CN113416260B - 靶向Claudin18.2的特异性嵌合抗原受体细胞及其制备方法和应用 - Google Patents

靶向Claudin18.2的特异性嵌合抗原受体细胞及其制备方法和应用 Download PDF

Info

Publication number
CN113416260B
CN113416260B CN202110397832.1A CN202110397832A CN113416260B CN 113416260 B CN113416260 B CN 113416260B CN 202110397832 A CN202110397832 A CN 202110397832A CN 113416260 B CN113416260 B CN 113416260B
Authority
CN
China
Prior art keywords
gly
leu
ser
ala
thr
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Active
Application number
CN202110397832.1A
Other languages
English (en)
Other versions
CN113416260A (zh
Inventor
代红久
徐慧
朱靓婧
王梦瑶
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Nanjing Kaidi Medical Technology Co ltd
Original Assignee
Nanjing Kaidi Medical Technology Co ltd
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Nanjing Kaidi Medical Technology Co ltd filed Critical Nanjing Kaidi Medical Technology Co ltd
Priority to CN202110397832.1A priority Critical patent/CN113416260B/zh
Publication of CN113416260A publication Critical patent/CN113416260A/zh
Application granted granted Critical
Publication of CN113416260B publication Critical patent/CN113416260B/zh
Active legal-status Critical Current
Anticipated expiration legal-status Critical

Links

Images

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C07K16/18—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans
    • C07K16/28—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K35/00—Medicinal preparations containing materials or reaction products thereof with undetermined constitution
    • A61K35/12—Materials from mammals; Compositions comprising non-specified tissues or cells; Compositions comprising non-embryonic stem cells; Genetically modified cells
    • A61K35/14—Blood; Artificial blood
    • A61K35/17—Lymphocytes; B-cells; T-cells; Natural killer cells; Interferon-activated or cytokine-activated lymphocytes
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K39/0005—Vertebrate antigens
    • A61K39/0011—Cancer antigens
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P31/00—Antiinfectives, i.e. antibiotics, antiseptics, chemotherapeutics
    • A61P31/04—Antibacterial agents
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P31/00—Antiinfectives, i.e. antibiotics, antiseptics, chemotherapeutics
    • A61P31/12—Antivirals
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P35/00—Antineoplastic agents
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P37/00—Drugs for immunological or allergic disorders
    • A61P37/02—Immunomodulators
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • C07K14/705—Receptors; Cell surface antigens; Cell surface determinants
    • C07K14/70503—Immunoglobulin superfamily
    • C07K14/7051—T-cell receptor (TcR)-CD3 complex
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • C07K14/705—Receptors; Cell surface antigens; Cell surface determinants
    • C07K14/70503—Immunoglobulin superfamily
    • C07K14/70517—CD8
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • C07K14/705—Receptors; Cell surface antigens; Cell surface determinants
    • C07K14/70503—Immunoglobulin superfamily
    • C07K14/70521—CD28, CD152
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • C07K14/705—Receptors; Cell surface antigens; Cell surface determinants
    • C07K14/70578—NGF-receptor/TNF-receptor superfamily, e.g. CD27, CD30, CD40, CD95
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
    • C12N15/79—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts
    • C12N15/85—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts for animal cells
    • C12N15/86—Viral vectors
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N5/00—Undifferentiated human, animal or plant cells, e.g. cell lines; Tissues; Cultivation or maintenance thereof; Culture media therefor
    • C12N5/06—Animal cells or tissues; Human cells or tissues
    • C12N5/0602—Vertebrate cells
    • C12N5/0634—Cells from the blood or the immune system
    • C12N5/0636—T lymphocytes
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K2039/51—Medicinal preparations containing antigens or antibodies comprising whole cells, viruses or DNA/RNA
    • A61K2039/515—Animal cells
    • A61K2039/5156—Animal cells expressing foreign proteins
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/20—Immunoglobulins specific features characterized by taxonomic origin
    • C07K2317/24—Immunoglobulins specific features characterized by taxonomic origin containing regions, domains or residues from different species, e.g. chimeric, humanized or veneered
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/60—Immunoglobulins specific features characterized by non-natural combinations of immunoglobulin fragments
    • C07K2317/62—Immunoglobulins specific features characterized by non-natural combinations of immunoglobulin fragments comprising only variable region components
    • C07K2317/622—Single chain antibody (scFv)
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/90—Immunoglobulins specific features characterized by (pharmaco)kinetic aspects or by stability of the immunoglobulin
    • C07K2317/92—Affinity (KD), association rate (Ka), dissociation rate (Kd) or EC50 value
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2319/00—Fusion polypeptide
    • C07K2319/01—Fusion polypeptide containing a localisation/targetting motif
    • C07K2319/02—Fusion polypeptide containing a localisation/targetting motif containing a signal sequence
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2319/00—Fusion polypeptide
    • C07K2319/01—Fusion polypeptide containing a localisation/targetting motif
    • C07K2319/03—Fusion polypeptide containing a localisation/targetting motif containing a transmembrane segment
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2319/00—Fusion polypeptide
    • C07K2319/33—Fusion polypeptide fusions for targeting to specific cell types, e.g. tissue specific targeting, targeting of a bacterial subspecies
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2319/00—Fusion polypeptide
    • C07K2319/70—Fusion polypeptide containing domain for protein-protein interaction
    • C07K2319/74—Fusion polypeptide containing domain for protein-protein interaction containing a fusion for binding to a cell surface receptor
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2510/00—Genetically modified cells
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2740/00—Reverse transcribing RNA viruses
    • C12N2740/00011—Details
    • C12N2740/10011—Retroviridae
    • C12N2740/15011—Lentivirus, not HIV, e.g. FIV, SIV
    • C12N2740/15041—Use of virus, viral particle or viral elements as a vector
    • C12N2740/15043—Use of virus, viral particle or viral elements as a vector viral genome or elements thereof as genetic vector
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2800/00—Nucleic acids vectors
    • C12N2800/10—Plasmid DNA
    • C12N2800/106—Plasmid DNA for vertebrates
    • C12N2800/107—Plasmid DNA for vertebrates for mammalian

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Cell Biology (AREA)
  • Veterinary Medicine (AREA)
  • Pharmacology & Pharmacy (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Public Health (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Gastroenterology & Hepatology (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • Toxicology (AREA)
  • Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Oncology (AREA)
  • Virology (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Communicable Diseases (AREA)
  • Epidemiology (AREA)
  • Hematology (AREA)
  • Mycology (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Plant Pathology (AREA)
  • Developmental Biology & Embryology (AREA)
  • Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)

Abstract

本发明涉及特异性靶向人Claudin18.2的嵌合抗原受体细胞及其制备方法和应用，本发明的靶向人Claudin18.2的特异性嵌合抗原受体修饰的免疫应答细胞能增强与肿瘤细胞的结合，具有明显抗肿瘤活性。本发明的特异性靶向人Claudin18.2的嵌合抗原受体修饰的工程免疫细胞具有强特异性和良好的安全性。

Description

靶向Claudin18.2的特异性嵌合抗原受体细胞及其制备方法 和应用
技术领域
本发明属于嵌合抗原受体细胞领域，涉及一种特异性靶向人Claudin18.2的嵌合抗原受体的氨基酸编码序列、及其修饰的免疫应答细胞，以及它们的制备方法和在药物制备中的应用。
背景技术
随着生物技术的飞速发展，免疫细胞治疗已成为癌症治疗领域的第四大疗法。
癌症免疫疗法主要包括过继性细胞治疗、免疫调节剂、肿瘤疫苗以及免疫结合点阻断治疗等。其中，在细胞治疗领域，CAR-T疗法无疑已成为研究机构和制药公司争相“追捧”的明星。
CAR-T(Chimeric Antigen Receptor T-Cell，嵌合抗原受体T细胞)免疫疗法，其原理主要是通过取病人自身T细胞进行嵌合抗原受体的基因修饰，CAR-T细胞能够特异性地识别肿瘤相关抗原(肿瘤细胞标志物)，从而引导T细胞靶向肿瘤。相较于常规免疫细胞，CAR-T细胞的靶向性、杀伤活性和持久性都更高，并且可以克服肿瘤局部免疫抑制微环境并打破宿主免疫耐受状态。该疗法在急性白血病和非霍奇金淋巴瘤的治疗上有着显著的疗效，被认为是最有前景的肿瘤治疗方式之一。
然而，90％的癌症是实体瘤，更多种类的实体瘤以及更多的肿瘤表面特异性靶点抗原有待进一步确认。CAR-T免疫疗法应用于实体瘤治疗面临诸多挑战，包括CAR-T细胞对于肿瘤细胞上抗原表达的特异性要求非常高、否则容易造成T细胞持续激活而杀伤正常细胞，或释放大量细胞因子引起严重副作用。此外，由于肿瘤异质性，免疫抑制性微环境以及肿瘤内T细胞运输和持久性不足，导致针对实体瘤的嵌合抗原受体CAR-T细胞疗法无法达到最佳疗效。
因此，发挥CAR-T技术应用的关键在于确定至少一种靶向肿瘤的合适抗原，这些抗原在肿瘤细胞表面高表达，而在正常细胞表面无表达或低表达。
近年来，研究表明，紧密连接蛋白Claudin是一种四次跨膜蛋白，NH2端和COOH端位于胞内，具有两个胞外环，迄今为止一共发现了27个家族成员。Claudin18.2是Claudin家族中在上皮紧密连接处表达的四次跨膜蛋白，是细胞紧密连接的重要分子，其构成了细胞旁屏障，控制细胞间分子流动。Claudin18.2是一个高度特异性的细胞表面分子，在正常的组织中仅表达在分化的胃粘膜上皮细胞上，使得开发针对Claudin18.2的治疗性抗体具有更大的抗癌潜力、更低的毒性，有更大的最佳用药剂量空间。Claudin18.2蛋白在胃癌、胰腺、卵巢、胆癌和肺腺癌等实体瘤中高表达(参见Sahin等人，Clinical Cancer Research(2008))。另外据专家披露，Claudin18.2高表达的肿瘤往往不表达PD-L1，对PD-L1靶向的免疫抑制药物不敏感，因此是一个临床需求未被满足的领域。Claudin18.2在正常组织中的独特表达谱，以及在多种肿瘤中的异常表达情况使其成为了非常有吸引力的抗癌治疗靶标。同时Claudin18.2作为细胞膜表面蛋白，暴露的胞外结构允许抗体的结合，这些特点表明Claudin18.2是一个理想的治疗性靶点。
综上所述，研发一种特异性靶向人Claudin18.2的特异性嵌合抗原受体修饰的工程化免疫应答细胞极具应用前景。该工程细胞通过高特异性识别肿瘤细胞表面产生的Claudin18.2来传递活化信号并激活免疫系统，对肿瘤细胞发挥杀伤作用且安全性良好，从而达到良好的临床治疗效果。
发明内容
鉴于相关技术的上述问题和/或其他问题，本发明的目的是为了克服现有肿瘤临床技术中面临的肿瘤微环境中效应细胞趋向结合并杀死肿瘤细胞的特异性不强和安全性不高的问题，提供特异性靶向人Claudin18.2的嵌合抗原受体、及其基因和重组表达载体、工程化的特异性靶向人Claudin18.2嵌合抗原受体修饰的免疫应答细胞及其应用。本发明的特异性靶向人Claudin18.2的嵌合抗原受体修饰的免疫应答细胞高特异性杀死肿瘤细胞且安全性良好，从而提供了一种具有应用前景的肿瘤治疗的新手段。
技术方案
特异性靶向人Claudin18.2的嵌合抗原受体修饰的免疫细胞，其特征在于所述的免疫细胞含有嵌合抗原受体，所述的嵌合抗原受体的氨基酸序列为：
从氨基端到羧基端顺次连接的引导序列的氨基酸序列、靶向结合人Claudin18.2的胞外识别结构域的scFv的氨基酸序列、铰链区氨基酸序列、跨膜结构域氨基酸序列、胞内信号结构域氨基酸序列；
其中所述胞内信号结构域包括免疫受体酪氨酸活化基序和共刺激信号域；
其中靶向结合人Claudin18.2的胞外识别结构域的人源化scFv的氨基酸序列为：SEQ ID No.2或SEQ ID No.3或SEQ ID No.4或SEQ ID No.5所示的靶向结合人Claudin18.2的氨基酸序列；或与所示SEQ ID No.2或SEQ ID No.3或SEQ ID No.4或SEQ ID No.5氨基酸序列具有80～99％同源性的经过氨基酸修饰产生的变体。
所述的免疫细胞，其特征在于：
编码所述的特异性靶向人Claudin18.2的嵌合抗原受体的核酸分子，包括从5’到3’依次串联连接的编码所述引导序列的核苷酸序列、编码所述靶向结合人Claudin18.2蛋白的scFv核苷酸序列、编码铰链区的核苷酸序列，编码所述跨膜结构域的核苷酸序列、编码所述胞内信号结构域的核苷酸序列；
一种特异性靶向人Claudin18.2的嵌合抗原受体的重组载体或表达质粒，其特征在于包含所述的核酸分子。
所述重组载体或表达质粒，其特征在于重组载体或表达质粒含有启动子，其中所述启动子包括EF1α长启动子，或EFS短启动子。
一种重组病毒，其特征在于包括所述的重组载体的核苷酸序列和病毒颗粒；所述病毒包括慢病毒、腺病毒、腺联病毒或逆转录病毒。
所述的免疫细胞在制备抗Claudin18.2阳性肿瘤，包括胃癌、胰腺癌、肝癌、脑癌、前列腺癌、淋巴癌、白血病、肠癌、肺癌、卵巢癌或乳腺癌药物中的应用。
具体说明：
第一方面，本申请提供了一种特异性靶向人Claudin18.2的嵌合抗原受体，所述靶向结合人Claudin18.2的scFv序列为：SEQ ID No.2或SEQ ID No.3或SEQ ID No.4或SEQ IDNo.5所示的氨基酸序列，或与所示SEQ ID No.2或SEQ ID No.3或SEQ ID No.4或SEQ IDNo.5氨基酸序列具有80～99％同源性的经过氨基酸修饰产生的变体。
发明人经过创造性劳动，不断地进行氨基酸序列设计以及序列的排列组合和筛选，对百余条CAR分子的序列进行随机筛选试验和靶向性功能验证(例如构建病毒载体，以及进一步感染T细胞，获得修饰的T细胞，并检测所得修饰的T细胞的体外杀伤活性等试验)，之后根据多个随机组合的结果比对，再进行序列调整，最终筛选出效果较好的4条序列，获得了本发明的高效价靶向人Claudin18.2的4条scFv氨基酸序列及其功能性变体。
第二方面，本申请提供了一种特异性靶向人Claudin18.2的嵌合抗原受体，其包含从氨基端到羧基端顺次连接的引导序列的氨基酸序列、靶向结合人Claudin18.2的胞外识别结构域的scFv的氨基酸序列、铰链区的氨基酸序列、跨膜结构域的核苷酸序列、胞内信号结构域的氨基酸序列。所
述靶向结合人Claudin18.2的胞外识别结构域的氨基酸序列包含本申请第一方面所述的靶向结合人Claudin18.2的scFv氨基酸序列或其变体。
胞外识别结构域(还称作胞外域或简单地由其含有的识别元件所指)包含特异性结合靶细胞的细胞表面上存在的分子的识别元件。
在一些非限制性实例中，前导序列共价连接到细胞外抗原结合结构域的5’末端。
在一些实施方式中，所述特异性靶向人Claudin18.2的嵌合抗原受体包括铰链区。
在一些实施方式中，所述跨膜结构域包括跨膜区。
在一些实施方式中，所述铰链区的人CD8多肽的氨基酸序列选自SEQ ID No.6所示的多肽或经过氨基酸修饰的功能性变体，其中所述经过氨基酸修饰的功能性变体为与SEQID No.6所示氨基酸序列具有90～99％同源性的多肽。
在一些实施例中，所述跨膜区的人CD8的氨基酸序列选自SEQ ID No.7所示的多肽或经过氨基酸修饰的功能性变体，其中所述经过氨基酸修饰的功能性变体为与SEQ IDNo.7所示氨基酸序列具有90～99％同源性的多肽。
在一些实施例中，所述跨膜区的人CD28的氨基酸序列选自SEQ ID No.8所示的多肽或经过氨基酸修饰的功能性变体，其中所述经过氨基酸修饰的功能性变体为与SEQ IDNo.8所示氨基酸序列具有90～99％同源性的多肽。
在一些实施方式中，所述人4-1BB胞内结构域选自：(1)具有如SEQ ID No.9所示氨基酸序列的多肽；或经过氨基酸修饰的功能性变体，其中所述经过氨基酸修饰的功能性变体为与SEQ ID No.9所示氨基酸序列具有90～99％同源性的多肽。
在一些实施方式中，所述人CD28胞内结构域选自：(1)具有如SEQ ID No.10所示氨基酸序列的多肽；或经过氨基酸修饰的功能性变体，其中所述经过氨基酸修饰的功能性变体为与SEQ ID No.10所示氨基酸序列具有90～99％同源性的多肽。
在一些实施方式中，所述人OX40胞内结构域选自：(1)具有如SEQ ID No.11所示氨基酸序列的多肽；或经过氨基酸修饰的功能性变体，其中所述经过氨基酸修饰的功能性变体为与SEQ ID No.11所示氨基酸序列具有90～99％同源性的多肽。
在一些实施方式中，所述CD3ζ胞内结构域选自：(1)具有如SEQ ID No.12所示氨基酸序列的多肽；或经过氨基酸修饰的功能性变体。其中所述经过氨基酸修饰的功能性变体为与SEQ ID No.12所示氨基酸序列具有90～99％同源性的多肽。
在一些非限制性实施方式中，所述胞内信号结构域包括免疫受体酪氨酸活化基序和共刺激信号域；
在一些非限制性实施方式中，特异性靶向人Claudin18.2的嵌合抗原受体是重组表达或由载体表达。
在某些非限制性的实施方式中，本申请的特异性靶向人Claudin18.2的嵌合抗原受体的细胞内结构域还包含至少一个共刺激信号传导区，其包含至少一个可提供最佳淋巴细胞活化的共刺激配体分子。
在一些非限制性实施方式中，特异性靶向人Claudin18.2的嵌合抗原受体的细胞内结构域包含共刺激信号传导区，所述共刺激信号传导区，包含三种共刺激分子：CD28和4-1BB或CD28和OX40或4-1BB和OX40。
在一非限制性实施方式中，本申请的特异性靶向人Claudin18.2的嵌合抗原受体细胞内结构域包含4-1BB多肽。
在某些非限制性实施方式中，特异性靶向人Claudin18.2的嵌合抗原受体还可包含将抗原结合结构域连接至跨膜结构域的间隔区(spacer)。间隔区可以是足够柔性的，以允许抗原结合结构域在不同方向上定向，以利于抗原识别。间隔区可以是来自IgG1的铰链区、或免疫球蛋白的CH2CH3区和CD3的部分。
在某些非限制性实施方式中，特异性靶向人Claudin18.2的嵌合抗原受体的细胞内结构域包含可激活或刺激细胞(例如，淋巴谱系的细胞，例如T细胞)的人CD3ζ多肽。
在某些非限制性的实施方式中，特异性靶向人Claudin18.2的嵌合抗原受体(CAR)的细胞内结构域还包含至少一个共刺激信号传导区，其包含至少一个可提供最佳淋巴细胞活化的共刺激分子。本文使用的“共刺激分子”是指淋巴细胞对抗原的有效应答所需的除抗原受体或其配体之外的细胞表面分子。至少一个共刺激信号传导区可包含CD28多肽、4-1BB多肽、OX40多肽、ICOS多肽(不基于与免疫应答相关的蛋白质)，或其组合。
第三方面，本申请提供了一种编码第二方面所述的特异性靶向人Claudin18.2的嵌合抗原受体的核酸分子，所述核酸分子包含从5’到3’依次串联连接的编码引导序列的核苷酸序列、编码靶向结合人Claudin18.2的胞外识别结构域的scFv核苷酸序列、编码跨膜结构域的核苷酸序列、编码胞内信号结构域的核苷酸序列。
在一些实施方式中，所述核酸分子还包含编码铰链区的核苷酸序列。
在一些实施方式中，所述胞内信号结构域包括免疫受体酪氨酸活化基序和共刺激信号域。
编码特异性靶向人Claudin18.2的嵌合抗原受体的核酸分子通过密码子优化进行修饰。密码子优化可以改变天然存在的和重组的基因序列，以在任何给定的表达系统中实现最高可能水平的生产力。
第四方面，本申请提供了一种包含本申请第二方面的嵌合抗原受体或本申请第三方面的核酸的重组载体或表达质粒。
免疫应答细胞(例如，T细胞、CTL细胞、NK细胞)的基因修饰可以通过用重组DNA或RNA构建体转导同源的细胞组合物来实现。在一个实施方案中，载体是逆转录病毒载体(例如，γ-逆转录病毒或慢病毒)，其可将DNA或RNA构建体导入宿主细胞基因组。例如特异性靶向人Claudin18.2的嵌合抗原受体的多核苷酸可以克隆到逆转录病毒载体中，并且可以从其内源启动子、逆转录病毒长末端重复序列或从替代的内部启动子驱动表达。
也可使用非病毒载体或RNA。可以使用随机染色体整合或靶向整合(例如使用核酸酶、转录激活子样效应物核酸酶TALEN、锌指核酸酶ZFN和/或规律成簇间隔短回文重复CRISPR或转基因表达(例如使用天然或化学修饰的RNA)。
在一些实施方式中，所述载体选自γ-逆转录病毒载体、慢病毒载体、腺病毒载体、腺联病毒载体。
在一示例性实施方式中，所述载体是γ-逆转录病毒载体。
第五方面，本申请提供了一种重组病毒，其是能够表达本发明第二方面所述的特异性靶向人Claudin18.2的嵌合抗原受体、且能够侵染免疫应答细胞的病毒。
在一些实施方式中，所述免疫应答细胞为细胞毒性T淋巴细胞、NK细胞、NKT细胞或辅助性T细胞或巨噬细胞。
在示例性实施方式中，所述免疫应答细胞为细胞毒性T淋巴细胞。
在一些实施方式中，所述病毒为慢病毒、腺病毒、腺联病毒或逆转录病毒。
在一示例性实施方式中，所述病毒为慢病毒。
在一示例性实施方式中，所述病毒为逆转录病毒。
第六方面，本申请提供了一种分离的修饰的免疫应答细胞，其包含本申请第二方面所述的嵌合抗原受体，其由本申请第四方面所述的重组载体或表达质粒转化所得。
对于细胞的初始基因修饰以提供所述的特异性靶向人Claudin18.2的嵌合抗原受体修饰的免疫应答细胞，通常使用逆转录病毒载体进行转导，然而可以使用任何其它合适的病毒载体或非病毒递送系统。对于细胞的后续基因修饰以提供包含含有至少两种共刺激配体的抗原递呈复合物的细胞，逆转录病毒基因转移(转导)同样证明是有效的。逆转录病毒载体和合适的组装线的联合也是合适的，其中衣壳蛋白对于感染人细胞是有功能的。
在一些实施方式中，所述免疫应答细胞还包含至少一种外源的共刺激配体。
可能的转导方法还包括将细胞与生产细胞的直接共培养。转导病毒载体可用于在免疫应答细胞中表达共刺激配体(例如4-1BBL和IL-12)。优选地，选择的载体表现出高的感染效率和稳定的整合和表达。
在一些实施方式中，优选地，所述至少一种共刺激配体选自4-1BBL、CD80、CD86、CD70、OX40L、CD48、TNFRSF14及其组合，或更优选地，所述共刺激配体是4-1BBL。
在一些实施方式中，所述免疫应答细胞选自T细胞、自然杀伤(NK)细胞、细胞毒性T淋巴细胞(CTL)、调节性T细胞、人胚胎干细胞和可分化成淋巴样细胞的多能干细胞，优选T细胞和自然杀伤(NK)细胞，更优选为T细胞。
可以利用用于CAR表达的载体转导从患者分离的多个T细胞亚群。
在一示例性实施例中，其中所述修饰的免疫应答细胞为CAR-T细胞。
可以利用所述的特异性靶向人Claudin18.2的嵌合抗原受体制备遗传修饰的中央记忆T细胞，然后冷藏保存。
第七方面，本申请提供了本申请的第六方面的分离的嵌合抗原受体修饰的免疫应答细胞的制备方法，包括以下步骤：
首先，将第三方面所述的核酸分子，通过分子克隆的方式连接到表达载体中，获得所述的特异性靶向人Claudin18.2的嵌合抗原受体的表达载体；
然后，将获得的所述的特异性靶向人Claudin18.2的嵌合抗原受体表达载体转染293T细胞，获得病毒液；
最后用所述病毒液感染免疫应答细胞，从感染后的细胞中获得表达所述的特异性靶向人Claudin18.2的嵌合抗原受体修饰的免疫应答细胞。
在一些非限制性实施方式中，本发明修饰的的免疫应答细胞可以是淋巴谱系的细胞。所述淋巴谱系的细胞选自B、T和自然杀伤(NK)细胞，提供抗体的产生、细胞免疫系统的调节、血液中外来物质的检测、对宿主外源细胞的检测等功能。淋巴谱系的细胞的非限制性实例包括T细胞、自然杀伤(NK)细胞、细胞毒性T淋巴细胞(CTL)、调节性T细胞、胚胎干细胞和多能干细胞(例如，可分化成淋巴样细胞的多能干细胞)。
在一些实施方式中，所述免疫应答细胞选自T细胞、自然杀伤(NK)细胞、细胞毒性T淋巴细胞(CTL)、调节性T细胞、人胚胎干细胞和可分化成淋巴样细胞的多能干细胞，优选T细胞或自然杀伤(NK)细胞。
在一些实例性实施方式中，T细胞是在胸腺中成熟的淋巴细胞，并且主要负责细胞介导的免疫。T细胞参与获得性免疫系统。
在一些非限制性实施方式中，T细胞包括但不限于T辅助细胞、细胞毒性T细胞、记忆T细胞(包括中心记忆T细胞、干细胞样记忆T细胞、干样记忆T细胞和两种类型的效应记忆T细胞(例如，TEM细胞和TEMRA细胞)、调节性T细胞(也称为抑制性T细胞)、自然杀伤T细胞、粘膜相关恒定T细胞、和γδT细胞。在一些实施方式中，表达CAR的T细胞表达Foxp3以实现和维持T调节表型。
在一些实施方式中，至少一种共刺激配体选自4-1BBL、CD80、CD86、CD70、OX40L，及其组合。在一个实施方式中，共刺激性配体是4-1BBL。
在一优选实施例中，所述分离的修饰的免疫应答细胞为T细胞。
在一优选实施例中，所述分离的修饰的免疫应答细胞为自然杀伤(NK)细胞。
在一些非限制性实施方式中，所述分离的修饰的免疫应答细胞(例如T细胞)可以是自体的、非自体的(例如同种异体的)、或在体外衍生自工程化的祖细胞或干细胞。
第八方面，本申请提供了一种药物组合物，其包含有效量的如本发明第六方面所述分离的修饰的免疫应答细胞和药学上可接受的赋形剂。
本申请公开的药物组合物，其包含表达所述的特异性靶向人Claudin18.2的嵌合抗原受体的分离的修饰的免疫应答细胞和药学上可接受的载体。
所述药物组合物的施用可以是自体的或非自体的。例如，表达所述的特异性靶向人Claudin18.2的嵌合抗原受体的免疫应答细胞和包含它的组合物可以从一个受试者获得，并施用于相同受试者或不同的相容受试者。可以通过包括导管给药、静脉内注射或胃肠外给药来施用本发明公开主题的外周血来源的T细胞或其子代(例如，体内、离体或体外衍生的)。当施用本发明公开主题的药物组合物(例如包含所述的特异性靶向人Claudin18.2的嵌合抗原受体的免疫应答细胞的药物组合物)时，通常将其配制成单位剂量可注射形式(溶液、悬浊液、乳浊液)。
本申请的组合物可以是制剂。本申请公开的表达所述的特异性靶向人Claudin18.2的嵌合抗原受体(CAR)的免疫应答细胞和包含其的组合物可以方便地作为无菌液体制剂提供，例如等渗水溶液、悬浊液、乳浊液、分散液或粘性组合物，其可以缓冲至选定的pH。液体制剂通常比凝胶、其它粘性组合物和固体组合物更容易制备。此外，液体组合物更方便施用，特别是通过注射。另一方面，粘性组合物可以在适当的粘度范围内配制，以提供与特定组织的更长的接触时间。液体或粘性组合物可以包含载体，其可以是包含例如水、生理盐水、磷酸盐缓冲盐水、多元醇(例如甘油、丙二醇、液体聚乙二醇等)和合适的其混合物的溶剂或分散介质。
可以加入增强组合物的稳定性和无菌性的各种添加剂，包括抗微生物防腐剂、抗氧化剂、螯合剂和缓冲剂。
根据本申请，使用的任何载体、稀释剂或添加剂必须与表达本发明公开主题的所述的特异性靶向人Claudin18.2的嵌合抗原受体(CAR)的免疫应答细胞相容。
如果需要，组合物的粘度可以使用药学上可接受的增稠剂保持在选定的水平。合适的载体和其它添加剂的选择将取决于确切的给药途径和特定剂型的性质，例如液体剂型(例如，是否将组合物配制成溶液、悬浊液、凝胶或另一液体形式，比如时间释放形式或液体填充形式)。
第九方面，本申请提供了一种用于治疗或预防疾病的试剂盒，其包含本发明第六方面所述的免疫应答细胞或本发明第三方面所述的核酸。
第十方面，本申请提供了本发明第一方面所述的靶向结合人Claudin18.2的蛋白或其功能性变体、第二方面所述的特异性靶向人Claudin18.2的嵌合抗原受体、第四方面所述重组载体或表达质粒，第六方面所述重组病毒、第七方面所述的分离的修饰的免疫应答细胞，第九方面所述的试剂盒在治疗，或预防疾病、不适或健康失调的产品中的应用。
在一些实施方式中，所述治疗或预防的疾病包括胃癌、胰腺癌、肝癌、脑癌、前列腺癌、淋巴癌、白血病、肠癌、肺癌、卵巢癌或乳腺癌。
作用原理
本发明的特异性靶向人Claudin18.2的嵌合抗原受体修饰的免疫应答细胞，该工程细胞通过识别肿瘤细胞表面产生的Claudin18.2来传递活化信号并激活免疫系统，从而对肿瘤细胞发挥杀伤作用。
有益效果
本发明利用嵌合抗原受体修饰T细胞技术来制备特异性靶向人Claudin18.2的嵌合抗原受体修饰的工程免疫细胞，该制备方法步骤简单，获得的新型工程免疫细胞能特异识别肿瘤细胞，能更有效地靶向攻击肿瘤细胞，对肿瘤的杀伤率高，并且可以用于制备抗肿瘤的产品，尤其是用于制备治疗Claudin18.2阳性肿瘤的药物。本发明可有望用于制备抗肿瘤的产品，尤其是用于制备治疗胃癌、胰腺癌、肝癌、脑癌、前列腺癌、淋巴癌、白血病、肠癌、肺癌、卵巢癌或乳腺癌的药物，具有良好的产业应用前景。
附图说明
图1为实施例1中嵌合抗原受体各部分的连接顺序示意图。
图2为实施例3中T细胞纯度流式细胞检测结果。
图3为实施例4中KD-182-1、KD-182-2、KD-182-3、KD-182-4CAR-T细胞CAR阳性率检测实验结果。其中图3A为空白对照组，图3B为实验组KD-182-1，图3C为实验组KD-182-2，图3D为实验组KD-182-3、图3E为实验组KD-182-4。
图4为实施例5中KD-182-1、KD-182-2、KD-182-3、KD-182-4CAR-T细胞体外杀伤实验结果。其中图4A为KD-182-1、KD-182-2、KD-182-3、KD-182-4CAR-T细胞对NUGC-4细胞的杀伤，图4B为KD-182-1、KD-182-2、KD-182-3、KD-182-4CAR-T细胞对AGS细胞的杀伤，图4C为KD-182-1、KD-182-2、KD-182-3、KD-182-4CAR-T细胞对AGS-18.2细胞的杀伤，图4D为KD-182-1、KD-182-2、KD-182-3、KD-182-4CAR-T细胞对MKN-28细胞的杀伤，图4E为KD-182-1、KD-182-2、KD-182-3、KD-182-4CAR-T细胞对MKN-28-18.2细胞的杀伤。
图5为实施例6中KD-182-1、KD-182-3 CAR-T细胞体外细胞因子释放实验结果，其中图5A、图5B为NUGC4、AGS-18.2细胞IFN-γ的释放；图5C、图5D为NUGC4、AGS和AGS-18.2细胞TNF-α的释放。
图6为实施例7中KD-182-1、KD-182-3 CAR-T细胞体外增殖实验结果。
图7为实施例8中KD-182-1、KD-182-3 CAR-T细胞输注小鼠体内药效实验结果。
图8为实施例8中KD-182-1、KD-182-3 CAR-T细胞输注小鼠体内安全性实验结果。其中图8A、图8B为小鼠脏器HE染色图片，图8C、图8D为小鼠输注CAR-T细胞30天后生存率。
具体实施方式
除非另有定义，本文使用的所有技术和科学术语具有本发明所属领域的技术员通常理解的含义。
术语“功能性变体”，是母体结构经过修饰得到的具有相同或相近的生物学功能和性质如与母体具有相同靶向结合功能的结构的变体。作为非限制性的实例，“功能性变体”可以通过在母体中进行一处或多处保守型取代获得。
术语“氨基酸修饰”是指不显著影响或改变包含氨基酸序列的本公开的CAR(例如，细胞外识别结构域)的结合特征的保守氨基酸修饰。这种保守修饰包括氨基酸取代、添加和缺失。
术语“同源性”是指目标氨基序列或目标核苷酸序列与参考序列比较显示的氨基酸或核苷酸的高比例匹配性。本文中的同源性可使用标准软件如BLAST或FASTA确定。
术语“scFv”是指单链抗体(single chain antibody fragment variable，scFv)，是由抗体重链可变区和轻链可变区通过15～20个氨基酸的短肽连接而成。
术语“嵌合抗原受体(CAR)”嵌合抗原受体包括引导肽部分、细胞外靶标识别结构域、跨膜结构域和细胞内结构域。
CAR可以既结合抗原又转导T细胞激活的功能，其不依赖于MHC限制。因此，CAR是“通用”免疫抗原受体，其可以治疗具有抗原阳性肿瘤的患者群体，不论其HLA基因型如何。使用表达肿瘤特异性CAR的T淋巴细胞的过继性免疫疗法可以是用于治疗癌症的强大治疗策略。
术语“识别”是指选择性结合靶标。本文使用的术语“特异性结合”或“特异性结合到”或“特异性靶向”是指多肽或其片段识别并结合目的生物分子(例如多肽)，但其不识别结合样品中的其他分子，例如天然地包括本发明多肽的生物样品中的其他分子。
术语“共刺激分子”是指淋巴细胞对抗原的有效应答所需的除抗原受体或其配体之外的细胞表面分子。
术语“载体”是指任何遗传元件，比如质粒、噬菌体、转座子、粘粒、染色体、病毒、病毒粒子等，其当关联有适当的控制元件时能够复制，并且其可以将基因序列转移到细胞中。因此，该术语包括克隆和表达载体，以及病毒载体和质粒载体。
术语“表达载体”是指一种重组核酸序列，即重组DNA分子，其含有期望编码序列和在特定宿主生物体中表达可操作连接的编码序列所必需的适当的核酸序列。用于在原核生物中表达所必需的核酸序列通常包括启动子、操纵子(可选的)和核糖体结合位点，通常伴随其它序列。已知真核细胞利用启动子、增强子和终止子及聚腺苷酸化信号。
本文使用的术语“免疫应答细胞”是指在免疫应答中起作用的细胞、或其祖细胞、或其子代。
术语“分离的细胞”是指与天然伴随细胞的分子和/或细胞组分分离的免疫细胞。
本文使用的术语“调节”是指正或负地改变。
本文使用的术语“外源的”是指并非内源性存在于细胞中或不足以达到过表达时获得的功能性效果的水平存在的核酸分子或多肽。因此，术语“外源的”将包括在细胞中表达的任何重组核酸分子或多肽，例如外源、异源和过表达的核酸分子和多肽。
本文使用的术语“外源核酸分子或多肽”是指并非正常存在于细胞中或由细胞获得的样品中的核酸分子(例如，cDNA、DNA或RNA分子)或多肽。该核酸可以来自另一生物体，或者其可以是例如细胞或样品中并非正常表达的mRNA分子。
以下通过实施例对本发明作进一步的说明，但本发明并不限于这些具体实施方式。下面实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。
实施例1制备特异性靶向人Claudin18.2的嵌合抗原受体的表达质粒
总体设计如下：
1、抗人Claudin18.2单链抗体(scFv)基因序列的获得
美国国立医学图书馆(NCBI)的Genbank数据库中Claudin18.2的全人氨基酸序列号为：NP_001002026.1。将人Claudin18.2蛋白免疫小鼠后纯化得到其抗体片段并进行人源化，获得人源化抗人Claudin18.2的单链抗体(scFv)；单链抗体由轻链和重链组成，轻链与重链之间的连接片段是(G4S)n(3≤n≤8)，最终经过效果筛选获得了与靶抗原Claudin18.2亲和力高的4条scFv抗体片段，其氨基酸序列如SEQ ID No.2或SEQ ID No.3或SEQ IDNo.4或SEQ ID No.5所示：
2、特异性靶向人Claudin18.2的嵌合抗原受体的氨基酸序列的确定
构建特异性靶向人Claudin18.2的嵌合抗原受体，即确定嵌合抗原受体分子的氨基酸序列：
自氨基端到羧基端，由引导肽的氨基酸序列(如SEQ ID No.1所示)、靶向人Claudin18.2的scFv氨基酸序列(如SEQ ID No.2或SEQ ID No.3或SEQ ID No.4或SEQ IDNo.5所示)、人CD8铰链区的氨基酸序列(如SEQ ID No.6所示)、人CD8跨膜区的氨基酸序列(如SEQ ID No.7所示)或人CD28跨膜区的氨基酸序列(如SEQ ID No.8所示)、人4-1BB胞内结构域的氨基酸序列(如SEQ ID No.9所示)或人CD28胞内结构域的氨基酸序列(如SEQ IDNo.10所示)或人OX40胞内结构域的氨基酸序列(如SEQ ID No.11所示)或两者组合、人CD3ζ结构域的氨基酸序列(如SEQ ID No.12所示)依次串联而成(如图1)；
表1为利用不同靶向人Claudin18.2的核苷酸序列按照下述方法(参照实施例4利用流式细胞术分析检测CAR蛋白的表达)所构建的载体、获得的病毒和获得相应的CAR-T细胞，并按照下述方法检测的CAR表达，结果显示四组CAR表达无显著性差异。
表1为靶向人Claudin18.2的不同scFv序列CAR表达
Figure BDA0003019224010000111
Figure BDA0003019224010000121
3、表达特异性靶向人Claudin18.2的嵌合抗原受体分子的质粒构建
本发明选用步骤2中的得到的CAR序列，其命名为KD-182-1(氨基酸序列如SEQ IDNo.13所示，核苷酸序列如SEQ ID No.17所示)、KD-182-2(氨基酸序列如SEQ ID No.14所示，核苷酸序列如SEQ ID No.18所示)、KD-182-3(氨基酸序列如SEQ ID No.15所示，核苷酸序列如SEQ ID No.19所示)、KD-182-4(氨基酸序列如SEQ ID No.16所示，核苷酸序列如SEQID No.20所示)完成后续实施例的药效验证试验：
自氨基端到羧基端，由引导肽的氨基酸序列(如SEQ ID No.1所示)、靶向人Claudin18.2的scFv氨基酸序列(如SEQ ID No.2或SEQ ID No.3或SEQ ID No.4或SEQ IDNo.5所示)、人CD8跨膜区的氨基酸序列(如SEQ ID No.6所示)或人CD28跨膜区的氨基酸序列(如SEQ ID No.7所示)或人CD28跨膜区的氨基酸序列(如SEQ ID No.8所示)、人4-1BB胞内结构域的氨基酸序列(如SEQ ID No.9所示)或人CD28胞内结构域的氨基酸序列(如SEQID No.10所示)或人OX40胞内结构域的氨基酸序列(如SEQ ID No.11所示)或两者组合、人CD3ζ结构域的氨基酸序列(如SEQ ID No.12所示)依次串联而成。
全基因合成特异性靶向人Claudin18.2的经密码子优化的嵌合抗原受体分子核苷酸序列KD-182-1(如SEQ ID NO.17所示)、KD-182-2(如SEQ ID NO.18所示)、KD-182-3(如SEQ ID NO.19所示)、KD-182-4(如SEQ ID NO.20所示)(南京一道生物合成)，通过分子克隆的方式连接到慢病毒载体lentiGuide-Puro(Addgene，美国)，构建单一编码框的全长CAR序列表达框，利用EF1alpha启动子进行表达。
具体操作步骤如下：
(1)全基因合成特异性靶向人Claudin18.2的嵌合抗原受体分子的核苷酸序列，PCR扩增人工合成CAR分子序列，经Axygen胶回收试剂盒(杭州泽衡)回收，与经过限制性内切酶SmaI和MluI消化的载体lentiGuide-Puro(Addgene，美国)，进行同源重组连接，形成KD-182-1或KD-182-2或KD-182-3或KD-182-4表达载体。
具体重组连接反应的体系和条件如下：
重组连接体系：
胶回收的PCR产物5μl，胶回收的SmaI和MluI酶切lentiGuide-Puro质粒(Addgene，美国)3μl；4×1402 QuickCloning Kit(南京基诺美)5μl；去离子水7μl；连接反应体系体积20μl；
重组连接条件：将上述反应体系置于50℃水浴中，反应15min后置冰上1min。
取10μl重组连接产物经感受态Stbl3转化，具体转化操作步骤如下。
将5μl连接产物加入到50μl的感受态细胞(Stbl3，购买自美国Thermo公司)中，冰浴30min，42℃45s，冰浴2min，然后加入500μl无抗LB液体培养基后，37℃，200rpm震荡培养40min，涂布氨苄抗性的LB固体培养基，在37℃培养箱中过夜。等待单菌落出现后，挑取5个大小适中的菌落，提取质粒，并送往商业测序公司测序，将测序结果与拟合成的核苷酸(即特异性靶向人Claudin18.2的嵌合抗原受体的核苷酸)比对证实序列完全正确，证明获得了表达特异性靶向人Claudin18.2的嵌合抗原受体的质粒。
(2)特异性靶向人Claudin18.2的嵌合抗原受体表达质粒的提取和纯化。
将含有KD-182-1或KD-182-2或KD-182-3或KD-182-4CAR的Stbl3菌株在LB培养基中大量培养，采用QIAGEN Plasmid Midi Kits(德国Qiagen公司，货号：12143)进行高纯度无内毒素抽提，以备感染。具体操作步骤参照试剂盒说明书。
实施例2：慢病毒载体的病毒液的制备
将实施例1获得的表达特异性靶向人Claudin18.2的嵌合抗原受体的重组质粒和包装载体psPAX2和VSVG，按照10：8：5的比例，用LipofectamineTM 6000转染试剂(购买自ThermoFisher公司，产品型号为11668019)共转染293T细胞(具体的转染操作过程参见ThermoFisher转染说明书)，转染后6小时更换为完全培养基(购买自Life Technologies公司，产品型号为11995-065)，培养48小时和72小时后，分别收集富含慢病毒颗粒的细胞上清液，病毒上清液通过超速离心浓缩病毒，获得携带表达特异性靶向人Claudin18.2的嵌合抗原受体的慢病毒载体的病毒液(下面简称KD-182-1或KD-182-2或KD-182-3或KD-182-4病毒液)。
实施例3：T细胞的分离培养
取健康供者的新鲜外周血，通过密度梯度离心分离新鲜的外周血单核细胞；再利用偶联了抗-CD3抗体和抗-CD28抗体的顺磁磁珠(购买自美国Invitrogen公司，产品信息为
Figure BDA0003019224010000131
Human T-Activator CD3/CD28)来富集CD3+ T细胞，具体来说，将外周血单核细胞稀释至浓度为(10～30)×106个单个细胞/ml，再将磁珠与细胞以3:1的比例在培养皿中混合，室温下共孵育2-3小时，利用磁微粒收集器(Magnetic particles concentrator，简称MPC，购买自美国Invitrogen公司)富集CD3+T细胞。最后将富集的CD3+T细胞重悬于培养基(购买自美国Life Technologies公司，产品信息为OpTmizerTM T-Cell Expansion SFM)中，调至细胞溶度为1×106个/ml，最后在37℃、5％CO2培养箱中培养2天，纯度检测结果为99.1％，见图2。
实施例4：特异性靶向人Claudin18.2的嵌合抗原受体T细胞(KD-182-1、KD-182-2、KD-182-3、KD-182-4CAR-T)的制备
首先，取实施例3获得的CD3+ T细胞，接种到24孔板，接种浓度为1～10×105个细胞/ml，在37℃、5％CO2环境培养约24小时(培养时间依据具体实践而定，一般来说，保证在病毒液感染时细胞汇合率介于50-70％之间)。之后，取实施例2收集的KD-182-1、KD-182-2、KD-182-3、KD-182-4慢病毒载体的病毒液，按照MOI＝1-10的值，一同加入细胞培养瓶后，封好口，放入平角离心机后，低速(500g-1000g/min)离心1小时，然后放入培养箱中37℃培养。感染后48小时后获得表达特异性靶向人Claudin18.2的嵌合抗原受体T细胞(KD-182-1、KD-182-2、KD-182-3、KD-182-4CAR-T)，可以进行下一步的功能实验。
利用流式细胞术分析检测CAR蛋白的表达：
离心细胞，用PBS清洗两次后重悬于FACS液中(含0.1％叠氮化钠和0.4％BSA的PBS)；将GoatAnti-Human IgG抗体(Alexa
Figure BDA0003019224010000141
647-AffiniPure F(ab')2 Fragment GoatAnti-Human IgG,F(ab')2Fragment Specific，jackson，109-606-006)加入细胞悬液中，4℃孵育1h，并设置同型对照组未感染病毒T细胞，同上孵育抗体；清洗细胞两次后，加入200μL的FACS液重悬细胞；BD FacsCanto II用于获取染色细胞，FlowJo用于分析结果。如图3所示，空白对照组为T细胞，无关CAR对照组为感染无关CAR载体病毒液的T细胞，感染几乎检测不到CAR分子的表达；实验组为感染KD-182-1、KD-182-2、KD-182-3、KD-182-4CAR分子病毒液的T细胞，CAR分子的表达率分别为75.7％和76.5％和69％和76.2％；
实施例5：KD-182-1、KD-182-2、KD-182-3、KD-182-4CAR-T细胞体外杀伤实验
首先，按照实施例4方法感染制备KD-019(参照专利CN110272493A)、KD-182-1、KD-182-2、KD-182-3、KD-182-4CAR-T细胞，感染后继续培养72小时后进行杀伤接种，每一种靶细胞系经过CFSE荧光染色后，在荧光显微镜下对靶细胞进行计数，调整细胞密度约为2×106cells/ml，20μl/孔，接种靶细胞于96孔培养板中；按照效靶比为1:4、1:1、4:1加入效应细胞T、KD-019、KD-182-1、KD-182-2、KD-182-3、KD-182-4CAR-T细胞；然后将细胞置于37℃温箱培养24h；最后利用7-AAD/CFSE细胞毒性测试试剂盒(购买自Biovision公司，货号：K315-100)，并按照该试剂盒的操作说明书来评估KD-182-1、KD-182-2、KD-182-3、KD-182-4CAR-T细胞对上述靶细胞系的杀伤情况。如图4所示，图4A、4B、4C、4D和4E分别是对NUGC4、AGS、过表达AGS-18.2、MKN-28和过表达MKN-28-18.2细胞的杀伤结果，KD-182-1、KD-182-2、KD-182-3、KD-182-4CAR-T对NUGC4细胞有一定的杀伤作用，同时对过表达AGS-18.2、MKN-28-18.2细胞也有一定的杀伤作用，KD-182-1、KD-182-2、KD-182-3、KD-182-4CAR-T细胞对靶细胞杀伤效果无显著性差异。
实施例6：KD-182-1、KD-182-3 CAR-T细胞体外细胞因子释放实验
首先，根据实施例5中CAR-T细胞体外杀伤实验结果任意挑选两条序列(KD-182-1、KD-182-3)进行后续实验。按照实施例4方法感染制备KD-019、KD-182-1、KD-182-3 CAR-T细胞，感染后继续培养72小时后进行杀伤接种，靶细胞系调整细胞密度约为1.5×106cells/ml，20μl/孔，接种靶细胞于96孔培养板中；按照效靶比为5：1加入效应细胞T、KD-019、KD-182-1、KD-182-3 CAR-T细胞；然后将细胞置于37℃温箱培养24h；最后利用Human IFN-γELISA Kit II试剂盒(购买自BD公司，货号：550612)和Human TNF-αELISA Kit II试剂盒(购买自BD公司，货号：550610)，并按照该试剂盒的操作说明书来评估效应细胞对上述靶细胞系的杀伤细胞因子释放情况。如图5所示，KD-182-1、KD-182-3 CAR-T细胞与肿瘤细胞NUGC4共培养后，与对照组相比，INF-γ和TNF-α释放显著增加。同时，KD-182-1、KD-182-3CAR-T细胞与过表达的AGS-18.2细胞共培养后，与对照组相比，INF-γ和TNF-α释放也显著增加，说明KD-182-1、KD-182-3 CAR-T细胞具有很好的抗肿瘤效果。
实施例7：KD-182-1、KD-182-3 CAR-T细胞体外增殖实验
首先，按照实施例4方法感染制备KD-019、KD-182-1、KD-182-3 CAR-T细胞，感染后继续培养24小时后进行计数分孔，计数后四组(空白对照、KD-019、KD-182-1、KD-182-3)细胞每孔按照4×104cells接种到96孔板中，三复孔，记为第0天，之后每隔一天进行计数。如图6所示，结果表明KD-182-1、KD-182-3 CAR-T细胞有很好的体外扩增能力且细胞数与空白对照组和KD-019 CAR-T细胞组没有显著性差异。
实施例8：KD-182-1、KD-182-3 CAR-T细胞小鼠体内药效实验
首先，将AGS-18.2细胞复苏培养，调整细胞状态至对数生长期。台盼蓝计数表明，AGS-18.2细胞活力大于98％。将AGS-18.2细胞的细胞密度调整到1×107/mL，用含25％基质胶(高浓度)的生理盐水重悬细胞。每只小鼠皮下注射106个细胞/100μLAGS-18.2，将肿瘤大小在100mm3左右的荷瘤小鼠随机分为空白对照组和治疗组(n＝5)。按照实施例4方法感染制备CAR-T细胞，用100μL生理盐水、KD-182-1CAR-T细胞或KD-182-3 CAR-T细胞(1×108cells/mL)静脉输注入小鼠体内。每周测量小鼠体重和肿瘤体积2次。如图7所示，与对照组小鼠相比，KD-182-1和KD-182-3 CAR-T组小鼠的肿瘤体积较小。
实施例9：KD-182-1、KD-182-3 CAR-T细胞小鼠体内安全性实验
首先，按照实施例4方法感染制备KD-182-1、KD-182-3 CAR-T细胞，如图8所示为不同剂量的KD-182-1、KD-182-3 CAR-T细胞对小鼠主要脏器和生存周期的影响。从图可以看出，输注KD-182-1、KD-182-3 CAR-T细胞不会引起小鼠心、肝、肺、肾等主要脏器发生炎症、水肿和坏死(图8A和8B)，并且对小鼠的生存周期没有任何负面影响(图8C和8D)。
总之，本发明所构建的特异性靶向人Claudin18.2的嵌合抗原受体的病毒载体，以及经其修饰的工程免疫细胞可以应用于治疗多种Claudin18.2阳性表达肿瘤，包括胃癌、胰腺癌、肝癌、脑癌、前列腺癌、淋巴癌、白血病、肠癌、肺癌或乳腺癌。
应当理解，虽然本说明书按照实施方式加以描述，但并非每个实施方式仅包含一个独立的技术方案，说明书的这种叙述方式仅仅是为清楚起见，本领域技术人员应当将说明书作为一个整体，各实施方式中的技术方案也可以经适当组合，形成本领域技术人员可以理解的其他实施方式。
上文所列出的一系列的详细说明仅仅是针对本发明的可行性实施方式的具体说明，它们并非用以限制本发明的保护范围，凡未脱离本发明技艺精神所作的等效实施方式或变更均应包含在本发明的保护范围之内。
序列表
<110> 南京凯地医疗技术有限公司
<120> 靶向Claudin18.2的特异性嵌合抗原受体细胞及其制备方法和应用
<160> 20
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 21
<212> PRT
<213> 引导序列(2 Ambystoma laterale x Ambystoma jeffersonianum)
<400> 1
Met Ala Leu Pro Val Thr Ala Leu Leu Leu Pro Leu Ala Leu Leu Leu
1 5 10 15
His Ala Ala Arg Pro
20
<210> 2
<211> 246
<212> PRT
<213> Claudin18.2 单链抗体序列1(2 Ambystoma laterale x Ambystomajeffersonianum)
<400> 2
Asp Val Val Met Thr Gln Ser Pro Asp Ser Leu Ala Val Ser Leu Gly
1 5 10 15
Glu Arg Ala Thr Ile Asn Cys Lys Ser Ser Gln Ser Leu Leu Asn Ser
20 25 30
Gly Asn Gln Lys Asn Tyr Leu Thr Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln
35 40 45
Pro Pro Lys Leu Leu Ile Tyr Trp Ala Ser Thr Arg Glu Ser Gly Val
50 55 60
Pro Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr
65 70 75 80
Ile Ser Ser Leu Gln Ala Glu Asp Val Ala Val Tyr Tyr Cys Gln Asn
85 90 95
Thr Tyr Ser Phe Pro Leu Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Leu Glu Ile
100 105 110
Lys Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser
115 120 125
Asp Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly
130 135 140
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Ser Phe
145 150 155 160
Gly Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
165 170 175
Ala Phe Ile Ser Ser Gly Ser His Thr Ile Tyr Tyr Ala Asp Ser Val
180 185 190
Lys Gly Arg Phe Ser Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn Thr Leu Phe
195 200 205
Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
210 215 220
Ala Arg Phe Gln Tyr Gly Asn Ser Phe Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr
225 230 235 240
Leu Val Thr Val Ser Ser
245
<210> 3
<211> 246
<212> PRT
<213> Claudin18.2 单链抗体序列2(2 Ambystoma laterale x Ambystomajeffersonianum)
<400> 3
Asp Val Val Met Thr Gln Thr Pro Leu Ser Leu Ser Val Thr Pro Gly
1 5 10 15
Gln Pro Ala Ser Ile Ser Cys Lys Ser Ser Gln Ser Leu Leu Asn Ser
20 25 30
Gly Asn Gln Lys Asn Tyr Leu Thr Trp Tyr Leu Gln Lys Pro Gly Gln
35 40 45
Pro Pro Lys Leu Leu Ile Tyr Trp Ala Ser Thr Arg Glu Ser Gly Val
50 55 60
Pro Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Lys
65 70 75 80
Ile Ser Arg Val Glu Ala Glu Asp Val Gly Val Tyr Tyr Cys Gln Asn
85 90 95
Thr Tyr Ser Phe Pro Leu Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Leu Glu Ile
100 105 110
Lys Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser
115 120 125
Asp Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly
130 135 140
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Ser Phe
145 150 155 160
Gly Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
165 170 175
Ala Phe Ile Ser Ser Gly Ser His Thr Ile Tyr Tyr Ala Asp Ser Val
180 185 190
Lys Gly Arg Phe Ser Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn Thr Leu Phe
195 200 205
Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
210 215 220
Ala Arg Phe Gln Tyr Gly Asn Ser Phe Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr
225 230 235 240
Leu Val Thr Val Ser Ser
245
<210> 4
<211> 246
<212> PRT
<213> Claudin18.2 单链抗体序列3(2 Ambystoma laterale x Ambystomajeffersonianum)
<400> 4
Asp Ile Val Ile Thr Gln Ser Pro Asp Ser Leu Ala Val Ser Leu Gly
1 5 10 15
Glu Arg Ala Thr Ile Asn Cys Lys Ser Ser Gln Ser Leu Leu Asn Ser
20 25 30
Gly Asn Gln Arg Asn Tyr Leu Thr Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln
35 40 45
Pro Pro Lys Leu Leu Phe Tyr Trp Ala Ser Thr Arg Glu Ser Gly Val
50 55 60
Pro Asp Arg Phe Thr Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr
65 70 75 80
Ile Ser Ser Leu Gln Ala Glu Asp Val Ala Val Tyr Tyr Cys Gln Asn
85 90 95
Ala Tyr Tyr Tyr Pro Phe Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Ile
100 105 110
Lys Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser
115 120 125
Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Val Val Gln Pro Gly Gly
130 135 140
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Lys Phe
145 150 155 160
Gly Met Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Arg Leu Glu Trp Val
165 170 175
Ala Thr Phe Ser Ser Gly Gly Asp Tyr Thr Phe Tyr Pro Asp Ser Val
180 185 190
Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr
195 200 205
Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
210 215 220
Ala Lys Leu Tyr Tyr Gly Asn Ser Met Asp Ser Trp Ser Gln Gly Leu
225 230 235 240
Ser Val Thr Val Ser Ser
245
<210> 5
<211> 246
<212> PRT
<213> Claudin18.2 单链抗体序列4(2 Ambystoma laterale x Ambystomajeffersonianum)
<400> 5
Asp Ile Val Ile Thr Gln Ser Pro Leu Ser Leu Pro Val Thr Pro Gly
1 5 10 15
Glu Pro Ala Ser Ile Ser Cys Lys Ser Ser Gln Ser Leu Leu Asn Ser
20 25 30
Gly Asn Gln Arg Asn Tyr Leu Thr Trp Tyr Leu Gln Lys Pro Gly Gln
35 40 45
Pro Pro Lys Leu Leu Phe Tyr Trp Ala Ser Thr Arg Glu Ser Gly Val
50 55 60
Pro Asp Arg Phe Thr Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Lys
65 70 75 80
Ile Ser Arg Val Glu Ala Glu Asp Val Gly Val Tyr Tyr Cys Gln Asn
85 90 95
Ala Tyr Tyr Tyr Pro Phe Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Ile
100 105 110
Lys Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser
115 120 125
Glu Val Gln Leu Leu Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly
130 135 140
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Lys Phe
145 150 155 160
Gly Met Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Asp Lys Arg Leu Glu Trp Val
165 170 175
Ala Thr Phe Ser Ser Gly Gly Asp Tyr Thr Phe Tyr Pro Asp Ser Val
180 185 190
Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr
195 200 205
Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Ile Tyr Tyr Cys
210 215 220
Ala Lys Leu Tyr Tyr Gly Asn Ser Met Asp Ser Trp Ser Gln Gly Leu
225 230 235 240
Ser Val Thr Val Ser Ser
245
<210> 6
<211> 45
<212> PRT
<213> CD8铰链区(2 Ambystoma laterale x Ambystoma jeffersonianum)
<400> 6
Thr Thr Thr Pro Ala Pro Arg Pro Pro Thr Pro Ala Pro Thr Ile Ala
1 5 10 15
Ser Gln Pro Leu Ser Leu Arg Pro Glu Ala Cys Arg Pro Ala Ala Gly
20 25 30
Gly Ala Val His Thr Arg Gly Leu Asp Phe Ala Cys Asp
35 40 45
<210> 7
<211> 24
<212> PRT
<213> CD8跨膜区(2 Ambystoma laterale x Ambystoma jeffersonianum)
<400> 7
Ile Tyr Ile Trp Ala Pro Leu Ala Gly Thr Cys Gly Val Leu Leu Leu
1 5 10 15
Ser Leu Val Ile Thr Leu Tyr Cys
20
<210> 8
<211> 27
<212> PRT
<213> CD28跨膜区(2 Ambystoma laterale x Ambystoma jeffersonianum)
<400> 8
Phe Trp Val Leu Val Val Val Gly Gly Val Leu Ala Cys Tyr Ser Leu
1 5 10 15
Leu Val Thr Val Ala Phe Ile Ile Phe Trp Val
20 25
<210> 9
<211> 42
<212> PRT
<213> 4-1BB胞内结构域(2 Ambystoma laterale x Ambystoma jeffersonianum)
<400> 9
Lys Arg Gly Arg Lys Lys Leu Leu Tyr Ile Phe Lys Gln Pro Phe Met
1 5 10 15
Arg Pro Val Gln Thr Thr Gln Glu Glu Asp Gly Cys Ser Cys Arg Phe
20 25 30
Pro Glu Glu Glu Glu Gly Gly Cys Glu Leu
35 40
<210> 10
<211> 41
<212> PRT
<213> CD28结构域(2 Ambystoma laterale x Ambystoma jeffersonianum)
<400> 10
Arg Ser Lys Arg Ser Arg Leu Leu His Ser Asp Tyr Met Asn Met Thr
1 5 10 15
Pro Arg Arg Pro Gly Pro Thr Arg Lys His Tyr Gln Pro Tyr Ala Pro
20 25 30
Pro Arg Asp Phe Ala Ala Tyr Arg Ser
35 40
<210> 11
<211> 36
<212> PRT
<213> OX40结构域(2 Ambystoma laterale x Ambystoma jeffersonianum)
<400> 11
Arg Asp Gln Arg Leu Pro Pro Asp Ala His Lys Pro Pro Gly Gly Gly
1 5 10 15
Ser Phe Arg Thr Pro Ile Gln Glu Glu Gln Ala Asp Ala His Ser Thr
20 25 30
Leu Ala Lys Ile
35
<210> 12
<211> 112
<212> PRT
<213> CD3ζ结构域(2 Ambystoma laterale x Ambystoma jeffersonianum)
<400> 12
Arg Val Lys Phe Ser Arg Ser Ala Asp Ala Pro Ala Tyr Gln Gln Gly
1 5 10 15
Gln Asn Gln Leu Tyr Asn Glu Leu Asn Leu Gly Arg Arg Glu Glu Tyr
20 25 30
Asp Val Leu Asp Lys Arg Arg Gly Arg Asp Pro Glu Met Gly Gly Lys
35 40 45
Pro Arg Arg Lys Asn Pro Gln Glu Gly Leu Tyr Asn Glu Leu Gln Lys
50 55 60
Asp Lys Met Ala Glu Ala Tyr Ser Glu Ile Gly Met Lys Gly Glu Arg
65 70 75 80
Arg Arg Gly Lys Gly His Asp Gly Leu Tyr Gln Gly Leu Ser Thr Ala
85 90 95
Thr Lys Asp Thr Tyr Asp Ala Leu His Met Gln Ala Leu Pro Pro Arg
100 105 110
<210> 13
<211> 490
<212> PRT
<213> KD-182-1 CAR(2 Ambystoma laterale x Ambystoma jeffersonianum)
<400> 13
Met Ala Leu Pro Val Thr Ala Leu Leu Leu Pro Leu Ala Leu Leu Leu
1 5 10 15
His Ala Ala Arg Pro Asp Val Val Met Thr Gln Ser Pro Asp Ser Leu
20 25 30
Ala Val Ser Leu Gly Glu Arg Ala Thr Ile Asn Cys Lys Ser Ser Gln
35 40 45
Ser Leu Leu Asn Ser Gly Asn Gln Lys Asn Tyr Leu Thr Trp Tyr Gln
50 55 60
Gln Lys Pro Gly Gln Pro Pro Lys Leu Leu Ile Tyr Trp Ala Ser Thr
65 70 75 80
Arg Glu Ser Gly Val Pro Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr
85 90 95
Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Ala Glu Asp Val Ala Val
100 105 110
Tyr Tyr Cys Gln Asn Thr Tyr Ser Phe Pro Leu Thr Phe Gly Gln Gly
115 120 125
Thr Lys Leu Glu Ile Lys Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser
130 135 140
Gly Gly Gly Gly Ser Asp Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu
145 150 155 160
Val Gln Pro Gly Gly Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe
165 170 175
Thr Phe Ser Ser Phe Gly Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys
180 185 190
Gly Leu Glu Trp Val Ala Phe Ile Ser Ser Gly Ser His Thr Ile Tyr
195 200 205
Tyr Ala Asp Ser Val Lys Gly Arg Phe Ser Ile Ser Arg Asp Asn Ala
210 215 220
Lys Asn Thr Leu Phe Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr
225 230 235 240
Ala Val Tyr Tyr Cys Ala Arg Phe Gln Tyr Gly Asn Ser Phe Asp Tyr
245 250 255
Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Thr Thr Thr Pro Ala
260 265 270
Pro Arg Pro Pro Thr Pro Ala Pro Thr Ile Ala Ser Gln Pro Leu Ser
275 280 285
Leu Arg Pro Glu Ala Cys Arg Pro Ala Ala Gly Gly Ala Val His Thr
290 295 300
Arg Gly Leu Asp Phe Ala Cys Asp Ile Tyr Ile Trp Ala Pro Leu Ala
305 310 315 320
Gly Thr Cys Gly Val Leu Leu Leu Ser Leu Val Ile Thr Leu Tyr Cys
325 330 335
Lys Arg Gly Arg Lys Lys Leu Leu Tyr Ile Phe Lys Gln Pro Phe Met
340 345 350
Arg Pro Val Gln Thr Thr Gln Glu Glu Asp Gly Cys Ser Cys Arg Phe
355 360 365
Pro Glu Glu Glu Glu Gly Gly Cys Glu Leu Arg Val Lys Phe Ser Arg
370 375 380
Ser Ala Asp Ala Pro Ala Tyr Gln Gln Gly Gln Asn Gln Leu Tyr Asn
385 390 395 400
Glu Leu Asn Leu Gly Arg Arg Glu Glu Tyr Asp Val Leu Asp Lys Arg
405 410 415
Arg Gly Arg Asp Pro Glu Met Gly Gly Lys Pro Arg Arg Lys Asn Pro
420 425 430
Gln Glu Gly Leu Tyr Asn Glu Leu Gln Lys Asp Lys Met Ala Glu Ala
435 440 445
Tyr Ser Glu Ile Gly Met Lys Gly Glu Arg Arg Arg Gly Lys Gly His
450 455 460
Asp Gly Leu Tyr Gln Gly Leu Ser Thr Ala Thr Lys Asp Thr Tyr Asp
465 470 475 480
Ala Leu His Met Gln Ala Leu Pro Pro Arg
485 490
<210> 14
<211> 490
<212> PRT
<213> KD-182-2 CAR(2 Ambystoma laterale x Ambystoma jeffersonianum)
<400> 14
Met Ala Leu Pro Val Thr Ala Leu Leu Leu Pro Leu Ala Leu Leu Leu
1 5 10 15
His Ala Ala Arg Pro Asp Val Val Met Thr Gln Thr Pro Leu Ser Leu
20 25 30
Ser Val Thr Pro Gly Gln Pro Ala Ser Ile Ser Cys Lys Ser Ser Gln
35 40 45
Ser Leu Leu Asn Ser Gly Asn Gln Lys Asn Tyr Leu Thr Trp Tyr Leu
50 55 60
Gln Lys Pro Gly Gln Pro Pro Lys Leu Leu Ile Tyr Trp Ala Ser Thr
65 70 75 80
Arg Glu Ser Gly Val Pro Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr
85 90 95
Asp Phe Thr Leu Lys Ile Ser Arg Val Glu Ala Glu Asp Val Gly Val
100 105 110
Tyr Tyr Cys Gln Asn Thr Tyr Ser Phe Pro Leu Thr Phe Gly Gln Gly
115 120 125
Thr Lys Leu Glu Ile Lys Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser
130 135 140
Gly Gly Gly Gly Ser Asp Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu
145 150 155 160
Val Gln Pro Gly Gly Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe
165 170 175
Thr Phe Ser Ser Phe Gly Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys
180 185 190
Gly Leu Glu Trp Val Ala Phe Ile Ser Ser Gly Ser His Thr Ile Tyr
195 200 205
Tyr Ala Asp Ser Val Lys Gly Arg Phe Ser Ile Ser Arg Asp Asn Ala
210 215 220
Lys Asn Thr Leu Phe Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr
225 230 235 240
Ala Val Tyr Tyr Cys Ala Arg Phe Gln Tyr Gly Asn Ser Phe Asp Tyr
245 250 255
Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Thr Thr Thr Pro Ala
260 265 270
Pro Arg Pro Pro Thr Pro Ala Pro Thr Ile Ala Ser Gln Pro Leu Ser
275 280 285
Leu Arg Pro Glu Ala Cys Arg Pro Ala Ala Gly Gly Ala Val His Thr
290 295 300
Arg Gly Leu Asp Phe Ala Cys Asp Ile Tyr Ile Trp Ala Pro Leu Ala
305 310 315 320
Gly Thr Cys Gly Val Leu Leu Leu Ser Leu Val Ile Thr Leu Tyr Cys
325 330 335
Lys Arg Gly Arg Lys Lys Leu Leu Tyr Ile Phe Lys Gln Pro Phe Met
340 345 350
Arg Pro Val Gln Thr Thr Gln Glu Glu Asp Gly Cys Ser Cys Arg Phe
355 360 365
Pro Glu Glu Glu Glu Gly Gly Cys Glu Leu Arg Val Lys Phe Ser Arg
370 375 380
Ser Ala Asp Ala Pro Ala Tyr Gln Gln Gly Gln Asn Gln Leu Tyr Asn
385 390 395 400
Glu Leu Asn Leu Gly Arg Arg Glu Glu Tyr Asp Val Leu Asp Lys Arg
405 410 415
Arg Gly Arg Asp Pro Glu Met Gly Gly Lys Pro Arg Arg Lys Asn Pro
420 425 430
Gln Glu Gly Leu Tyr Asn Glu Leu Gln Lys Asp Lys Met Ala Glu Ala
435 440 445
Tyr Ser Glu Ile Gly Met Lys Gly Glu Arg Arg Arg Gly Lys Gly His
450 455 460
Asp Gly Leu Tyr Gln Gly Leu Ser Thr Ala Thr Lys Asp Thr Tyr Asp
465 470 475 480
Ala Leu His Met Gln Ala Leu Pro Pro Arg
485 490
<210> 15
<211> 490
<212> PRT
<213> KD-182-3 CAR(2 Ambystoma laterale x Ambystoma jeffersonianum)
<400> 15
Met Ala Leu Pro Val Thr Ala Leu Leu Leu Pro Leu Ala Leu Leu Leu
1 5 10 15
His Ala Ala Arg Pro Asp Ile Val Ile Thr Gln Ser Pro Asp Ser Leu
20 25 30
Ala Val Ser Leu Gly Glu Arg Ala Thr Ile Asn Cys Lys Ser Ser Gln
35 40 45
Ser Leu Leu Asn Ser Gly Asn Gln Arg Asn Tyr Leu Thr Trp Tyr Gln
50 55 60
Gln Lys Pro Gly Gln Pro Pro Lys Leu Leu Phe Tyr Trp Ala Ser Thr
65 70 75 80
Arg Glu Ser Gly Val Pro Asp Arg Phe Thr Gly Ser Gly Ser Gly Thr
85 90 95
Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Ala Glu Asp Val Ala Val
100 105 110
Tyr Tyr Cys Gln Asn Ala Tyr Tyr Tyr Pro Phe Thr Phe Gly Gly Gly
115 120 125
Thr Lys Leu Glu Ile Lys Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser
130 135 140
Gly Gly Gly Gly Ser Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Val
145 150 155 160
Val Gln Pro Gly Gly Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe
165 170 175
Thr Phe Ser Lys Phe Gly Met Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys
180 185 190
Arg Leu Glu Trp Val Ala Thr Phe Ser Ser Gly Gly Asp Tyr Thr Phe
195 200 205
Tyr Pro Asp Ser Val Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser
210 215 220
Lys Asn Thr Leu Tyr Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr
225 230 235 240
Ala Val Tyr Tyr Cys Ala Lys Leu Tyr Tyr Gly Asn Ser Met Asp Ser
245 250 255
Trp Ser Gln Gly Leu Ser Val Thr Val Ser Ser Thr Thr Thr Pro Ala
260 265 270
Pro Arg Pro Pro Thr Pro Ala Pro Thr Ile Ala Ser Gln Pro Leu Ser
275 280 285
Leu Arg Pro Glu Ala Cys Arg Pro Ala Ala Gly Gly Ala Val His Thr
290 295 300
Arg Gly Leu Asp Phe Ala Cys Asp Ile Tyr Ile Trp Ala Pro Leu Ala
305 310 315 320
Gly Thr Cys Gly Val Leu Leu Leu Ser Leu Val Ile Thr Leu Tyr Cys
325 330 335
Lys Arg Gly Arg Lys Lys Leu Leu Tyr Ile Phe Lys Gln Pro Phe Met
340 345 350
Arg Pro Val Gln Thr Thr Gln Glu Glu Asp Gly Cys Ser Cys Arg Phe
355 360 365
Pro Glu Glu Glu Glu Gly Gly Cys Glu Leu Arg Val Lys Phe Ser Arg
370 375 380
Ser Ala Asp Ala Pro Ala Tyr Gln Gln Gly Gln Asn Gln Leu Tyr Asn
385 390 395 400
Glu Leu Asn Leu Gly Arg Arg Glu Glu Tyr Asp Val Leu Asp Lys Arg
405 410 415
Arg Gly Arg Asp Pro Glu Met Gly Gly Lys Pro Arg Arg Lys Asn Pro
420 425 430
Gln Glu Gly Leu Tyr Asn Glu Leu Gln Lys Asp Lys Met Ala Glu Ala
435 440 445
Tyr Ser Glu Ile Gly Met Lys Gly Glu Arg Arg Arg Gly Lys Gly His
450 455 460
Asp Gly Leu Tyr Gln Gly Leu Ser Thr Ala Thr Lys Asp Thr Tyr Asp
465 470 475 480
Ala Leu His Met Gln Ala Leu Pro Pro Arg
485 490
<210> 16
<211> 490
<212> PRT
<213> KD-182-4 CAR(2 Ambystoma laterale x Ambystoma jeffersonianum)
<400> 16
Met Ala Leu Pro Val Thr Ala Leu Leu Leu Pro Leu Ala Leu Leu Leu
1 5 10 15
His Ala Ala Arg Pro Asp Ile Val Ile Thr Gln Ser Pro Leu Ser Leu
20 25 30
Pro Val Thr Pro Gly Glu Pro Ala Ser Ile Ser Cys Lys Ser Ser Gln
35 40 45
Ser Leu Leu Asn Ser Gly Asn Gln Arg Asn Tyr Leu Thr Trp Tyr Leu
50 55 60
Gln Lys Pro Gly Gln Pro Pro Lys Leu Leu Phe Tyr Trp Ala Ser Thr
65 70 75 80
Arg Glu Ser Gly Val Pro Asp Arg Phe Thr Gly Ser Gly Ser Gly Thr
85 90 95
Asp Phe Thr Leu Lys Ile Ser Arg Val Glu Ala Glu Asp Val Gly Val
100 105 110
Tyr Tyr Cys Gln Asn Ala Tyr Tyr Tyr Pro Phe Thr Phe Gly Gly Gly
115 120 125
Thr Lys Leu Glu Ile Lys Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser
130 135 140
Gly Gly Gly Gly Ser Glu Val Gln Leu Leu Glu Ser Gly Gly Gly Leu
145 150 155 160
Val Gln Pro Gly Gly Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe
165 170 175
Thr Phe Ser Lys Phe Gly Met Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Asp Lys
180 185 190
Arg Leu Glu Trp Val Ala Thr Phe Ser Ser Gly Gly Asp Tyr Thr Phe
195 200 205
Tyr Pro Asp Ser Val Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser
210 215 220
Lys Asn Thr Leu Tyr Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr
225 230 235 240
Ala Ile Tyr Tyr Cys Ala Lys Leu Tyr Tyr Gly Asn Ser Met Asp Ser
245 250 255
Trp Ser Gln Gly Leu Ser Val Thr Val Ser Ser Thr Thr Thr Pro Ala
260 265 270
Pro Arg Pro Pro Thr Pro Ala Pro Thr Ile Ala Ser Gln Pro Leu Ser
275 280 285
Leu Arg Pro Glu Ala Cys Arg Pro Ala Ala Gly Gly Ala Val His Thr
290 295 300
Arg Gly Leu Asp Phe Ala Cys Asp Ile Tyr Ile Trp Ala Pro Leu Ala
305 310 315 320
Gly Thr Cys Gly Val Leu Leu Leu Ser Leu Val Ile Thr Leu Tyr Cys
325 330 335
Lys Arg Gly Arg Lys Lys Leu Leu Tyr Ile Phe Lys Gln Pro Phe Met
340 345 350
Arg Pro Val Gln Thr Thr Gln Glu Glu Asp Gly Cys Ser Cys Arg Phe
355 360 365
Pro Glu Glu Glu Glu Gly Gly Cys Glu Leu Arg Val Lys Phe Ser Arg
370 375 380
Ser Ala Asp Ala Pro Ala Tyr Gln Gln Gly Gln Asn Gln Leu Tyr Asn
385 390 395 400
Glu Leu Asn Leu Gly Arg Arg Glu Glu Tyr Asp Val Leu Asp Lys Arg
405 410 415
Arg Gly Arg Asp Pro Glu Met Gly Gly Lys Pro Arg Arg Lys Asn Pro
420 425 430
Gln Glu Gly Leu Tyr Asn Glu Leu Gln Lys Asp Lys Met Ala Glu Ala
435 440 445
Tyr Ser Glu Ile Gly Met Lys Gly Glu Arg Arg Arg Gly Lys Gly His
450 455 460
Asp Gly Leu Tyr Gln Gly Leu Ser Thr Ala Thr Lys Asp Thr Tyr Asp
465 470 475 480
Ala Leu His Met Gln Ala Leu Pro Pro Arg
485 490
<210> 17
<211> 1470
<212> DNA
<213> KD-182-1 CAR分子核苷酸(2 Ambystoma laterale x Ambystomajeffersonianum)
<400> 17
atggccctgc ccgtcaccgc tctgctgctg ccccttgctc tgcttcttca tgcagcaagg 60
ccggacgtgg tcatgacgca gtcaccggat tcactggcag taagtcttgg ggagcgagcg 120
acaatcaact gcaaatctag ccagagtctt cttaactccg gtaatcagaa gaattacttg 180
acttggtacc aacagaagcc aggacagccg cctaagcttc tgatctactg ggcgtctaca 240
cgcgagtcag gtgtacctga tcgattctcc gggagtggat ccggcacgga tttcacgctc 300
acgataagta gcttgcaagc tgaggatgtt gctgtctact attgccagaa tacatatagt 360
tttccactga cgttcggaca agggacgaag ctggaaataa aagggggtgg agggtccggc 420
ggcgggggat caggcggcgg tgggtccgat gtgcaattgg tagaatccgg tggcggtctg 480
gtacaacctg gcggatcttt gaggctgtcc tgcgccgcga gtggttttac attctcaagc 540
tttggcatgc attgggttag gcaagcccct ggtaagggtc tggagtgggt cgccttcatt 600
tcttctggaa gtcatacgat ttattacgcg gattctgtca aagggcgctt ctctatctca 660
agggataacg cgaagaatac actttttctc caaatgaata gcttgagagc ggaggacaca 720
gccgtttatt actgcgctcg cttccagtac ggcaatagct ttgactattg ggggcaaggt 780
actttggtta ctgtctcatc taccacgacg ccagcgccgc gaccaccaac accggcgccc 840
accatcgcgt cgcagcccct gtccctgcgc ccagaggcgt gccggccagc ggcggggggc 900
gcagtgcaca cgagggggct ggacttcgcc tgtgatatct acatctgggc gcccttggcc 960
gggacttgtg gggtccttct cctgtcactg gttatcaccc tttactgcaa acggggcaga 1020
aagaaactcc tgtatatatt caaacaacca tttatgagac cagtacaaac tactcaagag 1080
gaagatggct gtagctgccg atttccagaa gaagaagaag gaggatgtga actgagagtg 1140
aagttcagca ggagcgcaga cgcccccgcg taccagcagg gccagaacca gctctataac 1200
gagctcaatc taggacgaag agaggagtac gatgttttgg acaagagacg tggccgggac 1260
cctgagatgg ggggaaagcc gagaaggaag aaccctcagg aaggcctgta caatgaactg 1320
cagaaagata agatggcgga ggcctacagt gagattggga tgaaaggcga gcgccggagg 1380
ggcaaggggc acgatggcct ttaccagggt ctcagtacag ccaccaagga cacctacgac 1440
gcccttcaca tgcaggccct gccccctcgc 1470
<210> 18
<211> 1470
<212> DNA
<213> KD-182-2 CAR分子核苷酸(2 Ambystoma laterale x Ambystomajeffersonianum)
<400> 18
atggccctgc ccgtcaccgc tctgctgctg ccccttgctc tgcttcttca tgcagcaagg 60
ccggacgtag taatgacaca aaccccgctg tctctttctg ttacgcctgg gcagcctgct 120
tccatttcat gtaaaagttc tcagagtttg ttgaatagcg ggaaccaaaa gaattatctg 180
acgtggtacc tccaaaaacc tggtcaaccg cctaaactcc tgatctactg ggccagcaca 240
cgagagtccg gcgttccaga tcgattttcc ggaagtgggt ccgggacgga cttcaccctg 300
aagatttcaa gagtcgaagc agaggatgta ggcgtgtact actgccaaaa cacatatagc 360
tttccactca catttggaca aggcactaag ctggagataa agggtggagg aggctcaggg 420
ggtggtggct ctggaggcgg gggaagcgat gttcaacttg tggagagtgg cggaggactt 480
gtgcaaccag ggggtagtct gcggctctca tgcgccgcta gtggattcac atttagctct 540
tttgggatgc attgggtgag acaagcaccc ggcaaggggc ttgaatgggt ggcatttatc 600
agtagcggct cccatactat ttattatgcc gattccgtca agggcaggtt tagtatctca 660
cgcgataatg ctaaaaacac attgttcctg caaatgaact cactccgcgc agaagacacg 720
gcggtctatt attgcgcgcg ctttcaatac ggaaactctt tcgattactg gggtcaagga 780
acccttgtta ctgtcagctc caccacgacg ccagcgccgc gaccaccaac accggcgccc 840
accatcgcgt cgcagcccct gtccctgcgc ccagaggcgt gccggccagc ggcggggggc 900
gcagtgcaca cgagggggct ggacttcgcc tgtgatatct acatctgggc gcccttggcc 960
gggacttgtg gggtccttct cctgtcactg gttatcaccc tttactgcaa acggggcaga 1020
aagaaactcc tgtatatatt caaacaacca tttatgagac cagtacaaac tactcaagag 1080
gaagatggct gtagctgccg atttccagaa gaagaagaag gaggatgtga actgagagtg 1140
aagttcagca ggagcgcaga cgcccccgcg taccagcagg gccagaacca gctctataac 1200
gagctcaatc taggacgaag agaggagtac gatgttttgg acaagagacg tggccgggac 1260
cctgagatgg ggggaaagcc gagaaggaag aaccctcagg aaggcctgta caatgaactg 1320
cagaaagata agatggcgga ggcctacagt gagattggga tgaaaggcga gcgccggagg 1380
ggcaaggggc acgatggcct ttaccagggt ctcagtacag ccaccaagga cacctacgac 1440
gcccttcaca tgcaggccct gccccctcgc 1470
<210> 19
<211> 1470
<212> DNA
<213> KD-182-3 CAR分子核苷酸(2 Ambystoma laterale x Ambystomajeffersonianum)
<400> 19
atggccctgc ccgtcaccgc tctgctgctg ccccttgctc tgcttcttca tgcagcaagg 60
ccggatatcg ttataaccca atctcccgac tcattggcag tcagtttggg cgaacgggcg 120
actattaact gtaaatcatc acagtctttg ctcaactcag gcaatcagag aaattacctg 180
acttggtatc aacagaagcc cgggcaaccg ccaaaactgt tgttttattg ggcttcaaca 240
cgggaaagtg gggtgcctga tcggtttaca gggagcggat ccggcaccga ttttactttg 300
acaatctctt cactgcaagc cgaggacgta gcggtttact attgtcaaaa tgcctattat 360
tacccattta ccttcggagg cgggacaaaa cttgaaataa agggtggcgg aggctctggc 420
ggcgggggct cagggggtgg tggttctgag gttcaacttg tagagagtgg aggaggagtt 480
gtacaaccgg ggggcagtct tagactttct tgcgctgcat ctgggtttac attctctaag 540
tttggaatga gttgggtgag acaagcgccc ggtaagcgcc ttgagtgggt agcaactttt 600
agctcaggtg gtgactacac cttctaccca gactccgtga agggtcggtt caccattagc 660
cgagataact caaaaaacac gctttacctg caaatgaaca gtctgcgagc tgaggatacg 720
gcggtatatt actgtgcaaa gttgtattat ggaaatagca tggattcctg gagccagggt 780
ctctctgtga cagtttctag taccacgacg ccagcgccgc gaccaccaac accggcgccc 840
accatcgcgt cgcagcccct gtccctgcgc ccagaggcgt gccggccagc ggcggggggc 900
gcagtgcaca cgagggggct ggacttcgcc tgtgatatct acatctgggc gcccttggcc 960
gggacttgtg gggtccttct cctgtcactg gttatcaccc tttactgcaa acggggcaga 1020
aagaaactcc tgtatatatt caaacaacca tttatgagac cagtacaaac tactcaagag 1080
gaagatggct gtagctgccg atttccagaa gaagaagaag gaggatgtga actgagagtg 1140
aagttcagca ggagcgcaga cgcccccgcg taccagcagg gccagaacca gctctataac 1200
gagctcaatc taggacgaag agaggagtac gatgttttgg acaagagacg tggccgggac 1260
cctgagatgg ggggaaagcc gagaaggaag aaccctcagg aaggcctgta caatgaactg 1320
cagaaagata agatggcgga ggcctacagt gagattggga tgaaaggcga gcgccggagg 1380
ggcaaggggc acgatggcct ttaccagggt ctcagtacag ccaccaagga cacctacgac 1440
gcccttcaca tgcaggccct gccccctcgc 1470
<210> 20
<211> 1470
<212> DNA
<213> KD-182-4 CAR分子核苷酸(2 Ambystoma laterale x Ambystomajeffersonianum)
<400> 20
atggccctgc ccgtcaccgc tctgctgctg ccccttgctc tgcttcttca tgcagcaagg 60
ccggacatag tcataacaca atctccgctt agcttgccgg tcactcctgg cgaaccagcc 120
tctatcagtt gtaaaagctc acaatcactg ctcaatagcg gaaaccagcg gaactatttg 180
acatggtacc tccaaaaacc tggtcaacct ccaaagctgc tgttttactg ggcctcaacg 240
cgggagtcag gggttcctga tcggtttact ggttcaggca gcggtacaga ttttacgctg 300
aaaataagca gggttgaggc agaagatgtc ggtgtctatt actgtcagaa cgcatattac 360
tacccgttta cctttggtgg cggtacaaag ctggaaatca aaggcggggg cggaagcgga 420
ggtggtggtt caggtggagg cggttccgaa gtgcagcttc ttgaaagtgg tggtgggttg 480
gtacaaccag gaggcagtct cagactgtcc tgtgccgctt ccggcttcac gttctctaag 540
tttggaatgt catgggtacg acaggcaccc gataagcgcc tcgaatgggt cgcaactttt 600
tccagcggtg gtgattacac gttctatcca gattcagtca aaggccggtt tacgatctcc 660
cgagataaca gtaagaatac actgtatctt caaatgaatt cacttcgggc agaagatacc 720
gcgatttatt attgcgctaa actttactac gggaactcta tggattcctg gagtcaaggc 780
ttgagtgtta ctgtatcaag taccacgacg ccagcgccgc gaccaccaac accggcgccc 840
accatcgcgt cgcagcccct gtccctgcgc ccagaggcgt gccggccagc ggcggggggc 900
gcagtgcaca cgagggggct ggacttcgcc tgtgatatct acatctgggc gcccttggcc 960
gggacttgtg gggtccttct cctgtcactg gttatcaccc tttactgcaa acggggcaga 1020
aagaaactcc tgtatatatt caaacaacca tttatgagac cagtacaaac tactcaagag 1080
gaagatggct gtagctgccg atttccagaa gaagaagaag gaggatgtga actgagagtg 1140
aagttcagca ggagcgcaga cgcccccgcg taccagcagg gccagaacca gctctataac 1200
gagctcaatc taggacgaag agaggagtac gatgttttgg acaagagacg tggccgggac 1260
cctgagatgg ggggaaagcc gagaaggaag aaccctcagg aaggcctgta caatgaactg 1320
cagaaagata agatggcgga ggcctacagt gagattggga tgaaaggcga gcgccggagg 1380
ggcaaggggc acgatggcct ttaccagggt ctcagtacag ccaccaagga cacctacgac 1440
gcccttcaca tgcaggccct gccccctcgc 1470

Claims (7)

1.一种特异性靶向人Claudin18.2的嵌合抗原受体，其特征在于：
所述的嵌合抗原受体包括：
靶向人Claudin18.2的胞外识别结构域氨基酸序列：SEQ ID No.2或SEQ ID No.3或SEQID No.4或SEQ ID No.5所示的靶向结合人Claudin18.2的氨基酸序列；
所述的嵌合抗原受体的氨基酸序列为：
从氨基端到羧基端顺次连接的引导序列的氨基酸序列、靶向结合人Claudin18.2的胞外识别结构域氨基酸序列、铰链区氨基酸序列、跨膜结构域氨基酸序列、胞内信号结构域氨基酸序列，所述的嵌合抗原受体的氨基酸序列：SEQ ID No.13或SEQ ID No.14或SEQ IDNo.15或SEQ ID No.16所示。
2.编码权利要求1所述的特异性靶向人Claudin18.2的嵌合抗原受体的核酸分子，其特征在于：
包括从5’到3’依次串联连接的编码所述引导序列的核苷酸序列、编码靶向人Claudin18.2蛋白的核苷酸序列、编码铰链区的核苷酸序列、编码所述跨膜结构域的核苷酸序列、编码所述胞内信号结构域的核苷酸序列；所述的核酸分子的核苷酸序列为：SEQ IDNo.17或SEQ ID No.18或SEQ ID No.19或SEQ ID No.20所示。
3.一种重组载体，其特征在于包含权利要求2中所述的核酸分子。
4.一种重组病毒，其特征在于包括权利要求3所述的重组载体的病毒颗粒；所述病毒包括慢病毒、腺病毒、腺联病毒或逆转录病毒。
5.一种功能化免疫应答细胞，其特征在于其是通过采用如权利要求4所述的重组病毒感染免疫效应细胞获得；所述免疫效应细胞包括细胞毒性T淋巴细胞、NK细胞、NKT细胞、辅助性T细胞或巨噬细胞。
6.一种生物制品，其特征在于含有权利要求1所述的嵌合抗原受体；或含有权利要求2所述的核酸分子；或含有权利要求3所述的重组载体；或含有权利要求4所述的重组病毒；或含有权利要求5所述的功能化免疫应答细胞。
7.根据权利要求6所述的生物制品在制备治疗癌症药物的应用，所述的癌症为胃癌，胰癌，卵巢癌、胆癌和肺腺癌。
CN202110397832.1A 2021-04-14 2021-04-14 靶向Claudin18.2的特异性嵌合抗原受体细胞及其制备方法和应用 Active CN113416260B (zh)

Priority Applications (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN202110397832.1A CN113416260B (zh) 2021-04-14 2021-04-14 靶向Claudin18.2的特异性嵌合抗原受体细胞及其制备方法和应用

Applications Claiming Priority (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN202110397832.1A CN113416260B (zh) 2021-04-14 2021-04-14 靶向Claudin18.2的特异性嵌合抗原受体细胞及其制备方法和应用

Publications (2)

Publication Number Publication Date
CN113416260A CN113416260A (zh) 2021-09-21
CN113416260B true CN113416260B (zh) 2022-02-01

Family

ID=77711900

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
CN202110397832.1A Active CN113416260B (zh) 2021-04-14 2021-04-14 靶向Claudin18.2的特异性嵌合抗原受体细胞及其制备方法和应用

Country Status (1)

Country Link
CN (1) CN113416260B (zh)

Families Citing this family (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN113896801B (zh) * 2021-10-08 2022-05-17 南京凯地医疗技术有限公司 靶向人Claudin18.2和NKG2DL的嵌合抗原受体细胞及其制备方法和应用
TW202323285A (zh) * 2021-11-05 2023-06-16 大陸商正大天晴藥業集團股份有限公司 抗cldn18.2抗體及其用途
CN116284443B (zh) * 2023-01-18 2023-12-01 汕头普罗凯融生物医药科技有限公司 一种可特异性识别Claudin18.2的嵌合抗原受体及应用其的CAR-NK细胞

Family Cites Families (13)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN111518214B (zh) * 2019-02-03 2023-09-22 上海健信生物医药科技有限公司 靶向cldn18.2的双特异性抗体及其制备方法和应用
JP7468903B2 (ja) * 2018-06-17 2024-04-16 エルアンドエル バイオファーマ カンパニー リミテッド Ｃｌｄｎ１８．２を標的とする抗体、二重特異性抗体、ａｄｃ及びｃａｒならびにその使用
CN110606891B (zh) * 2018-06-17 2022-12-06 上海健信生物医药科技有限公司 一种针对人cldn18.2的抗体分子，抗原结合片段及其医药用途
CN111848809A (zh) * 2019-04-08 2020-10-30 上海健信生物医药科技有限公司 靶向Claudin18.2的CAR分子、其修饰的免疫细胞及用途
WO2020023679A1 (en) * 2018-07-25 2020-01-30 Accurus Biosciences, Inc. Novel cldn 18.2-specific monoclonal antibodies and methods of use thereof
CN110862454B (zh) * 2018-08-27 2022-12-30 南京圣和药业股份有限公司 一种抗Claudin18_2抗体及其应用
CN109762067B (zh) * 2019-01-17 2020-02-28 北京天广实生物技术股份有限公司 结合人Claudin 18.2的抗体及其用途
TW202102546A (zh) * 2019-04-01 2021-01-16 大陸商江蘇恆瑞醫藥股份有限公司 密蛋白抗體及其應用
KR20220024010A (ko) * 2019-05-16 2022-03-03 치루 파머수티컬 컴퍼니 리미티드 클라우딘 18a2에 대한 항체 및 그의 용도
KR20220006085A (ko) * 2019-05-30 2022-01-14 샨동 보안 바이오테크놀로지 컴퍼니, 리미티드 클라우딘(Claudin) 18.2를 표적화하는 항체 또는 키메라 항원 수용체
CN112111013A (zh) * 2019-06-22 2020-12-22 南京北恒生物科技有限公司 一种靶向claudin 18.2的通用型嵌合抗原受体T细胞、构建方法及其用途
CN112574307B (zh) * 2019-09-29 2023-11-28 迈威(上海)生物科技股份有限公司 抗人Claudin18.2抗体及其应用
CN112707965A (zh) * 2019-09-30 2021-04-27 和铂医药(苏州)有限公司 靶向cldn18.2的抗体及其制备方法和应用

Also Published As

Publication number Publication date
CN113416260A (zh) 2021-09-21

Similar Documents

Publication Publication Date Title
CN112142854B (zh) 免疫调节特异性嵌合抗原受体细胞及制备方法和应用
KR102223873B1 (ko) 단일 도메인 항체에 기반한 bcma 키메라 항원 수용체 및 응용
US11090335B2 (en) Chimeric antigen receptor targeting human NKG2DL and methods of preparing said receptor and pharmaceutical composition
CN108018299B (zh) 靶向bcma的嵌合抗原受体及其用途
US11453860B2 (en) GPC3 and ASGPR1 double-targeted transgenic immune effector cell and use thereof
CN113416260B (zh) 靶向Claudin18.2的特异性嵌合抗原受体细胞及其制备方法和应用
WO2017041749A1 (zh) 可活化的嵌合受体
CN109306016B (zh) 共表达细胞因子il-7的nkg2d-car-t细胞及其用途
JP2022031784A (ja) Ｂｃｍａを標的とするキメラ抗原受容体およびその製造方法と使用
WO2020108645A1 (en) Cd19-and bcma-based combined car-t immunotherapy
CN111675765B (zh) 靶向冠状病毒spike的武装嵌合抗原受体细胞及制备方法和应用
CN113896801B (zh) 靶向人Claudin18.2和NKG2DL的嵌合抗原受体细胞及其制备方法和应用
WO2019154391A1 (zh) 嵌合抗原受体、表达该嵌合抗原受体的nkg2d car-nk细胞及其制备方法和应用
CN114891751A (zh) 一种高效稳定表达激活型抗体的car-t细胞及其用途
CN112500497B (zh) Cltx-nkg2d双特异性嵌合抗原受体细胞及其制备方法和应用
US20190209671A1 (en) Specific Chimeric Antigen Receptor T Cells Targeting to CD47, Preparation Method and Application Thereof
WO2018233589A1 (zh) 一种微环dna转染t细胞制备临床级car-t细胞制剂的方法
WO2023083192A1 (zh) 联合表达CCR2b和CD40L的工程化免疫细胞及其制备和应用
WO2024113649A1 (zh) 提高nk细胞存活和抗肿瘤活性的方法及其应用
CN111978412B (zh) 武装靶向TGF-β的特异性嵌合抗原受体细胞及其制备方法和应用
WO2020019983A1 (zh) 一种用于治疗肿瘤的基因工程细胞
WO2024055339A1 (zh) 用于制备和扩增通用型人源化抗cd19 car-nk细胞的方法及其用途
CN110699371A (zh) 一种基于FcγRⅢa的嵌合基因及其用途
CN110669138A (zh) 一种双嵌合抗原受体、t细胞及其构建方法与应用
CN111607006B (zh) 武装靶向cxcr2配体的特异性嵌合抗原受体细胞及其制备方法和应用

Legal Events

Date Code Title Description
PB01 Publication
PB01 Publication
SE01 Entry into force of request for substantive examination
SE01 Entry into force of request for substantive examination
GR01 Patent grant
GR01 Patent grant