CN117343907A - 一种自分泌il7和il21的靶向cdh17的car-t细胞及其应用 - Google Patents
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Abstract
本发明提供了一种自分泌IL7和IL21的靶向CDH17的CAR‑T细胞及其应用，所述CAR‑T细胞表达特异性结合CDH17抗原的嵌合抗原受体和细胞因子IL7和IL21；所述嵌合抗原受体包括：(1)胞外识别域、(2)胞外间隔区、(3)跨膜区和(4)胞内信号传导结构域；所述胞外识别域包括抗CDH17的单链抗体，所述抗CDH17的单链抗体序列的氨基酸序列包括SEQ ID NO:1所示；所述细胞因子IL7的氨基酸序列包括SEQ ID NO:5所示。所述CAR‑T细胞自分泌高活性的IL7和IL21，既可以高效杀伤不同类型的肿瘤细胞，又可以作用于旁系免疫细胞，同时启动内源性抗肿瘤免疫应答。
Description
技术领域
本发明属于生物医药技术领域，具体涉及一种自分泌IL7和IL21的靶向CDH17的CAR-T细胞及其应用。
背景技术
嵌合抗原受体T细胞(CAR-T)过继免疫治疗是改善癌症患者预后的一种非常有前景的方法。随着CAR-T细胞结构的逐步改进和完善，众多病例已从中获益。然而，CAR-T在治疗实体瘤方面仍存在挑战。实体瘤由于其组织结构复杂、免疫抑制性微环境、肿瘤特异靶标缺乏等诸多因素，严重制约了CAR-T细胞的临床疗效。因此，迫切需要开发新型有效的基因工程免疫细胞技术以提升对实体瘤的治疗效果。
肿瘤的发生发展是一个多因素、多步骤相互作用的过程，其中细胞间的粘附及运动能力的失调是肿瘤发生发展的重要机制之一。CDH17是近年来发现的钙粘连蛋白家族中的新成员，在多种肿瘤的侵袭及转移中发挥重要作用。
CDH17主要表达于胚胎、成人肠上皮细胞和部分胰腺导管上皮细胞，在健康人群肝细胞、食管上皮细胞及胃黏膜中几乎不表达。CDH17在细胞黏附过程中充当了与钙黏蛋白同样重要的角色，CDH17可直接与细胞支架连接，发挥其细胞黏附作用，而经典的钙黏蛋白必须与链蛋白结合形成复合体才能发挥其黏附功能。在一些病理情况下，CDH17可表达于其它组织。CDH17的表达水平及其作用已在多种肿瘤中进行了实验研究，尤其在消化系统肿瘤中研究居多。目前研究发现，CDH17在胃癌、结直肠癌、肝癌、胰腺癌和胆管癌等多种肿瘤组织中均有不同程度的表达，CDH17的高水平表达与患者预后和风险评估密切相关。
目前已有多款基于CDH17的临床药物在研，主要用于胃肠道肿瘤治疗。其中，3款为双特异性抗体：ARB-202(CDH17×CD3)、ARB-001.T(CDH17×CD3)、BI-905711(CDH17×DR5/TRAIL-R2)；1款CAR-T药物CHM-2101；2款单抗。晚期消化道恶性肿瘤的治疗，往往是以化疗为基础的单药或联合治疗方案，虽然化疗药物及联合治疗策略迭代更新，但疗效始终未能获得突破性进展。肿瘤靶向免疫治疗提供了全新高效、安全、低毒的治疗策略，有望改变目前困境。现有研究成果已表明，靶向干扰CDH17可以抑制肿瘤生长。因此，CDH17作为新发现的肝肠钙黏蛋白，正成为胃肠道肿瘤靶向治疗的热门靶点。
目前使用的肿瘤抗原多为肿瘤相关抗原，在肿瘤细胞高表达，但在正常组织细胞亦有少量表达，导致CAR-T细胞疗法出现“靶向非肿瘤细胞的毒副效应”(On-target off-tumor)，限制了其在实体瘤治疗的临床应用。
细胞因子作为T细胞活化的第三信号，有助于T细胞增殖、存活和功能的发挥。许多细胞因子深刻影响T细胞的发育、分化和体内平衡。IL-2、IL-7、IL-15和IL-21是细胞因子家族的成员，其异聚受体共享共同的γ链(γc)。每种细胞因子都被描述为T细胞生长因子，并且每种细胞因子都被用来增强T细胞抗肿瘤免疫反应。细胞因子IL-21作为γ链家族的细胞因子成员，由活化的CD4+T细胞和NKT细胞产生分泌，其受体分布广泛，对于T细胞的增殖、分化和功能具有免疫调节作用。其中，IL-21协同IL-15促进NK细胞的增殖和成熟，IL-21协同IL-15和IL-18可促进NK和T细胞IFN-γ的产生，增强抗感染/肿瘤的活性。此外，IL-21可诱导B细胞产生抗感染/肿瘤的靶向抗体。目前已有数据证明IL-21在肿瘤清除方面表现要优于IL-2和IL-15，且其毒性较IL-2要更弱。研究发现，IL-7的表达与T细胞增殖密切相关。如用IL-7刺激新鲜T细胞，T细胞可剂量依赖性扩增，包括CD4+和CD8+亚群。还可以延长记忆性T细胞的存活时间。介于IL-7强大的免疫效应，尤其是调节T细胞的增殖、维持其细胞内环境稳定，并能增强T免疫应答的能力等的功能，使得IL-7作为一种免疫调节因子越来越受到关注。更有研究显示：IL-21与IL-7协同作用，增强细胞毒性T细胞的扩增和抗肿瘤功能。
然而，现有技术中，对于自分泌IL7和IL21的靶向CDH17的嵌合受体并没有详细的研究。因此，靶向CDH17的CAR-T细胞，且自分泌高活性的IL7和IL21细胞因子，将可能突破CAR-T实体瘤的困境，为胃肠道肿瘤患者带来新的治疗希望。
发明内容
针对现有技术存在的不足，本发明的目的在于提供一种自分泌IL7和IL21的靶向CDH17的CAR-T细胞及其应用。本发明提供的靶向CDH17嵌合受体的CAR-T细胞不仅具有针对CDH17阳性胃肠道肿瘤的特异性杀伤作用，而且可以与自分泌IL7和IL21一起通过病毒/非病毒递送方式导入多种杀伤性免疫细胞，如T细胞、NK细胞或NKT细胞等免疫细胞，并稳定表达于其上。使用本发明的自分泌IL7和IL21的靶向CDH17的嵌合受体T细胞，具有更好的抗肿瘤疗效。本发明的自分泌IL7和IL21的靶向CDH17的嵌合受体的免疫细胞，既可以高效杀伤不同类型的肿瘤细胞，又可以作用于旁系免疫细胞，同时启动内源性免疫应答。
为达到此发明目的，本发明采用以下技术方案：
第一方面，本发明提供一种自分泌IL7和IL21的靶向CDH17的CAR-T细胞，所述CAR-T细胞表达特异性结合CDH17抗原的嵌合抗原受体和细胞因子IL7和IL21；
所述嵌合抗原受体包括：(1)胞外识别域、(2)胞外间隔区、(3)跨膜区和(4)胞内信号传导结构域；
所述胞外识别域包括抗CDH17的单链抗体，所述抗CDH17的单链抗体序列的氨基酸序列包括SEQ ID NO:1所示；
所述细胞因子IL7的氨基酸序列包括SEQ ID NO:5所示。
本发明中，所述自分泌IL7和IL21的靶向CDH17的CAR-T细胞自分泌高活性的IL7和IL21细胞因子，既可以高效杀伤不同类型的肿瘤细胞，又可以作用于旁系免疫细胞，同时启动内源性抗肿瘤免疫应答。
优选地，所述胞内信号传导结构域包括：一个或多个共刺激信号传导结构域，和/或一个或多个细胞因子受体信号传导结构域。
优选地，所述嵌合抗原受体包括：CD8α的信号肽序列、抗CDH17的单链抗体序列、CD8α的铰链区序列、CD8α的跨膜区序列、4-1BB共刺激域序列和CD3ζ信号传导域序列。
在一个具体实施方式中，(1)胞外识别域为CD8α的信号肽序列和抗CDH17的单链抗体序列，(2)胞外间隔区为CD8α的铰链区序列，(3)跨膜区为CD8α的跨膜区序列，(4)胞内信号传导结构域为4-1BB共刺激域序列和CD3ζ信号传导域序列。
优选地，所述CD8α的信号肽序列的氨基酸序列包括SEQ ID NO:15所示。
优选地，所述CD8α的铰链区序列的氨基酸序列包括SEQ ID NO:16所示。
优选地，所述CD8α的跨膜区序列的氨基酸序列包括SEQ ID NO:17所示。
优选地，所述4-1BB共刺激域序列的氨基酸序列包括SEQ ID NO:18所示。
优选地，所述CD3ζ信号传导域序列的氨基酸序列包括SEQ ID NO:19所示。
优选地，所述嵌合抗原受体的氨基酸序列包括SEQ ID NO:3所示。
优选地，所述细胞因子IL21的氨基酸序列包括如下序列：野生型IL21、截短型IL21和突变型IL21及其活性片段。
优选地，所述细胞因子IL21的氨基酸序列包括SEQ ID NO:7所示。
优选地，所述嵌合抗原受体和细胞因子之间包含可裂解部分。
优选地，所述细胞因子IL7和IL21之间包含可裂解部分。
优选地，所述可裂解部分包含2A肽。
优选地，所述2A肽选自P2A、E2A、F2A或T2A中任意一种。
本发明中，所述P2A氨基酸序列如SEQ ID NO:11所示，所述E2A氨基酸序列如SEQID NO:12所示，所述F2A氨基酸序列如SEQ ID NO:13所示，所述T2A氨基酸序列如SEQ IDNO:14所示。
优选地，所述嵌合抗原受体和细胞因子各自组成性表达或诱导型表达。
优选地，所述IL-21是分泌型或膜型IL-21。
优选地，所述IL7是分泌型或膜型IL-7。
优选地，所述特异性结合CDH17抗原的嵌合抗原受体和细胞因子IL7和IL21的氨基酸序列包括SEQ ID NO:9所示。
第二方面，本发明提供一种核酸分子，所述核酸分子编码第一方面所述的自分泌IL7和IL21的靶向CDH17的CAR-T细胞中表达的嵌合抗原受体和细胞因子IL7和IL21。
优选地，所述核酸分子包括SEQ ID NO:10所示。
第三方面，本发明提供一种慢病毒载体，所述慢病毒载体包含第二方面所述的核酸分子。
第四方面，本发明提供一种重组慢病毒，所述重组慢病毒由第三方面所述的慢病毒载体与包装辅助质粒共转染哺乳动物细胞制备得到。
第五方面，本发明提供一种第一方面所述的自分泌IL7和IL21的靶向CDH17的CAR-T细胞的制备方法，所述制备方法包括：
将第四方面所述的重组慢病毒导入T细胞中，经过体外激活扩大培养获得所述自分泌IL7和IL21的靶向CDH17的CAR-T细胞。
第六方面，本发明提供一种药物组合物，所述药物组合物包括第一方面所述的自分泌IL7和IL21的靶向CDH17的CAR-T细胞。
优选地，所述药物组合物还包括药学上可接受的辅料。
第七方面，本发明提供第一方面所述的自分泌IL7和IL21的靶向CDH17的CAR-T细胞、第三方面所述的慢病毒载体、第四方面所述的重组慢病毒或第六方面所述的药物组合物在制备实体瘤治疗药物中的应用。
优选地，所述实体瘤包括胃肠道肿瘤。
相对于现有技术，本发明具有以下有益效果：
(1)本发明提供了自分泌IL7和IL21的靶向CDH17的嵌合受体的免疫细胞，本发明的CDH17嵌合受体具有特异性结合CDH17抗原的能力，其具备更高的亲和力，可特异性杀灭CDH17阳性肿瘤细胞，并对正常细胞无杀伤副作用。
(2)本发明的免疫细胞自分泌IL-7，既可以诱导活化状态下T细胞增殖，又可以延长记忆性T细胞的存活时间，增强T免疫应答的能力。
(3)本发明的免疫细胞自分泌IL-21，既可以高效杀伤不同类型的肿瘤细胞，又可以作用于旁系免疫细胞，同时启动内源性免疫应答。
(4)本发明提供了自分泌IL7和IL21的靶向CDH17的嵌合受体的免疫细胞，拥有更强的抵抗肿瘤免疫抑制微环境的能力，并使免疫细胞保持记忆表型，维持长效杀伤作用。
附图说明
图1是嵌合抗原受体的结构示意图。
图2是CAR-T扩增倍数。
图3是IL7和IL21的分泌水平检测结果。
图4是CAR-T杀伤率检测结果。
具体实施方式
下面通过具体实施方式来进一步说明本发明的技术方案。本领域技术人员应该明了，所述实施例仅仅是帮助理解本发明，不应视为对本发明的具体限制。
实施例中未注明具体技术或条件者，按照本领域内的文献所描述的技术或条件，或者按照产品说明书进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可通过正规渠道商购获得的常规产品。
Anti-CDH17 scFv氨基酸序列如SEQ ID NO:1所示。
Anti-CDH17 scFv核苷酸序列如SEQ ID NO:2所示。
Anti-CDH17 CAR氨基酸序列如SEQ ID NO:3所示。
Anti-CDH17 CAR核苷酸序列如SEQ ID NO:4所示。
IL-7氨基酸序列如SEQ ID NO:5所示。
IL-7核苷酸序列如SEQ ID NO:6所示。
IL-21氨基酸序列如SEQ ID NO:7所示。
IL-21核苷酸序列如SEQ ID NO:8所示。
自分泌IL7和IL21的靶向CDH17的嵌合受体(7×21CAR)氨基酸序列如SEQ ID NO:9所示。
自分泌IL7和IL21的靶向CDH17的嵌合受体(7×21CAR)核苷酸序列如SEQ ID NO:10所示。
2A肽包括：P2A、E2A、F2A、T2A。
P2A氨基酸序列如SEQ ID NO:11所示。
E2A氨基酸序列如SEQ ID NO:12所示。
F2A氨基酸序列如SEQ ID NO:13所示。
T2A氨基酸序列如SEQ ID NO:14所示。
嵌合抗原受体具体各部分序列如下所示：
CD8α信号肽(leader)的氨基酸序列如SEQ ID NO:15所示。
CD8α铰链区(hinge)的氨基酸序列如SEQ ID NO:16所示。
CD8α跨膜区(TM)的氨基酸序列如SEQ ID NO:17所示。
4-1BB胞内共刺激域(ICD)的氨基酸序列如SEQ ID NO:18所示。
CD3ζ信号传导域的氨基酸序列如SEQ ID NO:19所示。
实施例1嵌合抗原受体的设计
本实施例构建了抗CDH17的嵌合抗原受体(anti-CDH17 CAR)、自分泌IL7和IL21的靶向CDH17的嵌合受体(7×21CAR)，结构示意图见图1。嵌合抗原受体包括一段CD8α的信号肽序列(Leader)，抗CDH17的单链抗体序列(anti-CDH17 scFv)，CD8α的铰链区(Hinge)和跨膜区序列(Transmembrane)，4-1BB共刺激域序列和CD3ζ信号传导域序列。
Anti-CDH17 scFv氨基酸序列的氨基酸序列来源于专利WO2023107558A1中的07-0663-h7scfv序列，如SEQ ID NO:1所示。
CD8α信号肽(leader)的氨基酸序列如SEQ ID NO:15所示。
CD8α铰链区(hinge)的氨基酸序列如SEQ ID NO:16所示。
CD8α跨膜区(TM)的氨基酸序列如SEQ ID NO:17所示。
4-1BB胞内共刺激域(ICD)的氨基酸序列如SEQ ID NO:18所示。
CD3ζ信号传导域的氨基酸序列如SEQ ID NO:19所示。
所述抗CDH17的嵌合抗原受体(anti-CDH17 CAR)的氨基酸序列如SEQ ID NO:3所示。
所述自分泌IL7和IL21的靶向CDH17的嵌合受体(7×21CAR)的氨基酸序列如SEQID NO:9所示。
实施例2构建嵌合抗原受体表达载体
(1)根据CAR基因的蛋白理论序列，优化CAR基因，使其能够在人细胞中高效表达，通过密码子优化及全基因合成方法制备CAR基因，进行全基因合成。
编码抗CDH17的嵌合抗原受体(anti-CDH17 CAR)的核苷酸序列如SEQ ID NO:4所示。
编码自分泌IL7和IL21的靶向CDH17的嵌合受体(7×21CAR)的核苷酸序列如SEQID NO:10所示。
(2)用EcoRI和BamHI双酶切全基因合成的CAR基因和空载体pCDH-EF1-MCS，于37℃水浴中酶切30min后，使用1.5％的琼脂糖凝胶进行DNA电泳，然后使用天根的琼脂糖凝胶试剂盒纯化回收处理。
(3)pCDH-EF1-MCS载体与CAR基因片段的连接，连接体系如表1所示。
表1
| 组件 | 添加量(μL) |
| pCDH-EF1-MCS载体 | 2(50ng) |
| CAR基因 | 10(150ng) |
| T4 DNA连接缓冲液 | 2 |
| T4 DNA连接酶(NEB) | 1 |
| dd H2O | 5 |
| 总共 | 20 |
于22℃连接1h，连接产物直接转化Stbl3大肠杆菌感受态细胞，取200μL转化产物涂布氨苄抗性的LB平板，LB平板于37℃的培养箱中倒置培养过夜。次日早晨随机挑选3个单克隆进行菌落PCR鉴定，将阳性克隆送样测序。
实施例3慢病毒包装
分别对实施例2中的慢病毒表达载体进行慢病毒包装，采用四质粒系统，具体步骤如下：
(1)四质粒系统分别表达慢病毒载体包装所需的gag/pol、Rev、VSV-G及本发明构建的CAR表达载体：将四质粒进行瞬时转染293T细胞，DNA含量为2μg/mL。
(2)将上述质粒与PEI转染试剂混合，加入至一定体积的无血清的DMEM中，混匀后放置15分钟，将上述混合液加入至铺有293T细胞的T75培养瓶中，轻轻混匀，于37℃、5％CO2细胞培养箱培养6h。
(3)6h后更换新鲜培养基，继续进行培养，并且加入10mM的丁酸钠溶液，72h后收集慢病毒的培养上清进行纯化检测。
实施例4慢病毒感染T细胞
分离PBMC后，用含50ng/mL的OKT3、300IU/mL的IL-2的X-VIVO进行激活，2日后将培养基更换成含300IU/mL的X-VIVO进行扩大培养；利用RetroNectin(重组人纤维连接片段)提高慢病毒对T细胞的感染效率，将30μg的RetroNectin，包被于6孔板内，放于37℃细胞培养箱2h；吸取RetroNectin，利用含2.5％BSA的Hank’s溶液封闭包被后的6孔板，放于37℃细胞培养箱0.5h；吸取封闭液，利用含2％Hepes的Hank’s溶液洗涤6孔板，加入X-VIVO培养基，加入适量的慢病毒溶液，离心力2000g，离心2h；弃上清，加入1×106的激活后的PBMC细胞，离心力1000g，离心10min，于37℃、5％CO2和一定湿度的细胞培养箱内培养。每两天进行一次计数并更换含300IU/mL的X-VIVO，并且将细胞浓度维持0.5×106-1×106/mL，连续培养8天。用美国Countstar IC1000自动细胞计数仪计数，评估CAR-T细胞的扩增情况。CAR-T扩增倍数如图2所示，结果发现，各CAR-T组扩增良好，未转导T细胞、anti-CDH17 CAR-T和7×21CAR-T细胞在培养9天后分别扩增49.45、53.36和52.71倍。
实施例5CAR的表达及其功能评估
采用流式细胞仪检测CAR-T细胞表面CAR分子的表达及其与对应抗原蛋白的结合能力，利用APC-anti-CD3抗体标记T细胞群，然后用CDH17蛋白(ACRO Biosystems公司；货号CA7-H5258)检测CAR表达阳性率。流式细胞仪检测结果显示：anti-CDH17 CAR-T细胞和7×21CAR-T细胞的CAR表达率分别为58.62％和59.87％。表明CAR-T能有效识别CDH17抗原。另外，未转导T细胞不表达嵌合受体。
实施例6ELISA检测IL7和IL21的分泌
IL-21ELISA kit和IL-7ELISA kit分别购自上海达科为生物技术有限公司和上海优宁维生物科技有限公司。分别取3×106个anti-CDH17 CAR-T细胞和7×21CAR-T细胞置于12孔板中，加入1mL的完全培养基，置于37℃，5％CO2细胞培养箱中培养48h并收集上清，ELISA检测上清IL7和IL21的分泌水平。
结果如图3所示，自分泌IL7和IL21的靶向CDH17的嵌合受体T细胞(7×21CAR-T)可分泌高水平的IL7和IL-21，而anti-CDH17 CAR-T细胞培养上清和未转导T细胞不分泌IL7和IL-21。
实施例7CAR-T功能评估
肿瘤细胞杀伤效率由基于荧光素酶的细胞杀伤检测方法(Luciferase-basedcytotoxicity assay)进行评估。用过表达CDH17和荧光素酶基因的人结肠癌细胞SW480(SW480-CDH17-Luc)作为靶细胞，进行杀伤试验。
首先，将1×104个SW480-CDH17-Luc接种于96孔平底黑板上，每孔100μL培养基，置于37℃，5％CO2细胞培养箱中培养18-20h。第二天，以效应细胞：靶细胞＝1:1的比例加入嵌合受体修饰T细胞至含有靶细胞的孔中，置于37℃，5％CO2细胞培养箱中继续培养6h，共培养结束后使用微孔板发光检测仪检测靶细胞的荧光素酶活力值。细胞杀伤率的计算公式如下所示：
细胞杀伤率(％)＝(未转导T细胞组荧光素酶活力值-实验组荧光素酶活力值)/未转导T细胞组荧光素酶活力值×100。
CAR-T杀伤率检测结果如图4所示，结果显示，anti-CDH17 CAR-T细胞和7×21CAR-T细胞都能杀伤SW480-CDH17-Luc，anti-CDH17 CAR-T细胞的杀伤率为41.35％。进一步检测7×21CAR-T的杀伤能力，其杀伤率为75.47％，表明自分泌IL7和IL21的靶向CDH17的嵌合受体T细胞(7×21CAR-T)比经典CAR-T(anti-CDH17 CAR-T)的杀伤能力更强。
综上所述，自分泌IL7和IL21的靶向CDH17的嵌合受体T细胞(7×21CAR-T)能特异性识别CDH17抗原；相比经典的CAR-T(anti-CDH17 CAR-T)，7×21CAR-T的杀伤能力更强。本发明提供的自分泌IL7和IL21的靶向CDH17的嵌合受体T细胞在实体瘤的治疗中具有极大的临床转化价值。
申请人声明，以上所述仅为本发明的具体实施方式，但本发明的保护范围并不局限于此，所属技术领域的技术人员应该明了，任何属于本技术领域的技术人员在本发明揭露的技术范围内，可轻易想到的变化或替换，均落在本发明的保护范围和公开范围之内。
Claims (11)
1.一种自分泌IL7和IL21的靶向CDH17的CAR-T细胞，其特征在于，所述CAR-T细胞表达特异性结合CDH17抗原的嵌合抗原受体和细胞因子IL7和IL21；
所述嵌合抗原受体包括：(1)胞外识别域、(2)胞外间隔区、(3)跨膜区和(4)胞内信号传导结构域；
所述胞外识别域包括抗CDH17的单链抗体，所述抗CDH17的单链抗体序列的氨基酸序列包括SEQ ID NO:1所示；
所述细胞因子IL7的氨基酸序列包括SEQ ID NO:5所示。
2.根据权利要求1所述的自分泌IL7和IL21的靶向CDH17的CAR-T细胞，其特征在于，所述胞内信号传导结构域包括：一个或多个共刺激信号传导结构域，和/或一个或多个细胞因子受体信号传导结构域；
优选地，所述嵌合抗原受体包括：CD8α的信号肽序列、抗CDH17的单链抗体序列、CD8α的铰链区序列、CD8α的跨膜区序列、4-1BB共刺激域序列和CD3ζ信号传导域序列；
优选地，所述CD8α的信号肽序列的氨基酸序列包括SEQ ID NO:15所示；
优选地，所述CD8α的铰链区序列的氨基酸序列包括SEQ ID NO:16所示；
优选地，所述CD8α的跨膜区序列的氨基酸序列包括SEQ ID NO:17所示；
优选地，所述4-1BB共刺激域序列的氨基酸序列包括SEQ ID NO:18所示；
优选地，所述CD3ζ信号传导域序列的氨基酸序列包括SEQ ID NO:19所示；
优选地，所述嵌合抗原受体的氨基酸序列包括SEQ ID NO:3所示。
3.根据权利要求1或2所述的自分泌IL7和IL21的靶向CDH17的CAR-T细胞，其特征在于，所述细胞因子IL21的氨基酸序列包括如下序列：野生型IL21、截短型IL21和突变型IL21及其活性片段；
优选地，所述细胞因子IL21的氨基酸序列包括SEQ ID NO:7所示；
优选地，所述嵌合抗原受体和细胞因子之间包含可裂解部分；
优选地，所述细胞因子IL7和IL21之间包含可裂解部分；
优选地，所述可裂解部分包含2A肽；
优选地，所述2A肽选自P2A、E2A、F2A或T2A中任意一种。
4.根据权利要求1-3中任一项所述的自分泌IL7和IL21的靶向CDH17的CAR-T细胞，其特征在于，所述嵌合抗原受体和细胞因子各自组成性表达或诱导型表达；
优选地，所述IL-21是分泌型或膜型IL-21；
优选地，所述IL7是分泌型或膜型IL-7。
5.根据权利要求1-4中任一项所述的自分泌IL7和IL21的靶向CDH17的CAR-T细胞，其特征在于，所述特异性结合CDH17抗原的嵌合抗原受体和细胞因子IL7和IL21的氨基酸序列包括SEQ ID NO:9所示。
6.一种核酸分子，其特征在于，所述核酸分子编码权利要求1-5中任一项所述的自分泌IL7和IL21的靶向CDH17的CAR-T细胞中表达的嵌合抗原受体和细胞因子IL7和IL21；
优选地，所述核酸分子包括SEQ ID NO:10所示。
7.一种慢病毒载体，其特征在于，所述慢病毒载体包含权利要求6所述的核酸分子。
8.一种重组慢病毒，其特征在于，所述重组慢病毒由权利要求7所述的慢病毒载体与包装辅助质粒共转染哺乳动物细胞制备得到。
9.一种权利要求1-5中任一项所述的自分泌IL7和IL21的靶向CDH17的CAR-T细胞的制备方法，其特征在于，所述制备方法包括：
将权利要求8所述的重组慢病毒导入T细胞中，经过体外激活扩大培养获得所述自分泌IL7和IL21的靶向CDH17的CAR-T细胞。
10.一种药物组合物，其特征在于，所述药物组合物包括权利要求1-5中任一项所述的自分泌IL7和IL21的靶向CDH17的CAR-T细胞；
优选地，所述药物组合物还包括药学上可接受的辅料。
11.权利要求1-5中任一项所述的自分泌IL7和IL21的靶向CDH17的CAR-T细胞、权利要求7所述的慢病毒载体、权利要求8所述的重组慢病毒或权利要求10所述的药物组合物在制备实体瘤治疗药物中的应用；
优选地，所述实体瘤包括胃肠道肿瘤。
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