JP2022516710A - Ｃａｒ ｔ細胞の方法及び構築物 - Google Patents

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Abstract

本開示は、養子細胞療法に非複製ウイルスベクター(RNV)を提供する。該RNV は、in vivoで免疫細胞(例えば、T細胞)にキメラ抗原受容体を送達することができる。

Description

関連出願への相互参照
本願は、35 U.S.C.§119に基づき、2019年1月6日に出願された米国仮出願番号62/788,894の優先権を主張する。その開示は参照により本明細書に組み込まれる。
本開示は、養子細胞療法に複製ウイルスベクター(RRV)及び非複製ウイルスベクター(RNV)を提供する。該RRV及びRNVは、in vivoで免疫細胞(例えば、T細胞)にキメラ抗原受容体を送達することができる。
配列表の参照による組み込み
本願には、2020年1月6日に作成され、172,643バイトのデータを有し、IBM-PC、MS-ウィンドウズオペレーティングシステム上で機械フォーマットされ、"Sequence-Listing_ST25.txt"と題された、配列表が添付されている。あらゆる目的のため、該配列表の全体は参照により本明細書に組み込まれる。
背景
2013年にScience誌は、癌免疫療法を"今年の突破口"と名付けた(J. Couzan-Frankel, Science, 342：1432-1433, 2013)。キメラ抗原受容体(CAR)-遺伝子操作されたT細胞(June & Sadelain, N Engl J Med, 379：64-73, 2018)は、2013 年に始まった少なくとも2つの研究者グループによるこの命名の重要な部分であった。彼らは、患者のCAR 療法に対する注目すべき反応について、"白血病が溶けてなくなった"と報告し、進行癌からの驚くべき回復を示していた。CARは、T細胞機能を増強する、典型的にはT細胞である免疫エフェクター細胞に定義された特異性を移植する遺伝子操作された受容体である。最近では、この療法の2つの形態、即ち、Kymriah(またはtisagenlecleucel, [www.]hcp.novartis.com/products/kymriah/, Novartisによる販売)及びYeskarta(またはaxicabtagene ciloleucel,[www.]yescartahcp.com, Kite Pharmaceuticalsに開発され、現在Gileadによる販売)は、様々なタイプの B細胞白血病に対して商業販売が承認され、個別化医療の突破口を表している。該方法では、患者自身のTリンパ球が採取され、ex vivoで培養され、腫瘍抗原に結合する合成受容体をコードするように遺伝的に改変され、T細胞が、該患者に再び注入された後に、抗原を発現する癌細胞を認識して殺すことを可能にする。該手法は、上記のように、B細胞マーカーCD19を認識するCARについて承認され(S.L.ら ,N Engl J. Med., 371：1507-17, 2014)、CD20及びBCMAについて臨床で成功した。該2つのマーカーは、種々のタイプのリンパ腫、ならびにいくつか正常なB細胞のタイプについてのマーカーであり、γ-グロブリンの注入によって、それを欠損した患者を簡単に治療することができる。現在、これらのタイプの療法を固形腫瘍に使用し、CD34+造血幹細胞、γδT細胞及びNK細胞のような異なる集団を改変し、血液/骨髄、脾臓細胞の他のタイプの遺伝子改変を使用して、抗癌、抗ウイルス及び他のタイプの治療効果を達成する努力がなされている(K. B. Longら, Front. Immunol., 2018, [https://]doi. org/10.3389/fimmu.2018.02740；K. Ullahら, Oncol. Reports, 2018；[https：//]doi.org/10.3892/or.2018.6758)。その良い例はCD34+造血幹細胞である。これについて、欧州では、X関連重篤な複合免疫不全症候群(X-SCIDS)の遺伝子疾患を有する子供を治療するために、治療法Strimvelis(登録商標)GlaxoSmithKlineに開発され、現在、Orchard Therapeuticsによる販売)が承認された。これらの方法の大多数には、患者の細胞のex vivo単離、感受性細胞集団の遺伝的修飾、及び再移植が含まれる。該方法の最も初期の例は、ADA-SCIDS患者の部分的に成功した治療(R.M. Blaese, Immunol. Res., 38：274-284, 2007；DOI 10.1007/s12026-007-0009-z)及び同種異系骨髄移植治療の一部としてのドナーリンパ球注入後の移植片対宿主病を治療しようとする試み (G.Bonini, Science, 276：1719-1724, 1997)であった。これらの方法の全てには、レトロウイルスベクター、レンチウイルスベクターまたは他の遺伝子導入方法を用いた患者T細胞のex vivo遺伝子改変、続いて改変細胞の再注入が含まれた。
上記の治療法はいずれも、通常は自己組織を用いるex vivo細胞調製で実施される。このアプローチにはいくつかの理由がある：第1に、使用される遺伝子導入剤は非常に効率的ではなく、部分的または完全に精製された調製物を用いる場合のみ標的細胞を形質導入することが可能である。第2に、注入された遺伝子導入ベクター、特に組み込みベクターは、挿入突然変異誘発のために潜在的なリスクがあると認識された。なぜなら、このような方法は、いくつかの免疫抑制された個体、例えば、X-SCIDS患者においてリンパ腫を誘導しているからである。第3に、該ex vivoアプローチはまた、細胞のex vivo調製における異常な細胞または他の異常を同定することがより容易であるという観点から、より安全であると見られた。該ex vivo形質導入の方法は、治療上の利用可能性、コスト、及び一貫性の観点から、非常に制限されていることが証明された([https://]xtalks.com/kymriah-manufacturing-issues-spell-trouble-for-commercialization-of-novartis-car-t-therapy-1475/, [https://]labiotech.eu/medical/kymriah-car-t-therapy-novartis-sales/）。さらに一歩を引いて、該ex vivoアプローチは、出発材料の違いによって、予測可能性と成功のタイミングが欠け、患者ごとに新鮮な製品を調製する極端な労力と費用がかかり、またほとんどの場合、患者の既存する細胞集団の切除による最終的な再移植を成功させるために、"空間"を作る必要がある(例えば、S.L. Maudeら, N Engl J Med., 378：439-448, 2018；doi：10.1056/NEJMoa1709866)。遺伝子操作された同種異系T細胞の使用は、解決策として提案され、臨床試験が開始されたが、このstop-gap方法にはいくつかの問題がある。第1に、一卵性双生児を除いて、完璧なHLA一致は本質的に存在しないので、CAR T細胞はおそらく短命であり、同種異系応答によって排除される。また、HLAが除去された細胞を使用しようとする試みは、CAR T細胞由来の白血病の危険性を増大させる。第2に、該アプローチは、同種異系CAR T細胞の特定の調製物で複数の患者の治療を潜在的に可能にするが、治療できる患者の最大数は約100人と推定される。従って、未知の効力の新鮮な調製物を作製し、in vitroで試験する必要があり、in vivoでの効力予測ミスにつながる。
概要
本開示は、患者の細胞を直接に形質導入し、治療用遺伝子をコードする組み込み遺伝子導入ベクターの直接投与により、これらの困難の少なくともいくつかを克服する方法を提供する。一実施形態では、前記ベクターはレトロウイルスベクターであり、前記標的はT細胞であり、前記導入遺伝子はCARまたは類似の人工受容体構築物(例えば、第1、第2、第3世代等のCAR構築物)である。別の実施形態では、前記ベクターはレトロウイルスベクターであり、前記標的は外部の薬剤の投与により活性化された細胞であり、前記導入遺伝子は治療活性をコードする。この実施形態及び他の実施形態では、前記レトロウイルスベクターは、複製的(RRV)または非複製的(RNV)であってもよく、泡沫状ウイルス、レンチウイルス、α、βまたはγレトロウイルス、またはCRISPR要素等のあらゆる組み込みベクターに由来してもよく、"Piggy-bac" (Saitoら, Cytother. 16：1257-1269, 2014)または"Sleeping Beauty"等のトランスポゾンに基づくもののような非ウイルス性の組み込みベクターも含む。別の実施形態では、前記ベクターはレトロウイルスベクターであり、前記活性化剤は顆粒球コロニー刺激因子(GCSF)であり、前記標的はCD34+細胞である。さらなる実施形態では、前記ベクターはγレトロウイルス性の非複製ベクターであり、前記標的集団は天然に活性化されたT細胞であり、前記導入遺伝子はT細胞受容体である。さらなる実施形態では、前記ベクターはγレトロウイルスベクターであり、前記標的細胞集団は天然に活性化された細胞集団であり、前記導入遺伝子は免疫活性化剤をコードする。さらに別の実施形態では、前記ベクターはγレトロウイルスベクターであり、前記標的集団は天然に活性化されたT細胞であり、前記導入遺伝子はCAR (例えば、第1、第2、第3世代CAR)である。さらなる実施形態では、前記CARは、以下の1つまたは複数を標的とする結合ドメインを含む：CD5；CD19；CD123；CD22；CD30；CD171；CS1(CD2サブセット1、CRACC、SLAMF7、CD319、及び19A24とも呼ばれる)；C型レクチン様分子-1(CLL-1またはCLECL1)；CD33；表皮成長因子受容体変異体III(EGFRviii)；ガングリオシドG2(GD2)；ガングリオシドGD3(aNeu5Ac(2-8)aNeu5Ac(2-3)bDGalp(l-4)bDGlcp(l-l)Cer)；TNF受容体ファミリーメンバーB細胞成熟(BCMA)；Tn抗原((Tn Ag)または(GalNAcα-Ser/Thr))；前立腺特異的膜抗原(PSMA)；受容体チロシンキナーゼ様オーファン受容体1(ROR1)；Fms様チロシンキナーゼ3(FLT3)；腫瘍関連糖タンパク質72(TAG72)；CD38；CD44v6；急性白血病またはリンパ腫で発現されるが、造血前駆細胞には発現されないグリコシル化CD43エピトープ、非造血性癌に発現されるグリコシル化 CD43 エピトープ、発癌性抗原(CEA)；上皮細胞接着分子(EPCAM)；B7H3(CD276)；KIT(CD117)；インターロイキン-13受容体サブユニットα-2(IL-13Ra2またはCD213A2)；メソテリン；インターロイキン 11 受容体α(IL-llRa)；前立腺幹細胞抗原(PSCA)；プロテアーゼセリン21(テステシンまたはPRSS21)；血管内皮増殖因子受容体2(VEGFR2)；ルイス(Y)抗原；CD24；血小板由来増殖因子受容体β(PDGFR-β)；ステージ特異的胚抗原-4(SSEA-4)；CD20；フォレート受容体α(FRaまたはFR1)；葉酸受容体β(FRb)；受容体チロシンタンパク質キナーゼERBB2(Her2/neu)；細胞表面関連のムチン1(MUC1)；表皮成長因子受容体(EGFR)；神経細胞接着分子(NCAM)；プロスターゼ；前立腺酸性ホスファターゼ(PAP)；変異された伸長因子2(ELF2M)；エフリンB2；線維芽細胞活性化タンパク質α(FAP)；インスリン様成長因子1受容体(IGF-I受容体)、カルボニックアンヒドラーゼIX(CA1X)；プロテアソーム(プロサム、マクロペイン)サブユニット、β型、9(LMP2)；糖タンパク質100(gpl00)；ブレークポイントクラスター領域(BCR)及びAbelsonマウス白血病ウイルス発癌遺伝子ホモログ 1(Abl)(bcr-abl)からなる癌遺伝子融合タンパク質；チロシナーゼ；エフリン型A受容体2(EphA2)；シアリルルイス接着分子(sLe)；ガングリオシドGM3(aNeu5Ac(2-3)bDClalp(l-4)bDGlcp(l-1)Cer)；トランスグルタミナーゼ5(TGS5)；高分子量メラノーマ関連抗原(HMWMAA)；o-アセチル-GD2ガングリオシド(OAcGD2)；腫瘍内皮マーカー1(TEM1/CD248);腫瘍内皮マーカー7関連(TEM7R)；クローディン6(CLDN6)；甲状腺刺激ホルモン受容体(TSHR)；Gタンパク質共役型受容体クラスC群5、メンバーD(GPRC5D)；染色体Xオープンリーディングフレーム61(CXORF61)；CD97；CD179a；未分化リンパ腫キナーゼ(ALK)；ポリシアル酸；胎盤特異的1(PLAC1)；グロボHグリコセラミドの六糖部分(GloboH)；乳腺分化抗原(NY-BR-1)；ウロプラキン2(UPK2)；A型肝炎ウイルス細胞受容体1(HAVCR1)；アドレナリン受容体β3(ADRB3)；パネキシン3(PANX3)；Gタンパク質共役型受容体20(GPR20)；リンパ球抗原6複合体、遺伝子座K 9(LY6K)；嗅覚受容体51E2(OR51E2)；TCRγ代替リーディング フレーム タンパク質 (TARP)；ウィルムス腫瘍タンパク質 (WT1);癌/精巣抗原1(NY-ESO-1)；癌/精巣抗原2(LAGE-la)；メラノーマ関連抗原1(MAGE-A1)；染色体12pに位置する ETSトランスロケーション変異遺伝子6（ETV6-AML）；精子タンパク質17(SPA17)；X抗原ファミリー、メンバー1A(XAGE1)；アンジオポエチン結合細胞表面受容体2(Tie 2)；メラノーマ癌精巣抗原-1(MAD-CT-1)；メラノーマ癌精巣抗原-2(MAD-CT-2)；Fos関連抗原1；腫瘍タンパク質p53(p53)；p53変異体；プロスタイン；サバイビン；テロメラーゼ；前立腺癌腫瘍抗原-1(PCT A-lまたはガレクチン8)、T細胞1によって認識されるメラノーマ抗原(MelanAまたはMARTI)；ラット肉腫(Ras)突然変異体；ヒトテロメラーゼ逆転写酵素(hTERT)；肉腫トランスロケーションブレークポイント；アポトーシスのメラノーマ阻害剤(ML-IAP)；ERG (膜貫通プロテアーゼ、セリン2(TMPRSS2)ETS融合遺伝子)；N-アセチルグルコサミニル-トランスフェラーゼV(NA17)；ペアボックスタンパク質Pax-3(PAX3)；アンドロゲン受容体；サイクリンBl；v-mycトリ骨髄球腫症ウイルス腫瘍遺伝子神経芽細胞腫由来のホモログ(MYCN)；RasホモログファミリーメンバーC(RhoC)；チロシナーゼ関連タンパク質2(TRP-2)；チトクロームP450 1B 1(CYP1B 1)；CCCTC-結合因子(亜鉛フィンガータンパク質)様(BORIS, Brother of the Regulator of Imprinted Site)、T細胞3によって認識された扁平上皮細胞癌抗原(SART3)；ペアボックスタンパク質Pax-5(PAX5)、プロアクロシン結合タンパク質sp32(OY-TES1)；リンパ球特異的タンパク質チロシンキナーゼ(LCK)；キナーゼアンカータンパク質4(AKAP-4)；滑膜肉腫、Xブレークポイント2(SSX2)；最終糖化産物の受容体(RAGE-1)；腎ユビキタス1(RU1)；腎ユビキタス2(RU2)；レグマイン；ヒト乳頭腫ウイルスE6(HPV E6)；ヒト乳頭腫ウイルスE7(HPV E7)；腸管カルボキシルエステラーゼ；熱ショックタンパク質70-2変異(mut hsp70-2)；CD79a；CD79b；CD72；白血球関連免疫グロブリン様受容体1(LAIR1))；IgA受容体のFc断片(FCARまたはCD89)；白血球免疫グロブリン様受容体サブファミリーAメンバー2(LILRA2)；CD 300分子様ファミリーメンバーf(CD300LF)；C型レクチンドメインファミリー12メンバーA(CLEC12A)；骨髄間質細胞抗原2(BST2)；EGF様モジュールを含むムチン様ホルモン受容体様2(EMR2)；リンパ球抗原75(LY75)；グリピカン-3(GPC3)；Fc受容体様5(FCRL5)；免疫グロブリンλ様ポリペプチド1(IGLL1)、MPL、ビオチン、c-MYCエピトープタグ、CD34、LAMP1 TROP2、GFRα4、CDH17、CDH6、NYBR 1、CDH19、CD200R、Slea(CA19.9；シアリルルイス抗原)；フコシル-GMl、PTK7、gpNMB、CDH1-CD324、DLL3、CD276/B7H3、ILllRa、IL13Ra2、CD179b-IGL11、TCRγ-δ、NKG2D、CD32(FCGR2A)、Tn ag、Timl-/HVCR1、CSF2RA(GM-CSFR-α)、TGFβR2、Lews Ag、TCR-β1鎖、TCR-β2鎖、TCR-γ鎖、TCR-δ鎖、FITC、黄体形成ホルモン受容体 (LHR)、卵胞刺激ホルモン受容体(FSHR)、ゴ等トロピンホルモン受容体(CGHRまたはGR)、CCR4、GD3、SLAMF6、SLAMF4、HIV1エンベロープ糖タンパク質、HTLVl-Tax、CMV pp65、EBV-EBNA3c、KSHV K8.1、KSHV-gH、インフルエンザAヘマグルチニン(HA)、GAD、PDL1、グアニル酸シクラーゼC(GCC)、デスモグレイン3に対する自己抗体(Dsg3)、デスモグレイン1に対する自己抗体 (Dsg1)、HLA、HLA-A、HLA-A2、HLA-B、HLA-C、HLA-DP、HLA-DM、HLA-DOA、HLA-DOB、HLA-DQ、HLA-DR、HLA-G、IgE、CD99、Ras G12V、組織因子1(TF1)、AFP、GPRC5D、クローディン18.2(CLD18A2またはCLDN18A.2)、P-糖タンパク質、STEAP1、Liv1、ネクチン-4、クリプト、gpA33、BST1/CD157、低透過性塩化物チャンネル、及びTNT抗体によって認識される抗原。
図１（図１A、図１B、図１C、図１D、図１E）は、本開示のプラスミド構築物の配列及び注釈を示す。
図２は、複数のクローニング部位がハイライト/太字/下線で強調されたウイルスRNA (vRNA)配列を示す。CARコード配列(RNA)を多重クローニング部位(MCS)にクローニングし、RNVCARウイルス配列を形成することができる。
図３（図３A、図３B、図３C）は、本発明を例示するために使用されるCARをコードする種々のDNA配列を示す。注意されたいこととして、対応するRNA配列が意図され、ここで、配列中TはUに置換される。
図４（図４A、図４B、図４C、図４D、図４E、図４F、図４G、図４H）は、CD19-RNVCARの産生のためCD19に結合するscFv配列を含有する種々のプラスミド配列を示す。
図５Aおよび図５Bは、本開示の例示的なRNVベクターを概略的に示す。
図６は、Balb/cマウスにおけるPBMC感染レベルとRNV-GFPの初回IV投与の7日後に末梢血単核細胞(PBMC)において測定されたRNV-GFPのプロットである。
図７は、PBMC集団のサブセット(CD1lb+、CD4+、CD8+、及びCD19+)において評価されたRNV-GFP感染のプロットを、図6のデータを作成するために採取された試料のものと並行して示す。
図８は、A20 B細胞リンパ腫の動物モデルにおける実験の結果を示す。ここで、A20移植後5日目から、1日当たり1E7または1E8 TUの投与量でベクターRNV-1D3CARを腫瘍保有マウスに5日間連続してIV注射した。マウスを37日間モニターし、生存を評価した。高投与量のRNV-1D3CAR(5E8 TU)は、媒体処置の対照群(RNVなし)または低投与量のRNV-1D3CAR(5E7)と比べて、A20リンパ腫瘍保有マウスにおける生存率の改善をもたらした。
詳細な説明
本明細書及び添付の請求項において、単数形の"１つ"、及び"該"は、文脈が他に明確に指示しない限り、複数の対象物を含む。従って、例えば、"1つの細胞"を言及することは、複数のこのような細胞への言及を含む。また、"ポリヌクレオチド"を言及することは、1つまたは複数のポリヌクレオチドへの言及を含む。
また、他に記載されていない限り、"または"は、"及び/または"を意味する。同様に、"含む"、"含んでいる"、"包含する"、及び"包含している"は、交換可能であり、限定を意図したものではない。
さらに理解すべきこととして、様々な実施形態の説明が"含む"という用語を使用する場合、当業者は、いくつかの特定の例において、代替的に"本質的にからなる"または"からなる"という用語を用いて実施形態を説明してもよいことを理解するであろう。
他に定義されない限り、本明細書で使用される全ての技術用語及び科学用語は、本発明が属する技術分野の当業者によって一般的に理解されるものと同じ意味を有する。Allenら, Remington:薬学と実践(第22版), Pharmaceutical Press(2012年9月15日); Hornyakら,ナノサイエンスとナノテクノロジー入門, CRC Press(2008); SingletonとSainsbury, 微生物学及び分子生物学辞書(第3版改定), J. Wiley & Sons (New York, NY 2006); Smith, Marchの上級有機化学反応、メカニズムと構造(第7版), J. Wiley & Sons(New York, NY 2013); Singleton, DNAとゲノム技術辞典(第3版), Wiley-Blackwell(2012年11月28日); 及びGreenとSambrook, 分子クローニング：実験マニュアル(第4版), Cold Spring Harbor Laboratory Press(Cold Spring Harbor, NY 2012)では、当業者向けの、本出願で使用される多くの用語への一般的なガイドが提供されている。抗体の調製方法については、Greenfield, 抗体：実験マニュアル(第2版), Cold Spring Harbor Press(Cold Spring Harbor NY,2013); KohlerとMilstein, 細胞融合による特異的な抗体産生組織培養及び腫瘍株の誘導, Eur. J. Immunol. 1976年7月,6(7):511-9; QueenとSelick,ヒト化免疫グロブリン,米国特許番号5,585,089(1996年12月);及びRiechmannら,治療用ヒト抗体の再形成, Nature, 1988年3月24日,332(6162):323-7を参照されたい。また、CARのT細胞活性化分子の結合部分を提供するためのモノクローナル抗体または他の結合分子は、商業的供給業者によって調製され、提供されてもよい。本明細書の全ての見出し及び副見出しは、単に読み易さのためであり、本発明を限定するものと解釈されるべきではない。本明細書に記載した方法及び材料と類似または同等の方法及び材料を本発明の実施または試験に使用することができるが、適切な方法及び材料を以下に記載する。本明細書で言及された全ての刊行物、特許出願、特許、及び他の参考文献は、その全体が参照により組み込まれる。矛盾する場合は、定義を含む本明細書が優先する。さらに、材料、方法、及び特定の実施例は、例示的なものであり、限定することを意図するものではない。
本開示は、養子細胞療法に使用の医薬製剤、ベクター、細胞及び方法を提供する。本開示のベクターは、種々のキメラ抗原受容体のコード配列を含む複製または非複製のウイルスに由来するベクターを含む。
量や持続時間等の測定可能な値を指す場合、用語"約"は、該特定の値から、場合によっては±20%、または場合によっては±10%、または場合によっては±5%、または場合によっては±1%、または場合によっては±0.1%の変動を包含することを意味する。このような変動は、本明細書の開示された方法または組成物を実施するのに適切である。さらに、任意の値または範囲(例えば、20より小さい、または類似の用語)は、そのような値の間の、またはこの値までのいずれかの整数を明示的に含む。従って、例えば、"1～5回の突然変異"は、1回、2回、3回、4回、及び/または5回の突然変異を明確に含む。
用語"抗原結合分子"(ABM)は、ELISAのような結合アッセイにおいて実証されるように、標的抗原に対する特異的な親和性を有する任意の分子を指す。これは、抗体、抗体断片、ラクダ類またはサメまたは他の非定型的に構造化された抗体、及び非免疫グロブリン(Ig)足場タンパク質のような広範囲の抗体代替物または代用物を含む。このような分子は、抗原結合配列を特定するためのランダム化方法を用いた生物療法に開発された(U.H Wiedleら,癌ゲノミクスとプロテオミクス10:155-168, 2013; K.Skrlecら,バイオテクノロジーの動向,33:408-418, 2015)。非Ig足場タンパク質は、ヒト及び他の種からの天然タンパク質のドメイン由来サブユニットであるか、または人工的であり、それらのサイズは6～20 kDaであり、単一のポリペプチドから発現され得る。それらは、ランダム化、ファージディスプレイスクリーニング、及び親和性成熟プロセスを介した挿入、欠失及び置換に耐えられるα-らせんまたはβシートフレームワークにおける表面露出ループまたはアミノ酸を有し、拮抗薬または刺激薬として機能できる抗原結合足場タンパク質をもたらした。これまでに、治療用に足場結合剤として同定及び開発された非Ig足場タンパク質には50を超える異なるクラスがある。それらのサイズのため、該タンパク質が直面する主な課題の一つは、循環中の短い半減期につながる速い腎クリアランスである。しかし、それらがCARまたは他の膜透過性分子に組み込まれる場合には、この問題はない。
別の課題として、それらが、速い解離速度に関連して、しばしばモノクローナル抗体より結合親和性が低い(KD 1～100 nM)。二量体化ドメインを含むこれらの足場タンパク質の遺伝的改変は、立体障害を媒介するブロッキングまたは結合活性を増加させ、これにより、あるシグナル伝達経路において、これが生物学的機能及び治療効果につながる可能性がある。複数の方法が提案されており、足場タンパク質を含む融合タンパク質を用いて少なくとも一部が試験されている。
本開示は、足場ドメインによって連結された重鎖CDR及び/または軽鎖CDRの組み合わせを含む結合ドメイン(例えば、アディロン足場; ヒトステフィンAからの足場、EP22792058B1及びW02019/008335を参照。これらの開示は参照により本明細書に組み込まれる。)を使用する組成物及び方法を提供する。表1及び2は、本開示の組成物及び方法に有用な配列を提供する。RNAが意図されているため、以下の核酸配列では"T"が"U"であってもよいことに注意されたい。
表1:抗原結合タンパク質として機能できる非Ig足場タンパク質のアミノ酸配列
Figure 2022516710000002
Figure 2022516710000003
Figure 2022516710000004
Figure 2022516710000005
表2：抗原結合タンパク質として機能できる非Ig足場タンパク質の核酸配列
Figure 2022516710000006
Figure 2022516710000007
Figure 2022516710000008
Figure 2022516710000009
Figure 2022516710000010
Figure 2022516710000011
Figure 2022516710000012
Figure 2022516710000013
本開示は、細胞にまたは直接に被験者に送達できる、例えば、抗原結合ドメイン(例えば、抗体または抗体断片；または非免疫グロブリン(Ig)足場タンパク質のような非抗体結合ドメイン、またはコード配列等の組み合わせ)を有するCARをコードする異種ポリヌクレオチドを含むウイルスベクターを提供する。該ウイルスベクターは、アデノウイルスベクター、麻疹ベクター、ヘルペスウイルスベクター、レトロウイルスベクター(α-、β-、γ-、δ-レトロウイルスベクター、サル泡沫状ウイルス（SFV）またはヒト泡沫状ウイルス(HFV)等のスプマウイルスベクター、またはレンチウイルスベクターを含む)、水胞性口内炎ウイルスベクター等のラブドウイルスベクター、レオウイルスベクター、セリアバレーウイルスベクター、ポックスウイルスベクター(動物痘またはワクシニア由来のベクターを含む)、パルボウイルスベクター(AAVベクターを含む)、αウイルスベクター、または当業者に知られている他のウイルスベクター(例えば、遺伝学の概念，薬剤, Boro DropulicとBarrie Carter編集, Wiley, 2008, Hoboken, NJ.;ヒト遺伝子療法, Theodore Friedmann編集, Cold springs Harbor Laboratory Press, Cold springs Harbor, New York,1999；遺伝子と細胞療法, Nancy Smyth Templeton編集, Marcel Dekker Inc., New York, 2000、及び遺伝子及び細胞療法：治療のメカニズムと方法, 第3版, Nancy Smyth Templetone編集, CRC Press, Boca Raton, FL, 2008を参照。これらの開示は参照により本明細書に組み込まれる。) であってもよい。
上記及び下記に記載したように、本開示のレトロウイルスベクターは、MLV、MoMLV、GALV、FELV、HIV等に由来し (即ち、親ヌクレオチド配列が、MLV、MoMLV、GALV、FELV、HIV等から得られ)てもよく、従来のscFv抗原結合ドメインが直接またはリンカーを介して別のタイプの抗原結合ドメインで置換されているCARまたはCAR様ペプチドをコードする配列を含むように遺伝子操作されている。そのため、そのようなベクターで形質導入され、CARまたはCAR様タンパク質を発現する細胞において、膜に埋め込まれたCAR様分子のもう一方の端のζ鎖は、抗原結合時に細胞活性化を引き起こす。ここで、前記別のタイプの抗原結合ドメインは、別のscFv、または抗体断片、または本明細書に記載されるような非Ig分子(例えば、adenectin、pronectin、affimer、hckamer、またはanti-calin)であってもよい。
本明細書で使用される用語"抗体"は、抗原と特異的に結合する免疫グロブリン分子に由来するタンパク質またはポリペプチド配列を指す。抗体は、モノクローナル、またはポリクローナル、多鎖または単鎖、または無傷の免疫グロブリンであってもよく、天然の供給源または組換え供給源に由来してもよい。抗体は免疫グロブリン分子の四量体であってもよい。該抗体は、"ヒト化"、"キメラ"または非ヒトであってもよい。
用語"抗体断片"は、(例えば、結合、立体障害、安定化/不安定化、空間分布によって)抗原のエピトープと特異的に相互作用する能力を保持する抗体の少なくとも1つの部分を指す。抗体断片の例としては、これらに限定されないが、Fab、Fab'、F(ab'h、Fv断片、scFv抗体断片、ジスルフィド結合Fvs(sdFv)、VH及びCH1ドメインからなるFd断片、線状抗体、sdAbのような単一ドメイン抗体(vLまたはvHのいずれか)、ラクダ類vHHドメイン、ヒンジ領域でジスルフィド架橋によって連結された2つのFab断片を含む二価断片のような抗体断片から形成された多特異的抗体、及び抗体の単離されたCDRまたは他のエピトープ結合断片が挙げられる。抗原結合断片はまた、単一ドメイン抗体、マキシボディ、ミニボディ、ナノボディ、イントラボディ、ダイアボディ、トライアボディ、テトラボディ、v-NAR、及びbis-scFvに組み込むことができる(例えば、HollingerとHudson, Nature Biotechnology 23：1126-1136, 2005を参照)。抗原結合断片は、フィブロネクチンタイプIII(Fn3)のようなポリペプチドに基づいて足場に移植することもできる(フィブロネクチンポリペプチドミニボディを記載する米国特許第6,703,199号を参照)。
用語"抗体重鎖"は、抗体分子中に存在する2種類のポリペプチド鎖の天然に存在する立体構造の中の比較的大きいものを指す。これは、通常には抗体が属するクラスを決定する。
用語"抗体軽鎖"は、抗体分子中に存在する2種類のポリペプチド鎖の天然に存在する立体構造の中の比較的小さいものを指す。カッパー(κ)及びラムダ(λ)軽鎖は、2つの主要な抗体軽鎖アイソタイプを指す。
"抗癌作用"という用語は、様々な手段によって発現され得る生物学的効果を指す。該手段には、腫瘍体積の減少、癌細胞数の減少、転移数の減少、平均余命の延長、癌細胞増殖の減少、癌細胞生存の減少、または癌状態に関連する種々の生理学的症状の改善が含まれるが、これらに限定されない。
"抗がん剤"は、異常な細胞分裂及び増殖を阻害し、新生物細胞の遊走を阻害し、侵襲性を阻害し、または癌の増殖及び転移を防止する薬剤を指す。該用語には、化学療法製剤、生物学的製剤(例えば、siRNA、遺伝子操作されたMLV等のウイルスベクター、アデノウイルス、細胞傷害性遺伝子を送達するヘルペスウイルス)、及び抗体等が含まれる。
用語"抗原"または"Ag"は、免疫応答を誘発する分子を指す。該免疫応答は、抗体産生、または特異的免疫応答性細胞の活性化のいずれか、またはその両方を含むことができる。当業者は、実質的に全てのタンパク質またはペプチドを含む任意の巨大分子が抗原として機能することができることを理解するであろう。さらに、抗原は、組換えまたはゲノムDNAから誘導することができる。当業者は、免疫応答を誘発するタンパク質をコードするヌクレオチド配列または部分ヌクレオチド配列を含む任意のDNAが、本明細書で使用されるような"抗原"をコードすることを理解するであろう。さらに、当業者は、抗原が遺伝子の全長ヌクレオチド配列のみによってコードされる必要はないことを理解するであろう。限定するものではないが、本開示は、1つ以上の遺伝子の部分的ヌクレオチド配列の使用を含み、これらのヌクレオチド配列は、所望の免疫応答を誘発するポリペプチドをコードする様々な組み合わせで配列されることが容易に明らかである。さらに、当業者は、抗原が"遺伝子"によってコードされる必要は全くないことを理解するであろう。抗原が生成され、合成され、または生体試料から誘導されてもよく、あるいは、ポリペプチドの他の巨大分子であってもよいことは容易に明らかである。このような生体試料には、組織試料、腫瘍試料、または他の生体成分を含む細胞または液体が含まれるが、これらに限定されない。
標的抗原の非限定的な例には、CD5、CD19；CD123；CD22；CD30；CD171；CS1(CD2サブセット1、CRACC、SLAMF7、CD319、及び19A24とも呼ばれる)；C型レクチン様分子-1(CLL-1またはCLECL1)；CD33；表皮成長因子受容体変異体III(EGFRviii)；ガングリオシドG2(GD2)；ガングリオシドGD3(aNeu5Ac(2-8)aNeu5Ac(2-3)bDGalp(l-4)bDGlcp(l-l)Cer)；TNF受容体ファミリーメンバーB細胞成熟(BCMA)；Tn抗原((Tn Ag)または(GalNAcα-Ser/Thr))；前立腺特異的膜抗原(PSMA)；受容体チロシンキナーゼ様オーファン受容体1(ROR1)；Fms様チロシンキナーゼ3(FLT3)；腫瘍関連糖タンパク質72(TAG72)；CD38；CD44v6；急性白血病またはリンパ腫で発現されるが、造血前駆細胞には発現されないグリコシル化CD43エピトープ、非造血性癌に発現されるグリコシル化 CD43 エピトープ、発癌性抗原(CEA)；上皮細胞接着分子(EPCAM)；B7H3(CD276)；KIT(CD117)；インターロイキン-13受容体サブユニットα-2(IL-13Ra2またはCD213A2)；メソテリン；インターロイキン 11 受容体α(IL-llRa)；前立腺幹細胞抗原(PSCA)；プロテアーゼセリン21(テステシンまたはPRSS21)；血管内皮増殖因子受容体2(VEGFR2)；ルイス(Y)抗原；CD24；血小板由来増殖因子受容体β(PDGFR-β)；ステージ特異的胚抗原-4(SSEA-4)；CD20；フォレート受容体α(FRaまたはFR1)；葉酸受容体β(FRb)；受容体チロシンタンパク質キナーゼERBB2(Her2/neu)；細胞表面関連のムチン1(MUC1)；表皮成長因子受容体(EGFR)；神経細胞接着分子(NCAM)；プロスターゼ；前立腺酸性ホスファターゼ(PAP)；変異された伸長因子2(ELF2M)；エフリンB2；線維芽細胞活性化タンパク質α(FAP)；インスリン様成長因子1受容体(IGF-I受容体)、カルボニックアンヒドラーゼIX(CA1X)；プロテアソーム(プロサム、マクロペイン)サブユニット、β型、9(LMP2)；糖タンパク質100(gpl00)；ブレークポイントクラスター領域(BCR)及びAbelsonマウス白血病ウイルス発癌遺伝子ホモログ 1(Abl)(bcr-abl)からなる癌遺伝子融合タンパク質；チロシナーゼ；エフリン型A受容体2(EphA2)；シアリルルイス接着分子(sLe)；ガングリオシドGM3(aNeu5Ac(2-3)bDClalp(l-4)bDGlcp(l-1)Cer)；トランスグルタミナーゼ5(TGS5)；高分子量メラノーマ関連抗原(HMWMAA)；o-アセチル-GD2ガングリオシド(OAcGD2)；腫瘍内皮マーカー1(TEM1/CD248);腫瘍内皮マーカー7関連(TEM7R)；クローディン6(CLDN6)；甲状腺刺激ホルモン受容体(TSHR)；Gタンパク質共役型受容体クラスC群5、メンバーD(GPRC5D)；染色体Xオープンリーディングフレーム61(CXORF61)；CD97；CD179a；未分化リンパ腫キナーゼ(ALK)；ポリシアル酸；胎盤特異的1(PLAC1)；グロボHグリコセラミドの六糖部分(GloboH)；乳腺分化抗原(NY-BR-1)；ウロプラキン2(UPK2)；A型肝炎ウイルス細胞受容体1(HAVCR1)；アドレナリン受容体β3(ADRB3)；パネキシン3(PANX3)；Gタンパク質共役型受容体20(GPR20)；リンパ球抗原6複合体、遺伝子座K 9(LY6K)；嗅覚受容体51E2(OR51E2)；TCRγ代替リーディング フレーム タンパク質 (TARP)；ウィルムス腫瘍タンパク質 (WT1);癌/精巣抗原1(NY-ESO-1)；癌/精巣抗原2(LAGE-la)；メラノーマ関連抗原1(MAGE-A1)；染色体12pに位置する ETSトランスロケーション変異遺伝子6（ETV6-AML）；精子タンパク質17(SPA17)；X抗原ファミリー、メンバー1A(XAGE1)；アンジオポエチン結合細胞表面受容体2(Tie 2)；メラノーマ癌精巣抗原-1(MAD-CT-1)；メラノーマ癌精巣抗原-2(MAD-CT-2)；Fos関連抗原1；腫瘍タンパク質p53(p53)；p53変異体；プロスタイン；サバイビン；テロメラーゼ；前立腺癌腫瘍抗原-1(PCT A-lまたはガレクチン8)、T細胞1によって認識されるメラノーマ抗原(MelanAまたはMARTI)；ラット肉腫(Ras)突然変異体；ヒトテロメラーゼ逆転写酵素(hTERT)；肉腫トランスロケーションブレークポイント；アポトーシスのメラノーマ阻害剤(ML-IAP)；ERG (膜貫通プロテアーゼ、セリン2(TMPRSS2)ETS融合遺伝子)；N-アセチルグルコサミニル-トランスフェラーゼV(NA17)；ペアボックスタンパク質Pax-3(PAX3)；アンドロゲン受容体；サイクリンBl；v-mycトリ骨髄球腫症ウイルス腫瘍遺伝子神経芽細胞腫由来のホモログ(MYCN)；RasホモログファミリーメンバーC(RhoC)；チロシナーゼ関連タンパク質2(TRP-2)；チトクロームP450 1B 1(CYP1B 1)；CCCTC-結合因子(亜鉛フィンガータンパク質)様(BORIS, Brother of the Regulator of Imprinted Site)、T細胞3によって認識された扁平上皮細胞癌抗原(SART3)；ペアボックスタンパク質Pax-5(PAX5)、プロアクロシン結合タンパク質sp32(OY-TES1)；リンパ球特異的タンパク質チロシンキナーゼ(LCK)；キナーゼアンカータンパク質4(AKAP-4)；滑膜肉腫、Xブレークポイント2(SSX2)；最終糖化産物の受容体(RAGE-1)；腎ユビキタス1(RU1)；腎ユビキタス2(RU2)；レグマイン；ヒト乳頭腫ウイルスE6(HPV E6)；ヒト乳頭腫ウイルスE7(HPV E7)；腸管カルボキシルエステラーゼ；熱ショックタンパク質70-2変異(mut hsp70-2)；CD79a；CD79b；CD72；白血球関連免疫グロブリン様受容体1(LAIR1))；IgA受容体のFc断片(FCARまたはCD89)；白血球免疫グロブリン様受容体サブファミリーAメンバー2(LILRA2)；CD 300分子様ファミリーメンバーf(CD300LF)；C型レクチンドメインファミリー12メンバーA(CLEC12A)；骨髄間質細胞抗原2(BST2)；EGF様モジュールを含むムチン様ホルモン受容体様2(EMR2)；リンパ球抗原75(LY75)；グリピカン-3(GPC3)；Fc受容体様5(FCRL5)；免疫グロブリンλ様ポリペプチド1(IGLL1)、MPL、ビオチン、c-MYCエピトープタグ、CD34、LAMP1 TROP2、GFRα4、CDH17、CDH6、NYBR 1、CDH19、CD200R、Slea(CA19.9；シアリルルイス抗原)；フコシル-GMl、PTK7、gpNMB、CDH1-CD324、DLL3、CD276/B7H3、ILllRa、IL13Ra2、CD179b-IGL11、TCRγ-δ、NKG2D、CD32(FCGR2A)、Tn ag、Timl-/HVCR1、CSF2RA(GM-CSFR-α)、TGFβR2、Lews Ag、TCR-β1鎖、TCR-β2鎖、TCR-γ鎖、TCR-δ鎖、FITC、黄体形成ホルモン受容体 (LHR)、卵胞刺激ホルモン受容体(FSHR)、ゴ等トロピンホルモン受容体(CGHRまたはGR)、CCR4、GD3、SLAMF6、SLAMF4、HIV1エンベロープ糖タンパク質、HTLVl-Tax、CMV pp65、EBV-EBNA3c、KSHV K8.1、KSHV-gH、インフルエンザAヘマグルチニン(HA)、GAD、PDL1、グアニル酸シクラーゼC(GCC)、デスモグレイン3に対する自己抗体(Dsg3)、デスモグレイン1に対する自己抗体 (Dsg1)、HLA、HLA-A、HLA-A2、HLA-B、HLA-C、HLA-DP、HLA-DM、HLA-DOA、HLA-DOB、HLA-DQ、HLA-DR、HLA-G、IgE、CD99、Ras G12V、組織因子1(TF1)、AFP、GPRC5D、クローディン18.2(CLD18A2またはCLDN18A.2)、P-糖タンパク質、STEAP1、Liv1、ネクチン-4、クリプト、gpA33、BST1/CD157、低透過性塩化物チャンネル、及びTNT抗体によって認識される抗原が含まれる。
本明細書で使用される"親和性"は、結合強度の尺度を意味する。いくつかの例では、親和性は、結合剤とその標的(例えば、抗体と結合ドメインに特異的なエピトープを含む抗原との間)との間の立体化学的適合の近さ、それらの間の接触領域のサイズ、及び荷電基と疎水性基の分布に依存する。親和性は、一般に、標的と結合する結合剤の"能力"を指す。親和性を測定するために、当技術分野では多数の方法が使用されている。例えば、抗原に対する抗体の親和性を計算する方法は当該分野で公知であり、結合実験を用いて親和性を計算することが含まれる。結合親和性は、当技術分野で公知の種々の技術(例えば、表面プラズモン共鳴、生体層干渉法、二重偏光干渉法、静的光散乱、動的光散乱、等温滴定熱量測定、ELISA、分析超遠心分離法、及びフローサイトメトリー)を用いて測定することができる。結合親和性を測定するための例示的な方法は、表面プラズモン共鳴を使用する。表面プラズモン共鳴は、例えば、BIAcoreシステム(Pharmacia Biosensor AB, Uppsala、Sweden and Piscataway, N.J.)を用いて、バイオセンサマトリックス内のタンパク質濃度の変化を検出することによってリアルタイムの生体特異的な相互作用の分析を可能にする光学的現象である。
"抗原結合ドメイン"は、その一次、二次または三次配列、及び/または翻訳後修飾、及び/または高度な特異性を有する抗原に結合する電荷に起因するポリペプチドまたはペプチドを指す。該抗原結合ドメインは、例えば、抗体、非免疫グロブリン結合タンパク質（例えば、affibody、affimer、DARPin、またはPronectin（Skrlecら, Trends Biotechnol., 33：408-418, 2015)）、リガンド、または受容体のような異なる供給源から由来してもよい。
"結合活性"は、結合剤とその標的の間の相互作用の強さ(例えば、抗体とその抗原標的、受容体及びその同族体等との間の相互作用の強さ)を指す。該結合活性は弱くても、または強くてもよい。抗原に対する抗体の親和性を計算する方法は、当該分野で公知であり、結合実験を用いて親和性を計算することを含む。機能性アッセイ (例えば、フローサイトメトリーアッセイ)における抗体活性はまた、抗体の親和性を反映する。機能性アッセイ(例えば、フローサイトメトリーアッセイ)を用いて、抗体及び親和性を表現型的に特徴付けたりまたは比べたりすることができる。
用語"結合定数(Ka)"は、受容体とリガンドとの結合の平衡定数として定義される。
用語"自己抗原"は、自己抗体の産生のような自己免疫応答の産生を刺激する内因性抗原を指す。自己抗原は、セルフ抗原、または自己免疫疾患の発症をもたらせ、細胞または抗体を介した免疫応答の標的である正常組織からの抗原も含む。自己抗原の例には、デスモグレイン1、 デスモグレイン3、及びそれらの断片が含まれるが、これらに限定されない。
本明細書で使用され"有益な結果"は、病状の重症度を軽減または緩和すること、病状の悪化を防ぐこと、病状を治すこと、病状の進行を防ぐこと、患者における病状を発症する可能性を低減させること、及び患者の寿命または平均余命を延長することを含んでもよいが、これらに限定されない。
本明細書で使用される用語"結合ドメイン"または"抗体分子"は、少なくとも1つのドメイン（例えば、非特異的ドメインよりも高い親和性で標的に結合できる免疫グロブリン可変ドメイン配列）を含むタンパク質（例えば、免疫グロブリン鎖またはその断片）を指す。該用語は、抗体、抗体断片、及び他の非免疫グロブリンタンパク質結合ドメイン(Skrlecら,supra)を包含する。別の実施形態では、該抗体分子は、多重特異性抗体分子である。例えば、これは複数の免疫グロブリン可変ドメイン配列を含む。ここで、該複数中の第1免疫グロブリン可変ドメイン配列は、第1エピトープに対する結合特異性を有し、該複数中の第2免疫グロブリン可変ドメイン配列は、第2エピトープに対する結合特異性を有する。別の実施形態では、多重特異性抗体分子は二重特異性抗体分子である。二重特異性抗体は、2つの抗原に対する特異性を有する。二重特異性抗体分子は、第1エピトープに対して結合特異性を有する第1免疫グロブリン可変ドメイン配列及び第2エピトープに対して結合特異性を有する第2免疫グロブリン可変ドメイン配列によって特徴付けられる。
"抗癌"及び"癌性"は、典型的には調節されていない細胞増殖を特徴とする哺乳動物における生理学的状態を指すか、または説明する。癌の例には、B細胞リンパ腫(ホジキンリンパ腫及び/または非ホジキンリンパ腫)、T細胞リンパ腫、骨髄腫、骨髄異形成症候群、皮膚癌、脳腫瘍、乳癌、結腸癌、直腸癌、食道癌、肛門癌、未知の主要部位の癌、内分泌癌、精巣癌、肺癌、肝細胞癌、胃癌、膵臓癌、子宮頸癌、卵巣癌、肝臓癌、膀胱癌、子宮頸癌、卵巣癌、肝臓癌、膀胱癌、癌、黒色腫、頭部及び頸癌、脳腫瘍(例えば、神経膠芽細胞腫多型)、前立腺癌、（アンドロゲン依存性前立腺癌及びアンドロゲン非依存性前立腺癌を含むが、これらに限定されない。）、及び白血病が含まれるが、これらに限定されない。他の癌及び細胞増殖性障害は、当該技術分野において容易に認識されるであろう。用語"腫瘍"及び"癌"は、本明細書において互換的に使用され、例えば、両方の用語は、固体及び液体(例えば、拡散または循環)の腫瘍を包含する。本明細書で使用される場合、用語"癌"または"腫瘍"は、前悪性ならびに悪性の癌及び腫瘍を含む。
"化学療法剤"は、癌の化学療法に用いることで知られている化合物である。化学療法剤の非限定的な例には、以下が含まれる：チオテパ及びCYTOXAN (登録商標)シクロスホスホアミドのようなアルキル化剤；ブスルファン、インプロスルファン及びピポスルファンのようなアルキルスルホン酸塩；ベンゾドーパ、カルボクオン、メチュレドーパ、及びウレドパのようなアジリジン；アルトレタミン、トリエチレンメラミン、トリエチレンホスホルアミド、トリエチレンチオホスホルアミド、及びトリメチルオロメラミンを含むエチレンイミン及びメチルアメラミン；アセトゲニン(特に、ブラタシンとブラタシノン)；カンプトテシン(合成類似体トポテカンを含む)；ブリオスタチン；カリスタチン；CC-1065(その合成類似体アドゼレシン、カルゼレシン、及びビゼレシンを含む)；クリプトフィシン(特に、クリプトフィシン1及びクリプトフィシン8)；ドラスタチン；デュオカルマイシン(合成類似体KW-2189及びCB1-TM1を含む)；エリュテロビン；パンクラチスタチン; サルコディクチン; スポンジスタチン；クロラムブシル、クロルナファジン、クロロホスファミド、エストラムスチン、イホスファミド、メクロレタミン、塩酸メクロレタミン、メルファラン、ノベンビチン、フェネステリン、プレドニムスチン、トロホスファミド、ウラシルマスタードのようなナイトロジェンマスタード；カルムスチン、クロロゾトシン、フォテムスチン、ロムスチン、ニムスチン、及びラニムスチンのようなニトロソウレア；エンジイン抗生物質（例えば、カリケアマイシン、特にカリケアマイシンγ1I及びカリケアマイシンωI1（例えば、Agnew, Chem. Intl. Ed. Engl., 33: 183-186 (1994)を参照）のような抗生物質；ダイナミシンAを含むダイナミシン；クロドロネートのようなビスホスホネート；エスペアマイシン；ならびにネオカルゾノスタチン発色団及び関連の色素タンパク質エンジイン抗生物質発色団、アクラシノマイシン、アクチノマイシン、オートラマイシン、アザセリン、ブレオマイシン、カクチノマイシン、カラビシン、カミノマイシン、カルジノフィリン、クロモマイシン、ダクチノマイシン、ダウノルビシン、デトルビシン、6-ジアゾ-5-オキソ-L-ノルロイシン、ADRIAMYCIN(登録商標)ドキソルビシン(モルホリノ-ドキソルビシン、シアノモルホリン-ドキソルビシン、2-ピロリン-ドキソルビシン、及びデオキシドキソルビシンを含む)、エピルビシン、エソルビシン、イダルビシン、マルセロマイシン、マイトマイシンCのようなマイトマイシン、ミコフェノール酸、ノガラマイシン、オリボマイシン、ペプロマイシン、ポトフィロマイシン、ピューロマイシン、ケラマイシン、ロドルビシン、ストレプトニグリン、ストレプトゾシン、ツベルシジン、ウベニメクス、ジノスタチン、ゾルビシン；メトトレキサートや5-フルオロウラシル（5-FU）のような代謝拮抗剤；デノプテリン、メトトレキサート、プテロプテリン、トリメトレキサートのような葉酸類似体；フルダラビン、6-メルカプトプリン、チアミプリン、チオグアニンのようなプリン類似体；アンシタビン、アザシチジン、6-アザウリジン、カルモフル、シタラビン、ジデオキシウリジン、ドキシフルリジン、エノシタビン、フロクスウリジンのようなピリミジン類似体；カルステロン、プロピオン酸ドロスタノロン、エピチオスタノール、メピチオスタン、テストトラクトンようなアンドロゲン；アミノグルテチミド、ミトタン、トリロスタンのような抗副腎；フロリン酸のような葉酸補充剤；アセグラトン；アルドホスファミド配糖体；アミノレブリン酸；エニルラシル；アムサクリン；ベストラブシル；ビサントレン；エダトラクスエート；デフォファミン；デメコルシン；ジアジクオン；エルフォルミチン；酢酸エリプチニウム；エポチロン；エトグルシト；硝酸ガリウム；ヒドロキシ尿素；レンチナン；ロニダイニン；マイタンシンとアンサミトシンのようなマイタンシノイド；ミトグアゾン；ミトキサントロン；モピダンモール；ニトラエリン；ペントスタチン；フェナメット；ピラルビシン；ロソキサントロン；ポドフィリン酸；2-エチルヒドラジド；プロカルバジン；PSK (登録商標)多糖複合体(JHS天然物、Eugene、Oreg.)；ラゾキサン；リゾキシン；シゾフラン；スピロゲルマニウム；テヌアゾン酸；トリアジクオン；2,2',2"-トリクロロトリエチルアミン；トリコテセン(特に、T-2毒素、ベラクリンA、ロリジンA、及びアンギジン)；ウレタン；ビンデシン；ダカルバジン；マンノムスチン；ミトブロニトール；ミトラクトール；ピポブロマン；ガシトシン；アラビノシド("Ara-C")；シクロホスファミド；チオテパ；タキソイド (例えば、TAXOL(登録商標)パクリタキセル(Bristol-Myers Squibb Oncology, Princeton, N.J.)、ABRAXANE(登録商標)Cremophor-free、パクリタキセルのアルブミン-遺伝子操作されたナノ粒子製剤(American Pharmaceutical Partners, Schaumberg, III)、及びTAXOTERE (登録商標)ドセタキセル(Rhone-Poulenc Rorer, Antony, France)；クロランブシル；GEMZAR(登録商標)ゲムシタビン；6-チオグアニン；メルカプトプリン；メトトレキセート；シスプラチン、オキサリプラチン、及びカルボプラチンのような白金類似体；ビンブラスチン；白金；エトポシド(VP-16)；イホスファミド；ミトキサントロン；ビンクリスチン；NAVELBINE；ビノレルビン；ノバントロン；テニポシド；エダトレキサート；ダウノマイシン；アミノプテリン；ゼローダ；イバントネート；イリノテカン(Camptosar, CPT-11)(イリノテカンと5-FU及びロイコボリンの治療レジメンを含む)；トポイソメラーゼ阻害剤RFS 2000；ジフルオロメチルオルニチン(DMFO)；レチノイン酸のようなレチノイド；カペシタビン；コブレタスタチン；ロイコボリン(LV)；オキサリプラチン治療レジメン（FOLFOX）を含むオキサリプラチン；ラパチニブ（Tykerb）；PKC-α、Raf、H-Ras、EGFRの阻害剤(例えば、エルロチニブ(Tarceva(登録商標))、細胞増殖を抑えるVEGF-A；上記のいずれか薬学的に許容される塩、酸または誘導体、またはこれらの組み合わせ。
"キメラ抗原受容体" (CAR)は、養子細胞転写と呼ばれる技術を用いて、癌の標的療法として使用するために企図された人工T細胞受容体である。受容体ポリペプチドの本質的な抗原結合、シグナル伝達、及び刺激機能は、一般にキメラ抗原受容体(CAR)と呼ばれる単一のポリペプチド鎖への遺伝子組換え法によって減少されている(例えば、Eshhar, 米国特許第7,741,465号及びEshhar，米国特許出願公開第2012/0093842号を参照)。CARは、CARが結合する特異的抗原に応答してT細胞活性化及び増殖を刺激するように特異的に構築される。用語"キメラ抗原受容体"または"CAR"は、ポリペプチドのセット、最も単純な実施形態では、2つのポリペプチドを指す。これは、免疫エフェクター細胞において発現される場合、該細胞に標的細胞、典型的には癌細胞に対する特異性及び細胞内シグナル生成を提供する。いくつかの実施形態では、CARは、少なくとも細胞外抗原結合ドメイン、膜貫通ドメイン(例えば、配列番号：lを参照)、及び刺激分子及び/または共刺激分子に由来の機能性シグナル伝達ドメインを含む細胞質シグナルド伝達メイン(本明細書では"細胞内シグナル伝達ドメイン"とも呼ばれる)(例えば、配列番号:5を参照)を含む。いくつかの態様では、前記ポリペプチドのセットは、互いに隣接している。一態様では、前記刺激分子は、T細胞受容体複合体に関連するζ鎖である。一態様では、前記細胞質シグナル伝達ドメインは、以下に定義される少なくとも1つの共刺激分子に由来する1つまたは複数の機能性シグナル伝達ドメインをさらに含む。一態様では、前記共刺激分子は、本明細書に記載の共刺激分子、例えば、4-1BB (即ち、CD137；配列番号:5)、CD27及び/またはCD28から選択される。一態様では、前記CARは、CAR融合ポリペプチドのアミノ末端(N-末端)に任意のリーダー配列を含む(例えば、配列番号:6を参照)。一態様では、前記CARは、細胞外抗原結合ドメインのN末端にリーダー配列をさらに含み、該リーダー配列は、細胞処理及び細胞膜への該CARの局在化の間に、抗原結合ドメイン(例えば、scFv)から任意に切断される。典型的には、"CAR-T細胞"が使用される。これは、キメラ抗原受容体を含有するように遺伝子操作されたT細胞を指す。従って、そのようなCARを有するTリンパ球は、一般にCAR-Tリンパ球と呼ばれる。
"コドンの最適化"または"種コドンバイアスの制御"は、特定の宿主細胞の好ましいコドン使用を指す。当業者には理解されるように、コード配列を改変して特定の宿主におけるその発現を増強することが有利になりうる。遺伝子コードは、64個の可能なコドンで冗長であるが、ほとんどの生物は、典型的には、これらのコドンのサブセットを使用する。種において、最も頻繁に利用されるコドンは、最適なコドンと呼ばれ、頻繁に利用されないコドンは、希少コドンまたは使用率の低いコドンとして分類される。
特定の原核細胞または真核生物宿主によって好まれるコドンを含む最適化されたコード配列(Murrayら(1989) Nucl. Acids Res. 17：477-508も参照)を調製し、例えば、翻訳速度を増加させるか、または非最適化配列から生成される転写物と比べてより長い半減期のような望ましい特性を有する組換えRNA転写物を生成することができる。翻訳停止コドンも、宿主の好みを反映するように改変することができる。当業者は、遺伝コードの縮重された性質により、それらのヌクレオチド配列が異なる種々のDNA化合物を、本開示のポリペプチドをコードするために使用できることを認識するであろう。
"保存的置換"または"保存的配列修飾"とは、コードされたタンパク質の結合特性または機能を有意に影響または変化させないアミノ酸修飾を指す。例えば、"保存的配列修飾"は、TCR定数鎖、抗体、抗体断片、または非免疫グロブリン結合ドメインの結合特性または機能を有意に影響または改変しないアミノ酸修飾を指す。このような保存的修飾には、アミノ酸の置換、付加、及び欠失が含まれる。当技術分野で知られている標準的な技術、例えば、部位特異的突然変異誘発及びPCR媒介突然変異誘発によって、TCR定数鎖、抗体、抗体断片、非免疫グロブリン結合ドメイン、または本開示の他のタンパク質またはポリペプチドに修飾を導入することができる。保存的アミノ酸の置換は、アミノ酸残基が類似の側鎖を有するアミノ酸残基で置換されたものである。類似の側鎖を有するアミノ酸残基のファミリーは、当該技術分野において定義されている。これらのファミリーには、塩基性側鎖(例えば、リジン、アルギニン、ヒスチジン)、酸性側鎖(例えば、アスパラギン酸、グルタミン酸)、非荷電極性側鎖(例えば、グリシン、アスパラギン、グルタミン、セリン、スレオニン、チロシン、システイン、トリプトファン)、無極性側鎖(例えば、アラニン、バリン、ロイシン、イソロイシン、プロリン、フェニルアラニン、メチオニン)、β-分枝側鎖(例えば、スレオニン、バリン、イソロイシン)、及び芳香族側鎖(例えば、チロシン、フェニルアラニン、トリプトファン、ヒスチジン)を有するアミノ酸が含まれる。従って、本開示のSIR内の1つまたは複数のアミノ酸残基を同じ側鎖ファミリーからの他のアミノ酸残基と置換し、そして改変されたSIRを本明細書に記載の結合及び/または機能性アッセイを用いて試験することができる。
本明細書で使用される用語"から由来する"は、第1分子と第2分子との間の関係を示す。これは、該第1分子と第2分子との間の構造上の類似性を指し、第2分子に由来する第1分子に対するプロセスまたは供給源の制限を暗示したり、含んだりしない。例えば、抗体分子に由来する抗原結合ドメインの場合、該抗原結合ドメインは、必要な機能、即ち、抗原に結合する能力を有するような十分な抗体構造を保持している。それは、抗体を産生する特定のプロセスへの制限を暗示したり、含んだりしない。例えば、それは、抗原結合ドメインを提供するには、抗体配列から始めて不要な配列を削除しないと、または突然変異を課さないと抗原結合ドメインに到達できないことを意味しない。
本明細書で使用される用語"細胞内シグナル伝達ドメイン"は、分子の細胞内シグナル伝達部分を指す。該細胞内シグナル伝達ドメインは、免疫細胞の免疫エフェクター機能を促進するシグナルを生成する。免疫エフェクター機能の例には、サイトカインの分泌を含む細胞溶解活性及びヘルパー活性が含まれる。
別の実施形態では、前記細胞内シグナル伝達ドメインは、一次細胞内シグナル伝達ドメインを含むことができる。例示的な一次細胞内シグナル伝達ドメインには、一次刺激、または抗原依存性刺激に関与する分子から由来するものが含まれる。別の実施形態では、前記細胞内シグナル伝達ドメインは、共刺激細胞内シグナル伝達ドメインを含むことができる。例示的な共刺激細胞内シグナル伝達ドメインには、共刺激シグナル、または抗原非依存性刺激に関与する分子から由来するものが含まれる。例えば、一次細胞内シグナル伝達ドメインは、CD3zの細胞質配列を含むことができ、共刺激細胞内シグナル伝達ドメインは、CD28または41BBのような共受容体または共刺激分子からの細胞質配列を含むことができる。
一次細胞内シグナル伝達ドメインは、免疫受容体チロシンに基づく活性化モチーフまたはITAMとして知られているシグナル伝達モチーフを含むことができる。一次細胞質シグナル伝達配列を含有するITAMの例には、CD3ζ、共通FeRγ(FCER1G)、FeγRIIa、FeRβ(Feε R1b)、CD3γ、CD3δ、CD3ε、CD79a、CD 79b、DAP1O、及びDAP12から由来するものが含まれるが、これらに限定されない。
本明細書で使用される用語"可撓性ポリペプチドリンカー"は、ポリペプチド鎖を一緒に(例えば、可変重鎖領域及び可変軽鎖領域を一緒に)連結するために、単独でまたは組み合わせて使用されるグリシン残基及び/またはセリン残基のようなアミノ酸からなるペプチドリンカーを指す。一実施形態では、該可撓性ポリペプチドリンカーは、Gly/Serリンカーであり、アミノ酸配列(Gly-Gly-Gly-Ser)nを含み、ここでnは1以上の正の整数、例えば、n=l、n=2、n=3、n=4、n=5、n=6、n=7、n=8、n=9、及びn=10である。一実施形態では、該可撓性ポリペプチドリンカーは、(Gly4Ser)4または(Gly4Ser)3を含むが、これらに限定されない。別の実施形態では、該リンカーは、複数の(Gly2Ser)、(GlySer)、または(Gly3Ser) の反復配列を含む。
本明細書で使用される"哺乳動物"は、哺乳動物綱の任意のメンバーを指す。これは、ヒト及びチンパンジーや他の類人猿やサル種等の非ヒト霊長類；牛、羊、豚、山羊、馬等の家畜；犬や猫等の家畜哺乳類；マウス、ラット、モルモット等のげっ歯類を含む実験動物を含むが、これらに限定されない。該用語は、特定の年齢または性別を示すものではない。従って、成人及び新生児の被験者、ならびに胎児、男性または女性に関わらず、該用語の範囲内に含まれることが意図されている。
用語"作動可能に連結された"は、各成分が機能できるように、第1成分と第2成分との間の機能的な結合または関連を指す。例えば、作動可能に連結されたものは、調節配列と、結果として後者の発現をもたらす異種核酸配列との間の関連を含む。例えば、第1核酸配列は第2核酸配列と機能的に関係して配置されるときに、該第1核酸配列が、該第2核酸配列と作動可能に連結される。作動可能に連結されている2つのポリペプチドの状況では、第1ポリペプチドは、いかなる連結にも依存しないように機能し、第2ポリペプチドは、2つの間に連結がないように機能する。
2種以上の核酸またはポリペプチド配列の文脈における"同一性百分率"は、同じである2つ以上の配列を指す。2つの配列は、次の配列比較アルゴリズムのいずれかを用いて、または手動整列及び目視検査での測定によって、比較ウィンドウまたは指定された領域で最大の対応を得るために比較及び整列された場合に、同じアミノ酸残基またはヌクレオチドの特定の百分率（例えば、指定された領域、または指定されていない場合は配列全体にわたって、60％の同一性、場合によって、70％、71％。72％。73％、74％、75％、76％、77％、78％、79％、80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％の同一性）を有すれば、該2つの配列が"実質的に同一"である。場合によって、該同一性は、長さが少なくとも約50ヌクレオチド(または10アミノ酸)の領域、より好ましくは、長さが100～500または1000以上のヌクレオチド（または20、50、200、またはそれ以上のアミノ酸)の領域にわたって存在する。
一般に、配列比較では1つの配列を参照配列として、試験配列をそれと比較する。配列比較アルゴリズムを使用する場合、試験配列及び参照配列がコンピュータに入力され、必要に応じてサブ配列座標が指定され、配列アルゴリズムプログラムパラメータが指定される。デフォルトプログラムパラメータを使用することができ、または代替パラメータを指定することができる。次いで、配列比較アルゴリズムは、プログラムパラメータに基づいて、参照配列に対する試験配列の配列同一性の百分率を計算する。比較のための配列の整列方法は、当該技術分野で周知である。比較のための配列の最適な整列は、例えば、SmithとWatermanの局所ホモロジーアルゴリズム(1970, Adv. Appl. Math. 2:482c)、Needleman とWunschの相同性整列アルゴリズム(1970, J. Mol. Biol. 48:443)、Pearson とLipmanの類似性の検索方法(1988, Proc. Nat'l. Acad. Sci. USA 85:2444)、これらのアルゴリズムのコンピューター化された実装（GAP, BESTFIT, FASTA, 及びウィスコンシン遺伝学ソフトウェアパッケージにおけるTFASTA, Genetics Computer Group, 575 Science Dr., Madison, WI）、または手動整列と目視検査（例えば、Brentら, (2003) 分子生物学の現在のプロトコルを参照）によって行うことができる。
配列同一性及び配列類似性の百分率の測定に使用できるアルゴリズムの2つの例は、それぞれAltschulら, (1977) Nuc. Acids Res. 25:3389-3402及びAltschulら, (1990) J. Mol. Bioi. 215:403-410に記載されているBLAST及びBLAST 2.0アルゴリズムである。BLAST分析を行うためのソフトウェアは、米国国立バイオテクノロジー情報センターを通じて公開されている。
2つのアミノ酸配列の間の同一性百分率はまた、ALIGNプログラム（バージョン2.0）に組み込まれているE. MeyersとW. Millerのアルゴリズム(1988, Comput. Appl. Biosci. 4:11-17)（PAM120ウエイト残基表、ギャップ長ペナルティ：12、及びギャップペナルティ：4で）を用いて測定できる。また、2つのアミノ酸配列の間の同一性百分率は、GCGソフトウェアパッケージ（www.gcg.comで入手可能）のGAPプログラムに組み込まれているNeedlemanとWunschのアルゴリズム(1970, J. Mol. Bioi. 48:444-453)(マトリックス：Blossom 62またはPAM250、ギャップウエイト：16, 14, 12, 10, 8, 6,または4、長さウエイト：1, 2, 3, 4, 5,または6)を用いて測定できる。
用語"ポリヌクレオチド"、"核酸"、または"組換え核酸"は、デオキシリボ核酸(DNA)及び適切なリボ核酸(RNA)のようなヌクレオチドのポリマーを指す。当業者であれば、本明細書で提供される任意のDNA配列は、"T"を"U"に置換することでRNA配列に変換できることを認識するであろう。
本明細書において互換的に使用される"タンパク質"または"ポリペプチド"は、ペプチド結合と呼ばれる化学結合によって一緒に連結されるアミノ酸と呼ばれる化学的構築ブロックの1つまたは複数の鎖を含む。
用語"RNV"は、非複製ウイルスベクターを指し、長い末端反復、パッケージングシグナル、及びクローニング部位を含むレトロウイルスベクター（本開示の構築物のRNA主鎖配列を含む配列番号:12を参照）であり得る。本開示のRNVは、HT1080由来パッケージング細胞株HA-LB(Sheridan ら, Mol. Ther., 2：262-275, 2000)、または同様に構築されたパッケージング細胞株HA-L2のようなプロデューサー/パッケージング細胞株に形質転換された配列番号:3を含むプラスミドから、 またはウイルスタンパク質をコードする適切なヘルパーゲノムを他の効率的なプロデューサー細胞株の293Tに遺伝子導入することによって産生される。例えば、RNVは、gag、pol及びenvコード配列を含むパッケージング細胞株を、パッケージングシグナルを含む配列番号:3のプラスミドで遺伝子導入することによって産生できる。該方法は、パッケージング細胞を使用することにより、レトロウイルスゲノムがキャプシド及びエンベロープ中にパッケージングされたRNVを産生する。該パッケージング細胞は、通常、細胞のゲノムに組み込まれた2つのプラスミドの形でウイルスタンパク質コード配列で提供される。これにより、生存可能なレトロウイルス粒子、目的の遺伝子を運ぶRNAをコードするDNAウイルス構築物、及び前記RNAのパッケージングを前記レトロウイルス粒子に誘導するパッケージングシグナルの産生に必要な全てのタンパク質が産生される。
用語"RNVCAR"は、長い末端反復、パッケージングシグナルを含み、キメラ抗原受容体(CAR)のコード配列を含有する非複製ウイルスベクターを指す。前記CARは、任意の数の抗原(例えば、癌抗原等)を標的とし、それと選択的に結合する、結合ドメインを含む。いくつかの例では、本開示は、"X"-RNVCARの表現を用いる。ここで、Xが、特定の抗原の名前または頭字語である(例えば、CD19-RNVCAR)。前記抗原は、本明細書に記載されるように、任意の数の異なる結合ドメインによって標的化され得る(例えば、scFv)。CAR構築物の調製に有用な種々の結合ドメインの配列は知られている(例えば、国際出願公開WO 2018/102795の表5を参照。その配列及び開示は参照により本明細書に組み込まれる。)。
用語"RRV"は、複製ウイルスベクターを指し、そして長い末端反復、gag、pol、env、パッケージングシグナル、及びクローニング部位を含むレトロウイルスベクターであってもよい。本開示のRRVは、感染性ウイルスを産生するためにヘルプ細胞を必要としない。いくつかの実施形態では、該RRVは、γレトロウイルス性GAGタンパク質；γレトロウイルス性POLタンパク質；γレトロウイルス性エンベロープ；マウス白血病ウイルス（MLV）、モロニーマウス白血病ウイルス（MoMLV）、ネコ白血病ウイルス（FeLV）、ヒヒ内因性レトロウイルス（BEV）、ブタ内因性ウイルス（PERV）、ネコ由来のレトロウイルスRD114、リスサルレトロウイルス、異種指向性マウス白血病ウイルス関連のウイルス（XMRV）、トリ細網内皮症ウイルス（REV）、またはγレトロウイルスポリヌクレオチド配列の3'末端にあるテナガザル白血病ウイルス（GALV）からの3'非翻訳領域（U3）及び反復領域（R）配列を含むγレトロウイルスRNAポリヌクレオチド、γレトロウイルスポリヌクレオチドの5'末端にあるMLV、MoMLV、FeLV、BEV、PERV、RD114、リスザルレトロウイルス、XMRV、REV、またはGALVからのR及び5'非翻訳領域（U5）配列、U5領域とU3領域の間に位置するMLV、MoMLV、FeLV、BEV、PERV、RD114、リスザルレトロウイルス、XMRV、REV、またはGALVからのgag核酸ドメイン、pol核酸ドメイン、及びenv核酸ドメイン；内部リボソーム侵入部位（IRES）、ミニプロモーター、または上流の2Aまたは2A様配列を含み、免疫賦活作用を有する生成物をコードする異種ポリヌクレオチドに作動可能に連結され、U3領域の5'側及びenv核酸ドメインの3'側に配置されているカセット；及び逆転写、パッケージング、及び標的細胞への組み込みに必要なシス作用性配列を含む。
用語"RRVCAR"は、例えば、γレトロウイルス性GAGタンパク質；γレトロウイルス性POLタンパク質；γレトロウイルス性エンベロープ；マウス白血病ウイルス（MLV）、モロニーマウス白血病ウイルス（MoMLV）、ネコ白血病ウイルス（FeLV）、ヒヒ内因性レトロウイルス（BEV）、ブタ内因性ウイルス（PERV）、ネコ由来のレトロウイルスRD114、リスサルレトロウイルス、異種指向性マウス白血病ウイルス関連のウイルス（XMRV）、トリ細網内皮症ウイルス（REV）、またはγレトロウイルスポリヌクレオチド配列の3'末端にあるテナガザル白血病ウイルス（GALV）からの3'非翻訳領域（U3）及び反復領域（R）配列を含むγレトロウイルスRNAポリヌクレオチド、γレトロウイルスポリヌクレオチドの5'末端にあるMLV、MoMLV、FeLV、BEV、PERV、RD114、リスザルレトロウイルス、XMRV、REV、またはGALVからのR及び5'非翻訳領域（U5）配列、U5領域とU3領域の間に位置するMLV、MoMLV、FeLV、BEV、PERV、RD114、リスザルレトロウイルス、XMRV、REV、またはGALVからのgag核酸ドメイン、pol核酸ドメイン、及びenv核酸ドメイン；内部リボソーム侵入部位（IRES）、ミニプロモーター、または上流の2Aまたは2A様配列を含み、免疫賦活作用を有する生成物をコードする異種ポリヌクレオチドに作動可能に連結され、U3領域の5'側及びenv核酸ドメインの3'側に配置されているカセット；及び逆転写、パッケージング、及び標的細胞への組み込みに必要なシス作用性配列を含む複製ウイルスベクターを指す。該CARは、任意の数の抗原(例えば、癌抗原等)を標的とし、それと選択的に結合する、結合ドメインを含む。いくつかの例では、本開示は、"X"-RRVCARの表現を用いる。ここで、Xが、特定の抗原の名前または頭字語である(例えば、CD19-RRVCAR)。前記抗原は、本明細書に記載されるように、任意の数の異なる結合ドメインによって標的化され得る(例えば、scFv)。CAR構築物の調製に有用な種々の結合ドメインの配列は知られている(例えば、国際出願公開WO 2018/102795の表5を参照。その配列及び開示は参照により本明細書に組み込まれる)。
用語"scFv"は、軽鎖の可変領域を含む少なくとも1つの抗体断片及び重鎖の可変領域を含む少なくとも1つの抗体断片を含む融合タンパク質を指す。ここで、該軽鎖及び重鎖の可変領域は、例えば合成リンカー（例えば、短い可撓性ポリペプチドリンカー）を介して連続的に連結され、単一鎖ポリペプチドとして発現されうる。また、該scFvは、それが由来する無傷の抗体の特異性を保持する。特に明記しない限り、scFvは、いずれかの順序でのvL及びvH可変領域を有することができる。例えば、ポリペプチドのN末端及びC末端に関して、scFvは、vL-(リンカー)-vH、またはvH-(リンカー)-vLを含んでもよい。本開示では、scFvは、vL-(Gly-Ser-リンカー)-vHとしても記載されている。
用語"シグナル伝達ドメイン"は、二次情報伝達物質を生成することによって、または、そのような情報伝達物質に応答してエフェクターとして機能することによって、細胞内の情報を伝達し、規定されたシグナル伝達経路を介して細胞活性を調節するタンパク質の機能性領域を指す。
用語"被験者"は、免疫応答を誘発できる生物(例えば、任意の家畜化された哺乳動物またはヒト)を含むことを意図されている。
用語"T細胞"及び"Tリンパ球"は、交換可能であり、本明細書で同義的に使用される。その例には、ナイーブT細胞("リンパ球前駆体")、中央メモリT細胞、エフェクターメモリT細胞、幹メモリT細胞(Tscm)、iPSC由来T細胞、合成T細胞、またはそれらの組み合わせが含まれるが、これらに限定されない。
本明細書で使用される"治療"及び"治療する" は、治療処置及び予防措置の両方を指し、その目的は、標的となる病的状態を予防または減速（軽減）し、病状を予防し、有益な結果を追求または取得し、または、治療が最終的に成功しなくても、個人の状態を発症する可能性を低減させることである。治療を必要とするヒトには、既にその状態にあるヒト、その状態になりやすいヒト、またはその状態が防止されるヒトが含まれる。
本明細書で使用される"腫瘍"は、悪性か良性かにかかわらず、全ての腫瘍性細胞の成長と増殖、及び全ての前癌性及び癌性の細胞と組織を指す。
本開示は、in vivo vs. ex vivoでのCAR-T細胞を産生するための方法及び組成物を提供する。該組成物は、in vivoでT細胞または免疫細胞に組み込まれるキメラ抗原受容体(CAR)コード配列を含有する組換えベクター(例えば、ウイルスベクター)を含む。本開示の方法は、in vivoで(例えば、静脈内投与で)CARコード配列を担持する組換えベクターの導入を含む。
本開示は、レトロウイルス非複製ウイルス(RNV)または複製コンピテントウイルス(RRV)を用いて、in vivoで、患者リンパ球（例えば、T細胞）または他の免疫細胞へのキメラ抗原受容体（(CAR）をコードするベクターの静脈内送達を提供する。 従って、現在採用されている面倒なex vivo形質導入法を回避する。キメラ抗原受容体(CAR)を発現するT細胞は、CAR T細胞と呼ばれ、これは、合成非HLA制限ハイブリッド分子、（例えば、モノクローナル抗体からの外部標的抗原結合部位）、及び細胞内HLA制限エピトープ提示を認識する修飾または非修飾されたHLA制限従来型T細胞受容体サブユニットの両方を包含する。キメラ抗原受容体コード配列を含むRNVは、RNVCARと呼ばれる。CARを発現するRNVCARで遺伝子導入されたT細胞は、γCAR-T細胞RNVと呼ぶ。
本開示は、次を含む要素の特定に基づいている：(a) 任意に無血清及び/または浮遊培養中で、レトロウイルスベクタープロデューサーラインからの大量の高力価粗RNVCARを産生すること；(b) ベクターを医薬品として患者に安全にIV投与できるように、ベクターを精製して濃縮し、抗原性タンパク質汚染物質を排除すること；(c)ベクターのごく一部が患者のT細胞に取り込まれ、経時的にゆっくり減衰することを観察すること；(d) 標的を認識する特定のCAR T細胞がin vivoで増幅し、治療効果の達成を確認すること；(e)γレトロウイルスは複製細胞にのみ効果的に感染するため、IV投与は、血液中のアクセス可能な複製細胞の割合が大きいので、活性化されたT細胞の形質導入につながる。同じ論理は、顆粒球コロニー刺激因子(GCSF)で動員されたCD34造血幹細胞（A. Publicoverら, Brit. J. Haematology, 162: 107-111, 2013）のような特異的に刺激された/動員された細胞の標的化された形質導入を可能にする。以下を含むがこれらに限定されない種々の臨床的に使用されるT細胞刺激法により、in vivoでのベクター取り込みのため、T細胞の循環集団をさらに刺激することができる：はしか、ワクシニア、または一部のインフルエンザワクチン等の生または弱毒化ウイルスワクチンによるワクチン接種；サイトカイン刺激(IL2等);アレルギーパネルテスト、臨床的に許容されるヒト用量の様々なスーパー抗原、OKT3（ムロモナブ-CD3）等のモノクローナル抗体の投与。
RNVCARはまた、例えば、自己不活性化(SIN)構成で、遺伝子操作され、"安全性が改変された"ように、いくつかの標的細胞集団における挿入遺伝子活性化の可能性を低減させてもよい(Schambachら, 分子生物学の方法, 方法とプロトコル, 506：191-205, 2009)。種々の"SIN"構成は、当該技術分野において知られている。
"自己不活性化" (SIN)ベクターは、複製欠損ベクターを指す。例えば、U3領域として知られる3'LTRエンハンサー-プロモーター領域が（例えば、欠失または置換によって）改変されて、ウイルス複製の最初のラウンドを超えるウイルス転写を防ぐレトロウイルスまたはレンチウイルスベクター。これは、LTR U3領域がウイルス複製中に5'LTR U3領域のための鋳型として使用されるためであり、従って、ウイルス転写物はU3エンハンサー-プロモーターなしで作製することができないからである。さらなる実施形態では、該3'LTR は、U5領域が例えば理想的なポリ(A)配列で置換されるように改変される。3'LTR、5'LTR、または3'及び5'LTR両方 への改変のようなLTRへの改変もまた、本開示に含まれることに留意されたい。
5'LTR U3領域を異種プロモーターで置き換えて、ウイルス粒子の産生中にウイルスゲノムの転写を駆動することにより、追加の安全性の向上を提供することができる。使用できる異種プロモーターの例としては、例えば、ウイルス性サルウイルス40(SV40)(例えば、初期または後期)、サイトメガロウイルス(CMV)（例えば、ごく初期)、モロニーマウス白血病ウイルス(MoMLV)、ラウス肉腫ウイルス(RSV)、及びヘルペス単純ウイルス(HSV)(チミジンキナーゼ)プロモーターが含まれる。典型的なプロモーターは、Tatに非依存的に高レベルの転写を駆動することができる。ウイルス産生システムにおいて完全なU3配列が存在しないので、この置換により、複製能力のあるウイルスを生成するための組換えの可能性が減少する。特定の実施形態では、該異種プロモーターは、ウイルスゲノムが転写される様式の制御には他の利点を有する。例えば、該異種プロモーターは、誘導因子が存在する場合にのみウイルスゲノムの全部または一部の転写が起こるように、誘導性であり得る。誘導因子には、1つまたは複数の化学化合物、または宿主細胞が培養される温度またはpH等の生理学的条件が含まれるが、これらに限定されない。
遺伝子操作されたRNVCAR はまた、"コントロール"遺伝子を含有してもよい。例えば、これらに限定されないが、ヘルペスチミジンキナーゼ、プリンヌクレオシドホスホリラーゼ、シトシンデアミナーゼまたはニトロレダクターゼ、治療のエンドポイントが満たされた後、または臨床的に重要な副作用（例えば、自己抗原またはオフターゲット関連の有害事象、または潜在的に腫瘍をCAR T細胞に認識されないようにする腫瘍細胞の偶発的な伝達）が発生したときにCAR T細胞を削除するための、変異したFK506二量体化可能な尾を持つCas9ハイブリッド等の二量体化可能なデスまたはアポトーシス誘導タンパク質を含むプロドラッグ活性化遺伝子である。
遺伝子操作されたRNVCARはまた、"活性化増強"RNA発現修飾因子を含有してもよい。例えば、ノンコーディングRNAや一本鎖抗体、アフィマー等のタンパク質等である。これらは、PD-1、CTLA-4等のT細胞チェックポイント阻害剤または他の適切な免疫アクセサリー分子のアゴニストの発現を特異的に減少させる。このような実施形態では、該RNVは、患者のT細胞を形質導入し、それにより、CAR T細胞が、キメラ抗原受容体、シトシンデアミナーゼ等の"コントロール"遺伝子、及びPD-1転写産物を分解してPD-1タンパク質レベルを低下させるshRNAを発現する。
本開示では、複数の腫瘍関連抗原及び腫瘍新抗原または他の疾患関連抗原に対する複数のキメラ受容体が、複数の抗原及びエピトープに対するキメラ受容体を担持するRNVCARの混合物を使用することによって、静脈内に同時に送達されることが可能である。
T細胞へのキメラ抗原受容体のRNVCAR送達は、適応症に特異的な治療ではなく、個別化された癌または疾患プロファイリングと組み合わせて、適応症に関係なく、患者が発現する抗原及び新抗原に結合する可能性が最も高いキメラ受容体を選択してもよい。異なる抗原結合能力を有するキメラ受容体を静脈内送達する別個のRNVCARの能力は、元のCARエピトープを削除する選択的な圧力及び腫瘍または疾患の適応に続いて新しいCARを送達することを可能にする一時的な治療レジメンを可能にする。RNVCARは、チェックポイント阻害剤（例えば、抗CTLA4や抗PD-1等）、抗腫瘍回避標的薬（例えば、IDO-1阻害剤及び抗TGFβ）、及び/または既知の免疫調節効果を有する化学療法剤（例えば、テモゾロミド、シクロホスファミド及び5-FU）等の免疫療法エンハンサーと組み合わせて使用できる。
患者のT細胞へのキメラ受容体のRNV送達は、RNVCAR静脈内注射時にT細胞活性化アジュバントを使用することによって増強され得る(例えば、3-O-デサシル-4'-モノホスホリルリピドA(MPL)及びインターフェロンγ)。RNVはリンパ管に送達され、適切な場合には、腫瘍関連及び新抗原の存在が予想される固形腫瘍の適応症の流入領域リンパ節に送達される場合がある。
また、RNVを偽型化し、T細胞の形質導入の効率を高め(例えば、GALV、アンホトロピックenvまたは麻疹ウイルス糖タンパク質H及びF)、または、T細胞サブタイプの特異性を誘導し(例えば、キメラC-HIVエンベロープ偽型またはMLV-10A1エンベロープを有するCD8 T細胞を使用するメモリCD4 T細胞)てもよい。
レトロウイルス非複製ウイルス(RNV)を用いて患者T細胞に直接キメラ抗原受容体を送達することによって、現在使用されている煩雑なex vivo形質導入法は回避できる(表3を参照)。
表3：レトロウイルスベクターを用いた自家細胞のin vivo及びex vivo形質導入工程の比較

Figure 2022516710000014
Figure 2022516710000015
一実施形態では、目的の抗原/同族体(例えば、CD19)を標的とするコーディングドメインを含むRNVCARは、ヒト患者T細胞への薬学的に許容される製剤としてin vivoで送達される。例えば、CD19-RNVCARは、ヒトT細胞への送達のために血流中に静脈内注射される。該静脈内送達は、急速注射、または、数分や数時間にわたるゆっくりとした点滴で行うことができる。形質導入されたT細胞を獲得する頻度及び可能性を増加させるために、数日間にわたって注射を繰り返すことができる。in vivoでのRNVCARベクター取り込みのため、T細胞の集団は、種々のT細胞刺激法（はしか、ワクシニア、または一部のインフルエンザワクチン等の生ウイルスワクチンによるワクチン接種；ヒトワクチンで現在承認されているアジュバント賦形剤の追加、細菌タンパク質を刺激するT細胞（直接及び間接）、サイトカイン刺激（IL2等）、アレルギーパネルテストの投与、臨床的に許容されるヒト用量の様々なスーパー抗原、OKT3（Muromonab-CD3）等のモノクローナル抗体、及びシクロホスファミド等の薬物を用いた骨髄枯渇）でさらに予備刺激することができる。患者T細胞へのRNVCARの送達は、RNVCARの静脈内注射時にT細胞活性化アジュバントの使用によって強化されうる（例えば、3-O-デサシル-4'-モノホスホリルリピドA（MPL）及びインターフェロンγ）。これらのRNVCARは、チェックポイント阻害剤（例えば、抗CTLA4及び抗PD-1）、抗腫瘍回避標的薬（例えば、IDO-1阻害剤及び抗TGFβ）、既知の免疫調節効果を有する化学療法剤（例えば、テモゾリミド及び5-FU）、または個別化された新抗原ワクチン等の免疫療法エンハンサーと組み合わせて使用できる。
また、RNVを偽型化し、T細胞の形質導入の効率を高め(例えば、GALV、アンホトロピックenvまたは麻疹ウイルス糖タンパク質H及びF)、または、T細胞サブタイプの特異性を誘導し(例えば、キメラC-HIVエンベロープ偽型またはMLV-10A1エンベロープを有するCD8 T細胞を使用するメモリCD4 T細胞)てもよい。これらの静脈内方法を用いたRNVCAR（例えば、CD19-RNVCAR）の送達は、該RNVCARの結合ドメインによって特異的に認識される抗原を発現する細胞や微生物等を標的にして破壊する患者T細胞を産生する（例えば、 CD19-RNVCARで形質導入されたT細胞は、CD19+細胞を標的にして破壊する）。
別の実施形態では、RNVCARはリンパ管に送達され、適切な場合は、腫瘍関連及び新抗原の存在が予想される固形腫瘍の適応症の流入領域リンパ節に送達される。リンパ節の直接注射は、上記のアジュバントの使用及び組み合わせで同様に増強される。
本方法は、ヒトT細胞へのRNVCAR(例えば、CD19-RNVCAR)送達のさらに別の実施形態では、本法は、有害事象の場合、または治療の終わりに形質導入細胞を枯渇させる方法として、単純ヘルペスウイルス-チミジンキナーゼ（HSV-TK）、酵母シトシンデアミナーゼ（CD）または他の自殺遺伝子またはプロドラッグ活性化因子システムのRNVCARへの添加を含む。 例えば、CD19-CARをコードするRNVCARベクターは、TK、CD、または他の"コントロール"遺伝子で遺伝子操作される(例えば、Tocagenの改変された酵母シトシンデアミナーゼ、米国特許第8,722,867号を参照、その開示は参照により本明細書に組み込まれる。)。該改変されたRNVCARは、上述したのと同じ方法/プロセスを介して送達される。RNVCAR（CD19-RNVCAR等）は、PETによるHSV-TK酵素活性のイメージング用のレポータープローブとして放射性標識ピリミジン（チミジン）及びプリン（アシクログアノシン）誘導体を使用して腫瘍まで追跡できる。HSV-TKやCD等のプロドラッグ活性化酵素を含めることの別の利点としては、腫瘍細胞の一部もCARベクターで形質導入され、この事象によって形質導入された腫瘍細胞がT細胞のCARに反応しなくなった場合（M. Ruellaら, Nat. Med., 24:1499-1503, 2018）、このような腫瘍細胞は、それぞれバラシクロビルまたは5-フルオロシトシンのようなプロドラッグのコースによって自動的に排除されるであろう。
本開示は、本明細書で同定される抗原のいずれかを標的とするCARをコードする核酸分子を含む組換え核酸構築物を提供する。一実施形態では、前記核酸配列は、CAR構築物にクローニングされた配列番号:3を含むDNAプラスミド構築物を含む。例えば、配列番号:18～22は、配列番号:3に由来し、CD19を標的とする種々のCAR構築物を含有するプラスミド配列を提供する。
別の実施形態では、本開示は、ウイルスキャプシドにパッケージングされたRNA配列を含むRNVCARを提供する。該RNVCARは、CARを含み、配列番号:3を含有する核酸構築物をパッケージング細胞株に遺伝子導入し、該細胞株を培養してRNVCARを産生することにより得られる。該RNVCARは、所望のCAR構築物(例えば、所望の抗原を標的とするCAR構築物)をコードするRNA配列を含む配列番号:12を含むであろう。
本開示はまた、核酸配列またはRNV、RNVCAR、または本明細書に記載の自殺／プロドラッグ活性化因子配列を含むRNVをコードする配列を含むベクターを提供する。一実施形態では、本開示は、単一のベクターによってコードされるRNVCAR構築物を提供する。別の実施形態では、本開示は、１つ以上のベクターを提供する。例えば、CARをコードする1つのベクター、及び自殺/プロドラッグ活性化遺伝子をコードするもう1つのベクター。一実施形態では、前記ベクターは、DNAベクター、RNAベクター、プラスミド、γ-レトロウイルスベクターから選択される。一実施形態では、前記ベクターは、LTR及びパッケージング配列を含む損傷したγレトロウイルスベクターである。
いくつかの異なる方法のいずれかを用いて、DNA及び/またはRNAを標的細胞に導入することができる。例えば、市販の方法には、電気穿孔法(Amaxa Nucleofector-II (Amaxa Biosystems, Cologne, Germany))、(ECM 830(BTX)(Harvard Instruments, Boston, Mass)、またはGene Pulser II (BioRad, Denver, Colo.)、Multiporator (Eppendort、Hamburg Germany)、リポフェクション、ポリマーカプセル化、ペプチド媒介遺伝子導入、または"遺伝子銃"等の微粒子銃送達システムを使用すること(例えば、Nishikawaら, Hum Gene Ther., 12(8)：861-70(2001)を参照)、またはマイクロ流体装置を用いて細胞膜に一時的な摂動を引き起こすことによる(例えば、特許出願WO 2013/059343 Al及びPCT/US2012/060646を参照)カチオン性リポソーム媒介遺伝子導入が含まれるが、これらに限定されない。
別の実施形態では、例えば、過剰増殖性の障害または状態（例えば、固形腫瘍、軟部組織腫瘍、血液癌、または転移性病変を含むが、これらに限定されない癌）を軽減または改善することのような被験者を治療する方法が提供される。本明細書で使用される用語"癌"は、組織病理学的タイプまたは浸潤の段階に関係なく、すべてのタイプの癌性増殖または発癌過程、転移性組織または悪性形質転換された細胞、組織、または器官を含むことを意味する。例示的な固形腫瘍には、乳房、肝臓、肺、脳、リンパ球、胃腸（例えば、結腸）、泌尿生殖器（例えば、腎臓、尿路上皮細胞）、前立腺、咽頭に影響を与える様々な臓器系の悪性腫瘍、例えば、腺癌、肉腫、及び癌腫が含まれる。腺癌には、ほとんどの結腸癌、直腸癌、腎細胞癌、肝臓癌、肺の非小細胞癌、小腸の癌、及び食道癌等の癌が含まれる。一実施形態では、癌は黒色腫、例えば、進行期の黒色腫である。上記癌の転移性病変は、本開示の方法及び組成物を使用して治療または予防することもできる。治療または予防できる他の癌の例には、膵臓癌、骨癌、皮膚癌、皮膚または眼内悪性黒色腫、子宮癌、卵巣癌、直腸癌、頭頸部癌、肛門部癌、胃癌、精巣癌、子宮癌、ファロピアン癌管、子宮内膜の癌、頸部の癌、膣の癌、外陰部の癌、ホジキン病、非ホジキンリンパ腫、食道の癌、小腸の癌、内分泌系の癌、甲状腺、副甲状腺の癌、副腎の癌、軟組織の肉腫、尿道の癌、陰茎の癌、急性骨髄性白血病を含む慢性または急性白血病、慢性骨髄性白血病、急性リンパ芽球性白血病、慢性リンパ球性白血病、小児期の固形腫瘍、リンパ球性リンパ腫、膀胱の癌、腎臓または尿管の癌、腎骨盤の癌、中枢神経系（CNS）の新生物、プリム中枢性CNSリンパ腫、腫瘍血管新生、脊髄腫瘍、脳幹神経膠腫、下垂体腺腫、カポジ肉腫、類表皮癌、扁平上皮癌、T細胞リンパ腫、アスベストによって誘発される癌を含む環境誘発癌、及びこれらの癌の組み合わせが含まれる。本法は、癌細胞上に存在する抗原に特異的に結合するCARを含む本開示のRNVCARを投与することを含む。
増殖を阻害できる例示的な癌には、典型的には免疫療法に応答する癌が含まれる。治療する癌の非限定的な例には、腎臓癌(例えば、腎明細胞癌)、黒色腫（例えば、転移性悪性黒色腫）、乳癌、前立腺癌（例えば、ホルモン抵抗性前立腺腺癌）、結腸癌、及び肺癌（例えば、非小細胞肺癌）が含まれる。
以下の実施例は、開示される本発明をさらに例示するために提供されるが、本発明を限定するものではない。本開示の観点から、他の方法または以下の実施例の変形は、当業者には容易に明らかであろう。
In vivoでの非複製ウイルスによる送達のためのマウスCD19キメラ抗原受容体構築物の設計
非複製ベクター(RNV)を、キメラ抗原受容体(CAR)を含むように構築した。最初の例では、マウスCD19を標的としてRNVCARを開発した。ラットハイブリドーマクローン1D3から構築された一本鎖可変フラグメント(scFv)を用いて該マウスCD19の標的を実現した。該scFvには、1D3可変重鎖(VH)と、それに続く1D3可変軽鎖（VL)へのGSリンカーが含まれていた。該マウスを標的としたscFvのアミノ酸配列を表4に示す。該マウスCD19 scFvをコードするヌクレオチドは、ウイルスベクターの発現と安定性に最も適していると考えられる任意のコドンであってもよい。1D3 scFv(VH-GS-VL)をコードするヌクレオチド配列は、以下のいずれかから発現させることができる：レトロウイルスベクタープロモーター(例えば、LTR）、内部プロモーター、内部リボソーム侵入部位(IRES)(例えば、WO 2010036986を参照、参照により本明細書に組み込まれる）、または該レトロウイルスベクターにおけるタンパク質融合法（例えば、フューリンペプチダーゼ部位、または2Aカセットの使用；例えば、米国特許公開第2018/0251786A1号を参照、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる）。該scFvの後には、表5に示すように、ヒトCD8ヒンジドメイン、マウスCD8ヒンジドメイン、またはマウスCD28ヒンジドメインのいずれかをコードするヌクレオチド配列がインフレームで続いた。該ヒンジドメインの後には、表5に示すように、ヒトCD8膜貫通ドメイン(TMD）、マウスCD8 TMD、またはマウスCD28 TMDのいずれかをコードするヌクレオチド配列がインフレームで続いた。該膜貫通ドメインの後には、表5に示すように、ヒト4-1BB細胞内シグナル伝達ドメイン(ICD）、マウス4-1BB ICD、またはマウスCD28 ICDのいずれかをコードするヌクレオチド配列がインフレームで続いた。該細胞内シグナル伝達ドメインの後には、表5に示すように、ヒトCD3ζ細胞内シグナル伝達ドメイン(ICD）、またはマウスCD3ζICDのいずれかをコードするヌクレオチド配列がインフレームで続いた。次に、RNVベクター内の完全なマウスCD19を標的としたCAR構築物を静脈内(IV)または脾臓内に送達して、T細胞における最適なCAR送達、形質導入、及び発現を行うことができる。
表4
Figure 2022516710000016
表5

Figure 2022516710000017
Figure 2022516710000018
マウスにおけるIV投与後のRNVによる免疫細胞の感染
IV投与によるRNV感染の可能性を評価するために、Balb/cマウスにおいて、緑色蛍光タンパク質(RNV-GFP)を発現するRNVを評価した。RNVを、1日当たり1E7または1E8 TU(力価単位)の投与量で、100 mg/kgのシクロホスファミドで前処理する条件及びその前処理をしない条件で、3日間連続してIV投与した。RNV-GFPによる感染は、RNV-GFPの初回IV投与の7日後に末梢血単核細胞(PBMC)中で測定した(図6)。3E7 TUの総投与量では、CD45+ PBMCの0.045％がGFP(GFP+)に陽性であった。GFP+、RNV感染(GP+)CD45+細胞は、シクロホスファミド前処理で0.137％に増加した。3E8 TUの総投与量では、CD45+ PBMCの3.08％及び2.02％(シクロホスファミド前処理あり)がRNV-GFPによるGFP感染に陽性であった。
PBMC集団のサブセット:CD11b+、CD4+、CD8+、及びCD19+においてRNV-GFP感染を評価した(図7)。RNV-GFPの低投与量(総投与量：3E7 TU)では、各PBMC集団の0.5%未満はGFP+であった。3E7 TUの投与にシクロホスファミド前処理を加えることは、一般に、各集団のGFP+細胞の倍増、約1％GFP+をもたらした。RNV-GFPの高投与量(総投与量：3E3 TU)では、評価された各PBMC集団の約10％がGFP+であった。3E8 TUの投与にシクロホスファミド前処理を加えることは、評価された各PBMC集団におけるGFP+やRNV感染細胞の割合に明らかな影響を与えなかった。
B細胞リンパ腫のマウスモデルの処理
Balb/cマウスにおけるA20リンパ腫株(Kueberuwa ら, J. Vis. Exp., (140), e58492, 2018, doi：10.3791/58492, 2018) をモデルとして用いて、初期マウス標的構築物であるmCD19-RNVCAR(RNV-1D3CAR) のin vivo感染の有効性を評価した：マウス抗CD19 scFv 1D3、続いてマウスCD8膜貫通ドメイン、続いてマウス4-1BB細胞内ドメイン、続いてマウスCD3ζ細胞内ドメイン。簡単に説明すると、A20リンパ腫細胞の移植の1日前に、6～8週齢のBALB/cマウスに100 mg/kgのシクロホスファミドを腹腔内(IP)投与した。シクロホスファミドの前処理により、有意なリンパ球枯渇が生じることはなく、リンパ節へのA20腫瘍の生着が可能になった。 0日目にA20 B細胞リンパ腫細胞をIV注入した(100μL中5E5細胞)。A20移植後5日目から、該ベクター、RNV-1D3CARを1日当たり1E7または1E8 TUの投与量で5日間連続して注入した。マウスを37日間モニターし、その生存を評価した。
高投与量のRNV-1D3CAR(5E8 TU)は、媒体処置対照群(RNVなし)または低投与量のRNV-1D3CAR(5E7、図8を参照）と比較して、A20リンパ腫腫瘍を有するマウスの生存の改善をもたらした。高投与量のRNV-1D3CARで処置されたマウスの生存率の改善は、mCD19-RNVCARベクターのIV投与がA20腫瘍の増殖をある程度制御することを示唆している。RNV-1D3CARのIV投与後に腫瘍制御が起こるためには、ベクターは循環T細胞に入る必要があり、mCD19-CARはこれらのT細胞の表面に発現する必要があり、次に、これらのT細胞は、該腫瘍（主にリンパ節）に帰巣する必要があり、最後に、T細胞の表面にあるmCD19-CARは、A20腫瘍細胞のCD19と結合し、A20腫瘍細胞の死滅を活性化する必要がある。
pBA9b-hCD19CARベクターの構築
pBA9b(配列番号:3)は、拡張されたパッケージング領域を含むMLVベースのレトロウイルス非複製ベクター(RNV)を提供する。
ヒトCD19を標的とする様々な一本鎖可変断片(scFv)、リーダー配列、ヒトCD8に由来のヒンジドメイン、ヒトCD8に由来の膜貫通ドメイン、ヒト4-1BBに由来の細胞内ドメイン、及びヒトCD3ζに由来のシグナル伝達ドメインの核酸配列をコドン最適化し、合成した(Genewiz Inc.)。本開示は、hCD19CARl(配列番号:13)、hCD19CAR2(配列番号:14)、hCD19CAR3(配列番号:15)、hCD19CAR4(配列番号：16)、及びhCD19CAR5(配列番号：17)と命名され、対応する制限酵素部位（"MCS"）でpBA9b主鎖(配列番号:3)に直接クローニングするために、それぞれ5'及び3'にNot I及びSal I制限酵素部位を含有する5つの合成されたhCD19CAR核酸配列を提供する。得られたプラスミドDNAは、pBA9b-hCD19CARl、pBA9b-hCD19CAR2、pBA9b-hCD19CAR3、pBA9b-hCD19CAR4、及びpBA9b-hCD19CAR5(それぞれ、配列番号:18、19、20、21及び22)と命名される。全ての構築物において、CD19-CAR発現はウイルスLTRプロモーターによって媒介される(図5A-B)。
非クローン性HAL2-hCD19CARベクター産生細胞株(VPCL)は、高いhCD19-RNVCARウイルス力価を産生する。
ウイルス産生、hCD19CAR発現を確認するため、非クローン性HAL2-hCD19CAR産生細胞を生成した。最初に293GP産生細胞において、一過性遺伝子導入よりVSV-Gで偽型化されたpBA9b-hCD19CARベクターを産生した。続いて、MLVベースのgag-pol及び4070A両向性エンベロープタンパク質を安定して発現するHAL2産生細胞を、感染多重度(MOI)100で形質導入した。293GP細胞は、MLVベースのgag-polを安定して産生するHEK293細胞から誘導した。HAL2は、VPCL HA-LBと同じ方法で構築されたヒトパッケージング細胞株である(Sheridanら, Mol.Ther.2000)。qPCR法（5-MLV-U3-B:5’-AGCCCACAACCCCTCACTC-3’(配列番号:120)、3-MLV-Psi:5’-TCTCCCGATCCCGGACGA-3’(配列番号:121)、プローブ: FAM-5’-CCCCAAATGAAAGACCCCCGCTGACG-3’-BHQ1(配列番号:122)）を用いて、安定的に形質導入された細胞から生成されたすべてのpBA9b-hCD19CARベクターをヒト前立腺PC-3細胞に滴定した。その結果は、HAL2細胞によって産生されたpBA9b-hCD19CARベクターの力価値が5E5～1E7 TU/mLの範囲であることを示している。
hCD19CARの発現を確認するために、2x105 hCD19CAR VPCL細胞をFITC結合組換えヒトCD19タンパク質(ACROBiosystem, CD9-HF2H2)で染色した。細胞をフローサイトメーター(Canto, BD Biosciences)で分析し、細胞表面のhCD19CARへのCD19の結合を、VPCL細胞表面でのhCD19CAR発現の代替の読み出しとして確認した。また、hCD19CAR発現を、免疫ブロット法で抗CD3ζ抗体(abcam, ab200591)によって確認した。
クローン性HAL2-hCD19CARベクター産生細胞株(VPCL)は、製造のために高いhCD19-RNVCARウイルス力価を産生する。
非クローン性VPCLからの細胞を、細胞数と限界希釈に基づいてウェルあたり1細胞を標的とする5枚の96ウェルプレートに播種した。高力価産生クローンのスクリーニングのため、MLV特異的プライマーとプローブを用いたqRT-PCRにより、単一細胞を含むことが確認されたウェルを75％の培養密度まで増殖した。次に、選択された高力価産生クローンを6ウェルプレートに移し、続いて、細胞増殖及び増殖特性、レトロウイルス成分の安定性、力価、ベクターコピー数、及び導入遺伝子発現を含むさらなる特性評価のためにT75フラスコに移した。5日間のプロファイリング力価アッセイで、T75フラスコ中で選択され、培養された上位25の高力価産生クローンは、E6～2E8 TU/mLのウイルス力価を産生した。続いて、無菌性とマイコプラズマ、細菌汚染、RCRの欠如、及びウシウイルスを含む安全性評価のパネル及びウシウイルスを含む他の外来性病原体のために選択され、試験された最高力価のクローンからワーキング細胞バンクを生成した。
同定された安全性試験のリストに加えて、ワーキング細胞バンク及びマスター細胞バンクの両方からのバイアルを試験し、細胞形態、生存率、ベクター配列の完全性、平均ベクターコピー数、細胞倍加時間、及び形質導入力価によるベクター産生を確認した。
Sheridanら,op.cit.及び米国特許第10,316,333号(参照により本明細書に組み込まれる)に記載の大規模な細胞発酵方法で、hCD19-RNVCAR臨床材料を製造し、その後、イオン交換カラム法、そして製剤緩衝液（ショ糖とリン酸塩またはトリス緩衝生理食塩水）中でのサイズ排除クロマトグラフィーにより精製し(J.S.Powellら, Blood, 102:2038-2045, 2003)、続いて、0.2ミクロンのフィルターで2～5 mlのバイアルに濾過した。典型的には、これにより5E7～lE9/ml TU/mlの精製され、製剤化されたベクター調製物が得られた。GMP材料の場合、これはスポンサーが承認したGMP委託製造施設で実施される。
M.C.Miloneら, Molecular Therapy, 17：1453-1464, 2009及びC.Sommerら, Mol Ther., 27：1126-1138, 2019に記載の方法で、培養されたヒトPBMCを用いて、該ベクターをin vitroでの有効性について試験し、そして、異種移植マウスモデル(例えば、Miloneら, supra)において、注入されたヒトPBMCを用いて、続いて該ベクターをIV投与してさらに試験した。
B細胞リンパ腫患者の治療
CD19+再発性または難治性B細胞急性リンパ芽球性白血病(ALL)の若い成人患者に、lxE5、lxE6、lxE7、lxE8、lxE9、及びlxE10 TU/kgベクターの用量でIV投与した。
高用量コホートでは、3ヶ月で総寛解率は約75%であり、治療に応答した全ての患者は、フローサイトメトリーで評価されるように、最小残存病変に対して陰性であった。事象のない生存率及び総生存率は、6ヶ月でほとんどそれぞれ60%及び90%を超え、12ヶ月でほとんど35%及び60%を超えた。その正確な数値は、患者の初期状態に依存するが、MaudeらがN. Eng. J. Med., 378：439-449, 2018に記載のex vivo治験中の若い成人と同等であった。有用性の総合基準として、3か月での寛解率は>20%である。
本開示のいくつかの実施形態について説明した。しかし、本開示の主旨及び範囲から逸脱することなく、様々な改変はなされ得ることが理解されるであろう。従って、他の実施形態は下記請求項の範囲内である。

Claims (50)

  1. 被験者に投与するための医薬組成物であって、免疫賦活作用を有する生成物をコードする異種ポリヌクレオチドを含み、前記被験者の血液細胞に形質導入し、または組み込むウイルスベクターを含有する、医薬組成物。
  2. 前記被験者が、哺乳動物である、請求項1に記載の医薬組成物。
  3. 前記哺乳動物が、ヒトである、請求項2に記載の医薬組成物。
  4. 前記組成物が、腹腔内に投与される、請求項1に記載の医薬組成物。
  5. 前記組成物が、血管内に投与される、請求項1に記載の医薬組成物。
  6. 前記ウイルスベクターが、レトロウイルスベクターである、請求項1に記載の医薬組成物。
  7. 前記レトロウイルスベクターが、γレトロウイルスベクター、βレトロウイルスベクター、αレトロウイルスベクター、レンチウイルスベクター、及び泡沫状ウイルスベクターからなる群から選択される、請求項6に記載の医薬組成物。
  8. 前記レトロウイルスベクターが、複製レトロウイルスベクター(RRV)である、請求項7に記載の医薬組成物。
  9. 前記RRVが、γレトロウイルス性GAGタンパク質；γレトロウイルス性POLタンパク質；γレトロウイルス性エンベロープ；マウス白血病ウイルス（MLV）、モロニーマウス白血病ウイルス（MoMLV）、ネコ白血病ウイルス（FeLV）、ヒヒ内因性レトロウイルス（BEV）、ブタ内因性ウイルス（PERV）、ネコ由来のレトロウイルスRD114、リスサルレトロウイルス、異種指向性マウス白血病ウイルス関連のウイルス（XMRV）、トリ細網内皮症ウイルス（REV）、またはγレトロウイルスポリヌクレオチド配列の3'末端にあるテナガザル白血病ウイルス（GALV）からの3'非翻訳領域（U3）及び反復領域（R）配列を含むγレトロウイルスRNAポリヌクレオチド、γレトロウイルスポリヌクレオチドの5'末端にあるMLV、MoMLV、FeLV、BEV、PERV、RD114、リスザルレトロウイルス、XMRV、REV、またはGALVからのR及び5'非翻訳領域（U5）配列、U5領域とU3領域の間に位置するMLV、MoMLV、FeLV、BEV、PERV、RD114、リスザルレトロウイルス、XMRV、REV、またはGALVからのgag核酸ドメイン、pol核酸ドメイン、及びenv核酸ドメイン；内部リボソーム侵入部位（IRES）、ミニプロモーター、または上流の2Aまたは2A様配列を含み、免疫賦活作用を有する生成物をコードする異種ポリヌクレオチドに作動可能に連結され、U3領域の5'側及びenv核酸ドメインの3'側に配置されているカセット；及び逆転写、パッケージング、及び標的細胞への組み込みに必要なシス作用性配列を含む、請求項8に記載の医薬組成物。
  10. 前記RRVが、MLVから遺伝子操作される、請求項9に記載の医薬組成物。
  11. 前記ウイルスベクターが、非複製ウイルスベクター(RNV)である、請求項7に記載の医薬組成物。
  12. 前記RNVが、
    エンベロープタンパク質及び脂質膜を含むエンベロープ；
    前記エンベロープ内に含まれ、5'～3'にヌクレオチド1～1050の配列番号:12、またはそれと少なくとも85%同一である配列を含む核酸；
    免疫賦活作用を有する生成物をコードするRNA配列；及び
    ヌクレオチド1101～1662の配列番号:12、またはそれと少なくとも85%同一である配列
    を含み、前記RNVが、分裂細胞に感染することができ、前記免疫賦活作用を有する生成物をコードするRNA配列が、前記分裂細胞に組み込まれる、
    請求項11に記載の医薬組成物。
  13. 前記免疫賦活作用が、免疫介在活性である、請求項1～12のいずれか1項に記載の医薬組成物。
  14. 前記血液細胞が、T細胞またはT細胞前駆体である、請求項1～12のいずれか1項に記載の医薬組成物。
  15. 前記異種ポリヌクレオチドが、キメラ抗原受容体(CAR)またはCAR様分子をコードする、請求項1～12のいずれか1項に記載の医薬組成物。
  16. 前記CARまたはCAR様分子が、抗原結合ドメイン、任意のスペーサー、膜貫通ドメイン、及び任意の細胞内ドメインを含む、請求項15に記載の医薬組成物。
  17. 前記抗原結合ドメインが、非免疫グロブリン結合ドメインである、請求項16に記載の医薬組成物。
  18. 前記非免疫グロブリン結合ドメインが、足場タンパク質を含む、請求項17に記載の医薬組成物。
  19. 前記膜貫通ドメインが、CD28膜貫通ドメインである、請求項16に記載の医薬組成物。
  20. 前記膜貫通ドメインが、CD8膜貫通ドメインである、請求項16に記載の医薬組成物。
  21. 前記CD8膜貫通ドメインが、配列番号:lと98%～100%同一である配列によってコードされる、請求項20に記載の医薬組成物。
  22. 前記抗原結合ドメインが、scFvまたは抗体断片を含む、請求項16に記載の医薬組成物。
  23. 前記任意のスペーサーが、配列番号:2と少なくとも98%同一である配列によってコードされる、請求項16に記載の医薬組成物。
  24. 前記任意の細胞内ドメインが、CD3ζドメインを含む、請求項16に記載の医薬組成物。
  25. 前記任意の細胞内ドメインが、41BBまたはCD28細胞内ドメインを含む、請求項16に記載の医薬組成物。
  26. 前記41BBドメインが、配列番号:5と98%～100%同一である配列によってコードされる、請求項25に記載の医薬組成物。
  27. 前記CD3ζドメインが、配列番号:4と少なくとも98%同一である配列によってコードされる、請求項24に記載の医薬組成物。
  28. 前記抗原結合ドメインが、CD5、CD19；CD123；CD22；CD30；CD171；CS1(CD2サブセット1、CRACC、SLAMF7、CD319、及び19A24とも呼ばれる)；C型レクチン様分子-1(CLL-1またはCLECL1)；CD33；表皮成長因子受容体変異体III(EGFRviii)；ガングリオシドG2(GD2)；ガングリオシドGD3(aNeu5Ac(2-8)aNeu5Ac(2-3)bDGalp(l-4)bDGlcp(l-l)Cer)；TNF受容体ファミリーメンバーB細胞成熟(BCMA)；Tn抗原((Tn Ag)または(GalNAcα-Ser/Thr))；前立腺特異的膜抗原(PSMA)；受容体チロシンキナーゼ様オーファン受容体1(ROR1)；Fms様チロシンキナーゼ3(FLT3)；腫瘍関連糖タンパク質72(TAG72)；CD38；CD44v6；急性白血病またはリンパ腫で発現されるが、造血前駆細胞には発現されないグリコシル化CD43エピトープ、非造血性癌に発現されるグリコシル化 CD43 エピトープ、発癌性抗原(CEA)；上皮細胞接着分子(EPCAM)；B7H3(CD276)；KIT(CD117)；インターロイキン-13受容体サブユニットα-2(IL-13Ra2またはCD213A2)；メソテリン；インターロイキン 11 受容体α(IL-llRa)；前立腺幹細胞抗原(PSCA)；プロテアーゼセリン21(テステシンまたはPRSS21)；血管内皮増殖因子受容体2(VEGFR2)；ルイス(Y)抗原；CD24；血小板由来増殖因子受容体β(PDGFR-β)；ステージ特異的胚抗原-4(SSEA-4)；CD20；フォレート受容体α(FRaまたはFR1)；葉酸受容体β(FRb)；受容体チロシンタンパク質キナーゼERBB2(Her2/neu)；細胞表面関連のムチン1(MUC1)；表皮成長因子受容体(EGFR)；神経細胞接着分子(NCAM)；プロスターゼ；前立腺酸性ホスファターゼ(PAP)；変異された伸長因子2(ELF2M)；エフリンB2；線維芽細胞活性化タンパク質α(FAP)；インスリン様成長因子1受容体(IGF-I受容体)、カルボニックアンヒドラーゼIX(CA1X)；プロテアソーム(プロサム、マクロペイン)サブユニット、β型、9(LMP2)；糖タンパク質100(gpl00)；ブレークポイントクラスター領域(BCR)及びAbelsonマウス白血病ウイルス発癌遺伝子ホモログ 1(Abl)(bcr-abl)からなる癌遺伝子融合タンパク質；チロシナーゼ；エフリン型A受容体2(EphA2)；シアリルルイス接着分子(sLe)；ガングリオシドGM3(aNeu5Ac(2-3)bDClalp(l-4)bDGlcp(l-1)Cer)；トランスグルタミナーゼ5(TGS5)；高分子量メラノーマ関連抗原(HMWMAA)；o-アセチル-GD2ガングリオシド(OAcGD2)；腫瘍内皮マーカー1(TEM1/CD248);腫瘍内皮マーカー7関連(TEM7R)；クローディン6(CLDN6)；甲状腺刺激ホルモン受容体(TSHR)；Gタンパク質共役型受容体クラスC群5、メンバーD(GPRC5D)；染色体Xオープンリーディングフレーム61(CXORF61)；CD97；CD179a；未分化リンパ腫キナーゼ(ALK)；ポリシアル酸；胎盤特異的1(PLAC1)；グロボHグリコセラミドの六糖部分(GloboH)；乳腺分化抗原(NY-BR-1)；ウロプラキン2(UPK2)；A型肝炎ウイルス細胞受容体1(HAVCR1)；アドレナリン受容体β3(ADRB3)；パネキシン3(PANX3)；Gタンパク質共役型受容体20(GPR20)；リンパ球抗原6複合体、遺伝子座K 9(LY6K)；嗅覚受容体51E2(OR51E2)；TCRγ代替リーディング フレーム タンパク質 (TARP)；ウィルムス腫瘍タンパク質 (WT1);癌/精巣抗原1(NY-ESO-1)；癌/精巣抗原2(LAGE-la)；メラノーマ関連抗原1(MAGE-A1)；染色体12pに位置するETSトランスロケーション変異遺伝子6（ETV6-AML）；精子タンパク質17(SPA17)；X抗原ファミリー、メンバー1A(XAGE1)；アンジオポエチン結合細胞表面受容体2(Tie 2)；メラノーマ癌精巣抗原-1(MAD-CT-1)；メラノーマ癌精巣抗原-2(MAD-CT-2)；Fos関連抗原1；腫瘍タンパク質p53(p53)；p53変異体；プロスタイン；サバイビン；テロメラーゼ；前立腺癌腫瘍抗原-1(PCT A-lまたはガレクチン8)、T細胞1によって認識されるメラノーマ抗原(MelanAまたはMARTI)；ラット肉腫(Ras)突然変異体；ヒトテロメラーゼ逆転写酵素(hTERT)；肉腫トランスロケーションブレークポイント；アポトーシスのメラノーマ阻害剤(ML-IAP)；ERG (膜貫通プロテアーゼ、セリン2(TMPRSS2)ETS融合遺伝子)；N-アセチルグルコサミニル-トランスフェラーゼV(NA17)；ペアボックスタンパク質Pax-3(PAX3)；アンドロゲン受容体；サイクリンBl；v-mycトリ骨髄球腫症ウイルス腫瘍遺伝子神経芽細胞腫由来のホモログ(MYCN)；RasホモログファミリーメンバーC(RhoC)；チロシナーゼ関連タンパク質2(TRP-2)；チトクロームP450 1B 1(CYP1B 1)；CCCTC-結合因子(亜鉛フィンガータンパク質)様(BORIS, Brother of the Regulator of Imprinted Site)、T細胞3によって認識された扁平上皮細胞癌抗原(SART3)；ペアボックスタンパク質Pax-5(PAX5)、プロアクロシン結合タンパク質sp32(OY-TES1)；リンパ球特異的タンパク質チロシンキナーゼ(LCK)；キナーゼアンカータンパク質4(AKAP-4)；滑膜肉腫、Xブレークポイント2(SSX2)；最終糖化産物の受容体(RAGE-1)；腎ユビキタス1(RU1)；腎ユビキタス2(RU2)；レグマイン；ヒト乳頭腫ウイルスE6(HPV E6)；ヒト乳頭腫ウイルスE7(HPV E7)；腸管カルボキシルエステラーゼ；熱ショックタンパク質70-2変異(mut hsp70-2)；CD79a；CD79b；CD72；白血球関連免疫グロブリン様受容体1(LAIR1))；IgA受容体のFc断片(FCARまたはCD89)；白血球免疫グロブリン様受容体サブファミリーAメンバー2(LILRA2)；CD300分子様ファミリーメンバーf(CD300LF)；C型レクチンドメインファミリー12メンバーA(CLEC12A)；骨髄間質細胞抗原2(BST2)；EGF様モジュールを含むムチン様ホルモン受容体様2(EMR2)；リンパ球抗原75(LY75)；グリピカン-3(GPC3)；Fc受容体様5(FCRL5)；免疫グロブリンλ様ポリペプチド1(IGLL1)、MPL、ビオチン、c-MYCエピトープタグ、CD34、LAMP1 TROP2、GFRα4、CDH17、CDH6、NYBR 1、CDH19、CD200R、Slea(CA19.9；シアリルルイス抗原)；フコシル-GMl、PTK7、gpNMB、CDH1-CD324、DLL3、CD276/B7H3、ILllRa、IL13Ra2、CD179b-IGL11、TCRγ-δ、NKG2D、CD32(FCGR2A)、Tn ag、Timl-/HVCR1、CSF2RA(GM-CSFR-α)、TGFβR2、Lews Ag、TCR-β1鎖、TCR-β2鎖、TCR-γ鎖、TCR-δ鎖、FITC、黄体形成ホルモン受容体 (LHR)、卵胞刺激ホルモン受容体(FSHR)、ゴ等トロピンホルモン受容体(CGHRまたはGR)、CCR4、GD3、SLAMF6、SLAMF4、HIV1エンベロープ糖タンパク質、HTLVl-Tax、CMV pp65、EBV-EBNA3c、KSHV K8.1、KSHV-gH、インフルエンザAヘマグルチニン(HA)、GAD、PDL1、グアニル酸シクラーゼC(GCC)、デスモグレイン3に対する自己抗体(Dsg3)、デスモグレイン1に対する自己抗体 (Dsg1)、HLA、HLA-A、HLA-A2、HLA-B、HLA-C、HLA-DP、HLA-DM、HLA-DOA、HLA-DOB、HLA-DQ、HLA-DR、HLA-G、IgE、CD99、Ras G12V、組織因子1(TF1)、AFP、GPRC5D、クローディン18.2(CLD18A2またはCLDN18A.2)、P-糖タンパク質、STEAP1、Liv1、ネクチン-4、クリプト、gpA33、BST1/CD157、低透過性塩化物チャンネル、及びTNT抗体によって認識される抗原からなる群から選択される抗原に特異的に結合する、請求項16に記載の医薬組成物。
  29. 前記ウイルスベクターが、自己不活性化核酸配列(SIN)を含む、請求項1に記載の医薬組成物。
  30. 前記ウイルスベクターが、配列番号:18、19、20、21、及び22からなる群から選択される配列の発現によって産生される、請求項1に記載の医薬組成物。
  31. エンベロープタンパク質及び脂質膜を含むエンベロープ；
    前記エンベロープ内に含まれ、5'～3'にヌクレオチド1～1050の配列番号:12、またはそれと少なくとも85%同一である配列を含む核酸；
    キメラ抗原受容体(CAR)をコードするRNA配列；及び
    ヌクレオチド1101～1662の配列番号:12、またはそれと少なくとも85%同一である配列
    を含み、前記RNVが、分裂細胞に感染することができ、前記キメラ抗原受容体をコードするRNA配列が、前記分裂細胞に組み込まれる、
    非複製ウイルスベクター。
  32. 前記CARが、抗原結合ドメイン、任意のスペーサー、膜貫通ドメイン、及び任意の細胞内ドメインを含む、請求項31に記載のRNVCAR。
  33. 前記膜貫通ドメインが、CD28膜貫通ドメインである、請求項32に記載のRNVCAR。
  34. 前記膜貫通ドメインが、CD8膜貫通ドメインである、請求項32に記載のRNVCAR。
  35. 前記CD8膜貫通ドメインが、配列番号:lと98%～100%同一である配列によってコードされる、請求項34に記載のRNVCAR。
  36. 前記抗原結合ドメインが、scFv、または抗体断片、または非免疫グロブリン結合ドメインを含む、請求項32に記載のRNVCAR。
  37. 前記任意のスペーサーが、配列番号:2と少なくとも98%同一である配列によってコードされる、請求項32に記載のRNVCAR。
  38. 前記細胞内ドメインが、CD3ζドメインを含む、請求項32に記載のRNVCAR。
  39. 前記細胞内ドメインが、41BBまたはCD28細胞内ドメインを含む、請求項32に記載のRNVCAR。
  40. 前記41BBドメインが、配列番号:5と85%～100%同一である配列によってコードされる、請求項39に記載のRNVCAR。
  41. 前記CD3ζドメインが、配列番号:4と少なくとも98%同一である配列によってコードされる、請求項38に記載のRNVCAR。
  42. 前記キメラ抗原受容体をコードするRNA配列が、配列番号:13～17のいずれか1つを含み、TがUである、請求項31に記載のRNVCAR。
  43. 前記抗原結合ドメインが、CD5、CD19；CD123；CD22；CD30；CD171；CS1(CD2サブセット1、CRACC、SLAMF7、CD319、及び19A24とも呼ばれる)；C型レクチン様分子-1(CLL-1またはCLECL1)；CD33；表皮成長因子受容体変異体III(EGFRviii)；ガングリオシドG2(GD2)；ガングリオシドGD3(aNeu5Ac(2-8)aNeu5Ac(2-3)bDGalp(l-4)bDGlcp(l-l)Cer)；TNF受容体ファミリーメンバーB細胞成熟(BCMA)；Tn抗原((Tn Ag)または(GalNAcα-Ser/Thr))；前立腺特異的膜抗原(PSMA)；受容体チロシンキナーゼ様オーファン受容体1(ROR1)；Fms様チロシンキナーゼ3(FLT3)；腫瘍関連糖タンパク質72(TAG72)；CD38；CD44v6；急性白血病またはリンパ腫で発現されるが、造血前駆細胞には発現されないグリコシル化CD43エピトープ、非造血性癌に発現されるグリコシル化 CD43 エピトープ、発癌性抗原(CEA)；上皮細胞接着分子(EPCAM)；B7H3(CD276)；KIT(CD117)；インターロイキン-13受容体サブユニットα-2(IL-13Ra2またはCD213A2)；メソテリン；インターロイキン 11 受容体α(IL-llRa)；前立腺幹細胞抗原(PSCA)；プロテアーゼセリン21(テステシンまたはPRSS21)；血管内皮増殖因子受容体2(VEGFR2)；ルイス(Y)抗原；CD24；血小板由来増殖因子受容体β(PDGFR-β)；ステージ特異的胚抗原-4(SSEA-4)；CD20；フォレート受容体α(FRaまたはFR1)；葉酸受容体β(FRb)；受容体チロシンタンパク質キナーゼERBB2(Her2/neu)；細胞表面関連のムチン1(MUC1)；表皮成長因子受容体(EGFR)；神経細胞接着分子(NCAM)；プロスターゼ；前立腺酸性ホスファターゼ(PAP)；変異された伸長因子2(ELF2M)；エフリンB2；線維芽細胞活性化タンパク質α(FAP)；インスリン様成長因子1受容体(IGF-I受容体)、カルボニックアンヒドラーゼIX(CA1X)；プロテアソーム(プロサム、マクロペイン)サブユニット、β型、9(LMP2)；糖タンパク質100(gpl00)；ブレークポイントクラスター領域(BCR)及びAbelsonマウス白血病ウイルス発癌遺伝子ホモログ 1(Abl)(bcr-abl)からなる癌遺伝子融合タンパク質；チロシナーゼ；エフリン型A受容体2(EphA2)；シアリルルイス接着分子(sLe)；ガングリオシドGM3(aNeu5Ac(2-3)bDClalp(l-4)bDGlcp(l-1)Cer)；トランスグルタミナーゼ5(TGS5)；高分子量メラノーマ関連抗原(HMWMAA)；o-アセチル-GD2ガングリオシド(OAcGD2)；腫瘍内皮マーカー1(TEM1/CD248);腫瘍内皮マーカー7関連(TEM7R)；クローディン6(CLDN6)；甲状腺刺激ホルモン受容体(TSHR)；Gタンパク質共役型受容体クラスC群5、メンバーD(GPRC5D)；染色体Xオープンリーディングフレーム61(CXORF61)；CD97；CD179a；未分化リンパ腫キナーゼ(ALK)；ポリシアル酸；胎盤特異的1(PLAC1)；グロボHグリコセラミドの六糖部分(GloboH)；乳腺分化抗原(NY-BR-1)；ウロプラキン2(UPK2)；A型肝炎ウイルス細胞受容体1(HAVCR1)；アドレナリン受容体β3(ADRB3)；パネキシン3(PANX3)；Gタンパク質共役型受容体20(GPR20)；リンパ球抗原6複合体、遺伝子座K 9(LY6K)；嗅覚受容体51E2(OR51E2)；TCRγ代替リーディング フレーム タンパク質 (TARP)；ウィルムス腫瘍タンパク質 (WT1);癌/精巣抗原1(NY-ESO-1)；癌/精巣抗原2(LAGE-la)；メラノーマ関連抗原1(MAGE-A1)；染色体12pに位置する ETSトランスロケーション変異遺伝子6（ETV6-AML）；精子タンパク質17(SPA17)；X抗原ファミリー、メンバー1A(XAGE1)；アンジオポエチン結合細胞表面受容体2(Tie 2)；メラノーマ癌精巣抗原-1(MAD-CT-1)；メラノーマ癌精巣抗原-2(MAD-CT-2)；Fos関連抗原1；腫瘍タンパク質p53(p53)；p53変異体；プロスタイン；サバイビン；テロメラーゼ；前立腺癌腫瘍抗原-1(PCT A-lまたはガレクチン8)、T細胞1によって認識されるメラノーマ抗原(MelanAまたはMARTI)；ラット肉腫(Ras)突然変異体；ヒトテロメラーゼ逆転写酵素(hTERT)；肉腫トランスロケーションブレークポイント；アポトーシスのメラノーマ阻害剤(ML-IAP)；ERG (膜貫通プロテアーゼ、セリン2(TMPRSS2)ETS融合遺伝子)；N-アセチルグルコサミニル-トランスフェラーゼV(NA17)；ペアボックスタンパク質Pax-3(PAX3)；アンドロゲン受容体；サイクリンBl；v-mycトリ骨髄球腫症ウイルス腫瘍遺伝子神経芽細胞腫由来のホモログ(MYCN)；RasホモログファミリーメンバーC(RhoC)；チロシナーゼ関連タンパク質2(TRP-2)；チトクロームP450 1B 1(CYP1B 1)；CCCTC-結合因子(亜鉛フィンガータンパク質)様(BORIS, Brother of the Regulator of Imprinted Site)、T細胞3によって認識された扁平上皮細胞癌抗原(SART3)；ペアボックスタンパク質Pax-5(PAX5)、プロアクロシン結合タンパク質sp32(OY-TES1)；リンパ球特異的タンパク質チロシンキナーゼ(LCK)；キナーゼアンカータンパク質4(AKAP-4)；滑膜肉腫、Xブレークポイント2(SSX2)；最終糖化産物の受容体(RAGE-1)；腎ユビキタス1(RU1)；腎ユビキタス2(RU2)；レグマイン；ヒト乳頭腫ウイルスE6(HPV E6)；ヒト乳頭腫ウイルスE7(HPV E7)；腸管カルボキシルエステラーゼ；熱ショックタンパク質70-2変異(mut hsp70-2)；CD79a；CD79b；CD72；白血球関連免疫グロブリン様受容体1(LAIR1))；IgA受容体のFc断片(FCARまたはCD89)；白血球免疫グロブリン様受容体サブファミリーAメンバー2(LILRA2)；CD 300分子様ファミリーメンバーf(CD300LF)；C型レクチンドメインファミリー12メンバーA(CLEC12A)；骨髄間質細胞抗原2(BST2)；EGF様モジュールを含むムチン様ホルモン受容体様2(EMR2)；リンパ球抗原75(LY75)；グリピカン-3(GPC3)；Fc受容体様5(FCRL5)；免疫グロブリンλ様ポリペプチド1(IGLL1)、MPL、ビオチン、c-MYCエピトープタグ、CD34、LAMP1 TROP2、GFRα4、CDH17、CDH6、NYBR 1、CDH19、CD200R、Slea(CA19.9；シアリルルイス抗原)；フコシル-GMl、PTK7、gpNMB、CDH1-CD324、DLL3、CD276/B7H3、ILllRa、IL13Ra2、CD179b-IGL11、TCRγ-δ、NKG2D、CD32(FCGR2A)、Tn ag、Timl-/HVCR1、CSF2RA(GM-CSFR-α)、TGFβR2、Lews Ag、TCR-β1鎖、TCR-β2鎖、TCR-γ鎖、TCR-δ鎖、FITC、黄体形成ホルモン受容体 (LHR)、卵胞刺激ホルモン受容体(FSHR)、ゴ等トロピンホルモン受容体(CGHRまたはGR)、CCR4、GD3、SLAMF6、SLAMF4、HIV1エンベロープ糖タンパク質、HTLVl-Tax、CMV pp65、EBV-EBNA3c、KSHV K8.1、KSHV-gH、インフルエンザAヘマグルチニン(HA)、GAD、PDL1、グアニル酸シクラーゼC(GCC)、デスモグレイン3に対する自己抗体(Dsg3)、デスモグレイン1に対する自己抗体 (Dsg1)、HLA、HLA-A、HLA-A2、HLA-B、HLA-C、HLA-DP、HLA-DM、HLA-DOA、HLA-DOB、HLA-DQ、HLA-DR、HLA-G、IgE、CD99、Ras G12V、組織因子1(TF1)、AFP、GPRC5D、クローディン18.2(CLD18A2またはCLDN18A.2)、P-糖タンパク質、STEAP1、Liv1、ネクチン-4、クリプト、gpA33、BST1/CD157、低透過性塩化物チャンネル、及びTNT抗体によって認識される抗原からなる群から選択される抗原に特異的に結合する、請求項32に記載のRNVCAR。
  44. 異種ポリヌクレオチドに作動可能に連結されたIRESまたは2Aペプチドカセットをさらに含む、請求項31に記載のRNVCAR。
  45. 前記異種ポリヌクレオチドが、プロドラッグ活性化酵素をコードする、請求項44に記載のRNVCAR。
  46. 前記プロドラッグ活性化酵素が、シトシンデアミナーゼまたはチミジンキナーゼである、請求項45に記載のRNVCAR。
  47. キメラ抗原受容体をコードする配列を含有する配列番号:3を含むプラスミドでパッケージング細胞株を遺伝子導入し、該パッケージング細胞を培養してRNVCARを産生し、そして該RNVCARを単離することにより産生された、請求項31～43のいずれか1項に記載のRNVCAR。
  48. 前記プラスミドが、配列番号:18～22からなる群から選択された配列を含む、請求項47に記載のRNVCAR。
  49. 請求項1～12のいずれか1項に記載の医薬組成物または請求項31～43のいずれか1項に記載のRNVCARを被験者に投与することを含む、養子細胞療法を被験者に提供する方法。
  50. 前記RNVCARの投与前またはそれと同時に、前記被験者が、T細胞を活性化するため薬剤で治療される、請求項49に記載の方法。



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