンド結合に応答してリン酸化されるアミノ酸の改変を含む。
一実施形態では、単離された組み換え核酸分子はmRNAである。
一実施形態では、第1のTFP、第2のTFP、または両方は、CD3ゼータTCRサブユニット、CD3イプシロンTCRサブユニット、CD3ガンマTCRサブユニット、CD3デルタTCRサブユニット、TCRゼータ鎖、Fcイプシロン受容体1鎖、Fcイプシロン受容体2鎖、Fcガンマ受容体1鎖、Fcガンマ受容体2a鎖、Fcガンマ受容体2b1鎖、Fcガンマ受容体2b2鎖、Fcガンマ受容体3a鎖、Fcガンマ受容体3b鎖、Fcベータ受容体1鎖、TYROBP(DAP12)、CD5、CD16a、CD16b、CD22、CD23、CD32、CD64、CD79a、CD79b、CD89、CD278、CD66d、それらの機能的断片、及びそれらに対する少なくとも1つであるが20以下の改変を有するそれらのアミノ酸配列からなる群から選択されるタンパク質の免疫受容活性化チロシンモチーフ(ITAM)またはその一部分を含む、TCRサブユニットのITAMを含む。
別の実施形態では、該ITAMは、CD3ガンマ、CD3デルタ、またはCD3イプシロンのITAMと置きかわる。別の実施形態では、該ITAMは、CD3ゼータTCRサブユニット、CD3イプシロンTCRサブユニット、CD3ガンマTCRサブユニット、及びCD3デルタTCRサブユニットからなる群から選択され、CD3ゼータTCRサブユニット、CD3イプシロンTCRサブユニット、CD3ガンマTCRサブユニット、及びCD3デルタTCRサブユニットからなる群から選択される異なるITAMと置きかわる。一実施形態では、コードされる組み換え核酸は、リーダー配列をさらに含む。
別の態様では、本明細書に記載する核酸分子のいずれかによってコードされるポリペプチド分子を含む組成物を提供する。一実施形態では、該ポリペプチドは、第1の核酸分子によってコードされる第1のポリペプチドと、第2の核酸分子によってコードされる第2のポリペプチドとを含む。
別の態様では、本明細書に記載する核酸分子のいずれかによってコードされる組み換えTFP分子を含む組成物を提供する。
別の態様では、本明細書に記載するポリペプチドまたは組み換えTFP分子をコードするベクターを含む組成物を提供する。一実施形態では、該ベクターは、a)第1のTFPをコードする第1の核酸分子を含む第1のベクターと、b)第2のTFPをコードする第2の核酸分子を含む第2のベクターとを含む。別の実施形態では、該ベクターは、第1のTFPと第2のTFPとを含み、ここで、第1のTFPをコードする配列及び第2のTFPをコードする配列は切断部位によって分離され、該ベクターは、DNA、RNA、プラスミド、レンチウイルスベクター、アデノウイルスベクター、ラウス肉腫ウイルス(RSV)ベクター、またはレトロウイルスベクターからなる群から選択される。一実施形態では、該ベクターは、プロモーターを含む。一実施形態では、該ベクターは、in vitro転写ベクターである。一実施形態では、該ベクター内の核酸分子は、ポリ(A)テールをさらにコードする。別の実施形態では、該ベクター内の核酸分子は、3’UTRをさらにコードする。別の実施形態では、該ベクター内の核酸分子は、プロテアーゼ切断部位をさらにコードする。
一実施形態では、該組成物は、細胞内シグナル伝達ドメインからの正のシグナルを含む第2のポリペプチドと会合した、抑制分子の少なくとも一部分を含む第1のポリペプチドを含む抑制分子をコードする核酸をさらに含む。別の実施形態では、該抑制分子は、PD1の少なくとも一部分を含む第1のポリペプチドと、共刺激ドメイン及び一次シグナル伝達ドメインを含む第2のポリペプチドとを含む。
別の態様では、本明細書に開示する組み換え核酸配列を含むベクターを提供する。一実施形態では、該ベクターは、第1の組み換え核酸配列を含む。別の実施形態では、該ベクターは、第2の組み換え核酸配列を含む。
別の態様では、本明細書に開示する単離された組み換え核酸分子、ベクター、またはポリペプチドのいずれかを含む組成物を含む細胞を提供する。一実施形態では、該細胞は、ヒトT細胞である。別の実施形態では、該T細胞は、CD8+またはCD4+T細胞である。一実施形態では、該細胞は、細胞内シグナル伝達ドメインからの正のシグナルを含む第2のポリペプチドと会合した、抑制分子の少なくとも一部分を含む第1のポリペプチドを含む抑制分子をコードする核酸を含む。一実施形態では、該抑制分子は、PD1の少なくとも一部分を含む第1のポリペプチドと、共刺激ドメイン及び一次シグナル伝達ドメインを含む第2のポリペプチドとを含む。
別の態様では、少なくとも2つのTFP分子を含むヒトCD8+またはCD4+T細胞であって、該TFP分子が、抗MUC16結合ドメイン、抗MSLN結合ドメイン、TCR細胞外ドメイン、膜貫通ドメイン、及び細胞内ドメインを含み、該TFP分子が、該ヒトCD8+またはCD4+T細胞内で、該細胞で、及び/または該細胞の表面上で、内因性TCR複合体及び/または少なくとも1つの内因性TCRポリペプチドと機能的に相互作用することができる、ヒトCD8+またはCD4+T細胞を提供する。別の実施形態では、抗MUC16結合ドメイン、TCR細胞外ドメイン、膜貫通ドメイン、及び細胞内ドメインを含む第1のTFP分子と;抗MSLN結合ドメイン、TCR細胞外ドメイン、膜貫通ドメイン、及び細胞内ドメインを含む第2のTFP分子と;少なくとも1つの内因性TCRサブユニットまたは内因性TCR複合体とを含む、タンパク質複合体を提供する。
別の態様では、抗MUC16結合ドメイン、TCR細胞外ドメイン、膜貫通ドメイン、及び細胞内ドメインを含むTFP分子と;少なくとも1つの内因性TCRサブユニットまたは内因性TCR複合体とを含む、タンパク質複合体を提供する。
別の態様では、抗MSLN結合ドメイン、TCR細胞外ドメイン、膜貫通ドメイン、及び細胞内ドメインを含むTFP分子と;少なくとも1つの内因性TCRサブユニットまたは内因性TCR複合体とを含む、タンパク質複合体を提供する。
一実施形態では、タンパク質複合体中のTCRは、TCRアルファ鎖、TCRベータ鎖、CD3イプシロンTCRサブユニット、CD3ガンマTCRサブユニット、及びCD3デルタTCRサブユニットからなる群から選択されるタンパク質の細胞外ドメインまたはその一部分を含む。一実施形態では、抗MUC16結合ドメイン、抗MSLN結合ドメイン、または両方は、リンカー配列によってTCR細胞外ドメインに接続される。一実施形態では、リンカー領域は、(G4S)n(式中、n=1〜4)を含む。
別の態様では、本明細書に記載するタンパク質複合体のいずれかに少なくとも2つの異なるTFPタンパク質を含む、ヒトCD8+またはCD4+T細胞を提供する。別の態様では、本明細書に開示する単離された核酸分子のいずれかによってコードされる少なくとも2つの異なるTFP分子を含む、ヒトCD8+またはCD4+T細胞を提供する。
別の態様では、ヒトCD8+またはCD4+T細胞の集団であって、該集団のT細胞が、少なくとも2つのTFP分子を個々にまたは集合的に含み、該TFP分子が、抗MUC16結合ドメインまたは抗MSLN結合ドメインまたは抗MUC16結合ドメインと抗MSLN結合ドメインの両方、TCR細胞外ドメイン、膜貫通ドメイン、及び細胞内ドメインを含み、該TFP分子が、該ヒトCD8+またはCD4+T細胞内で、該細胞で、及び/または該細胞の表面上で、内因性TCR複合体及び/または少なくとも1つの内因性TCRポリペプチドと機能的に相互作用することができる、ヒトCD8+またはCD4+T細胞の集団を提供する。
別の態様では、ヒトCD8+またはCD4+T細胞の集団であって、該集団のT細胞が、本明細書に開示する単離された組み換え核酸分子のいずれかによってコードされる少なくとも2つのTFP分子を個々にまたは集合的に含む、ヒトCD8+またはCD4+T細胞の集団を提供する。別の態様では、本明細書に開示する有効量の組成物、ベクター、細胞、またはタンパク質複合体と、医薬として許容される賦形剤とを含む、医薬組成物を提供する。
別の態様では、MSLNまたはMUC16の発現に関連する疾患を有する哺乳動物を治療する方法であって、該哺乳動物に有効量の本明細書に開示する組成物のいずれかを投与することを含む方法を提供する。一実施形態では、MUC16またはMSLNの発現に関連する疾患は、増殖性疾患、がん、悪性腫瘍、骨髄形成異常、骨髄異形成症候群、前白血病、MUC16の発現に関連する非がん関連適応症、MSLNの発現に関連する非がん関連適応症、乳癌、前立腺癌、卵巣癌、子宮頚癌、皮膚癌、膵癌、結腸直腸癌、腎癌、肝臓癌、脳癌、リンパ腫、白血病、肺癌、食道癌、胃癌、及び再発性または難治性疾患を有する切除不能な卵巣癌からなる群から選択される。別の実施形態では、該疾患は、B細胞急性リンパ性白血病(B−ALL)、T細胞急性リンパ性白血病(T−ALL)、急性リンパ芽球性白血病(ALL);慢性骨髄性白血病(CML)、慢性リンパ球性白血病(CLL)、B細胞前リンパ性白血病、芽球性形質細胞様樹状細胞腫瘍、バーキットリンパ腫、びまん性大細胞型B細胞リンパ腫、濾胞性リンパ腫、ヘアリーセル白血病、小細胞濾胞性リンパ腫、大細胞濾胞性リンパ腫、悪性リンパ球増殖状態、MALTリンパ腫、マントル細胞リンパ腫、辺縁帯リンパ腫、多発性骨髄腫、骨髄形成異常、骨髄異形成症候群、非ホジキンリンパ腫、形質芽球性リンパ腫、形質細胞様樹状細胞腫瘍、ワルデンシュトレームマクログロブリン血症、前白血病、MUC16またはMSLNの発現に関連する疾患、及びそれらの組み合わせからなる群から選択される血液のがんである。別の実施形態では、第1のTFP分子及び第2のTFP分子を発現する細胞または細胞集団は、第1のTFP分子及び第2のTFP分子を発現する細胞または細胞集団の効力を増大させる作用物質と組み合わせて投与される。一実施形態では、哺乳動物において、抗MSLNキメラ抗原受容体(CAR)、抗MUC16 CAR、抗MSLN CAR及び抗MUC16 CAR;またはそれらの組み合わせを発現する有効量のT細胞を投与された哺乳動物と比較して少ないサイトカインが放出される。一実施形態では、第1のTFP分子及び第2のTFP分子を発現する細胞は、第1のTFP分子及び第2のTFP分子を発現する細胞の投与に関連する1つまたは複数の副作用を改善する作用物質と組み合わせて投与される。別の実施形態では、第1のTFP分子及び第2のTFP分子は、MSLNまたはMUC16に関連する疾患を治療する作用物質と組み合わせて投与される。
参照による援用
本明細書で言及されるすべての出版物、特許、及び特許出願は、1つ1つの出版物、特許、または特許出願が参照により援用されると明確にかつ個別に示される場合と同様に、参照により本明細書に援用される。
本明細書で言及されるすべての出版物、特許、及び特許出願は、1つ1つの出版物、特許、または特許出願が参照により援用されると明確にかつ個別に示される場合と同様に、参照により本明細書に援用される。
本明細書で提供するのは、二重特異性T細胞受容体(TCR)融合タンパク質または二重特異性T細胞集団を使用する、がんなどの疾患を治療するための組成物及び使用方法である。本明細書で使用される場合、「T細胞受容体(TCR)融合タンパク質」または「TFP」は、TCRを含む様々なポリペプチドに由来する組み換えポリペプチドを含み、該TCRは、一般に、i)標的細胞上の表面抗原に結合することができ、かつii)典型的にはT細胞内またはT細胞の表面上の同じ場所に位置するときに、インタクトなTCR複合体の他のポリペプチド成分と相互作用することができる。本明細書で提供する場合、TFPは、キメラ抗原受容体と比較して、相当な利益をもたらす。「キメラ抗原受容体」または代替的に「CAR」という用語は、scFvの形態の細胞外抗原結合ドメイン、膜貫通ドメイン、及び以下に定義する通りの刺激分子に由来する機能的シグナル伝達ドメインを含む細胞質内シグナル伝達ドメイン(本明細書では「細胞内シグナル伝達ドメイン」とも呼ぶ)を含む、組み換えポリペプチドを指す。一般に、CARの中央の細胞内シグナル伝達ドメインは、通常TCR複合体と会合して見出されるCD3ゼータ鎖に由来する。CD3ゼータシグナル伝達ドメインは、4−1BB(すなわち、CD137)、CD27及び/またはCD28などの少なくとも1つの共刺激分子に由来する1つまたは複数の機能的シグナル伝達ドメインと融合することができる。
一態様では、本明細書で提供するのは、(I)第1のT細胞受容体(TCR)融合タンパク質(TFP)をコードする第1の組み換え核酸配列であって、該第1のTFPが、(a)(i)TCR細胞外ドメインの少なくとも一部分と、(ii)膜貫通ドメインと、(iii)TCRアルファ鎖、TCRベータ鎖、CD3ガンマ鎖、CD3デルタ鎖、及びCD3イプシロン鎖からなる群から選択されるTCRサブユニットのみに由来する細胞内シグナル伝達ドメインからの刺激ドメインを含むTCR細胞内ドメインとを含む、TCRサブユニット;及び(b)抗MUC16結合ドメインを含む、ヒトまたはヒト化抗体ドメインを含み、TCRサブユニットと、抗MUC16結合ドメインとが作動可能に連結され、T細胞に発現したときに、第1のTFPが、TCRと機能的に相互作用するか、またはTCRに組み込まれている、第1の組み換え核酸配列;ならびに(II)第2のTFPをコードする第2の組み換え核酸配列であって、該第2のTFPが、(a)(i)TCR細胞外ドメインの少なくとも一部分と、(ii)膜貫通ドメインと、(iii)TCRアルファ鎖、TCRベータ鎖、CD3ガンマ鎖、CD3デルタ鎖、及びCD3イプシロン鎖からなる群から選択されるTCRサブユニットのみに由来する細胞内シグナル伝達ドメインからの刺激ドメインを含むTCR細胞内ドメインとを含む、TCRサブユニット;及び(b)抗メソテリン(MSLN)結合ドメインを含む、ヒトまたはヒト化抗体ドメインを含み、TCRサブユニットと抗MSLN結合ドメインとが作動可能に連結され、T細胞に発現したときに、第2のTFPが、TCRと機能的に相互作用するか、またはTCRに組み込まれている、第2の組み換え核酸配列を含む、組成物である。
一態様では、本明細書で提供するのは、(I)第1のT細胞受容体(TCR)融合タンパク質(TFP)をコードする第1の組み換え核酸配列であって、該第1のTFPが、TCR細胞外ドメインの少なくとも一部分と、膜貫通ドメインと、TCRアルファ鎖、TCRベータ鎖、CD3ガンマ鎖、CD3デルタ鎖、及びCD3イプシロン鎖からなる群から選択されるTCRサブユニットのみに由来する細胞内シグナル伝達ドメインからの刺激ドメインを含むTCR細胞内ドメインとを含む、TCRサブユニット;及び抗MUC16結合ドメインを含む第1のヒトまたはヒト化抗体ドメインと、抗MSLN結合ドメインとを含む第2のヒトまたはヒト化抗体ドメインを含み;TCRサブユニットと、第1の抗体ドメインと、第2の抗体ドメインとが作動可能に連結され、T細胞に発現したときに、第1のTFPが、TCRと機能的に相互作用するか、またはTCRに組み込まれている、第1の組み換え核酸配列を含む、組成物である。
一態様では、本明細書で提供するのは、TCRサブユニット、抗MUC16結合ドメインである第1の抗原結合ドメインを含む第1のヒトまたはヒト化抗体ドメインを含む、第1のT細胞受容体(TCR)融合タンパク質(TFP);及びTCRサブユニット、抗MSLN結合ドメインである第2の抗原結合ドメインを含む第2のヒトまたはヒト化抗体ドメインを含む、第2のT細胞受容体(TCR)融合タンパク質(TFP)をコードする組み換え核酸分子を含み、第1のTFPのTCRサブユニットと第1の抗体ドメインとが作動可能に連結され、第2のTFPのTCRサブユニットと第2の抗体ドメインとが作動可能に連結される、組成物である。
一態様では、本明細書で提供するのは、TCRサブユニットと、抗MUC16結合ドメインである第1の抗原結合ドメインを含む第1のヒトまたはヒト化抗体ドメインと、抗MSLN結合ドメインである第2の抗原結合ドメインを含む第2のヒトまたはヒト化抗体ドメインとを含む第1のT細胞受容体(TCR)融合タンパク質(TFP)をコードする組み換え核酸分子を含み、第1のTFPのTCRサブユニットと、第1の抗体ドメインと、第2の抗体ドメインとが作動可能に連結される、組成物である。
幾つかの実施形態では、第1のTFPのTCRサブユニットの細胞外、膜貫通、及び細胞内シグナル伝達ドメインは、TCRアルファ鎖、TCRベータ鎖、CD3ガンマ鎖、CD3デルタ鎖、及びCD3イプシロン鎖からなる群から選択されるTCRサブユニットのみに由来する。
幾つかの実施形態では、第2のTFPのTCRサブユニットの細胞外、膜貫通、及び細胞内シグナル伝達ドメインは、TCRアルファ鎖、TCRベータ鎖、TCRガンマ鎖、TCRデルタ鎖、及びTCRイプシロン鎖からなる群から選択されるTCRサブユニットのみに由来する。
幾つかの実施形態では、第1のTFPのTCRサブユニットの細胞外、膜貫通、及び細胞内シグナル伝達ドメインは、TCRアルファ鎖のみに由来する。
幾つかの実施形態では、第1のTFPのTCRサブユニットの細胞外、膜貫通、及び細胞内シグナル伝達ドメインは、TCRベータ鎖のみに由来する。
幾つかの実施形態では、第1のTFPのTCRサブユニットの細胞外、膜貫通、及び細胞内シグナル伝達ドメインは、TCRガンマ鎖のみに由来する。
幾つかの実施形態では、第1のTFPのTCRサブユニットの細胞外、膜貫通、及び細胞内シグナル伝達ドメインは、TCRデルタ鎖のみに由来する。
幾つかの実施形態では、第1のTFPのTCRサブユニットの細胞外、膜貫通、及び細胞内シグナル伝達ドメインは、CD3ガンマ鎖のみに由来する。
幾つかの実施形態では、第1のTFPのTCRサブユニットの細胞外、膜貫通、及び細胞内シグナル伝達ドメインは、CD3デルタ鎖のみに由来する。
幾つかの実施形態では、第1のTFPのTCRサブユニットの細胞外、膜貫通、及び細胞内シグナル伝達ドメインは、CD3イプシロン鎖のみに由来する。
幾つかの実施形態では、第2のTFPのTCRサブユニットの細胞外、膜貫通、及び細胞内シグナル伝達ドメインは、TCRアルファ鎖のみに由来する。
幾つかの実施形態では、第2のTFPのTCRサブユニットの細胞外、膜貫通、及び細胞内シグナル伝達ドメインは、TCRベータ鎖のみに由来する。
幾つかの実施形態では、第2のTFPのTCRサブユニットの細胞外、膜貫通、及び細胞内シグナル伝達ドメインは、TCRガンマ鎖のみに由来する。
幾つかの実施形態では、第2のTFPのTCRサブユニットの細胞外、膜貫通、及び細胞内シグナル伝達ドメインは、TCRデルタ鎖のみに由来する。
幾つかの実施形態では、第2のTFPのTCRサブユニットの細胞外、膜貫通、及び細胞内シグナル伝達ドメインは、CD3ガンマ鎖のみに由来する。
幾つかの実施形態では、第2のTFPのTCRサブユニットの細胞外、膜貫通、及び細胞内シグナル伝達ドメインは、CD3デルタ鎖のみに由来する。
幾つかの実施形態では、第2のTFPのTCRサブユニットの細胞外、膜貫通、及び細胞内シグナル伝達ドメインは、CD3イプシロン鎖のみに由来する。
幾つかの実施形態では、第1のTFP、第2のTFP、または両方は、T細胞に発現したときに、TCRに組み込まれているか、またはTCRと機能的に相互作用する。
幾つかの実施形態では、第1のTFP、第2のTFP、または両方は、T細胞に発現したときに、TCRに組み込まれているか、またはTCRと機能的に相互作用する。
幾つかの実施形態では、コードされる第1の抗原結合ドメインは、第1のリンカー配列によって第1のTFPのTCR細胞外ドメインに接続され、コードされる第2の抗原結合ドメインは第2のリンカー配列によって第2のTFPのTCR細胞外ドメインに接続され、または第1の抗原結合ドメインは、第1のリンカー配列によって第1のTFPのTCR細胞外ドメインに接続され、かつコードされる第2の抗原結合ドメインは、第2のリンカー配列によって第2のTFPのTCR細胞外ドメインに接続される。
幾つかの実施形態では、第1のリンカー配列及び第2のリンカー配列は、(G4S)n(式中、n=1〜4である)を含む。
幾つかの実施形態では、第1のTFPのTCRサブユニット、第2のTFPのTCRサブユニット、または両方は、TCR細胞外ドメインを含む。
幾つかの実施形態では、第1のTFPのTCRサブユニット、第2のTFPのTCRサブユニット、または両方は、TCR膜貫通ドメインを含む。
幾つかの実施形態では、第1のTFPのTCRサブユニット、第2のTFPのTCRサブユニット、または両方は、TCR細胞内ドメインを含む。
幾つかの実施形態では、第1のTFPのTCRサブユニット、第2のTFPのTCRサブユニット、または両方は、(i)TCR細胞外ドメイン、(ii)TCR膜貫通ドメイン、及び(iii)TCR細胞内ドメインを含み、(i)、(ii)、及び(iii)のうちの少なくとも2つは、同じTCRサブユニットに由来する。
幾つかの実施形態では、第1のTFPのTCRサブユニット、第2のTFPのTCRサブユニット、または両方は、CD3イプシロン、CD3ガンマ、もしくはCD3デルタの細胞内シグナル伝達ドメイン、またはそれらに対する少なくとも1つの改変を有するアミノ酸配列から選択される刺激ドメインを含むTCR細胞内ドメインを含む。
幾つかの実施形態では,第1のTFPのTCRサブユニット、第2のTFPのTCRサブユニット、または両方は、4−1BBの機能的シグナル伝達ドメイン及び/またはCD3ゼータの機能的シグナル伝達ドメイン、またはそれらに対する少なくとも1つの改変を有するアミノ酸配列から選択される刺激ドメインを含む細胞内ドメインを含む。
幾つかの実施形態では、第1のヒトまたはヒト化抗体ドメイン、第2のヒトまたはヒト化抗体ドメイン、または両方は、抗体断片を含む。
幾つかの実施形態では、第1のヒトまたはヒト化抗体ドメイン、第2のヒトまたはヒト化抗体ドメイン、または両方は、scFvまたはVHドメインを含む。
幾つかの実施形態では、組成物は、(i)表2の軽鎖配列に対して70〜100%の配列同一性を有する軽鎖結合ドメインアミノ酸配列の軽鎖(LC)CDR1、LC CDR2、及びLC CDR3、及び/または(ii)表2の重鎖配列の重鎖(HC)CDR1、HC CDR2、及びHC CDR3をコードする。
幾つかの実施形態では、組成物は軽鎖可変領域をコードし、ここで、軽鎖可変領域は、表2の軽鎖可変領域アミノ酸配列の少なくとも1つであるが30以下の改変を有するアミノ酸配列、または表2の軽鎖可変領域アミノ酸配列に対して95〜99%の同一性を有する配列を含む。
幾つかの実施形態では、組成物は重鎖可変領域をコードし、ここで、重鎖可変領域は、表2の重鎖可変領域アミノ酸配列の少なくとも1つであるが30以下の改変を有するアミノ酸配列、または表2の重鎖可変領域アミノ酸配列に対して95〜99%の同一性を有する配列を含む。
幾つかの実施形態では、コードされる第1のTFP、コードされる第2のTFP、または両方は、TCRアルファ鎖、TCRベータ鎖、CD3イプシロンTCRサブユニット、CD3ガンマTCRサブユニット、CD3デルタTCRサブユニット、それらの機能的断片、及び少なくとも1つであるが20以下の改変を有するそれらのアミノ酸配列からなる群から選択されるタンパク質の細胞外ドメインまたはその一部分を含む、TCRサブユニットの細胞外ドメインを含む。
幾つかの実施形態では、コードされる第1のTFP及びコードされる第2のTFPは、TCRアルファ鎖、TCRベータ鎖、CD3イプシロンTCRサブユニット、CD3ガンマTCRサブユニット、CD3デルタTCRサブユニット、それらの機能的断片、及び少なくとも1つであるが20以下の改変を有するそれらのアミノ酸配列からなる群から選択されるタンパク質の膜貫通ドメインを含む、膜貫通ドメインを含む。
幾つかの実施形態では、コードされる第1のTFP及びコードされる第2のTFPは、TCRアルファ鎖、TCRベータ鎖、TCRゼータ鎖、CD3イプシロンTCRサブユニット、CD3ガンマTCRサブユニット、CD3デルタTCRサブユニット、CD45、CD4、CD5、CD8、CD9、CD16、CD22、CD33、CD28、CD37、CD64、CD80、CD86、CD134、CD137、CD154、それらの機能的断片、及び少なくとも1つであるが20以下の改変を有するそれらのアミノ酸配列からなる群から選択されるタンパク質の膜貫通ドメインを含む、膜貫通ドメインを含む。
幾つかの実施形態では、組成物は、共刺激ドメインをコードする配列をさらに含む。
幾つかの実施形態では、共刺激ドメインは、OX40、CD2、CD27、CD28、CDS、ICAM−1、LFA−1(CD11a/CD18)、ICOS(CD278)、及び4−1BB(CD137)、ならびにそれらに対する少なくとも1つであるが20以下の改変を有するそれらのアミノ酸配列からなる群から選択されるタンパク質から得られる機能的シグナル伝達ドメインである。
幾つかの実施形態では、組成物は、細胞内シグナル伝達ドメインをコードする配列をさらに含む。
幾つかの実施形態では、組成物は、リーダー配列をさらに含む。
幾つかの実施形態では、組成物は、プロテアーゼ切断部位をさらに含む。
幾つかの実施形態では、アミノ酸配列に対する少なくとも1つであるが20以下の改変は、細胞のシグナル伝達を媒介するアミノ酸の改変、または第1のTFP、第2のTFP、もしくは両方へのリガンド結合に応答してリン酸化されるアミノ酸の改変を含む。
幾つかの実施形態では、単離された核酸分子はmRNAである。
幾つかの実施形態では、第1のTFP、第2のTFP、または両方は、CD3ゼータTCRサブユニット、CD3イプシロンTCRサブユニット、CD3ガンマTCRサブユニット、CD3デルタTCRサブユニット、TCRゼータ鎖、Fcイプシロン受容体1鎖、Fcイプシロン受容体2鎖、Fcガンマ受容体1鎖、Fcガンマ受容体2a鎖、Fcガンマ受容体2b1鎖、Fcガンマ受容体2b2鎖、Fcガンマ受容体3a鎖、Fcガンマ受容体3b鎖、Fcベータ受容体1鎖、TYROBP(DAP12)、CD5、CD16a、CD16b、CD22、CD23、CD32、CD64、CD79a、CD79b、CD89、CD278、CD66d、それらの機能的断片、及びそれらに対する少なくとも1つであるが20以下の改変を有するそれらのアミノ酸配列からなる群から選択されるタンパク質の免疫受容活性化チロシンモチーフ(ITAM)またはその一部分を含む、TCRサブユニットのITAMを含む。
幾つかの実施形態では、該ITAMは、CD3ガンマ、CD3デルタ、またはCD3イプシロンのITAMと置きかわる。
幾つかの実施形態では、該ITAMは、CD3ゼータTCRサブユニット、CD3イプシロンTCRサブユニット、CD3ガンマTCRサブユニット、及びCD3デルタTCRサブユニットからなる群から選択され、CD3ゼータTCRサブユニット、CD3イプシロンTCRサブユニット、CD3ガンマTCRサブユニット、及びCD3デルタTCRサブユニットからなる群から選択される異なるITAMと置きかわる。
幾つかの実施形態では、該組成物は、リーダー配列をさらに含む。
一態様では、本明細書で提供するのは、本明細書に記載する組成物の核酸分子によってコードされるポリペプチド分子を含む、組成物である。
幾つかの実施形態では、該ポリペプチドは、第1の核酸分子によってコードされる第1のポリペプチドと、第2の核酸分子によってコードされる第2のポリペプチドとを含む。
一態様では、本明細書で提供するのは、本明細書に記載する組成物の核酸分子によってコードされる組み換えTFP分子を含む、組成物である。
一態様では、本明細書で提供するのは、本明細書に記載するポリペプチドまたは組み換えTFP分子をコードする核酸分子を含むベクターを含む、組成物である。
幾つかの実施形態では、該ベクターは、a)第1のTFPをコードする第1の核酸分子を含む第1のベクターと、b)第2のTFPをコードする第2の核酸分子を含む第2のベクターとを含む。
幾つかの実施形態では、該ベクターは、DNA、RNA、プラスミド、レンチウイルスベクター、アデノウイルスベクター、ラウス肉腫ウイルス(RSV)ベクター、またはレトロウイルスベクターからなる群から選択される。
幾つかの実施形態では、該ベクターは、プロモーターをさらに含む。
幾つかの実施形態では、該ベクターは、in vitro転写ベクターである。
幾つかの実施形態では、該ベクター内の核酸分子は、ポリ(A)テールをさらにコードする。
幾つかの実施形態では、該ベクター内の核酸分子は、3’UTRをさらにコードする。
幾つかの実施形態では、該ベクター内の核酸分子は、プロテアーゼ切断部位をさらにコードする。
一態様では、本明細書で提供するのは、本明細書に記載する組成物を含む細胞を含む、組成物である。
幾つかの実施形態では、該細胞は、ヒトT細胞である。
幾つかの実施形態では、該T細胞は、CD8+またはCD4+T細胞である。
幾つかの実施形態では、該組成物は、細胞内シグナル伝達ドメインからの正のシグナルを含む第2のポリペプチドと会合した、抑制分子の少なくとも一部分を含む第1のポリペプチドを含む抑制分子をコードする核酸をさらに含む。
幾つかの実施形態では、該抑制分子は、PD1の少なくとも一部分を含む第1のポリペプチドと、共刺激ドメイン及び一次シグナル伝達ドメインを含む第2のポリペプチドとを含む。
一態様では、本明細書で提供するのは、MSLNまたはMUC16の発現に関連する疾患を有する哺乳動物を治療する方法であって、該哺乳動物に有効量の本明細書に記載する組成物を投与することを含む方法である。
幾つかの実施形態では、MUC16またはMSLNの発現に関連する疾患は、増殖性疾患、がん、悪性腫瘍、骨髄形成異常、骨髄異形成症候群、前白血病、MUC16の発現に関連する非がん関連適応症、MSLNの発現に関連する非がん関連適応症、乳癌、前立腺癌、卵巣癌、子宮頚癌、皮膚癌、膵癌、結腸直腸癌、腎癌、肝臓癌、脳癌、リンパ腫、白血病、肺癌、食道癌、胃癌、及び再発性または難治性疾患を有する切除不能な卵巣癌からなる群から選択される。
幾つかの実施形態では、該疾患は、B細胞急性リンパ性白血病(B−ALL)、T細胞急性リンパ性白血病(T−ALL)、急性リンパ芽球性白血病(ALL);慢性骨髄性白血病(CML)、慢性リンパ球性白血病(CLL)、B細胞前リンパ性白血病、芽球性形質細胞様樹状細胞腫瘍、バーキットリンパ腫、びまん性大細胞型B細胞リンパ腫、濾胞性リンパ腫、ヘアリーセル白血病、小細胞型濾胞性リンパ腫、大細胞型濾胞性リンパ腫、悪性リンパ球増殖状態、MALTリンパ腫、マントル細胞リンパ腫、辺縁帯リンパ腫、多発性骨髄腫、骨髄形成異常、骨髄異形成症候群、非ホジキンリンパ腫、形質芽球性リンパ腫、形質細胞様樹状細胞腫瘍、ワルデンシュトレームマクログロブリン血症、前白血病、MUC16またはMSLNの発現に関連する疾患、及びそれらの組み合わせからなる群から選択される血液のがんである。
幾つかの実施形態では、第1のTFP分子及び第2のTFP分子を発現する細胞は、第1のTFP分子及び第2のTFP分子を発現する細胞の効力を増大させる作用物質と組み合わせて投与される。
幾つかの実施形態では、哺乳動物において、抗MSLNキメラ抗原受容体(CAR)、抗MUC16 CAR、抗MSLN CAR、及び抗MUC16 CAR;またはそれらの組み合わせを発現する有効量のT細胞を投与された哺乳動物と比較して少ないサイトカインが放出される。
幾つかの実施形態では、一実施形態では、第1のTFP分子及び第2のTFP分子を発現する細胞は、第1のTFP分子及び第2のTFP分子を発現する細胞の投与に関連する1つまたは複数の副作用を改善する作用物質と組み合わせて投与される。
幾つかの実施形態では、第1のTFP分子及び第2のTFP分子を発現する細胞は、MSLNまたはMUC16に関連する疾患を治療する作用物質と組み合わせて投与される。
一態様では、本明細書に記載するのは、TCRサブユニットと、抗腫瘍抗原結合ドメイン、例えば、抗BCMA、抗CD19、抗CD20、抗CD22、抗MUC16、抗MSLNなどを含むヒトまたはヒト化抗体ドメインとを含むT細胞受容体(TCR)融合タンパク質(TFP)をコードする、単離された核酸分子である。幾つかの実施形態では、TCRサブユニットは、TCR細胞外ドメインを含む。他の実施形態では、TCRサブユニットは、TCR膜貫通ドメインを含む。さらに他の実施形態では、TCRサブユニットは、TCR細胞内ドメインを含む。さらなる実施形態では、TCRサブユニットは、(i)TCR細胞外ドメイン、(ii)TCR膜貫通ドメイン、及び(iii)TCR細胞内ドメインを含み、ここで、(i)、(ii)、及び(iii)のうちの少なくとも2つは、同じTCRサブユニットに由来する。なおさらなる実施形態では、TCRサブユニットは、CD3イプシロン、CD3ガンマ、もしくはCD3デルタの細胞内シグナル伝達ドメイン、またはそれらに対する少なくとも1つ、2つ、もしくは3つの改変を有するアミノ酸配列から選択される刺激ドメインを含むTCR細胞内ドメインを含む。なおさらなる実施形態では、TCRサブユニットは、4−1BBの機能的シグナル伝達ドメイン及び/またはCD3ゼータの機能的シグナル伝達ドメイン、またはそれらに対する少なくとも1つ、2つ、もしくは3つの改変を有するアミノ酸配列から選択される刺激ドメインを含む細胞内ドメインを含む。
幾つかの実施形態では、ヒトまたはヒト化抗体ドメインは、抗体断片を含む。幾つかの実施形態では、ヒトまたはヒト化抗体ドメインは、scFvまたはVHドメインを含む。
幾つかの実施形態では、単離された核酸分子は、(i)本明細書で提供する任意の抗腫瘍関連抗原軽鎖結合ドメインアミノ酸配列の軽鎖(LC)CDR1、LC CDR2、及びLC CDR3、及び/または(ii)本明細書で提供する任意の抗腫瘍関連抗原重鎖結合ドメインアミノ酸配列の重鎖(HC)CDR1、HC CDR2、及びHC CDR3を含む。
幾つかの実施形態では、軽鎖可変領域は、本明細書で提供する軽鎖可変領域のアミノ酸配列の少なくとも1つ、2つ、もしくは3つであるが30、20、もしくは10以下の改変を有するアミノ酸配列、または本明細書で提供するアミノ酸配列に対して95〜99%の同一性を有する配列を含む。他の実施形態では、重鎖可変領域は、本明細書で提供する重鎖可変領域のアミノ酸配列の少なくとも1つ、2つ、もしくは3つであるが30、20、もしくは10以下の改変を有するアミノ酸配列、または本明細書で提供するアミノ酸配列に対して95〜99%の同一性を有する配列を含む。
幾つかの実施形態では、TFPは、T細胞受容体のアルファもしくはベータ鎖、CD3デルタ、CD3イプシロン、もしくはCD3ガンマ、またはそれらの機能的断片、またはそれらに対する少なくとも1つ、2つ、もしくは3つであるが20、10、もしくは5以下の改変を有するアミノ酸配列からなる群から選択されるタンパク質の細胞外ドメインまたはその一部分を含む、TCRサブユニットの細胞外ドメインを含む。他の実施形態では、コードされるTFPは、TCRもしくはTCRサブユニットのアルファ、ベータ鎖、CD3イプシロン、CD3ガンマ、及びCD3デルタ、またはそれらの機能的断片、またはそれらに対するなくとも1つ、2つ、もしくは3つであるが20、10、もしくは5以下の改変を有するアミノ酸配列からなる群から選択されるタンパク質の膜貫通ドメインを含む、膜貫通ドメインを含む。
幾つかの実施形態では、コードされるTFPは、TCRのアルファ、ベータ、もしくはゼータ鎖、またはCD3イプシロン、CD3ガンマ、及びCD3デルタ、CD45、CD4、CD5、CD8、CD9、CD16、CD22、CD33、CD28、CD37、CD64、CD80、CD86、CD134、CD137、ならびにCD154、あるいはそれらの機能的断片、あるいはそれらに対する少なくとも1つ、2つ、もしくは3つであるが20、10、もしくは5以下の改変を有するアミノ酸配列からなる群から選択されるタンパク質の膜貫通ドメインを含む、膜貫通ドメインを含む。
幾つかの実施形態では、コードされる抗腫瘍関連抗原結合ドメインは、リンカー配列によってTCR細胞外ドメインに接続される。幾つかの場合では、コードされるリンカー配列は、(G4S)n(式中、n=1〜4)を含む。幾つかの場合では、コードされるリンカー配列は、(G4S)n(式中、n=2〜4)を含む。幾つかの場合では、コードされるリンカー配列は、(G4S)n(式中、n=1〜3)を含む。
幾つかの実施形態では、単離された核酸分子は、共刺激ドメインをコードする配列をさらに含む。幾つかの場合では、共刺激ドメインは、OX40、CD2、CD27、CD28、CDS、ICAM−1、LFA−1(CD11a/CD18)、ICOS(CD278)、及び4−1BB(CD137)、またはそれらに対しする少なくとも1つ、2つ、もしくは3つであるが20、10、もしくは5以下の改変を有するアミノ酸配列からなる群から選択されるタンパク質から得られる機能的シグナル伝達ドメインである。
幾つかの実施形態では、単離された核酸分子は、リーダー配列をさらに含む。
本明細書で提供するのはまた、前述の核酸分子のいずれかによってコードされる、単離されたポリペプチド分子である。
別の態様で本明細書で提供するのはまた、ヒトまたはヒト化抗腫瘍関連抗原結合ドメイン、TCR細胞外ドメイン、膜貫通ドメイン、及び細胞内ドメインを含む、単離されたT細胞受容体融合タンパク質(TFP)分子である。幾つかの実施形態では、単離されたTFP分子は、ヒトまたはヒト化抗腫瘍関連抗原結合ドメインを含む抗体または抗体断片、TCR細胞外ドメイン、膜貫通ドメイン、及び細胞内ドメインを含む。
幾つかの実施形態では、抗腫瘍関連抗原結合ドメインは、scFvまたはVHドメインである。他の実施形態では、抗腫瘍関連抗原結合ドメインは、本明細書で提供するアミノ酸配列の軽鎖及び重鎖、それらの機能的断片、または本明細書で提供する軽鎖可変領域のアミノ酸配列に対して少なくとも1つ、2つ、もしくは3つであるが30、20、もしくは10以下の改変を有するアミノ酸配列、または本明細書で提供するアミノ酸配列に95〜99%の同一性を有する配列を含む。幾つかの実施形態では、単離されたTFP分子は、T細胞受容体のアルファもしくはベータ鎖、CD3デルタ、CD3イプシロン、もしくはCD3ガンマ、またはそれらに対する少なくとも1つ、2つ、もしくは3つであるが20、10、もしくは5以下の改変を有するアミノ酸配列からなる群から選択されるタンパク質の細胞外ドメインまたはその一部分を含む、TCR細胞外ドメインを含む。
幾つかの実施形態では、抗腫瘍関連抗原結合ドメインは、リンカー配列によってTCR細胞外ドメインに接続される。幾つかの場合では、リンカー領域は、(G4S)n(式中、n=1〜4)を含む。幾つかの場合では、リンカー配列は、(G4S)n(式中、n=2〜4)を含む。幾つかの場合では、リンカー配列は、(G4S)n(式中、n=1〜3)を含む。
幾つかの実施形態では、単離されたTFP分子は、共刺激ドメインをコードする配列をさらに含む。他の実施形態では、単離されたTFP分子は、細胞内シグナル伝達ドメインをコードする配列をさらに含む。さらに他の実施形態では、単離されたTFP分子は、リーダー配列をさらに含む。
本明細書で提供するのはまた、前述のTFP分子のいずれかをコードする核酸分子を含む、ベクターである。幾つかの実施形態では、該ベクターは、DNA、RNA、プラスミド、レンチウイルスベクター、アデノウイルスベクター、またはレトロウイルスベクターからなる群から選択される。幾つかの実施形態では、該ベクターは、プロモーターをさらに含む。幾つかの実施形態では、該ベクターは、in vitro転写ベクターである。幾つかの実施形態では、該ベクター内の核酸配列は、ポリ(A)テールをさらに含む。幾つかの実施形態では、該ベクター内の核酸配列は、3’UTRをさらに含む。
本明細書で提供するのはまた、記載するベクターのいずれかを含む細胞である。幾つかの実施形態では、該細胞は、ヒトT細胞である。幾つかの実施形態では、該T細胞は、CD8+またはCD4+T細胞である。他の実施形態では、該細胞は、細胞内シグナル伝達ドメインからの正のシグナルを含む第2のポリペプチドと会合した、抑制分子の少なくとも一部分を含む第1のポリペプチドを含む抑制分子をコードする核酸をさらに含む。幾つかの場合では、該抑制分子は、PD1の少なくとも一部分を含む第1のポリペプチドと、共刺激ドメイン及び一次シグナル伝達ドメインを含む第2のポリペプチドとを含む。
別の態様では、本明細書で提供するのは、ヒトまたはヒト化抗腫瘍関連抗原結合ドメイン、TCR細胞外ドメイン、膜貫通ドメイン、及び細胞内シグナル伝達ドメインを含む単離されたTFP分子であって、内因性TCR複合体及び/または少なくとも1つの内因性TCRポリペプチドと機能的に相互作用することができる、単離されたTFP分子である。
別の態様では、本明細書で提供するのは、ヒトまたはヒト化抗腫瘍関連抗原結合ドメイン、TCR細胞外ドメイン、膜貫通ドメイン、及び細胞内シグナル伝達ドメインを含む単離されたTFP分子であって、内因性TCR複合体に機能的に統合することができる、単離されたTFP分子である。
別の態様では、本明細書で提供するのは、少なくとも2つのTFP分子を含むヒトCD8+またはCD4+T細胞であって、該TFP分子が、ヒトまたはヒト化抗腫瘍関連抗原結合ドメイン、TCR細胞外ドメイン、膜貫通ドメイン、及び細胞内ドメインを含み、該TFP分子が、該ヒトCD8+またはCD4+T細胞内で、該細胞で、及び/または該細胞の表面上で、内因性TCR複合体及び/または少なくとも1つの内因性TCRポリペプチドと機能的に相互作用することができる、ヒトCD8+またはCD4+T細胞である。
別の態様では、本明細書で提供するのは、i)ヒトまたはヒト化抗腫瘍関連抗原結合ドメイン、TCR細胞外ドメイン、膜貫通ドメイン、及び細胞内ドメインを含むTFP分子と;ii)少なくとも1つの内因性TCR複合体とを含む、タンパク質複合体である。
幾つかの実施形態では、TCRは、T細胞受容体のアルファもしくはベータ鎖、CD3デルタ、CD3イプシロン、またはCD3ガンマからなる群から選択されるタンパク質の細胞外ドメインまたはその一部分を含む。幾つかの実施形態では、抗腫瘍関連抗原結合ドメインは、リンカー配列によってTCR細胞外ドメインに接続される。幾つかの場合では、リンカー領域は、リンカー領域は、(G4S)n(式中、n=1〜4)を含む。幾つかの場合では、リンカー配列は、(G4S)n(式中、n=2〜4)を含む。幾つかの場合では、リンカー配列は、(G4S)n(式中、n=1〜3)を含む。
本明細書で提供するのはまた、記載するタンパク質複合体のいずれか1つ当たりに少なくとも2つの異なるTFPタンパク質を含む、ヒトCD8+またはCD4+T細胞である。
別の態様では、本明細書で提供するのは、ヒトCD8+またはCD4+T細胞の集団であって、該集団のT細胞が、少なくとも2つのTFP分子を個々にまたは集合的に含み、該TFP分子が、ヒトまたはヒト化抗腫瘍関連抗原結合ドメイン、TCR細胞外ドメイン、膜貫通ドメイン、及び細胞内ドメインを含み、該TFP分子が、該ヒトCD8+またはCD4+T細胞内で、該細胞で、及び/または該細胞の表面上で、内因性TCR複合体及び/または少なくとも1つの内因性TCRポリペプチドと機能的に相互作用することができる、ヒトCD8+またはCD4+T細胞の集団である。
別の態様では、本明細書で提供するのは、ヒトCD8+またはCD4+T細胞の集団であって、該集団のT細胞が、本明細書で提供する単離された核酸分子によってコードされる少なくとも2つのTFP分子を個々にまたは集合的に含む、ヒトCD8+またはCD4+T細胞の集団である。
別の態様では、本明細書で提供するのは、記載するベクターのいずれかでT細胞に形質導入することを含む、細胞を作製する方法である。
別の態様では、本明細書で提供するのは、RNAが操作された細胞の集団を生成する方法であって、in vitro転写RNAまたは合成RNAを細胞に導入することを含み、該RNAが、記載するTFP分子のいずれかをコードする核酸を含む方法である。
別の態様では、本明細書で提供するのは、哺乳動物に抗腫瘍免疫をもたらす方法であって、記載するTFP分子のいずれかを発現する有効量の細胞を該哺乳動物に投与することを含む方法である。幾つかの実施形態では、細胞は、自己T細胞である。幾つかの実施形態では、細胞は、同種異系T細胞である。幾つかの実施形態では、哺乳動物は、ヒトである。
別の態様では、本明細書で提供するのは、腫瘍関連抗原の発現に関連する疾患を有する哺乳動物を治療する方法であって、該哺乳動物に、記載するTFP分子のいずれかを含む有効量の細胞を投与することを含む方法である。幾つかの実施形態では、腫瘍関連抗原の発現に関連する疾患は、増殖性疾患、例えば、がんもしくは悪性腫瘍、または前がん状態、例えば、骨髄形成異常、骨髄異形成症候群、もしくは前白血病、または腫瘍関連抗原の発現に関連する非がん関連適応症からなる群から選択される。幾つかの実施形態では、疾患は、1つまたは複数の急性白血病、例えば、限定するものではないが、B細胞急性リンパ性白血病(「B−ALL」)、T細胞急性リンパ性白血病(「T−ALL」)、急性リンパ芽球性白血病(ALL);1つまたは複数の慢性白血病、例えば、限定するものではないが、慢性骨髄性白血病(CML)、慢性リンパ球性白血病(CLL);さらなる血液のがんまたは血液状態、例えば、限定するものではないが、B細胞前リンパ性白血病、芽球性形質細胞様樹状細胞腫瘍、バーキットリンパ腫、びまん性大細胞型B細胞リンパ腫、濾胞性リンパ腫、ヘアリーセル白血病、小細胞型または大細胞型濾胞性リンパ腫、悪性リンパ球増殖状態、MALTリンパ腫、マントル細胞リンパ腫、辺縁帯リンパ腫、多発性骨髄腫、くすぶり型多発性骨髄腫、孤立性形質細胞腫、リンパ形質細胞性リンパ腫、形質細胞性白血病、骨髄形成異常及び骨髄異形成症候群、非ホジキンリンパ腫、形質芽球性リンパ腫、形質細胞様樹状細胞腫瘍、ワルデンシュトレームマクログロブリン血症、及び骨髄の血液細胞の無効な産生(または異形成)によって総括される血液状態の多様な集まりである「前白血病」、及び腫瘍関連抗原の発現に関連する疾患、例えば、限定するものではないが、腫瘍関連抗原を発現する非定型及び/または非古典的がん、悪性腫瘍、前がん状態、または増殖性疾患;ならびにそれらの組み合わせからなる群から選択される、血液のがんである。
幾つかの実施形態では、記載するTFP分子のいずれかを発現する細胞は、TFP分子を発現する細胞の投与に関連する1つまたは複数の副作用を改善する作用物質と組み合わせて投与される。幾つかの実施形態では、記載するTFP分子のいずれかを発現する細胞は、腫瘍関連抗原に関連する疾患を治療する作用物質と組み合わせて投与される。
本明細書で提供するのはまた、医薬として使用するための、記載する単離された核酸分子のいずれか、記載する単離されたポリペプチド分子のいずれか、記載する単離されたTFPのいずれか、記載するタンパク質複合体のいずれか、記載するベクターのいずれか、または記載する細胞のいずれかである。
1.定義
別段の定義がない限り、本明細書に使用されるすべての技術用語及び科学用語は、本発明が属する技術分野の当業者によって共通に理解される意味と同じ意味を有する。
別段の定義がない限り、本明細書に使用されるすべての技術用語及び科学用語は、本発明が属する技術分野の当業者によって共通に理解される意味と同じ意味を有する。
「a」及び「an」という用語は、該冠詞の文法上の目的語が1つまたは2つ以上(すなわち、少なくとも1つ)であることを指す。例として、「エレメント(an element)」は、1つのエレメントまたは2つ以上のエレメントを意味する。
本明細書で使用される場合、「約」は、状況、及び当業者が知っているかまたは知り得ることに応じて、プラスまたはマイナス1パーセント未満、または1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、25、30パーセント、または30パーセント超を意味し得る。
本明細書で使用される場合、「対象(subject)」もしくは「対象(subjects)」または「個体」として、哺乳動物、例えば、ヒトまたは非ヒト哺乳動物、例えば、家畜、農業用動物、もしくは野生動物、ならびに鳥類、及び水生動物が挙げることができるが、これらに限定されない。「患者」とは、疾患、障害、または状態に罹患しているか、またはそれらを発症するリスクがあるか、さもなければ本明細書で提供する組成物及び方法を必要とする対象である。
本明細書で使用される場合、「治療すること」または「治療」は、疾患または状態の治療または改善における成功を示す任意の徴候を指す。治療は、例えば、疾患もしくは状態の1つもしくは複数の症状の重症度の低減、遅延、もしくは緩和を含むことができ、または患者が経験する疾患、欠陥、障害、もしくは有害な状態などの症状の頻度の低減を含むことができる。本明細書で使用される場合、「治療または予防する」は、疾患または状態のある程度の治療または改善をもたらす方法を指すために本明細書で使用されることがあり、限定するものではないが、状態の完全な予防を含めた、その目的に向けた様々な結果が企図される。
本明細書で使用される場合、「予防すること」は、患者における疾患または状態、例えば腫瘍形成を防止することを指す。例えば、腫瘍または他の形態のがんを発症するリスクのある個体が本発明の方法で治療され、その後腫瘍または他の形態のがんを発症しないならば、疾患は、少なくともある期間にわたってその個体において予防されている。
本明細書で使用される場合、「治療的有効量」は、組成物またはその活性成分の量であって、該組成物を投与される個体に対して、有益効果をもたらすか、さもなければ有害で非有益な事象を低減させるのに十分な量である。本明細書における「治療的有効用量」は、それが投与されたことに対して1つまたは複数の所望のまたは望ましい(例えば有益な)効果を生み出す用量を意味しており、そのような投与は所与の期間にわたって一回または複数回行われる。正確な用量は、治療の目的に応じて異なることとなり、当業者によって公知の技法を使用して確定されることとなる(例えば、Lieberman,Pharmaceutical Dosage Forms(vols.1−3,1992);Lloyd,The Art,Science and Technology of Pharmaceutical Compounding(1999);及びPickar,Dosage Calculations(1999)を参照されたい)。
本明細書で使用される場合、「T細胞受容体(TCR)融合タンパク質」または「TFP」は、TCRを含む様々なポリペプチドに由来する組み換えポリペプチドを含み、該TCRは、一般に、i)標的細胞の表面抗原に結合することができ、かつii)典型的にはT細胞内またはT細胞の表面上の同じ場所に位置するときに、インタクトなTCR複合体の他のポリペプチド成分と相互作用することができる。
「抗体」という用語は、本明細書で使用される場合、抗原に特異的に結合する免疫グロブリン分子に由来するタンパク質またはポリペプチド配列を指す。抗体は、ポリクローナルもしくはモノクローナル起源のインタクトな免疫グロブリンまたはそれらの断片であってもよく、天然源由来であっても組み換え源由来であってもよい。
「抗体断片」または「抗体結合ドメイン」という用語は、抗体の少なくとも一部分またはその組み換え変異体であって、抗原及びその所定のエピトープなどの標的に対する認識及び特異的結合を抗体断片に付与するのに十分な、インタクトな抗体の抗原結合ドメイン、すなわち抗原を決定する可変領域を含有するものを指す。抗体断片の例として、Fab、Fab’、F(ab’)2、及びFv断片、一本鎖(sc)Fv(「scFv」)抗体断片、線状抗体、単一ドメイン抗体(「sdAb」と略される)(VLまたはVHのいずれか)、ラクダ科VHHドメイン、抗体断片から形成される多重特異性抗体が挙げられるが、これらに限定されない。
「scFv」という用語は、軽鎖の可変領域を含む少なくとも1つの抗体断片と、重鎖の可変領域を含む少なくとも1つの抗体断片とを含む融合タンパク質であって、軽鎖可変領域と重鎖可変領域とが短いフレキシブルなポリペプチドリンカーによって隣接して連結され、単一のポリペプチド鎖として発現することが可能であり、該scFvが、その由来であるインタクトな抗体の特異性を保持しているものを指す。
抗体に関する「重鎖可変領域」または「VH」(または、単一ドメイン抗体、例えばナノボディの場合、「VHH」)は、フレームワーク領域として公知の隣接するストレッチ間に介在する3つのCDRを含有する重鎖の断片を指し、これらのフレームワーク領域は一般に、CDRより高度に保存され、CDRを支持する足場を形成する。
指定されない限り、本明細書で使用される場合、scFvは、例えば、ポリペプチドのN末端及びC末端に対して、VL及びVH領域をいずれの順序で有してもよく、scFvは、VL−リンカー−VHを含んでも、VH−リンカー−VLを含んでもよい。
抗体またはその抗体断片を含む本発明のTFP組成物の一部分は、例えば、単一ドメイン抗体断片(sdAb)または重鎖抗体HCAb242:423−426を含めた、抗原結合ドメインが連続するポリペプチド鎖の一部として発現される種々の形態で存在してもよい。一態様では、本発明のTFP組成物の抗原結合ドメインは、抗体断片を含む。さらなる態様では、TFPは、scFvまたはsdAbを含む抗体断片を含む。
「抗体重鎖」という用語は、天然に存在する立体配座の抗体分子に存在する2つのタイプのポリペプチド鎖のうちの大きい方を指し、それは通常、その抗体が属するクラスを決定する。
「抗体軽鎖」という用語は、天然に存在する立体配座の抗体分子に存在する2つのタイプのポリペプチド鎖のうちの小さい方を指す。カッパ(「κ」)及びラムダ(「λ」)軽鎖は、2つの主要な抗体軽鎖アイソタイプを指す。
「組み換え抗体」という用語は、組み換えDNA技術を使用して生成される抗体、例えば、バクテリオファージまたは酵母発現系によって発現される抗体などを指す。この用語はまた、抗体をコードし、抗体タンパク質を発現するDNA分子、または抗体を特定するアミノ酸配列の合成によって生成された抗体を意味すると解釈されるものとし、ここで、該DNAまたはアミノ酸配列は、当技術分野で利用可能であり、周知されている組み換えDNAまたはアミノ酸配列技術を使用して得られたものである。
「抗原」または「Ag」という用語は、抗体が特異的に結合することができる分子、さもなければ免疫応答を誘発する分子を指す。この免疫応答は、抗体産生、もしくは特定の免疫適格細胞の活性化、または両方を含み得る。
当業者であれば、実質的にすべてのタンパク質またはペプチドを含めた任意の巨大分子が抗原として機能し得ることを理解するであろう、さらに、抗原は、組み換えまたはゲノムDNAに由来し得る。したがって、当業者であれば、免疫応答を誘発するタンパク質をコードするヌクレオチド配列または部分的ヌクレオチド配列を含む任意のDNAが、本明細書で使用される用語としての「抗原」をコードすることを理解するであろう。さらに、当業者であれば、抗原が遺伝子の完全長ヌクレオチド配列によってのみコードされる必要がないことを理解するであろう。本発明には、限定するものではないが、2つ以上の遺伝子の部分的なヌクレオチド配列の使用が含まれること、そしてこれらのヌクレオチド配列が所望の免疫応答を誘発するポリペプチドをコードするように様々な組み合わせで配置されることは容易に認められる。さらに、当業者であれば、抗原は、「遺伝子」によってコードされる必要が全くないことを理解するであろう。抗原は、合成で生成されてもよく、または生体試料に由来してもよく、またはポリペプチド以外の巨大分子であってもよいことは容易に認められる。そのような生体試料として、組織試料、腫瘍試料、細胞、または他の生体内成分を有する液体を挙げることができるが、これらに限定されない。
「抗腫瘍効果」という用語は、様々な手段によって明らかにすることができる生物学的効果を指し、それらとして、例えば、腫瘍量の減少、腫瘍細胞数の減少、転移数の減少、平均余命の増大、腫瘍細胞増殖の減少、腫瘍細胞生存の減少、またはがん性状態に関連する様々な生理的症状の改善が挙げられるが、これらに限定されない。「抗腫瘍効果」は、まず第一に、腫瘍の発生の予防における本発明のペプチド、ポリヌクレオチド、細胞、及び抗体の能力によって明らかにすることができる。
「自己」という用語は、任意の物質であって、それを後で再導入しようとする個体と同じ個体に由来する物質を指す。
「同種異系」という用語は、任意の物質であって、その物質が導入される個体と同じ種の異なる動物または異なる患者に由来する物質を指す。2つ以上の個体は、1つまたは複数の遺伝子座における遺伝子が同一でないとき、互いに同種異系と言われる。幾つかの態様では、同じ種の個体に由来する同種異系物質は、抗原的に相互作用するのに十分に遺伝学的に異なり得る。
「異種」という用語は、異なる種の動物に由来する移植片を指す。
「がん」という用語は、急速で無制御な異常細胞の増殖によって特徴付けられる疾患を指す。がん細胞は、局所的に、または血流及びリンパ系を通して体の他の部分に広がり得る。様々ながんの例は、本明細書に記載されており、それらとして、乳癌、前立腺癌、卵巣癌、子宮頚癌、皮膚癌、膵癌、結腸直腸癌、腎癌、肝臓癌、脳癌、リンパ腫、白血病、肺癌、食道癌、胃癌、再発性または難治性疾患を有する切除不能な卵巣癌などが挙げられるが、これらに限定されない。
「保存的配列改変」という用語は、アミノ酸配列を含有する抗体または抗体断片の結合特性に有意な影響を与えないか、またはそれを変更しないアミノ酸改変を指す。そのような保存的改変には、アミノ酸の置換、付加、及び欠失が含まれる。改変は、部位特異的変異誘発及びPCR媒介変異誘発などの当技術分野で公知の標準的技法によって、本発明の抗体または抗体断片に導入することができる。保存的アミノ酸置換は、アミノ酸残基を、類似の側鎖を有するアミノ酸残基で置きかえるものである。類似の側鎖を有するアミノ酸残基のファミリーは、当技術分野で定められている。これらのファミリーには、塩基性側鎖を有するアミノ酸(例えば、リジン、アルギニン、ヒスチジン)、酸性側鎖を有するアミノ酸(例えば、アスパラギン酸、グルタミン酸)、非荷電極性側鎖を有するアミノ酸(例えば、グリシン、アスパラギン、グルタミン、セリン、トレオニン、チロシン、システイン、トリプトファン)、非極性側鎖を有するアミノ酸(例えば、アラニン、バリン、ロイシン、イソロイシン、プロリン、フェニルアラニン、メチオニン)、ベータ分枝側鎖を有するアミノ酸(例えば、トレオニン、バリン、イソロイシン)、及び芳香族側鎖を有するアミノ酸(例えば、チロシン、フェニルアラニン、トリプトファン、ヒスチジン)が含まれる。よって、本発明のTFP中の1つまたは複数のアミノ酸残基は、同じ側鎖ファミリーに由来する他のアミノ酸残基で置きかえることができ、変更されたTFPは、本明細書に記載する機能アッセイを使用して試験することができる。
「刺激」という用語は、刺激ドメインまたは刺激分子(例えば、TCR/CD3複合体)がその同族リガンドと結合し、それによってシグナル伝達事象、例えば、限定するものではないが、TCR/CD3複合体を介するシグナル伝達を媒介することによって誘導される一次応答を指す。刺激は、ある種の分子の発現の変更、及び/または細胞骨格構造の再構築などを媒介し得る。
「刺激分子」または「刺激ドメイン」という用語は、T細胞によって発現される分子またはその一部分であって、T細胞シグナル伝達経路の少なくともある側面に対して刺激を与えるようにTCR複合体の一次活性化を制御する一次細胞質シグナル伝達配列(複数可)を提供するものを指す。一態様では、一次シグナルは、例えば、TCR/CD3複合体がペプチドを担持するMHC分子と結合することによって開始され、これによって、限定するものではないが、増殖、活性化、分化などのT細胞応答が媒介される。刺激を与えるように作用する一次細胞質シグナル伝達配列(「一次シグナル伝達ドメイン」とも呼ばれる)は、免疫受容活性化チロシンモチーフまたは「ITAM」として公知のシグナル伝達モチーフを含有し得る。本発明に特に有用な一次細胞質シグナル伝達配列を含有するITAMの例として、TCRゼータ、FcRガンマ、FcRベータ、CD3ガンマ、CD3デルタ、CD3イプシロン、CD5、CD22、CD79a、CD79b、CD278(「ICOS」としても公知である)及びCD66dに由来するものが挙げられるが、これらに限定されない。
「抗原提示細胞」または「APC」という用語は、アクセサリー細胞(例えば、B細胞、樹状細胞など)などの免疫系細胞であって、その表面上で主要組織適合抗原複合体(MHC)と複合体化した外来抗原を表示するものを指す。T細胞は、それらのT細胞受容体(TCR)を使用して、これらの複合体を認識し得る。APCは、抗原を処理し、それらをT細胞に提示する。
「細胞内シグナル伝達ドメイン」は、この用語が本明細書で使用される場合、分子の細胞内部分を指す。細胞内シグナル伝達ドメインは、TFP含有細胞、例えば、TFP発現T細胞の免疫エフェクター機能を促進するシグナルを生成する。例えば、TFP発現T細胞における免疫エフェクター機能の例として、細胞溶解活性、及びサイトカインの分泌を含めたヘルパーT細胞活性が挙げられる。ある実施形態では、細胞内シグナル伝達ドメインは、一次細胞内シグナル伝達ドメインを含み得る。例示的な一次細胞内シグナル伝達ドメインとして、一次刺激、または抗原依存性刺激に関与する分子に由来するものが挙げられる。ある実施形態では、細胞内シグナル伝達ドメインは、共刺激細胞内ドメインを含み得る。例示的な共刺激細胞内シグナル伝達ドメインとして、共刺激シグナルまたは抗原非依存性刺激に関与する分子に由来するものが挙げられる。
一次細胞内シグナル伝達ドメインは、ITAM(「免疫受容活性化チロシンモチーフ」)を含み得る。ITAMを含有する一次細胞質シグナル伝達配列の例として、CD3ゼータ、FcRガンマ、FcRベータ、CD3ガンマ、CD3デルタ、CD3イプシロン、CD5、CD22、CD79a、CD79b、及びCD66d DAP10、及びDAP12に由来するものが挙げられるが、これらに限定されない。
「共刺激分子」という用語は、共刺激リガンドに特異的に結合し、それによって、限定するものではないが、増殖などのT細胞による共刺激応答を媒介する、T細胞上の同族結合パートナーを指す。共刺激分子は、効率的な免疫応答に必要とされる、抗原受容体またはそれらのリガンド以外の細胞表面分子である。共刺激分子として、MHCクラス1分子、BTLA、及びTollリガンド受容体、ならびにOX40、CD2、CD27、CD28、CDS、ICAM−1、LFA−1(CD11a/CD18)、及び4−1BB(CD137)が挙げられるが、これらに限定されない。共刺激細胞内シグナル伝達ドメインは、共刺激分子の細胞内部分であり得る。共刺激分子は、次のタンパク質ファミリー:TNF受容体タンパク質、免疫グロブリン様タンパク質、サイトカイン受容体、インテグリン、シグナル伝達リンパ球活性化分子(SLAMタンパク質)、及び活性化NK細胞受容体に代表され得る。そのような分子の例として、CD27、CD28、4−1BB(CD137)、OX40、GITR、CD30、CD40、ICOS、BAFFR、HVEM、リンパ球機能関連抗原1(LFA−1)、CD2、CD7、LIGHT、NKG2C、SLAMF7、NKp80、CD160、B7−H3、及びCD83に特異的に結合するリガンドなどが挙げられる。細胞内シグナル伝達ドメインは、それが由来する分子の細胞内部分全体、もしくは本来の細胞内シグナル伝達ドメイン全体、またはそれらの機能的断片を含み得る。「4−1BB」という用語は、GenBankアクセッション番号AAA62478.2として提供されるアミノ酸配列、または非ヒト種、例えば、マウス、げっ歯類、サル、類人猿などに由来する同等な残基を有する、TNFRスーパーファミリーのメンバーを指し、「4−1BB共刺激ドメイン」は、GenBankアクセッション番号AAA62478.2のアミノ酸残基214〜255、または非ヒト種、例えば、マウス、げっ歯類、サル、類人猿などに由来する同等の残基として定義される。
「コードする」という用語は、定義されたヌクレオチド配列(例えば、rRNA、tRNA、及びmRNA)または定義されたアミノ酸配列のいずれか、及びそれに起因する生物学的特性を有する生物学的プロセスにおいて、他のポリマー及び巨大分子を合成するための鋳型として機能する、遺伝子、cDNA、またはmRNAなどの、ポリヌクレオチド中のヌクレオチドの特定の配列の固有特性を指す。よって、遺伝子、cDNA、またはRNAは、その遺伝子に対応するmRNAの転写及び翻訳が細胞または他の生体系内でタンパク質を産生するならば、タンパク質をコードする。mRNAの配列と同一であり、通常配列表に示されるヌクレオチド配列であるコード鎖と、遺伝子またはcDNAを転写するための鋳型として使用される非コード鎖は、両方とも、その遺伝子またはcDNAのタンパク質または他の産物をコードするとみなすことができる。
別段の指定がない限り、「アミノ酸配列をコードするヌクレオチド配列」には、互いの縮重型であって、同じアミノ酸配列をコードするすべてのヌクレオチド配列が含まれる。タンパク質またはRNAをコードするヌクレオチド配列という語句には、該タンパク質をコードするヌクレオチド配列が幾つかの型において1つまたは複数のイントロンを含有することがあるという範囲でイントロンが含まれてもよい。
「有効量」または「治療的有効量」という用語は、本明細書では相互に交換可能に使用され、本明細書に記載する通りの化合物、製剤、物質、または組成物の特定の生物学的または治療的結果を実現するのに有効な量を指す。
「内因性」という用語は、生物、細胞、組織、または系の内部に由来するか、またはそれらの内部で生成される任意の物質を指す。
「外因性」という用語は、生物、細胞、組織、または系の外部から導入されるか、またはそれらの外部で生成される任意の物質を指す。
「発現」という用語は、プロモーターによって駆動される、特定のヌクレオチド配列の転写及び/または翻訳を指す。
「移入ベクター」という用語は、単離された核酸を含む組成物であって、単離された核酸を細胞の内側に送達するために使用することができるものを指す。多数のベクターが当技術分野で公知であり、それらとして、線状ポリヌクレオチド、イオン性または両親媒性化合物に会合したポリヌクレオチド、プラスミド、及びウイルスが挙げられるが、これらに限定されない。よって、「移入ベクター」という用語には、自己複製プラスミドまたはウイルスが含まれる。この用語にはまた、核酸の細胞への移入を促進する非プラスミドまたは非ウイルス性化合物、例えば、ポリリジン化合物、リポソームなどがさらに含まれると解釈されるものとする。ウイルス性移入ベクターの例として、アデノウイルスベクター、アデノ随伴ウイルスベクター、レトロウイルスベクター、レンチウイルスベクターなどが挙げられるが、これらに限定されない。
「発現ベクター」という用語は、発現させようとするヌクレオチド配列に作動可能に連結された発現調節配列を含む組み換えポリヌクレオチドを含むベクターを指す。発現ベクターは、発現に十分なシス作用性エレメントを含み、発現のための他のエレメントは、宿主細胞によって、またはin vitroでの発現系において供給され得る。発現ベクターとして、当技術分野で公知のすべてのものが挙げられ、それらとして、組み換えポリヌクレオチドを組み込んだ、コスミド、プラスミド(例えば、裸のものまたはリポソーム中に含有されたもの)、及びウイルス(例えば、レンチウイルス、レトロウイルス、アデノウイルス、及びアデノ随伴ウイルス)が挙げられる。
「レンチウイルス」という用語は、レトロウイルス科の属を指す。レンチウイルスは、非分裂細胞に感染することができるという点で、レトロウイルスの中でも独特である。それらは、宿主細胞のDNAに相当量の遺伝情報を送達することができるので、遺伝子送達ベクターの最も効率的な方法のうちの一つである。HIV、SIV、及びFIVは、すべてレンチウイルスの例である。
「レンチウイルスベクター」という用語は、レンチウイルスゲノムの少なくとも一部分に由来するベクターを指し、それとして、とりわけ、Milone et al.,Mol.Ther.17(8):1453−1464(2009)に示されるような自己不活性化レンチウイルスベクターが挙げられる。臨床で使用することができるレンチウイルスベクターの他の例として、Oxford BioMedicaのLENTIVECTOR(商標)遺伝子送達技術、LentigenのLENTIMAX(商標)ベクター系などが挙げられるが、これらに限定されない。非臨床タイプのレンチウイルスベクターも利用可能であり、当業者には公知であろう。
「相同」または「同一性」という用語は、2つのポリマー分子間、例えば、2つのDNA分子もしくは2つのRNA分子などの2つの核酸分子間、または2つのポリペプチド分子間のサブユニット配列の同一性を指す。2つの分子の両方におけるあるサブユニット位置が同じ単量体のサブユニットで占められているとき、例えば、2つのDNA分子の各々におけるある位置がアデニンで占められているならば、それらは、その位置で相同または同一である。2つの配列間の相同性は、一致するまたは相同な位置の数の一次関数であり、例えば、2つの配列における位置の半分(例えば、長さ10のサブユニットのポリマー中で5つの位置)が相同であるならば、2つの配列は50%相同であり、位置の90%(例えば、10のうち9)が一致するまたは相同であるならば、2つの配列は90%相同である。
非ヒト(例えば、マウス)抗体の「ヒト化」形態は、非ヒト免疫グロブリンに由来する最小配列を含有する、キメラ免疫グロブリン、免疫グロブリン鎖、またはそれらの断片(Fv、Fab、Fab’、F(ab’)2、または抗体の他の抗原結合サブ配列など)である。ほとんどの部分で、ヒト化抗体及びその抗体断片はヒト免疫グロブリン(レシピエント抗体または抗体断片)であり、それにおいて該レシピエントの相補性決定領域(CDR)に由来する残基は、所望の特異性、親和性、及び能力を有するマウス、ラット、またはウサギなどの非ヒト種(ドナー抗体)のCDRに由来する残基によって置きかえられている。幾つかの場合では、ヒト免疫グロブリンのFvフレームワーク領域(FR)残基が、対応する非ヒト残基によって置きかえられている。さらに、ヒト化抗体/抗体断片は、レシピエント抗体にも、移入されたCDRまたはフレームワーク配列にも見出されない残基を含むことができる。これらの改変によって、抗体または抗体断片の性能をさらに洗練し、最適化することができる。一般に、ヒト化抗体またはその抗体断片は、少なくとも1つ、典型的には2つの可変ドメインの実質的にすべてを含むものであり、それにおいてCDR領域のすべてまたは実質的にすべてが非ヒト免疫グロブリンのものに対応し、FR領域のすべてまたは相当な部分がヒト免疫グロブリン配列のものである。ヒト化抗体または抗体断片は、免疫グロブリンの定常領域(Fc)、典型的にはヒト免疫グロブリンのものの少なくとも一部分も含むことができる。さらなる詳細については、Jones et al.,Nature,321:522−525,1986;Reichmann et al.,Nature,332:323−329,1988;Presta,Curr.Op.Struct.Biol.,2:593−596,1992を参照されたい。
「ヒト」または「完全ヒト」は、抗体または抗体断片などの免疫グロブリンであって、分子全体がヒト起源のものであるか、またはヒト型の抗体もしくは免疫グロブリンと同一のアミノ酸配列からなるものを指す。
「単離された」という用語は、天然の状態から変更されたか、または取り出されたことを意味する。例えば、生きている動物に天然に存在する核酸またはペプチドは「単離された」ものではないが、同じ核酸またはペプチドであって、その天然の状態の共存する物質から部分的にまたは完全に分離されたものは、「単離された」ものである。単離された核酸またはタンパク質は、実質的に精製された形態で存在することができ、または、例えば、宿主細胞などの非天然環境で存在することができる。
本発明との関係において、通常存在する核酸塩基について、次の略語が使用される。「A」はアデノシンを指し、「C」はシトシンを指し、「G」はグアノシンを指し、「T」はチミジンを指し、「U」はウリジンを指す。
「作動可能に連結された」または「転写調節」という用語は、異種核酸配列の発現をもたらす、制御配列と異種核酸配列との間の機能的連結を指す。例えば、第1の核酸配列が第2の核酸配列と機能的な関係に置かれているとき、第1の核酸配列は第2の核酸配列と作動可能に連結されている。例えば、プロモーターがコード配列の転写または発現に影響を与えるならば、該プロモーターは該コード配列に作動可能に連結されている。作動可能に連結されたDNA配列は、互いに隣接していてもよく、例えば、2つのタンパク質コード領域を結合するために必要な場合、同じリーディングフレーム内にある。
免疫原性組成物の「非経口」投与という用語には、例えば、皮下(s.c.)、静脈内(i.v.)、筋肉内(i.m.)、もしくは胸骨内注射、腫瘍内または注入技法が含まれる。
「核酸」または「ポリヌクレオチド」という用語は、一本鎖または二本鎖の形態のいずれかのデオキシリボ核酸(DNA)またはリボ核酸(RNA)及びそれらのポリマーを指す。特に限定しない限り、この用語は、参照核酸と同様の結合特性を有し、天然に存在するヌクレオチドと同様に代謝される、天然のヌクレオチドの公知の類似体を含有する核酸を包含する。別段の指示がない限り、特定の核酸配列は、明確に示された配列だけでなく、保存的に改変されたその変異体(例えば、縮重コドン置換)、対立遺伝子、相同分子種、SNP、及び相補的配列も暗黙的に包含する。具体的には、縮重コドン置換は、1つまたは複数の選択された(またはすべての)コドンの3番目の位置が混合塩基及び/またはデオキシイノシン残基で置換された配列を生成することによって実現することができる(Batzer et al.,Nucleic Acid Res.19:5081(1991);Ohtsuka et al.,J.Biol.Chem.260:2605−2608(1985);及びRossolini et al.,Mol.Cell.Probes 8:91−98(1994))。
「ペプチド」、「ポリペプチド」、及び「タンパク質」という用語は、相互に交換可能に使用され、ペプチド結合によって共有結合的に連結されたアミノ酸残基からなる化合物を指す。タンパク質またはペプチドは、少なくとも2つのアミノ酸を含有しなければならず、タンパク質またはペプチド配列を構成することができるアミノ酸の最大数については制限はない。ポリペプチドには、ペプチド結合によって互いに結合された2つ以上のアミノ酸を含む任意のペプチドまたはタンパク質が含まれる。本明細書で使用される場合、この用語は、例えば、通常、当技術分野でペプチド、オリゴペプチド、及びオリゴマーとも呼ばれる短鎖と、一般に当技術分野でタンパク質と呼ばれ、多くのタイプが存在する長鎖の両方を指す。「ポリペプチド」には、例えば、とりわけ、生物学的に活性な断片、実質的に相同なポリペプチド、オリゴペプチド、ホモ二量体、ヘテロ二量体、ポリペプチドの変異体、改変されたポリペプチド、誘導体、類似体、融合タンパク質が含まれる。ポリペプチドには、天然のペプチド、組み換えペプチド、またはそれらの組み合わせが含まれる。
「プロモーター」という用語は、ポリヌクレオチド配列の特異的転写を開始するのに必要とされる、細胞の転写機構または導入された合成機構によって認識されるDNA配列を指す。
「プロモーター/制御配列」という用語は、プロモーター/制御配列に作動可能に連結された遺伝子産物の発現に必要とされる核酸配列を指す。幾つかの場合では、この配列はコアプロモーター配列であってもよく、他の場合では、この配列は、エンハンサー配列及び遺伝子産物の発現に必要とされる他の制御エレメントも含んでもよい。プロモーター/制御配列は、例えば、遺伝子産物を組織特異的に発現するものであってもよい。
「構成的」プロモーターという用語は、ヌクレオチド配列であって、遺伝子産物をコードするまたは特定するポリヌクレオチドと作動可能に連結されているとき、細胞のほとんどまたはすべての生理的条件下で該細胞内に該遺伝子産物を産生させるものを指す。
「誘導性プロモーター」という用語は、ヌクレオチド配列であって、遺伝子産物をコードするまたは特定するポリヌクレオチドと作動可能に連結されているとき、実質的にプロモーターに対応する誘導物質が細胞内に存在するときのみ、該細胞内に該遺伝子産物を産生させるものを指す。
「組織特異的」プロモーターという用語は、ヌクレオチド配列であって、遺伝子をコードするまたは遺伝子によって特定されるポリヌクレオチドと作動可能に連結されているとき、実質的に細胞が該プロモーターに対応する組織タイプの細胞である場合にのみ、該細胞内に該遺伝子産物を産生させるものを指す。
「リンカー」及び「フレキシブルポリペプチドリンカー」という用語は、scFvとの関係において使用される場合、グリシン及び/またはセリン残基などのアミノ酸からなるペプチドリンカーであって、可変重鎖及び可変軽鎖領域を一緒に連結するために単独でまたは組み合わせて使用されるものを指す。一実施形態では、フレキシブルポリペプチドリンカーは、Gly/Serリンカーであり、アミノ酸配列(Gly−Gly−Gly−Ser)nを含み、式中、nは、1以上の正の整数である。例えば、n=1、n=2、n=3、n=4、n=5、n=6、n=7、n=8、n=9、及びn=10である。一実施形態では、フレキシブルポリペプチドリンカーには、(Gly4Ser)4または(Gly4Ser)3が含まれるが、これらに限定されない。別の実施形態では、リンカーには、(Gly2Ser)、(GlySer)、または(Gly3/Ser)の複数の繰返しが含まれる。本発明の範囲内に含まれるのはまた、WO2012/138475(参照により本明細書に援用される)に記載されるリンカーである。幾つかの場合では、リンカー配列は、(G4S)n(式中、n=2〜4である)を含む。幾つかの場合では、リンカー配列は、(G4S)n(式中、n=1〜3である)を含む。
本明細書で使用される場合、5’キャップ(RNAキャップ、RNA7−メチルグアノシンキャップ、またはRNA m7Gキャップとも呼ばれる)は、転写の開始直後に真核生物メッセンジャーRNAの「フロント」または5’末端に付加される改変されたグアニンヌクレオチドである。5’キャップは、最初に転写されたヌクレオチドに連結される末端基からなる。その存在は、リボソームによる認識及びリボヌクレアーゼからの保護に不可欠である。キャップ付加は転写と対であり、転写と同時に起こるため、互いに影響を与え合う。転写の開始直後に、合成中のmRNAの5’末端は、RNAポリメラーゼに会合しているキャップ合成複合体と結合する。この酵素複合体は、mRNAのキャッピングに必要とされる化学反応に触媒作用を及ぼす。合成は、多段階の生化学反応として進行する。キャッピング部分は、mRNAの機能性、例えば、その安定性または翻訳の効率を調節するために改変することができる。
本明細書で使用される場合、「in vitro転写RNA」は、in vitroで合成されたRNA、好ましくはmRNAを指す。一般に、in vitro転写RNAは、in vitro転写ベクターから生成される。in vitro転写ベクターは、in vitro転写RNAを生成するために使用される鋳型を含む。
本明細書で使用される場合、「ポリ(A)」は、ポリアデニル化によってmRNAに結合される一連のアデノシンである。一過性発現用の構築物の好ましい実施形態では、ポリAは、50〜5000の間、好ましくは64超、より好ましくは100超、最も好ましくは300または400超である。ポリ(A)配列は、局在性、安定性、または翻訳の効率などのmRNAの機能性を改変するために、化学的または酵素的に改変することができる。
本明細書で使用される場合、「ポリアデニル化」は、ポリアデニリル部分、またはその改変された変異体のメッセンジャーRNA分子への共有結合を指す。真核生物では、ほとんどのメッセンジャーRNA(mRNA)分子は、3’末端でポリアデニル化される。3’ポリ(A)テールは、ポリアデニル酸ポリメラーゼという酵素の作用を通してRNA前駆体に付加された、アデニンヌクレオチドの長い配列(多くの場合、数百)である。高等真核生物では、ポリ(A)テールは、特定配列、ポリアデニル化シグナルを含有する転写物に付加される。ポリ(A)テール及びそれに結合したタンパク質は、エキソヌクレアーゼによる分解からmRNAを保護するのを助ける。ポリアデニル化は、転写終結、核からのmRNAの輸送、及び翻訳にも重要である。ポリアデニル化は、DNAをRNAに転写した直後に核内で生じるが、それに加えて後で細胞質内で生じることもある。転写が終結した後、mRNA鎖は、RNAポリメラーゼに会合したエンドヌクレアーゼ複合体の作用を通して切断される。切断部位は、通常、切断部位の近くに塩基配列AAUAAA(配列番号98)が存在することによって特徴付けられる。mRNAが切断された後、アデノシン残基が切断部位の遊離3’末端に付加される。
本明細書で使用される場合、「一過性」は、非統合導入遺伝子の数時間、数日、または数週間にわたる発現を指し、ここで、この発現期間は、ゲノムに統合された場合または宿主細胞内の安定したプラスミドレプリコン内に含有される場合の該遺伝子の発現期間より短い。
「シグナル伝達経路」という用語は、細胞の一方の部分から細胞の他方の部分へのシグナル伝達に役割を果たす種々のシグナル伝達分子間の生化学的関係を指す。「細胞表面受容体」という語句には、シグナルを受け取り、細胞膜を越えてシグナルを伝達することができる分子及び分子の複合体が含まれる。
「対象」という用語には、免疫応答が誘発され得る生体(例えば、哺乳動物、ヒト)が含まれることが意図される。
「実質的に精製された」細胞という用語は、他の細胞型を本質的に含まない細胞を指す。実質的に精製された細胞はまた、それが天然に存在する状態で通常会合する他の細胞型から分離されている細胞を指す。幾つかの場合では、実質的に精製された細胞の集団は、均質な細胞集団を指す。他の場合では、この用語は、単に、その天然の状態で天然に会合している細胞から分離されている細胞を指す。幾つかの態様では、該細胞は、in vitroで培養される。他の態様では、該細胞は、in vitroで培養されない。
「治療(の)(therapeutic)」という用語は、本明細書で使用される場合、治療(treatment)を意味する。治療効果は、病態の低減、阻害、寛解、または根絶によって得られる。
「予防(prophylaxis)という用語は、本明細書で使用される場合、疾患または病態の予防(prevention)または保護的治療を意味する。
本発明との関係において、「腫瘍抗原」または「過剰増殖性障害抗原」または「過剰増殖性障害に関連する抗原」は、特定の過剰増殖性障害に共通する抗原を指す。ある種の態様では、本発明の過剰増殖性障害抗原は、限定するものではないが、原発性または転移性黒色腫、胸腺腫、リンパ腫、肉腫、肺癌、肝臓癌、NHL、白血病、子宮癌、子宮頚癌、膀胱癌、腎臓癌、及び腺癌、例えば、乳癌、前立腺癌、卵巣癌、子宮頚癌、皮膚癌、膵癌、結腸直腸癌、腎癌、肝臓癌、脳癌、リンパ腫、白血病、肺癌、食道癌、胃癌、再発性または難治性疾患を有する切除不能な卵巣癌を含めた、がんに由来する。
「形質移入された」または「形質転換された」または「形質導入された」という用語は、外来核酸が宿主細胞内に移入されるまたは導入されるプロセスを指す。「形質移入された」または「形質転換された」または「形質導入された」細胞は、外来核酸によって形質移入された、形質転換された、または形質導入されたものである。該細胞には、初代対象細胞及びその子孫が含まれる。
「特異的に結合する」という用語は、試料中に存在する同族結合パートナー(例えば、BCMA)を認識し、結合するが、試料中の他の分子を必然的に及び実質的に認識または結合しない、抗体、抗体断片、または特異的リガンドを指す。
範囲:本開示を通して、本発明の様々な態様は、範囲の形式で提示され得る。範囲の形式での説明は単に便宜上及び簡潔さのためであり、本発明の範囲に対する確固たる限定と解釈されるべきではないことが理解されるものとする。したがって、範囲の説明は、その範囲内の個々の数値だけでなく、すべての可能な部分範囲を具体的に開示しているとみなされるものとする。例えば、1〜6などの範囲の説明は、その範囲内の個々の数字、例えば、1、2、2.7、3、4、5、5.3、及び6だけでなく、1〜3、1〜4、1〜5、2〜4、2〜6、3〜6などの部分範囲を具体的に開示しているとみなされるものとする。別の例として、95〜99%の同一性などの範囲は、95%、96%、97%、98%、または99%の同一性を有するものを含み、かつ96〜99%、96〜98%、96〜97%、97〜99%、97〜98%、及び98〜99%の同一性などの部分範囲を含む。これは、範囲の幅にかかわらず適用される。
2.T細胞受容体(TCR)融合タンパク質(TFP)
本発明は、TFPをコードする組み換えDNA構築物であって、該TFPが、特異的にBCMA、例えば、ヒトBCMAに結合する抗体断片を含み、該抗体断片の配列が、TCRサブユニットまたはその一部分をコードする核酸配列に隣接し、同じリーディングフレーム内にある、DNA構築物を包含する。本明細書で提供するTFPは、機能的TCR複合体を形成するために、1つまたは複数の内因性の(または代替的に、1つもしくは複数の外因性、または内因性と外因性との組み合わせの)TCRサブユニットと会合することができる。
本発明は、TFPをコードする組み換えDNA構築物であって、該TFPが、特異的にBCMA、例えば、ヒトBCMAに結合する抗体断片を含み、該抗体断片の配列が、TCRサブユニットまたはその一部分をコードする核酸配列に隣接し、同じリーディングフレーム内にある、DNA構築物を包含する。本明細書で提供するTFPは、機能的TCR複合体を形成するために、1つまたは複数の内因性の(または代替的に、1つもしくは複数の外因性、または内因性と外因性との組み合わせの)TCRサブユニットと会合することができる。
一態様では、本発明のTFPは、別名では抗原結合ドメインと呼ばれる、標的特異的結合エレメントを含む。部分の選択は、標的細胞の表面を定める標的抗原のタイプと数に依存する。例えば、抗原結合ドメインは、特定の病態に関連する標的細胞上の細胞表面マーカーとして作用する標的抗原を認識するように選択することができる。よって、本発明のTFP内の抗原結合ドメインの標的抗原として作用することができる細胞表面マーカーの例として、ウイルス感染症、細菌感染症、及び寄生虫感染症;自己免疫疾患;ならびにがん性疾患(例えば、悪性疾患)に関連するものが挙げられる。
一態様では、TFP媒介性T細胞応答は、所望の抗原に特異的に結合する抗原結合ドメインを操作してTFPに入れることによって、関心対象の抗原に指向させることができる。
一態様では、抗原結合ドメインを含むTFPの一部分は、BCMAを標的とする抗原結合ドメインを含む。一態様では、抗原結合ドメインは、ヒトBCMAを標的とする。
抗原結合ドメインは、抗原に結合する任意のドメインであってもよく、それらとして、モノクローナル抗体、ポリクローナル抗体、組み換え抗体、ヒト抗体、ヒト化抗体、及びそれらの機能的断片、例えば、限定するものではないが、単一ドメイン抗体、例えば、重鎖可変ドメイン(VH)、軽鎖可変ドメイン(VL)、及びラクダ科由来ナノボディの可変ドメイン(VHH)、ならびに抗原結合ドメインとして機能することが当技術分野で公知の代替の足場、例えば、組み換えフィブロネクチンドメイン、アンチカリン、DARPINなどが挙げられるが、これらに限定されない。同様に、標的抗原を特異的に認識し、結合する天然または合成リガンドを、TFPの抗原結合ドメインとして使用することができる。幾つかの場合では、抗原結合ドメインは、TFPが最終的に使用されることとなる種と同じ種に由来することが有益である。例えば、ヒトで使用する場合、TFPの抗原結合ドメインは、抗体または抗体断片の抗原結合ドメインにヒトまたはヒト化残基を含むことが有益であり得る。
よって、一態様では、抗原結合ドメインは、ヒト化もしくはヒト抗体もしくは抗体断片、またはマウス抗体もしくは抗体断片を含む。一実施形態では、ヒト化またはヒト抗BCMA結合ドメインは、本明細書に記載するヒト化またはヒト抗BCMA結合ドメインの1つまたは複数(例えば、3つすべて)の軽鎖相補性決定領域1(LC CDR1)、軽鎖相補性決定領域2(LC CDR2)、及び軽鎖相補性決定領域3(LC CDR3)、及び/または本明細書に記載するヒト化またはヒト抗BCMA結合ドメインの1つまたは複数(例えば、3つすべて)の重鎖相補性決定領域1(HC CDR1)、重鎖相補性決定領域2(HC CDR2)、及び重鎖相補性決定領域3(HC CDR3)を含み、例えば、ヒト化またはヒト抗BCMA結合ドメインは、1つまたは複数の、例えば3つすべてのLC CDR、及び1つまたは複数の、例えば3つすべてのHC CDRを含む。一実施形態では、ヒト化またはヒト抗BCMA結合ドメインは、本明細書に記載するヒト化またはヒト抗BCMA結合ドメインの1つまたは複数(例えば、3つすべて)の重鎖相補性決定領域1(HC CDR1)、重鎖相補性決定領域2(HC CDR2)、及び重鎖相補性決定領域3(HC CDR3)を含み、例えば、ヒト化またはヒト抗腫瘍関連抗原結合ドメインは、2つの可変重鎖領域を有し、各々が、本明細書に記載するHC CDR1、HC CDR2、及びHC CDR3を含む。一実施形態では、ヒト化またはヒト抗腫瘍関連抗原結合ドメインは、本明細書に記載するヒト化もしくはヒト軽鎖可変領域、及び/または本明細書に記載するヒト化もしくはヒト重鎖可変領域を含む。一実施形態では、ヒト化またはヒト抗腫瘍関連抗原結合ドメインは、本明細書に記載するヒト化重鎖可変領域、例えば、少なくとも2つの本明細書に記載するヒト化またはヒト重鎖可変領域を含む。一実施形態では、抗腫瘍関連抗原結合ドメインは、本明細書で提供するアミノ酸配列の軽鎖及び重鎖を含む、scFvである。ある実施形態では、抗腫瘍関連抗原結合ドメイン(例えば、scFvまたはVHH nb)は、本明細書で提供する軽鎖可変領域のアミノ酸配列の少なくとも1つ、2つ、もしくは3つの改変(例えば、置換)であるが、30、20、もしくは10以下の改変(例えば、置換)を有するアミノ酸配列、または本明細書で提供するアミノ酸配列に95〜99%の同一性を有する配列を含む軽鎖可変領域;及び/または本明細書で提供する重鎖可変領域のアミノ酸配列の少なくとも1つ、2つ、もしくは3つの改変(例えば、置換)であるが、30、20、もしくは10以下の改変(例えば、置換)を有するアミノ酸配列、または本明細書で提供するアミノ酸配列に対して95〜99%の同一性を有する配列を含む重鎖可変領域を含む。一実施形態では、ヒト化またはヒト抗腫瘍関連抗原結合ドメインはscFvであり、本明細書に記載するアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域が、本明細書に記載するアミノ酸配列を含む重鎖可変領域に、リンカー、例えば、本明細書に記載するリンカーを介して結合される。一実施形態では、ヒト化抗腫瘍関連抗原結合ドメインは、(Gly4−Ser)nリンカー(式中、nは、1、2、3、4、5、または6であり、好ましくは、3または4である)を含む。scFvの軽鎖可変領域及び重鎖可変領域は、例えば、次の配向:軽鎖可変領域−リンカー−重鎖可変領域または重鎖可変領域−リンカー−軽鎖可変領域のいずれかであり得る。幾つかの場合では、リンカー配列は、(G4S)n(式中、n=2〜4)を含む。幾つかの場合では、リンカー配列は、(G4S)n(式中、n=1〜3)を含む。
幾つかの態様では、非ヒト抗体はヒト化されており、この場合、抗体の特定の配列または領域が、ヒトにおいて天然に産生される抗体またはそれらの断片に対する類似性を増大させるように改変されている。一態様では、抗原結合ドメインは、ヒト化されている。
ヒト化抗体は、当技術分野で公知の種々の技法を使用して生成することができ、それらとして、CDR移植(例えば、欧州特許第EP239,400号;国際公開第WO91/09967号;ならびに米国特許第5,225,539号、第5,530,101号、及び第5,585,089号(これらの各々は、参照によりその全体が本明細書に援用される)を参照されたい)、ベニアリングまたはリサーフェシング(例えば、欧州特許第EP592,106号及び第EP519,596号;Padlan,1991,Molecular Immunology,28(4/5):489−498;Studnicka et al.,1994,Protein Engineering,7(6):805−814;ならびにRoguska et al.,1994,PNAS,91:969−973(これらの各々は、参照によりその全体が本明細書に援用される)を参照されたい)、鎖シャッフリング(例えば、米国特許第5,565,332号(参照によりその全体が本明細書に援用される)を参照されたい)、ならびに、例えば、米国特許出願公開第US2005/0042664号、米国特許出願公開第US2005/0048617号、米国特許第6,407,213号、米国特許第5,766,886号、国際公開第WO9317105号、Tan et al.,J.Immunol.,169:1119−25(2002)、Caldas et al.,Protein Eng.,13(5):353−60(2000)、Morea et al.,Methods,20(3):267−79(2000)、Baca et al.,J.Biol.Chem.,272(16):10678−84(1997)、Roguska et al.,Protein Eng.,9(10):895−904(1996)、Couto et al.,Cancer Res.,55(23 Supp):5973s−5977s(1995)、Couto et al.,Cancer Res.,55(8):1717−22(1995)、Sandhu J S,Gene,150(2):409−10(1994)、及びPedersen et al.,J.Mol.Biol.,235(3):959−73(1994)(これらの各々は、参照によりその全体が本明細書に援用される)に開示される技法が挙げられるが、これらに限定されない。多くの場合、フレームワーク領域内のフレームワーク残基は、例えば、抗原結合を変更する、例えば向上させるために、CDRドナー抗体に由来する対応する残基で置換される。これらのフレームワーク置換は、当技術分野で周知の方法によって特定され、例えば、CDRとフレームワーク残基との相互作用をモデル化して抗原結合に重要なフレームワーク残基を特定し、配列を比較して、特定の位置にある他とは異なるフレームワーク残基を特定することによって行われる(例えば、Queen et al.,米国特許第5,585,089号;及びRiechmann et al.,1988,Nature,332:323(これらは参照によりそれらの全体が本明細書に援用される)を参照されたい)。
ヒト化抗体または抗体断片は、その中に残留する非ヒト源に由来する1つまたは複数のアミノ酸残基を含む。これらの非ヒトアミノ酸残基は、「移入」残基と呼ばれることが多く、典型的には「移入」可変ドメインから得られる。本明細書で提供する場合、ヒト化抗体または抗体断片は、非ヒト免疫グロブリン分子に由来する1つまたは複数のCDR、及びフレームワーク領域を含み、ここで、フレームワークを構成するアミノ酸残基は、完全にまたはほとんどヒト生殖細胞系列に由来する。抗体または抗体断片をヒト化する複数の技法が当技術分野で周知であり、本質的にはWinter及び共同研究者による方法に従って(Jones et al.,Nature,321:522−525(1986);Riechmann et al.,Nature,332:323−327(1988);Verhoeyen et al.,Science,239:1534−1536(1988))、げっ歯類のCDRまたはCDR配列を、対応するヒト抗体の配列の代わりに置換することによって、すなわちCDR移植によって実施することができる(EP239,400;PCT公開第WO91/09967号;及び米国特許第4,816,567号;第6,331,415号;第5,225,539号;第5,530,101号;第5,585,089号;第6,548,640号(それらの内容は、参照によりそれらの全体が本明細書に援用される)。そのようなヒト化抗体及び抗体断片では、インタクトなヒト可変ドメインより実質的に小さい部分が、非ヒト種由来の対応する配列によって置換されている。ヒト化抗体は、幾つかのCDR残基及び場合により幾つかのフレームワーク(FR)残基がげっ歯類抗体の類似部位に由来する残基によって置換されているヒト抗体であることが多い。抗体及び抗体断片のヒト化は、ベニアリングもしくはリサーフェシング(EP592,106;EP519,596;Padlan,1991,Molecular Immunology,28(4/5):489−498;Studnicka et al.,Protein Engineering,7(6):805−814(1994);及びRoguska et al.,PNAS,91:969−973(1994))、または鎖シャッフリング(米国特許第5,565,332号)によっても実現することができる(これらの内容は、その全体が参照により本明細書に援用される)。
ヒト化抗体の作製に使用される軽鎖及び重鎖両方のヒト可変ドメインを選択するのは、抗原性を低減させるためである。いわゆる「ベストフィット」法に従って、げっ歯類抗体の可変ドメインの配列が、公知のヒト可変ドメイン配列のライブラリー全体に対してスクリーニングされる。次いで、げっ歯類のものに最も近いヒト配列が、ヒト化抗体用のヒトフレームワーク(FR)として認められる(Sims et al.,J.Immunol.,151:2296(1993);Chothia et al.,J.Mol.Biol.,196:901(1987)(これらの内容は、その全体が参照により本明細書に援用される))。別の方法は、軽鎖または重鎖の特定のサブグループのすべてのヒト抗体のコンセンサス配列に由来する特定のフレームワークを使用する。同じフレームワークが、幾つかの異なるヒト化抗体に使用されてもよい(例えば、Nicholson et al.Mol.Immun.34(16−17):1157−1165(1997);Carter et al.,Proc.Natl.Acad.Sci.USA,89:4285(1992);Presta et al.,J.Immunol.,151:2623(1993)(これらの内容は、その全体が参照により本明細書に援用される)を参照されたい)。幾つかの実施形態では、重鎖可変領域のフレームワーク領域、例えば、4つすべてのフレームワーク領域は、VH4−4−59生殖細胞系列配列に由来する。一実施形態では、フレームワーク領域は、対応するマウス配列のアミノ酸に由来する1つ、2つ、3つ、4つ、または5つの改変、例えば置換を含むことができる。一実施形態では、軽鎖可変領域のフレームワーク領域、例えば4つすべてのフレームワーク領域は、VK3−1.25生殖細胞系列配列に由来する。一実施形態では、フレームワーク領域は、対応するマウス配列のアミノ酸に由来する1つ、2つ、3つ、4つ、または5つの改変、例えば置換を含むことができる。
幾つかの態様では、抗体断片を含む本発明のTFP組成物の一部分は、標的抗原に対する高親和性及び他の好適な生物学的特性を保持したままヒト化される。本発明の一態様によれば、ヒト化抗体及び抗体断片は、親及びヒト化配列の三次元モデルを使用して、親配列及び様々な概念的ヒト化産物を解析するプロセスによって調製される。三次元免疫グロブリンモデルは、一般に利用可能であり、当業者にはよく知られている。選択された候補免疫グロブリン配列の推定三次元立体配座構造を図解し、表示するコンピュータプログラムが利用可能である。これらの表示を詳細に調べることによって、候補免疫グロブリン配列の機能における残基の考えられる役割の解析、例えば、候補免疫グロブリンが標的抗原に結合する能力に影響を与える残基の解析が可能になる。このようにして、FR残基は、標的抗原に対する親和性の増大などの所望の抗体または抗体断片の特性が実現されるように、レシピエント及び移入配列から選択し、組み合わせることができる。一般に、CDR残基は、抗原結合への影響に直接的かつ最も実質的に関与している。
一態様では、抗腫瘍関連抗原結合ドメインは、断片、例えば、一本鎖可変断片(scFv)またはラクダ科重鎖(VHH)である。一態様では、抗腫瘍関連抗原結合ドメインは、Fv、Fab、(Fab’)2、または二機能性(例えば、二重特異性)ハイブリッド抗体である(例えば、Lanzavecchia et al.,Eur.J.Immunol.17,105(1987))。一態様では、本発明の抗体及びその断片は、野生型または親和性が強化された腫瘍関連抗原タンパク質と結合する。
本明細書で提供するのはまた、標的抗原(例えば、BCMA、または融合部分結合ドメインの標的に関して本明細書に別途記載する任意の標的抗原)に特異的な抗体抗原結合ドメインを得るための方法であり、該方法は、本明細書に述べるVH(またはVHH)ドメインのアミノ酸配列内の1つまたは複数のアミノ酸の付加、欠失、置換、または挿入によって、VHドメインのアミノ酸配列変異体であるVHドメインを用意すること、任意選択によりこのようにして用意したVHドメインを1つまたは複数のVLドメインと組み合わせること、及びVHドメインまたはVH/VLの組み合わせ(1つまたは複数)を試験して、関心対象の標的抗原(例えば、BCMA)に特異的であり、任意選択により1つまたは複数の所望の特性を有する、特異的結合メンバーまたは抗体抗原結合ドメインを特定することを含む。
幾つかの場合、VHドメイン及びscFvは、当技術分野で公知の方法に従って調製することができる(例えば、Bird et al.,(1988)Science 242:423−426、及びHuston et al.,(1988)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 85:5879−5883を参照されたい)。scFv分子は、フレキシブルポリペプチドリンカーを使用して、VH及びVL領域を一緒に連結することによって生成することができる。scFv分子は、最適化された長さ及び/またはアミノ酸組成のリンカー(例えば、Ser−Glyリンカー)を含む。リンカーの長さは、scFvの可変領域がどのように折り畳まれ、相互作用するかに大きく影響を与え得る。実際、短いポリペプチドリンカーが用いられるならば(例えば、5〜10のアミノ酸)、鎖内の折り畳みは妨げられる。鎖間の折り畳みも、2つの可変領域を一緒にして機能的エピトープ結合部位を形成するために必要とされる。幾つかの場合では、リンカー配列は、(G4S)n(式中、n=2〜4)を含む。幾つかの場合では、リンカー配列は、(G4S)n(式中、n=1〜3)を含む。リンカーの配向及びサイズの例については、Hollinger et al.1993 Proc Natl Acad.Sci.U.S.A.90:6444−6448、米国特許出願公開第2005/0100543号、第2005/0175606号、第2007/0014794号、ならびにPCT公開第WO2006/020258号及び第WO2007/024715号(これらは、参照により本明細書に援用される)を参照されたい。
scFvは、そのVL領域とVH領域との間に、約10、11、12、13、14、15、または15個超の残基のリンカーを含むことができる。リンカー配列は、任意の天然に存在するアミノ酸を含んでもよい。幾つかの実施形態では、リンカー配列は、アミノ酸のグリシン及びセリンを含む。別の実施形態では、リンカー配列は、(Gly4Ser)n(式中、nは、1以上の正の整数である)などのグリシンとセリンとの組の繰返しを含む。一実施形態では、リンカーは、(Gly4Ser)4または(Gly4Ser)3であり得る。リンカーの長さを変動させると、活性を保持または強化することができ、それによって活性試験において優れた効力が生じる。幾つかの場合では、リンカー配列は、(G4S)n(式中、n=2〜4)を含む。幾つかの場合では、リンカー配列は、(G4S)n(式中、n=1〜3)を含む。
3.安定性及び変異
抗腫瘍関連抗原結合ドメイン、例えば、scFv分子(例えば、可溶性scFv)の安定性は、従来の対照scFv分子または完全長抗体の生物物理学的特性(例えば、熱安定性)を基準にして評価することができる。一実施形態では、ヒト化またはヒトscFvは、記載するアッセイにおいて、親のscFvより約0.1、約0.25、約0.5、約0.75、約1、約1.25、約1.5、約1.75、約2、約2.5、約3、約3.5、約4、約4.5、約5、約5.5、約6、約6.5、約7、約7.5、約8、約8.5、約9、約9.5、約10℃、約11℃、約12℃、約13℃、約14℃、または約15℃高い熱安定性を有する。
抗腫瘍関連抗原結合ドメイン、例えば、scFv分子(例えば、可溶性scFv)の安定性は、従来の対照scFv分子または完全長抗体の生物物理学的特性(例えば、熱安定性)を基準にして評価することができる。一実施形態では、ヒト化またはヒトscFvは、記載するアッセイにおいて、親のscFvより約0.1、約0.25、約0.5、約0.75、約1、約1.25、約1.5、約1.75、約2、約2.5、約3、約3.5、約4、約4.5、約5、約5.5、約6、約6.5、約7、約7.5、約8、約8.5、約9、約9.5、約10℃、約11℃、約12℃、約13℃、約14℃、または約15℃高い熱安定性を有する。
抗腫瘍関連抗原結合ドメイン、例えばscFvの熱安定性の向上は、次に腫瘍関連抗原−TFP構築物全体にもたらされ、抗腫瘍関連抗原TFP構築物の治療特性の向上につながる。抗腫瘍関連抗原結合ドメイン、例えば、scFvの熱安定は、従来の抗体と比較したときに少なくとも約2℃または3℃向上し得る。一実施形態では、抗腫瘍関連抗原結合ドメイン、例えば、scFvは、従来の抗体と比較したときに1℃向上した熱安定性を有する。別の実施形態では、抗腫瘍関連抗原結合ドメイン、例えば、scFvは、従来の抗体と比較したときに2℃向上した熱安定性を有する。別の実施形態では、scFvは、従来の抗体と比較したときに4℃、5℃、6℃、7℃、8℃、9℃、10℃、11℃、12℃、13℃、14℃、または15℃向上した熱安定性を有する。比較は、例えば、本明細書に開示するscFv分子と、該scFvのVH及びVLが由来する抗体のscFv分子またはFab断片との間で行うことができる。熱安定性は、当技術分野で公知の方法を使用して測定することができる。例えば、一実施形態では、TMを測定することができる。TMを測定する方法及びタンパク質の安定性を決定する他の方法は、後述する。
scFvの変異(可溶性scFvのヒト化または変異誘発を通して生じる)によって、scFvの安定性が変更され、scFv及び抗腫瘍関連抗原TFP構築物の全体的な安定性が向上する。ヒト化scFvの安定性は、TM、温度変性、及び温度凝集などの測定値を使用してマウスscFvと比較される。一実施形態では、抗腫瘍関連抗原結合ドメイン、例えば、scFvは、ヒト化プロセスから生じる少なくとも1つの変異を含み、それによって、変異したscFvが抗腫瘍関連抗原TFP構築物に安定性の向上をもたらすようになる。別の実施形態では、抗腫瘍関連抗原結合ドメイン、例えば、scFvは、ヒト化プロセスから生じる少なくとも1、2、3、4、5、6、7、8、9、10の変異を含み、それによって、変異したscFvが抗腫瘍関連抗原TFP−構築物に安定性の向上をもたらすようになる。
一態様では、TFPの抗原結合ドメインは、本明細書に記載する抗原結合ドメインのアミノ酸配列と相同なアミノ酸配列を含み、該抗原結合ドメインは、本明細書に記載する抗腫瘍関連抗原抗体断片の所望の機能特性を保持する。特定の一態様では、本発明のTFP組成物は、抗体断片を含む。さらなる態様では、その抗体断片は、scFvを含む。
様々な態様では、TFPの抗原結合ドメインは、一方または両方の可変領域(例えば、VH及び/またはVL)内、例えば、1つもしくは複数のCDR領域内及び/または1つもしくは複数のフレームワーク領域内の1つもしくは複数のアミノ酸を改変することによって操作される。特定の一態様では、本発明のTFP組成物は、抗体断片を含む。さらなる態様では、その抗体断片は、scFvを含む。
当業者であれば、本発明の抗体または抗体断片をさらに改変して、アミノ酸配列が(例えば、野生型から)変動しているが、所望の活性が変動していないようにすることができることを理解するであろう。例えば、「可欠」アミノ酸残基でアミノ酸置換を生じる追加のヌクレオチド置換が、タンパク質に施されてもよい。例えば、分子中の可欠アミノ酸残基は、同じ側鎖ファミリーに由来する別のアミノ酸残基で置きかえられてもよい。別の実施形態では、アミノ酸の鎖を、側鎖ファミリーメンバーの順序及び/または組成が異なる構造的に類似した鎖で置きかえることができ、例えば、アミノ酸残基が、類似の側鎖を有するアミノ酸残基で置きかえられる保存的置換がなされてもよい。
類似の側鎖を有するアミノ酸残基のファミリーは、当技術分野で定義されており、それらには、塩基性側鎖(例えば、リジン、アルギニン、ヒスチジン)、酸性側鎖(例えば、アスパラギン酸、グルタミン酸)、非荷電極性側鎖(例えば、グリシン、アスパラギン、グルタミン、セリン、トレオニン、チロシン、システイン)、非極性側鎖(例えば、アラニン、バリン、ロイシン、イソロイシン、プロリン、フェニルアラニン、メチオニン、トリプトファン)、ベータ分枝側鎖(例えば、トレオニン、バリン、イソロイシン)、及び芳香族側鎖(例えば、チロシン、フェニルアラニン、トリプトファン、ヒスチジン)が含まれる。
2つ以上の核酸またはポリペプチド配列の関係における同一性の割合(%)は、同じである2つ以上の配列を指す。2つの配列は、以下の配列比較アルゴリズムのうちの1つを使用して、または手動アラインメント及び目視検査によって、比較域または指定領域にわたって最大の一致が得られるように比較し、整列させたときに、2つの配列が特定の割合(%)の同じアミノ酸残基またはヌクレオチドを有するならば(例えば、特定の領域にわたって、または特定されていないときは配列全体にわたって、60%の同一性、任意選択により70%、71%、72%、73%、74%、75%、76%、77%、78%、79%、80%、81%、82%、83%、84%、85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、または99%の同一性)、「実質的に同一」である。任意選択により、同一性は、少なくとも約50ヌクレオチド長(または10アミノ酸長)の領域にわたって、またはより好ましくは100〜500もしくは1000以上のヌクレオチド長(または20、50、200以上のアミノ酸長)の領域にわたって存在する。
配列比較については、典型的には1つの配列が参照配列として機能し、それに対して試験配列が比較される。配列比較アルゴリズムを使用するとき、試験配列及び参照配列をコンピュータに入力し、必要であれば部分配列の座標を指定し、配列アルゴリズムプログラムのパラメータを指定する。デフォルトのプログラムパラメータを使用してもよいし、または代替のパラメータを指定してもよい。次いで、配列比較アルゴリズムは、プログラムパラメータに基づいて、参照配列に対する試験配列の配列同一性の割合(%)を算出する。比較のための配列のアラインメント方法は、当技術分野で周知である。比較のための最適な配列のアラインメントは、例えば、Smith and Waterman,(1970) Adv.Appl.Math.2:482cの局所相同性アルゴリズム、Needleman and Wunsch,(1970)J.Mol.Biol.48:443の相同性アラインメントアルゴリズム、Pearson and Lipman,(1988)Proc Nat’l.Acad.Sci.USA 85:2444の類似性検索法、コンピュータによるこれらのアルゴリズムの実行(Wisconsin Genetics Software PackageにおけるGAP、BESTFIT、FASTA、及びTFASTA、Genetics Computer Group,575 Science Dr.,Madison,Wis.)、または手動アラインメント及び目視検査(例えば、Brent et al.,(2003)Current Protocols in Molecular Biologyを参照されたい)によって実施することができる。配列同一性の割合(%)及び配列類似性を決定するのに適したアルゴリズムの2つの例は、BLAST及びBLAST2.0アルゴリズムであり、これらは、Altschul et al.,(1977)Nuc.Acids Res.25:3389−3402;及びAltschul et al.,(1990)J.Mol.Biol.215:403−410にそれぞれ記載されている。BLAST解析を実施するためのソフトウェアは、国立バイオテクノロジー情報センター(National Center for Biotechnology Information)を通して公的に利用可能である。
一態様では、本発明は、機能的に同等な分子を生成する、出発抗体または断片(例えば、scFv)のアミノ酸配列の改変を企図する。例えば、TFPに含まれる抗腫瘍関連抗原結合ドメイン、例えば、scFvのVHまたはVLは、抗腫瘍関連抗原結合ドメイン、例えば、scFvの出発VHまたはVLフレームワーク領域の少なくとも約70%、71%、72%、73%、74%、75%、76%、77%、78%、79%、80%、81%、82%、83%、84%、85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%の同一性を保持するように改変することができる。本発明は、機能的に同等な分子を生成するための、TFP構築物全体の改変、例えば、TFP構築物の様々なドメインの1つまたは複数のアミノ酸配列における改変を企図する。TFP構築物は、出発TFP構築物の少なくとも約70%、71%、72%、73%、74%、75%、76%、77%、78%、79%、80%、81%、82%、83%、84%、85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、または99%の同一性を保持するように改変することができる。
4.細胞外ドメイン
細胞外ドメインは、天然源由来または組み換え源由来のいずれであってもよい。その源が天然である場合、該ドメインはいずれのタンパク質に由来してもよいが、特に、膜結合または膜貫通タンパク質に由来してもよい。一態様では、細胞外ドメインは、膜貫通ドメインと会合することができる。本発明に特に有用な細胞外ドメインは、少なくとも、例えば、T細胞受容体のアルファ、ベータ、もしくはゼータ鎖、またはCD3イプシロン、CD3ガンマ、もしくはCD3デルタ、あるいは、代替実施形態では、CD28、CD45、CD4、CD5、CD8、CD9、CD16、CD22、CD33、CD37、CD64、CD80、CD86、CD134、CD137、CD154の細胞外領域(複数可)を含んでもよい。
細胞外ドメインは、天然源由来または組み換え源由来のいずれであってもよい。その源が天然である場合、該ドメインはいずれのタンパク質に由来してもよいが、特に、膜結合または膜貫通タンパク質に由来してもよい。一態様では、細胞外ドメインは、膜貫通ドメインと会合することができる。本発明に特に有用な細胞外ドメインは、少なくとも、例えば、T細胞受容体のアルファ、ベータ、もしくはゼータ鎖、またはCD3イプシロン、CD3ガンマ、もしくはCD3デルタ、あるいは、代替実施形態では、CD28、CD45、CD4、CD5、CD8、CD9、CD16、CD22、CD33、CD37、CD64、CD80、CD86、CD134、CD137、CD154の細胞外領域(複数可)を含んでもよい。
5.膜貫通ドメイン
一般に、TFP配列は、単一のゲノム配列によってコードされる細胞外ドメイン及び膜貫通ドメインを含有する。代替実施形態では、TFPは、TFPの細胞外ドメインとは異種の膜貫通ドメインを含むように設計することができる。膜貫通ドメインは、膜貫通領域に隣接した1つまたは複数の追加のアミノ酸、例えば、膜貫通が由来するタンパク質の細胞外領域に会合した1つまたは複数のアミノ酸(例えば、細胞外領域の少なくとも1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、またはそれ以上のアミノ酸)、及び/または膜貫通タンパク質が由来したタンパク質の細胞内領域に会合する1つまたは複数の追加のアミノ酸(例えば、細胞内領域の1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、またはそれ以上のアミノ酸)を含むことができる。ある場合には、膜貫通ドメインは、細胞外領域の少なくとも30、35、40、45、50、55、60、またはそれ以上のアミノ酸を含むことができる。ある場合には、膜貫通ドメインは、細胞内領域の少なくとも30、35、40、45、50、55、60、またはそれ以上のアミノ酸を含むことができる。一態様では、膜貫通ドメインは、使用されるTFPの他のドメインのうちの1つに会合しているものである。幾つかの場合では、膜貫通ドメインは、そのようなドメインが同じまたは異なる表面膜タンパク質の膜貫通ドメインに結合しないように、例えば、受容体複合体の他のメンバーとの相互作用を最低限に抑えるように選択したり、またはアミノ酸置換によって改変したりすることができる。一態様では、膜貫通ドメインを、TFP T細胞表面上の別のTFPとホモ二量体化することができる。異なる態様では、膜貫通ドメインのアミノ酸配列は、同じTFPに存在する本来の結合パートナーの結合ドメインとの相互作用を最低限に抑えるように改変または置換されてもよい。
一般に、TFP配列は、単一のゲノム配列によってコードされる細胞外ドメイン及び膜貫通ドメインを含有する。代替実施形態では、TFPは、TFPの細胞外ドメインとは異種の膜貫通ドメインを含むように設計することができる。膜貫通ドメインは、膜貫通領域に隣接した1つまたは複数の追加のアミノ酸、例えば、膜貫通が由来するタンパク質の細胞外領域に会合した1つまたは複数のアミノ酸(例えば、細胞外領域の少なくとも1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、またはそれ以上のアミノ酸)、及び/または膜貫通タンパク質が由来したタンパク質の細胞内領域に会合する1つまたは複数の追加のアミノ酸(例えば、細胞内領域の1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、またはそれ以上のアミノ酸)を含むことができる。ある場合には、膜貫通ドメインは、細胞外領域の少なくとも30、35、40、45、50、55、60、またはそれ以上のアミノ酸を含むことができる。ある場合には、膜貫通ドメインは、細胞内領域の少なくとも30、35、40、45、50、55、60、またはそれ以上のアミノ酸を含むことができる。一態様では、膜貫通ドメインは、使用されるTFPの他のドメインのうちの1つに会合しているものである。幾つかの場合では、膜貫通ドメインは、そのようなドメインが同じまたは異なる表面膜タンパク質の膜貫通ドメインに結合しないように、例えば、受容体複合体の他のメンバーとの相互作用を最低限に抑えるように選択したり、またはアミノ酸置換によって改変したりすることができる。一態様では、膜貫通ドメインを、TFP T細胞表面上の別のTFPとホモ二量体化することができる。異なる態様では、膜貫通ドメインのアミノ酸配列は、同じTFPに存在する本来の結合パートナーの結合ドメインとの相互作用を最低限に抑えるように改変または置換されてもよい。
膜貫通ドメインは、天然源由来または組み換え源由来のいずれであってもよい。その源が天然である場合、該ドメインは、いずれの膜結合または膜貫通タンパク質に由来してもよい。一態様では、膜貫通ドメインは、TFPが標的に結合したときは必ず細胞内ドメイン(複数可)にシグナル伝達することができる。本発明に特に有用な膜貫通ドメインは、少なくとも、例えば、T細胞受容体のアルファ、ベータ、もしくはゼータ鎖、またはCD28、CD3イプシロン、CD45、CD4、CD5、CD8、CD9、CD16、CD22、CD33、CD37、CD64、CD80、CD86、CD134、CD137、CD154の膜貫通領域(複数可)を含んでもよい。
幾つかの場合では、膜貫通ドメインは、ヒンジ、例えば、ヒトタンパク質に由来するヒンジを介して、TFPの細胞外領域、例えば、TFPの抗原結合ドメインに結合することができる。例えば、一実施形態では、ヒンジは、ヒト免疫グロブリン(Ig)のヒンジ、例えば、IgG4のヒンジ、またはCD8aのヒンジであり得る。
6.リンカー
任意選択により、2〜10のアミノ酸長の短いオリゴペプチドまたはポリペプチドリンカーが、TFPの膜貫通ドメインと細胞質領域の間の連結を形成してもよい。グリシン−セリンのダブレットは、特に適切なリンカーを提供する。例えば、一態様では、リンカーは、GGGGSGGGGSのアミノ酸配列を含む。幾つかの実施形態では、リンカーは、GGTGGCGGAGGTTCTGGAGGTGGAGGTTCCのヌクレオチド配列によってコードされる。
任意選択により、2〜10のアミノ酸長の短いオリゴペプチドまたはポリペプチドリンカーが、TFPの膜貫通ドメインと細胞質領域の間の連結を形成してもよい。グリシン−セリンのダブレットは、特に適切なリンカーを提供する。例えば、一態様では、リンカーは、GGGGSGGGGSのアミノ酸配列を含む。幾つかの実施形態では、リンカーは、GGTGGCGGAGGTTCTGGAGGTGGAGGTTCCのヌクレオチド配列によってコードされる。
7.細胞質ドメイン
TFPの細胞質ドメインは、TFPがCD3ガンマ、デルタ、またはイプシロンポリペプチドを含有するならば、細胞内シグナル伝達ドメインを含むことができる。TCRアルファ及びTCRベータサブユニットは、一般に、シグナル伝達ドメインを欠いている。細胞内シグナル伝達ドメインは、一般に、TFPが導入された免疫細胞の正常なエフェクター機能のうちの少なくとも1つの活性化に関与する。「エフェクター機能」という用語は、細胞の特殊化された機能を指す。T細胞のエフェクター機能は、例えば、細胞溶解活性、またはサイトカインの分泌を含めたヘルパー活性であり得る。よって、「細胞内シグナル伝達ドメイン」という用語は、エフェクター機能シグナルを伝達し、細胞に特殊化された機能を果たすように指示する、タンパク質の部分を指す。通常、細胞内シグナル伝達ドメイン全体を用いることができるが、多くの場合、鎖全体を使用する必要はない。細胞内シグナル伝達ドメインの切断部分が使用される限りにおいて、エフェクター機能シグナルを伝達するのであれば、そのような切断部分がインタクトな鎖の代わりに使用されてもよい。よって、細胞内シグナル伝達ドメインという用語には、エフェクター機能シグナルを伝達するのに十分な細胞内シグナル伝達ドメインの任意の切断部分が含まれることを意味する。
TFPの細胞質ドメインは、TFPがCD3ガンマ、デルタ、またはイプシロンポリペプチドを含有するならば、細胞内シグナル伝達ドメインを含むことができる。TCRアルファ及びTCRベータサブユニットは、一般に、シグナル伝達ドメインを欠いている。細胞内シグナル伝達ドメインは、一般に、TFPが導入された免疫細胞の正常なエフェクター機能のうちの少なくとも1つの活性化に関与する。「エフェクター機能」という用語は、細胞の特殊化された機能を指す。T細胞のエフェクター機能は、例えば、細胞溶解活性、またはサイトカインの分泌を含めたヘルパー活性であり得る。よって、「細胞内シグナル伝達ドメイン」という用語は、エフェクター機能シグナルを伝達し、細胞に特殊化された機能を果たすように指示する、タンパク質の部分を指す。通常、細胞内シグナル伝達ドメイン全体を用いることができるが、多くの場合、鎖全体を使用する必要はない。細胞内シグナル伝達ドメインの切断部分が使用される限りにおいて、エフェクター機能シグナルを伝達するのであれば、そのような切断部分がインタクトな鎖の代わりに使用されてもよい。よって、細胞内シグナル伝達ドメインという用語には、エフェクター機能シグナルを伝達するのに十分な細胞内シグナル伝達ドメインの任意の切断部分が含まれることを意味する。
本発明のTFPに使用される細胞内シグナル伝達ドメインの例として、T細胞受容体(TCR)及び抗原受容体の関与に続いてシグナル伝達を開始するように協調して作用する共受容体の細胞質配列、ならびにこれらの配列の任意の誘導体または変異体、及び同じ機能的能力を有する任意の組み換え配列が挙げられる。
TCRのみを通して生成されるシグナルはナイーブT細胞の完全な活性化には不十分であり、二次及び/または共刺激シグナルが必要とされることが公知である。よって、ナイーブT細胞の活性化は、2つの別個のクラスの細胞質シグナル伝達配列、すなわち、TCRを通して抗原依存性の一次活性化を開始するもの(一次細胞内シグナル伝達ドメイン)、及び抗原非依存的に作用して二次または共刺激シグナルをもたらすもの(二次細胞質ドメイン、例えば、共刺激ドメイン)によって媒介されると言うことができる。
一次シグナル伝達ドメインは、刺激的または抑制的のいずれかで、TCR複合体の一次活性化を制御する。刺激的に作用する一次細胞内シグナル伝達ドメインは、免疫受容活性化チロシンモチーフ(ITAM)として公知のシグナル伝達モチーフを含有し得る。
本発明に特に有用な、ITAMを含有する一次細胞内シグナル伝達ドメインの例として、CD3ゼータ、FcRガンマ、FcRベータ、CD3ガンマ、CD3デルタ、CD3イプシロン、CD5、CD22、CD79a、CD79b、及びCD66dのものが挙げられる。一実施形態では、本発明のTFPは、細胞内シグナル伝達ドメイン、例えば、CD3イプシロンの一次シグナル伝達ドメインを含む。一実施形態では、一次シグナル伝達ドメインは、改変されたITAMドメイン、例えば、本来のITAMドメインと比較して変更された(例えば、増大されたまたは減少された)活性を有する変異ITAMドメインを含む。一実施形態では、一次シグナル伝達ドメインは、改変されたITAMを含有する一次細胞内シグナル伝達ドメイン、例えば、最適化された及び/または切断されたITAMを含有する一次細胞内シグナル伝達ドメインを含む。ある実施形態では、一次シグナル伝達ドメインは、1、2、3、4、またはそれ以上のITAMモチーフを含む。
TFPの細胞内シグナル伝達ドメインは、CD3ゼータシグナル伝達ドメインをそれ自体で含むことができ、またはそれを、本発明のTFPとの関係において有用な任意の他の所望の細胞内シグナル伝達ドメイン(複数可)を組み合わせることができる。例えば、TFPの細胞内シグナル伝達ドメインは、CD3イプシロン鎖部分と共刺激シグナル伝達ドメインとを含むことができる。共刺激シグナル伝達ドメインは、共刺激分子の細胞内ドメインを含む、TFPの一部分を指す。共刺激分子は、抗原に対するリンパ球の効率的な応答に必要とされる、抗原受容体またはそのリガンド以外の細胞表面分子である。そのような分子の例として、CD27、CD28、4−1BB(CD137)、OX40、CD30、CD40、PD1、ICOS、リンパ球機能関連抗原1(LFA−1)、CD2、CD7、LIGHT、NKG2C、B7−H3、及びCD83に特異的に結合するリガンドなどが挙げられる。例えば、CD27の共刺激は、ヒトTFP−T細胞のin vitroでの拡大、エフェクター機能、及び生存を強化することが実証されており、ヒトT細胞のin vivoでの持続性及び抗腫瘍活性を増強する(Song et al.Blood.2012;119(3):696−706)。
本発明のTFPの細胞質部分内の細胞内シグナル伝達配列は、ランダムなまたは特定の順序で互いに連結されてもよい。任意選択により、例えば、2〜10アミノ酸長(例えば、2、3、4、5、6、7、8、9、または10アミノ酸長)の、短いオリゴペプチドまたはポリペプチドリンカーによって、細胞内シグナル伝達配列間の連結が形成されてもよい。
一実施形態では、グリシン−セリンのダブレットを、適切なリンカーとして使用することができる。一実施形態では、単一のアミノ酸、例えば、アラニン、グリシンを、適切なリンカーとして使用することができる。
一態様では、本明細書に記載するTFP発現細胞は、第2のTFP、例えば、異なる抗原結合ドメイン、例えば、同じ標的(例えば、MUC16またはMSLN)または異なる標的(例えば、MUC16またはMSLN)に対するものを含む第2のTFPをさらに含むことができる。一実施形態では、TFP発現細胞が2つ以上の異なるTFPを含むとき、異なるTFPの抗原結合ドメインは、抗原結合ドメインが互いに相互作用しないようなものであり得る。例えば、第1及び第2のTFPを発現する細胞は、第1のTFPの抗原結合ドメインを、例えば、断片、例えば、scFvとして含むことができ、これは、第2のTFPの抗原結合ドメインと会合しないものであり、例えば、第2のTFPの抗原結合ドメインは、VHHである。
別の態様では、本明細書に記載するTFP発現細胞は、別の作用物質、例えば、TFP発現細胞の活性を強化する作用物質をさらに発現することができる。例えば、一実施形態では、作用物質は、抑制分子を阻害する作用物質であり得る。抑制分子、例えば、PD1は、幾つかの実施形態では、TFP発現細胞の免疫エフェクター応答開始能力を減少させることがある。抑制分子の例として、PD1、PD−L1、CTLA4、TIM3、LAG3、VISTA、BTLA、TIGIT、LAIR1、CD160、2B4、及びTGFRベータが挙げられる。一実施形態では、抑制分子を阻害する作用物質は、第1のポリペプチド、例えば、抑制分子を含み、それは、細胞に正のシグナルをもたらす第2のポリペプチド、例えば、本明細書に記載する細胞内シグナル伝達ドメインに会合している。一実施形態では、作用物質は、例えば、PD1、LAG3、CTLA4、CD160、BTLA、LAIR1、TIM3、2B4、及びTIGITなどの抑制分子またはこれらのいずれかの断片(例えば、これらのいずれかの細胞外ドメインの少なくとも一部分)の第1のポリペプチドと、本明細書に記載する細胞内シグナル伝達ドメイン(例えば、共刺激ドメインを含むもの(例えば、4−1BB、CD27、またはCD28、例えば、本明細書に記載するようなもの)及び/または一次シグナル伝達ドメイン(例えば、本明細書に記載するCD3ゼータシグナル伝達ドメイン)である第2のポリペプチドとを含む。一実施形態では、作用物質は、PD1またはその断片(例えば、PD1の細胞外ドメインの少なくとも一部分)の第1のポリペプチドと、本明細書に記載する細胞内シグナル伝達ドメイン(例えば、本明細書に記載するCD28シグナル伝達ドメイン及び/または本明細書に記載するCD3ゼータシグナル伝達ドメイン)の第2のポリペプチドとを含む。PD1は、CD28、CTLA−4、ICOS、及びBTLAも含むCD28受容体ファミリーの抑制性メンバーである。PD−1は、活性化されたB細胞、T細胞、及び骨髄細胞上に発現される(Agata et al.1996 Int.Immunol 8:765−75)。PD1に対する2つのリガンド、PD−L1及びPD−L2は、PD1に結合するとT細胞の活性化を下方制御することが示されている(Freeman et al.2000 J Exp Med 192:1027−34;Latchman et al.2001 Nat Immunol 2:261−8;Carter et al.2002 Eur J Immunol 32:634−43)。PD−L1は、ヒトのがんに豊富に存在する(Dong et al.2003 J Mol Med 81:281−7;Blank et al.2005 Cancer Immunol.Immunother 54:307−314;Konishi et al.2004 Clin Cancer Res 10:5094)。免疫抑制は、PD1のPD−L1との局所的相互作用を阻害することによって、逆転させることができる。
一実施形態では、作用物質は、抑制分子の細胞外ドメイン(ECD)を含み、例えば、プログラム死1(PD1)の細胞外ドメイン(ECD)を、膜貫通ドメイン、及び任意選択により、41BB及びCD3ゼータなどの細胞内シグナル伝達ドメインに融合させることができる(本明細書ではPD1 TFPとも呼ばれる)。一実施形態では、PD1 TFPは、本明細書に記載する抗腫瘍抗原TFPと組み合わせて使用すると、T細胞の持続性を向上させる。一実施形態では、TFPは、PD1の細胞外ドメインを含むPD1 TFPである。あるいは、提供するのは、プログラム死−リガンド1(PD−L1)またはプログラム死−リガンド2(PD−L2)に特異的に結合するscFvなどの抗体または抗体断片を含有するTFPである。
別の態様では、本発明は、TFP発現T細胞、例えば、TFP−T細胞の集団を提供する。幾つかの実施形態では、TFP発現T細胞の集団は、異なるTFPを発現する細胞の混合物を含む。例えば、一実施形態では、TFP−T細胞の集団は、本明細書に記載する抗腫瘍関連抗原結合ドメインを有するTFPを発現する第1の細胞と、異なる抗腫瘍関連抗原結合ドメイン、例えば、第1の細胞によって発現されるTFP内の抗腫瘍関連抗原結合ドメインとは異なる本明細書に記載される抗腫瘍関連抗原結合ドメインを有するTFPを発現する第2の細胞とを含むことができる。別の例として、TFP発現細胞の集団は、抗腫瘍関連抗原結合ドメイン、例えば本明細書に記載するようなものを含むTFPを発現する第1の細胞と、腫瘍関連抗原以外(例えば、別の腫瘍関連抗原)の標的に対する抗原結合ドメインを含むTFPを発現する第2の細胞とを含むことができる。
別の態様では、本発明は、細胞集団であって、該集団内の少なくとも1つの細胞が、本明細書に記載する抗腫瘍関連抗原ドメインを有するTFPを発現し、第2の細胞が、別の作用物質、例えば、TFP発現細胞の活性を強化する作用物質を発現する、細胞集団を提供する。例えば、一実施形態では、作用物質は、抑制分子を阻害する作用物質であり得る。抑制分子は、例えば、幾つかの実施形態では、TFP発現細胞が免疫エフェクター応答を開始する能力を減少させ得る。抑制分子の例として、PD1、PD−L1、PD−L2、CTLA4、TIM3、LAG3、VISTA、BTLA、TIGIT、LAIR1、CD160、2B4、及びTGFRベータが挙げられる。一実施形態では、抑制分子を阻害する作用物質は、第1のポリペプチド、例えば、抑制分子を含み、それは、細胞に正のシグナルをもたらす第2のポリペプチド、例えば、本明細書に記載する細胞内シグナル伝達ドメインに会合している。
本明細書に開示するのは、TFPをコードするin vitro転写RNAを生成するための方法である。本発明はまた、細胞内に直接形質移入することができる、TFPをコードするRNA構築物を含む。形質移入に使用するためのmRNAを生成するための方法は、特別に設計されたプライマーを用いた鋳型のin vitro転写(IVT)、それに続くポリAの付加によって、3’及び5’非翻訳配列(「UTR」)、5’キャップ及び/または配列内リボソーム進入部位(IRES)、発現しようとする核酸、ならびに典型的には50〜2000塩基長であるポリAテールを含有する構築物を生成することを含み得る。そのように生成されたRNAは、異なる種類の細胞に効率的に形質移入させることができる。一態様では、鋳型は、TFPの配列を含む。
一態様では、抗腫瘍関連抗原TFPは、メッセンジャーRNA(mRNA)によってコードされる。一態様では、抗腫瘍関連抗原TFPをコードするmRNAは、TFP−T細胞を産生するためにT細胞に導入される。一実施形態では、in vitro転写RNA TFPは、一過性形質移入の形態で細胞に導入することができる。RNAは、ポリメラーゼ連鎖反応(PCR)で生成された鋳型を使用するin vitro転写によって生成される。任意の源に由来する関心対象のDNAは、PCRによって、適正なプライマー及びRNAポリメラーゼを使用して、in vitro mRNA合成用の鋳型に直接変換することができる。DNA源は、例えば、ゲノムDNA、プラスミドDNA、ファージDNA、cDNA、合成DNA配列、または任意の他の適正なDNA源であり得る。in vitro転写に望ましい鋳型は、本発明のTFPである。一実施形態では、PCRに使用しようとするDNAは、オープンリーディングフレームを含有する。DNAは、生物のゲノムに由来する天然に存在するDNA配列に由来するものであり得る。一実施形態では、核酸は、5’及び/または3’非翻訳領域(UTR)の一部または全部を含むことができる。核酸は、エキソン及びイントロンを含むことができる。一実施形態では、PCRに使用しようとするDNAは、ヒト核酸配列である。別の実施形態では、PCRに使用しようとするDNAは、5’及び3’UTRを含むヒト核酸配列である。DNAは、あるいは、天然に存在する生物には通常発現されない人工DNA配列であり得る。例示的な人工DNA配列は、融合タンパク質をコードするオープンリーディングフレームを形成するように一緒に連結された遺伝子部分を含有するものである。一緒に連結されたDNA部分は、単一の生物に由来しても、2種以上の生物に由来してもよい。
形質移入に使用されるmRNAのin vitro転写用の鋳型を生成するのに、PCRが使用される。PCRの実施方法は、当技術分野で周知である。PCRに使用するためのプライマーは、PCR用の鋳型として使用しようとするDNAの領域に実質的に相補的な領域を有するように設計される。「実質的に相補的」とは、本明細書で使用される場合、プライマー配列内の塩基の大部分またはすべてが相補的であるか、または1つまたは複数の塩基が非相補的もしくは不一致である、ヌクレオチドの配列を指す。実質的に相補的な配列は、PCRに使用されるアニーリング条件下で、アニーリングまたは意図されるDNA標的とのハイブリッド形成が可能である。プライマーは、DNA鋳型の任意の部分と実質的に相補的になるように設計することができる。例えば、プライマーは、細胞内で通常転写される核酸の部分(オープンリーディングフレーム)を、5’及び3’UTRを含めて増幅するように設計することができる。プライマーは、関心対象の特定のドメインをコードする核酸の一部分を増幅するように設計することもできる。一実施形態では、プライマーは、ヒトcDNAのコード領域を、5’及び3’UTRのすべてまたは部分を含めて増幅するように設計される。PCRに有用なプライマーは、当技術分野で周知の合成方法によって生成することができる。「フォワードプライマー」は、増幅しようとするDNA配列の上流にある、DNA鋳型上のヌクレオチドと実質的に相補的なヌクレオチドの領域を含有するプライマーである。「上流」は、増幅しようとするDNA配列に対して、コーディング鎖の5側の位置を指すために使用される。「リバースプライマー」は、増幅しようとするDNA配列の下流にある、二本鎖DNA鋳型に実質的に相補的なヌクレオチドの領域を含有するプライマーである。「下流」は、増幅しようとするDNA配列に対して、コーディング鎖の3’側の位置を指すために本明細書において使用される。
PCRに有用な任意のDNAポリメラーゼを、本明細書に開示する方法に使用することができる。試薬及びポリメラーゼは、幾つもの供給業者から市販されている。
安定性及び/または翻訳効率を促進する能力を有する化学構造も使用されてもよい。RNAは、好ましくは、5’及び3’UTRを有する。一実施形態では、5’UTRは、1〜3,000ヌクレオチド長である。コーディング領域に付加しようとする5’及び3’UTR配列の長さは、様々な方法によって変更することができ、それらとして、UTRの異なる領域にアニーリングするPCRのためのプライマーを設計することが挙げられるが、これに限定されない。この手法を使用すれば、当業者であれば、転写されたRNAの形質移入後に最適な翻訳効率を実現するのに必要とされる5’及び3’UTRの長さを改変することができる。
5’及び3’UTRは、天然に存在する、関心対象の核酸に内因性の5’及び3’UTRであり得る。あるいは、UTR配列をフォワードまたはリバースプライマーに組み込むことによって、または鋳型の任意の他の改変によって、関心対象の核酸に内因性でないUTR配列を付加することができる。関心対象の核酸に内因性ではないUTR配列を使用することは、RNAの安定性及び/または翻訳効率を改変するのに有用であり得る。例えば、3’UTR配列にAUリッチなエレメントがあると、mRNAの安定性が減少することが公知である。したがって、3’UTRは、当技術分野で周知のUTRの特性に基づいて、転写されたRNAの安定性を増大させるように選択または設計することができる。
一実施形態では、5’UTRは、内因性核酸のコザック配列を含有することができる。あるいは、関心対象の核酸に内因性ではない5’UTRが上記のようにPCRによって付加されているとき、この5’UTR配列を付加することによって、コンセンサスコザック配列を再設計することができる。コザック配列は、幾つかのRNA転写物の翻訳の効率を増大させることができるが、効率的な翻訳を可能にするためにすべてのRNAに必要とされるわけではないと思われる。多くのmRNAのためのコザック配列の要件は、当技術分野で公知である。他の実施形態では、5’UTRは、RNAゲノムが細胞内で安定であるRNAウイルスの5’UTRであり得る。他の実施形態では、3’または5’UTRに様々なヌクレオチド類似体を使用して、mRNAのエキソヌクレアーゼ分解を妨害させることができる。
遺伝子クローニングを必要とせずにDNA鋳型からRNAを合成できるようにするには、転写しようとするDNA鋳型の配列の上流に、転写のプロモーターが結合されていなければならない。RNAポリメラーゼのプロモーターとして機能する配列がフォワードプライマーの5’末端に付加されると、RNAポリメラーゼプロモーターは、PCR産物中に、転写しようとするオープンリーディングフレームの上流に組み込まれることとなる。好ましい一態様では、プロモーターは、本明細書に別途記載するようなT7ポリメラーゼプロモーターである。他の有用なプロモーターとして、T3及びSP6 RNAポリメラーゼプロモーターが挙げられるが、これらに限定されない。T7、T3、及びSP6プロモーターのコンセンサスヌクレオチド配列は、当技術分野で公知である。
好ましい実施形態では、mRNAは、5’末端のキャップと3’ポリ(A)テールの両方を有し、これらは、細胞内のmRNAのリボソーム結合、翻訳の開始、及び安定性を決定する。環状DNA鋳型、例えば、プラスミドDNAにおいて、RNAポリメラーゼは、真核細胞での発現に適さない長いコンカテマー産物を生成する。3’UTRの末端で線状化されたプラスミドDNAを転写すると、通常のサイズのmRNAが生じるが、これは転写後にポリアデニル化されても、真核生物の形質移入に有効ではない。
線状DNA鋳型において、ファージT7 RNAポリメラーゼは、転写物の3’末端を、鋳型の最後の塩基を越えて伸長させることができる(Schenborn and Mierendorf,Nuc Acids Res.,13:6223−36(1985);Nacheva and Berzal−Herranz,Eur.J.Biochem.,270:1485−65(2003)。
ポリA/TストレッチをDNA鋳型に組み込む従来の方法は、分子クローニングである。しかし、プラスミドDNAに統合されたポリA/T配列は、プラスミドの不安定性を引き起こすことがあり、これが、細菌細胞から得られたプラスミドDNA鋳型に欠失及び他の異常が高度に混入していることが多い理由である。これによって、クローニング手順は、労力と時間を要するだけでなく、信用できないものとなる。これが、ポリA/T 3’ストレッチを有するDNA鋳型をクローニングを用いずに構築することができる方法が非常に望ましい理由である。
転写DNA鋳型のポリA/Tセグメントは、PCR中に100Tテール(サイズが50〜5000Tであり得る)などのポリTテールを含有するリバースプライマーを使用することによって、またはPCR後に、限定するものではないが、DNAライゲーションまたはin vitro組み換えを含めた任意の他の方法によって、生成することができる。ポリ(A)テールはまた、RNAに安定性をもたらし、その分解を低減させる。一般に、ポリ(A)テールの長さは、転写されたRNAの安定性と正に相関する。一実施形態では、ポリ(A)テールは、100〜5000アデノシンである。
RNAのポリ(A)テールは、in vitro転写後に、E.coliポリAポリメラーゼ(E−PAP)などのポリ(A)ポリメラーゼを使用してさらに伸長させることができる。一実施形態では、ポリ(A)テールの長さを、100ヌクレオチドから300〜400ヌクレオチドに増加させると、RNAの翻訳効率が約2倍増大する。加えて、異なる化学基を3’末端に結合させると、mRNAの安定性が増大し得る。そのような結合は、改変/人工ヌクレオチド、アプタマー、及び他の化合物を含有し得る。例えば、ポリ(A)ポリメラーゼを使用してATP類似体をポリ(A)テールに組み込むことができる。ATP類似体は、RNAの安定性をさらに増大させることができる。
5’キャップを付けることによっても、RNA分子の安定性をもたらすことができる。好ましい実施形態では、本明細書に開示する方法によって生成されるRNAは、5’キャップを含む。5’キャップは、当技術分野で公知の、本明細書に記載する技法を使用して提供される(Cougot,et al.,Trends in Biochem.Sci.,29:436−444(2001);Stepinski,et al.,RNA,7:1468−95(2001)、Elango,et al.,Biochim.Biophys.Res.Commun.,330:958−966(2005))。
本明細書に開示する方法によって生成されるRNAは、配列内リボソーム進入部位(IRES)配列も含有することができる。IRES配列は、任意のウイルス、染色体、または人工設計配列であってもよく、mRNAへのキャップ非依存性リボソーム結合を開始し、翻訳の開始を促進する。細胞エレクトロポレーションに適した任意の溶質であって、糖、ペプチド、脂質、タンパク質、酸化防止剤、及び界面活性剤などの、細胞の透過性及び生存能を促進する因子を含有することができるものが含まれ得る。
RNAは、幾つもの異なる方法、例えば、商業的に入手可能な方法のいずれかを使用して標的細胞に導入することができ、それらの方法として、エレクトロポレーション(Amaxa Nucleofector−II(Amaxa Biosystems,Cologne,Germany))、(ECM 830(BTX)(Harvard Instruments,Boston,Mass.)、もしくはGene Pulser II(BioRad,Denver,Colo.)、Multiporator(Eppendort、Hamburg Germany)、リポフェクションを使用するカチオン性リポソーム媒介形質移入、ポリマーカプセル化、ペプチド媒介形質移入、または「遺伝子銃」などのパーティクルガン送達系(例えば、Nishikawa,et al.Hum Gene Ther.,12(8):861−70(2001)を参照されたい)が挙げられるが、これらに限定されない。
8.TFPをコードする核酸構築物
本発明はまた、本明細書に記載する1つまたは複数のTFP構築物をコードする核酸分子を提供する。一態様では、核酸分子は、メッセンジャーRNA転写物として提供する。一態様では、核酸分子は、DNA構築物として提供する。
本発明はまた、本明細書に記載する1つまたは複数のTFP構築物をコードする核酸分子を提供する。一態様では、核酸分子は、メッセンジャーRNA転写物として提供する。一態様では、核酸分子は、DNA構築物として提供する。
所望の分子をコードする核酸配列は、当技術分野で公知の組み換え方法を使用して、例えば、該遺伝子を発現する細胞に由来するライブラリーをスクリーニングすること、該遺伝子を含むことが公知のベクターからそれを抽出すること、または該遺伝子を含有する細胞及び組織から直接それを単離することなどによって、標準的技法を使用して得ることができる。あるいは、関心対象の遺伝子は、クローニングではなく、合成的に生成することができる。
本発明はまた、本発明のDNAが挿入されるベクターを提供する。レンチウイルスなどのレトロウイルスに由来するベクターは、導入遺伝子の長期の安定な統合及び娘細胞におけるその伝播を可能にするために、長期の遺伝子移入を実現するのに適したツールである。レンチウイルスベクターは、肝細胞などの非増殖性細胞に形質導入することができるという点で、マウス白血病ウイルスなどのオンコレトロウイルスに由来するベクターに優るさらなる利点を有する。それは、低免疫原性というさらなる利点も有する。
別の実施形態では、本発明の所望のTFPをコードする核酸を含むベクターは、アデノウイルスベクター(A5/35)である。別の実施形態では、TFPをコードする核酸の発現は、スリーピングビューティー、crispr、CAS9、及びジンクフィンガーヌクレアーゼなどのトランスポゾンを使用して遂行することができる(June et al.2009 Nature Reviews Immunol.9.10:704−716(参照により本明細書に援用される)を参照されたい)。
本発明の発現構築物はまた、標準的な遺伝子送達プロトコルを使用して、核酸免疫化及び遺伝子療法に使用されてもよい。遺伝子送達のための方法は、当技術分野で公知である(例えば、米国特許第5,399,346号、第5,580,859号、第5,589,466号(参照によりそれらの全体が本明細書に組み込まれている)を参照されたい)。別の実施形態では、本発明は、遺伝子療法用ベクターを提供する。
核酸は、幾つものタイプのベクターにクローニングすることができる。例えば、核酸は、限定するものではないが、プラスミド、ファージミド、ファージ誘導体、動物ウイルス、及びコスミドを含めたベクターにクローニングすることができる。特に関心対象のベクターとして、発現ベクター、複製ベクター、プローブ生成ベクター、及び配列決定ベクターが挙げられる。
さらに、発現ベクターは、ウイルスベクターの形態で細胞に提供されてもよい。ウイルスベクター技術は、当技術分野で周知であり、例えば、Sambrook et al.,2012,Molecular Cloning:A Laboratory Manual,volumes 1−4,Cold Spring Harbor Press,NY)、ならびに他のウイルス学及び分子生物学の手引き書に記載されている。ベクターとして有用なウイルスとして、レトロウイルス、アデノウイルス、アデノ随伴ウイルス、ヘルペスウイルス、及びレンチウイルスが挙げられるが、これらに限定されない。一般に、適切なベクターは、少なくとも1種の生物で機能する複製開始点、プロモーター配列、便利な制限エンドヌクレアーゼ部位、及び1つまたは複数の選択マーカーを含有する(例えば、WO01/96584;WO01/29058;及び米国特許第6,326,193号)。
幾つものウイルスベースの系が、哺乳類細胞への遺伝子移入のために開発されてきた。例えば、レトロウイルスは、遺伝子送達系に便利なプラットフォームを提供する。当技術分野で公知の技法を使用して、選択された遺伝子をベクターに挿入し、レトロウイルス粒子にパッケージングすることができる。次いで組み換えウイルスを単離し、対象の細胞にin vivoまたはex vivoのいずれかで送達することができる。幾つものレトロウイルス系が、当技術分野で公知である。幾つかの実施形態では、アデノウイルスベクターが使用される。幾つものアデノウイルスベクターが、当技術分野で公知である。一実施形態では、レンチウイルスベクターが使用される。
追加的なプロモーターエレメント、例えば、エンハンサーは、転写開始の頻度を制御する。典型的には、これらは、開始部位の30〜110bp上流の領域に位置しているが、幾つものプロモーターが、開始部位の下流にも機能的エレメントを含有することが示されている。プロモーターエレメント間の間隔は、多くの場合フレキシブルなので、エレメントが互いに逆転または移動してもプロモーター機能は保持される。チミジンキナーゼ(tk)プロモーターでは、プロモーターエレメント間の間隔は50bp離れるまで増加させることができ、その後活性は低下し始める。個々のエレメントは、プロモーターに応じて協同的または独立に機能して転写を活性化することができると思われる。
哺乳動物のT細胞でTFP導入遺伝子を発現することができるプロモーターの例は、EF1aプロモーターである。本来のEF1aプロモーターは、アミノアシルtRNAのリボソームへの酵素的送達に関与する、伸長因子1複合体のアルファサブユニットの発現を駆動する。EF1aプロモーターは、哺乳動物の発現プラスミドに広く使用されており、レンチウイルスベクターにクローニングされた導入遺伝子からのTFP発現を駆動するのに有効であることが示されている(例えば、Milone et al.,Mol.Ther.17(8):1453−1464(2009)を参照されたい)。プロモーターの別の例は、前初期サイトメガロウイルス(CMV)プロモーター配列である。このプロモーター配列は、これに作動可能に連結された任意のポリヌクレオチド配列の高レベルの発現を駆動することができる強力な構成的プロモーター配列である。しかし、他の構成的プロモーター配列も使用されてもよく、それらとして、サルウイルス40(SV40)初期プロモーター、マウス乳癌ウイルス(MMTV)、ヒト免疫不全ウイルス(HIV)末端反復配列(LTR)プロモーター、MoMuLVプロモーター、トリ白血病ウイルスプロモーター、エプスタイン・バーウイルス前初期プロモーター、ラウス肉腫ウイルスプロモーター、ならびにヒト遺伝子プロモーター、例えば、限定するものではないが、アクチンプロモーター、ミオシンプロモーター、伸長因子1aプロモーター、ヘモグロビンプロモーター、及びクレアチンキナーゼプロモーターが挙げられるが、これらに限定されない。さらに、本発明は、構成的プロモーターの使用に限定されるものではない。誘導性プロモーターも、本発明の一部として企図される。誘導性プロモーターを使用すると、それに作動可能に連結されたポリヌクレオチドの発現を、そのような発現が所望されるときにオンにしたり、発現が所望されないときにオフにしたりすることができる分子スイッチが得られる。誘導性プロモーターの例として、メタロチオネインプロモーター、糖質コルチコイドプロモーター、プロゲステロンプロモーター、及びテトラサイクリンにより制御されるプロモーターが挙げられるが、これらに限定されない。
TFPポリペプチドまたはその一部分の発現を査定するために、細胞に導入しようとする発現ベクターはまた、選択マーカー遺伝子もしくはレポーター遺伝子のいずれかまたは両方を含有して、ウイルスベクターを通して形質移入または感染させようとする細胞集団からの発現細胞の特定または選択を容易にすることができる。他の態様では、選択マーカーを別々のDNA断片上に担持させて、同時形質移入手順に使用してもよい。選択マーカーとレポーター遺伝子の両方を適正な制御配列に隣接させて、宿主細胞内で発現できるようにしてもよい。有用な選択マーカーとして、例えば、neoなどの抗生物質抵抗性遺伝子が挙げられる。
レポーター遺伝子は、形質移入された可能性がある細胞の特定、及び制御配列の機能性の評価に使用される。一般に、レポーター遺伝子は、レシピエントの生物もしくは組織に存在しないか、またはそれらによって発現されない遺伝子であり、容易に検出可能な何らかの特性、例えば酵素活性によって発現が顕在化するポリペプチドをコードする。レポーター遺伝子の発現は、該DNAがレシピエント細胞に導入された後の適切な時点でアッセイされる。適切なレポーター遺伝子として、ルシフェラーゼ、ベータガラクトシダーゼ、クロラムフェニコールアセチルトランスフェラーゼ、分泌型アルカリホスファターゼをコードする遺伝子、または緑色蛍光タンパク質遺伝子を挙げることができる(例えば、Ui−Tei et al.,2000 FEBS Letters 479:79−82)。適切な発現系は周知であり、公知の技法を使用して調製しても、商業的に得てもよい。一般に、レポーター遺伝子の最も高い発現レベルを示す最小限の5’隣接領域を有する構築物が、プロモーターとして特定される。そのようなプロモーター領域をレポーター遺伝子に連結し、これを使用して、プロモーター駆動転写を調節する能力について作用物質を評価してもよい。
遺伝子を細胞に導入し、発現させる方法は、当技術分野で公知である。発現ベクターとの関係において、該ベクターは、宿主細胞、例えば、哺乳動物、細菌、酵母、または昆虫の細胞に、当技術分野における任意の方法によって容易に導入することができる。例えば、発現ベクターは、物理的、化学、または生物学的手段によって宿主細胞に移入することができる。
ポリヌクレオチドを宿主細胞に導入するための物理的方法として、リン酸カルシウム沈殿、リポフェクション、微粒子銃、マイクロインジェクション、エレクトロポレーションなどが挙げられる。ベクター及び/または外因性核酸を含む細胞を生成するための方法は、当技術分野で周知である(例えば、Sambrook et al.,2012,Molecular Cloning:A Laboratory Manual,volumes 1−4,Cold Spring Harbor Press,NYを参照されたい)。ポリヌクレオチドを宿主細胞に導入するための一方法は、リン酸カルシウム形質移入である。
関心対象のポリヌクレオチドを宿主細胞に導入するための生物学的方法として、DNA及びRNAベクターの使用が挙げられる。ウイルスベクター、とりわけレトロウイルスベクターは、遺伝子を哺乳動物、例えばヒトの細胞に挿入するための最も広く使用される方法となっている。他のウイルスベクターは、レンチウイルス、ポックスウイルス、単純ヘルペスウイルスI型、アデノウイルス、及びアデノ随伴ウイルスなどから誘導することができる(例えば、米国特許第5,350,674号及び第5,585,362号を参照されたい)。
ポリヌクレオチドを宿主細胞に導入するための化学的手段として、巨大分子複合体、ナノカプセル、微小球、ビーズなどのコロイド分散系、及び脂質ベースの系、例えば、水中油型エマルション、ミセル、混合ミセル、及びリポソームが挙げられる。in vitro及びin vivoでの送達ビヒクルとして使用するための例示的なコロイド系は、リポソーム(例えば、人工膜小胞)である。核酸を標的化送達する現状技術の他の方法、例えば、標的化ナノ粒子または他の適切なサブミクロンサイズの送達系でのポリヌクレオチドの送達が利用可能である。
非ウイルス送達系が利用される場合、例示的な送達ビヒクルは、リポソームである。脂質配合物の使用は、宿主細胞に核酸を導入するために企図される(in vitro、ex vivo、またはin vivo)。別の態様では、核酸は、脂質と会合されてもよい。脂質と会合された核酸は、リポソームの水性内部に封入されてもよく、リポソームの脂質二重層内に散在してもよく、リポソームとオリゴヌクレオチドの両方に会合する連結分子を介してリポソームに結合されてもよく、リポソーム内に捕捉されてもよく、リポソームと複合体を形成してもよく、脂質を含有する溶液中に分散されてもよく、脂質と混合されてもよく、脂質と組み合わされてもよく、脂質中の懸濁液として含有されてもよく、ミセルに含有されてもミセルと複合体を形成してもよく、または脂質と別様に会合されてもよい。脂質、脂質/DNA、または脂質/発現ベクター会合組成物は、溶液中のいずれの特定の構造にも限定されない。例えば、それらは、二重層構造内に存在しても、ミセルとして存在しても、「崩壊した」構造で存在してもよい。それらはまた、場合によりサイズまたは形状が均一でない凝集粒子を形成して、溶液中に単に散在しているだけでもよい。脂質は、天然に存在する脂質でも合成脂質でもよい脂肪性物質である。例えば、脂質として、細胞質内に天然に存在する脂肪小滴、ならびに長鎖脂肪族炭化水素を含有する化合物及びそれらの誘導体の部類、例えば、脂肪酸、アルコール、アミン、アミノアルコール、及びアルデヒドが挙げられる。
使用に適した脂質は、商業的供給元から得ることができる。例えば、ジミリストイルホスファチジルコリン(dimyristyl phosphatidylcholine)(「DMPC」)は、Sigma,St.Louis,Mo.から得ることができ;リン酸ジセチル(「DCP」)は、K&K Laboratories(Plainview,N.Y.)から得ることができ;コレステロール(「Choi」)は、Calbiochem−Behringから得ることができ;ジミリストイルホスファチジルグリセロール(dimyristyl phosphatidylglycerol)(「DMPG」)及び他の脂質は、Avanti Polar Lipids,Inc.(Birmingham,Ala.)から得てもよい。クロロホルムまたはクロロホルム/メタノール中の脂質のストック溶液は、約−20℃で保存することができる。クロロホルムは、メタノールより容易に蒸発するので、唯一の溶媒として使用される。「リポソーム」は、閉鎖された脂質二重層または凝集粒子の生成によって形成される、種々の一重膜及び多重膜の脂質ビヒクルを包含する総称である。リポソームは、リン脂質の二重膜と内部の水性媒体とを有する小胞構造を有することを特徴とし得る。多重膜リポソームは、水性媒体によって隔てられた複数の脂質層を有する。それは、リン脂質を過剰な水溶液に懸濁させると自然に形成する。脂質成分は、自己再編成を経た後で、閉鎖構造を形成し、水及び溶解した溶質を脂質二重層の間に捕捉する(Ghosh et al.,1991 Glycobiology 5:505−10)。しかし、溶液中で通常の小胞構造とは異なる構造を有する組成物も包含される。例えば、脂質は、ミセル構造であると想定されてもよいし、単に脂質分子の不均一な凝集粒子として存在すると想定されてもよい。リポフェクタミン−核酸複合体もまた企図される。
外因性核酸を宿主細胞に導入するために使用される方法であるか、または別様に細胞を本発明の阻害剤に曝露するために使用される方法であるかにかかわらず、宿主細胞における組み換えDNA配列の存在を確認するために、種々のアッセイが実施されてもよい。そのようなアッセイとして、例えば、当業者に周知の「分子生物学的」アッセイ、例えば、サザン及びノーザンブロット法、RT−PCR及びPCR;「生化学的」アッセイ、例えば、特定のペプチドの存在または非存在を、例えば、免疫学的手段(ELISA及びウエスタンブロット)または本発明の範囲内の作用物質を特定するための本明細書に記載するアッセイによって検出することを挙げることができる。
本発明は、TFPをコードする核酸分子を含むベクターをさらに提供する。一態様では、TFPベクターは、細胞、例えばT細胞に直接形質導入することができる。一態様では、ベクターは、クローニングまたは発現ベクターであり、例えば、限定するものではないが、1種または複数のプラスミド(例えば、発現プラスミド、クローニングベクター、ミニサークル、ミニベクター、二重微小染色体)、レトロウイルス及びレンチウイルスベクター構築物を含めたベクターである。一態様では、ベクターは、哺乳動物のT細胞においてTFP構築物を発現することができる。一態様では、哺乳動物のT細胞は、ヒトT細胞である。
9.T細胞源
拡大及び遺伝子改変の前に、T細胞源を対象から得る。「対象」という用語には、免疫応答を誘発することができる生体(例えば、哺乳動物)が含まれることが意図される。対象の例として、ヒト、イヌ、ネコ、マウス、ラット、及びそれらのトランスジェニック種が挙げられる。T細胞は、末梢血単核球、骨髄、リンパ節組織、臍帯血、胸腺組織、感染症の部位由来の組織、腹水、胸水、脾臓組織、及び腫瘍を含めた、幾つもの源から得ることができる。本発明のある種の態様では、当技術分野で入手可能な幾つものT細胞株が使用されてもよい。本発明のある種の態様では、T細胞は、Ficoll(商標)分離などの、当業者に公知の幾つもの技法を使用して、対象から収集した血液単位から得ることができる。好ましい一態様では、個体の循環血に由来する細胞は、アフェレーシスによって得られる。アフェレーシス産物は、典型的には、T細胞を含めたリンパ球、単球、顆粒球、B細胞、他の有核白血球、赤血球、及び血小板を含有する。一態様では、アフェレーシスによって収集された細胞は、洗浄して、血漿分画を除去し、後続の処理工程のために適正な緩衝液または培地中に入れてもよい。本発明の一態様では、細胞は、リン酸緩衝食塩水(PBS)で洗浄される。代替の態様では、洗浄溶液は、カルシウムを含まず、かつマグネシウムを含まなくてもよく、または全部とまでいかなくても多くの二価カチオンを含まなくてもよい。カルシウムの非存在下での初期活性化工程は、活性化の拡大につながり得る。当業者であれば容易に理解するように、洗浄工程は、当技術分野で公知の方法によって、例えば、半自動化「フロースルー」遠心分離機(例えば、COBE(登録商標)2991細胞処理装置、Baxter CytoMate(登録商標)、またはHaemonetics(登録商標)Cell Saver(登録商標)5)を製造業者の使用説明書に従って使用することによって遂行することができる。洗浄後に、細胞は、種々の生体適合性緩衝液、例えば、Ca非含有、Mg非含有PBS、PlasmaLyte(登録商標)A、または緩衝液を含むもしくは含まない他の生理食塩水などに再懸濁させてもよい。あるいは、アフェレーシス試料の望ましくない成分を除去し、細胞を培養培地に直接再懸濁させてもよい。
拡大及び遺伝子改変の前に、T細胞源を対象から得る。「対象」という用語には、免疫応答を誘発することができる生体(例えば、哺乳動物)が含まれることが意図される。対象の例として、ヒト、イヌ、ネコ、マウス、ラット、及びそれらのトランスジェニック種が挙げられる。T細胞は、末梢血単核球、骨髄、リンパ節組織、臍帯血、胸腺組織、感染症の部位由来の組織、腹水、胸水、脾臓組織、及び腫瘍を含めた、幾つもの源から得ることができる。本発明のある種の態様では、当技術分野で入手可能な幾つものT細胞株が使用されてもよい。本発明のある種の態様では、T細胞は、Ficoll(商標)分離などの、当業者に公知の幾つもの技法を使用して、対象から収集した血液単位から得ることができる。好ましい一態様では、個体の循環血に由来する細胞は、アフェレーシスによって得られる。アフェレーシス産物は、典型的には、T細胞を含めたリンパ球、単球、顆粒球、B細胞、他の有核白血球、赤血球、及び血小板を含有する。一態様では、アフェレーシスによって収集された細胞は、洗浄して、血漿分画を除去し、後続の処理工程のために適正な緩衝液または培地中に入れてもよい。本発明の一態様では、細胞は、リン酸緩衝食塩水(PBS)で洗浄される。代替の態様では、洗浄溶液は、カルシウムを含まず、かつマグネシウムを含まなくてもよく、または全部とまでいかなくても多くの二価カチオンを含まなくてもよい。カルシウムの非存在下での初期活性化工程は、活性化の拡大につながり得る。当業者であれば容易に理解するように、洗浄工程は、当技術分野で公知の方法によって、例えば、半自動化「フロースルー」遠心分離機(例えば、COBE(登録商標)2991細胞処理装置、Baxter CytoMate(登録商標)、またはHaemonetics(登録商標)Cell Saver(登録商標)5)を製造業者の使用説明書に従って使用することによって遂行することができる。洗浄後に、細胞は、種々の生体適合性緩衝液、例えば、Ca非含有、Mg非含有PBS、PlasmaLyte(登録商標)A、または緩衝液を含むもしくは含まない他の生理食塩水などに再懸濁させてもよい。あるいは、アフェレーシス試料の望ましくない成分を除去し、細胞を培養培地に直接再懸濁させてもよい。
一態様では、T細胞は、赤血球を溶解し、単球を除去することによって、例えば、PERCOLL(商標)勾配による遠心分離によって、または対向流遠心溶出法によって、末梢血リンパ球から単離される。CD3+、CD28+、CD4+、CD8+、CD45RA+、及びCD45RO+T細胞などのT細胞の特定の亜集団を、ポジティブまたはネガティブ選択技法によってさらに単離することができる。例えば、一態様では、T細胞は、DYNABEADS(商標)M−450 CD3/CD28 Tなどの抗CD3/抗CD28(例えば、3×28)結合ビーズと、所望のT細胞のポジティブ選択に十分な時間インキュベートすることによって単離される。一態様では、その時間は、約30分である。さらなる態様では、その時間は、30分〜36時間の範囲またはそれ以上、及びその間のすべての整数値である。さらなる態様では、その時間は、少なくとも1、2、3、4、5、または6時間である。さらに別の好ましい態様では、その時間は、10〜24時間である。一態様では、インキュベーション時間は、24時間である。腫瘍組織からまたは免疫不全の個体から腫瘍浸潤リンパ球(TIL)を単離する際など、他の細胞型と比較してT細胞があまりないような状況では、より長いインキュベーション時間を使用してT細胞を単離してもよい。さらに、より長いインキュベーション時間を使用すると、CD8+T細胞を捕捉する効率を上げることができる。よって、CD3/CD28ビーズに結合することができる時間を単に短くするもしくは長くすることによって、及び/またはビーズのT細胞に対する比率を増加させるまたは減少させることによって(本明細書でさらに記載するように)、培養開始時またはプロセス中の他の時点で、T細胞の亜集団を優先的に選択するまたは反選択することができる。加えて、ビーズまたは他の表面上の抗CD3及び/または抗CD28抗体の比率を増加させるまたは減少させることによって、培養開始時または他の所望の時点で、T細胞の亜集団を優先的に選択するまたは反選択することができる。当業者であれば、本発明との関係において複数回の選択も使用できることを認識するであろう。ある種の態様では、選択手順を実施し、「選択されていない」細胞を活性化及び拡大プロセスに使用することが望ましい場合がある。「選択されていない」細胞は、さらなる回の選択に供することもできる。
ネガティブ選択によるT細胞集団の濃厚化は、ネガティブ選択された細胞に特有の表面マーカーに指向する抗体を組み合わせて遂行することができる。一方法は、ネガティブ選択された細胞上に存在する細胞表面マーカーに指向するモノクローナル抗体のカクテルを使用するネガティブ磁性免疫接着またはフローサイトメトリーを介した細胞選別及び/または選択である。例えば、ネガティブ選択によってCD4+細胞を濃厚化するために、モノクローナル抗体カクテルは、典型的には、CD14、CD20、CD11b、CD16、HLA−DR、及びCD8に対する抗体を含む。ある種の態様では、典型的には、CD4+、CD25+、CD62Lhi、GITR+、及びFoxP3+を発現する制御性T細胞を濃厚化するまたはポジティブ選択することが望ましい場合がある。あるいは、ある種の態様では、制御性T細胞は、抗C25結合ビーズまたは他の同様の選択方法によって除去される。
一実施形態では、IFN−γ、TNF−アルファ、IL−17A、IL−2、IL−3、IL−4、GM−CSF、IL−10、IL−13、グランザイムB、及びパーフォリン、または他の適正な分子、例えば他のサイトカインの1つまたは複数を発現するT細胞集団を選択することができる。細胞発現をスクリーニングするための方法は、例えば、PCT公開第WO2013/126712号に記載される方法によって決定することができる。
所望の細胞集団をポジティブまたはネガティブ選択によって単離するために、細胞及び表面(例えば、ビーズなどの粒子)の濃度を変動させることができる。ある種の態様では、細胞とビーズの最大限の接触を確実にするために、ビーズと細胞とが一緒に混合される体積を相当減少させる(例えば、細胞の濃度を増加させる)ことが望ましい場合がある。例えば、一態様では、20億細胞/mLの濃度が使用される。一態様では、10億細胞/mLの濃度が使用される。さらなる態様では、1億細胞/mL超が使用される。さらなる態様では、1000万、1500万、2000万、2500万、3000万、3500万、4000万、4500万、または5000万細胞/mLの濃度が使用される。さらなる一態様では、7500万、8000万、8500万、9000万、9500万、または1億細胞/mLからの濃度が使用される。さらなる態様では、1億2500または1億5000万細胞/mLの濃度を使用することができる。高い濃度を使用すると、細胞収率、細胞活性化、及び細胞拡大を増大させることができる。さらに、高い細胞濃度を使用すると、CD28−ネガティブT細胞などの、関心対象の標的抗原を弱く発現し得る細胞をより効率的に捕捉することができ、または多くの腫瘍細胞が存在する試料(例えば、白血病血液、腫瘍組織など)から、より効率的に捕捉することができる。そのような細胞集団は、治療的価値を有することがあり、得ることが望ましいと思われる。例えば、高濃度の細胞を使用すると、通常、より弱いCD28の発現を有するCD8+T細胞を、より効率的に選択することができる。
関連する態様では、低い方の細胞濃度を使用することが望ましい場合がある。T細胞と表面(例えば、ビーズなどの粒子)との混合物を相当希釈することによって、粒子と細胞の間の相互作用が最小限に抑えられる。これは、粒子に結合する所望の抗原を豊富に発現する細胞を選択する。例えば、CD4+T細胞は、より高いレベルのCD28を発現し、希釈濃度でCD8+T細胞より効率的に捕捉される。一態様では、使用される細胞濃度は、5×106/mLである。他の態様では、使用される濃度は、約1×l05/mL〜1×l06/mL、及びその間の任意の整数値であり得る。他の態様では、細胞は、ローテーター上で、様々な長さの時間、様々な速度で、2〜10℃または室温のいずれかでインキュベートされてもよい。
刺激のためのT細胞は、洗浄工程後に凍結することもできる。理論に束縛されることを望むものではないが、凍結及び後続の解凍工程によって、細胞集団中の顆粒球及びある程度の単球が除去されることによって、より均一な産物が得られる。血漿及び血小板を除去する洗浄工程後に、細胞は、凍結溶液中に懸濁されてもよい。多くの凍結溶液及びパラメータが当技術分野で公知であり、これとの関係で有用であるが、一方法は、20%DMSO及び8%ヒト血清アルブミンを含有するPBS、または10%デキストラン40及び5%デキストロース、20%ヒト血清アルブミン、及び7.5%DMSOを含有する培養培地、もしくは31.25%Plasmalyte−A、31.25%デキストロース5%、0.45%NaCl、10%デキストラン40及び5%デキストロース、20%ヒト血清アルブミン、ならびに7.5%DMSOを含有する培養培地、あるいは、例えば、Hespan(登録商標)及びPlasmaLyte(登録商標)Aを含有する他の適切な細胞凍結培地を使用することを含み、次いで、細胞は、−80℃まで1/分の速度で凍結され、液体窒素貯蔵タンクの気相で保存される。その他の制御凍結法だけでなく、即時に−20℃にする、または液体窒素中での非制御凍結も使用されてもよい。ある種の態様では、凍結保存された細胞は、本明細書に記載するように解凍及び洗浄され、室温で1時間静置され、その後本発明の方法を使用して活性化される。
本発明との関係において企図するのはまた、本明細書に記載するように拡大させた細胞が必要になると思われる時期より前の時期に、対象から血液試料またはアフェレーシス産物を収集することである。そのため、拡大させようとする細胞の源は、任意の必要な時点で収集することができ、T細胞などの所望の細胞を単離及び凍結して、T細胞療法から利益を得ると思われる本明細書に記載するものなどの幾つもの疾患または状態のために、後でT細胞療法に使用することができる。一態様では、血液試料またはアフェレーシスは、全般的に健常な対象から採取される。ある種の態様では、血液試料またはアフェレーシスは、疾患を発症するリスクがあるが疾患をまだ発症していない、全般的に健常な対象から採取され、関心対象の細胞が、後で使用するために単離及び凍結される。ある種の態様では、T細胞は、拡大され、凍結され、後で使用されてもよい。ある種の態様では、試料は、本明細書に記載するような特定の疾患の診断の直後に、任意の治療の前に患者から収集される。さらなる態様では、細胞は、幾つもの関連する治療法、例えば、限定するものではないが、作用物質、例えば、ナタリズマブ、エファリズマブ、抗ウイルス剤、化学療法、放射線、免疫抑制剤、例えば、シクロスポリン、アザチオプリン、メトトレキサート、ミコフェノレート、及びタクロリムス(FK506)、抗体、または他の免疫除去剤、例えば、CAMPATH、抗CD3抗体、シクロホスファミド、フルダラビン、シクロスポリン、ラパマイシン、ミコフェノール酸、ステロイド、ロミデプシン(以前のFR901228)、ならびに放射線照射での治療の前に、対象からの血液試料またはアフェレーシスから単離される。
本発明のさらなる態様では、T細胞は、対象に機能性T細胞を残す治療に続いて、患者から直接得られる。これに関して、ある種のがん治療、特に免疫系を損傷する薬物での治療に続く、治療の直後で患者が通常治療から回復しようとする期間中に得られたT細胞の質は、ex vivoでの拡大能力に関して最適であり得るか、または向上したものであり得ることが観察されている。同様に、本明細書に記載する方法を使用するex vivoでの操作後に、これらの細胞は、生着及びin vivoでの拡大の強化に好ましい状態にあり得る。よって、本発明との関係において、T細胞、樹状細胞、または他の造血系細胞を含む血液細胞をこの回復期の間に収集することが企図される。さらに、ある種の態様では、動員(例えば、GM−CSFでの動員)及び移植前処置を使用して、とりわけ、療法後の所定の時間枠の間に、対象に、特定の細胞型の再増殖、再循環、再生、及び/または拡大が好ましい状態を作り出すことができる。実例となる細胞型として、T細胞、B細胞、樹状細胞、及び免疫系の他の細胞が挙げられる。
10.T細胞の活性化及び拡大
T細胞は、一般に、例えば、米国特許第6,352,694号;第6,534,055号;第6,905,680号;第6,692,964号;第5,858,358号;第6,887,466号;第6,905,681号;第7,144,575号;第7,067,318号;第7,172,869号;第7,232,566号;第7,175,843号;第5,883,223号;第6,905,874号;第6,797,514号;第6,867,041号;及び米国特許出願公開第20060121005号に記載される方法を使用して、活性化及び拡大させてもよい。
T細胞は、一般に、例えば、米国特許第6,352,694号;第6,534,055号;第6,905,680号;第6,692,964号;第5,858,358号;第6,887,466号;第6,905,681号;第7,144,575号;第7,067,318号;第7,172,869号;第7,232,566号;第7,175,843号;第5,883,223号;第6,905,874号;第6,797,514号;第6,867,041号;及び米国特許出願公開第20060121005号に記載される方法を使用して、活性化及び拡大させてもよい。
一般に、本発明のT細胞は、CD3/TCR複合体に関連するシグナルを刺激する作用物質が結合された表面と、T細胞の表面上の共刺激分子を刺激するリガンドとの接触によって拡大し得る。特に、T細胞集団は、本明細書に記載するように、例えば、抗CD3抗体もしくはその抗原結合断片、または表面上に固定化された抗CD2抗体との接触によって、またはカルシウムイオノフォアと併せたプロテインキナーゼC活性化剤(例えば、ブリオスタチン)との接触によって刺激することができる。T細胞の表面上のアクセサリー分子の共刺激については、アクセサリー分子に結合するリガンドが使用される。例えば、T細胞の集団は、T細胞の増殖を刺激するのに適した条件下で、抗CD3抗体及び抗CD28抗体と接触させることができる。CD4+T細胞またはCD8+T細胞のいずれかの増殖を刺激するためには、抗CD3抗体及び抗CD28抗体である。抗CD28抗体の例として、9.3、B−T3、XR−CD28(Diaclone,Besancon,France)が挙げられ、当技術分野で一般に公知の他の方法を使用することができる(Berg et al.,Transplant Proc.30(8):3975−3977,1998;Haanen et al.,J.Exp.Med.190(9):13191328,1999;Garland et al.,J.Immunol.Meth.227(1−2):53−63,1999)。
異なる刺激時間に曝露されたT細胞は、異なる特徴を呈し得る。例えば、典型的な血液またはアフェレーシスで得られた末梢血の単核細胞産物は、細胞傷害性またはサプレッサーT細胞集団(TC、CD8+)より多いヘルパーT細胞集団(TH、CD4+)を有する。CD3及びCD28受容体を刺激することによってT細胞をex vivoで拡大させると、約8〜9日目前では主にTH細胞からなるT細胞集団が産生されるが、約8〜9日目から後では、T細胞集団は、次第に大きくなるTC細胞集団を含む。したがって、治療目的に応じて、主にTH細胞を含むT細胞集団を対象に注入することが有利であり得る。同様に、TC細胞の抗原特異的サブセットを単離したならば、このサブセットをより大きく拡大させることが有益であり得る。
さらに、CD4及びCD8マーカーに加えて、他の表現型マーカーが相当に変動するが、大部分は、細胞拡大プロセスの過程において再現性が良い。よって、そのような再現性によって活性化T細胞産物を特定の目的に合わせる能力が可能になる。
抗腫瘍関連抗原TFPが構築されたら、様々なアッセイを使用して、限定するものではないが、抗原刺激に続いてT細胞を拡大させる能力、再刺激の非存在下でT細胞の拡大を持続する能力、及び適正なin vitro及び動物モデルでの抗がん活性などの、分子の活性を評価することができる。抗腫瘍関連抗原TFPの効果を評価するアッセイについては、以下でさらに詳述する。
一次T細胞でのTFP発現のウエスタンブロット解析を使用して、単量体及び二量体の存在を検出することができる(例えば、Milone et al,Molecular Therapy 17(8):1453−1464(2009)を参照されたい)。極めて簡潔に述べると、TFPを発現するT細胞(CD4+T細胞とCD8+T細胞との1:1混合物)をin vitroで10日間より長く拡大させ、続いて溶解させ、還元条件下でSDS−PAGEを行う。TFPを、TCR鎖に対する抗体を使用するウエスタンブロット法によって検出する。同じT細胞サブセットを非還元条件下でSDS−PAGE解析に使用すれば、共有結合二量体の形成を評価することができる。
抗原刺激に続くTFP+T細胞のin vitroでの拡大は、フローサイトメトリーによって測定することができる。例えば、CD4+T細胞とCD8+T細胞との混合物をアルファCD3/アルファCD28及びAPCで刺激し、続いて、解析されるGFPをプロモーターの制御下で発現するレンチウイルスベクターで形質導入する。例示的なプロモーターとして、CMV IE遺伝子、EF−1アルファ、ユビキチンC、またはホスホグリセロキナーゼ(PGK)プロモーターが挙げられる。GFPの蛍光は、CD4+及び/またはCD8+T細胞サブセットでの培養の6日目に、フローサイトメトリーによって評価する(例えば、Milone et al.,Molecular Therapy 17(8):1453−1464(2009)を参照されたい)。あるいは、CD4+T細胞とCD8+T細胞との混合物をアルファCD3/アルファCD28被覆磁気ビーズで0日目に刺激し、2Aリボソームスキッピング配列を使用してTFPと共にeGFPを発現するバイシストロニックレンチウイルスベクターを使用して、1日目にTFPを形質導入する。
再刺激の非存在下でのTFP+T細胞の拡大の持続も測定することができる(例えば、Milone et al.,Molecular Therapy 17(8):1453−1464(2009)を参照されたい)。簡潔に述べると、0日目にアルファCD3/アルファCD28被覆磁気ビーズで刺激し、1日目に指定のTFPを形質導入した後、培養8日目にCoulter Multisizer III粒子計数器を使用して平均T細胞容積(fl)を測定する。
動物モデルを使用してTFP−T活性を測定することもできる。例えば、がんを治療するためのヒトBCMA特異的TFP+T細胞を使用する、免疫不全マウスにおける異種移植モデルである(例えば、Milone et al.,Molecular Therapy 17(8):1453−1464(2009)を参照されたい)。極めて簡潔に述べると、がんの確立後、マウスを処置群に従って無作為化する。様々な数の操作したT細胞を、1:1の比率で、がんを有するNOD/SCID/γ−/−マウスに同時注射する。マウス由来の脾臓DNA中の各ベクターのコピー数を、T細胞注射後の様々な時点で評価する。動物は、1週間間隔でがんについて査定する。アルファ腫瘍関連抗原−ゼータTFP+T細胞または偽の形質導入されたT細胞を注射されたマウスにおける末梢血腫瘍関連抗原+がん細胞数を測定する。これらの群についての生存曲線を、ログランク検定を使用して比較する。加えて、NOD/SCID/γ−/−マウスにT細胞を注射してから4週間後の末梢血CD4+及びCD8+T細胞の絶対数も解析することができる。マウスにがん細胞を注射し、3週間後に、eGFPに連結されたTFPをコードするバイシストロニックレンチウイルスベクターによってTFPを発現するように操作したT細胞を注射する。T細胞は、注射前に偽の形質導入細胞と混合することによって45〜50%入力GFP+T細胞に正規化し、フローサイトメトリーによって確認する。動物は、1週間間隔でがんについて査定する。TFP+T細胞群についての生存曲線を、ログランク検定を使用して比較する。
用量依存的なTFP処置応答を評価することができる(例えば、Milone et al.,Molecular Therapy 17(8):1453−1464(2009)を参照されたい)。例えば、TFP T細胞、同等数の偽の形質導入T細胞を21日目に注射したマウス、またはT細胞を注射しなかったマウスにおける末梢血を、がんの確立から35〜70日後に得る。末梢血+がん細胞数を決定するために各群からのマウスを無作為に採血し、35日目及び49日目に屠殺する。残りの動物は、57日目及び70日目に評価する。
細胞増殖及びサイトカイン産生の査定については、例えば、Milone et al.,Molecular Therapy 17(8):1453−1464(2009)で前に記載されている。簡潔に述べると、TFP媒介増殖の査定は、マイクロタイタープレート内で、洗浄したT細胞を、BCMAまたはCD32及びCD137(KT32−BBL)を発現する細胞と、最終T細胞:BCMA発現細胞の比率が2:1になるように混合することによって実施する。BCMA細胞を発現する細胞には、使用前にガンマ放射線を照射する。抗CD3モノクローナル抗体(クローンOKT3)及び抗CD28モノクローナル抗体(クローン9.3)をKT32−BBL細胞を有する培養物に添加して、T細胞増殖刺激の陽性対照とする。何故なら、これらのシグナルは、ex vivoでの長期のCD8+T細胞の拡大を支援するからである。CountBright(商標)蛍光ビーズ(Invitrogen)及びフローサイトメトリーを製造業者によって記載されるように使用して、T細胞を培養物中で計数する。TFP+T細胞は、eGFP−2Aを連結したTFPを発現するレンチウイルスベクターで操作したT細胞を使用して、GFP発現によって特定する。GFPを発現しないTFP+T細胞の場合、TFP+T細胞は、ビオチン化組み換えBCMAタンパク質及び二次アビジン−PE結合体を用いて検出する。T細胞上のCD4+及びCD8+の発現も、特異的モノクローナル抗体(BD Biosciences)を用いて同時に検出する。サイトカインの測定は、ヒトTH1/TH2サイトカインサイトメトリックビーズアレイキット(BD Biosciences)を製造業者の使用説明書に従って使用して、再刺激から24時間後に収集した上清で実施する。FACScalibur(商標)フローサイトメーターを使用して蛍光を査定し、製造業者の使用説明書に従ってデータを解析する。
細胞傷害性は、標準的な51Cr放出アッセイによって査定することができる(例えば、Milone et al.,Molecular Therapy 17(8):1453−1464(2009)を参照されたい)。簡潔に述べると、標的細胞に、37℃で2時間頻繁に撹拌しながら51Cr(NaCrO4として、New England Nuclear)を加え、完全RPMI中で2回洗浄し、マイクロタイタープレート内に播種する。エフェクターT細胞を、ウェル内の完全RPMI中で、様々なエフェクター細胞:標的細胞(E:T)比で標的細胞と混合する。培地のみ(自然放出、SR)またはtriton−X100界面活性剤の1%溶液(全放出、TR)を含有するさらなるウェルも調製する。37℃で4時間のインキュベーション後に、各ウェルからの上清を採集する。次いで、ガンマ粒子カウンター(Packard Instrument Co.,Waltham,Mass)を使用して、放出される51Crを測定する。各条件を少なくとも3連で実施し、次式を使用して溶解率(%)を算出する:溶解(%)=(ER−SR)/(TR−SR)(式中、ERは、各実験条件で放出された平均51Crを表す)。
画像技術を使用して、腫瘍を有する動物モデルにおけるTFPの特異的輸送及び増殖を評価することができる。そのようなアッセイは、例えば、Barrett et al.,Human Gene Therapy 22:1575−1586(2011)に記載されている。簡潔に述べると、NOD/SCID/γc−/−(NSG)マウスにがん細胞をIV注射し、その7日後に、TFP構築物でのエレクトロポレーションから4時間後のT細胞を注射する。そのT細胞に、ホタルルシフェラーゼを発現するようにレンチウイルス構築物で安定的に形質移入し、マウスを生物発光について撮像する。あるいは、がん異種移植モデルにおける単回注射のTFP+T細胞の治療効力及び特異性を、次のように測定することができる。NSGマウスに、ホタルルシフェラーゼを安定的に発現するように形質導入したがん細胞を注射し、続いて7日後に、BCMA TFPをエレクトロポレーションしたT細胞を単回尾静脈注射する。注射後の様々な時点で、動物を撮像する。例えば、代表的なマウスにおけるホタルルシフェラーゼ陽性がんの光子密度ヒートマップを、5日目(処置の2日前)及び8日目(TFP+ PBLの24時間後)に生成することができる。
本明細書の実施例の項に記載するものだけでなく、当技術分野で公知のものを含めた他のアッセイも、本発明の抗BCMA TFP構築物を評価するために使用することができる。
11.治療用途
腫瘍抗原関連疾患または障害
腫瘍細胞上の1つの標的、例えば、BCMA、CD19、CD20、CD22、CD123、MUC16、MSLNなどに指向するがん療法で治療された多くの患者は、時間の経過と共に、代替のシグナル伝達経路及びフィードバックループなどの回避機構が活性化されるにつれて抵抗性になる。二重特異性療法は、回避経路として互いに代用されることの多い標的を組み合わせることによって、これに対処しようとするものである。2つ以上の腫瘍関連抗原に特異的なTCRを有する治療用T細胞集団は、有望な併用療法である。幾つかの実施形態では、二重特異性TFP T細胞は、追加的な抗がん剤と投与される。幾つかの実施形態では、該抗がん剤は、抗体もしくはその断片、別のTFP T細胞、CAR T細胞、または小分子である。例示的な腫瘍関連抗原として、腫瘍胎児抗原(例えば、胎児組織及びがん性体細胞に発現されるもの)、腫瘍ウイルス抗原(例えば、腫瘍化ウイルスによってコードされるもの)、過剰発現/蓄積抗原(例えば、正常組織と新生物組織の両方によって発現され、新生物において発現レベルが非常に高いもの)、がん−精巣抗原(例えば、がん細胞及び精巣及び胎盤などの成人生殖組織によってのみ発現されるもの)、系統限定抗原(例えば、単一のがん組織型によって大部分発現されるもの)、変異抗原(例えば、遺伝子変異または転写の変更の結果としてがんによって発現されるもの)、翻訳後に変更された抗原(例えば、グリコシル化における腫瘍関連の変更などがあるもの)、及びイディオタイプ抗原(例えば、腫瘍細胞が特定のクローン型を発現する、高度に多型の遺伝子に由来するもの、例えば、クローン異常に起因するB細胞、T細胞リンパ腫/白血病におけるものなど)が挙げられるが、これらに限定されない。例示的な腫瘍関連抗原として、アルファ−アクチニン−4、ARTC1、アルファフェトプロテイン(AFP)、BCR−ABL融合タンパク質(b3a2)、B−RAF、CASP−5、CASP−8、ベータ−カテニン、Cdc27、CDK4、CDK12、CDKN2A、CLPP、COA−1、CSNK1A1、CD79、CD79B、dek−can融合タンパク質、EFTUD2、伸長因子2、ETV6−AML1融合タンパク質、FLT3−ITD、FNDC3B、FN1、GAS7、GPNMB、HAUS3、HSDL1、LDLR−フコシルトランスフェラーゼAS融合タンパク質、HLA−A2d、HLA−A11d、hsp70−2、MART2、MATN、MEI、MUM−1f、MUM−2、MUM−3、neo−PAP、I型ミオシン、NFYC、OGT、OS−9、p53、pml−RARアルファ融合タンパク質、PPP1R3B、PRDX5、PTPRK、K−ras、N−ras、RBAF600、SIRT2、SNRPD1、SYT−SSX1または−SSX2融合タンパク質、TGF−ベータRII、トリオースリン酸イソメラーゼ、BAGE−1、D393−CD20n、サイクリン−A1、GAGE−1、GAGE−2、GAGE−8、GAGE−3、GAGE−4、GAGE−5、GAGE−6、GAGE−7、GnTVf、HERV−K−MEL、KK−LC−1、KM−HN−1、LAGE−1、LY6K、MAGE−A1、MAGE−A2、MAGE−A3、MAGE−A4、MAGE−A6、MAGE−A9、MAGE−A10、MAGE−A12m、MAGE−C1、MAGE−C2、mucink、NA88−A、NY−ESO−1/LAGE−2、SAGE、Sp17、SSX−2、SSX−4、TAG−1、TAG−2、TRAG−3、TRP2−INT2g、XAGE−1b/GAGED2a、遺伝子/タンパク質、CEA、gp100/Pmel17、マンマグロビン−A、Melan−A/MART−1、NY−BR−1、OA1、PAP、PSA、RAB38/NY−MEL−1、TRP−1/gp75、TRP−2、チロシナーゼ、アディポフィリン、AIM−2、ALDH1A1、BCLX(L)、BING−4、CALCA、CD45、CD274、CPSF、サイクリンD1、DKK1、ENAH(hMena)、EpCAM、EphA3、EZH2、FGF5、グリピカン−3、G250/MN/CAIX、HER−2/neu、HLA−DOB、ヘプシン、IDO1、IGF2B3、IL13Rアルファ2、腸カルボキシエステラーゼ、アルファ−フェトプロテイン、カリクレイン4、KIF20A、Lengsin、M−CSF、MCSP、mdm−2、Meloe、ミッドカイン、MMP−2、MMP−7、MUC1、MUC5AC、p53、PAX5、PBF、PRAME、PSMA、RAGE−1、RGS5、RhoC、RNF43、RU2AS、セセルニン1、SOX10、STEAP1、サバイビン、テロメラーゼ、TPBG、VEGF、及びWT1の抗原が挙げられるが、これらに限定されない。
腫瘍抗原関連疾患または障害
腫瘍細胞上の1つの標的、例えば、BCMA、CD19、CD20、CD22、CD123、MUC16、MSLNなどに指向するがん療法で治療された多くの患者は、時間の経過と共に、代替のシグナル伝達経路及びフィードバックループなどの回避機構が活性化されるにつれて抵抗性になる。二重特異性療法は、回避経路として互いに代用されることの多い標的を組み合わせることによって、これに対処しようとするものである。2つ以上の腫瘍関連抗原に特異的なTCRを有する治療用T細胞集団は、有望な併用療法である。幾つかの実施形態では、二重特異性TFP T細胞は、追加的な抗がん剤と投与される。幾つかの実施形態では、該抗がん剤は、抗体もしくはその断片、別のTFP T細胞、CAR T細胞、または小分子である。例示的な腫瘍関連抗原として、腫瘍胎児抗原(例えば、胎児組織及びがん性体細胞に発現されるもの)、腫瘍ウイルス抗原(例えば、腫瘍化ウイルスによってコードされるもの)、過剰発現/蓄積抗原(例えば、正常組織と新生物組織の両方によって発現され、新生物において発現レベルが非常に高いもの)、がん−精巣抗原(例えば、がん細胞及び精巣及び胎盤などの成人生殖組織によってのみ発現されるもの)、系統限定抗原(例えば、単一のがん組織型によって大部分発現されるもの)、変異抗原(例えば、遺伝子変異または転写の変更の結果としてがんによって発現されるもの)、翻訳後に変更された抗原(例えば、グリコシル化における腫瘍関連の変更などがあるもの)、及びイディオタイプ抗原(例えば、腫瘍細胞が特定のクローン型を発現する、高度に多型の遺伝子に由来するもの、例えば、クローン異常に起因するB細胞、T細胞リンパ腫/白血病におけるものなど)が挙げられるが、これらに限定されない。例示的な腫瘍関連抗原として、アルファ−アクチニン−4、ARTC1、アルファフェトプロテイン(AFP)、BCR−ABL融合タンパク質(b3a2)、B−RAF、CASP−5、CASP−8、ベータ−カテニン、Cdc27、CDK4、CDK12、CDKN2A、CLPP、COA−1、CSNK1A1、CD79、CD79B、dek−can融合タンパク質、EFTUD2、伸長因子2、ETV6−AML1融合タンパク質、FLT3−ITD、FNDC3B、FN1、GAS7、GPNMB、HAUS3、HSDL1、LDLR−フコシルトランスフェラーゼAS融合タンパク質、HLA−A2d、HLA−A11d、hsp70−2、MART2、MATN、MEI、MUM−1f、MUM−2、MUM−3、neo−PAP、I型ミオシン、NFYC、OGT、OS−9、p53、pml−RARアルファ融合タンパク質、PPP1R3B、PRDX5、PTPRK、K−ras、N−ras、RBAF600、SIRT2、SNRPD1、SYT−SSX1または−SSX2融合タンパク質、TGF−ベータRII、トリオースリン酸イソメラーゼ、BAGE−1、D393−CD20n、サイクリン−A1、GAGE−1、GAGE−2、GAGE−8、GAGE−3、GAGE−4、GAGE−5、GAGE−6、GAGE−7、GnTVf、HERV−K−MEL、KK−LC−1、KM−HN−1、LAGE−1、LY6K、MAGE−A1、MAGE−A2、MAGE−A3、MAGE−A4、MAGE−A6、MAGE−A9、MAGE−A10、MAGE−A12m、MAGE−C1、MAGE−C2、mucink、NA88−A、NY−ESO−1/LAGE−2、SAGE、Sp17、SSX−2、SSX−4、TAG−1、TAG−2、TRAG−3、TRP2−INT2g、XAGE−1b/GAGED2a、遺伝子/タンパク質、CEA、gp100/Pmel17、マンマグロビン−A、Melan−A/MART−1、NY−BR−1、OA1、PAP、PSA、RAB38/NY−MEL−1、TRP−1/gp75、TRP−2、チロシナーゼ、アディポフィリン、AIM−2、ALDH1A1、BCLX(L)、BING−4、CALCA、CD45、CD274、CPSF、サイクリンD1、DKK1、ENAH(hMena)、EpCAM、EphA3、EZH2、FGF5、グリピカン−3、G250/MN/CAIX、HER−2/neu、HLA−DOB、ヘプシン、IDO1、IGF2B3、IL13Rアルファ2、腸カルボキシエステラーゼ、アルファ−フェトプロテイン、カリクレイン4、KIF20A、Lengsin、M−CSF、MCSP、mdm−2、Meloe、ミッドカイン、MMP−2、MMP−7、MUC1、MUC5AC、p53、PAX5、PBF、PRAME、PSMA、RAGE−1、RGS5、RhoC、RNF43、RU2AS、セセルニン1、SOX10、STEAP1、サバイビン、テロメラーゼ、TPBG、VEGF、及びWT1の抗原が挙げられるが、これらに限定されない。
一態様では、本発明は、少なくとも1つの腫瘍関連抗原の発現に関連する疾患を治療するための方法を提供する。一態様では、本発明は、腫瘍の一部が腫瘍関連抗原に対して陰性であり、腫瘍の一部が腫瘍関連抗原に対して陽性である疾患を治療するための方法を提供する。例えば、本発明の抗体またはTFPは、該腫瘍抗原の発現の上昇に関連する疾患について治療を受けてきた対象を治療するのに有用であり、ここで、腫瘍関連抗原のレベルの上昇について治療を受けてきた対象は、腫瘍関連抗原のレベルの上昇に関連する疾患を呈する。
一態様では、本発明は、哺乳動物のT細胞で発現させるためのプロモーターに作動可能に連結された抗腫瘍関連抗原抗体またはTFPを含むベクターに関する。一態様では、本発明は、腫瘍関連抗原を発現する腫瘍の治療に使用される、腫瘍関連抗原TFPを発現する組み換えT細胞を提供し、ここで、腫瘍関連抗原TFPを発現する組み換えT細胞は、腫瘍関連抗原TFP−Tと呼ばれる。一態様では、本発明の腫瘍関連抗原TFP−Tは、TFP−Tが腫瘍細胞を標的化し、腫瘍の増殖が阻害されるように、その表面上に発現した本発明の少なくとも1つの腫瘍関連抗原TFPに腫瘍細胞を接触させることができる。
一態様では、本発明は、腫瘍関連抗原を発現する腫瘍細胞の増殖を阻害する方法であって、TFP−Tが抗原に応答して活性化され、がん細胞を標的化するように、腫瘍細胞を本発明の腫瘍関連抗原抗体またはTFP T細胞と接触させることを含み、腫瘍の増殖が阻害される方法に関する。
一態様では、本発明は、対象におけるがんを治療する方法に関する。該方法は、対象におけるがんが治療されるように、対象に本発明の腫瘍関連抗原抗体、二重特異性抗体、またはTFP T細胞を投与することを含む。本発明の腫瘍関連抗原TFP T細胞によって治療可能ながんの例は、腫瘍関連抗原の発現に関連するがんである。一態様では、がんは骨髄腫である。一態様では、がんはリンパ腫である。一態様では、がんは結腸癌である。
幾つかの実施形態では、腫瘍関連抗原抗体またはTFP療法は、1つまたは複数の追加療法と組み合わせて使用することができる。幾つかの場合では、そのような追加療法は、化学療法薬、例えば、シクロホスファミドを含む。幾つかの場合では、そのような追加療法は、外科的切除または放射線治療を含む。
一態様では、本明細書に開示するのは、細胞療法の方法であって、T細胞が、TFPを発現するように遺伝子改変され、TFP発現T細胞が、それを必要とするレシピエントに注入される方法である。注入された細胞は、レシピエントにおいて腫瘍細胞を殺傷することができる。抗体療法とは異なり、TFP発現T細胞は、in vivoでの複製が可能であり、それによって長期の持続性がもたらされることから、持続的に腫瘍を制御することができる。様々な態様では、患者に投与されたT細胞またはその子孫は、患者へのT細胞の投与後、少なくとも4か月、5か月、6か月、7か月、8か月、9か月、10か月、11か月、12か月、13か月、14か月、15か月、16か月、17か月、18か月、19か月、20か月、21か月、22か月、23か月、2年、3年、4年、または5年、患者内で存続する。
幾つかの場合では、本明細に開示するのは、細胞療法の一種であって、T細胞が、例えば、in vitro転写RNAによって、TFPを一過性に発現するように改変され、TFP発現T細胞が、それを必要とするレシピエントに注入される療法である。注入された細胞は、レシピエントにおいて腫瘍細胞を殺傷することができる。よって、様々な態様において、患者に投与されたT細胞は、患者へのT細胞の投与後、1か月未満、例えば、3週間、2週間、または1週間存在する。
いかなる特定の理論にも束縛されることを望むものではないが、TFP発現T細胞によって誘発される抗腫瘍免疫応答は、能動免疫応答でも受動免疫応答でもよく、あるいは、直接対間接免疫応答によるものであってもよい。一態様では、TFPが形質導入されたT細胞は、腫瘍関連抗原を発現するヒトがん細胞に応答して特定の炎症誘発性サイトカインの分泌及び強力な細胞溶解活性を呈し、可溶性腫瘍関連抗原抑制に抵抗し、バイスタンダー殺傷を媒介し、及び/または確立されたヒト腫瘍の退行を媒介する。例えば、腫瘍関連抗原を発現する腫瘍の不均一な領域内の無抗原腫瘍細胞は、隣接する抗原陽性がん細胞に対して先に応答している腫瘍関連抗原再指向性T細胞による間接的な破壊を受けやすい可能性がある。
一態様では、本発明のヒトTFP改変T細胞は、哺乳動物におけるex vivoでの免疫化及び/またはin vivo療法のためのワクチンの一種である。一態様では、哺乳動物はヒトである。
ex vivoでの免疫化に関して、細胞を哺乳動物に投与する前に、次のうちの少なくとも1つがin vitroで行われる:i)細胞の拡大、ii)TFPをコードする核酸の細胞への導入、またはiii)細胞の凍結保存。
ex vivoでの手順は、当技術分野で周知であり、以下でより詳細に考察する。簡潔に述べると、細胞を哺乳動物(例えば、ヒト)から単離し、本明細書に開示するTFPを発現するベクターで遺伝子改変する(すなわち、in vitroで形質導入または形質移入する)。TFP改変細胞は、哺乳動物のレシピエントに投与して、治療上の利益をもたらすことができる。哺乳動物のレシピエントは、ヒトであってもよく、TFP改変細胞は、レシピエントに対して自己由来であり得る。あるいは、細胞は、レシピエントに対して同種異系、同系、または異種であり得る。
造血幹細胞及び前駆細胞をex vivoで拡大させる手順については、例えば、米国特許第5,199,942号(参照により本明細書に援用される)に記載されており、本発明の細胞に適用することができる。他の適切な方法が当技術分野で公知であり、したがって、本発明は、細胞をex vivoで拡大させるいかなる特定の方法にも限定されない。簡潔に述べると、T細胞のex vivoでの培養及び拡大は、(1)哺乳動物由来のCD34+造血幹細胞及び前駆細胞を末梢血採集物または骨髄外植体から収集すること;ならびに(2)そのような細胞をex vivoで拡大させることを含む。米国特許第5,199,942号に記載される細胞増殖因子に加えて、flt3−L、IL−1、IL−3、及びc−kitリガンドなどの他の因子を細胞の培養及び拡大に使用することができる。
ex vivoでの免疫化に関する細胞ベースのワクチンに加えて、本発明はまた、患者において抗原に対する免疫応答を誘発するin vivoでの免疫化のための組成物及び方法を提供する。
一般に、本明細書に記載するように活性化及び拡大させた細胞は、免疫不全の個体に生じる疾患の治療及び予防に利用することができる。特に、本発明のTFP改変T細胞は、腫瘍関連抗原の発現に関連する疾患、障害、及び状態の治療に使用される。ある種の態様では、本発明の細胞は、腫瘍関連抗原の発現に関連する疾患、障害、及び状態を発症するリスクのある患者の治療に使用される。よって、本発明は、腫瘍関連抗原の発現に関連する疾患、障害、及び状態の治療または予防するための方法であって、それを必要とする対象に治療的有効量の本発明のTFP改変T細胞を投与することを含む方法を提供する。
一態様では、本発明の抗体またはTFP−T細胞は、がんもしくは悪性腫瘍などの増殖性疾患、または前がん状態を治療するために使用することができる。一態様では、がんは骨髄腫である。一態様では、がんはリンパ腫である。一態様では、がんは結腸癌である。さらに、腫瘍関連抗原の発現に関連する疾患として、例えば、腫瘍関連抗原を発現する、非定型及び/または非古典的がん、悪性腫瘍、前がん状態、または増殖性疾患が挙げられるが、これらに限定されない。腫瘍関連抗原の発現に関連する非がん関連適応症は、抗原によって異なり、例えば、感染性疾患、自己免疫疾患(例えば、ループス)、炎症性障害(アレルギー及び喘息)、及び移植であるが、これらに限定されない。
本発明の抗体またはTFP改変T細胞は、単独で投与されても、あるいは希釈剤及び/または他の成分、例えば、IL−2もしくはIL−12、または他のサイトカインもしくは細胞集団と組み合わせた医薬組成物として投与されてもよい。
本発明はまた、腫瘍関連抗原を発現する細胞集団の増殖を阻害するまたは該細胞集団を低減させるための方法であって、腫瘍関連抗原を発現する細胞を含む細胞集団を、該腫瘍関連抗原を発現する細胞に結合する本発明の抗腫瘍関連抗原TFP−T細胞と接触させることを含む方法を提供する。特定の態様では、本発明は、腫瘍関連抗原を発現するがん細胞集団の増殖を阻害するまたは該細胞集団を低減させるための方法であって、腫瘍関連抗原を発現するがん細胞集団を、該腫瘍関連抗原を発現する細胞に結合する本発明の抗腫瘍関連抗原抗体またはTFP−T細胞と接触させることを含む方法を提供する。一態様では、本発明は、腫瘍関連抗原を発現するがん細胞集団の増殖を阻害するまたは該細胞集団を低減させるための方法であって、腫瘍関連抗原を発現するがん細胞集団を、該腫瘍関連抗原を発現する細胞に結合する本発明の抗腫瘍関連抗原抗体またはTFP−T細胞と接触させることを含む方法を提供する。ある種の態様では、本発明の抗腫瘍関連抗原抗体またはTFP−T細胞は、多発性骨髄腫または腫瘍関連抗原を発現する細胞に関連する別のがんを有する対象またはそれらの動物モデルにおいて、細胞及び/またはがん細胞の分量、数、量、または割合(%)を、陰性対照に対して少なくとも25%、少なくとも30%、少なくとも40%、少なくとも50%、少なくとも65%、少なくとも75%、少なくとも85%、少なくとも95%、または少なくとも99%低減させる。一態様では、対象はヒトである。
本発明はまた、腫瘍関連抗原を発現する細胞に関連する疾患(例えば、腫瘍関連抗原を発現するがん)を予防する、治療する、及び/または管理するための方法であって、必要とする対象に、該腫瘍関連抗原を発現する細胞に結合する本発明の抗腫瘍関連抗原抗体またはTFP−T細胞を投与することを含む方法を提供する。一態様では、対象はヒトである。腫瘍関連抗原を発現する細胞に関連する障害の非限定的な例として、自己免疫性障害(ループスなど)、炎症性障害(アレルギー及び喘息など)、及びがん(血液のがん、または腫瘍関連抗原を発現する非定型がんなど)が挙げられる。
本発明はまた、腫瘍関連抗原を発現する細胞に関連する疾患を予防する、治療する、及び/または管理するための方法であって、必要とする対象に、該腫瘍関連抗原を発現する細胞に結合する本発明の抗腫瘍関連抗原抗体またはTFP−T細胞を投与することを含む方法を提供する。一態様では、対象はヒトである。
本発明は、腫瘍関連抗原を発現する細胞に関連するがんの再発を予防するための方法であって、それを必要とする対象に、該腫瘍関連抗原を発現する細胞に結合する本発明の抗腫瘍関連抗原抗体またはTFP−T細胞を投与することを含む方法を提供する。一態様では、該方法は、それを必要とする対象に、該腫瘍関連抗原を発現する細胞に結合する本明細書に記載する有効量の抗腫瘍関連抗原抗体またはTFP−T細胞を、有効量の別の療法と組み合わせて投与することを含む。
12.併用療法
本明細書に記載する抗体またはTFP発現細胞は、他の公知の作用物質及び療法と組み合わせて使用されてもよい。「組み合わせて」投与されるとは、本明細書で使用される場合、対象が障害に罹患する間に2つ(またはそれ以上)の異なる治療が対象に送達されること、例えば、対象が障害と診断された後、かつ障害が治癒もしくは排除されるかまたは他の理由で治療が中止される前に、2つ以上の治療が送達されることを意味する。幾つかの実施形態では、一方の治療の送達が、第2の治療の送達の開始時に依然として行われており、そのために投与に関して重複がある。これは、本明細書において「同時(simultaneous)」また「同時(concurrent)送達」と呼ばれることがある。他の実施形態では、一方の治療の送達は、他方の治療の開始前に終了する。いずれかの場合の幾つかの実施形態では、治療は、併用投与であるために、より有効である。例えば、第2の治療は、より有効であり、例えば、第1の治療の非存在下で第2の治療を投与した場合に見られるよりも、少ない第2の治療で同等な効果が見られるか、もしくは第2の治療が症状を大幅に低減させるか、または同等な状況が第1の治療で見られる。幾つかの実施形態では、送達は、症状、または障害に関係する他のパラメータの低減が、一方の治療が他方の非存在下で送達されるときに観察されるものよりも大きくなるようなものである。2つの治療の効果は、部分的に相加的であるか、完全に相加的であるか、または相加的以上であり得る。送達は、送達される第1の治療の効果が、第2の治療が送達されても検出可能であるようなものであり得る。
本明細書に記載する抗体またはTFP発現細胞は、他の公知の作用物質及び療法と組み合わせて使用されてもよい。「組み合わせて」投与されるとは、本明細書で使用される場合、対象が障害に罹患する間に2つ(またはそれ以上)の異なる治療が対象に送達されること、例えば、対象が障害と診断された後、かつ障害が治癒もしくは排除されるかまたは他の理由で治療が中止される前に、2つ以上の治療が送達されることを意味する。幾つかの実施形態では、一方の治療の送達が、第2の治療の送達の開始時に依然として行われており、そのために投与に関して重複がある。これは、本明細書において「同時(simultaneous)」また「同時(concurrent)送達」と呼ばれることがある。他の実施形態では、一方の治療の送達は、他方の治療の開始前に終了する。いずれかの場合の幾つかの実施形態では、治療は、併用投与であるために、より有効である。例えば、第2の治療は、より有効であり、例えば、第1の治療の非存在下で第2の治療を投与した場合に見られるよりも、少ない第2の治療で同等な効果が見られるか、もしくは第2の治療が症状を大幅に低減させるか、または同等な状況が第1の治療で見られる。幾つかの実施形態では、送達は、症状、または障害に関係する他のパラメータの低減が、一方の治療が他方の非存在下で送達されるときに観察されるものよりも大きくなるようなものである。2つの治療の効果は、部分的に相加的であるか、完全に相加的であるか、または相加的以上であり得る。送達は、送達される第1の治療の効果が、第2の治療が送達されても検出可能であるようなものであり得る。
幾つかの実施形態では、「少なくとも1つの追加治療剤」には、TFP発現細胞が含まれる。提供するのはまた、同じもしくは異なる標的抗原、または同じ標的抗原上の同じもしくは異なるエピトープに結合する、複数のTFPを発現するT細胞である。提供するのはまた、第1のサブセットのT細胞が第1のTFPを発現し、第2のサブセットのT細胞が第2のTFPを発現する、T細胞の集団である。
本明細書に記載するTFP発現細胞及び少なくとも1つの追加治療剤は、同じもしくは別々の組成物で同時に投与することも、または逐次投与することもできる。逐次投与の場合、本明細書に記載するTFP発現細胞を1番目に、追加作用物質を2番目に投与することができ、または投与の順序を逆にすることができる。
さらなる態様では、本明細書に記載するTFP発現細胞は、手術、化学療法、放射線、免疫抑制剤、例えば、シクロスポリン、アザチオプリン、メトトレキサート、ミコフェノレート、及びタクロリムス、抗体または他の免疫除去剤、例えば、アレムツズマブ、抗CD3抗体、もしくは他の抗体療法、シクロホスファミド、フルダラビン、シクロスポリン、タクロリムス、ラパマイシン、ミコフェノール酸、ステロイド、ロミデプシン、サイトカイン、及び放射線照射、ペプチドワクチン、例えば、Izumoto et al.2008 J Neurosurg 108:963−971に記載されるものと組み合わせた治療レジメンに使用されてもよい。
一実施形態では、対象に、TFP発現細胞の投与に関連する副作用を低減または改善する作用物質を投与することができる。TFP発現細胞の投与に関連する副作用として、サイトカイン放出症候群(CRS)、及びマクロファージ活性化症候群(MAS)とも呼ばれる血球貪食性リンパ組織球症(HLH)が挙げられるが、これらに限定されない。CRSの症状として、高熱、嘔気、一過性低血圧、低酸素症などが挙げられる。したがって、本明細書に記載する方法は、本明細書に記載するTFP発現細胞を対象に投与すること、及びTFP発現細胞での治療に起因する可溶性因子のレベルの上昇を管理する作用物質をさらに投与することを含むことができる。一実施形態では、対象において上昇する可溶性因子は、IFN−γ、TNFα、IL−2、及びIL−6のうちの1つまたは複数である。したがって、この副作用を治療するために投与される作用物質は、これらの可溶性因子のうちの1つまたは複数を中和する作用物質であり得る。そのような作用物質として、ステロイド、TNFαの阻害剤、及びIL−6の阻害剤が挙げられるが、これらに限定されない。TNFαの阻害剤の例は、エタネルセプトである(エンブレル(登録商標)という名称で市販されている)。IL−6の阻害剤の例は、トシリズマブである(ACTEMRA(登録商標)という名称で市販されている)。
一実施形態では、対象に、TFP発現細胞の活性を強化する作用物質を投与することができる。例えば、一実施形態では、作用物質は、抑制分子を阻害する作用物質であり得る。抑制分子、例えば、プログラム死1(PD1)は、幾つかの実施形態では、TFP発現細胞の免疫エフェクター応答開始能力を減少させることがある。抑制分子の例として、PD1、PD−L1、CTLA4、TIM3、LAG3、VISTA、BTLA、TIGIT、LAIR1、CD160、2B4、及びTGFRベータが挙げられる。抑制分子の阻害は、例えば、DNA、RNA、またはタンパク質レベルでの阻害によるものは、TFP発現細胞の性能を最適化することができる。実施形態では、抑制核酸、例えば、dsRNA、例えば、siRNAまたはshRNAを使用して、TFP発現細胞内の抑制分子の発現を阻害することができる。ある実施形態では、阻害剤はshRNAである。ある実施形態では、抑制分子は、TFP発現細胞内で阻害される。これらの実施形態では、抑制分子の発現を阻害するdsRNA分子は、TFPの構成要素、例えば、構成要素のすべてをコードする核酸に連結される。一実施形態では、抑制シグナルの阻害剤は、例えば、抑制分子に結合する抗体または抗体断片であり得る。例えば、該作用物質は、PD1、PD−L1、PD−L2、またはCTLA4に結合する抗体(例えば、イピリムマブ(MDX−010及びMDX−101とも呼ばれ、YERVOY(登録商標)として市販されている);Bristol−Myers Squibb;トレメリムマブ(Pfizerから入手可能なIgG2モノクローナル抗体、以前はチシリムマブとして公知であったもの、CP−675,206))または抗体断片であり得る。ある実施形態では、該作用物質は、T細胞免疫グロブリン及びムチンドメイン含有分子−3(TIM3)に結合する抗体または抗体断片である。ある実施形態では、該作用物質は、リンパ球活性化遺伝子3(LAG3)に結合する抗体または抗体断片である。
幾つかの実施形態では、TFP発現細胞の活性を強化する作用物質は、例えば、第1のドメインと第2のドメインを含む融合タンパク質であって、第1のドメインが、抑制分子、またはその断片であり、第2のドメインが、正のシグナルに関連するポリペプチド、例えば、本明細書に記載するような細胞内シグナル伝達ドメインを含むポリペプチドである、融合タンパク質である。幾つかの実施形態では、正のシグナルに関連するポリペプチドは、CD28、CD27、ICOSの共刺激ドメイン、例えば、CD28、CD27、及び/またはICOSの細胞内シグナル伝達ドメイン、及び/または一次シグナル伝達ドメイン、例えば、CD3ゼータの、例えば、本明細書に記載するものを含むことができる。一実施形態では、融合タンパク質は、TFPを発現する細胞と同じ細胞によって発現される。別の実施形態では、融合タンパク質は、抗腫瘍関連抗原TFPを発現しない細胞、例えばT細胞によって発現される。
13.医薬組成物
本発明の医薬組成物は、本明細書に記載する通りのTFP発現細胞、例えば、複数のTFP発現細胞を、1つまたは複数の医薬としてまたは生理学的に許容される担体、希釈剤、または賦形剤と組み合わせて含んでもよい。そのような組成物は、緩衝液、例えば、中性緩衝生理食塩水、リン酸緩衝食塩水など;炭水化物、例えば、グルコース、マンノース、スクロース、またはデキストラン、マンニトール;タンパク質;ポリペプチドまたはアミノ酸、例えば、グリシン;酸化防止剤;キレート剤、例えば、EDTA、またはグルタチオン;アジュバント(例えば、水酸化アルミニウム);及び防腐剤を含んでもよい。本発明の組成物は、一態様では、静脈内投与用に製剤化される。
本発明の医薬組成物は、本明細書に記載する通りのTFP発現細胞、例えば、複数のTFP発現細胞を、1つまたは複数の医薬としてまたは生理学的に許容される担体、希釈剤、または賦形剤と組み合わせて含んでもよい。そのような組成物は、緩衝液、例えば、中性緩衝生理食塩水、リン酸緩衝食塩水など;炭水化物、例えば、グルコース、マンノース、スクロース、またはデキストラン、マンニトール;タンパク質;ポリペプチドまたはアミノ酸、例えば、グリシン;酸化防止剤;キレート剤、例えば、EDTA、またはグルタチオン;アジュバント(例えば、水酸化アルミニウム);及び防腐剤を含んでもよい。本発明の組成物は、一態様では、静脈内投与用に製剤化される。
本発明の医薬組成物は、治療しようとする(または予防しようとする)疾患に適した方式で投与されてもよい。適正な投与量は、臨床試験によって決定されてもよいが、投与の分量及び頻度は、患者の状態、及び患者の疾患のタイプ及び重症度などの因子によって決定されることとなる。
一実施形態では、医薬組成物は、例えば、エンドトキシン、マイコプラズマ、複製可能なレンチウイルス(RCL)、p24、VSV−G核酸、HIV gag、残留する抗CD3/抗CD28被覆ビーズ、マウス抗体、プールヒト血清、ウシ血清アルブミン、ウシ血清、培養培地成分、ベクターパッケージング細胞またはプラスミド成分、細菌、及び真菌からなる群から選択される混入物質を実質的に含まない、例えば、検出可能レベルのこれらの混入物質が存在しない。一実施形態では、細菌は、Alcaligenes faecalis、Candida albicans、Escherichia coli、Haemophilus influenza、Neisseria meningitides、Pseudomonas aeruginosa、Staphylococcus aureus、Streptococcus pneumonia、及びStreptococcus pyogenes A群からなる群から選択される少なくとも1種である。
「免疫学的有効量」、「抗腫瘍有効量」、「腫瘍阻害有効量」、または「治療量」が示されるとき、投与しようとする本発明の組成物の正確な量は、患者(対象)の年齢、体重、腫瘍サイズ、感染症または転移の程度、及び状態の個体差を考慮して、医師によって決定され得る。一般論として述べると、本明細書に記載するT細胞を含む医薬組成物は、104〜109細胞/kg体重、幾つかの場合では、105〜106細胞/kg体重(これらの範囲内のすべての整数値を含む)の投与量で投与されてもよい。T細胞組成物はまた、これらの投与量で複数回投与されてもよい。細胞は、免疫療法で一般に公知の注入技法を使用することによって投与することができる(例えば、Rosenberg et al.,New Eng.J.of Med.319:1676,1988を参照されたい)。
ある種の態様では、活性化T細胞を対象に投与し、その後続いて再採血し(またはアフェレーシスを行い)、そこからのT細胞を本発明に従って活性化し、活性化及び拡大させたT細胞を患者に再注入することが所望されることがある。このプロセスは、数週間毎に複数回実施することができる。ある種の態様では、T細胞は、10cc〜400ccの採取血液から活性化することができる。ある種の態様では、T細胞は、20cc、30cc、40cc、50cc、60cc、70cc、80cc、90cc、または100ccの採取血液から活性化される。
主題組成物の投与は、エアロゾル吸入、注射、経口摂取、輸血、埋め込み、または移植による方式を含めた、任意の便利な方式で行われてもよい。本明細書に記載する組成物は、患者に、経動脈的に、皮下に、皮内に、腫瘍内に、節内に、髄内に、筋肉内に、静脈内(i.v.)注射により、または腹腔内に投与されてもよい。一態様では、本発明のT細胞組成物は、患者に、皮内または皮下注射によって投与される。一態様では、本発明のT細胞組成物は、i.v.注射によって投与される。T細胞の組成物は、腫瘍、リンパ節、または感染症の部位に直接注射されてもよい。
特定の例示的な態様では、対象は、白血球搬出法を受けてもよく、この方法では、白血球が、ex vivoで収集、濃厚化、または除去されて、関心対象の細胞、例えば、T細胞が選択及び/または単離される。これらのT細胞単離物は、当技術分野で公知の方法によって拡大されてもよく、本発明の1つまたは複数のTFP構築物が導入され、それによって本発明のTFP発現T細胞を作出することができるように処理されてもよい。それを必要とする対象は、その後、高用量の化学療法での標準的治療に続いて末梢血幹細胞移植を受けてもよい。ある種の態様では、移植に続いて、または移植と同時に、対象は、本発明の拡大されたTFP T細胞の注入を受ける。追加的な態様において、拡大された細胞は、手術の前または手術に続いて投与される。
患者に投与しようとする上記治療の投与量は、治療されている状態の正確な性質及び治療のレシピエントに応じて異なることとなる。ヒトに投与する場合の投与量の調整は、当技術分野に受け入れられている慣例に従って実施することができる。例えば、アレムツズマブ(CAMPATH(登録商標))の用量は、一般に、成人患者には1〜約100mgの範囲内であり、通常、1〜30日間の期間にわたって毎日投与される。好ましい日用量は、1日当たり1〜10mgであるが、幾つかの場合では、1日当たり40mgまでの、より多い用量が使用されてもよい(米国特許第6,120,766号に記載されている)。
一実施形態では、TFPは、T細胞に、例えば、in vitro転写を使用して導入され、対象(例えば、ヒト)は、本発明のTFP T細胞の初回投与、及び本発明のTFP T細胞の1回またな複数回の後続投与を受け、ここで、1回または複数回の後続投与は、前の投与後15日未満、例えば、14、13、12、11、10、9、8、7、6、5、4、3、または2日未満に施される。一実施形態では、1週間当たり2回以上の本発明のTFP T細胞の投与が、対象(例えば、ヒト)に施され、例えば、1週間当たり、2、3、または4回の本発明のTFP T細胞の投与が施される。一実施形態では、対象(例えば、ヒト対象)は、1週間当たり2回以上のTFP T細胞の投与を受け(例えば、1週間当たり2、3、または4回の投与)(本明細書ではサイクルとも呼ばれる)、続いて1週間はTFP T細胞の投与を受けず、次いで1回または複数回のTFP T細胞の追加投与(例えば、1週間当たり2回以上のTFP T細胞の投与)が対象に施される。別の実施形態では、対象(例えば、ヒト対象)は、2回以上のサイクルのTFP T細胞を受け、各サイクルの間の時間は、10、9、8、7、6、5、4、または3日未満である。一実施形態では、TFP T細胞は、1日おきに投与されて、1週間当たり3回投与される。一実施形態では、本発明のTFP T細胞は、少なくとも2、3、4、5、6、7、8週間またはそれ以上にわたって投与される。
一態様では、腫瘍関連抗原TFP T細胞は、レンチウイルスなどのレンチウイルスベクターを使用して生成される。そのように生成されたTFP−T細胞は、安定なTFP発現を有する。
一態様では、TFP T細胞は、形質導入後、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15日間、TFPベクターを一過性に発現する。TFPの一過性発現は、RNA TFPベクター送達によってもたらすことができる。一態様では、TFP RNAは、エレクトロポレーションによってT細胞に形質導入される。
一過性に発現するTFP T細胞(特に、マウスscFvを有するTFP T細胞)を使用して治療されている患者に生じるおそれがある潜在的な問題は、複数回の治療後のアナフィラキシーである。
この理論に束縛されるものではないが、そのようなアナフィラキシー反応は、患者において体液性抗TFP応答、すなわち、抗IgEアイソタイプを有する抗TFP抗体が発生していることによって引き起こされる可能性があると考えられる。患者の抗体産生細胞は、抗原への曝露が10〜14日間中断されると、IgGアイソタイプ(アナフィラキシーを引き起こさない)からIgEアイソタイプへのクラススイッチを受けると思われる。
患者が一過性TFP療法の過程で抗TFP抗体応答(RNA形質導入によって生成されるものなど)を生じるリスクが高いならば、TFP T細胞注入の中断は、10日〜14日より長く続けるべきではない。
以下の実験例を参照することによって、本発明をさらに詳述する。これらの実施例は、例示のみを目的として提供されており、別段の指定がない限り、限定は意図されていない。よって、本発明は、決して以下の実施例に限定されると解釈されるものではなく、本明細書で提供する教示の結果として明らかになる、ありとあらゆる変形を包含すると解釈されるものとする。さらなる説明はなくとも、当業者であれば、前述の説明及び以下の実例を使用して、本発明の化合物を作製及び利用することができ、特許請求する方法を実施することができると考えられる。以下の実施例は、本発明の様々な態様を具体的に指摘するものであり、決して本開示の残りの部分を限定するものとして解釈されるべきではない。
以下の実施例は、がん細胞上の2つ以上の標的抗原に特異性を有する、操作されたT細胞受容体について記載する。加えて、同じ細胞または細胞の組み合わせのいずれかで、2つ以上の抗原に特異的なTCRを有するT細胞の集団を作出する方法について記載する。一実施形態では、単一のTCRサブユニットに両方の結合ドメイン(例えば、scFv、sdAbなど)をタンデムに有するTFP構築物が作製される。一実施形態では、単一のTCRに両方の結合ドメインを有し、1つの結合ドメインが2つのTCRサブユニット(例えば、両方ともイプシロンサブユニット、イプシロンサブユニット及びガンマサブユニットなど)の各々にある、TFP構築物が作製される。別の実施形態では、TFP構築物は、別々のレンチウイルスベクターで個々に作製され、標的T細胞集団は、両方のウイルスで形質導入される。実施例は、抗MSLN TFPと抗MUC16 TFPとの組み合わせ、及び/または抗MSLN及びMUC16の両方に特異性を有するTFP、及び/またはT細胞が、抗MSLN TFPを形質導入されたT細胞と抗MUC16 TFPを形質導入されたT細胞との混合物である、混合T細胞集団を開示する。本明細書に開示する抗MSLN及び抗MUC16構築物は例示に過ぎず、上述のように限定と解釈すべきではないことを意味している。本発明の方法には抗腫瘍抗原抗体の種々の組み合わせを有する構築物が企図される。
実施例1:TFP構築物
抗メソテリンTFP構築物は、配列(G4S)n(式中、n=1〜4)を有するリンカーをコードするDNA配列によってCD3またはTCR DNA断片に連結された抗メソテリン結合ドメイン(例えば、sdAb、scFv、またはそれらの断片)DNA断片を、例えば、XbaI及びEcoR1部位でp510ベクター(System Biosciences(SBI))にクローニングすることによって操作する。他の適切なベクターを使用してもよい。
抗メソテリンTFP構築物は、配列(G4S)n(式中、n=1〜4)を有するリンカーをコードするDNA配列によってCD3またはTCR DNA断片に連結された抗メソテリン結合ドメイン(例えば、sdAb、scFv、またはそれらの断片)DNA断片を、例えば、XbaI及びEcoR1部位でp510ベクター(System Biosciences(SBI))にクローニングすることによって操作する。他の適切なベクターを使用してもよい。
生成した抗メソテリンTFP構築物は、p510_抗メソテリン_TCRα(抗メソテリン−リンカー−ヒト完全長T細胞受容体α鎖)、p510_抗メソテリン_TCRαC(抗メソテリン リンカー−ヒトT細胞受容体α定常ドメイン鎖)、p510_抗メソテリン_TCRβ(抗メソテリン−リンカー−ヒト完全長T細胞受容体β鎖)、p510_抗メソテリン_TCRβC(抗メソテリン−リンカー−ヒトT細胞受容体β定常ドメイン鎖)、p510_抗メソテリン_TCRγ(抗メソテリン−リンカー−ヒト完全長T細胞受容体γ鎖)、p510_抗メソテリン_TCRγC(抗メソテリン リンカー−ヒトT細胞受容体γ定常ドメイン鎖)、p510_抗メソテリン_TCRδ(抗メソテリン−リンカー−ヒト完全長T細胞受容体δ鎖)、p510_抗メソテリン_TCRδC(抗メソテリン−リンカー−ヒトT細胞受容体δ定常ドメイン鎖)、p510_抗メソテリン_CD3γ(抗メソテリン−リンカー−ヒトCD3γ鎖)、p510_抗メソテリン_CD3δ(抗メソテリン−リンカー−ヒトCD3δ鎖)、及びp510_抗メソテリン_CD3ε(抗メソテリン−リンカー−ヒトCD3ε鎖)である。
幾つかの実施形態では、抗メソテリンCAR構築物であるp510_抗メソテリン_28ζは、抗メソテリン、部分的なCD28細胞外ドメイン、CD28膜貫通ドメイン、CD28細胞内ドメイン、及びCD3ゼータをコードする合成DNAをXbaI及びEcoR1部位でp510ベクターにクローニングすることによって生成する。他の実施形態では、抗メソテリンCAR構築物は、4−1BBゼータドメインを使用して生成する。
抗MUC16 TFP構築物は、配列(G4S)n(式中、n=1〜4)を有するリンカーをコードするDNA配列によってCD3またはTCR DNA断片に連結された 抗MUC16結合ドメイン(例えば、sdAb、scFv、またはそれらの断片)DNA断片を、XbaI及びEcoR1部位でp510ベクター((System Biosciences(登録商標)(SBI))にクローニングすることによって操作することができる。他のベクター、例えば、pLRPOベクターも使用してもよい。
抗MUC16 TFP構築物の実施例には、p510_抗MUC16_TCRα(抗MUC16−リンカー−ヒト完全長T細胞受容体α鎖)、p510_抗MUC16_TCR αC(抗MUC16−リンカー−ヒトT細胞受容体α定常ドメイン鎖)、p510_抗MUC16_TCRβ(抗MUC16−リンカー−ヒト完全長T細胞受容体β鎖)、p510_抗MUC16_TCRβC(抗MUC16−リンカー−ヒトT細胞受容体β定常ドメイン鎖)、p510_抗MUC16_TCRγ(抗MUC16−リンカー−ヒト完全長T細胞受容体γ鎖)、p510_抗MUC16_TCRγC(抗MUC16−リンカー−ヒトT細胞受容体γ定常ドメイン鎖)、p510_抗MUC16_TCRδ(抗MUC16−リンカー−ヒト完全長T細胞受容体δ鎖)、p510_抗MUC16_TCRδC(抗MUC16−リンカー−ヒトT細胞受容体δ定常ドメイン鎖)、p510_抗muc16_CD3γ(抗MUC16−リンカー−ヒトCD3γ鎖)、p510_抗MUC16_CD3δ(抗MUC16−リンカー−ヒトCD3δ鎖)、及びp510_抗MUC16_CD3ε(抗MUC16−リンカー−ヒトCD3ε鎖)が含まれる。本明細書に使用する抗MUC16は、ヒトMUC16特異的scFv、例えば、4H11であってもよい。
抗MUC16 CAR構築物であるp510_抗MUC16_28ζの実施例は、抗MUC16、部分的なCD28細胞外ドメイン、CD28膜貫通ドメイン、CD28細胞内ドメイン、及びCD3ゼータをコードする合成DNAをXbaI及びEcoR1部位でp510ベクターにクローニングすることによって生成することができる。他の実施形態では、抗MUC16 CAR構築物は、4−1BBゼータドメインを使用して生成する。
TCRドメイン及び結合ドメインからのTFPの生成
MUC16結合ドメイン(例えば、単一ドメイン抗体、scFv、またはそれらの断片)は、G4S、(G4S)2、(G4S)3、または(G4S)4などのリンカー配列を使用して、組み換えによってCD3−イプシロンまたは他のTCRサブユニットに連結することができる。scFvを使用するならば、様々なリンカー及びscFv構造を使用することができる。TCRアルファ鎖及びTCRベータ鎖、またはTCRガンマ鎖及びTCRデルタ鎖は、完全長ポリペプチドまたはそれらの定常ドメインのみのいずれかとして、TFPの生成に使用することができる。TCRアルファ鎖及びTCRベータ鎖/TCRガンマ鎖及びTCRデルタ鎖のいずれの可変配列もTFPの作製に適している。
TFP発現ベクター
プロモーター(サイトメガロウイルス(CMV)エンハンサー−プロモーター)、分泌を可能にするシグナル配列、ポリアデニル化シグナル、及び転写ターミネーター(ウシ成長ホルモン(BGH)遺伝子)、エピソーム複製及び原核生物での複製を可能にするエレメント(例えば、SV40起点及びColE1または当技術分野で公知の他のもの)、ならびに選択を可能にするエレメント(アンピシリン耐性遺伝子及びゼオシンマーカー)を含む、発現ベクターを用意する。
好ましくは、TFPをコードする核酸構築物を、レンチウイルス発現ベクターにクローニングし、発現を、MUC16+標的細胞に応答する抗MUC16−TFP形質導入T細胞のエフェクターT細胞応答の分量及び質に基づいて検証する。エフェクターT細胞応答として、細胞拡大、増殖、倍加、サイトカイン産生、及び標的細胞溶解または細胞溶解活性(すなわち、脱顆粒)が挙げられるが、これらに限定されない。
TFP.MUC16レンチウイルス移入ベクターを使用して、VSV−G偽型レンチウイルス粒子にパッケージングされたゲノム材料を生成することができる。レンチウイルス移入ベクターDNAを、リポフェクタミン(登録商標)試薬と合わせた3つのパッケージング成分、VSV−G、gag/pol、及びrevと混合して、それらを一緒にHEK−293(胚性腎、ATCC(登録商標)CRL−1573(商標))細胞に形質移入する。24時間後及び48時間後に、培地を収集し、ろ過し、超遠心分離によって濃縮する。得られたウイルス調製物を−80℃で保存する。形質導入単位の数は、Sup−T1(T細胞リンパ芽球性リンパ腫、ATCC(登録商標)CRL−1942(商標))細胞での滴定によって決定することができる。再指向性TFP.MUC16 T細胞は、新たなナイーブT細胞を、例えば、抗CD3抗CD28ビーズで24時間活性化し、次いで適正な数の形質導入単位を添加して所望の割合(%)の形質導入T細胞を得ることによって生成する。これらの改変T細胞を拡大させ、それらが休止し、サイズが小さくなるまで行い、その時点で、後日の解析のためにそれらを凍結保存する。細胞の数及びサイズは、Coulter Multisizer(商標)IIIを使用して測定する。凍結保存の前に、形質導入された細胞(TFP.MUC16を細胞表面上に発現するもの)の割合(%)及びその発現の相対蛍光強度をフローサイトメトリー解析によって決定する。ヒストグラムプロットから、形質導入された割合(%)とその相対蛍光強度とを比較することによって、TFPの相対的発現レベルを調べることができる。
幾つかの実施形態では、複数のウイルスベクターでのT細胞形質導入によって、複数のTFPを導入する。
ヒト化TFP再指向性T細胞の細胞溶解活性、増殖能力、及びサイトカイン分泌の評価
TFP.MUC16 T細胞が、細胞表面に発現されるTFPを産生する、標的腫瘍細胞を殺傷する、増殖する、及びサイトカインを分泌する機能的能力は、当技術分野で公知のアッセイを使用して決定することができる。
ヒト末梢血単核球(PBMC、例えば、正常なアフェレーシスドナー由来の血液であり、そのナイーブT細胞は、T細胞、すなわちCD4+及びCD8+リンパ球に対するネガティブ選択によって得ることができる)をヒトインターロイキン−2(IL−2)で処理し、次いで抗CD3×抗CD28ビーズで、例えば、10%RPMI中37℃、5%CO2で活性化し、その後TFPをコードするレンチウイルスベクターで形質導入する。フローサイトメトリーアッセイを使用して、例えば、抗FLAG抗体または抗マウス可変ドメイン抗体によって、細胞表面のTFPの存在を確認することができる。サイトカイン(例えば、IFN−γ)産生は、ELISAまたは他のアッセイを使用して測定することができる。
TCRサブユニット源
ヒトT細胞受容体(TCR)複合体のサブユニットはすべて、細胞外ドメイン、膜貫通ドメイン、及び細胞内ドメインを含有する。ヒトTCR複合体は、CD3−イプシロンポリペプチド、CD3−ガンマポリペプチド、CD3−デルタポリペプチド、CD3−ゼータポリペプチド、TCRアルファ鎖ポリペプチド、及びTCRベータ鎖ポリペプチドを含有する。ヒトCD3−イプシロンポリペプチドの規範配列は、UniProtアクセッション番号P07766である。ヒトCD3−ガンマポリペプチドの規範配列は、UniProtアクセッション番号P09693である。ヒトCD3−デルタポリペプチドの規範配列は、UniProtアクセッション番号P043234である。ヒトCD3−ゼータポリペプチドの規範配列は、UniProtアクセッション番号P20963である。ヒトTCRアルファ鎖の規範配列は、UniProtアクセッション番号Q6ISU1である。ヒトTCRベータ鎖C領域の規範配列は、UniProtアクセッション番号P01850であり、ヒトTCRベータ鎖V領域の配列はP04435である。
TCRドメイン及びscFvからのTFPの生成
メソテリンscFvは、G4S、(G4S)2、(G4S)3、または(G4S)4などのリンカー配列を使用して、組み換えによってCD3−イプシロンまたは他のTCRサブユニット(1C参照)に連結される。様々なリンカー及びscFv構造が利用される。TCRアルファ鎖及びTCRベータ鎖は、完全長ポリペプチドまたはそれらの定常ドメインのみのいずれかとして、TFPの生成に使用した。TCRアルファ鎖及びTCRベータ鎖のいずれの可変配列もTFPの作製に許容される。
TFP発現ベクター
プロモーター(サイトメガロウイルス(CMV)エンハンサー−プロモーター)、分泌を可能にするシグナル配列、ポリアデニル化シグナル、及び転写ターミネーター(ウシ成長ホルモン(BGH)遺伝子)、エピソーム複製及び原核生物での複製を可能にするエレメント(例えば、SV40起点及びColE1または当技術分野で公知の他のもの)、ならびに選択を可能にするエレメント(アンピシリン耐性遺伝子及びゼオシンマーカー)を含む、発現ベクターを用意する。
好ましくは、TFPをコードする核酸構築物を、レンチウイルス発現ベクターにクローニングし、発現を、メソテリン+標的細胞に応答する抗MSLN TFP T細胞のエフェクターT細胞応答の分量及び質に基づいて検証する。エフェクターT細胞応答として、細胞拡大、増殖、倍加、サイトカイン産生、及び標的細胞溶解または細胞溶解活性(すなわち、脱顆粒)が挙げられるが、これらに限定されない。
TFP.メソテリンレンチウイルス移入ベクターを使用して、VSV−G偽型レンチウイルス粒子にパッケージングされたゲノム材料を生成する。レンチウイルス移入ベクターDNAを、リポフェクタミン(登録商標)試薬と合わせた3つのパッケージング成分、VSV−G、gag/pol、及びrevと混合して、それらを一緒にHEK−293(胚性腎、ATCC(登録商標)CRL−1573(商標))細胞に形質移入する。24時間後及び48時間後に、培地を収集し、ろ過し、超遠心分離によって濃縮する。得られたウイルス調製物を−80℃で保存する。形質導入単位の数は、Sup−T1(T細胞リンパ芽球性リンパ腫、ATCC(登録商標)CRL−1942(商標))細胞での滴定によって決定する。再指向性TFP.メソテリンT細胞は、新たなナイーブT細胞を、例えば、抗CD3抗CD28ビーズで24時間活性化し、次いで適正な数の形質導入単位を添加して所望の割合(%)の形質導入T細胞を得ることによって生成する。これらの改変T細胞を拡大させ、それらが休止し、サイズが小さくなるまで行い、その時点で、後日の解析のためにそれらを凍結保存する。細胞の数及びサイズは、Coulter Multisizer(商標)IIIを使用して測定する。凍結保存の前に、形質導入された細胞(TFP.メソテリンを細胞表面上に発現するもの)の割合(%)及びその発現の相対蛍光強度をフローサイトメトリー解析によって決定する。ヒストグラムプロットから、形質導入された割合(%)とその相対蛍光強度とを比較することによって、TFPの相対的発現レベルを調べる。
幾つかの実施形態では、複数のウイルスベクターでのT細胞形質導入によって、複数のTFPを導入する。
TFP再指向性T細胞の細胞溶解活性、増殖能力、及びサイトカイン分泌の評価
抗MSLN TFP T細胞が、細胞表面に発現されるTFPを産生する、標的腫瘍細胞を殺傷する、増殖する、及びサイトカインを分泌する機能的能力は、当技術分野で公知のアッセイを使用して決定する。
ヒト末梢血単核球(PBMC、例えば、正常なアフェレーシスドナー由来の血液であり、そのナイーブT細胞は、T細胞、すなわちCD4+及びCD8+リンパ球に対するネガティブ選択によって得ることができる)をヒトインターロイキン−2(IL−2)で処理し、次いで抗CD3×抗CD28ビーズで、例えば、10%RPMI中37℃、5%CO2で活性化し、その後TFPをコードするレンチウイルスベクターで形質導入する。フローサイトメトリーアッセイを使用して、例えば、抗FLAG抗体または抗マウス可変ドメイン抗体によって、細胞表面のTFPの存在を確認する。サイトカイン(例えば、IFN−γ)産生は、ELISAまたは他のアッセイを使用して測定する。
実施例2:抗体配列
抗体配列の生成
ヒトメソテリンポリペプチドの規範配列は、UniProtアクセッション番号Q13421(またはQ13421−1)である。用意するのは、ヒトメソテリンポリペプチド及びその断片またはドメインに特異的に結合することができる抗体ポリペプチドである。抗メソテリン抗体は、様々な技術を使用して生成することができる(例えば、(Nicholson et al,1997を参照されたい)。マウス、ラクダ、または他の種で作製された抗メソテリン抗体が出発物質として使用される場合、ヒト化が実施される。例えば、マウス抗メソテリン抗体のヒト化は、T細胞受容体(TCR)融合タンパク質(TFP)治療、すなわち、抗MSLN/抗MUC16TFP構築物を形質導入したT細胞での治療を受けた対象においてマウス特異的残基がヒト抗マウス抗原(HAMA)応答を誘導し得る臨床状況に所望される。ヒト化は、非ヒト抗メソテリン抗体由来のCDR領域を適正なヒト生殖細胞系列のアクセプターフレームワークに移植することによって遂行され、それには任意選択によりCDR及び/またはフレームワーク領域に他の改変を施すことが含まれる。本明細書で示す場合、抗体及び抗体断片残基のナンバリングは、Kabatに従う(Kabat E.A.et al,1991;Chothia et al,1987)。
scFvの生成
ヒトまたはヒト化抗メソテリンIgGを使用して、TFP構築物のscFv配列を生成する。ヒトまたはヒト化VL及びVHドメインをコードするDNA配列を得、任意選択により、構築物のコドンをヒト由来の細胞での発現に最適化する。scFvに出現するVL及びVHドメインの順序は様々であり(すなわち、VL−VH、またはVH−VLの配向)、「G4S」または「G4S」サブユニットの3つのコピー(G4S)3が、可変ドメインを接続してscFvドメインを作出する。抗メソテリンまたは抗MUC16 scFvプラスミド構築物は、最適なFlag、His、または他の親和性タグを有することができ、これをHEK293または他の適切なヒトもしくは哺乳類細胞株にエレクトロポレーションし、精製する。検証アッセイには、FACSによる結合解析、Proteon(登録商標)を使用する動態解析、及びメソテリン発現細胞の染色が含まれる。
ヒトまたはヒト化抗メソテリンIgGを使用して、TFP構築物のscFv配列を生成する。ヒトまたはヒト化VL及びVHドメインをコードするDNA配列を得、任意選択により、構築物のコドンをヒト由来の細胞での発現に最適化する。scFvに出現するVL及びVHドメインの順序は様々であり(すなわち、VL−VH、またはVH−VLの配向)、「G4S」または「G4S」サブユニットの3つのコピー(G4S)3が、可変ドメインを接続してscFvドメインを作出する。抗メソテリンまたは抗MUC16 scFvプラスミド構築物は、最適なFlag、His、または他の親和性タグを有することができ、これをHEK293または他の適切なヒトもしくは哺乳類細胞株にエレクトロポレーションし、精製する。検証アッセイには、FACSによる結合解析、Proteon(登録商標)を使用する動態解析、及びメソテリン発現細胞の染色が含まれる。
例示的な抗メソテリンVL及びVHドメイン、CDR、及びそれらをコードするヌクレオチド配列は、米国特許第9,272,002号;第8,206,710号;第9,023,351号;第7,081,518号;第8,911,732号;第9,115,197号、及び第9,416,190号;ならびに米国特許出願公開第20090047211号に記載されるものであり得る。他の例示的な抗メソテリンVL及びVHドメイン、CDR、及びそれらをそれぞれコードするヌクレオチド配列は、次のモノクローナル抗体:ラット抗メソテリン抗体420411、ラット抗メソテリン抗体420404、マウス抗メソテリン抗体MN−1、マウス抗メソテリン抗体MB−G10、マウス抗メソテリン抗体ABIN233753、ウサギ抗メソテリン抗体FQS3796(3)、ウサギ抗メソテリン抗体TQ85、マウス抗メソテリン抗体TA307799、ラット抗メソテリン抗体295D、ラット抗メソテリン抗体B35、マウス抗メソテリン抗体5G157、マウス抗メソテリン抗体129588、ウサギ抗メソテリン抗体11C187、マウス抗メソテリン抗体5B2、ウサギ抗メソテリン抗体SP74、ウサギ抗メソテリン抗体D4X7M、マウス抗メソテリン抗体C−2、マウス抗メソテリン抗体C−3、マウス抗メソテリン抗体G−1、マウス抗メソテリン抗体G−4、マウス抗メソテリン抗体K1、マウス抗メソテリン抗体B−3、マウス抗メソテリン抗体200−301−A87、マウス抗メソテリン抗体200−301−A88、ウサギ抗メソテリン抗体EPR2685(2)、ウサギ抗メソテリン抗体EPR4509、またはウサギ抗メソテリン抗体PPI−2e(IHC)のものであり得る。
幾つかの実施形態では、配列番号52〜54(それぞれ、SD1、SD4、及びSD6)に定められるものなどの、単一ドメイン(VHH)バインダーを使用する。
ヒトまたはヒト化抗MUC16 IgGを使用して、TFP構築物のscFv配列を生成することができる。ヒトまたはヒト化VL及びVHドメインをコードするDNA配列を得、任意選択により、構築物のコドンをヒト由来の細胞での発現に最適化する。scFvに出現するVL及びVHドメインの順序は様々であり(すなわち、VL−VH、またはVH−VLの配向)、「G4S」または「G4S」サブユニットの3つのコピー(G4S)3が、可変ドメインを接続してscFvドメインを作出する。抗MUC16 scFvプラスミド構築物は、最適なFlag、His、または他の親和性タグを有することができ、これをHEK293または他の適切なヒトもしくは哺乳類細胞株にエレクトロポレーションし、精製する。検証アッセイには、FACSによる結合解析、Proteonを使用する動態解析、及びMUC16発現細胞の染色が含まれる。
本明細書に記載する組成物及び方法で使用することができる、VLドメイン、VHドメイン、及びCDRを含めた抗MUC16結合ドメインの例は、幾つかの出版物及び/または商業的供給元に存在し得る。例えば、3A5及び11D10を含めた、ある種の抗MUC16抗体は、WO2007/001851に開示されている(その内容は参照により援用される)。3A5モノクローナル抗体は、OVCAR−3スキャチャード解析による433pMの親和性でMUC16ポリペプチドの複数の部位に結合する。抗MUC16 VL及びVHドメイン、CDR、及びそれらをそれぞれコードするヌクレオチド配列の他の例は、次のモノクローナル抗体:GTX10029、GTX21107、MA5−124525、MA5−11579、25450002、ABIN1584127、ABIN93655、112889、120204、LS−C356195、LS−B6756、TA801241、TA801279、V3494、V3648、666902、666904、HPA065600、AMAb91056のものであり得る。
ヒトMUC16ポリペプチドの規範配列は、UniProtアクセッション番号Q8WXI7に相当する。用意するのは、ヒトMUC16ポリペプチド及びその断片またはドメインに特異的に結合することができる抗体ポリペプチドである。抗MUC16抗体は、様々な技術を使用して生成することができる(例えば、(Nicholson et al,1997を参照されたい)。抗MUC16抗体が出発物質として使用される場合、マウス抗MUC16抗体のヒト化が、T細胞受容体(TCR)融合タンパク質(TFP)治療、すなわち、TFP.MUC16構築物を形質導入したT細胞での治療を受けた対象においてマウス特異的残基がヒト抗マウス抗原(HAMA)応答を誘導し得る臨床状況に所望される。ヒト化は、マウス抗MUC16抗体由来のCDR領域を適正なヒト生殖細胞系列のアクセプターフレームワークに移植することによって遂行され、それには任意選択によりCDR及び/またはフレームワーク領域に他の改変を施すことが含まれる。本明細書で示す場合、抗体及び抗体断片残基のナンバリングは、Kabatに従う(Kabat E.A.et al,1991;Chothia et al,1987)。
単一ドメインバインダー
ラクダ科または他の単一ドメイン抗体を使用して抗MUC16 TFP構築物を生成することもできる。そのVHHドメインを使用して、様々なTCRサブユニットと融合させることができる。幾つかの実施形態では、単一ドメイン(例えば、VHH)バインダー、例えば、表2(配列番号:14、配列番号:19、配列番号:24、配列番号:29、配列番号:34、配列番号:39、配列番号:43、及び配列番号:47)に定められるものを使用する。抗hMUC16ラクダ科抗体の調製は、実施例3にさらに記載する。
TCRドメイン及びscFvからのTFPの生成
MUC16 scFvは、G4S、(G4S)2、(G4S)3、または(G4S)4などのリンカー配列を使用して、組み換えによってCD3−イプシロンまたは他のTCRサブユニットに連結することができる。様々なリンカー及びscFv構造を使用することができる。TCRアルファ鎖及びTCRベータ鎖は、完全長ポリペプチドまたはそれらの定常ドメインのみのいずれかとして、TFPの生成に使用することができる。TCRアルファ鎖及びTCRベータ鎖のいずれの可変配列もTFPの作製に許容される。
TFP発現ベクター
プロモーター(サイトメガロウイルス(CMV)エンハンサー−プロモーター)、分泌を可能にするシグナル配列、ポリアデニル化シグナル、及び転写ターミネーター(ウシ成長ホルモン(BGH)遺伝子)、エピソーム複製及び原核生物での複製を可能にするエレメント(例えば、SV40起点及びColE1または当技術分野で公知の他のもの)、ならびに選択を可能にするエレメント(アンピシリン耐性遺伝子及びゼオシンマーカー)を含む、発現ベクターを用意する。
好ましくは、TFPをコードする核酸構築物を、レンチウイルス発現ベクターにクローニングし、発現を、MUC16+標的細胞に応答するTFP.MUC16形質導入T細胞(「MUC16.TFP」または「MUC16.TFP T細胞」または「TFP.MUC16」または「TFP.MUC16 T細胞」)のエフェクターT細胞応答の分量及び質に基づいて検証する。エフェクターT細胞応答として、細胞拡大、増殖、倍加、サイトカイン産生、及び標的細胞溶解または細胞溶解活性(すなわち、脱顆粒)が挙げられるが、これらに限定されない。
TFP.MUC16レンチウイルス移入ベクターを使用して、VSV−G偽型レンチウイルス粒子にパッケージングされたゲノム材料を生成することができる。レンチウイルス移入ベクターDNAを、リポフェクタミン(登録商標)試薬と合わせた3つのパッケージング成分、VSV−G、gag/pol、及びrevと混合して、それらを一緒にHEK−293(胚性腎、ATCC(登録商標)CRL−1573(商標))細胞に形質移入する。24時間後及び48時間後に、培地を収集し、ろ過し、超遠心分離によって濃縮する。得られたウイルス調製物を−80℃で保存する。形質導入単位の数は、Sup−T1(T細胞リンパ芽球性リンパ腫、ATCC(登録商標)CRL−1942(商標))細胞での滴定によって決定することができる。再指向性TFP.MUC16 T細胞は、新たなナイーブT細胞を、例えば、抗CD3抗CD28ビーズで24時間活性化し、次いで適正な数の形質導入単位を添加して所望の割合(%)の形質導入T細胞を得ることによって生成する。これらの改変T細胞を拡大させ、それらが休止し、サイズが小さくなるまで行い、その時点で、後日の解析のためにそれらを凍結保存する。細胞の数及びサイズは、Coulter Multisizer(商標)IIIを使用して測定する。凍結保存の前に、形質導入された細胞(TFP.MUC16を細胞表面上に発現するもの)の割合(%)及びその発現の相対蛍光強度をフローサイトメトリー解析によって決定する。ヒストグラムプロットから、形質導入された割合(%)とその相対蛍光強度とを比較することによって、TFPの相対的発現レベルを調べることができる。
幾つかの実施形態では、複数のウイルスベクターでのT細胞形質導入によって、複数のTFPを導入する。
ヒト化TFP再指向性T細胞の細胞溶解活性、増殖能力、及びサイトカイン分泌の評価
TFP.MUC16 T細胞が、細胞表面に発現されるTFPを産生する、標的腫瘍細胞を殺傷する、増殖する、及びサイトカインを分泌する機能的能力は、当技術分野で公知のアッセイを使用して決定することができる。
ヒト末梢血単核球(PBMC、例えば、正常なアフェレーシスドナー由来の血液であり、そのナイーブT細胞は、T細胞、すなわちCD4+及びCD8+リンパ球に対するネガティブ選択によって得ることができる)をヒトインターロイキン−2(IL−2)で処理し、次いで抗CD3×抗CD28ビーズで、例えば、10%RPMI中37℃、5%CO2で活性化し、その後TFPをコードするレンチウイルスベクターで形質導入する。フローサイトメトリーアッセイを使用して、例えば、抗FLAG抗体または抗マウス可変ドメイン抗体によって、細胞表面のTFPの存在を確認することができる。サイトカイン(例えば、IFN−γ)産生は、ELISAまたは他のアッセイを使用して測定することができる。
TCRサブユニット源
ヒトT細胞受容体(TCR)複合体のサブユニットはすべて、細胞外ドメイン、膜貫通ドメイン、及び細胞内ドメインを含有する。ヒトTCR複合体は、CD3−イプシロンポリペプチド、CD3−ガンマポリペプチド、CD3−デルタポリペプチド、CD3−ゼータポリペプチド、TCRアルファ鎖ポリペプチド、及びTCRベータ鎖ポリペプチドを含有する。ヒトCD3−イプシロンポリペプチドの規範配列は、UniProtアクセッション番号P07766である。ヒトCD3−ガンマポリペプチドの規範配列は、UniProtアクセッション番号P09693である。ヒトCD3−デルタポリペプチドの規範配列は、UniProtアクセッション番号P043234である。ヒトCD3−ゼータポリペプチドの規範配列は、UniProtアクセッション番号P20963である。ヒトTCRアルファ鎖の規範配列は、UniProtアクセッション番号Q6ISU1である。ヒトTCRベータ鎖C領域の規範配列は、UniProtアクセッション番号P01850であり、ヒトTCRベータ鎖V領域の配列は、P04435である。
TCRドメイン及びscFvからのTFPの生成
メソテリンscFvは、G4S、(G4S)2、(G4S)3、または(G4S)4などのリンカー配列を使用して、組み換えによってCD3−イプシロンまたは他のTCRサブユニット(1C参照)に連結される。様々なリンカー及びscFv構造が利用される。TCRアルファ鎖及びTCRベータ鎖は、完全長ポリペプチドまたはそれらの定常ドメインのみのいずれかとして、TFPの生成に使用した。TCRアルファ鎖及びTCRベータ鎖のいずれの可変配列もTFPの作製に許容される。
TFP発現ベクター
プロモーター(サイトメガロウイルス(CMV)エンハンサー−プロモーター)、分泌を可能にするシグナル配列、ポリアデニル化シグナル、及び転写ターミネーター(ウシ成長ホルモン(BGH)遺伝子)、エピソーム複製及び原核生物での複製を可能にするエレメント(例えば、SV40起点及びColE1または当技術分野で公知の他のもの)、ならびに選択を可能にするエレメント(アンピシリン耐性遺伝子及びゼオシンマーカー)を含む、発現ベクターを用意する。
好ましくは、TFPをコードする核酸構築物を、レンチウイルス発現ベクターにクローニングし、発現を、メソテリン+標的細胞に応答する抗MSLN TFP T細胞のエフェクターT細胞応答の分量及び質に基づいて検証する。エフェクターT細胞応答として、細胞拡大、増殖、倍加、サイトカイン産生、及び標的細胞溶解または細胞溶解活性(すなわち、脱顆粒)が挙げられるが、これらに限定されない。
TFP.メソテリンレンチウイルス移入ベクターを使用して、VSV−G偽型レンチウイルス粒子にパッケージングされたゲノム材料を生成する。レンチウイルス移入ベクターDNAを、リポフェクタミン(登録商標)試薬と合わせた3つのパッケージング成分、VSV−G、gag/pol、及びrevと混合して、それらを一緒にHEK−293(胚性腎、ATCC(登録商標)CRL−1573(商標))細胞に形質移入する。24時間後及び48時間後に、培地を収集し、ろ過し、超遠心分離によって濃縮する。得られたウイルス調製物を−80℃で保存する。形質導入単位の数は、Sup−T1(T細胞リンパ芽球性リンパ腫、ATCC(登録商標)CRL−1942(商標))細胞での滴定によって決定する。再指向性TFP.メソテリンT細胞は、新たなナイーブT細胞を、例えば、抗CD3抗CD28ビーズで24時間活性化し、次いで適正な数の形質導入単位を添加して所望の割合(%)の形質導入T細胞を得ることによって生成する。これらの改変T細胞を拡大させ、それらが休止し、サイズが小さくなるまで行い、その時点で、後日の解析のためにそれらを凍結保存する。細胞の数及びサイズは、Coulter Multisizer(商標)IIIを使用して測定する。凍結保存の前に、形質導入された細胞(TFP.メソテリンを細胞表面上に発現するもの)の割合(%)及びその発現の相対蛍光強度をフローサイトメトリー解析によって決定する。ヒストグラムプロットから、形質導入された割合(%)とその相対蛍光強度とを比較することによって、TFPの相対的発現レベルを調べる。
幾つかの実施形態では、複数のウイルスベクターでのT細胞形質導入によって、複数のTFPを導入する。
TFP再指向性T細胞の細胞溶解活性、増殖能力、及びサイトカイン分泌の評価
抗MSLN TFP T細胞が、細胞表面に発現されるTFPを産生する、標的腫瘍細胞を殺傷する、増殖する、及びサイトカインを分泌する機能的能力は、当技術分野で公知のアッセイを使用して決定する。
ヒト末梢血単核球(PBMC、例えば、正常なアフェレーシスドナー由来の血液であり、そのナイーブT細胞は、T細胞、すなわちCD4+及びCD8+リンパ球に対するネガティブ選択によって得ることができる)をヒトインターロイキン−2(IL−2)で処理し、次いで抗CD3×抗CD28ビーズで、例えば、10%RPMI中37℃、5%CO2で活性化し、その後TFPをコードするレンチウイルスベクターで形質導入する。フローサイトメトリーアッセイを使用して、例えば、抗FLAG抗体または抗マウス可変ドメイン抗体によって、細胞表面のTFPの存在を確認する。サイトカイン(例えば、IFN−γ)産生は、ELISAまたは他のアッセイを使用して測定する。
実施例3:多重化されたTFPポリペプチドの実証、及び多重化されたヒト化TFP再指向性T細胞の使用
本明細書で提供するTFPポリペプチドは、内因性TCRサブユニットポリペプチドと機能的に会合して、機能的TCR複合体を形成することができる。ここでは、機能的な、多重化された組み換えTCR複合体を作出するために、レンチウイルスベクター内の複数のTFPを使用してT細胞に形質導入する。例えば、用意するのは、i)例えば、CD3−イプシロンポリペプチド由来の細胞外ドメイン、膜貫通ドメイン、及び細胞内ドメイン、ならびにメソテリン特異的scFv抗体断片を有する第1のTFPと、ii)CD3−ガンマポリペプチド由来の細胞外ドメイン、膜貫通ドメイン、及び細胞内ドメイン、ならびにメソテリン特異的抗体断片を有する第2のTFPとを含有するT細胞である。第1のTFP及び第2のTFPは、互いに、及び内因性TCRサブユニットポリペプチドと相互作用することができ、それによって機能的TCR複合体を形成することができる。
本明細書で提供するTFPポリペプチドは、内因性TCRサブユニットポリペプチドと機能的に会合して、機能的TCR複合体を形成することができる。ここでは、機能的な、多重化された組み換えTCR複合体を作出するために、レンチウイルスベクター内の複数のTFPを使用してT細胞に形質導入する。例えば、用意するのは、i)例えば、CD3−イプシロンポリペプチド由来の細胞外ドメイン、膜貫通ドメイン、及び細胞内ドメイン、ならびにメソテリン特異的scFv抗体断片を有する第1のTFPと、ii)CD3−ガンマポリペプチド由来の細胞外ドメイン、膜貫通ドメイン、及び細胞内ドメイン、ならびにメソテリン特異的抗体断片を有する第2のTFPとを含有するT細胞である。第1のTFP及び第2のTFPは、互いに、及び内因性TCRサブユニットポリペプチドと相互作用することができ、それによって機能的TCR複合体を形成することができる。
これらの多重化されたヒト化抗MSLN、抗MUC16 TFP T細胞の使用は、固形腫瘍で実証することができる。
実施例4:TFPを形質導入したT細胞の調製
レンチウイルスの生成
レンチウイルスの生成
適正な構築物をコードするレンチウイルスは、次のように調製する。5×106個のHEK−293FT細胞を100mmの皿に播種し、一晩置いて70〜90%の培養密度に到達させる。指定のDNAプラスミド2.5μg及び20μLのLentivirus Packaging Mix(ALSTEM、カタログ番号VP100)を、血清を含まない0.5mLのDMEMまたはOpti−MEM(登録商標)I培地中で希釈し、穏やかに混合する。別のチューブで、30μLのNanoFect(登録商標)形質移入試薬(ALSTEM、カタログ番号NF100)を、血清を含まない0.5mLのDMEMまたはOpti−MEM(登録商標)I培地中で希釈し、穏やかに混合する。次いでNanoFect/DMEM及びDNA/DMEM溶液を一緒に混合し、10〜15秒間ボルテックスし、その後DMEM−プラスミド−NanoFect混合物を室温で15分間インキュベートする。前の工程からの完全な形質移入複合体を細胞のプレートに滴加し、揺動して形質移入複合体をプレート内で均等に分散させる。次いで、プレートを、加湿した5%CO2のインキュベーター内で一晩37℃でインキュベートする。翌日、上清を10mLの新たな培地に置きかえ、20μLのViralBoost(500×、ALSTEM、カタログ番号VB100)を補給する。次いで、プレートを37℃でさらに24時間インキュベートする。次いで、レンチウイルスを含有する上清を、50mLの滅菌した蓋付きの円錐状遠心分離管内に収集し、氷上に置く。3000rpmで15分間4℃で遠心分離した後、透明な上清を低タンパク質結合0.45μm滅菌フィルターでろ過し、続いてウイルスを25,000rpmで1.5時間4℃での超遠心分離(Beckmann、L8−70M)によって単離する。ペレットを取り出し、DMEM培地中に再懸濁させ、Lenti−X(商標)qRT−PCR Titrationキット(Clontech(登録商標);カタログ番号631235)を使用する定量的RT−PCRによって、レンチウイルス濃度/力価を確定する。あらゆる残留プラスミドDNAをDNアーゼIでの処理によって除去する。このウイルスストック調製物は、直ちに感染に使用するか、または小分けにし、さらなる使用のために−80℃で保存する。
PBMCの単離
末梢血単核球(PBMC)は、全血またはバフィーコートのいずれかから調製する。全血を10mLのHeparinバキュテナー内に収集し、直ちに処理するか、または4℃で一晩保存する。抗凝固処理したおよそ10mLの全血を、50mLの円錐状遠心分離管内で、滅菌リン酸緩衝食塩水(PBS)緩衝液と混合して総体積を20mLとする(PBS、pH7.4、Ca2+/Mg2+を含まない)。次いで、この血液/PBS混合物20mLを、15mLのFicoll−Paque(登録商標)PLUS(GE Healthcare(登録商標)、17−1440−03)の表面上にそっと重ね、その後、ブレーキをかけずに400gで30〜40分間室温で遠心分離する。
バフィーコートは、Research Blood Components(Boston,MA)から購入する。LeucoSep(登録商標)チューブ(Greiner bio−one)は、15mLのFicoll−Paque(登録商標)(GE Health Care)を添加することによって調製し、1000gで1分間遠心分離する。バフィーコートをPBS(pH7.4、Ca2+またはMg2+を含まない)中で1:3に希釈する。希釈したバフィーコートをLeucosepチューブに移し、ブレーキをかけずに1000gで15分間遠心分離する。希釈した血漿/Ficollの界面に見られる、PBMCを含有する細胞の層を、Ficollの混入が最小限になるように注意深く取り出す。次いで、PBMCを40mLのPBSで3回洗浄し、200gで10分間室温で遠心分離することによって、残留するFicoll、血小板、及び血漿タンパク質を除去する。次いで、細胞を血球計数器で計数する。この洗浄したPBMCを、5%AB血清及び1.25μg/mLのアンフォテリシンB(Gemini Bio−products,Woodland,CA)、100U/mLのペニシリン、及び100μg/mLのストレプトマイシンを有する)CAR−T培地(AIM V−AlbuMAX(登録商標)(BSA)(Life Technologies)で一度洗浄する。あるいは、この洗浄したPBMCを断熱容器に移し、−80℃で24時間凍結させた後、後日の使用のために液体窒素中で保存する。
T細胞の活性化
全血またはバフィーコートのいずれかから調製したPBMCを抗ヒトCD28及びCD3抗体結合磁気ビーズで24時間刺激し、その後ウイルス形質導入を行う。新たに単離したPBMCを、CAR−T培地(AIM V−AlbuMAX(BSA)(Life Technologies)、5%AB血清及び1.25μg/mLアンフォテリシンB(Gemini Bio−products)、100U/mLペニシリン、及び100μg/mLストレプトマイシンを有する)中でhuIL−2を用いずに1回洗浄し、その後、300IU/mLのヒトIL−2(1000×ストックからのもの;Invitrogen)を有するCAR−T培地中に、1×106細胞/mLの最終濃度で再懸濁させる。もしPBMCを予め凍結していたなら、それを解凍し、1×107細胞/mLの最終濃度で、9mLの予め温めておいた(37℃)cDMEM培地(Life Technologies)中に再懸濁させ、10%FBS、100U/mLペニシリン、及び100μg/mLストレプトマイシンの存在下で1×106細胞/mLの濃度とし、その後CAR−T培地中で1回洗浄し、1×106細胞/mLでCAR−T培地中に再懸濁させ、上記のようにIL−2を添加する。
活性化の前に、抗ヒトCD28及びCD3抗体結合磁気ビーズ(例えば、Invitrogen、Life Technologiesから入手可能)を、1mLの滅菌1×PBS(pH7.4)で3回洗浄し(ビーズを溶液から単離するのに磁気ラックを使用する)、その後、300IU/mLのヒトIL−2を有するCAR−T培地中に再懸濁させ、4×l07ビーズ/mLの最終濃度にする。次いで、25μL(1×106個のビーズ)を1mLのPBMCに移すことによって、PBMCとビーズとを1:1のビーズ対細胞比で混合する。次いで、所望の数のアリコートを、12ウェルの低付着性または非処理細胞培養プレートの単一ウェルに分注し、37℃、5%CO2で24時間インキュベートし、その後ウイルス形質導入を行う。
T細胞の形質導入/形質移入及び拡大
PBMCの活性化に続き、細胞を48時間、37℃、5%CO2でインキュベートする。レンチウイルスを氷上で解凍し、5×106個のレンチウイルスを、培地1mL当たり2μLのTransPlus(商標)(Alstem)(1:500の最終希釈)と共に、細胞1×106個の各ウェルに添加する。細胞をさらに24時間インキュベートし、その後ウイルスの添加を繰り返す。あるいは、レンチウイルスを氷上で解凍し、それぞれのウイルスを、5μg/mLポリブレン(Sigma)の存在下で、5または50MOIで添加する。細胞を100gで100分間室温でスピノキュレーションする。次いで、細胞を、300IU/mLのヒトIL−2の継続的な存在下で6〜14日間増殖させる(総インキュベーション時間は、必要とされる最終的なCAR−T細胞数に依存する)。細胞濃度を2〜3日毎に解析し、その時点で培地を添加して、細胞懸濁液を1×106細胞/mLに維持する。
幾つかの場合では、活性化したPBMCを、in vitro転写(IVT)mRNAでエレクトロポレーションする。一実施形態では、ヒトPBMCを、1対1の比率のDynabeads(登録商標)(Thermo Fisher Scientific(登録商標))で、300IU/mlの組み換えヒトIL−2(R&D Systems)(Milyeni Biotec製のTransAct(登録商標)T Cell Reagentなどの他の刺激試薬を使用してもよい)の存在下で3日間刺激する。これらのビーズは、エレクトロポレーションの前に除去する。細胞を洗浄し、OPTI−MEM培地(Thermo Fisher Scientific)中に2.5×107細胞/mLの濃度で再懸濁させる。200μLの細胞懸濁液(5×106細胞)を2mmのギャップのElectroporation Cuvettes Plus(商標)(Harvard Apparatus(登録商標)BTX)に移し、氷上で予冷する。この細胞懸濁液に10μgのIVT TFP mRNAを添加する。次いで、ECM(登録商標)830 Electro Square Wave Porator(Harvard Apparatus BTX)を使用して、mRNA/細胞混合物を200Vで20ミリ秒間エレクトロポレーションする。エレクトロポレーションの直後に、細胞を新たな細胞培養培地(AIM V AlbuMAX(登録商標)(BSA)無血清培地+5%ヒトAB血清+300IU/ml IL−2)に移し、37℃でインキュベートする。
細胞染色によるTFP発現の確認
レンチウイルスの形質導入またはmRNAのエレクトロポレーションに続いて、抗メソテリンまたはMUC16 TFPの発現を、マウス抗メソテリンまたはMUC16を検出する抗マウスFab抗体を使用するフローサイトメトリーによって確認する。T細胞を3mLの染色用緩衝液(PBS、4%BSA)中で3回洗浄し、ウェル当たり細胞1×106個でPBS中に再懸濁させる。死細胞を排除するために、細胞をLIVE/DEAD(登録商標)Fixable Aqua Dead Cell Stain(Invitrogen)と共に氷上で30分間インキュベートする。細胞をPBSで2回洗浄し、50μLの染色用緩衝液中に再懸濁させる。Fc受容体をブロッキングするために、1μLの1:100希釈正常ヤギIgG(BD Bioscience)を各チューブに添加し、氷上で10分間インキュベートする。1.0mLのFACS緩衝液を各チューブに添加し、よく混合し、細胞を300gで5分間遠心分離することによってペレットにする。scFv TFPの表面発現は、Zenon(登録商標)R−Phycoerythrin標識ヒトMSLN IgG1 FcまたはヒトIgG1アイソタイプ対照によって検出する。1μgの抗体をそれぞれの試料に添加し、氷上で30分間インキュベートする。次いで、細胞を2回洗浄し、BD(登録商標)bioscience製のAnti−CD3 APC(クローン、UCHT1)、anti−CD4−Paciflc blue(クローンRPA−T4)、nti−CD8 APCCy7(クローンSK1)を使用して、表面マーカーを染色する。フローサイトメトリーは、LSRFortessaTM X20(BD Biosciences)を使用して実施し、データは、FACSDiva(登録商標)ソフトウェアを使用して取得し、FlowJo(登録商標)(Treestar,Inc.Ashland,OR)で解析する。
実施例5:フローサイトメトリーによる細胞傷害性アッセイ
メソテリンまたはMUC16について陽性または陰性のいずれかである標的細胞を、蛍光染料であるカルボキシフルオセイン二酢酸サクシニミジルエステル(CFSE)で標識する。これらの標的細胞を、非形質導入、対照CAR−T構築物形質導入、またはTFP形質導入のいずれかを行ったエフェクターT細胞と混合する。指定のインキュベーション時間後、フローサイトメトリーによって、各々のエフェクター/標的細胞培養物について、CFSE標識標的細胞及び陰性対照標的細胞の生細胞に対する死細胞の割合(%)を決定する。各々のT細胞陽性標的細胞培養物における標的細胞の生存率(%)を標的細胞のみを含有するウェルに対して算出する。
メソテリンまたはMUC16について陽性または陰性のいずれかである標的細胞を、蛍光染料であるカルボキシフルオセイン二酢酸サクシニミジルエステル(CFSE)で標識する。これらの標的細胞を、非形質導入、対照CAR−T構築物形質導入、またはTFP形質導入のいずれかを行ったエフェクターT細胞と混合する。指定のインキュベーション時間後、フローサイトメトリーによって、各々のエフェクター/標的細胞培養物について、CFSE標識標的細胞及び陰性対照標的細胞の生細胞に対する死細胞の割合(%)を決定する。各々のT細胞陽性標的細胞培養物における標的細胞の生存率(%)を標的細胞のみを含有するウェルに対して算出する。
エフェクターT細胞の細胞障害活性は、エフェクター細胞と標的細胞との共インキュベーション後に、フローサイトメトリーを使用して、エフェクターT細胞がある場合またはない場合での標的細胞内の生存標的細胞数を比較することによって測定する。メソテリン.MUC16 TFPまたはCAR−T細胞での実験では、標的細胞はメソテリンまたはMUC16陽性細胞であり、それに対して陰性対照として使用する細胞はメソテリンまたはMUC16陰性細胞である。
標的細胞を1回洗浄し、PBS中に1×106細胞/mLで再懸濁させる。蛍光染料であるカルボキシフルオセイン二酢酸サクシニミジルエステル(CFSE)(Thermo Fisher Scientific(登録商標))を0.03μMの濃度で細胞懸濁液に添加し、細胞を室温で20分間インキュベートする。完全細胞培養培地(RPMI(登録商標)−1640+10%HI−FBS)を反応体積の5倍の体積で細胞懸濁液に添加することによって標識反応を停止し、細胞をさらに2分間室温でインキュベートする。細胞を遠心分離によってペレットにし、細胞傷害性培地(フェノールレッド不含RPMI−1640(Invitrogen(登録商標))プラス5%AB血清(Gemini Bio−products)中に2×l05細胞/mLで再懸濁させる。50マイクロリットルのCFSE標識−標的細胞懸濁液(10,000個の細胞と同等である)を96ウェルU底プレート(Corning(登録商標)Life Sciences)の各ウェルに添加する。
TFP構築物を形質導入したエフェクターT細胞を、陰性対照としての非形質導入T細胞と共に洗浄し、細胞傷害性培地中に2×106細胞/mL、または1×106細胞/mLで懸濁させる。50μLのエフェクターT細胞懸濁液(100,000または50,000個の細胞と同等である)をプレーティングした標的細胞に添加して、100μLの総体積中でエフェクター対標的の比率が、それぞれ10対1または5対1になるようにする。次いで培養物を混合し、遠沈させ、4時間37℃及び5%CO2でインキュベートする。このインキュベーションの直後に、培養細胞に7AAD(7−アミノアクチノマイシンD)(BioLegend(登録商標))を製造業者によって推奨される通りに添加し、フローサイトメトリーをBD LSRFortessa(登録商標)X−20(BD(登録商標)Biosciences)で実施する。フローサイトメトリーのデータの解析は、FlowJo(登録商標)ソフトウェア(TreeStar,Inc.)を使用して実施する。
標的細胞の生存率(%)は、エフェクターT細胞及び標的細胞を有する試料中の生存標的細胞(CFSE+7−AAD−)の数を、標的細胞のみを有する試料中の生存細胞(CFSE+7−AAD−)の数で除することによって算出する。エフェクター細胞の細胞傷害性は、標的細胞の殺傷率(%)=100%−細胞の生存率(%)として算出する。
抗MSLN.MUC16 28ζ CAR構築物または抗MSLN抗MUC16 BBζ CAR構築物を形質導入したT細胞は、非形質導入T細胞または非メソテリンもしくはMUC16特異的CAR対照を形質導入したT細胞のいずれかと比較したときに、メソテリンまたはMUC16発現細胞に対して細胞傷害性を実証することができる。しかし、抗メソテリン−CD3ε及び抗MUCl6−CD3εを形質導入したT細胞は、抗メソテリンCAR対照よりも標的に対して効率的に細胞傷害性を誘導することができる。抗メソテリン−CD3γ及び抗MUC16−CD3γ TFPも、5〜10:1のエフェクター標的比で抗メソテリン及び抗MUC16−CARで観察されるものよりも大きい確固たる細胞傷害性を媒介することができる。代替ヒンジ領域を有するTFP構築物でも同様の結果を得ることができる。この場合でも、メソテリンまたはMUC16発現標的細胞に対する細胞傷害性は、抗メソテリン−CD3ε及び抗MUC16−CD3εまたは抗メソテリン−CD3γ及び抗MUC16−CD3γTFPを形質導入したT細胞での細胞傷害性の方が、抗メソテリン及び抗MUC16−CARを形質導入したT細胞での細胞傷害性より大きくなり得る。
メソテリン及びMUC16に特異的なTFPをコードするmRNAでエレクトロポレーションしたT細胞も、メソテリン発現細胞に対して確固たる細胞傷害性を実証する。メソテリン−ネガティブ細胞の有意な殺傷は、対照または抗メソテリン及び抗MUC16 TFP構築物のいずれでも見られなかったが、メソテリンまたはMUC16発現細胞のメソテリンまたはMUC16特異的殺傷を、抗メソテリン及び抗MUC16−CD3ε、または抗メソテリン及び抗MUC16 CD3γ TFPを形質導入したT細胞で観察することができる。
実施例6:リアルタイム細胞傷害性アッセイによる細胞傷害性の決定
TFPは、リアルタイム細胞傷害性アッセイ(RTCA)形式でもCARより優れた細胞傷害性を実証することができる。RTCAアッセイは、専用96ウェルプレートの各ウェルで接着性標的細胞単層の電気インピーダンスをリアルタイムで測定し、最終的な読み出しを細胞指数と呼ばれる値として提示する。細胞指数の変動は、共インキュベートしたT細胞エフェクターによる標的細胞殺傷の結果として標的細胞単層が破壊されることを示す。よって、エフェクターT細胞の細胞傷害性は、標的細胞及びエフェクターT細胞を両方有するウェルの細胞指数の、標的細胞のみを有するウェルのものと比較した変動として評価することができる。
TFPは、リアルタイム細胞傷害性アッセイ(RTCA)形式でもCARより優れた細胞傷害性を実証することができる。RTCAアッセイは、専用96ウェルプレートの各ウェルで接着性標的細胞単層の電気インピーダンスをリアルタイムで測定し、最終的な読み出しを細胞指数と呼ばれる値として提示する。細胞指数の変動は、共インキュベートしたT細胞エフェクターによる標的細胞殺傷の結果として標的細胞単層が破壊されることを示す。よって、エフェクターT細胞の細胞傷害性は、標的細胞及びエフェクターT細胞を両方有するウェルの細胞指数の、標的細胞のみを有するウェルのものと比較した変動として評価することができる。
接着性標的細胞は、DMEM、10%FBS、1%Antibiotic−Antimycotic(Life Technologies)中で培養する。RTCAの調製のために、50μLの、例えばDMEM培地を、E−プレート(ACEA Biosciences(登録商標),Inc、カタログ番号:JL−10−156010−1A)の適正なウェルに添加する。次いで、このプレートをRTCA MP機器(ACEA Biosciences,Inc.)に入れ、適正なプレートレイアウト及びアッセイスケジュールを製造業者のマニュアルに記載される通りにRTCA2.0ソフトウェアに入力する。ベースライン測定は、100回の測定を15分毎に実施する。100μLの体積中1×104個の標的細胞を各アッセイウェルに添加し、細胞を15分間静置する。プレートを読み取り装置に戻し、読み取りを再開する。
翌日、エフェクターT細胞を洗浄し、細胞傷害性培地(フェノールレッド不含RPMI1640(Invitrogen(登録商標))プラス5%AB血清(Gemini Bio−products;100−318))中に再懸濁させる。次いで、プレートを機器から取り出し、細胞傷害性培地(フェノールレッド不含RPMI(登録商標)−1640+5%AB血清)中に懸濁させたエフェクターT細胞を、100,000個の細胞または50,000個の細胞で各ウェルに添加して、エフェクター対標的比がそれぞれ10対1または5対1になるようにする。次いで、プレートを機器に戻す。測定は、100回の測定を2分毎に、次いで1,000回の測定を15分毎に行う。
RTCAアッセイでは、抗メソテリン−28ζ及び抗MUC16−28ζ CAR形質導入T細胞、または抗メソテリン−BBζ及び抗MUC16 BBζ CAR形質導入構築物を形質導入したT細胞で、TFP形質導入細胞の殺傷を観察することができる。これは、細胞単独または対照CAR構築物を形質導入したT細胞と共インキュベートした細胞と比較して、エフェクター細胞添加後に細胞指数が時間依存的に減少することによって実証される。しかし、TFP発現T細胞による標的細胞の殺傷の方が、CARで観察されるものよりも深く、迅速であり得る。例えば、TFPを形質導入したT細胞の添加から4時間以内に、メソテリンまたはMUC16発現標的細胞の殺傷が本質的に完了し得る。他のCD3及びTCR構築物含む幾つものTFP構築物を形質導入したT細胞では、殺傷はほとんどまたは全く観察できない。代替ヒンジ領域を有するTFP構築物で同様の結果を得ることができる。メソテリンを形質導入した標的細胞に対する細胞傷害性は、TFPを形質導入したT細胞での細胞傷害性の方が、CARを形質導入したT細胞での細胞傷害性より大きくなり得る。
TFPを形質導入したT細胞の細胞傷害活性は、形質導入に使用したウイルス量(MOI)に関して用量依存的であり得る。TFPレンチウイルスのMOIが増加するとメソテリン陽性細胞の殺傷が増加することを観察することができ、それによってTFP形質導入と細胞障害活性との間の関係性がさらに強化される。
実施例7:高または低標的密度を有する細胞におけるルシフェラーゼベースの細胞傷害性アッセイ
ルシフェラーゼベースの細胞傷害性アッセイは、共培養後に残留する生存標的細胞におけるルシフェラーゼ酵素活性を間接的に測定することによって、TFP T細胞の細胞傷害性を査定するものである。
ルシフェラーゼベースの細胞傷害性アッセイは、共培養後に残留する生存標的細胞におけるルシフェラーゼ酵素活性を間接的に測定することによって、TFP T細胞の細胞傷害性を査定するものである。
ヒト腫瘍細胞株、K562を共培養する標的細胞株として使用する。標的を発現しない(「DN」)、MSLNを発現する(「MSLN+」)、MUC16を発現する(「MUC16+」)、またはMSLNとMUC16を両方発現する(「DP」)K562細胞を、ヒトMSLN、ヒトMUC16細胞外ドメインをコードするレンチウイルスで形質導入することによって、または両方のウイルスで逐次形質導入することによって生成した。レンチウイルスによってコードされる耐性遺伝子に一致する抗生物質を適用することによって、所望の標的抗原を安定的に発現する標的細胞を選択した。標的細胞は、ホタルルシフェラーゼをコードするレンチウイルスでの形質導入、続いて安定な細胞株を生成するための抗生物質の選択を介して、ホタルルシフェラーゼを過剰発現するようにさらに改変した。
典型的な細胞傷害性アッセイでは、標的細胞をウェル当たり5000個の細胞で96ウェルプレートにプレーティングする。TFP Tまたは対照細胞を標的細胞に様々なエフェクター対標的比で添加した。次いで、細胞の混合物を24時間または48時間、37℃、5%CO2で培養し、その後、生存標的細胞におけるルシフェラーゼ酵素活性を、Bright−Glo(登録商標)Luciferase Assay System(Promega(登録商標)、カタログ番号E2610)によって測定した。細胞は遠心してペレットにし、ルシフェラーゼ基質を含有する培地中に再懸濁させた。次いで、腫瘍細胞の殺傷率(%)を次式で算出した:細胞傷害性(%)=100%×[1−RLU(腫瘍細胞+T細胞)/RLU(腫瘍細胞)]。
実施例8:T細胞でのCD69またはCD25の上方制御によって測定される活性化
CAR及びTFP構築物を発現するT細胞の活性化は、MSLN+またはMUC16+、及びMSLN−またはMUC16−細胞を使用して実施する。上記のように、活性化したPBMCに50MOIのLVで2日間連続して形質導入し、それを拡大する。形質導入後8日目に、PBMCの共培養物を、細胞傷害性培地(フェノールレッド不含RPMI1640(Invitrogen(登録商標))プラス5%AB血清(Gemini Bio−products;100−318)中で標的細胞とE:T比1:1で合わせる(各細胞型0.2×106)。BCMAを過剰発現する細胞は、陰性対照として使用することができる。共培養の開始から24時間後に、細胞を採集し、PBSで3回洗浄し、Live/Dead Aquaで30分間氷上で染色する。Fc受容体をブロッキングするために、ヒトFc block(BD)を添加し、10分間室温でインキュベートする。続いて細胞を、抗CD3 APC(クローン、UCHT1)、抗CD8 APCcy7(クローンSKI)、抗CD69−Alexa Fluor(登録商標)700(クローンFN50)(BD(登録商標)Biosciences製)、及び抗CD25−PE(クローンBC96、eBioscience(登録商標))で染色する。細胞を2回洗浄し、BD LSRII−Fortessa(登録商標)によって解析する。データは、上記のようにFlowJo(登録商標)解析ソフトウェア(Tree star,Inc)を使用して解析する。
CAR及びTFP構築物を発現するT細胞の活性化は、MSLN+またはMUC16+、及びMSLN−またはMUC16−細胞を使用して実施する。上記のように、活性化したPBMCに50MOIのLVで2日間連続して形質導入し、それを拡大する。形質導入後8日目に、PBMCの共培養物を、細胞傷害性培地(フェノールレッド不含RPMI1640(Invitrogen(登録商標))プラス5%AB血清(Gemini Bio−products;100−318)中で標的細胞とE:T比1:1で合わせる(各細胞型0.2×106)。BCMAを過剰発現する細胞は、陰性対照として使用することができる。共培養の開始から24時間後に、細胞を採集し、PBSで3回洗浄し、Live/Dead Aquaで30分間氷上で染色する。Fc受容体をブロッキングするために、ヒトFc block(BD)を添加し、10分間室温でインキュベートする。続いて細胞を、抗CD3 APC(クローン、UCHT1)、抗CD8 APCcy7(クローンSKI)、抗CD69−Alexa Fluor(登録商標)700(クローンFN50)(BD(登録商標)Biosciences製)、及び抗CD25−PE(クローンBC96、eBioscience(登録商標))で染色する。細胞を2回洗浄し、BD LSRII−Fortessa(登録商標)によって解析する。データは、上記のようにFlowJo(登録商標)解析ソフトウェア(Tree star,Inc)を使用して解析する。
同様の実験を、非形質導入T細胞または陽性対照バインダーを形質導入したT細胞のいずれかで、MSLN−またはMUC16−細胞、及びMSLN+またはMUC16+細胞を使用して行うことができる。
T細胞の活性化は、グランザイムB産生の解析によっても同様に査定することができる。T細胞は、上記のように培養及び拡大し、グランザイムBの細胞内染色を製造業者のキット使用説明書に従って行う(Gemini Bio−products;100−318)。細胞を採集し、PBSで3回洗浄し、ヒトFc blockで10分間ブロッキングする。細胞は、表面抗原を抗CD3 APC(クローン、UCHT1)及び抗CD8 APCcy7(クローンSKI)で30分間4℃で染色する。次いで、細胞を固定/透過処理溶液(BD Cytofix/Cytoperm(登録商標)Fixation/Permealbilzationキット カタログ番号554714)で20分間4℃で固定し、BD Perm/Wash(登録商標)緩衝液で洗浄することによって流す。続いて細胞を抗グランザイムB Alexafluor700(登録商標)(クローンGB11)で染色し、BD Perm/洗浄緩衝液で2回洗浄し、FACS緩衝液中に再懸濁させる。データをBD LSRII−Fortessa(登録商標)で取得し、FlowJo(登録商標)(Tree star Inc.)を使用して解析する。
実施例9:ELISAによるサイトカイン分泌の比較定量化
同種抗原を有する細胞の認識に関連するエフェクターT細胞の活性化及び増殖の別の尺度は、インターロイキン−2(IL−2)及びインターフェロン−ガンマ(IFN−γ)などのエフェクターサイトカインの産生である。
同種抗原を有する細胞の認識に関連するエフェクターT細胞の活性化及び増殖の別の尺度は、インターロイキン−2(IL−2)及びインターフェロン−ガンマ(IFN−γ)などのエフェクターサイトカインの産生である。
顆粒球−マクロファージコロニー刺激因子(GM−CSF)及び腫瘍壊死因子α(TNF−α)。
単一特異性TFP T細胞及び二重特異性TFP T細胞による、IL−2、IFN−γ、GM−CSF、及びTNF−αを含めた標的特異的サイトカインの産生を、T細胞と様々なK562ベースの標的細胞との共培養の48時間後に採集した上清から、U−PLEX(登録商標)Biomarker Group I(hu)Assays(Meso Scale Diagnostics(登録商標)、LLC、カタログ番号:K15067L−4)を使用して測定した。
非形質導入T細胞または対照であるCARを形質導入したT細胞と比較して、TFPを形質導入したT細胞は、メソテリンもしくはMUC16を内因的に発現する細胞またはメソテリンもしくはMUC16を形質導入した細胞のいずれかと共培養したときに、より高いレベルのIL−2及びIFN−γを両方とも産生し得る。対照的に、メソテリンもしくはMUC16陰性細胞または非形質導入細胞と共培養すると、TFPを形質導入したT細胞からのサイトカインの放出をほとんどまたは全くもたらすことができない。前述の細胞傷害性のデータと一致して、代替ヒンジ領域で構築したTFPは、メソテリンまたはMUC16を有する標的細胞と共培養したときに同様の結果を生じ得る。
実施例10:ヒトMUC16ペプチドに特異的なナノボディの生成及び同定
材料及び方法
ヒトMUC16ペプチドを使用するVHHの形質転換、再クローニング、及び発現
NFSPLARRVDRVAIYEEFLRMTRNGTQLQNFTLDRSSVLVDGYSPNRNEPLTGNSDLP(配列番号92)
材料及び方法
ヒトMUC16ペプチドを使用するVHHの形質転換、再クローニング、及び発現
NFSPLARRVDRVAIYEEFLRMTRNGTQLQNFTLDRSSVLVDGYSPNRNEPLTGNSDLP(配列番号92)
組み換えpMECS GGでの非サプレッサー株(例えば、WK6)の形質転換
pMECS GGベクターにクローニングするナノボディ遺伝子は、PelBシグナル配列をN末端に、HAタグ及びHis6タグをC末端に含有する(PelBリーダー−ナノボディ−HA−His6)。PelBリーダー配列は、ナノボディをE.coliの細胞膜周辺腔に指向させ、HA及びHis6タグは、ナノボディの精製及び検出(例えば、ELISA、ウエスタンブロットなどでの)に使用することができる。
pMECS GGベクターにクローニングするナノボディ遺伝子は、PelBシグナル配列をN末端に、HAタグ及びHis6タグをC末端に含有する(PelBリーダー−ナノボディ−HA−His6)。PelBリーダー配列は、ナノボディをE.coliの細胞膜周辺腔に指向させ、HA及びHis6タグは、ナノボディの精製及び検出(例えば、ELISA、ウエスタンブロットなどでの)に使用することができる。
pMECS GGベクターでは、His6タグの後にアンバー終止コドン(TAG)が続き、このアンバー終止コドンの後にM13ファージの遺伝子IIIが続く。サプレッサーE.coll株(例えば、TG1)では、アンバー終止コドンはグルタミンとして読み取られ、したがってナノボディはファージのタンパク質IIIとの融合タンパク質として発現し、それによってパニングのためにナノボディをファージコート上にディスプレイすることが可能になる。非サプレッサーE.coli株(例えば、WK6)では、アンバー終止コドンは終止コドンとして読み取られ、したがって得られるナノボディはタンパク質IIIに融合しない。
pMECS GGベクターにクローニングされたナノボディを発現し、精製するために、関心対象のナノボディの遺伝子を含有するpMECS GGベクターを調製し、非サプレッサー株(例えば、WK6)をこのプラスミドで形質転換するために使用する。得られたクローンのナノボディは、MP057プライマー(5’−TTATGCTTCCGGCTCGTATG−3’(配列番号99))を使用して配列決定して、クローンの同一性を確認する。抗原結合能力は、ELISAまたは任意の他の適正なアッセイによって再試験する。ナノボディ遺伝子を有する組み換えpMECS GGベクターを含有する非サプレッサー株(例えば、WK6)を使用して、ナノボディを発現させ、精製することができる。
ナノボディ遺伝子のpMECS GGからpHEN6cベクターへの再クローニング
プライマー配列:
− プライマーA6E(5’ GAT GTG CAG CTG CAG GAG TCT GGR GGA GG3’)(配列番号:94)。
プライマー配列:
− プライマーA6E(5’ GAT GTG CAG CTG CAG GAG TCT GGR GGA GG3’)(配列番号:94)。
− プライマーPMCF(5’ CTA GTG CGG CCG CTG AGG AGA CGG TGA CCT GGG T 3’)(配列番号:95)。
− ユニバーサルリバースプライマー(5’ TCA CAC AGG AAA CAG CTA TGA C 3’)(配列番号:96)。
− ユニバーサルフォワードプライマー(5 CGC CAG GGT TTT CCC AGT CAC GAC 3’)(配列番号:97)。
ナノボディ遺伝子は、鋳型としてのナノボディ遺伝子ならびにプライマーA6E及びPMCFを有する組み換えpMECS GGを含有するE.coliを使用するPCRによって増幅する(約30サイクルのPCR、各サイクルは、94℃で30秒、55℃で30秒、及び72℃で45秒からなり、続いてPCRの最後に72℃で10分の伸長)。約400bpの断片を増幅する。次いでPCR産物を精製し(例えば、Qiagen(登録商標)製のQiaQuick(登録商標)PCR精製キットによる)、PstIで一晩消化する。
PCR産物を精製し、BstEIIで一晩消化する(またはFermentas Life Sciences(登録商標)製のEco91I)。PCR産物を上記のように精製し、pHEN6cベクターをPstIで3時間消化する。消化したベクターを上記のように精製し、次いでBstEIIで2〜3時間消化する。消化したベクターを1%アガロースゲルで泳動し、ベクターバンドをゲルから切り出し、精製する(例えば、Qiagen製のQIAQuickゲル抽出キットによる)。PCR産物とベクターとをライゲーションする。エレクトロコンピテントWK6細胞をライゲーション反応で形質転換する。形質転換体を、LB/寒天/アンピシリン(100μg/ml)/グルコース(1〜2%)プレートを使用して選択する。
ナノボディの発現及び精製:
新たに形質転換したWK6コロニーを使用して、10〜20mlのLB+アンピシリン(100μg/ml)+グルコース(1%)に接種し、200〜250rpmで振盪しながら37℃で一晩インキュベートする。この前培養物1mlを、100μg/mlアンピシリン、2mM MgCl2、及び0.1%グルコースを補給したTB培地330mlに添加し、振盪(200〜250rpm)しながら37℃で増殖させ、OD600が0.6〜0.9になるまで行う。1mMの最終濃度までIPTGを添加することによってナノボディの発現を誘導し、培養物を28℃で一晩振盪しながらインキュベートする(約16〜18時間;一晩の誘導後のOD600は、理想的には25〜30の間になるはずである)。
新たに形質転換したWK6コロニーを使用して、10〜20mlのLB+アンピシリン(100μg/ml)+グルコース(1%)に接種し、200〜250rpmで振盪しながら37℃で一晩インキュベートする。この前培養物1mlを、100μg/mlアンピシリン、2mM MgCl2、及び0.1%グルコースを補給したTB培地330mlに添加し、振盪(200〜250rpm)しながら37℃で増殖させ、OD600が0.6〜0.9になるまで行う。1mMの最終濃度までIPTGを添加することによってナノボディの発現を誘導し、培養物を28℃で一晩振盪しながらインキュベートする(約16〜18時間;一晩の誘導後のOD600は、理想的には25〜30の間になるはずである)。
培養物を8分間8000rpmで遠心分離し、ペレットを1リットルの培養物から12mlのTES(Sigma−Aldrich(登録商標))に再懸濁させ、氷上で1時間振盪する。使用したTES12ml毎に、18mlのTES/4を添加し、氷上でさらに1時間(振盪しながら)さらにインキュベートし、次いで8000rpmで30分間4℃で遠心分離する。その上清は、細胞膜周辺腔から抽出されたタンパク質を含有する。
IMACによる精製
His−selectをPBSで平衡化する:1リットルの培養物に由来する周辺質抽出物当たり1mlの樹脂(約2mlのHis−select溶液)を50mlのファルコンチューブに添加し、PBSを添加して最終体積を50mlにし、混合し、次いで、2000rpmで2分間遠心分離し、上清を捨てる。この樹脂をPBSで2回洗浄し、次いで周辺質抽出物を添加し、穏やかに振盪しながら30分間〜1時間室温でインキュベートする(インキュベーション時間をそれより長くすると非特異的結合が生じることがある)。
His−selectをPBSで平衡化する:1リットルの培養物に由来する周辺質抽出物当たり1mlの樹脂(約2mlのHis−select溶液)を50mlのファルコンチューブに添加し、PBSを添加して最終体積を50mlにし、混合し、次いで、2000rpmで2分間遠心分離し、上清を捨てる。この樹脂をPBSで2回洗浄し、次いで周辺質抽出物を添加し、穏やかに振盪しながら30分間〜1時間室温でインキュベートする(インキュベーション時間をそれより長くすると非特異的結合が生じることがある)。
試料を、底部にフィルターを有するPD−10カラム(GE healthcare、カタログ番号17−0435−01)にかけ、50〜100mlのPBS(使用する樹脂1ml当たり50〜100mlのPBS)で洗浄する。溶出を3回実施し、毎回、使用する樹脂1ml当たり1mlのPBS/0.5Mイミダゾールを用い、合わせた溶出液をPBSに対して一晩4℃で透析して(カットオフ3500ダルトン)、イミダゾールを除去する。
タンパク質の量は、溶出した試料のOD280測定によって、この時点で推定することができる。各クローンの吸光係数は、Expasyプロテオミクスサーバーでの一次構造解析の下でProtParamツールによって決定することができる。ナノボディのさらなる精製は、様々な方法によって実現することができる。例えば、試料は、Superdex(登録商標)75 16/60にかけるのに適した体積が得られるまで(最大4ml)2000rpm、4℃で遠心分離することによって、濃縮されてもよい(Vivaspin(登録商標)5000MWカットオフ、Vivascience(登録商標))。次いで、濃縮した試料を、PBSで平衡化したSuperdex 75 16/60カラムにかける。ピーク画分をプールし、試料をOD280で測定し、定量化する。アリコートは、約1mg/mlの濃度で、−20℃で保存する。
免疫化
ラマに、KLHに結合したヒトMUC16ペプチド(hMUC16)(NFSPLARRVDRVAIYEEFLRMTRNGTQLQNFTLDRSSVLVDGYSPNRNEPLTGNSDLP−C−KLH)(配列番号93)、及び/またはC末端でビオチン化したヒトMUC16ペプチド(NFSPLARRVDRVAIYEEFLRMTRNGTQLQNFTLDRSSVLVDGYSPNRNEPLTGNSDLP−C−ビオチン)、及び/またはN末端でビオチン化したヒトMUC16ペプチド(ビオチン−NFSPLARRVDRVAIYEEFLRMTRNGTQLQNFTLDRSSVLVDGYSPNRNEPLTGNSDLP)を、0、7、14、21、28、及び35日目に皮下注射した。ビオチン化ペプチドは、注射前に中性アビジンと混合した。使用したアジュバントは、GERBUアジュバントP(GERBU Biotechnik GmbH)であった。40日目に、リンパ球調製物のために、ラマから約100mlの抗凝固処理血液を収集した。
ラマに、KLHに結合したヒトMUC16ペプチド(hMUC16)(NFSPLARRVDRVAIYEEFLRMTRNGTQLQNFTLDRSSVLVDGYSPNRNEPLTGNSDLP−C−KLH)(配列番号93)、及び/またはC末端でビオチン化したヒトMUC16ペプチド(NFSPLARRVDRVAIYEEFLRMTRNGTQLQNFTLDRSSVLVDGYSPNRNEPLTGNSDLP−C−ビオチン)、及び/またはN末端でビオチン化したヒトMUC16ペプチド(ビオチン−NFSPLARRVDRVAIYEEFLRMTRNGTQLQNFTLDRSSVLVDGYSPNRNEPLTGNSDLP)を、0、7、14、21、28、及び35日目に皮下注射した。ビオチン化ペプチドは、注射前に中性アビジンと混合した。使用したアジュバントは、GERBUアジュバントP(GERBU Biotechnik GmbH)であった。40日目に、リンパ球調製物のために、ラマから約100mlの抗凝固処理血液を収集した。
VHHライブラリーの構築
抗原特異的ナノボディの存在をスクリーニングするために、ラマのリンパ球からVHHライブラリーを構築した。この目的のために、末梢血リンパ球からの全RNAを、オリゴ(dT)プライマーを用いる第1鎖cDNA合成のための鋳型として使用した。このcDNAを使用して、VHHコード配列をPCRによって増幅し、SAPIで消化し、ファージミドベクターpMECS−GGのSAPI部位にクローニングした。このように得られたVHHライブラリーをCore 93GGと呼んだ。このライブラリーは、約108個の独立した形質転換体から構成され、約87%の形質転換体が、正しい挿入物サイズを有するベクターを有していた。
抗原特異的ナノボディの存在をスクリーニングするために、ラマのリンパ球からVHHライブラリーを構築した。この目的のために、末梢血リンパ球からの全RNAを、オリゴ(dT)プライマーを用いる第1鎖cDNA合成のための鋳型として使用した。このcDNAを使用して、VHHコード配列をPCRによって増幅し、SAPIで消化し、ファージミドベクターpMECS−GGのSAPI部位にクローニングした。このように得られたVHHライブラリーをCore 93GGと呼んだ。このライブラリーは、約108個の独立した形質転換体から構成され、約87%の形質転換体が、正しい挿入物サイズを有するベクターを有していた。
ヒトMUC16ペプチド特異的ナノボディの単離
Core 93GGライブラリーを、CまたはN末端のいずれかをビオチン化したhMUC16(bio−hMUC16)ペプチド
NFSPLARRVDRVAIYEEFLRMTRNGTQLQNFTLDRSSVLVDGYSPNRNEPLTGNSDLP(配列番号92)に対して4回パニングした。bio−hMUC16ペプチドをストレプトアビジン被覆プレートと相互作用させ、その後ライブラリー由来のファージをプレートに添加した。抗原特異的ファージの濃厚化は、各回のパニング後に、抗原被覆ウェルから溶出したファージミド粒子の数を、陰性対照ウェル(ストレプトアビジンで被覆され、ブロッキングされているが、ペプチドを含有しない)から溶出したファージミド粒子の数と比較することによって査定した。これらの実験から、ファージ集団が、2回目の後に抗原特異的ファージについて約2倍に濃厚化されたことが示唆された。1回目、3回目、及び4回目の後に濃厚化は観察されなかった。合計して380個のコロニー(3回目から190個、4回目から190個)を無作為に選択し、それらの周辺質抽出物中の抗原特異的ナノボディの存在についてELISAによって解析した(ELISAは可溶性ナノボディを含む粗周辺質抽出物を使用する)。ELISAスクリーニングに使用したペプチドは、パニングに使用したものと同じであり、ブロッキングしたストレプトアビジン被覆ウェルにペプチドを含まないものを陰性対照として使用した。これらの380個のコロニーのうち、34個のコロニーがこのアッセイで陽性と評価された。陽性コロニーの配列データに基づいて、2つの異なるCDR3グループ(B細胞系統)に属する、6つの異なる完全長ナノボディが区別された(Excelファイルを参照されたい)。同じCDR3グループ(同じB細胞系統)に属するナノボディは、非常に類似しており、それらのアミノ酸配列から、それらは、体細胞超突然変異に起因するクローン的に関連したB細胞に由来するか、または同じB細胞に由来するが、ライブラリー構築中のRT及び/またはPCRエラーによって多様化したことが示唆される。同じCDR3グループに属するナノボディは、同じエピトープを認識するが、それらの他の特徴(例えば、親和性、効力、安定性、発現収率など)が異なり得る。これらのパニングからのクローンは、次の名称のコード:MUを有する。
Core 93GGライブラリーを、CまたはN末端のいずれかをビオチン化したhMUC16(bio−hMUC16)ペプチド
NFSPLARRVDRVAIYEEFLRMTRNGTQLQNFTLDRSSVLVDGYSPNRNEPLTGNSDLP(配列番号92)に対して4回パニングした。bio−hMUC16ペプチドをストレプトアビジン被覆プレートと相互作用させ、その後ライブラリー由来のファージをプレートに添加した。抗原特異的ファージの濃厚化は、各回のパニング後に、抗原被覆ウェルから溶出したファージミド粒子の数を、陰性対照ウェル(ストレプトアビジンで被覆され、ブロッキングされているが、ペプチドを含有しない)から溶出したファージミド粒子の数と比較することによって査定した。これらの実験から、ファージ集団が、2回目の後に抗原特異的ファージについて約2倍に濃厚化されたことが示唆された。1回目、3回目、及び4回目の後に濃厚化は観察されなかった。合計して380個のコロニー(3回目から190個、4回目から190個)を無作為に選択し、それらの周辺質抽出物中の抗原特異的ナノボディの存在についてELISAによって解析した(ELISAは可溶性ナノボディを含む粗周辺質抽出物を使用する)。ELISAスクリーニングに使用したペプチドは、パニングに使用したものと同じであり、ブロッキングしたストレプトアビジン被覆ウェルにペプチドを含まないものを陰性対照として使用した。これらの380個のコロニーのうち、34個のコロニーがこのアッセイで陽性と評価された。陽性コロニーの配列データに基づいて、2つの異なるCDR3グループ(B細胞系統)に属する、6つの異なる完全長ナノボディが区別された(Excelファイルを参照されたい)。同じCDR3グループ(同じB細胞系統)に属するナノボディは、非常に類似しており、それらのアミノ酸配列から、それらは、体細胞超突然変異に起因するクローン的に関連したB細胞に由来するか、または同じB細胞に由来するが、ライブラリー構築中のRT及び/またはPCRエラーによって多様化したことが示唆される。同じCDR3グループに属するナノボディは、同じエピトープを認識するが、それらの他の特徴(例えば、親和性、効力、安定性、発現収率など)が異なり得る。これらのパニングからのクローンは、次の名称のコード:MUを有する。
hMUC16ペプチド特異的ナノボディのフローサイトメトリー解析
ナノボディ及び細胞
各々の抗hMUC16−ペプチドNbについて、上記の最初のELISAスクリーニングで行ったのと同じように周辺質抽出物を生成した。各細胞株からの細胞(SKOV3 Muc16 Luc、OVCAR 3 Muc16 Luc、Expi−293、及びジャーカット)を解凍し、洗浄し、計数した。各Nbクローンからの周辺質抽出物を、約2×105個の細胞でインキュベートした。洗浄後、細胞を、マウス抗HAタグ抗体と抗マウスPEとの混合物とインキュベートした。さらに洗浄した後、To−pro(登録商標)(Thermo Fisher Scientific(登録商標))を生/死染色として各試料に添加し、細胞をフローサイトメトリーで解析した。陽性対照Mabとして、ヒト抗Muc16−4h11(+抗ヒトIgG−PE+To−pro)を、SKOV3 Muc16 Luc及びOVCAR 3 Muc16 Luc細胞に対して使用した。陰性対照として、各細胞株に、無関係のNbを有する試料(BCII10−細菌βラクタマーゼ特異的)、すべての検出Mabを有する試料、二次抗マウスPE Mabだけを有する試料、及び細胞だけを有する試料(To−proを含む及び含まないもの)を使用した。
ナノボディ及び細胞
各々の抗hMUC16−ペプチドNbについて、上記の最初のELISAスクリーニングで行ったのと同じように周辺質抽出物を生成した。各細胞株からの細胞(SKOV3 Muc16 Luc、OVCAR 3 Muc16 Luc、Expi−293、及びジャーカット)を解凍し、洗浄し、計数した。各Nbクローンからの周辺質抽出物を、約2×105個の細胞でインキュベートした。洗浄後、細胞を、マウス抗HAタグ抗体と抗マウスPEとの混合物とインキュベートした。さらに洗浄した後、To−pro(登録商標)(Thermo Fisher Scientific(登録商標))を生/死染色として各試料に添加し、細胞をフローサイトメトリーで解析した。陽性対照Mabとして、ヒト抗Muc16−4h11(+抗ヒトIgG−PE+To−pro)を、SKOV3 Muc16 Luc及びOVCAR 3 Muc16 Luc細胞に対して使用した。陰性対照として、各細胞株に、無関係のNbを有する試料(BCII10−細菌βラクタマーゼ特異的)、すべての検出Mabを有する試料、二次抗マウスPE Mabだけを有する試料、及び細胞だけを有する試料(To−proを含む及び含まないもの)を使用した。
実施例11:ジャーカットヒトT細胞株におけるフローサイトメトリーベースのMSLN及びMUC16特異的TFPの検出
MSLN及びMUC16二重特異性TFPの発現を、フローサイトメトリーを使用して、最初にジャーカットヒトT細胞株で評価した。MSLN特異的TFP、MUC16特異的TFP、または二重特異性TFP(MSLN TFP及びMUC16 TFPが単一のレンチウイルスベクター内でT2A配列によって連結されたもの)をコードするレンチウイルス調製物を使用して、ジャーカット細胞に形質導入した。
MSLN及びMUC16二重特異性TFPの発現を、フローサイトメトリーを使用して、最初にジャーカットヒトT細胞株で評価した。MSLN特異的TFP、MUC16特異的TFP、または二重特異性TFP(MSLN TFP及びMUC16 TFPが単一のレンチウイルスベクター内でT2A配列によって連結されたもの)をコードするレンチウイルス調製物を使用して、ジャーカット細胞に形質導入した。
レンチウイルスによる形質導入から48時間後に、形質導入されたジャーカット細胞及び非形質導入(NT)対照細胞を採集し、MSLN及びMUC16特異的TFPの表面発現について解析した。MSLN特異的TFPは、Fc MSLN、Fcタグを有するヒトメソテリン/MSLN(296−580)タンパク質(AcroBiosystems、カタログ番号:MSN−H526x)によって検出した。このタンパク質は、Zenon(商標)Allophycocyanin Human IgG Labelling Kit(ThermoFisher Scientific、カタログ番号:Z25451)で標識し、1μg/試料で染色に使用した。
MUC16特異的TFPは、MUC16−ビオチンペプチド(UniProtKB:Q8WXI7、aa 14319−14438、New England Peptideで合成されたもの)、続いてストレプトアビジン−PE(BD Bioscience、カタログ番号:554061)によって検出した。MUC16ペプチドは、試料当たり40ピコモルで使用した。すべてのジャーカット細胞(NT、MSLN TFP、MUC16 TFP、二重特異性TFP)は、最初に標識Fc_MSLN及びMUC16−ビオチンで同時に染色し、次いでストレプトアビジン−PEで染色した。
MSLN特異的TFPを発現するが、MUC16 TFPを発現しないことが、MSLN TFPをコードするレンチウイルスで形質導入したジャーカット細胞で検出された(図3B)。加えて、MUC16 TFPをコードするレンチウイルスで形質導入したジャーカット細胞で、MUC16 TFPは検出されたが、MSLN TFPは検出されなかった(図3C)。二重特異性TFPをコードするレンチウイルスで形質導入したジャーカット細胞では、両方のMSLN TFPとMUC16 TFPが、形質導入したジャーカット細胞の同じ集団の表面に検出された(図3D)。NTジャーカット細胞では、MSLN TFPまたはMUC16 TFPの検出は観察されなかった(図3A)。
実施例13:二重特異性TFPジャーカット細胞による標的特異的サイトカイン産生
標的を発現しない(「DN」)、MSLNを発現する(「MSLN+」)、MUC16を発現する(「MUC16+」)、またはMSLNとMUC16を両方発現する(「DP」)、単一特異性TFPジャーカット細胞及び二重特異性TFPジャーカット細胞による標的特異的サイトカイン産生を、ジャーカット細胞と様々なK562ベースの標的細胞との共培養から24時間後に採集された上清で測定した。上清中のヒトIL−2のレベルは、Meso Scale Discovery Technology(MesoScale Diagnostic,LLC)を使用して、U−PLEX Biomarker Group I(hu) Assays(カタログ番号:K15067L−4)で解析した。
標的を発現しない(「DN」)、MSLNを発現する(「MSLN+」)、MUC16を発現する(「MUC16+」)、またはMSLNとMUC16を両方発現する(「DP」)、単一特異性TFPジャーカット細胞及び二重特異性TFPジャーカット細胞による標的特異的サイトカイン産生を、ジャーカット細胞と様々なK562ベースの標的細胞との共培養から24時間後に採集された上清で測定した。上清中のヒトIL−2のレベルは、Meso Scale Discovery Technology(MesoScale Diagnostic,LLC)を使用して、U−PLEX Biomarker Group I(hu) Assays(カタログ番号:K15067L−4)で解析した。
NTジャーカット細胞は、標的の発現にかかわらず、いずれの標的腫瘍細胞との共培養でも検出可能なIL−2を産生しなかった(図4)。単一特異性TFPジャーカット細胞は、マッチした標的を発現する標的細胞との共培養でのみ(すなわち、MSLN発現細胞またはK562過剰発現細胞と共培養したMSLN TFPジャーカット細胞、及びMUC16発現細胞またはK562過剰発現細胞と共培養したMUC16 TFPジャーカット細胞)IL−2を産生した。MSLN TFPジャーカット細胞は、MSLN+標的細胞またはDP標的細胞との共培養でIL−2を産生したが、DNまたはMUC16+標的細胞との共培養では産生しなかった。MUC16 TFPジャーカット細胞は、MUC16+標的細胞またはDP標的細胞との共培養でIL−2を産生したが、DNまたはMSLN+標的細胞との共培養では産生しなかった。二重特異性TFPジャーカット細胞は、標的、MSLNのみ(MSLN+)、MUC16のみ(MUC16+)、または両方の標的(DP)のうちのいずれかを発現する標的細胞に応答してIL−2を産生し、両方の単一特異性TFPジャーカット細胞より広い反応性を実証した(図4)。標的を発現しない標的細胞(DN)との共培養ではIL−2が産生されなかったことから、二重特異性TFPの特異性が確認された。
実施例14:初代ヒトT細胞におけるフローサイトメトリーベースのMSLN及びMUC16の二重特異性TFPの検出
NT、MSLN TFP、MUC16 TFP、及び二重特異性TFP T細胞は、健常なドナーのヒト初代T細胞から、単一または二重特異性TFPをコードするレンチウイルスで形質導入することによって生成した。これらのT細胞は、健常なドナーのPBMCから精製し、0日目に、MACS GMP T Cell TransAct(登録商標)(Miltenyi(登録商標)Biotech、カタログ番号:130−019−011)によって活性化し、ヒトIL−7が存在するときは、プレミアムグレード(Miltenyi Biotech、カタログ番号:130−095−364)、及びヒトIL−15が存在するときは、プレミアムグレード(Miltenyi Biotech、カタログ番号:130−095−766)によって行った。1日目に、活性化T細胞にレンチウイルスで形質導入し、新たな培地を2日毎に補給することによって、細胞を10日間拡大させた。
NT、MSLN TFP、MUC16 TFP、及び二重特異性TFP T細胞は、健常なドナーのヒト初代T細胞から、単一または二重特異性TFPをコードするレンチウイルスで形質導入することによって生成した。これらのT細胞は、健常なドナーのPBMCから精製し、0日目に、MACS GMP T Cell TransAct(登録商標)(Miltenyi(登録商標)Biotech、カタログ番号:130−019−011)によって活性化し、ヒトIL−7が存在するときは、プレミアムグレード(Miltenyi Biotech、カタログ番号:130−095−364)、及びヒトIL−15が存在するときは、プレミアムグレード(Miltenyi Biotech、カタログ番号:130−095−766)によって行った。1日目に、活性化T細胞にレンチウイルスで形質導入し、新たな培地を2日毎に補給することによって、細胞を10日間拡大させた。
10日目に、T細胞を採集し、上記のようにフローサイトメトリーによってFc MSLN及びMUC16−ビオチンペプチドで染色して、単一または二重特異性TFPの表面発現を決定した。このリガンドに加えて、MonoRab(登録商標)Rabbit Anti−Camelid VHH Antibody[iFluor488](GenScript(登録商標)、カタログ番号:A01862)を使用してTFPを検出した。
ジャーカット細胞を使用するアッセイに見られる結果と同様に、MSLN特異的TFPを発現するが(図5C)、MUC16 TFPを発現しないことが(図5D)MSLN TFP T細胞で検出され、加えて、MUC16 TFPを発現するが(図5F)、MSLN TFPを発現しないことが(図5E)MUC16 TFP T細胞で検出された。二重特異性TFP T細胞では、両方のMSLN TFP及びMUC16 TFPが形質導入した細胞の表面上で検出された(図5G及び5H)。NT T細胞では、MSLN TFPまたはMUC16 TFPの検出は観察されなかった(図5A及び5B)。
実施例15:二重特異性TFP T細胞による標的特異的な腫瘍細胞殺傷
単一特異性及び二重特異性TFP T細胞による標的特異的な腫瘍細胞殺傷を、実施例14に従って調製した初代ヒトT細胞を使用して、in vitroでの細胞傷害性アッセイを使用して評価した。標的を発現しない(DN)、MSLNを発現する(MSLN+)、MUC16を発現する(MUC16+)、またはMSLNとMUC16を両方発現する(DP)腫瘍細胞株(実施例13に記載する通り)を、レポーターとしてホタルルシフェラーゼを発現するように安定的に形質導入した。NTまたはTFP T細胞との48時間の共培養後に、共培養細胞のルシフェラーゼ活性を、生腫瘍細胞のマーカーとしてBright−Glo(商標)Luciferase Assay System(Promega(登録商標)、カタログ番号E2610)を用いて決定した。次いで、腫瘍細胞の殺傷率(%)を次式で算出した:細胞傷害性(%)=100%×[1−RLU(腫瘍細胞+T細胞)/RLU(腫瘍細胞)]。
単一特異性及び二重特異性TFP T細胞による標的特異的な腫瘍細胞殺傷を、実施例14に従って調製した初代ヒトT細胞を使用して、in vitroでの細胞傷害性アッセイを使用して評価した。標的を発現しない(DN)、MSLNを発現する(MSLN+)、MUC16を発現する(MUC16+)、またはMSLNとMUC16を両方発現する(DP)腫瘍細胞株(実施例13に記載する通り)を、レポーターとしてホタルルシフェラーゼを発現するように安定的に形質導入した。NTまたはTFP T細胞との48時間の共培養後に、共培養細胞のルシフェラーゼ活性を、生腫瘍細胞のマーカーとしてBright−Glo(商標)Luciferase Assay System(Promega(登録商標)、カタログ番号E2610)を用いて決定した。次いで、腫瘍細胞の殺傷率(%)を次式で算出した:細胞傷害性(%)=100%×[1−RLU(腫瘍細胞+T細胞)/RLU(腫瘍細胞)]。
予想した通りに、NT T細胞は、標的細胞のいずれに対しても検出可能な殺傷を示さなかった(図6)。単一特異性TFP T細胞は、マッチした標的を発現する標的細胞のみを殺傷した。MSLN TFP T細胞は、MSLN+標的細胞またはDP標的細胞を劇的に殺傷したが、DNまたはMUC16+標的細胞を殺傷しなかった。MUC16 TFP T細胞は、MUC16+標的細胞またはDP標的細胞を完全に殺傷したが、DNまたはMSLN+標的細胞を殺傷しなかった。二重特異性TFP T細胞は、標的、MSLNのみ(MSLN+)、MUC16のみ(MUC16+)、または両方の標的(DP)のいずれかを発現する標的細胞を有意に殺傷し、両方の単一特異性TFP T細胞より広い範囲の反応性を実証した(図6)。標的を発現しない標的細胞(DN)に対して殺傷しないことから、二重特異性TFP T細胞の特異性が確認される。
実施例17:二重特異性TFP T細胞による標的特異的なサイトカイン産生
前述の実施例に記載する方法によって、初代ヒトT細胞を調製し、形質導入した。単一特異性TFP T細胞及び二重特異性TFP T細胞による、IFN−γ、GM−CSF、及びTNF−αを含めた標的特異的なサイトカイン産生を、T細胞と様々なK562ベースの標的細胞との共培養から48時間後に採集した上清から、U−PLEX(登録商標)Biomarker Group I(hu)Assays(Meso Scale Diagnostics(登録商標),LLC、カタログ番号:K15067L−4)を使用して測定した。
前述の実施例に記載する方法によって、初代ヒトT細胞を調製し、形質導入した。単一特異性TFP T細胞及び二重特異性TFP T細胞による、IFN−γ、GM−CSF、及びTNF−αを含めた標的特異的なサイトカイン産生を、T細胞と様々なK562ベースの標的細胞との共培養から48時間後に採集した上清から、U−PLEX(登録商標)Biomarker Group I(hu)Assays(Meso Scale Diagnostics(登録商標),LLC、カタログ番号:K15067L−4)を使用して測定した。
すべてのTFP T細胞は、マッチする標的を発現する腫瘍細胞と共培養したときに、有意な量のIFN−γを産生した(図7A)。MUC16+標的細胞と培養したMSLN TFP T細胞、またはMSLN+標的細胞と培養したMUC16 TFP T細胞では、マッチしない標的発現を有する腫瘍細胞に対する殺傷及びそれらの特異性の欠如と一致して、サイトカイン産生は観察されなかった。二重特異性TFP T細胞では、それとは逆に、MSLN+、MUC16+、またはDP標的細胞との共培養後に有意なIFN−γの産生が観察された単一特異性TFP T細胞のいずれかよりも、広い反応性が観察された(図7A)。
GM−CSF(図7B)及びTNF−α(図7C)の顕著な産生が、単一特異性TFP T細胞及び二重特異性 TFP T細胞で観察され、腫瘍細胞に対して同様の反応性パターンを有していた。MSLN TFP及びMUC16 TFP T細胞は、マッチした標的腫瘍細胞と共培養したときのみサイトカインを産生したが、マッチしない標的細胞と共培養したときは産生しなかった。二重特異性TFP T細胞は、一方または両方の標的を発現する標的細胞に応答した。
実施例18:臨床試験
再発性または難治性疾患を有する切除不能な卵巣癌を有する患者を、MSLN−MUC16−TFPを発現するT細胞の臨床試験に登録する。初期試験では、MSLN−MUC16−TFPを発現するT細胞の安全性プロファイルを調査し、また細胞動力学及び薬力学の成果を調査する。これらの結果から、さらなる試験のための投与量の選択に関する情報を入手し、さらなる試験では、次に、切除不能な卵巣癌を有する患者のより大きいコホートに投与して、MSLN−MUC16−TFPを発現するT細胞の効力プロファイルを定める。
再発性または難治性疾患を有する切除不能な卵巣癌を有する患者を、MSLN−MUC16−TFPを発現するT細胞の臨床試験に登録する。初期試験では、MSLN−MUC16−TFPを発現するT細胞の安全性プロファイルを調査し、また細胞動力学及び薬力学の成果を調査する。これらの結果から、さらなる試験のための投与量の選択に関する情報を入手し、さらなる試験では、次に、切除不能な卵巣癌を有する患者のより大きいコホートに投与して、MSLN−MUC16−TFPを発現するT細胞の効力プロファイルを定める。
実施例19:フローサイトメトリーによるCD107aの露出
T細胞活性化に関するさらなるアッセイは、休止細胞内の細胞質細胞溶解性顆粒の膜に位置するリソソーム膜タンパク質(LAMP−1)である、CD107aの表面発現である。細胞溶解活性の前提条件であるエフェクターT細胞の脱顆粒は、活性化により誘導される顆粒エキソサイトーシスに続いて、CD107aの細胞表面への動員をもたらす。よって、CD107aの露出は、サイトカイン産生に加えて、細胞傷害性と密接に相関するT細胞活性化のさらなる尺度となる。
T細胞活性化に関するさらなるアッセイは、休止細胞内の細胞質細胞溶解性顆粒の膜に位置するリソソーム膜タンパク質(LAMP−1)である、CD107aの表面発現である。細胞溶解活性の前提条件であるエフェクターT細胞の脱顆粒は、活性化により誘導される顆粒エキソサイトーシスに続いて、CD107aの細胞表面への動員をもたらす。よって、CD107aの露出は、サイトカイン産生に加えて、細胞傷害性と密接に相関するT細胞活性化のさらなる尺度となる。
標的及びエフェクター細胞を別々に洗浄し、細胞傷害性培地(RPMI+5%ヒトAB血清+1%抗生物質抗真菌剤)中に再懸濁させる。このアッセイは、U底96ウェルプレート(Corning)内の100μLの最終体積中、0.5μL/ウェルのPE/Cy7標識抗ヒトCD107a(LAMP−1)抗体(Clone−H4A3、BD(登録商標)Biosciences)の存在下で、2×105個のエフェクター細胞を2×105個の標的細胞と合わせることによって実施する。次いで、培養物を1時間37℃、5%CO2でインキュベートする。このインキュベーションの直後に、10μLの1:10希釈の分泌阻害剤モネンシン(1000×溶液、BD GolgiStop(商標))を、細胞を乱さないように各ウェルに注意深く添加する。次いで、プレートをさらに2.5時間37℃、5%CO2でインキュベートする。このインキュベーションに続いて、細胞をAPC抗ヒトCD3抗体(Clone−UCHT1、BD Biosciences)、PerCP/Cy5.5抗ヒトCD8抗体(Clone−SK1、BD Biosciences)、及びPacific Blue抗ヒトCD4抗体(Clone−RPA−T4、BD Biosciences)で染色し、次いで30分間37℃、5%CO2でインキュベートする。次いで、細胞をFACS緩衝液で2回洗浄し、100μLのFACS緩衝液及び100μLのIC固定緩衝液中に再懸濁させ、その後解析する。
T細胞の表面上のCD107aの露出をフローサイトメトリーによって検出する。フローサイトメトリーは、LSRFortessa(登録商標)X20(BD Biosciences)で実施し、フローサイトメトリーのデータの解析は、FlowJo(登録商標)ソフトウェア(Treestar,Inc.Ashland,OR)を使用して実施する。CD107+veであるCD3ゲート内のCD8+エフェクター細胞の割合(%)を、各エフェクター/標的細胞培養物について決定する。
前述の細胞傷害性及びサイトカインデータと一致して、腫瘍関連抗原を発現する標的細胞と、抗腫瘍関連抗原−28ζ CARを形質導入したエフェクターT細胞とを共培養すると、腫瘍関連抗原陰性標的細胞とインキュベートしたエフェクターと比較して、CD107a表面発現の増加を誘導し得る。同じ条件下で比較すると、抗腫瘍関連抗原−CD3ε LLまたは抗腫瘍関連抗原−CD3γ LL TFPを発現するエフェクターは、5〜7倍のCD107a発現の誘導を提示し得る。代替ヒンジ領域で構築された抗腫瘍関連抗原TFPは、腫瘍関連抗原を有する標的細胞と共培養したときに、同様の結果を生み出し得る。
実施例20:in vivoでのマウスの効力試験
抗腫瘍関連抗原TFPを形質導入したエフェクターT細胞が、in vivoで抗腫瘍応答を実現する能力を査定するために、抗腫瘍関連抗原−28ζ CAR、抗腫瘍関連抗原−CD3ε TFP、または抗腫瘍関連抗原−CD3γ TFPのいずれかを形質導入したエフェクターT細胞を、腫瘍関連抗原+ヒトがん細胞株を予め接種したNOD/SCID/IL−2Rγ−/−(NSG−JAX)マウスに養子移入する。
抗腫瘍関連抗原TFPを形質導入したエフェクターT細胞が、in vivoで抗腫瘍応答を実現する能力を査定するために、抗腫瘍関連抗原−28ζ CAR、抗腫瘍関連抗原−CD3ε TFP、または抗腫瘍関連抗原−CD3γ TFPのいずれかを形質導入したエフェクターT細胞を、腫瘍関連抗原+ヒトがん細胞株を予め接種したNOD/SCID/IL−2Rγ−/−(NSG−JAX)マウスに養子移入する。
試験の開始前に少なくとも6週齢である雌のNOD/SCID/IL−2Rγ−/−(NSG−JAX)マウスをThe Jackson Laboratory(ストック番号005557)から入手し、実験で使用する前に3日間順化させる。接種用のヒト腫瘍関連抗原発現細胞株は、対数期培養に維持し、その後採集し、トリパンブルーで計数して生細胞数を決定する。腫瘍接種の当日に、細胞を300gで5分間遠心分離し、予め温めておいた滅菌PBS中に、0.5〜1×106細胞/100μLのいずれかで再懸濁させる。非形質導入、または抗腫瘍関連抗原−28ζ CAR、抗腫瘍関連抗原−CD3ε TFP、もしくは抗CD3γ TFP構築物を形質導入した、いずれかのT細胞を、養子移入用に調製する。試験の0日目に、実験群当たり10匹の動物に、0.5〜1×106個の腫瘍関連抗原発現細胞を静脈内接種する。3日後に、100μLの滅菌PBS中の5×106個のエフェクターT細胞集団を各動物に静脈内移入する。動物についての詳細な臨床所見を安楽死まで毎日記録する。すべての動物について死亡または安楽死まで体重測定を毎週行う。試験及び対照物質の養子移入から35日後にすべての動物を安楽死させる。試験中に瀕死状態を呈するすべての動物は、獣医師と相談した上で、試験責任者の判断で安楽死させる。
非形質導入T細胞と比較して、抗腫瘍関連抗原−28ζ CAR、抗腫瘍関連抗原−CD3ε TFP、または抗腫瘍関連抗原−CD3γ TFPのいずれかを形質導入したT細胞の養子移入は、メソテリン発現細胞株腫瘍を有するマウスの生存を延ばすことができ、また、抗腫瘍関連抗原CAR及びTFPを形質導入したT細胞が両方とも、これらのマウスモデルで標的細胞の殺傷を媒介することができ、それに伴って生存を延ばすことができることを示すことができる。総括すると、これらのデータから、TFPが、in vitro及びin vivoの両方で第一世代のCARに優る抗原特異的殺傷を実証する、キメラ受容体操作に取って代わるプラットフォームになることを示すことができる。
文末脚注
本明細書で本発明の好ましい実施形態を示し、説明してきたが、そのような実施形態が単なる例として提供されているに過ぎないことが当業者には明らかであろう。当業者であれば、本発明から逸脱することなく多数の変形、変更、及び置換をここから想起するであろう。本発明を実施する際に、本明細書に記載する本発明の実施形態の様々な代替形態を用いることができることが理解されるべきである。添付する特許請求の範囲が本発明の範囲を規定するものであり、これらの特許請求の範囲内の方法及び構造ならびにそれらの等価物が本発明の範囲に包含されることが意図される。
本明細書で本発明の好ましい実施形態を示し、説明してきたが、そのような実施形態が単なる例として提供されているに過ぎないことが当業者には明らかであろう。当業者であれば、本発明から逸脱することなく多数の変形、変更、及び置換をここから想起するであろう。本発明を実施する際に、本明細書に記載する本発明の実施形態の様々な代替形態を用いることができることが理解されるべきである。添付する特許請求の範囲が本発明の範囲を規定するものであり、これらの特許請求の範囲内の方法及び構造ならびにそれらの等価物が本発明の範囲に包含されることが意図される。
Claims (93)
- (I)第1のT細胞受容体(TCR)融合タンパク質(TFP)をコードする第1の組み換え核酸配列であって、前記第1のTFPが、
(a)(i)TCR細胞外ドメインの少なくとも一部分と、
(ii)膜貫通ドメインと、
(iii)TCRアルファ鎖、TCRベータ鎖、TCRガンマ鎖、TCRデルタ鎖、CD3ガンマ鎖、CD3デルタ鎖、及びCD3イプシロン鎖からなる群から選択されるTCRサブユニットのみに由来する細胞内シグナル伝達ドメインからの刺激ドメインを含む、TCR細胞内ドメインと
を含むTCRサブユニット;及び
(b)抗MUC16結合ドメインを含む、マウス、ヒト、またはヒト化抗体ドメイン
を含み、
前記TCRサブユニットと前記抗MUC16結合ドメインとが作動可能に連結され、
T細胞に発現したときに、前記第1のTFPが、TCRと機能的に相互作用するか、またはTCRに組み込まれている、
前記第1の組み換え核酸配列;ならびに
(II)第2のTFPをコードする第2の組み換え核酸配列であって、前記第2のTFPが、
(a)(i)TCR細胞外ドメインの少なくとも一部分と、
(ii)膜貫通ドメインと、
(iii)TCRアルファ鎖、TCRベータ鎖、TCRガンマ鎖、TCRデルタ鎖、CD3ガンマ鎖、CD3デルタ鎖、及びCD3イプシロン鎖からなる群から選択されるTCRサブユニットのみに由来する細胞内シグナル伝達ドメインからの刺激ドメインを含む、TCR細胞内ドメインと
を含むTCRサブユニット;及び
(b)抗メソテリン(MSLN)結合ドメインを含む、マウス、ヒト、またはヒト化抗体ドメイン
を含み、
前記TCRサブユニットと前記抗MSLN結合ドメインとが作動可能に連結され、
T細胞に発現したときに、前記第2のTFPが、TCRと機能的に相互作用するか、またはTCRに組み込まれている、
前記第2の組み換え核酸配列
を含む、組成物。 - (I)第1のT細胞受容体(TCR)融合タンパク質(TFP)をコードする第1の組み換え核酸配列であって、前記第1のTFPが、
(a)(i)TCR細胞外ドメインの少なくとも一部分と、
(ii)膜貫通ドメインと、
(iii)TCRアルファ鎖、TCRベータ鎖、TCRガンマ鎖、TCRデルタ鎖、CD3ガンマ鎖、CD3デルタ鎖、及びCD3イプシロン鎖からなる群から選択されるTCRサブユニットのみに由来する細胞内シグナル伝達ドメインからの刺激ドメインを含む、TCR細胞内ドメインと
を含むTCRサブユニット;及び
(b)抗MUC16結合ドメインを含む第1のヒトまたはヒト化抗体ドメインと、抗MSLN結合ドメインを含む第2のヒトまたはヒト化抗体ドメインと;
を含み、
前記TCRサブユニットと、前記第1の抗体ドメインと、前記第2の抗体ドメインとが作動可能に連結され、
T細胞に発現したときに、前記第1のTFPが、TCRと機能的に相互作用するか、またはTCRに組み込まれている、
前記第1の組み換え核酸配列
を含む、組成物。 - (a)TCRサブユニット、抗MUC16結合ドメインである第1の抗原結合ドメインを含む第1のヒトまたはヒト化抗体ドメインを含む、第1のT細胞受容体(TCR)融合タンパク質(TFP);及び
(b)TCRサブユニット、抗MSLN結合ドメインである第2の抗原結合ドメインを含む第2のヒトまたはヒト化抗体ドメインを含む、第2のT細胞受容体(TCR)融合タンパク質(TFP)
をコードする組み換え核酸分子を含み、
前記第1のTFPのTCRサブユニットと前記第1の抗体ドメインとが作動可能に連結され、前記第2のTFPのTCRサブユニットと前記第2の抗体ドメインとが作動可能に連結される、
組成物。 - (a)TCRサブユニットと、抗MUC16結合ドメインである第1の抗原結合ドメインを含む第1のヒトまたはヒト化抗体ドメインと、抗MSLN結合ドメインである第2の抗原結合ドメインを含む第2のヒトまたはヒト化抗体ドメインとを含む、第1のT細胞受容体(TCR)融合タンパク質(TFP)
をコードする組み換え核酸分子を含み、
前記第1のTFPのTCRサブユニットと、前記第1の抗体ドメインと、前記第2の抗体ドメインとが作動可能に連結される、
組成物。 - 前記第1のTFPのTCRサブユニットの細胞外、膜貫通、及び細胞内シグナル伝達ドメインが、TCRアルファ鎖、TCRベータ鎖、CD3ガンマ鎖、CD3デルタ鎖、及びCD3イプシロン鎖からなる群から選択されるTCRサブユニットのみに由来する、請求項1〜4のいずれか1項に記載の組成物。
- 前記第2のTFPのTCRサブユニットの細胞外、膜貫通、及び細胞内シグナル伝達ドメインが、TCRアルファ鎖、TCRベータ鎖、TCRガンマ鎖、TCRデルタ鎖、及びTCRイプシロン鎖からなる群から選択されるTCRサブユニットのみに由来する、請求項1〜5のいずれか1項に記載の組成物。
- 前記第1のTFPのTCRサブユニットの細胞外、膜貫通、及び細胞内シグナル伝達ドメインが、TCRアルファ鎖のみに由来する、請求項5または6に記載の組成物。
- 前記第1のTFPのTCRサブユニットの細胞外、膜貫通、及び細胞内シグナル伝達ドメインが、TCRベータ鎖のみに由来する、請求項5または6に記載の組成物。
- 前記第1のTFPのTCRサブユニットの細胞外、膜貫通、及び細胞内シグナル伝達ドメインが、CD3ガンマ鎖のみに由来する、請求項5または6に記載の組成物。
- 前記第1のTFPのTCRサブユニットの細胞外、膜貫通、及び細胞内シグナル伝達ドメインが、CD3デルタ鎖のみに由来する、請求項5または6に記載の組成物。
- 前記第1のTFPのTCRサブユニットの細胞外、膜貫通、及び細胞内シグナル伝達ドメインが、CD3イプシロン鎖のみに由来する、請求項5または6に記載の組成物。
- 前記第2のTFPのTCRサブユニットの細胞外、膜貫通、及び細胞内シグナル伝達ドメインが、TCRアルファ鎖のみに由来する、請求項5〜11のいずれか1項に記載の組成物。
- 前記第2のTFPのTCRサブユニットの細胞外、膜貫通、及び細胞内シグナル伝達ドメインが、TCRベータ鎖のみに由来する、請求項5〜11のいずれか1項に記載の組成物。
- 前記第2のTFPのTCRサブユニットの細胞外、膜貫通、及び細胞内シグナル伝達ドメインが、CD3ガンマ鎖のみに由来する、請求項5〜11のいずれか1項に記載の組成物。
- 前記第2のTFPのTCRサブユニットの細胞外、膜貫通、及び細胞内シグナル伝達ドメインが、CD3デルタ鎖のみに由来する、請求項5〜11のいずれか1項に記載の組成物。
- 前記第2のTFPのTCRサブユニットの細胞外、膜貫通、及び細胞内シグナル伝達ドメインが、CD3イプシロン鎖のみに由来する、請求項5〜11のいずれか1項に記載の組成物。
- 前記第2のTFPのTCRサブユニットの細胞外、膜貫通、及び細胞内シグナル伝達ドメインが、TCRガンマ鎖のみに由来する、請求項5〜11のいずれか1項に記載の組成物。
- 前記第2のTFPのTCRサブユニットの細胞外、膜貫通、及び細胞内シグナル伝達ドメインが、TCRデルタ鎖のみに由来する、請求項5〜11のいずれか1項に記載の組成物。
- 前記第1のTFP、前記第2のTFP、または両方が、T細胞に発現したときに、TCRに組み込まれているか、またはTCRと機能的に相互作用する、請求項3〜16のいずれか1項に記載の組成物。
- 前記第1のTFP、前記第2のTFP、または両方が、T細胞に発現したときに、TCRに組み込まれているか、またはTCRと機能的に相互作用する、請求項3〜19のいずれか1項に記載の組成物。
- コードされる第1の抗原結合ドメインが、第1のリンカー配列によって前記第1のTFPのTCR細胞外ドメインに接続され、コードされる第2の抗原結合ドメインが、第2のリンカー配列によって前記第2のTFPのTCR細胞外ドメインに接続され、または、前記第1の抗原結合ドメインが、前記第1のリンカー配列によって前記第1のTFPのTCR細胞外ドメインに接続され、かつ前記コードされる第2の抗原結合ドメインが、前記第2のリンカー配列によって前記第2のTFPのTCR細胞外ドメインに接続される、請求項1〜20のいずれか1項に記載の組成物。
- 前記第1のリンカー配列及び前記第2のリンカー配列が、(G4S)n(式中、n=1〜4)を含む、請求項21に記載の組成物。
- 前記第1のTFPのTCRサブユニット、前記第2のTFPのTCRサブユニット、または両方が、TCR細胞外ドメインを含む、請求項1〜22のいずれか1項に記載の組成物。
- 前記第1のTFPのTCRサブユニット、前記第2のTFPのTCRサブユニット、または両方が、TCR膜貫通ドメインを含む、請求項1〜23のいずれか1項に記載の組成物。
- 前記第1のTFPのTCRサブユニット、前記第2のTFPのTCRサブユニット、または両方が、TCR細胞内ドメインを含む、請求項1〜24のいずれか1項に記載の組成物。
- 前記第1のTFPのTCRサブユニット、前記第2のTFPのTCRサブユニット、または両方が、(i)TCR細胞外ドメイン、(ii)TCR膜貫通ドメイン、及び(iii)TCR細胞内ドメインを含み、(i)、(ii)、及び(iii)のうちの少なくとも2つが、同じTCRサブユニットに由来する、請求項1〜25のいずれか1項に記載の組成物。
- 前記第1のTFPのTCRサブユニット、前記第2のTFPのTCRサブユニット、または両方が、CD3イプシロン、CD3ガンマ、もしくはCD3デルタの細胞内シグナル伝達ドメイン、またはそれらに対する少なくとも1つの改変を有するアミノ酸配列から選択される刺激ドメインを含むTCR細胞内ドメインを含む、請求項1〜26のいずれか1項に記載の組成物。
- 前記第1のTFPのTCRサブユニット、前記第2のTFPのTCRサブユニット、または両方が、4−1BBの機能的シグナル伝達ドメイン及び/またはCD3ゼータの機能的シグナル伝達ドメイン、またはそれらに対する少なくとも1つの改変を有するアミノ酸配列から選択される刺激ドメインを含む細胞内ドメインを含む、請求項1〜27のいずれか1項に記載の組成物。
- 前記第1のヒトまたはヒト化抗体ドメイン、前記第2のヒトまたはヒト化抗体ドメイン、または両方が、抗体断片を含む、請求項1〜28のいずれか1項に記載の組成物。
- 前記第1のヒトまたはヒト化抗体ドメイン、前記第2のヒトまたはヒト化抗体ドメイン、または両方が、scFvまたはVHドメインを含む、請求項1〜29のいずれか1項に記載の組成物。
- (i)表2の軽鎖配列に対して70〜100%の配列同一性を有する軽鎖結合ドメインアミノ酸配列の軽鎖(LC)CDR1、LC CDR2、及びLC CDR3、及び/または(ii)表2の重鎖配列の重鎖(HC)CDR1、HC CDR2、及びHC CDR3をコードする、請求項1〜30のいずれか1項に記載の組成物。
- 軽鎖可変領域をコードする、請求項1〜31のいずれか1項に記載の組成物であって、前記軽鎖可変領域が、表2の軽鎖可変領域アミノ酸配列の少なくとも1つであるが30以下の改変を有するアミノ酸配列、または表2の軽鎖可変領域アミノ酸配列に対して95〜99%の同一性を有する配列を含む、前記組成物。
- 重鎖可変領域をコードする、請求項1〜32のいずれか1項に記載の組成物であって、前記重鎖可変領域が、表2の重鎖可変領域アミノ酸配列の少なくとも1つであるが30以下の改変を有するアミノ酸配列、または表2の重鎖可変領域アミノ酸配列に対して95〜99%の同一性を有する配列を含む、前記組成物。
- コードされる第1のTFP、コードされる第2のTFP、または両方が、TCRアルファ鎖、TCRベータ鎖、CD3イプシロンTCRサブユニット、CD3ガンマTCRサブユニット、CD3デルタTCRサブユニット、それらの機能的断片、及び少なくとも1つであるが20以下の改変を有するそれらのアミノ酸配列からなる群から選択されるタンパク質の細胞外ドメインまたはその一部分を含む、TCRサブユニットの細胞外ドメインを含む、請求項1〜33のいずれか1項に記載の組成物。
- 前記コードされる第1のTFP及び前記コードされる第2のTFPが、TCRアルファ鎖、TCRベータ鎖、CD3イプシロンTCRサブユニット、CD3ガンマTCRサブユニット、CD3デルタTCRサブユニット、それらの機能的断片、及び少なくとも1つであるが20以下の改変を有するそれらのアミノ酸配列からなる群から選択されるタンパク質の膜貫通ドメインを含む、膜貫通ドメインを含む、請求項1〜34のいずれか1項に記載の組成物。
- 前記コードされる第1のTFP及び前記コードされる第2のTFPが、TCRアルファ鎖、TCRベータ鎖、TCRゼータ鎖、CD3イプシロンTCRサブユニット、CD3ガンマTCRサブユニット、CD3デルタTCRサブユニット、CD45、CD4、CD5、CD8、CD9、CD16、CD22、CD33、CD28、CD37、CD64、CD80、CD86、CD134、CD137、CD154、それらの機能的断片、及び少なくとも1つであるが20以下の改変を有するそれらのアミノ酸配列からなる群から選択されるタンパク質の膜貫通ドメインを含む、膜貫通ドメインを含む、請求項1〜35のいずれか1項に記載の組成物。
- 共刺激ドメインをコードする配列をさらに含む、請求項1〜36のいずれか1項に記載の組成物。
- 前記共刺激ドメインが、OX40、CD2、CD27、CD28、CDS、ICAM−1、LFA−1(CD11a/CD18)、ICOS(CD278)、及び4−1BB(CD137)、ならびにそれらに対する少なくとも1つであるが20以下の改変を有するそれらのアミノ酸配列からなる群から選択されるタンパク質から得られる機能的シグナル伝達ドメインである、請求項37に記載の組成物。
- 細胞内シグナル伝達ドメインをコードする配列をさらに含む、請求項1〜38のいずれか1項に記載の組成物。
- リーダー配列をさらに含む、請求項1〜39のいずれか1項に記載の組成物。
- プロテアーゼ切断部位をさらに含む、請求項1〜40のいずれか1項に記載の組成物。
- 前記それらに対する少なくとも1つであるが20以下の改変が、細胞のシグナル伝達を媒介するアミノ酸の改変、または前記第1のTFP、前記第2のTFP、もしくは両方へのリガンド結合に応答してリン酸化されるアミノ酸の改変を含む、請求項1〜41のいずれか1項に記載の組成物。
- 前記単離された核酸分子がmRNAである、請求項1〜42のいずれか1項に記載の組成物。
- 前記第1のTFP、前記第2のTFP、または両方が、CD3ゼータTCRサブユニット、CD3イプシロンTCRサブユニット、CD3ガンマTCRサブユニット、CD3デルタTCRサブユニット、TCRゼータ鎖、Fcイプシロン受容体1鎖、Fcイプシロン受容体2鎖、Fcガンマ受容体1鎖、Fcガンマ受容体2a鎖、Fcガンマ受容体2b1鎖、Fcガンマ受容体2b2鎖、Fcガンマ受容体3a鎖、Fcガンマ受容体3b鎖、Fcベータ受容体1鎖、TYROBP(DAP12)、CD5、CD16a、CD16b、CD22、CD23、CD32、CD64、CD79a、CD79b、CD89、CD278、CD66d、それらの機能的断片、及びそれらに対する少なくとも1つであるが20以下の改変を有するそれらのアミノ酸配列からなる群から選択されるタンパク質の免疫受容活性化チロシンモチーフ(ITAM)またはその一部分を含む、TCRサブユニットのITAMを含む、請求項1〜43のいずれか1項に記載の組成物。
- 前記ITAMが、CD3ガンマ、CD3デルタ、またはCD3イプシロンのITAMと置きかわる、請求項44に記載の組成物。
- 前記ITAMが、CD3ゼータTCRサブユニット、CD3イプシロンTCRサブユニット、CD3ガンマTCRサブユニット、及びCD3デルタTCRサブユニットからなる群から選択され、CD3ゼータTCRサブユニット、CD3イプシロンTCRサブユニット、CD3ガンマTCRサブユニット、及びCD3デルタTCRサブユニットからなる群から選択される異なるITAMと置きかわる、請求項44に記載の組成物。
- リーダー配列をさらに含む、請求項1〜46のいずれか1項に記載の単離された核酸分子。
- 請求項1〜47のいずれか1項に記載の組成物の前記核酸分子によってコードされるポリペプチド分子を含む、組成物。
- 前記ポリペプチドが、第1の核酸分子によってコードされる第1のポリペプチドと、第2の核酸分子によってコードされる第2のポリペプチドとを含む、請求項48に記載の組成物。
- 請求項1〜47のいずれか1項に記載の組成物の核酸分子によってコードされる組み換えTFP分子を含む、組成物。
- 請求項48〜50のいずれか1項に記載のポリペプチドまたは組み換えTFP分子をコードする核酸分子を含むベクターを含む、組成物。
- 前記ベクターが、a)第1のTFPをコードする第1の核酸分子を含む第1のベクターと、b)第2のTFPをコードする第2の核酸分子を含む第2のベクターとを含む、請求項51に記載の組成物。
- 前記ベクターが、DNA、RNA、プラスミド、レンチウイルスベクター、アデノウイルスベクター、ラウス肉腫ウイルス(RSV)ベクター、またはレトロウイルスベクターからなる群から選択される、請求項51または52に記載の組成物。
- プロモーターをさらに含む、請求項51〜53のいずれか1項に記載の組成物。
- 前記ベクターが、in vitro転写ベクターである、請求項51〜54のいずれか1項に記載の組成物。
- 前記ベクター内の前記核酸分子が、ポリ(A)テールをさらにコードする、請求項51〜55のいずれか1項に記載の組成物。
- 前記ベクター内の前記核酸分子が、3’UTRをさらにコードする、請求項51〜56のいずれか1項に記載の組成物。
- 前記ベクター内の前記核酸分子が、プロテアーゼ切断部位をさらにコードする、請求項51〜57のいずれか1項に記載の組成物。
- 請求項1〜58のいずれか1項に記載の組成物を含む細胞を含む、組成物。
- 前記細胞が、ヒトT細胞である、請求項59に記載の組成物。
- 前記T細胞が、CD8+またはCD4+T細胞である、請求項60に記載の組成物。
- 細胞内シグナル伝達ドメインからの正のシグナルを含む第2のポリペプチドと会合した、抑制分子の少なくとも一部分を含む第1のポリペプチドを含む抑制分子をコードする核酸をさらに含む、請求項59〜61のいずれか1項に記載の組成物。
- 前記抑制分子が、PD1の少なくとも一部分を含む第1のポリペプチドと、共刺激ドメイン及び一次シグナル伝達ドメインを含む第2のポリペプチドとを含む、請求項62に記載の組成物。
- 請求項1〜63のいずれか1項に記載の組み換え核酸配列を含む、ベクター。
- 請求項1または請求項2に記載の第1の組み換え核酸配列を含む、ベクター。
- 請求項1または請求項2に記載の第2の組み換え核酸配列を含む、ベクター。
- 請求項1〜63のいずれか1項に記載の組成物または請求項64〜66のいずれか1項に記載のベクターを含む、細胞。
- 請求項65に記載のベクターを含む、細胞。
- 請求項66に記載のベクターを含む、細胞。
- 前記細胞が、ヒトT細胞である、請求項67〜69のいずれか1項に記載の細胞。
- 前記T細胞が、CD8+またはCD4+T細胞である、請求項70に記載の細胞。
- 細胞内シグナル伝達ドメインからの正のシグナルを含む第2のポリペプチドと会合した、抑制分子の少なくとも一部分を含む第1のポリペプチドを含む抑制分子をコードする核酸をさらに含む、請求項67〜71のいずれか1項に記載の細胞。
- 前記抑制分子が、PD1の少なくとも一部分を含む第1のポリペプチドと、共刺激ドメイン及び一次シグナル伝達ドメインを含む第2のポリペプチドとを含む、請求項72に記載の細胞。
- 少なくとも2つのTFP分子を含むヒトCD8+またはCD4+T細胞であって、前記TFP分子が、抗MUC16結合ドメイン、抗MSLN結合ドメイン、TCR細胞外ドメイン、膜貫通ドメイン、及び細胞内ドメインを含み、前記TFP分子が、前記ヒトCD8+またはCD4+T細胞内で、前記細胞で、及び/または前記細胞の表面上で、内因性TCR複合体及び/または少なくとも1つの内因性TCRポリペプチドと機能的に相互作用することができる、前記ヒトCD8+またはCD4+T細胞。
- i)抗MUC16結合ドメイン、TCR細胞外ドメイン、膜貫通ドメイン、及び細胞内ドメインを含む第1のTFP分子と;
ii)抗MSLN結合ドメイン、TCR細胞外ドメイン、膜貫通ドメイン、及び細胞内ドメインを含む第2のTFP分子と;
iii)少なくとも1つの内因性TCRサブユニットまたは内因性TCR複合体と
を含む、タンパク質複合体。 - i)抗MUC16結合ドメイン、TCR細胞外ドメイン、膜貫通ドメイン、及び細胞内ドメインを含むTFP分子と;
ii)少なくとも1つの内因性TCRサブユニットまたは内因性TCR複合体と
を含む、タンパク質複合体。 - i)抗MSLN結合ドメイン、TCR細胞外ドメイン、膜貫通ドメイン、及び細胞内ドメインを含むTFP分子と;
ii)少なくとも1つの内因性TCRサブユニットまたは内因性TCR複合体と
を含む、タンパク質複合体。 - 前記TCRが、TCRアルファ鎖、TCRベータ鎖、CD3イプシロンTCRサブユニット、CD3ガンマTCRサブユニット、及びCD3デルタTCRサブユニットからなる群から選択されるタンパク質の細胞外ドメインまたはその一部分を含む、請求項75〜77のいずれか1項に記載のタンパク質複合体。
- 前記抗MUC16結合ドメイン、前記抗MSLN結合ドメイン、または両方が、リンカー配列によって前記TCR細胞外ドメインに接続される、請求項76〜78のいずれか1項に記載のタンパク質複合体。
- 前記リンカー領域が、(G4S)n(式中、n=1〜4)を含む、請求項79に記載のタンパク質複合体。
- 請求項75〜79のいずれか1項に記載のタンパク質複合体1つ当たりに少なくとも2つの異なるTFPタンパク質を含む、ヒトCD8+またはCD4+T細胞。
- 請求項1〜63のいずれか1項に記載の単離された核酸分子によってコードされる少なくとも2つの異なるTFP分子を含む、ヒトCD8+またはCD4+T細胞。
- ヒトCD8+またはCD4+T細胞の集団であって、前記集団のT細胞が、個々にまたは集合的に少なくとも2つのTFP分子を含み、前記TFP分子が、抗MUC16結合ドメインまたは抗MSLN結合ドメインまたは抗MUC16と抗MSLN結合ドメインの両方、TCR細胞外ドメイン、膜貫通ドメイン、及び細胞内ドメインを含み、前記TFP分子が、前記ヒトCD8+またはCD4+T細胞の細胞内で、前記細胞で、及び/または前記細胞の表面上で、内因性TCR複合体及び/または少なくとも1つの内因性TCRポリペプチドと機能的に相互作用することができる、前記ヒトCD8+またはCD4+T細胞の集団。
- ヒトCD8+またはCD4+T細胞の集団であって、前記集団のT細胞が、請求項1〜63のいずれか1項に記載の組み換え核酸分子によってコードされる少なくとも2つのTFP分子を個々にまたは集合的に含む、前記ヒトCD8+またはCD4+T細胞の集団。
- 有効量の請求項1〜63のいずれか1項に記載の組成物、請求項64〜66のいずれか1項に記載のベクター、請求項67〜69のいずれか1項に記載の細胞、または請求項75〜80のいずれか1項に記載のタンパク質複合体と、医薬として許容される賦形剤とを含む、医薬組成物。
- 有効量の請求項68に記載の細胞と、有効量の請求項69に記載の細胞と、医薬として許容される賦形剤とを含む、医薬組成物。
- MSLNまたはMUC16の発現に関連する疾患を有する哺乳動物を治療する方法であって、前記哺乳動物に有効量の請求項1〜63のいずれか1項に記載の組成物を投与することを含む、前記方法。
- 前記MUC16またはMSLNの発現に関連する疾患が、増殖性疾患、がん、悪性腫瘍、骨髄形成異常、骨髄異形成症候群、前白血病、MUC16の発現に関連する非がん関連適応症、MSLNの発現に関連する非がん関連適応症、乳癌、前立腺癌、卵巣癌、子宮頚癌、皮膚癌、膵癌、結腸直腸癌、腎癌、肝臓癌、脳癌、リンパ腫、白血病、肺癌、食道癌、胃癌、及び再発性または難治性疾患を有する切除不能な卵巣癌からなる群から選択される、請求項87に記載の方法。
- 前記疾患が、B細胞急性リンパ性白血病(B−ALL)、T細胞急性リンパ性白血病(T−ALL)、急性リンパ芽球性白血病(ALL);慢性骨髄性白血病(CML)、慢性リンパ球性白血病(CLL)、B細胞前リンパ性白血病、芽球性形質細胞様樹状細胞腫瘍、バーキットリンパ腫、びまん性大細胞型B細胞リンパ腫、濾胞性リンパ腫、ヘアリーセル白血病、小細胞型濾胞性リンパ腫、大細胞型濾胞性リンパ腫、悪性リンパ球増殖状態、MALTリンパ腫、マントル細胞リンパ腫、辺縁帯リンパ腫、多発性骨髄腫、骨髄形成異常、骨髄異形成症候群、非ホジキンリンパ腫、形質芽球性リンパ腫、形質細胞様樹状細胞腫瘍、ワルデンシュトレームマクログロブリン血症、前白血病、MUC16またはMSLNの発現に関連する疾患、及びそれらの組み合わせからなる群から選択される血液のがんである、請求項87に記載の方法。
- 第1のTFP分子及び第2のTFP分子を発現する前記細胞が、前記第1のTFP分子及び前記第2のTFP分子を発現する細胞の効力を増大させる作用物質と組み合わせて投与される、請求項87に記載の方法。
- 前記哺乳動物において、
(a)抗MSLNキメラ抗原受容体(CAR);
(b)抗MUC16 CAR;
(c)抗MSLN CAR及び抗MUC16 CAR;または
(d)それらの組み合わせ
を発現する有効量のT細胞を投与された哺乳動物と比較して少ないサイトカインが放出される、請求項87〜90のいずれか1項に記載の方法。 - 前記第1のTFP分子及び第2のTFP分子を発現する前記細胞が、前記第1のTFP分子及び前記第2のTFP分子を発現する細胞の投与に関連する1つまたは複数の副作用を改善する作用物質と組み合わせて投与される、請求項87〜91のいずれか1項に記載の方法。
- 前記第1のTFP分子及び第2のTFP分子を発現する前記細胞が、MSLNまたはMUC16に関連する疾患を治療する作用物質と組み合わせて投与される、請求項87〜92のいずれか1項に記載の方法。
Applications Claiming Priority (3)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
US201862725098P | 2018-08-30 | 2018-08-30 | |
US62/725,098 | 2018-08-30 | ||
PCT/US2019/049202 WO2020047501A1 (en) | 2018-08-30 | 2019-08-30 | Compositions and methods for tcr reprogramming using fusion proteins |
Publications (1)
Publication Number | Publication Date |
---|---|
JP2021536432A true JP2021536432A (ja) | 2021-12-27 |
Family
ID=68084937
Family Applications (1)
Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
---|---|---|---|
JP2021509190A Pending JP2021536432A (ja) | 2018-08-30 | 2019-08-30 | 融合タンパク質を使用するtcr再プログラミングのための組成物及び方法 |
Country Status (14)
Country | Link |
---|---|
US (1) | US20210253666A1 (ja) |
EP (1) | EP3844192A1 (ja) |
JP (1) | JP2021536432A (ja) |
KR (1) | KR20210069048A (ja) |
CN (1) | CN113039209A (ja) |
AR (1) | AR116048A1 (ja) |
AU (1) | AU2019327569A1 (ja) |
BR (1) | BR112021003416A2 (ja) |
CA (1) | CA3110565A1 (ja) |
EA (1) | EA202190573A1 (ja) |
MX (1) | MX2021002225A (ja) |
SG (1) | SG11202101811VA (ja) |
TW (1) | TW202026006A (ja) |
WO (1) | WO2020047501A1 (ja) |
Families Citing this family (6)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
CA2986254A1 (en) | 2015-05-18 | 2016-11-24 | TCR2 Therapeutics Inc. | Compositions and methods for tcr reprogramming using fusion proteins |
WO2018026953A1 (en) | 2016-08-02 | 2018-02-08 | TCR2 Therapeutics Inc. | Compositions and methods for tcr reprogramming using fusion proteins |
KR20190058509A (ko) | 2016-10-07 | 2019-05-29 | 티씨알2 테라퓨틱스 인크. | 융합 단백질을 이용하는 t-세포 수용체 리프로그래밍을 위한 조성물 및 방법 |
CA3044593A1 (en) | 2016-11-22 | 2018-05-31 | TCR2 Therapeutics Inc. | Compositions and methods for tcr reprogramming using fusion proteins |
EP4126962A1 (en) * | 2020-04-01 | 2023-02-08 | Medigene Immunotherapies GmbH | Cd3-fusion protein and uses thereof |
CN115776991A (zh) * | 2020-05-07 | 2023-03-10 | 华夏英泰(北京)生物技术有限公司 | 改进的t细胞受体-共刺激分子嵌合物 |
Family Cites Families (54)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
FR901228A (fr) | 1943-01-16 | 1945-07-20 | Deutsche Edelstahlwerke Ag | Système d'aimant à entrefer annulaire |
US4816567A (en) | 1983-04-08 | 1989-03-28 | Genentech, Inc. | Recombinant immunoglobin preparations |
GB8607679D0 (en) | 1986-03-27 | 1986-04-30 | Winter G P | Recombinant dna product |
US5225539A (en) | 1986-03-27 | 1993-07-06 | Medical Research Council | Recombinant altered antibodies and methods of making altered antibodies |
US6548640B1 (en) | 1986-03-27 | 2003-04-15 | Btg International Limited | Altered antibodies |
US6905680B2 (en) | 1988-11-23 | 2005-06-14 | Genetics Institute, Inc. | Methods of treating HIV infected subjects |
US6352694B1 (en) | 1994-06-03 | 2002-03-05 | Genetics Institute, Inc. | Methods for inducing a population of T cells to proliferate using agents which recognize TCR/CD3 and ligands which stimulate an accessory molecule on the surface of the T cells |
US5858358A (en) | 1992-04-07 | 1999-01-12 | The United States Of America As Represented By The Secretary Of The Navy | Methods for selectively stimulating proliferation of T cells |
US6534055B1 (en) | 1988-11-23 | 2003-03-18 | Genetics Institute, Inc. | Methods for selectively stimulating proliferation of T cells |
US5530101A (en) | 1988-12-28 | 1996-06-25 | Protein Design Labs, Inc. | Humanized immunoglobulins |
US5703055A (en) | 1989-03-21 | 1997-12-30 | Wisconsin Alumni Research Foundation | Generation of antibodies through lipid mediated DNA delivery |
US5399346A (en) | 1989-06-14 | 1995-03-21 | The United States Of America As Represented By The Department Of Health And Human Services | Gene therapy |
US5585362A (en) | 1989-08-22 | 1996-12-17 | The Regents Of The University Of Michigan | Adenovirus vectors for gene therapy |
GB8928874D0 (en) | 1989-12-21 | 1990-02-28 | Celltech Ltd | Humanised antibodies |
DE69233482T2 (de) | 1991-05-17 | 2006-01-12 | Merck & Co., Inc. | Verfahren zur Verminderung der Immunogenität der variablen Antikörperdomänen |
US5199942A (en) | 1991-06-07 | 1993-04-06 | Immunex Corporation | Method for improving autologous transplantation |
WO1992022653A1 (en) | 1991-06-14 | 1992-12-23 | Genentech, Inc. | Method for making humanized antibodies |
ES2136092T3 (es) | 1991-09-23 | 1999-11-16 | Medical Res Council | Procedimientos para la produccion de anticuerpos humanizados. |
GB9125768D0 (en) | 1991-12-04 | 1992-02-05 | Hale Geoffrey | Therapeutic method |
CA2103887C (en) | 1991-12-13 | 2005-08-30 | Gary M. Studnicka | Methods and materials for preparation of modified antibody variable domains and therapeutic uses thereof |
GB9203459D0 (en) | 1992-02-19 | 1992-04-08 | Scotgen Ltd | Antibodies with germ-line variable regions |
US5350674A (en) | 1992-09-04 | 1994-09-27 | Becton, Dickinson And Company | Intrinsic factor - horse peroxidase conjugates and a method for increasing the stability thereof |
US5639641A (en) | 1992-09-09 | 1997-06-17 | Immunogen Inc. | Resurfacing of rodent antibodies |
US7175843B2 (en) | 1994-06-03 | 2007-02-13 | Genetics Institute, Llc | Methods for selectively stimulating proliferation of T cells |
US5731168A (en) | 1995-03-01 | 1998-03-24 | Genentech, Inc. | Method for making heteromultimeric polypeptides |
US7067318B2 (en) | 1995-06-07 | 2006-06-27 | The Regents Of The University Of Michigan | Methods for transfecting T cells |
US6692964B1 (en) | 1995-05-04 | 2004-02-17 | The United States Of America As Represented By The Secretary Of The Navy | Methods for transfecting T cells |
EP1180123B1 (en) | 1999-05-27 | 2008-07-16 | Government of the United States as represented by the Secretary, Department of Health and Human Services | Immunoconjugates having high binding affinity |
WO2001029058A1 (en) | 1999-10-15 | 2001-04-26 | University Of Massachusetts | Rna interference pathway genes as tools for targeted genetic interference |
US6326193B1 (en) | 1999-11-05 | 2001-12-04 | Cambria Biosciences, Llc | Insect control agent |
IL151287A0 (en) | 2000-02-24 | 2003-04-10 | Xcyte Therapies Inc | A method for stimulation and concentrating cells |
US6867041B2 (en) | 2000-02-24 | 2005-03-15 | Xcyte Therapies, Inc. | Simultaneous stimulation and concentration of cells |
US6797514B2 (en) | 2000-02-24 | 2004-09-28 | Xcyte Therapies, Inc. | Simultaneous stimulation and concentration of cells |
US7572631B2 (en) | 2000-02-24 | 2009-08-11 | Invitrogen Corporation | Activation and expansion of T cells |
WO2001096584A2 (en) | 2000-06-12 | 2001-12-20 | Akkadix Corporation | Materials and methods for the control of nematodes |
CN1294148C (zh) | 2001-04-11 | 2007-01-10 | 中国科学院遗传与发育生物学研究所 | 环状单链三特异抗体 |
AU2004255216B2 (en) | 2003-07-01 | 2010-08-19 | Immunomedics, Inc. | Multivalent carriers of bi-specific antibodies |
WO2005042743A2 (en) | 2003-08-18 | 2005-05-12 | Medimmune, Inc. | Humanization of antibodies |
WO2005035575A2 (en) | 2003-08-22 | 2005-04-21 | Medimmune, Inc. | Humanization of antibodies |
JP2008512352A (ja) | 2004-07-17 | 2008-04-24 | イムクローン システムズ インコーポレイティド | 新規な四価の二重特異性抗体 |
ES2429340T3 (es) | 2005-03-10 | 2013-11-14 | Morphotek, Inc. | Anticuerpos anti-mesotelina |
AU2006247565A1 (en) | 2005-05-12 | 2006-11-23 | The Government Of The United States, As Represented By The Secretary Of Health And Human Services | Anti-mesothelin antibodies useful for immunological assays |
CN101948541B (zh) | 2005-06-20 | 2014-08-06 | 健泰科生物技术公司 | 用于肿瘤诊断和治疗的组合物和方法 |
MY169746A (en) | 2005-08-19 | 2019-05-14 | Abbvie Inc | Dual variable domain immunoglobulin and uses thereof |
EP2215121B1 (en) | 2007-11-26 | 2016-02-10 | Bayer Intellectual Property GmbH | Anti-mesothelin antibodies and uses therefor |
TWI589589B (zh) | 2010-12-20 | 2017-07-01 | 建南德克公司 | 抗間皮素(mesothelin)抗體及免疫接合物 |
JP6076963B2 (ja) | 2011-04-08 | 2017-02-15 | アメリカ合衆国 | 抗上皮成長因子受容体変異体iiiキメラ抗原受容体及び癌の治療のためのその使用 |
US9272002B2 (en) | 2011-10-28 | 2016-03-01 | The Trustees Of The University Of Pennsylvania | Fully human, anti-mesothelin specific chimeric immune receptor for redirected mesothelin-expressing cell targeting |
MX2014010183A (es) | 2012-02-22 | 2015-03-20 | Univ Pennsylvania | Composiciones y metodos para generar una poblacion persistente de celulas t utiles para el tratamiento de cancer. |
JP6307085B2 (ja) | 2012-09-27 | 2018-04-04 | ザ・ユナイテッド・ステイツ・オブ・アメリカ・アズ・リプリゼンテッド・バイ・ザ・セクレタリー・デパートメント・オブ・ヘルス・アンド・ヒューマン・サービシーズThe United States of America,as represented by the Secretary,Department of Health and Human Services | メソテリン抗体および強力な抗腫瘍活性を惹起するための方法 |
TWI654206B (zh) * | 2013-03-16 | 2019-03-21 | 諾華公司 | 使用人類化抗-cd19嵌合抗原受體治療癌症 |
EP3604333B1 (en) * | 2014-03-11 | 2021-05-05 | Molecular Templates, Inc. | Proteins comprising amino-terminal proximal shiga toxin a subunit effector regions and cell-targeting immunoglobulin-type binding regions capable of specifically binding cd38 |
KR20190058509A (ko) * | 2016-10-07 | 2019-05-29 | 티씨알2 테라퓨틱스 인크. | 융합 단백질을 이용하는 t-세포 수용체 리프로그래밍을 위한 조성물 및 방법 |
JP2020513754A (ja) * | 2016-12-21 | 2020-05-21 | ティーシーアール2 セラピューティクス インク. | がん治療用に操作されたt細胞 |
-
2019
- 2019-08-30 EP EP19779636.0A patent/EP3844192A1/en not_active Withdrawn
- 2019-08-30 JP JP2021509190A patent/JP2021536432A/ja active Pending
- 2019-08-30 MX MX2021002225A patent/MX2021002225A/es unknown
- 2019-08-30 CN CN201980067230.0A patent/CN113039209A/zh active Pending
- 2019-08-30 TW TW108131439A patent/TW202026006A/zh unknown
- 2019-08-30 SG SG11202101811VA patent/SG11202101811VA/en unknown
- 2019-08-30 US US17/271,265 patent/US20210253666A1/en not_active Abandoned
- 2019-08-30 EA EA202190573A patent/EA202190573A1/ru unknown
- 2019-08-30 AR ARP190102489A patent/AR116048A1/es unknown
- 2019-08-30 WO PCT/US2019/049202 patent/WO2020047501A1/en unknown
- 2019-08-30 CA CA3110565A patent/CA3110565A1/en not_active Abandoned
- 2019-08-30 BR BR112021003416-1A patent/BR112021003416A2/pt not_active Application Discontinuation
- 2019-08-30 KR KR1020217009478A patent/KR20210069048A/ko unknown
- 2019-08-30 AU AU2019327569A patent/AU2019327569A1/en not_active Abandoned
Also Published As
Publication number | Publication date |
---|---|
KR20210069048A (ko) | 2021-06-10 |
TW202026006A (zh) | 2020-07-16 |
EA202190573A1 (ru) | 2021-07-14 |
MX2021002225A (es) | 2021-07-16 |
CN113039209A (zh) | 2021-06-25 |
BR112021003416A2 (pt) | 2021-05-18 |
AU2019327569A1 (en) | 2021-04-29 |
CA3110565A1 (en) | 2020-03-05 |
AR116048A1 (es) | 2021-03-25 |
US20210253666A1 (en) | 2021-08-19 |
WO2020047501A1 (en) | 2020-03-05 |
EP3844192A1 (en) | 2021-07-07 |
SG11202101811VA (en) | 2021-03-30 |
Similar Documents
Publication | Publication Date | Title |
---|---|---|
JP7262535B2 (ja) | 融合タンパク質を用いたtcrの再プログラミングのための組成物及び方法 | |
US11242376B2 (en) | Compositions and methods for TCR reprogramming using fusion proteins | |
JP7291396B2 (ja) | 融合タンパク質を用いたtcrの再プログラミングのための組成物及び方法 | |
US9790267B2 (en) | Glypican-3-specific antibody and uses thereof | |
JP2023052446A (ja) | 融合タンパク質を用いてt細胞受容体をリプログラミングするための組成物及び方法 | |
US9272002B2 (en) | Fully human, anti-mesothelin specific chimeric immune receptor for redirected mesothelin-expressing cell targeting | |
US20210187022A1 (en) | Engineered t cells for the treatment of cancer | |
US20210315933A1 (en) | Compositions and methods for tcr reprogramming using target specific fusion proteins | |
JP2021536432A (ja) | 融合タンパク質を使用するtcr再プログラミングのための組成物及び方法 | |
US20240252641A1 (en) | Compositions and methods for tcr reprogramming using cd70 specific fusion proteins | |
WO2016025884A1 (en) | Glycosyl-phosphatidylinositol (gpi)-linked gdnf family alpha-receptor 4 (gfralpha4)-specific antibody and uses thereof |
Legal Events
Date | Code | Title | Description |
---|---|---|---|
RD03 | Notification of appointment of power of attorney |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A7423 Effective date: 20210615 |
|
RD04 | Notification of resignation of power of attorney |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A7424 Effective date: 20210616 |