CN117567650B - 共表达细胞间黏附分子icam2的car-t细胞及其制备方法与应用 - Google Patents

共表达细胞间黏附分子icam2的car-t细胞及其制备方法与应用 Download PDF

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Abstract

本发明涉及免疫疗法和基因工程技术领域，涉及一种共表达细胞间黏附分子ICAM2的CAR‑T细胞及其制备方法与应用。所述方法包括将细胞间黏附分子ICAM2与抗CDH17的CAR分子构建到同一个慢病毒载体上，中间用可剪接的2A linker相连，使得T细胞既表达抗CDH17的CAR，也表达细胞间黏附分子ICAM2。通过体外迁移试验，发明人发现表达ICAM2分子后显著增强了CAR‑T的迁移能力。这表明ICAM2可以帮助CAR‑T细胞向实体瘤迁移，从而可以对实体瘤展现出更强的杀伤功能。

Description

共表达细胞间黏附分子ICAM2的CAR-T细胞及其制备方法与 应用
技术领域
本发明涉及免疫疗法和基因工程技术领域，更具体地说，它涉及一种利用慢病毒载体共表达细胞间黏附分子ICAM2的CAR-T细胞及其制备方法与应用。
背景技术
CAR-T细胞疗法是一种新型的肿瘤治疗方法，通过将CAR（嵌合抗原受体）基因导入T细胞，使其能够识别并攻击特定的肿瘤细胞。然而，实体瘤的复杂性和异质性使得CAR-T细胞在实体瘤治疗中效果有限。由于实体瘤组织的屏障作用，CAR-T细胞往往难以渗透到实体瘤内部，限制了其治疗效果。因此，提高CAR-T细胞的迁移能力和实体瘤渗透能力是当前亟待解决的问题。
细胞间黏附分子ICAM2是一种属于免疫球蛋白超家族的细胞表面分子，在结肠癌等肿瘤中发挥重要作用。结构上，ICAM2由三个免疫球蛋白样结构域组成，每个结构域都包含两个链，通过二硫键连接。这些结构域与免疫球蛋白V区结构类似，具有与配体结合的能力。功能上，ICAM2主要参与细胞间的黏附过程。它作为淋巴细胞功能相关抗原-1（LFA-1）的配体，与白细胞表面相互作用，在炎症反应、免疫应答和肿瘤转移等过程中起到关键作用。在结肠癌中，ICAM2的表达与肿瘤的恶性程度和预后不良相关。
在结肠癌中，ICAM2的表达情况复杂。一方面，肿瘤细胞和浸润的免疫细胞均可表达ICAM2，这些表达上调的ICAM2可促进肿瘤细胞的转移和浸润。另一方面，ICAM2也在T细胞的迁移过程中起到关键作用。在肿瘤微环境中，ICAM2表达上调的T细胞更易进入肿瘤组织，从而影响肿瘤的生长和预后。
总的来说，细胞间黏附分子ICAM2的结构和功能使其成为结肠癌等肿瘤转移和T细胞迁移的重要调节因子。了解ICAM2的作用机制和调控因素有助于我们更好地理解肿瘤的免疫逃逸机制，为肿瘤治疗提供新的思路和方法。
CDH17是一种糖蛋白，结构上包含多个免疫球蛋白样结构域，具有多个跨膜螺旋。它属于粘附分子家族，是一种细胞间粘附分子，主要在胃肠道的上皮细胞中表达。CDH17的功能主要是在细胞间传递信号，维持和调节细胞的粘附和分化。它也参与了细胞迁移、增殖和癌变等过程。在结肠癌中，CDH17的表达通常与肿瘤的恶性程度和预后不良相关。
在结肠癌中，CDH17的表达水平可能会升高，这可能与肿瘤的增殖、转移和预后不良有关。一些研究表明，CDH17的高表达与结肠癌患者的生存率下降相关，因此，它可能是一个预测结肠癌预后的生物标志物。
作为一种理想的CAR-T治疗的靶点，CDH17的结构特点使其成为一种有前途的治疗结肠癌的策略。CAR-T是一种基因工程改造的T细胞，可以识别并攻击特定的肿瘤细胞。通过将CAR-T细胞靶向CDH17，可以特异性地攻击表达CDH17的结肠癌细胞，同时减少对正常细胞的损害。这种治疗方法有望提高结肠癌的治疗效果，降低副作用，提高患者的生活质量。
发明内容
本发明的目的是提供一种共表达细胞间黏附分子ICAM2的CAR-T细胞的制备方法及其在实体瘤治疗中的应用。该方法是通过将细胞间黏附分子ICAM2与抗CDH17的CAR分子构建到同一个慢病毒载体上，中间用可剪接的2A linker相连，使得T细胞既表达抗CDH17的CAR，也表达细胞间黏附分子ICAM2。
本发明的上述技术目的是通过以下技术方案得以实现的：
一种共表达细胞间黏附分子ICAM2的CAR，其特征在于，所述的CAR包括有SEQ IDNo:1所示的氨基酸序列和SEQ ID No:2所示的氨基酸序列。
优选地，SEQ ID No:1所示的氨基酸序列与SEQ ID No:2所示的氨基酸序列之间使用可剪接的2A linker相连。
优选地，所述的CAR具有下式I结构：
L-CDH17 scFv-H-TM-C-CD3ζ-2A-ICAM2(I)
式中，
各“-”为连接肽或肽键；L为信号肽序列；CDH17 scFv为针对CDH17肿瘤抗原的抗体，所述CDH17 scFv的氨基酸序列如SEQ ID NO：1所示；H为铰链区序列；TM为跨膜区序列；C为共刺激域序列；CD3ζ为信号传导域序列。
一种核酸分子，其编码上述的CAR。
优选地，所述的核酸分子包括有SEQ ID No:5所示的核苷酸序列和SEQ ID No:6所示的核苷酸序列。
一种载体，其包括有上述的核酸分子。
优选地，所述的载体选自DNA、RNA、质粒、慢病毒载体、腺病毒载体、逆转录病毒载体、转座子中的一种或多种组合。
一种细胞，其包括有上述的载体、或染色体中整合有外源的上述的核酸分子、或表达上述的CAR。
优选地，所述细胞为T细胞。
一种共表达细胞间黏附分子ICAM2的CAR-T细胞的制备方法，其包括如下步骤：将细胞间黏附分子ICAM2与抗CDH17的CAR分子构建到同一个慢病毒载体上，并使用可剪接的2A linker使两者相连，然后将该慢病毒载体转染到T细胞中。
综上所述，本发明具有以下有益效果：通过本发明中的制备方法得到的抗CDH17的CAR-T细胞共表达细胞间黏附分子ICAM2后，显著增强了CAR-T的迁移能力，并帮助CAR-T细胞向实体瘤迁移，从而可以对实体瘤展现出更强的杀伤功能。这主要得益于ICAM2分子的表达，它可以帮助CAR-T细胞与肿瘤细胞之间的黏附作用，提高CAR-T细胞在实体瘤中的浸润能力。同时，抗CDH17的CAR分子可以增强CAR-T细胞对肿瘤细胞的识别和攻击能力。因此，本发明为实体瘤治疗提供了一种新的、有效的治疗方法。
附图说明
图1是本发明中CDH17的结构示意图；
图2是本发明中CAR的结构示意图；
图3是本发明中CAR-T的扩增倍数图；
图4是本发明中流式检测CAR-T细胞的表达情况图I；
图5是本发明中流式检测CAR-T细胞的表达情况图II；
图6 是本发明中Transwell评估CAR-T的迁移情况图；
图7是本发明中CAR-T的杀伤率检测图。
具体实施方式
为使本发明的目的、特征和优点能够更加明显易懂，下面结合附图对本发明的具体实施方式做详细的说明。附图中给出了本发明的若干实施例。但是，本发明可以以许多不同的形式来实现，并不限于本文所描述的实施例。
实施例1：嵌合抗原受体的设计
本实施例构建了抗CDH17的嵌合抗原受体（CDH17 CAR）、共表达细胞间黏附分子ICAM2的抗CDH17的（CDH17-ICAM2 CAR），其结构见图1-2。嵌合抗原受体包括一段CD8α的信号肽序列（Leader），抗CDH17的单链抗体序列（anti-CDH17scFv），CD8α的铰链区（Hinge）和跨膜区序列（Transmembrane），4-1BB共刺激域序列和CD3ζ信号传导域序列，其结构见图2。
其中抗人CDH17抗体序列（Anti-CDH17 scFv）的氨基酸序列来源于专利WO2023107558A1中07-0663-h7scfv序列（SEQ ID No:1），具体如下所示：
DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRVSSIISSSKLHWYQQKPGKAPKPLIYGTSTLASGVPSRFSGSGSGTDYTLTISSLQPEDFATYYCQQWSNYPFTFGQGTKLEIKGGGGSGGGGSGGGGSQVQLVQSGAEVKKPGSSVKISCKVSGYTFTDHTIHWMRQAPGQGLEWIGYIFPRDDIVVYAQKFQGRATLTADKSTSTAYMELSSLRSEDTAVYYCARPPYYYSRNFYFDYWGQGTTLTVSS
ICAM2氨基酸序列（SEQ ID NO:2），具体如下所示：
MSSFGYRTLTVALFTLICCPGSDEKVFEVHVRPKKLAVEPKGSLEVNCSTTCNQPEVGGLETSLDKILLDEQAQWKHYLVSNISHDTVLQCHFTCSGKQESMNSNVSVYQPPRQVILTLQPTLVAVGKSFTIECRVPTVEPLDSLTLFLFRGNETLHYETFGKAAPAPQEATATFNSTADREDGHRNFSCLAVLDLMSRGGNIFHKHSAPKMLEIYEPVSDSQMVIIVTVVSVLLSLFVTSVLLCFIFGQHLRQQRMGTYGVRAAWRRLPQAFRP
Anti-CDH17 CAR氨基酸序列（SEQ ID NO:3），具体如下所示：
MALPVTALLLPLALLLHAARPDIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRVSSIISSSKLHWYQQKPGKAPKPLIYGTSTLASGVPSRFSGSGSGTDYTLTISSLQPEDFATYYCQQWSNYPFTFGQGTKLEIKGGGGSGGGGSGGGGSQVQLVQSGAEVKKPGSSVKISCKVSGYTFTDHTIHWMRQAPGQGLEWIGYIFPRDDIVVYAQKFQGRATLTADKSTSTAYMELSSLRSEDTAVYYCARPPYYYSRNFYFDYWGQGTTLTVSSTTTPAPRPPTPAPTIASQPLSLRPEACRPAAGGAVHTRGLDFACDIYIWAPLAGTCGVLLLSLVITLYCKRGRKKLLYIFKQPFMRPVQTTQEEDGCSCRFPEEEEGGCELRVKFSRSADAPAYQQGQNQLYNELNLGRREEYDVLDKRRGRDPEMGGKPRRKNPQEGLYNELQKDKMAEAYSEIGMKGERRRGKGHDGLYQGLSTATKDTYDALHMQALPPR
共表达细胞间黏附分子ICAM2的抗CDH17的（CDH17-ICAM2 CAR）氨基酸序列（SEQID NO:4），具体如下所示：MALPVTALLLPLALLLHAARPDIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRVSSIISSSKLHWYQQKPGKAPKPLIYGTSTLASGVPSRFSGSGSGTDYTLTISSLQPEDFATYYCQQWSNYPFTFGQGTKLEIKGGGGSGGGGSGGGGSQVQLVQSGAEVKKPGSSVKISCKVSGYTFTDHTIHWMRQAPGQGLEWIGYIFPRDDIVVYAQKFQGRATLTADKSTSTAYMELSSLRSEDTAVYYCARPPYYYSRNFYFDYWGQGTTLTVSSTTTPAPRPPTPAPTIASQPLSLRPEACRPAAGGAVHTRGLDFACDIYIWAPLAGTCGVLLLSLVITLYCKRGRKKLLYIFKQPFMRPVQTTQEEDGCSCRFPEEEEGGCELRVKFSRSADAPAYQQGQNQLYNELNLGRREEYDVLDKRRGRDPEMGGKPRRKNPQEGLYNELQKDKMAEAYSEIGMKGERRRGKGHDGLYQGLSTATKDTYDALHMQALPPRGSG ATNFSLLKQAGDVEENPGPMSSFGYRTLTVALFTLICCPGSDEKVFEVHVRPKKLAVEPKGSLEVNCSTTCNQPEVGGLETSLDKILLDEQAQWKHYLVSNISHDTVLQCHFTCSGKQESMNSNVSVYQPPRQVILTLQPTLVAVGKSFTIECRVPTVEPLDSLTLFLFRGNETLHYETFGKAAPAPQEATATFNSTADREDGHRNFSCLAVLDLMSRGGNIFHKHSAPKMLEIYEPVSDSQMVIIVTVVSVLLSLFVTSVLLCFIFGQHLRQQRMGTYGVRAAWRRLPQAFRP
Anti-CDH17 scFv核苷酸序列（SEQ ID NO:5），具体如下所示：
GATATACAAATGACACAAAGCCCATCTTCACTTAGCGCTTCAGTCGGGGATAGGGTGACTATCACTTGCCGGGTAAGCTCCATTATAAGCAGCTCCAAGTTGCACTGGTACCAGCAGAAACCCGGCAAGGCGCCAAAACCGCTTATTTACGGGACTTCCACACTGGCAAGTGGAGTGCCCTCCCGGTTTAGTGGCTCTGGCTCTGGCACTGACTACACTCTGACCATCTCTTCACTCCAGCCTGAGGATTTCGCTACTTACTACTGCCAGCAGTGGAGCAACTACCCATTCACCTTTGGTCAGGGGACAAAGCTCGAAATCAAAGGAGGCGGCGGGTCAGGGGGCGGAGGATCTGGAGGGGGTGGTTCTCAGGTCCAACTCGTGCAAAGCGGAGCCGAGGTAAAGAAGCCAGGATCTAGTGTCAAGATCTCATGCAAGGTATCTGGCTACACGTTTACAGACCACACTATACACTGGATGAGGCAGGCTCCTGGGCAGGGACTCGAATGGATTGGCTATATATTTCCACGGGACGACATCGTGGTCTACGCCCAGAAGTTTCAGGGAAGGGCTACACTTACTGCCGATAAGTCAACGTCCACCGCCTATATGGAGCTGTCCTCCCTCAGGAGCGAGGACACAGCAGTCTACTATTGCGCCCGACCCCCATACTACTACTCTCGGAATTTCTACTTTGATTATTGGGGACAGGGGACAACTCTTACCGTGAGTAGT
ICAM2核苷酸序列（SEQ ID NO:6），具体如下所示：
ATGTCAAGTTTCGGCTACAGAACCCTCACAGTTGCTCTCTTTACGCTGATTTGCTGTCCCGGTTCAGATGAAAAGGTGTTCGAGGTTCATGTGAGGCCCAAGAAGTTGGCCGTGGAACCGAAGGGCAGTCTGGAGGTGAATTGCAGCACAACCTGTAATCAGCCTGAGGTAGGCGGACTCGAAACGAGCCTCGACAAGATCCTTCTCGACGAGCAAGCACAATGGAAGCACTACCTGGTGAGCAACATCTCACACGACACTGTTCTTCAGTGCCATTTCACCTGTTCTGGTAAGCAGGAATCTATGAACTCTAACGTGTCAGTATACCAGCCTCCAAGACAGGTTATTCTCACGCTCCAGCCTACATTGGTGGCTGTGGGCAAGTCCTTTACCATAGAGTGCCGGGTCCCCACTGTGGAGCCACTGGACTCACTGACACTGTTTCTGTTCAGGGGTAACGAGACTCTGCACTATGAGACCTTTGGAAAAGCTGCACCAGCTCCCCAGGAGGCTACAGCAACATTCAACAGTACCGCCGACCGGGAAGATGGCCACCGGAATTTTTCCTGTCTTGCCGTGCTCGACTTGATGAGCAGGGGGGGGAACATCTTCCACAAGCATTCTGCCCCCAAAATGCTGGAGATTTATGAACCAGTCTCCGACAGCCAGATGGTAATCATCGTGACGGTCGTTTCCGTGTTGCTGTCCTTGTTTGTGACTTCCGTGCTCCTCTGTTTCATCTTCGGACAGCATCTGAGGCAACAGAGGATGGGCACATATGGGGTAAGAGCAGCATGGAGACGGCTGCCCCAAGCATTCCGGCCA
Anti-CDH17 CAR核苷酸序列（SEQ ID NO:7），具体如下所示：
ATGGCCCTGCCCGTTACAGCTCTGTTGTTGCCCCTGGCACTCCTGTTGCATGCCGCCAGACCTGATATTCAGATGACACAGTCACCCAGTAGCCTGTCTGCCAGTGTGGGTGACAGGGTGACCATCACCTGTAGAGTGAGCAGTATCATATCATCATCTAAGCTGCATTGGTACCAGCAAAAACCAGGAAAGGCCCCCAAGCCACTGATTTACGGAACATCAACCCTCGCCTCCGGCGTGCCCTCTAGGTTTTCAGGATCTGGTAGCGGCACTGACTACACTCTGACTATCAGCTCCCTGCAGCCCGAGGATTTTGCAACATATTACTGTCAGCAATGGAGCAACTATCCCTTTACTTTCGGGCAGGGCACTAAGCTCGAGATAAAAGGTGGAGGTGGTTCAGGTGGGGGAGGTTCAGGAGGGGGAGGTTCACAGGTGCAGCTCGTTCAGTCAGGAGCCGAGGTGAAAAAGCCCGGCTCCAGCGTGAAAATTTCATGCAAAGTCAGTGGCTACACTTTCACCGATCATACCATACACTGGATGAGACAGGCTCCCGGACAGGGACTGGAGTGGATCGGTTATATATTTCCTCGCGACGACATCGTGGTTTATGCACAGAAGTTCCAAGGCAGGGCTACCCTGACCGCAGACAAGTCCACCTCTACCGCCTACATGGAACTCAGCTCTCTCAGGAGTGAGGACACGGCTGTATACTATTGCGCCCGCCCTCCCTATTACTATAGCAGGAACTTTTACTTTGATTATTGGGGCCAGGGGACAACATTGACCGTGAGTAGCACCACAACCCCAGCTCCTAGACCTCCAACCCCAGCTCCAACAATAGCTAGTCAGCCACTGAGTCTCAGACCTGAGGCTTGTAGGCCAGCGGCAGGAGGGGCAGTGCATACCAGAGGCCTGGATTTCGCCTGCGACATTTACATCTGGGCGCCTTTGGCGGGAACCTGCGGAGTGCTCTTGCTGAGCCTCGTGATTACTTTGTACTGCAAGCGCGGAAGGAAGAAGCTGCTGTATATCTTCAAGCAGCCATTCATGAGACCGGTTCAGACGACCCAGGAGGAAGATGGTTGCTCCTGTCGCTTCCCCGAGGAAGAAGAAGGAGGCTGCGAGTTGCGCGTGAAATTCAGTAGGTCTGCAGACGCTCCAGCCTACCAACAGGGGCAAAACCAGTTGTATAATGAGCTCAACCTCGGGAGGAGAGAAGAATACGATGTGCTGGATAAACGGAGAGGGCGCGATCCTGAAATGGGAGGAAAACCTAGGCGCAAGAATCCCCAGGAAGGCCTCTACAACGAACTGCAGAAGGATAAGATGGCCGAGGCATACTCAGAAATAGGCATGAAGGGAGAACGAAGACGGGGCAAGGGGCATGATGGCCTGTATCAAGGCCTGTCTACCGCAACTAAGGATACCTACGATGCGCTCCATATGCAGGCCCTTCCCCCTCGG
共表达细胞间黏附分子ICAM2的抗CDH17的（CDH17-ICAM2 CAR）核苷酸序列（SEQID NO:8），具体如下所示：ATGGCATTGCCCGTGACTGCACTCCTTCTTCCACTTGCCCTCTTGCTGCATGCTGCTCGCCCAGACATCCAGATGACACAGTCCCCTTCTAGCCTGTCCGCATCCGTCGGAGATAGAGTGACTATCACATGCAGAGTAAGCAGCATCATCAGCAGCAGCAAATTGCATTGGTACCAACAAAAGCCCGGGAAGGCGCCAAAACCTCTGATCTACGGGACCTCAACGTTGGCTAGTGGTGTGCCGTCTAGATTCTCTGGGAGCGGCTCAGGAACTGACTACACGCTCACTATAAGTTCCCTTCAGCCCGAAGACTTCGCTACGTATTATTGCCAGCAATGGTCCAACTACCCATTTACATTTGGGCAGGGTACTAAACTGGAAATCAAGGGAGGCGGAGGAAGTGGAGGAGGTGGATCTGGAGGCGGCGGTAGTCAGGTGCAGCTGGTGCAGTCTGGAGCTGAAGTGAAAAAGCCTGGTAGTTCAGTGAAGATCAGCTGCAAAGTGAGTGGATATACCTTTACCGATCATACTATCCACTGGATGAGACAGGCCCCAGGGCAAGGTCTTGAATGGATAGGTTATATCTTTCCACGAGACGACATAGTGGTGTATGCACAAAAATTCCAAGGTCGCGCCACGCTGACCGCTGATAAGAGTACAAGTACCGCCTATATGGAGCTTTCAAGTCTCAGATCCGAAGACACAGCCGTATACTACTGTGCTCGGCCTCCATACTACTACAGCAGAAACTTCTACTTCGATTACTGGGGCCAGGGAACTACCCTCACCGTCTCATCCACTACTACCCCCGCACCTAGACCTCCTACACCCGCTCCCACAATAGCCAGCCAGCCTCTTTCTCTTAGACCTGAAGCGTGTAGACCCGCTGCTGGTGGTGCAGTGCATACAAGAGGCTTGGATTTCGCCTGCGACATCTATATATGGGCCCCATTGGCAGGAACTTGTGGCGTGTTGCTGCTGTCACTCGTGATCACTCTGTACTGCAAGAGAGGTCGCAAAAAGCTGCTGTATATCTTCAAGCAACCATTTATGCGGCCTGTCCAGACTACCCAGGAGGAAGATGGCTGTAGCTGCCGGTTCCCCGAGGAAGAGGAGGGCGGATGTGAACTGAGAGTCAAGTTCTCTAGATCCGCTGATGCCCCAGCTTACCAACAGGGTCAGAACCAGCTCTATAACGAGCTGAACCTTGGGCGGAGGGAAGAGTACGACGTGTTGGACAAAAGAAGAGGCAGGGACCCAGAAATGGGCGGTAAGCCAAGGCGCAAGAATCCCCAAGAAGGGCTGTACAATGAACTCCAGAAAGACAAGATGGCCGAGGCCTACAGCGAGATTGGGATGAAGGGAGAAAGACGACGCGGAAAAGGCCACGACGGCTTGTACCAGGGTCTCTCAACTGCCACTAAAGACACTTACGATGCCCTCCACATGCAGGCACTTCCACCAAGAGGCTCCGGAGCCACGAATTTCTCATTGCTGAAGCAAGCAGGAGATGTGGAAGAGAACCCTGGACCCATGTCCTCCTTTGGCTATAGAACTCTGACTGTGGCTCTCTTTACTCTTATCTGCTGCCCCGGCTCTGATGAGAAAGTATTCGAGGTCCATGTTAGGCCGAAGAAGCTGGCAGTGGAACCCAAAGGTAGCCTCGAGGTAAACTGCTCTACTACGTGTAATCAGCCAGAGGTGGGGGGACTCGAAACATCTCTCGATAAGATACTTCTGGATGAGCAGGCTCAGTGGAAACACTACCTGGTGAGTAACATAAGCCACGATACCGTTCTTCAGTGCCACTTTACTTGCAGCGGTAAACAGGAATCAATGAACTCCAATGTGTCAGTGTATCAGCCACCCAGACAGGTCATTCTGACACTCCAGCCAACTCTTGTTGCTGTGGGGAAATCTTTTACGATTGAGTGTCGGGTTCCGACAGTCGAACCTCTGGACAGTCTTACCCTGTTCCTGTTTCGCGGCAATGAGACCCTTCACTATGAAACATTCGGAAAGGCCGCACCAGCTCCACAGGAGGCCACAGCTACATTCAACTCAACAGCCGACAGAGAAGACGGCCACAGAAACTTCTCCTGCCTGGCAGTGCTGGACCTGATGTCACGAGGCGGCAATATCTTTCATAAACACTCTGCCCCCAAGATGCTGGAAATTTACGAACCCGTAAGCGATTCCCAGATGGTGATCATTGTGACAGTGGTATCCGTGCTGTTGAGTTTGTTTGTTACCAGCGTGTTGCTGTGCTTTATCTTCGGCCAGCACCTGCGGCAACAGAGGATGGGTACATATGGGGTCAGAGCTGCATGGAGGCGGCTGCCTCAGGCTTTTAGGCCT
具体各部分序列如下：
L(leader)为选自下组的蛋白的信号肽：CD8、GM-CSF、CD4、CD137、或其组合；优选为CD8α信号肽，其氨基酸序列（SEQ ID NO:40）为：MALPVTALLLPLALLLHAARP。
H(Hinge)为选自下组的蛋白的铰链区：CD8、CD28、CD137、或其组合；优选为CD8α铰链区，其氨基酸序列（SEQ ID NO:42）为：TTTPAPRPPTPAPTIASQPLSLRPEACRPAAGGAVHTRGLDFACD。
TM为选自下组的蛋白的跨膜区：CD28、CD3epsilon、CD45、CD4、CD5、CD8、CD9、CD16、CD22、CD33、CD37、CD64、CD80、CD86、CD134、CD137、CD154；优选为CD8α跨膜区，其氨基酸序列（SEQ ID NO:44）为：IYIWAPLAGTCGVLLLSLVITLYC。
C为选自下组的共刺激域：CCD28、4-1BB、GITR、ICOS-1、CD27、OX-40、DAP10；优选为4-1BB，其氨基酸序列（SEQ ID NO:46）为：KRGRKKLLYIFKQPFMRPVQTTQEEDGCSCRFPEEEEGGCEL。
CD3ζ信号传导域的氨基酸序列（SEQ ID NO:48）为：RVKFSRSADAPAYQQGQNQLYNELNLGRREEYDVLDKRRGRDPEMGGKPRRKNPQEGLYNELQKDKMAEAYSEIGMKGERRRGKGHDGLYQGLSTATKDTYDALHMQALPPR。
2A linker为2A肽，其氨基酸序列包括但不限于以下几种：
P2A (e.g., sequence: ATNFSLLKQAGDVEENPGP)、
E2A (e.g., sequence: QCTNYALLKLAGDVESNPGP)、
F2A (e g., sequence: VKQTLNFDLLKLAGDVESNPGP)、
T2A (e g., sequence :EGRGSLLTCGDVEENPGP)。
实施例2：构建的嵌合抗原受体表达载体
（1）根据CAR基因的蛋白理论序列，优化CAR基因，使其能够在人细胞中高效表达，通过密码子优化及全基因合成方法制备CAR基因，进行全基因合成；
（2）用EcoRI和BamHI双酶切全基因合成的CAR基因和空载体pCDH-EF1-MCS,于37℃水浴中酶切30min后，使用1.5%的琼脂糖凝胶进行DNA电泳，然后使用天根的琼脂糖凝胶试剂盒纯化回收处理；
（3）pCDH-EF1-MCS载体与CAR基因片段的连接，连接体系如表1所示：
表1 pCDH-EF1-MCS载体与CAR基因片段的连接体系表
组件 添加量（μl）
pCDH-EF1-MCS载体 2（50ng）
CAR基因 10（150ng）
T4 DNA 连接缓冲液 2
T4 DNA 连接酶（NEB） 1
dd H2O 5
总共 20
于22℃连接1h，连接产物直接转化Stbl3大肠杆菌感受态细胞，取200μl转化产物涂布氨苄抗性的LB平板，LB平板于37℃的培养箱中倒置培养过夜。次日早晨随机挑选3个单克隆进行菌落PCR鉴定，将阳性克隆送样测序。
实施例3：慢病毒包装
分别对实施例中的慢病毒表达载体进行慢病毒包装，采用四质粒系统，具体步骤如下：
（1）四质粒系统分别表达慢病毒载体包装所需的gag/pol、Rev、VSV-G及本发明构建的CAR表达载体：将四质粒进行瞬时转染293T细胞，DNA含量为2μg/mL；
（2）将上述质粒与PEI转染试剂混合，加入至一定体积的无血清的DMEM中，混匀后放置15分钟，将上述混合液加入至铺有293T细胞的T75培养瓶中，轻轻混匀，于37℃、5％CO2细胞培养箱培养6h；
（3）6h后更换新鲜培养基，继续进行培养，并且加入10mM的丁酸钠溶液，72小时后收集慢病毒的培养上清进行纯化检测。
实施例4：慢病毒感染T细胞
分离PBMC后，用含50ng/mL的OKT3，300IU/ml的IL-2的X-VIVO进行激活，2日后将培养基更换成含300IU/mL的X-VIVO进行扩大培养；利用RetroNectin提高慢病毒对T细胞的感染效率，将30μg的RetroNectin，包被于6孔板内，放于37℃细胞培养箱2h；吸取RetroNectin，利用含2.5％BSA的Hank’s溶液封闭包被后的6孔板，放于37℃细胞培养箱0.5h；吸取封闭液，利用含2％Hepes的Hank’s溶液洗涤6孔板，加入X-VIVO培养基，加入适量的慢病毒溶液，2000×g，离心2h；弃上清，加入1×106的激活后的PBMC细胞，1000×g，离心10min，于37℃、5％CO2和一定湿度的细胞培养箱内培养。每两天进行一次计数并更换含300IU/mL的X-VIVO，并且将细胞浓度维持0.5×106-1×106/mL，连续培养8天。用美国Countstar IC1000 自动细胞计数仪计数，评估CAR-T细胞的扩增情况。结果发现，各CAR-T组扩增良好，未转导T细胞、CDH17 CAR-T和CDH17-ICAM2 CAR-T细胞在培养9天后分别扩增42.23、69.65和83.42倍，见图3所示。
实施例5：CAR的表达及其功能评估
采用流式细胞仪检测CAR-T细胞表面CAR分子的表达及其与对应抗原蛋白的结合能力，利用APC-anti-CD3抗体标记T细胞群，然后用CDH17蛋白（ACRO Biosystems公司；货号CA7-H5258）检测CAR表达阳性率。结果显示：未转导T细胞、CDH17 CAR-T和CDH17-ICAM2CAR-T细胞的CAR表达率分别为2.3%、58.45%和54.63%（见图4所示），表明CAR-T能有效识别CDH17抗原。
另外，未转导T细胞不表达嵌合受体。未转导T细胞、CDH17 CAR-T和CDH17-ICAM2CAR-T细胞的ICAM2表达率分别为22.43%、23.41%和54.78%，见图5所示。
实施例6：Transwell评估CAR-T的迁移能力
使用Transwell评估CAR-T细胞的迁移能力的具体步骤如下：
（1）在24孔板中每孔接种8×10E4个细胞，常规条件培养24小时；
（2）弃培养基，用PBS洗涤细胞2次，用消化液消化细胞，继而用无血清培养液重悬细胞，计数，将细胞密度调为30万/ml；
（3）将transwell培养小室放入24孔板中，共分2组，每组3个复孔，一组在小室下层分别加600μl无血清培养基、另一组加600μl含10%胎牛血清的培养液，小室内则加入100μl含3× 10E4个细胞的单细胞悬液，常规培养12小时；
（4）取出transwell小室，用甲醇固定15分钟，0.1%结晶紫染色20分钟，用棉签小心擦去微孔膜上层细胞，PBS清洗两次；
（5）细胞计数：在荧光显微镜下给微孔膜下层细胞拍照，每孔拍9个视野，计数。
培养一段时间以后，一部分细胞穿过transwel小室，迁移到孔膜下层，在荧光显微镜下可看到蓝紫色的细胞。通过以上步骤，可以评估CAR-T细胞的迁移能力。
结果显示：相比未转导T细胞和CDH17 CAR-T细胞，CDH17-ICAM2 CAR-T细胞的迁移能力明显提升，见图6所示。
实施例7：CAR-T功能评估
肿瘤细胞杀伤效率由基于荧光素酶的细胞杀伤检测方法(Luciferase-basedcytotoxicity assay)进行评估。用过表达CDH17和荧光素酶基因的人结肠癌细胞SW480（SW480-CDH17-Luc）作为靶细胞，进行杀伤试验。
首先，将1×104个SW480-CDH17-Luc接种于96孔平底黑板上，每孔100μL培养基，置于37℃，5％CO2细胞培养箱中培养18～20小时。第二天，以效应细胞：靶细胞＝1:1的比例加入嵌合受体修饰T细胞至含有靶细胞的孔中，置于37℃，5％CO2细胞培养箱中继续培养6小时，共培养结束后使用微孔板发光检测仪检测靶细胞的荧光素酶活力值。细胞杀伤率的计算公式如下所示，细胞杀伤率(％)＝(未转导T细胞组荧光素酶活力值-实验组荧光素酶活力值)/未转导T细胞组荧光素酶活力值×100。
结果显示，CDH17 CAR-T细胞和CDH17-ICAM2 CAR-T细胞都能杀伤SW480-CDH17-Luc，杀伤率分别为54.35%和65.32%。共表达细胞间黏附分子ICAM2的CAR-T细胞（CDH17-ICAM2 CAR-T）比经典CAR-T（CDH17 CAR-T）的杀伤能力更优，见图7所示。
综上所述，共表达细胞间黏附分子ICAM2的CAR-T细胞（CDH17-ICAM2 CAR-T）能特异性识别CDH17抗原；相比经典的CAR-T（anti-CDH17 CAR-T），CDH17-ICAM2 CAR-T的迁移能力更强，杀伤力更优。本发明提供的共表达细胞间黏附分子ICAM2的CAR-T细胞在实体瘤的治疗中具有极大的临床转化价值。
以上所述仅是本发明的优选实施方式，本发明的保护范围并不仅局限于上述实施例，凡属于本发明思路下的技术方案均属于本发明的保护范围。应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理前提下的若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。

Claims (8)

1.一种共表达细胞间黏附分子ICAM2的CAR，其特征在于，所述的CAR具有下式I结构：
L-CDH17 scFv-H-TM-C-CD3ζ-2A-ICAM2(I)
式中，各“-”为连接肽或肽键；L为信号肽序列；CDH17 scFv为针对CDH17肿瘤抗原的抗体，所述CDH17 scFv的氨基酸序列如SEQ ID NO：1所示；H为铰链区序列；TM为跨膜区序列；C为共刺激域序列；CD3ζ为信号传导域序列；2A 为可剪接的2A linker；所述ICAM2 的氨基酸序列如SEQ ID NO：2 所示。
2.一种核酸分子，其特在在于，其编码权利要求1所述的CAR。
3.根据权利要求2所述的核酸分子，其特征在于，所述的核酸分子包括有SEQ ID No:5所示的核苷酸序列和SEQ ID No:6所示的核苷酸序列。
4.一种载体，其特征在于，所述的载体包括有权利要求3所述的核酸分子。
5.根据权利要求4所述的载体，其特征在于，所述的载体选自DNA、RNA中的一种或两种组合。
6.一种细胞，其特征在于，所述的细胞包括有权利要求4所述的载体、或染色体中整合有外源的权利要求2所述的核酸分子、或表达权利要求1所述的CAR。
7.根据权利要求6所述的细胞，其特征在于，所述细胞为T细胞。
8.一种共表达细胞间黏附分子ICAM2的CAR-T细胞的制备方法，其特征在于，将细胞间黏附分子ICAM2与抗CDH17的CAR分子构建到同一个慢病毒载体上，并使用可剪接的2Alinker使两者相连，然后将该慢病毒载体转染到T细胞中；所述的CAR-T细胞中包含有权利要求1所述的CAR。
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