CN110862454B - 一种抗Claudin18_2抗体及其应用 - Google Patents

一种抗Claudin18_2抗体及其应用 Download PDF

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Abstract

本发明涉及抗体药物技术领域，具体涉及一种抗Claudin18.2抗体或其抗原结合片段，包含抗Claudin18.2抗体或其抗原结合片段的药物组合物以及它们的应用。所述抗体与Claudin18.2具有显著的结合活性和亲和力，同时对肿瘤细胞具有高效的体外ADCC杀伤活性，可在制备抗肿瘤的药物中应用，具有广阔的市场前景。

Description

一种抗Claudin18_2抗体及其应用
技术领域
本发明涉及抗体药物技术领域，具体涉及一种抗Claudin18.2抗体或其抗原结合片段，包含抗Claudin18.2抗体或其抗原结合片段的药物组合物以及它们的应用。
背景技术
胃癌是全球发病率第五高的癌症类型，其致死率更是达到第三高。目前，化疗是晚期或复发性胃癌的标准一线治疗。90％以上癌症病人会接受普通的化疗和靶向化疗，但化疗一般不能治愈癌症，只能延长患者生存期和改善生活质量，而且易产生抗药性。生物靶向治疗，通常以肿瘤特异性抗原或肿瘤相关抗原为靶点，依赖抗体对靶点的结合或阻断从而引发机体免疫反应，选择性杀伤肿瘤而不波及周围正常细胞和组织。靶向治疗特异性强，副反应少，疗效确切。
然而由于恶性肿瘤异质性，不同癌症表现出不一致的分子生物学特性。尤其对于胃癌，其异质程度较高，以往开发的针对胃癌的生物靶向治疗药物，作为单药使用基本无效或对极少部分患者有效。究其原因是这些单抗药物所针对的靶点仅在胃癌患者中特定亚型中表达。典型的例如曲妥珠单抗(Trastuzumab)，其结合化疗有好的疗效，但只能适用于仅占所有胃癌患者15％的HER2阳性个体。
紧密连接蛋白(Claudins)是决定细胞间紧密连接结构的最重要的骨架蛋白，其参与粘附连接，并且在肿瘤细胞的转移和侵袭中起到重要作用。Claudin蛋白广泛存在于哺乳动物上皮和内皮细胞中，其分布主要是上皮细胞侧面以及基底细胞质膜上。
不同的Claudin蛋白在不同组织中具有各自特异性表达，其中Claudin18(CLDN18)基因定位于3q22.3，分子量24kDa，包含261个氨基酸残基，属Claudins超家族成员，其蛋白结构包含2个细胞外环和4个穿膜区。人CLDN18蛋白的两个亚型分别是CLDN18.1(NM_016369.3)和CLDN18.2(NM_001002026.2)，在二者蛋白的一级结构序列中，仅N端信号肽至细胞外环1(Loop1)结构的某些位置的氨基酸残基上有所区别，尤其是在细胞外环1上，CLDN18.1和CLDN18.2仅8个氨基酸不同。此外，CLDN18的两种亚型蛋白的种属间序列同源性也非常高。其中CLDN18.2的细胞外环1在人、小鼠、猕猴等不同物种上序列完全一致，而人与小鼠的CLDN18.2蛋白同源性达到84％，表明CLDN18.2蛋白序列极端保守性(O.Tureci.,etal.,Gene 481:83-92,2011)。
CLDN18的两种亚型蛋白，分别在不同组织表达和发挥生理学功能。CLDN18.1组成性表达于正常的肺组织细胞；而CLDN18.2蛋白表达于正常胃上皮细胞膜，在除胃以外的各种组织中均不表达或极低表达。Salin等(U.Salin.,et al.,Clin Cancer Res 14(23):7624-34,2008)应用RT-PCR和免疫组化方法检测包括胃癌、胰腺癌、食管癌等多种癌症组织为CLDN18.2阳性，总体表达阳性率达62.7％。另有研究显示，正常胃壁细胞表达的CLDN18.2蛋白具有均一的糖基化修饰，细胞间结构致密。而胃癌细胞间结构松散，细胞易侵袭转移，其上表达的CLDN18.2蛋白糖基化不完全，可能导致靶点暴露(WO2004/047863)。因此，CLDN18.2可能是理想的肿瘤相关抗原靶点。
目前，安斯泰来公司(Astellas Pharma Inc.)开发了以人Claudin18.2为靶点的单克隆抗体药物Zolbetuximab(又名IMAB362)在临床疗效显著。Ⅱ期临床试验显示(S.Batran.et al.,Journal of Clinical Oncology 34(no.18_suppl),2016)，单抗药物与化药联合治疗晚期或复发性胃癌，其患者中位生存期13.2个月，显著长于仅用化疗的8.4个月。初步证实靶向CLDN18.2的特异性抗体可以明显改善晚期胃、胃食管结合部腺癌患者的无进展生存期和总生存期。
WO2004/047863描述一种人鼠嵌合单克隆抗体的制备是全球首个针对人Claudin18.2靶点开发的治疗性抗体(以下简称抗CLDN18.2抗体)。该专利申请所述抗体主要通过抗体依赖的细胞介导的细胞毒作用(Antibody-dependent cell-mediatedcytotoxicity,ADCC)途径特异性杀伤CLDN18.2阳性肿瘤细胞。然而，该专利申请所述抗体与肿瘤细胞之间的特异性识别和杀伤，主要依赖于CLDN18.2靶点在肿瘤细胞上表达丰度，当细胞表面高表CLDN18.2，才体现出较明显的结合和杀伤活性。这说明有必要制备一种高亲和力单克隆抗体，提高其选择性杀伤肿瘤细胞的能力。
基于以上现有技术，本发明现提供一种高效的CLDN18.2抗体或其抗原结合片段，其具有优异的抗肿瘤活性。
发明内容
本发明一方面提供一种抗CLDN18.2抗体或其抗原结合片段，其包含重链可变区和/或轻链可变区，其中所述重链可变区包含重链可变区的互补决定区1(HCDR1)、重链可变区的互补决定区2(HCDR2)和/或重链可变区的互补决定区3(HCDR3)，所述轻链可变区包含轻链可变区的互补决定区1(LCDR1)、轻链可变区的互补决定区2(LCDR2)和/或轻链可变区的互补决定区3(LCDR3)。
在一些实施方案中，本发明提供一种抗CLDN18.2抗体或其抗原结合片段，其包含重链可变区和轻链可变区，其中：
(1)所述重链可变区包含HCDR1、HCDR2和HCDR3：
(a1)所述HCDR1的氨基酸序列选自SEQ ID NO 101、SEQ ID NO 102、SEQ ID NO103和与它们具有至少85％序列同一性的氨基酸序列；
(a2)所述HCDR2的氨基酸序列选自SEQ ID NO 104、SEQ ID NO 105和与它们具有至少85％序列同一性的氨基酸序列；
(a3)所述HCDR3的氨基酸序列选自SEQ ID NO 106、SEQ ID NO 107和与它们具有至少85％序列同一性的氨基酸序列；和
(2)所述轻链可变区包含LCDR1、LCDR2和LCDR3，其中：
(a4)所述LCDR1的氨基酸序列为SEQ ID NO 108；
(a5)所述LCDR2的氨基酸序列选自SEQ ID NO 109、SEQ ID NO 110、SEQ ID NO111和与它们具有至少85％序列同一性的氨基酸序列；
(a6)所述LCDR3的氨基酸序列选自SEQ ID NO 112、SEQ ID NO 113、SEQ ID NO114、SEQ ID NO 115、SEQ ID NO 116和与它们具有至少85％序列同一性的氨基酸序列。
在一个具体的实施方案中，本发明提供一种抗CLDN18.2抗体或其抗原结合片段，其具有所述HCDR1、HCDR2和HCDR3分别为SEQ ID NO 101、105和106或与SEQ ID NO 101、105和106所示的氨基酸序列具有至少85％序列同一性的CDR的重链可变区，和所述LCDR1、LCDR2和LCDR3分别为SEQ ID NO 108、111和115或与SEQ ID NO 108、111和115所示的氨基酸序列具有至少85％序列同一性的CDR的轻链可变区。
在一些具体的实施方案中，根据本发明的抗CLDN18.2抗体或其抗原结合片段是单克隆抗体或其抗原结合片段。
在一些具体的实施方案中，根据本发明的抗CLDN18.2抗体或其抗原结合片段是鼠源抗体或其抗原结合片段、嵌合抗体或其抗原结合片段或人源化抗体或其抗原结合片段。
在一些具体的实施方案中，本发明提供一种抗CLDN18.2抗体或其抗原结合片段，其包含重链可变区和轻链可变区，其中
(1)所述重链可变区的氨基酸序列选自：
(b1)如SEQ ID NO 50、SEQ ID NO 72、SEQ ID NO 74、SEQ ID NO 77、SEQ ID NO79所示的氨基酸序列；
(b2)(b1)所示的氨基酸序列经取代、缺失或添加一个或多个氨基酸获得的、且与(b1)所示的氨基酸序列功能相同或相似的氨基酸序列；和
(b3)与(b1)所示的氨基酸序列具有至少80％序列同一性的氨基酸序列；和
(2)所述轻链可变区的氨基酸序列选自：
(b4)如SEQ ID NO 51、SEQ ID NO 70、SEQ ID NO 71、SEQ ID NO 73、SEQ ID NO75、SEQ ID NO 76、SEQ ID NO 78、SEQ ID NO 80、SEQ ID NO 81所示的氨基酸序列；
(b5)(b4)所示的氨基酸序列经取代、缺失或添加一个或多个氨基酸获得的、且与(b4)所示的氨基酸序列功能相同或相似的氨基酸序列；和
(b6)与(b4)所示的氨基酸序列具有至少80％序列同一性的氨基酸序列。
在一些具体的实施方案中，本发明提供一种抗CLDN18.2抗体或其抗原结合片段，其中所述重链可变区的氨基酸序列为SEQ ID NO:50，SEQ ID NO:50经取代、缺失或添加一个或多个氨基酸获得的且与SEQ ID NO:50功能相同的氨基酸序列或与SEQ ID NO:50具有至少85％序列同一性的氨基酸序列，且所述轻链可变区的氨基酸序列为SEQ ID NO:51，SEQID NO:51经取代、缺失或添加一个或多个氨基酸获得的且与SEQ ID NO:51功能相同的氨基酸序列或与SEQ ID NO:51具有至少85％序列同一性的氨基酸序列。
在一些具体的实施方案中，本发明提供一种抗CLDN18.2抗体或其抗原结合片段，其中所述重链可变区的氨基酸序列为SEQ ID NO:50，SEQ ID NO:50经取代、缺失或添加一个或多个氨基酸获得的且与SEQ ID NO:50功能相同的氨基酸序列或与SEQ ID NO:50具有至少85％序列同一性的氨基酸序列，且所述轻链可变区的氨基酸序列为SEQ ID NO:70，SEQID NO:70经取代、缺失或添加一个或多个氨基酸获得的且与SEQ ID NO:70功能相同的氨基酸序列或与SEQ ID NO:70具有至少85％序列同一性的氨基酸序列。
在一些具体的实施方案中，本发明提供一种抗CLDN18.2抗体或其抗原结合片段，其中所述重链可变区的氨基酸序列为SEQ ID NO:50，SEQ ID NO:50经取代、缺失或添加一个或多个氨基酸获得的且与SEQ ID NO:50功能相同的氨基酸序列或与SEQ ID NO:50具有至少85％序列同一性的氨基酸序列，且所述轻链可变区的氨基酸序列为SEQ ID NO:71，SEQID NO:71经取代、缺失或添加一个或多个氨基酸获得的且与SEQ ID NO:71功能相同的氨基酸序列或与SEQ ID NO:71具有至少85％序列同一性的氨基酸序列。
在一些具体的实施方案中，本发明提供一种抗CLDN18.2抗体或其抗原结合片段，其中所述重链可变区的氨基酸序列为SEQ ID NO:72，SEQ ID NO:72经取代、缺失或添加一个或多个氨基酸获得的且与SEQ ID NO:72功能相同的氨基酸序列或与SEQ ID NO:72具有至少85％序列同一性的氨基酸序列，且所述轻链可变区的氨基酸序列为SEQ ID NO:73，SEQID NO:73经取代、缺失或添加一个或多个氨基酸获得的且与SEQ ID NO:73功能相同的氨基酸序列或与SEQ ID NO:73具有至少85％序列同一性的氨基酸序列。
在一些具体的实施方案中，本发明提供一种抗CLDN18.2抗体或其抗原结合片段，其中所述重链可变区的氨基酸序列为SEQ ID NO:74，SEQ ID NO:74经取代、缺失或添加一个或多个氨基酸获得的且与SEQ ID NO:74功能相同的氨基酸序列或与SEQ ID NO:74具有至少85％序列同一性的氨基酸序列，且所述轻链可变区的氨基酸序列为SEQ ID NO:75，SEQID NO:75经取代、缺失或添加一个或多个氨基酸获得的且与SEQ ID NO:75功能相同的氨基酸序列或与SEQ ID NO:75具有至少85％序列同一性的氨基酸序列。
在一些具体的实施方案中，本发明提供一种抗CLDN18.2抗体或其抗原结合片段，其中所述重链可变区的氨基酸序列为SEQ ID NO:50，SEQ ID NO:50经取代、缺失或添加一个或多个氨基酸获得的且与SEQ ID NO:50功能相同的氨基酸序列或与SEQ ID NO:50具有至少85％序列同一性的氨基酸序列，且所述轻链可变区的氨基酸序列为SEQ ID NO:76，SEQID NO:76经取代、缺失或添加一个或多个氨基酸获得的且与SEQ ID NO:76功能相同的氨基酸序列或与SEQ ID NO:76具有至少85％序列同一性的氨基酸序列。
在一些具体的实施方案中，本发明提供一种抗CLDN18.2抗体或其抗原结合片段，其中所述重链可变区的氨基酸序列为SEQ ID NO:77，SEQ ID NO:77经取代、缺失或添加一个或多个氨基酸获得的且与SEQ ID NO:77功能相同的氨基酸序列或与SEQ ID NO:77具有至少85％序列同一性的氨基酸序列，且所述轻链可变区的氨基酸序列为SEQ ID NO:78，SEQID NO:78经取代、缺失或添加一个或多个氨基酸获得的且与SEQ ID NO:78功能相同的氨基酸序列或与SEQ ID NO:78具有至少85％序列同一性的氨基酸序列。
在一些具体的实施方案中，本发明提供一种抗CLDN18.2抗体或其抗原结合片段，其中所述重链可变区的氨基酸序列为SEQ ID NO:74，SEQ ID NO:74经取代、缺失或添加一个或多个氨基酸获得的且与SEQ ID NO:74功能相同的氨基酸序列或与SEQ ID NO:74具有至少85％序列同一性的氨基酸序列，且所述轻链可变区的氨基酸序列为SEQ ID NO:70，SEQID NO:70经取代、缺失或添加一个或多个氨基酸获得的且与SEQ ID NO:70功能相同的氨基酸序列或与SEQ ID NO:70具有至少85％序列同一性的氨基酸序列。
在一些具体的实施方案中，本发明提供一种抗CLDN18.2抗体或其抗原结合片段，其中所述重链可变区的氨基酸序列为SEQ ID NO:74，SEQ ID NO:74经取代、缺失或添加一个或多个氨基酸获得的且与SEQ ID NO:74功能相同的氨基酸序列或与SEQ ID NO:74具有至少85％序列同一性的氨基酸序列，且所述轻链可变区的氨基酸序列为SEQ ID NO:71，SEQID NO:71经取代、缺失或添加一个或多个氨基酸获得的且与SEQ ID NO:71功能相同的氨基酸序列或与SEQ ID NO:71具有至少85％序列同一性的氨基酸序列。
在一些具体的实施方案中，本发明提供一种抗CLDN18.2抗体或其抗原结合片段，其中所述重链可变区的氨基酸序列为SEQ ID NO:74，SEQ ID NO:74经取代、缺失或添加一个或多个氨基酸获得的且与SEQ ID NO:74功能相同的氨基酸序列或与SEQ ID NO:74具有至少85％序列同一性的氨基酸序列，且所述轻链可变区的氨基酸序列为SEQ ID NO:76，SEQID NO:76经取代、缺失或添加一个或多个氨基酸获得的且与SEQ ID NO:76功能相同的氨基酸序列或与SEQ ID NO:76具有至少85％序列同一性的氨基酸序列。
在一些具体的实施方案中，本发明提供一种抗CLDN18.2抗体或其抗原结合片段，其中所述重链可变区的氨基酸序列为SEQ ID NO:72，SEQ ID NO:72经取代、缺失或添加一个或多个氨基酸获得的且与SEQ ID NO:72功能相同的氨基酸序列或与SEQ ID NO:72具有至少85％序列同一性的氨基酸序列，且所述轻链可变区的氨基酸序列为SEQ ID NO:76，SEQID NO:76经取代、缺失或添加一个或多个氨基酸获得的且与SEQ ID NO:76功能相同的氨基酸序列或与SEQ ID NO:76具有至少85％序列同一性的氨基酸序列。
在一些具体的实施方案中，本发明提供一种抗CLDN18.2抗体或其抗原结合片段，其中所述重链可变区的氨基酸序列为SEQ ID NO:77，SEQ ID NO:77经取代、缺失或添加一个或多个氨基酸获得的且与SEQ ID NO:77功能相同的氨基酸序列或与SEQ ID NO:77具有至少85％序列同一性的氨基酸序列，且所述轻链可变区的氨基酸序列为SEQ ID NO:70，SEQID NO:70经取代、缺失或添加一个或多个氨基酸获得的且与SEQ ID NO:70功能相同的氨基酸序列或与SEQ ID NO:70具有至少85％序列同一性的氨基酸序列。
在一些具体的实施方案中，本发明提供一种抗CLDN18.2抗体或其抗原结合片段，其中所述重链可变区的氨基酸序列为SEQ ID NO:77，SEQ ID NO:77经取代、缺失或添加一个或多个氨基酸获得的且与SEQ ID NO:77功能相同的氨基酸序列或与SEQ ID NO:77具有至少85％序列同一性的氨基酸序列，且所述轻链可变区的氨基酸序列为SEQ ID NO:76，SEQID NO:76经取代、缺失或添加一个或多个氨基酸获得的且与SEQ ID NO:76功能相同的氨基酸序列或与SEQ ID NO:76具有至少85％序列同一性的氨基酸序列。
在一些具体的实施方案中，本发明提供一种抗CLDN18.2抗体或其抗原结合片段，其中所述重链可变区的氨基酸序列为SEQ ID NO:79，SEQ ID NO:79经取代、缺失或添加一个或多个氨基酸获得的且与SEQ ID NO:79功能相同的氨基酸序列或与SEQ ID NO:79具有至少85％序列同一性的氨基酸序列，且所述轻链可变区的氨基酸序列为SEQ ID NO:70，SEQID NO:70经取代、缺失或添加一个或多个氨基酸获得的且与SEQ ID NO:70功能相同的氨基酸序列或与SEQ ID NO:70具有至少85％序列同一性的氨基酸序列。
在一些具体的实施方案中，本发明提供一种抗CLDN18.2抗体或其抗原结合片段，其中所述重链可变区的氨基酸序列为SEQ ID NO:79，SEQ ID NO:79经取代、缺失或添加一个或多个氨基酸获得的且与SEQ ID NO:79功能相同的氨基酸序列或与SEQ ID NO:79具有至少85％序列同一性的氨基酸序列，且所述轻链可变区的氨基酸序列为SEQ ID NO:76，SEQID NO:76经取代、缺失或添加一个或多个氨基酸获得的且与SEQ ID NO:76功能相同的氨基酸序列或与SEQ ID NO:76具有至少85％序列同一性的氨基酸序列。
在一些具体的实施方案中，本发明提供一种抗CLDN18.2抗体或其抗原结合片段，其中所述重链可变区的氨基酸序列为SEQ ID NO:50，SEQ ID NO:50经取代、缺失或添加一个或多个氨基酸获得的且与SEQ ID NO:50功能相同的氨基酸序列或与SEQ ID NO:50具有至少85％序列同一性的氨基酸序列，且所述轻链可变区的氨基酸序列为SEQ ID NO:80，SEQID NO:80经取代、缺失或添加一个或多个氨基酸获得的且与SEQ ID NO:80功能相同的氨基酸序列或与SEQ ID NO:80具有至少85％序列同一性的氨基酸序列。
在一些具体的实施方案中，本发明提供一种抗CLDN18.2抗体或其抗原结合片段，其中所述重链可变区的氨基酸序列为SEQ ID NO:50，SEQ ID NO:50经取代、缺失或添加一个或多个氨基酸获得的且与SEQ ID NO:50功能相同的氨基酸序列或与SEQ ID NO:50具有至少85％序列同一性的氨基酸序列，且所述轻链可变区的氨基酸序列为SEQ ID NO:81，SEQID NO:81经取代、缺失或添加一个或多个氨基酸获得的且与SEQ ID NO:81功能相同的氨基酸序列或与SEQ ID NO:81具有至少85％序列同一性的氨基酸序列。
在一些具体的实施方案中，本发明提供一种抗CLDN18.2抗体或其抗原结合片段，其中所述重链可变区的氨基酸序列为SEQ ID NO:79，SEQ ID NO:79经取代、缺失或添加一个或多个氨基酸获得的且与SEQ ID NO:79功能相同的氨基酸序列或与SEQ ID NO:79具有至少85％序列同一性的氨基酸序列，且所述轻链可变区的氨基酸序列为SEQ ID NO:80，SEQID NO:80经取代、缺失或添加一个或多个氨基酸获得的且与SEQ ID NO:80功能相同的氨基酸序列或与SEQ ID NO:80具有至少85％序列同一性的氨基酸序列。
在一些具体的实施方案中，本发明提供一种抗CLDN18.2抗体或其抗原结合片段，其中所述重链可变区的氨基酸序列为SEQ ID NO:79，SEQ ID NO:79经取代、缺失或添加一个或多个氨基酸获得的且与SEQ ID NO:79功能相同的氨基酸序列或与SEQ ID NO:79具有至少85％序列同一性的氨基酸序列，且所述轻链可变区的氨基酸序列为SEQ ID NO:81，SEQID NO:81经取代、缺失或添加一个或多个氨基酸获得的且与SEQ ID NO:81功能相同的氨基酸序列或与SEQ ID NO:81具有至少85％序列同一性的氨基酸序列。
在一些具体的实施方案中，本发明提供一种抗CLDN18.2抗体或其抗原结合片段，其中所述抗体还含有人源的IgG1或其变体的重链恒定区，人源的kappa链或其变体的轻链恒定区。
在一些具体的实施方案中，本发明提供一种抗CLDN18.2抗体或其抗原结合片段，对氨基酸序列如SEQ ID NO 79所示的重链可变区作如下氨基酸替换：
(c1)K3Q、L19R、R42G、P45L、A49S、E73D、T78S、E82Q、S84N、S88A、M93V、A118S，替换后的氨基酸序列如SEQ ID NO 82所示；
(c2)K3Q、V5L、L19R、R42G、P45L、A49S、E73D、A75S、E82Q、S8N、S88A、M93V、A118S，替换后的氨基酸序列如SEQ ID NO 88所示。
且对氨基酸序列如SEQ ID NO 81所示的轻链可变区作如下氨基酸替换：
(c3)D1E、S9P、S10T、T12S、V13L、T14S、A15P、K18R、K21L、P49A、K51L、G63S、V64I、D66A、T69S、V84L、A86P、A106Q、L112I，替换后的氨基酸序列如SEQ ID NO 84所示；
(c4)S9D、T12A、T14S、A15L、K18R、V19A、M21I、S22N、T69S、V84L、L89V、A106Q、L112I，替换后的氨基酸序列如SEQ ID NO 86所示；
(c5)A9L、T12P、A15L、E17Q、K18P、V19A、T20S、M21I、K45R、P49S、K51R、T69S、T80K、S83R、Q85E、L89V、A90G、A106Q、L112I，替换后的氨基酸序列如SEQ ID NO 90所示。
在一些具体的实施方案中，本发明提供一种抗CLDN18.2抗体或其抗原结合片段，其中：
(1)所述重链可变区的氨基酸序列选自：
(c1)如SEQ ID NO 82、SEQ ID NO 88所示的氨基酸序列；
(c2)(c1)所示的氨基酸序列经取代、缺失或添加一个或多个氨基酸获得的、且与(c1)所示的氨基酸序列功能相同或相似的氨基酸序列；和
(c3)与(c1)所示的氨基酸序列具有至少80％序列同一性的氨基酸序列；和
(2)所述轻链可变区的氨基酸序列选自：
(c4)SEQ ID NO 84、SEQ ID NO 86、SEQ ID NO 90所示的氨基酸序列；
(c5)(c4)所示的氨基酸序列经取代、缺失或添加一个或多个氨基酸获得的、且与(c4)所示的氨基酸序列功能相同或相似的氨基酸序列；和
(c6)与(c4)所示的氨基酸序列具有至少80％序列同一性的氨基酸序列。
在一些具体的实施方案中，本发明提供一种抗CLDN18.2抗体或其抗原结合片段，所述重链可变区的氨基酸序列为SEQ ID NO 82，SEQ ID NO 82经取代、缺失或添加一个或多个氨基酸获得的且与SEQ ID NO 82功能相同的氨基酸序列或与SEQ ID NO 82具有至少85％序列同一性的氨基酸序列，且所述轻链可变区的氨基酸序列为SEQ ID NO 84，SEQ IDNO 84经取代、缺失或添加一个或多个氨基酸获得的且与SEQ ID NO 84功能相同的氨基酸序列或与SEQ ID NO 84具有至少85％序列同一性的氨基酸序列。
在一些具体的实施方案中，本发明提供一种抗CLDN18.2抗体或其抗原结合片段，所述重链可变区的氨基酸序列为SEQ ID NO 82，SEQ ID NO 82经取代、缺失或添加一个或多个氨基酸获得的且与SEQ ID NO 82功能相同的氨基酸序列或与SEQ ID NO 82具有至少85％序列同一性的氨基酸序列，且所述轻链可变区的氨基酸序列为SEQ ID NO 86，SEQ IDNO 86经取代、缺失或添加一个或多个氨基酸获得的且与SEQ ID NO 86功能相同的氨基酸序列或与SEQ ID NO 86具有至少85％序列同一性的氨基酸序列。
在一些具体的实施方案中，本发明提供一种抗CLDN18.2抗体或其抗原结合片段，所述重链可变区的氨基酸序列为SEQ ID NO 88，SEQ ID NO 88经取代、缺失或添加一个或多个氨基酸获得的且与SEQ ID NO 88功能相同的氨基酸序列或与SEQ ID NO 88具有至少85％序列同一性的氨基酸序列，且所述轻链可变区的氨基酸序列为SEQ ID NO 84，SEQ IDNO 84经取代、缺失或添加一个或多个氨基酸获得的且与SEQ ID NO 84功能相同的氨基酸序列或与SEQ ID NO 84具有至少85％序列同一性的氨基酸序列。
在一些具体的实施方案中，本发明提供一种抗CLDN18.2抗体或其抗原结合片段，所述重链可变区的氨基酸序列为SEQ ID NO 88，SEQ ID NO 88经取代、缺失或添加一个或多个氨基酸获得的且与SEQ ID NO 88功能相同的氨基酸序列或与SEQ ID NO 88具有至少85％序列同一性的氨基酸序列，且所述轻链可变区的氨基酸序列为SEQ ID NO 86，SEQ IDNO 86经取代、缺失或添加一个或多个氨基酸获得的且与SEQ ID NO 86功能相同的氨基酸序列或与SEQ ID NO 86具有至少85％序列同一性的氨基酸序列。
在一些具体的实施方案中，本发明提供一种抗CLDN18.2抗体或其抗原结合片段，所述重链可变区的氨基酸序列为SEQ ID NO 82，SEQ ID NO 82经取代、缺失或添加一个或多个氨基酸获得的且与SEQ ID NO 82功能相同的氨基酸序列或与SEQ ID NO 82具有至少85％序列同一性的氨基酸序列，且所述轻链可变区的氨基酸序列为SEQ ID NO 90，SEQ IDNO 90经取代、缺失或添加一个或多个氨基酸获得的且与SEQ ID NO 90功能相同的氨基酸序列或与SEQ ID NO 90具有至少85％序列同一性的氨基酸序列。
在一些具体的实施方案中，本发明提供一种抗CLDN18.2抗体或其抗原结合片段，所述重链可变区的氨基酸序列为SEQ ID NO 88 SEQ ID NO 88经取代、缺失或添加一个或多个氨基酸获得的且与SEQ ID NO 88功能相同的氨基酸序列或与SEQ ID NO 88具有至少85％序列同一性的氨基酸序列，且所述轻链可变区的氨基酸序列为SEQ ID NO 90，SEQ IDNO 90经取代、缺失或添加一个或多个氨基酸获得的且与SEQ ID NO 90功能相同的氨基酸序列或与SEQ ID NO 90具有至少85％序列同一性的氨基酸序列。
在一些具体的实施方案中，本发明提供一种抗CLDN18.2抗体或其抗原结合片段，其包含重链氨基酸序列为SEQ ID NO 92，SEQ ID NO 92经取代、缺失或添加一个或多个氨基酸获得的且与SEQ ID NO 92功能相同的氨基酸序列或与SEQ ID NO 92具有至少85％序列同一性的氨基酸序列，且轻链氨基酸序列为SEQ ID NO 94，SEQ ID NO 94经取代、缺失或添加一个或多个氨基酸获得的且与SEQ ID NO 94功能相同的氨基酸序列或与SEQ ID NO94具有至少85％序列同一性的氨基酸序列。
在一些具体的实施方案中，本发明提供一种抗CLDN18.2抗体或其抗原结合片段，其包含重链氨基酸序列为SEQ ID NO 96，SEQ ID NO 96经取代、缺失或添加一个或多个氨基酸获得的且与SEQ ID NO 96功能相同的氨基酸序列或与SEQ ID NO 96具有至少85％序列同一性的氨基酸序列，且轻链氨基酸序列为SEQ ID NO 98，SEQ ID NO 98经取代、缺失或添加一个或多个氨基酸获得的且与SEQ ID NO 98功能相同的氨基酸序列或与SEQ ID NO98具有至少85％序列同一性的氨基酸序列。
本发明的另一方面提供一种分离的核苷酸，其编码本发明的抗CLDN18.2抗体或其抗原结合片段。
在一些具体的实施方案中，本发明提供了编码本发明的抗CLDN18.2抗体或其抗原结合片段的核苷酸序列，其中，
(1)编码所述重链氨基酸序列的核苷酸序列如SEQ ID NO 93或SEQ ID NO 97所示；
(2)编码所述轻链氨基酸序列的核苷酸序列如SEQ ID NO 95或SEQ ID NO 99所示。
在一些具体的实施方案中，本发明提供了编码本发明的抗CLDN18.2抗体或其抗原结合片段的核苷酸序列，其中，
(1)编码所述重链氨基酸序列SEQ ID NO 92的核苷酸序列如SEQ ID NO 93所示；和
(2)编码所述轻链氨基酸序列SEQ ID NO 94的核苷酸序列如SEQ ID NO 95所示。
在一些具体的实施方案中，本发明提供了编码本发明的抗CLDN18.2抗体或其抗原结合片段的核苷酸序列，其中，
(1)编码所述重链氨基酸序列SEQ ID NO 96的核苷酸序列如SEQ ID NO 97所示；和
(2)编码所述轻链氨基酸序列SEQ ID NO 98的核苷酸序列如SEQ ID NO 99所示。
本发明的另一方面提供一种表达载体，其表达本发明的抗CLDN18.2抗体或其抗原结合片段。根据本发明的表达载体其包含本发明的分离的核苷酸分子。
本发明的另一方面提供一种如上所述的表达载体转化的宿主细胞。
在一些实施方案中，根据本发明的宿主细胞选自原核细胞和真核细胞。在一些实施方案中，所述的宿主细胞为细菌，优选为大肠杆菌。在另一个优选的实施方案中，所述的宿主细胞为哺乳动物细胞。
本发明的另一方面提供制备本发明的抗CLDN18.2抗体或其抗原结合片段的方法，包括在所述宿主细胞中表达抗体以及从宿主细胞中分离所述抗体的步骤。
本发明的另一方面提供一种药物组合物，其包含本发明的抗CLDN18.2人源化抗体或其抗原结合片段和药学可接受的载体。在一些实施方案中，本发明提供药物组合物，其包含本发明的抗CLDN18.2人源化抗体或其抗原结合片段，还包含其他活性组分，如其他抗体、靶向药物等。在一些实施方案中，所述药学可接受的载体选自抗氧化剂、多肽、蛋白质、亲水性聚合物、氨基酸、糖、螯合剂、糖醇、离子和表面活性剂。在一个具体的实施方案中，所述药学可接受的载体为缓冲水溶液。在另一个具体的实施方案中，所述药学可接受的载体为脂质体的形式。
可以将本发明的抗CLDN18.2人源化抗体或其抗原结合片段与药学上可接受的载体、稀释剂或赋形剂混合制备成药物制剂，以适合于经口或胃肠外给药。给药方法包括，但不限于经口、皮内、肌内、腹膜内、静脉内、脑内、眼内、气管内、皮下、鼻内途径。所述制剂可以通过任何途径施用，例如通过输注或推注，通过经上皮或皮肤粘膜(例如口腔粘膜或直肠等)吸收的途径施用。给药可以是全身的或局部的。所述制剂可通过本领域已知的方法制备，且包含药物制剂领域常规使用的载体、稀释剂或赋形剂。
本发明的另一方面提供靶向CLDN18.2治疗的方法，所述方法包括向有此需要的个体施用本发明的抗CLDN18.2抗体或其抗原结合片段或本发明的药物组合物。
本发明的另一方面提供本发明的抗CLDN18.2抗体或其抗原结合片段或本发明的药物组合物在制备靶向CLDN18.2的药物中的应用。在一些实施方案中，所述靶向CLDN18.2的药物用于治疗胃癌、食管癌、胰腺癌、肺癌、卵巢癌、结肠癌、肝癌、头颈癌和胆囊癌。在一些实施方案中，本发明提供上述抗CLDN18.2抗体或其抗原结合片段或本发明的药物组合物在制备抗肿瘤的药物中的应用，优选地，所述肿瘤选自胃癌、食管癌、胰腺癌、肺癌、卵巢癌、结肠癌、肝癌、头颈癌和胆囊癌。
本发明提供的抗CLDN18.2抗体或其抗原结合片段具有显著的抗肿瘤作用，亲和力高，体外ADCC杀伤肿瘤细胞的能力强，具有显著的技术优势。
定义
除非另有定义，本文中使用的科学和技术术语的含义是本领域技术人员所通常理解的含义。本文中所述的细胞和组织培养、分子生物学以及蛋白质和寡或多核苷酸化学及杂交中使用的命名和技术是本领域公知且普遍使用的。对于重组DNA、寡核苷酸合成和组织培养与转化(如电穿孔、脂质转染)，使用了标准技术。酶促反应和纯化技术根据生产商的说明书或本领域普遍使用或本文所述的方法进行。前述技术和方法通常根据本领域公知且本说明书中引用和讨论的多部综合和较具体的文献中描述的那样使用。参见例如Sambrook等，Molecular Cloning:A Laboratory Manual)(第2版，Cold Spring Harbor LaboratoryPress，纽约冷泉港(1989))。本文所述的分析化学、合成有机化学以及医学和药学化学中使用的命名以及实验室方法和技术是本领域公知且普遍使用的。
在本发明中，术语“至少80％序列同一性”是指至少80％，81％，82％，83％，84％，85％，86％，87％，88％，89％，90％，91％，92％，93％，94％，95％，96％，97％，98％，99％，100％的序列同一性。在本发明中，术语“至少85％序列同一性”是指至少85％，86％，87％，88％，89％，90％，91％，92％，93％，94％，95％，96％，97％，98％，99％，100％的序列同一性。在一些优选的实施方案中，本发明所述的序列同一性可以至少为90％，91％，92％，93％，94％，95％，96％，97％，98％，99％，100％。两个序列之间的序列比较和同一性百分比测定可以通过National Center For Biotechnology Instutute网站上的BLASTN/BLASTP算法来进行。
在抗体分子中，轻链的三个高变区和重链的三个高变区在三维空间中以相对彼此的位置排列以形成抗原结合表面。抗原结合表面与所结合抗原的三维表面互补，且每条重链和轻链的三个高变区均被称作“互补决定区”或“CDR”。氨基酸向每个结构域的分配是根据Kabat《免疫学感兴趣的蛋白质的序列》(国立卫生研究院，马里兰州贝塞斯达(1987和1991))或Chothia和Lesk，J.Mol.Biol.196:901-917(1987)，Chothia等，Nature 342:878-883(1989)定义。
本发明所述的“抗原结合片段”是指具有抗原结合活性的Fab片段、Fab’片段、F(ab’)2片段及与人Claudin18.2结合的Fv片段、scFv片段。Fv片段含有抗体重链可变区和轻链可变区，但没有恒定区，并具有全部抗原结合位点的最小抗体片段。一般地，Fv抗体还包含在VH和VL结构域之间的多肽接头，且能够形成抗原结合所需的结构。也可以用不同的连接物将两个抗体可变区连接成一条多肽链，称为单链抗体或单链Fv(scFv)。
本发明所述的抗体指免疫球蛋白分子或其免疫活性部分，即包含特异性结合抗原(与其免疫反应)的抗原结合位点的分子。“特异性结合”指抗体与抗原的一种或多种抗原决定簇反应而不与其他多肽反应或以很低的亲和性(Kd>10-6)结合其他多肽。抗体包括但不限于多克隆、单克隆、嵌合、dAb(结构域抗体)、单链、Fab、Fab’和F(ab’)2片段、Fv、scFv及Fab表达文库。单克隆抗体(mAb)是由单一的克隆细胞株得到的抗体，所述的细胞株不限于真核的、原核的或噬菌体的克隆细胞株。单克隆抗体或抗原结合片段可以用如杂交瘤技术、重组技术、噬菌体展示技术及合成技术如CDR grafting或其它现有技术进行重组得到。
本发明所述的“鼠源抗体”为根据本领域知识和技能制备的对人CLDN18.2的单克隆抗体。制备时用CLDN18.2抗原注射试验对象，然后分离表达具有所需序列或功能特性的抗体的杂交瘤。
本发明所述的“嵌合抗体”是将鼠源性抗体的可变区与人抗体的恒定区融合而成的抗体，可以减轻鼠源性抗体诱发的免疫应答反应。建立嵌合抗体，要先建立分泌鼠源性特异性单抗的杂交瘤，然后从小鼠杂交瘤细胞中克隆可变区基因，再根据需要克隆人抗体的恒定区基因，将小鼠可变区基因与人恒定区基因连接成嵌合基因后插入表达载体中，最后在真核工业系统或原核工业系统中表达嵌合抗体分子。
本发明所述的“人源化抗体”也称为CDR移植抗体，是将小鼠的CDR序列移植到人的抗体可变区框架(FR)中产生的抗体。此类可变区框架序列可以从公共的DNA数据库或公开的参考文献获得，例如从ImMunoGeneTics(IMGT)网站http://imgt.cines.fr得到或从免疫球蛋白杂志，2001ISBN012441351上获得。
附图说明
图1是嵌合抗体与CLDN18.2细胞的结合，其中横坐标为抗体浓度，单位是ng/ml；纵坐标为450nm的OD值。
图2是嵌合抗体与CLDN18.1细胞的结合，其中横坐标为抗体浓度，单位是ng/ml；纵坐标为450nm的OD值。
图3是噬菌体Fab与CLDN18.2蛋白的结合，其中横坐标为噬菌体滴度；纵坐标为450nm的OD值。
图4是人源化抗体与CHO-K1-CLDN18.2细胞的结合，其中横坐标为抗体浓度，单位是mg/ml；纵坐标为与细胞结合的平均荧光强度MFI。
图5是人源化抗体与CHO-K1-CLDN18.1细胞的结合，其中横坐标为抗体浓度，单位是mg/ml；纵坐标为与细胞结合的平均荧光强度MFI。
图6是人源化抗体的ADCC活性。
具体实施方式
下面代表性的实施例是为了更好地说明本发明，而非用于限制本发明的保护范围。以下实施例中未注明条件的实验方法通常按照常规条件，如冷泉港的抗体技术实验手册、分子克隆手册等，或按照原料或商品制造厂商所建议的条件进行。实施例中使用的材料、试剂如无特殊说明均为商购获得。
实施例1阳性对照抗体的制备
1、阳性对照抗体IMAB362-similar-hG1的制备：
根据专利申请WO2007/059997提供的175D10克隆(IMAB362)抗体序列(即本公开中的SEQ ID NO 11和SEQ ID NO 12)，委托南京金斯瑞生物科技有限公司进行密码子优化后合成在pcDNA3.1(+)载体中。构建质粒包括pcDNA3.1-hG1和pcDNA3.1-hK。将质粒按1:1比例共转染expiCHO细胞瞬时表达，转速110rpm，37℃，8％CO2培养4天后，转移到32℃摇床中继续培养8-10天。4500rpm，25分钟离心，收获蛋白上清经ProteinA亲和层析纯化：0.1M NaOH溶液清洗AKTA层析系统及层析柱30min，超纯水冲洗干净；pH7.4的20mM磷酸钠缓冲液平衡10个柱体积；设定流速2ml/min，上样；平衡液清洗层析柱10个柱体积；pH3.4的50mM醋酸缓冲液洗脱3-5个柱体积，收集洗脱蛋白；超滤浓缩将抗体置换于pH7.0的20mM磷酸盐缓冲液中保存。
SDS-PAGE凝胶电泳结果显示：阳性抗体IMAB362-similar-hG1的分子量约155KD，SDS-PAGE纯度大于90％。
2、鼠源阳性对照抗体IMAB362-similar-mG2a的制备：
即阳性抗体可变区序列与小鼠IgG2a恒定区组合的抗体序列SEQ ID NO 13和SEQID NO14。密码子优化后合成在pcDNA3.1(+)载体中。构建质粒包括pcDNA3.1-mG2a和pcDNA3.1-mK。将质粒按1:1比例共转染expiCHO细胞瞬时表达阳性抗体蛋白。收获的上清蛋白经ProteinA亲和层析纯化：0.1M NaOH溶液清洗AKTA层析系统及层析柱30min，超纯水冲洗干净；pH7.4的20mM磷酸钠缓冲液平衡10个柱体积；设定流速2ml/min，上样；平衡液清洗层析柱10个柱体积；pH3.4的50mM醋酸缓冲液洗脱3-5个柱体积，收集洗脱蛋白；超滤浓缩将抗体置换于pH7.0的20mM磷酸盐缓冲液中保存。
SDS-PAGE凝胶电泳结果显示：阳性抗体IMAB362-similar-mG2a的非还原电泳显示蛋白分子量约155KD，SDS-PAGE纯度大于90％。
实施例2 CLDN18.2抗原基因合成及表达载体构建
表达人CLDN18.2抗原的融合蛋白序列设计如下表1所示：
表1 CLDN18.2序列设计
Figure BDA0002179648780000171
上述设计的人CLDN18.2抗原的融合蛋白序列进行真核密码子优化，并在基因5’端加入NotI等酶切位点及tPA信号肽序列，在基因3’端加入XhoI等酶切位点以及Myc-His融合蛋白标签。合成上述SEQ ID NO 1、3、5、6序列并构建到pcDNA3.1(+)载体中，获得表达人CLDN18.2抗原的DNA质粒。质粒包括：pcDNA3.1-loop1、pcDNA3.1-TML、pcDNA3.1-CpG-loop1以及pcDNA3.1-CLDN18.2-FL。
上述SEQ ID NO 7、9序列由宝生物工程(大连)有限公司(以下简称：宝生物公司)优化后合成，构建到慢病毒载体pLVX-NS-ZsGreen上(宝生物公司)。所构建慢病毒质粒pLVX-CLDN18.2-ZsGreen及pLVX-CLDN18.1-ZsGreen用于进一步构建HEK293-CLDN18.2融合绿色荧光蛋白稳定表达细胞株，以及构建HEK293-CLDN18.1融合绿色荧光蛋白稳定表达细胞株。
将扩增培养的质粒用于酶切鉴定，鉴定结果显示酶切目的条带与预期大小一致，表明构建正确。
实施例3 CLDN18.2抗原蛋白的表达
1、质粒DNA体外瞬时转染
将实施例2中扩增培养的质粒通过体外瞬间转染HEK293T细胞(中国科学院生物化学与细胞生物学研究所，以下简称上海细胞所)，在蛋白水平鉴定。具体实验步骤如下：转染前一天，按3×105个/cm2的接种密度将HEK293T细胞平铺在六孔板中，培养(培养基成分：10％胎牛血清DMEM培养基+1％青霉素-链霉素)过夜，使细胞在转染当日完全贴壁，并使细胞丰度达70％-90％(六孔板每孔大小为9cm2，细胞长满约2-2.5×106个/孔)；使用PEI阳离子转染试剂(sigma)或脂质体(Lipo3000,Thermo)与DNA质粒混合，制备DNA质粒转染复合物，加入细胞室温静置5-20分钟，37℃，5％CO2孵育4-5小时；向六孔板中补加含血清的完全培养基，培养48-72小时，使外源基因在体外真核细胞瞬时表达。
2、WesternBlot免疫印迹杂交
收集瞬时转染后的HEK293T细胞，将目的蛋白与兔抗人Claudin18抗体(Thermo,Cat:700178)室温杂交，2小时；PBST洗涤3次，碱性磷酸酶标记的山羊抗兔IgG(Thermo,Cat:31346)室温杂交，1小时；Western Blot免疫印迹鉴定目的蛋白表达情况：使用Lipo脂质体转染系统，质粒可成功表达目的蛋白CLDN18.2-loop1和CLDN18.2-TM-loop1，分子量分别为11KD和14KD，pcDNA3.1-CLDN18.2-FL质粒成功表达目的蛋白CLDN18.2，分子量大小29KD。
实施例4小鼠杂交瘤的制备
1、动物免疫：
按QIAGEN无内毒素质粒大量提取试剂盒说明书提取制备质粒DNA，包括pcDNA3.1-loop1(以下简称Loop1)、pcDNA3.1-TM-Loop1(以下简称TML)、pcDNA3.1-CpG-loop1(以下简称Loop1-C)。各质粒按照如下表2实验分组进行小鼠免疫，其中SJL小鼠购自北京维通利华实验动物技术有限公司，BALB/c小鼠和C57小鼠购自南京市玄武区华阜康生物制品中心。免疫参考Zhiwei Chen等描述的方法(Z.Chen.,et al.,J Clin Invest.123(6):2629-2642(2013))，并进行了适当的修改，具体如下：DNA质粒通过活体基因导入仪(上海塔瑞莎生物技术有限公司)分两点分别注射小鼠左右后肢肌肉，每点注射等量DNA质粒，注射体积50μl。注射后立即用导入仪的电极向小鼠注射位点处输入电脉冲刺激，电压设置36V，共脉冲6次。电脉冲刺激可以促进小鼠肌肉细胞吸收DNA质粒并提高小鼠DNA免疫应答尤其是体液免疫应答水平。DNA免疫每2周注射一次，共免疫三次。在第2次及第3次免疫7天后，小鼠眼底静脉丛采血进行流式分析，当检测到血清抗体中明显的CLDN18阳性信号时，则对小鼠采用HEK293-CLDN18.2细胞作为抗原，制备成5×107个/ml细胞悬液，小鼠腹腔注射100μl即5×106个细胞加强免疫。
表2小鼠免疫分组
Figure BDA0002179648780000191
Figure BDA0002179648780000201
2、FACS检测免疫血清：
小鼠第二次、第三次DNA免疫后一周，分别采集小鼠眼底静脉丛血，制备免疫血清。封闭液(2％BSA的PBS)按1:50体积稀释血清。提前复苏并培养人胃癌细胞NUGC4(南京科佰生物科技有限公司)，含10％胎牛血清的1640培养基培养，37℃，5％CO2。当细胞状态良好，生长汇合度在70-80％时，使用胃癌细胞消化液(齐氏生物科技有限公司)消化处理细胞，37℃，15分钟。完全1640培养基终止消化，1000rpm，5分钟离心，弃上清。加入适量的封闭液重悬细胞，调节细胞密度至1×106个/ml。将100μl NUGC4细胞与100μl稀释的小鼠血清混合，4℃孵育，1小时；Cell Stain Buffer(Biolegend)洗涤2次，每次1000rpm，5分钟离心，弃上清。加入100μl PE标记的山羊抗鼠抗体(Biolegend)，4℃孵育，1小时；Cell Stain Buffer(Biolegend)洗涤2次，每次1000rpm，5分钟离心，弃上清。加入300μl Cell Stain Buffer重悬细胞，以流式分析仪检测。
DNA免疫第2次后，编号#0103小鼠即检测到明显阳性信号偏移，表明该号小鼠产生抗CLDN18特异性抗体反应。而DNA免疫第3次后，所有小鼠都检测到阳性信号，其中编号#0101、#0102、#0103、#0203、#0301，#0303小鼠CLDN18阳性率大于50％，显示第三次DNA免疫后这些小鼠体内产生明显抗体免疫应答，血清中存在较高水平的抗CLDN18抗体。
3、小鼠杂交瘤细胞的制备：
制备小鼠骨髓瘤细胞悬液：提前两周复苏小鼠骨髓瘤细胞SP2/0，用含10％胎牛血清的1640培养基37℃，5％CO2培养、传代。融合当天，观察SP2/0细胞状态。镜检SP2/0细胞汇合度70％-80％，由此判断细胞处于对数生长期。300g，5分钟离心收集SP2/0细胞，用20mlPBS洗涤1次，1000rpm，5min，弃上清；用适量的1640培养基重悬，调节SP2/0细胞浓度至1×107个/ml，待用。
制备小鼠饲养层细胞悬液：融合前一天，拉颈处死20只周龄在10-12周的健康Balb/c小鼠，无菌手术剪打开小鼠腹部皮肤，先在腹部横剪一小口，再纵向向胸部剪开，使小鼠腹部暴露。收集腹腔巨噬细胞：先用酒精棉球消毒小鼠腹部，再用注射器往小鼠腹腔注射5ml的1640基础培养基，轻柔按摩小鼠腹部5分钟，然后用注射器回吸腹腔的液体。重复一次，注射3ml 1640基础培养基后回吸(或者剪开腹膜后，再用巴氏吸管回吸剩下的巨噬细胞)。将收集的巨噬细胞离心1500rpm，10min，弃上清，用10ml(含10％胎牛血清的1640培养基)重悬细胞，待用。
制备小鼠脾淋巴细胞悬液：细胞加强免疫后第3-4天，取免疫小鼠脾细胞与SP2/0融合。小鼠拉颈处死，无菌剪开腹膜，取出脾脏并剥去周围结缔组织。研磨小鼠脾细胞后70μm筛网过滤至事先装有15ml 1640培养基的50ml离心管中，制备单细胞悬液；1500rpm，5min，1640培养基洗涤，弃上清；加入4ml红细胞裂解液(Sigma)裂解红细胞约2min；加入等体积1640培养基至，1500rpm,5min离心，弃上层红细胞层；用20ml PBS重悬，洗涤2次，1500rpm,5min离心。第2次洗涤后，用15ml PBS重悬细胞，此时如果有结块的结缔组织残留，可以将细胞全部过筛，转移到新的50ml离心管；对脾淋巴细胞计数，用适量的1640培养基重悬，调节脾细胞至1×107个/ml。
取1×108个脾细胞按1:1比例与SP2/0细胞混合，1500rpm，5分钟离心，弃上清。用BTX电融合缓冲液重悬混匀，按照BTX电融合仪说明书步骤进行电融合操作。将融合后的细胞室温静置30分钟，向其中加入含有1×HAT，10％胎牛血清的1640选择培养基中，再加入事先制备的饲养层细胞悬液，铺96孔板共200块，37℃，5％CO2培养5-7天。其后使用含1×HT的培养基换液培养融合后的杂交瘤细胞克隆。
实施例5阳性细胞株的制备
a.构建CHO-K1-CLDN18.2稳定细胞株
提前一周复苏CHO-K1细胞(上海细胞所)，用含10％胎牛血清的DME/F12完全培养基，37℃，5％CO2培养。转染细胞的质粒为pcDNA3.1-CLDN18.2-FL(合成序列见SEQ ID NO6)。转染当天，CHO-K1细胞生长密度达80％-90％，按Biorad Gene Pulser Xcell电转仪操作说明，将质粒转入CHO-K1细胞，将转染后细胞全部转移到事先预热有完全培养基的培养皿中，37℃，5％CO2静置过夜培养。第二天，加入终浓度为1mg/ml的G418(Sigma)抗性筛选3-4天，使用含G418抗性的完全培养基至少传5代使克隆稳定后，检测细胞CLDN18.2表达情况。结果显示，使用阳性抗体IMAB362-similar-hG1(终浓度10μg/ml)与细胞孵育检测流式，与CHO-K1空细胞相比，转染细胞显示传代5代后，转染细胞稳定表达人Claudin18.2。
b.构建CHO-K1-CLDN18.1稳定细胞株
以pLVX-CLDN18.1-ZsGreen质粒为模板，设计引物序列SEQ ID NO 15和SEQ ID NO16，按PrimeStar(Takara)说明书配制PCR体系，PCR程序设置98℃变性30秒，60℃退火30秒，72℃延伸1分钟，30次循环扩增获得CLDN18.1-FL目的基因片段(见SEQ ID NO 17)。BamHI和EcoRI双酶切目的基因和pcDNA3.1(+)载体，T4连接酶(Takara)16℃连接过夜。将连接产物转化入E.coli大肠杆菌，小量提取试剂盒提取质粒pcDNA3.1-CLDN18.1。将质粒按上述步骤电转导入CHO-K1细胞，G418抗性培养基培养和传代细胞，WesternBlot结果显示，转染后细胞可被抗CLDN18抗体(Thermo)染色呈阳性反应，而FACS分析转染细胞与CLDN18.2阳性抗体IMAB362-similar-hG1以10μg/ml浓度孵育后，显示为阴性荧光信号。表明转染CLDN18.1细胞构建成功。
实施例6母克隆杂交瘤抗体筛选
对融合后获得的母克隆杂交瘤细胞进行第一轮初筛，筛选方法包括细胞ELISA和FACS分别检测杂交瘤细胞培养上清，从中筛选CLDN18阳性的杂交瘤母克隆。对初筛显示CLDN18阳性克隆扩大培养后，进行第二轮复筛，从中筛选FACS显示CLDN18.2阳性CLDN18.1阴性的杂交瘤母克隆。经过两轮细胞ELISA和FACS筛选杂交瘤抗体，从几百株母克隆细胞中共筛选获得9株母克隆细胞分泌CLDN18.2特异性抗体，能与HEK293-CLDN18.2细胞产生阳性结合，而与HEK293-CLDN18.1细胞结合为阴性。
实施例7亚克隆的培养及筛选
1、亚克隆的培养
由实施例6中筛选获得的杂交瘤细胞制备单克隆。重悬24孔板中杂交瘤细胞，制备成细胞悬液。对每个克隆细胞计数，1640完全培养基将细胞终浓度调节到1×104个/ml；分别取60μl细胞悬液加入140μl 1640完全培养基，共200μl，混匀；提前一天取出-20℃保存的半固体培养基D(StemCell)，4℃化冻，使用前放置于37℃预热1小时。取2.5ml半固体培养基与200μl细胞悬液充分混匀，室温静置15分钟；将混匀的半固体培养基细胞悬液转移到6孔细胞培养板(Corning)，接种数量为每孔600个细胞，孔板四周加入适量无菌水，置于37℃，5％CO2中培养5-7天。待孔板中细胞生长为密实的球形单克隆细胞群落，则用10μl枪头吸取，转移到铺有200μl 1×HT，10％CloneEasy及10％胎牛血清的1640培养基中，充分混匀细胞悬液，37℃，5％CO2培养2-3天。
2、亚克隆的筛选
鉴定亚克隆细胞培养上清抗体的CLDN18.2特异性，所采用筛选方法为细胞ELISA分别检测上清抗体与CLDN18.2和CLDN18.1稳转细胞阳性结合情况。具体实施方法如下：
用含10％胎牛血清的DMEM完全培养基37℃，5％CO2，分别培养HEK293-CLDN18.1和HEK293-CLDN18.2细胞。当细胞生长汇合度达80％-90％时，0.5mM EDTA-PBS无胰酶消化液室温消化细胞，1000rpm，5分钟离心，弃上清。DMEM完全培养基重悬，调节细胞浓度至6×105个/ml。将细胞平铺在预先包被多聚赖氨酸的96孔细胞板(Corning)，每孔100μl，37℃，5％CO2培养24小时，使细胞均匀铺满孔底。吸走培养上清，4％多聚甲醛室温固定细胞20分钟，200μl PBS洗涤3次，每次2分钟。200μl 3％BSA-PBS封闭孔板，37℃，1小时。取亚克隆培养上清100μl加入孔板，37℃孵育1小时，PBS洗涤5次。封闭液1:10000稀释的HRP-anti mouseIgG+IgM(Jackson)37℃孵育1小时。PBS洗涤5次。加入100μl TMB单组份显色液室温避光5-10分钟，2M硫酸终止，酶标仪OD450读数。结果如表3所示，杂交瘤培养上清与CLDN18.2结合强阳性亚克隆(即OD值高于阳性对照OD值50％)包括：S3F10C5、S5H3A6、S5H3B6、S5H3D6、S6F10E7、S6H9B8、S6H9C8、C40B10D9、C42B12D10和C58B11E11。在这些亚克隆中，S5H3A6、S5H3B6、S5H3D6、C40B10D9、C42B12D10和C58B11E11显示与CLDN18.1细胞结合为阴性。
表3细胞ELISA筛选亚克隆结果
Figure BDA0002179648780000231
Figure BDA0002179648780000241
将亚克隆B4B10G3、S5H3B6、S6H9B8、C40B10D9、C42B12D10和C58B11E11进行克隆扩大培养。用200μL移液器重悬96孔板中的细胞，细胞悬液全部转移到24孔细胞板(Corning)中，加入1ml含2％CloneEasy，10％胎牛血清的1640培养基，置于37℃，5％CO2培养箱中培养3-4天。
实施例8抗体亚型鉴定
按小鼠抗体亚型鉴定试剂盒SBA Clonotyping System(SouthernBiotech)说明书操作步骤，加入待测亚克隆细胞培养上清鉴定小鼠抗体的亚型。鉴定结果如下：
亚克隆B4B10G3，抗体重链恒定区亚型为鼠IgG2b；抗体轻链恒定区亚型为鼠Kappa链；
亚克隆S5H3B6，抗体重链恒定区亚型为鼠IgM，抗体轻链恒定区亚型为鼠Kappa链；
亚克隆S6H9B8，抗体重链恒定区亚型为鼠IgG3，抗体轻链恒定区亚型为鼠Kappa链；
亚克隆C58B11E11，抗体重链恒定区亚型为鼠IgG2c，抗体轻链恒定区亚型为鼠Kappa链；
亚克隆C40B10D9，抗体重链恒定区亚型为鼠IgM，抗体轻链恒定区亚型为鼠Kappa链；
亚克隆C42B12D10，抗体重链恒定区亚型为鼠IgM，抗体轻链恒定区亚型为鼠Kappa链。
实施例9抗体可变区测序
收集24孔板中单克隆化杂交瘤细胞，调节至1×106个/ml，共1ml，1000rpm，5分钟离心，弃上清。按照QIAGEN公司的RNA提取试剂盒(Cat:#74134)说明书操作步骤进行细胞总RNA的小量提取，使用NanoDrop核酸定量分析仪测定RNA浓度。接下来，按照Takera逆转录试剂盒(Cat:#6110A)将2μg的总RNA逆转录成cDNA，-80℃保存，待用。以cDNA为模板，按Takara公司的PremixTaq酶操作说明分别配制抗体轻重链测序的PCR体系及设置PCR仪程序。PCR体系中所用引物合成自苏州金唯智公司，具体引物序列如下：
重链测序引物VH-F包括:
VH-F1(包含引物序列SEQ ID NO 18和SEQ ID NO19)、VH-F2(包含引物序列SEQ IDNO 20，SEQ ID NO 21，SEQ ID NO 22，以及引物序列SEQ ID NO 23，SEQ ID NO 24，SEQ IDNO 25)、VH-F3(引物序列SEQ ID NO 26)
重链测序引物VH-R包括:
VH-R1(引物序列SEQ ID NO 27)、VH-R2(引物序列SEQ ID NO 28)
轻链测序引物VL-F包括:
VL-F1(引物序列SEQ ID NO 29)、VL-F2(包含引物序列SEQ ID NO 30和SEQ ID NO31)、VL-F3(包含引物序列SEQ ID NO 32，SEQ ID NO33，SEQ ID NO 34)
轻链测序引物VL-R包括:
VL-R(引物序列SEQ ID NO 35)
将PCR扩增所获得PCR产物委托苏州金唯智公司测序，测序结果见表4。
表4亚克隆核苷酸序列表
Figure BDA0002179648780000251
Figure BDA0002179648780000261
实施例10嵌合抗体的制备
根据实施例9中获得的鼠源抗体可变区序列，将人IgG1恒定区与小鼠抗体可变区组合，通过基因合成方式构建人鼠嵌合抗体，以进一步研究抗体亲和力和抗体性质。
a.人鼠嵌合抗体基因合成
委托苏州金唯智生物科技有限公司合成嵌合抗体基因优化并构建到真核表达载体pcDNA3.1(+)，嵌合抗体分别命名为1CHI、3CHI、7CHI、17CHI、18CHI、19CHI。各嵌合抗体所对应抗体可变区序列如下表5所示：
表5嵌合抗体的序列
Figure BDA0002179648780000262
b.嵌合抗体表达和蛋白纯化
将包含上述嵌合抗体轻重链基因的质粒按1:1比例瞬时转染HEK293E细胞(上海细胞所)。转速110rpm，37℃，8％CO2振荡培养7天。4500rpm，20分钟离心，收获上清蛋白。经ProteinA亲和层析纯化：0.1M NaOH溶液清洗AKTA层析系统及层析柱30min，超纯水冲洗干净；pH7.4的20mM磷酸钠缓冲液平衡10个柱体积；设定流速2ml/min，上样；平衡液清洗层析柱10个柱体积；pH3.4的50mM醋酸缓冲液洗脱3-5个柱体积，收集洗脱蛋白；超滤浓缩将抗体置换于pH5.55的50mM醋酸盐缓冲液中保存。
其中，嵌合抗体3CHI、18CHI和19CHI的SDS-PAGE凝胶电泳显示嵌合抗体3CHI、18CHI和19CHI的SDS-PAGE纯度均大于90％。
实施例11嵌合抗体与CLDN18.2特异性结合测定
提前两周复苏HEK293-CLDN18.2和HEK293-CLDN18.1细胞，用含10％胎牛血清的DMEM完全培养基37℃，5％CO2培养。当细胞生长汇合度达80％-90％时，0.5mM EDTA-PBS(Sigma)室温消化细胞，1000rpm，5分钟离心，弃上清。DMEM完全培养基重悬，调节细胞浓度至6×105个/ml。将细胞分别平铺在预先包被2.5μg/孔的多聚赖氨酸(Corning)的96孔细胞板，每孔100μl，37℃，5％CO2培养24小时，使细胞均匀长满孔底。吸走培养上清，4％多聚甲醛室温固定细胞20分钟，200μl PBS洗涤3次，每次2分钟。200μl 3％BSA-PBS封闭孔板，37℃，1小时。以3％BSA-PBS稀释各嵌合抗体浓度至6μg/ml，并按6倍梯度稀释，共稀释7个浓度。同时以相同浓度梯度稀释的IMAB362-similar-hG1作为阳性对照，以人IgG1,kappa同型对照抗体(以下简称Isotype，中美冠科生物技术(太仓)有限公司提供)作为阴性对照，分别加入到HEK293-CLDN18.2和HEK293-CLDN18.1细胞板中。37℃孵育1小时，PBS洗涤5次。封闭液1:10000稀释的HRP-anti human IgG(Jackson)37℃孵育1小时。PBS洗涤5次。加入100μlTMB单组份显色液室温避光5-10分钟，加入50μl 2M硫酸终止，酶标仪OD450读数。数据处理：将原始数据代入GraphPad 5.0软件作图并计算。结果见表6。
表6嵌合抗体与CLDN18.2特异性结合测定
Figure BDA0002179648780000271
Figure BDA0002179648780000281
各嵌合抗体与CLDN18.2细胞和CLDN18.1细胞结合情况如图1和图2所示，其中isotype为阴性对照，IMAB362-similar-hG1为阳性对照。结果显示，各嵌合抗体的结合曲线均呈浓度梯度依赖性。其中，17CHI表现出与CLDN18.2及CLDN18.1均为强阳性结合，19CHI则与CLDN18.2，CLDN18.1呈弱阳性结合，而1CHI、3CHI及18CHI抗体能特异性与CLDN18.2结合而不与CLDN18.1结合。同时，抗CLDN18.2特异性抗体中，3CHI抗体EC50数值较小，且与阳性对照抗体IMAB362-similar-hG1 EC50值相近，显示出较强的与CLDN18.2特异性结合活性。
实施例12嵌合抗体亲和力成熟
选取实施例11中，亲和力与阳性对照抗体最为接近的嵌合抗体3CHI在体外进行亲和力成熟及筛选。主要采用噬菌体Fab抗体库来筛选获得能保持CLDN18.2特异性，同时亲和力提高的抗体。
噬菌体筛选结果如图3所示，噬菌体抗体C1-22、A1-18等均表现出比原始的3CHI噬菌体抗体(WT)更高的CLDN18.2结合活性。噬菌体经测序后获得氨基酸位点突变的CDR序列，将这些突变位点重新组合，构建为带有人IgG1恒定区的嵌合抗体。将来源于噬菌体的嵌合抗体进行重新编号和命名后，通过细胞ELISA鉴定上述30个嵌合抗体与CLDN18.2是否特异性结合，鉴定结果如表7所示，表中符合与CLDN18.1结合阴性且与CLDN18.2结合阳性的特异性抗体共有18个，氨基酸序列分别如表11所示。
表7噬菌体来源的嵌合抗体筛选结果
Figure BDA0002179648780000282
Figure BDA0002179648780000291
表8特异性嵌合抗体的氨基酸序列表
序号 抗体名称 重链可变区 轻链可变区
1 301CHI SEQ ID NO 50 SEQ ID NO 70
2 302CHI SEQ ID NO 50 SEQ ID NO 71
3 303CHI SEQ ID NO 72 SEQ ID NO 73
4 304CHI SEQ ID NO 74 SEQ ID NO 75
5 305CHI SEQ ID NO 50 SEQ ID NO 76
6 306CHI SEQ ID NO 77 SEQ ID NO 78
7 307CHI SEQ ID NO 74 SEQ ID NO 70
8 308CHI SEQ ID NO 74 SEQ ID NO 71
9 309CHI SEQ ID NO 74 SEQ ID NO 76
10 312CHI SEQ ID NO 72 SEQ ID NO 76
11 313CHI SEQ ID NO 77 SEQ ID NO 70
12 315CHI SEQ ID NO 77 SEQ ID NO 76
13 319CHI SEQ ID NO 79 SEQ ID NO 70
14 321CHI SEQ ID NO 79 SEQ ID NO 76
15 322CHI SEQ ID NO 50 SEQ ID NO 80
16 324CHI SEQ ID NO 50 SEQ ID NO 81
17 328CHI SEQ ID NO 79 SEQ ID NO 80
18 330CHI SEQ ID NO 79 SEQ ID NO 81
分别使用人胃癌细胞NUGC4以及稳转细胞CHO-K1-CLDN18.1(实施例5制得)，通过FACS技术验证上述抗CLDN18.2抗体在细胞水平上的特异性和亲和力。结果如表9所示，经过体外抗体亲和力成熟与筛选，与原始的3CHI抗体相比，各抗体都能与NUGC4细胞上CLDN18.2靶点结合，而不与CHO-K1-CLDN18.1细胞结合。根据FACS的MFI(平均荧光强度)所提示的抗体亲和力水平，与阳性对照抗体IMAB362-similar-hG1相比，330CHI抗体显示其靶向NUGC4细胞的亲和力有显著提高。
表9亲和力成熟抗体FACS检测结果
Figure BDA0002179648780000301
通过Fortebio分子相互作用仪验证上述抗CLDN18.2抗体在蛋白水平上的亲和力：首先，配制抗体溶液及抗原稀释液，用SD缓冲液(含0.02％Tween20和0.1％BSA的PBS溶液)将嵌合抗体稀释到终浓度为5μg/ml；抗原蛋白Claudin18.2-His则用SD缓冲液按照4倍浓度梯度稀释，使浓度分别为10μg/ml、2.5μg/ml、0.625μg/ml、0μg/ml。其后，选择AHC传感器固化抗体，再结合不同浓度的抗原，按Octet RED96的操作说明进行亲和力测定。
结果表明，阳性对照抗体IMAB362-similar-hG1在37℃时与CLDN18.2蛋白结合的平衡解离常数(KD)为7.14nM，330CHI和305CHI抗体KD值分别为0.84nM和0.87nM，与阳性对照相比，其抗体亲和力显著地提高了一个数量级(见表10)。
表10亲和力成熟抗体亲和力测试结果
Figure BDA0002179648780000302
Figure BDA0002179648780000311
实施例13嵌合抗体体外ADCC活性测定
测定实验前一天，将CHO-K1-CLDN18.2(实施例5制得)细胞消化，以完全培养基重悬细胞，对细胞进行计数，并调整密度至1×105个/ml，100μl/孔接种到96孔板，于37℃、5％CO2培养箱中培养过夜；测试当天，将无酚红1640培养基(Gibco)孵育至37℃，将抗体按5倍梯度稀释；取出铺有CHO-K1-CLDN18.2的96孔板，弃培养基，向每孔加入25μl无酚红1640，将稀释好的抗体加入到样品孔中，使抗体终浓度分别为10μg/ml、2μg/ml、0.4μg/ml、0.08μg/ml、0.016μg/ml和0.0032μg/ml；对照孔分别加入等量的IMAB362-similar-hG1和人IgG1同型对照抗体(CrownBio)，于37℃、5％CO2培养箱中孵育1h；
将稳转表达人CD16A蛋白和NFAT报告基因蛋白的Jurkat细胞(以下简称Jurkat-CD16A/NF)作为效应细胞，转移至离心管中，室温，1000rpm离心5min，弃上清；5ml无酚红1640培养基重悬洗涤1次，1000rpm，离心5min，弃上清；无酚红1640重悬细胞，并调整细胞密度至8×106个/ml；
按照20:1的效靶比(即效应细胞与靶细胞数比例为20:1)，向孔板中加入Jurkat-CD16A/NF细胞2×105个，200g，离心2分钟，使效靶细胞充分接触；37℃、5％CO2培养箱中孵育5-6小时；检测前30分钟，将细胞板恢复至室温，按照Bio-Turbo萤火虫荧光素酶分析试剂盒(江苏瑞安生物技术有限公司)操作说明书加入检测试剂，将待测上清转移至白色平底96孔板，Thermo Floskan Ascent FL荧光酶标仪检测孔板荧光信号。将原始数据代入Graphpad5.0软件计算分析，结果如表11所示。
表11嵌合抗体体外ADCC活性测定结果
Figure BDA0002179648780000312
Figure BDA0002179648780000321
与Isotype阴性对照相比，各嵌合抗体荧光信号随浓度梯度呈剂量依赖性。在实验组中，嵌合抗体330CHI的EC50为0.22nM，嵌合抗体305CHI的EC50为0.28nM，其抗体的ADCCEC50活性比阳性对照抗体IMAB362-similar-hG1(0.72nM)提高3倍以上。由此可见，嵌合抗体针对CLDN18.2的细胞结合活性及亲和力提升的同时，也能有效提高抗体体外ADCC活性作用。
实施例14抗体人源化
将实施例12中体外亲和力成熟改造后的抗体330CHI进行人源化序列优化。人源化序列优化及抗体理化性质鉴定委托杭州皓阳生物技术有限公司开展。人源化序列优化通过免疫基因数据库(IMGT)，确认3CHI抗体及330CHI抗体可变区的鼠源序列来源，经过同源比对，3CHI抗体及330CHI抗体的重链可变区序列的FR区来源于小鼠抗体IGHV5-15*01；抗体轻链可变区的FR序列则来源于小鼠抗体IGKV8-19*01。将小鼠抗体CDR区与人源抗体FR区重组形成人源化抗体，其中所采用人源抗体轻重链模板与所对应鼠抗可变区序列相似度达到65％或以上，人源抗体来源见表12。最终人源化抗体名称及序列见表13所示。
表12人源化序列设计信息
Figure BDA0002179648780000322
表13人源化抗体序列表
Figure BDA0002179648780000331
将包含人源化抗体轻重链基因的质粒载体按1:1比例共转染于HEK293E细胞，110rpm，37℃，8％CO2振荡培养7天。4500rpm，20分钟离心，收获上清蛋白。经Protein A亲和层析纯化：0.1M NaOH溶液清洗AKTA层析系统及层析柱30min，超纯水冲洗干净；pH7.4的20mM磷酸钠缓冲液平衡10个柱体积；设定流速2ml/min，上样；平衡液清洗层析柱10个柱体积；pH3.4的50mM醋酸缓冲液洗脱3-5个柱体积，收集洗脱蛋白；超滤浓缩将抗体置换于pH6.5的20mM磷酸盐缓冲液中保存。通过尺寸排阻高效液相色谱(SEC-HPLC)测定纯化后抗体纯度，人源化抗体Hu330-1、Hu330-2和Hu330-4的单体蛋白纯度都达到95％以上，其中，Hu330-1为例，抗体重链分子量为48.72KD，轻链分子量为24.21KD。
实施例15 FACS检测人源化抗体在细胞水平上与人CLDN18.2结合的特异性和亲和力
胃癌细胞消化液分别消化处理CHO-K1-CLDN18.2细胞和CHO-K1-CLDN18.1细胞(实施例5制得)，37℃，消化15分钟；完全培养基终止，1000rpm，离心5分钟，弃上清；用2％胎牛血清-PBS稀释液重悬细胞，调节细胞至1×106个/ml，向96孔U底板每孔加入100μl细胞悬液；用2％胎牛血清-PBS将人源化抗体及对照抗体分别稀释到终浓度10μg/ml、2μg/ml、0.4μg/ml、0.08μg/ml和0.016μg/ml，等体积与细胞混匀，4℃孵育1小时；1000rpm，5分钟离心，弃上清；每孔加入200μl Cell Stain Buffer(Biolegend)洗涤2次，每次1000rpm，5分钟离心，弃上清；加入100μl PE-anti human Fc抗体(Biolegend)，4℃孵育，1小时；Cell StainBuffer(Biolegend)洗涤2次，每次1000rpm，5分钟离心，弃上清。加入300μl Cell StainBuffer重悬细胞，BD FACS Jazz流式分析仪检测。
结果如图4和图5所示，各人源化抗体Hu330-1、Hu330-3、Hu330-5和Hu330-6都与CLDN18.2表现为特异性结合，与CLDN18.1细胞结合则为阴性。其中，人源化抗体Hu330-1的结合曲线几乎与嵌合抗体330CHI完全重合，表明抗体在人源化后，其亲和力与嵌合抗体没有明显差异，基本保持一致水平。根据Graphpad拟合曲线计算的抗体相对平衡解离常数Kd值如表14所示，人源化抗体Hu330-1的Kd值为1.7nM，显著低于阳性对照抗体(28.7nM)，表明人源化抗体与表达CLDN18.2细胞的结合活性比阳性对照抗体IMAB362-similar-hG1高出约15倍。
表14人源化抗体FACS测定相对平衡解离常数Kd拟合结果
Figure BDA0002179648780000341
实施例16 Fortebio检测人源化抗体在蛋白水平上与人CLDN18.2结合的特异性和亲和力
另一方法是通过验证上述人源化抗体在蛋白水平上的亲和力，选择AHC传感器固化抗体，并与不同浓度的抗原结合，按Octet RED96的操作说明进行亲和力测定。结果如表15所示，人源化抗体Hu330-1在37℃时与CLDN18.2蛋白结合的平衡解离常数(KD)为5.26nM，与阳性对照相比，其抗体亲和力显著地提高约18倍。
表15人源化抗体Fortebio测定平衡解离常数KD值
Figure BDA0002179648780000342
实施例17荧光素酶标记测定人源化抗体体外ADCC活性
以CHO-K1-CLDN18.2细胞(实施例5制得)为靶细胞，将细胞密度调节至1×105个/ml，100μl/孔接种到96孔板，37℃、5％CO2培养箱中培养过夜；将人源化抗体按5倍梯度稀释，使抗体终浓度分别为10μg/ml、2μg/ml、0.4μg/ml、0.08μg/ml、0.016μg/ml和0.0032μg/ml；对照孔分别加入等量的IMAB362-similar-hG1和330CHI嵌合抗体，于37℃、5％CO2培养箱中孵育1h；将效应细胞Jurkat-CD16A/NF按照效靶比20:1的比例，每孔加入2×105个效应细胞，200g，离心2分钟，使效靶细胞充分接触；37℃、5％CO2培养箱中孵育5-6小时；Bio-Turbo萤火虫荧光素酶分析试剂盒检测孔板荧光信号，测试结果如表16所示。
表16荧光素酶标记测定人源化抗体ADCC活性
Figure BDA0002179648780000351
与IMAB362-similar-hG1阳性抗体相比，人源化抗体Hu330-1和Hu330-2的EC50降低6倍以上，且与嵌合抗体ADCC活性基本持平。由此说明人源化抗体在具有高亲和力的同时，也比阳性抗体显示出较高的ADCC生物学活性。
实施例18 RTCA测定人源化抗体在体外对肿瘤细胞的ADCC杀伤活性
采集人外周血从中分离PBMC细胞，加入等体积含2％胎牛血清的PBS稀释血样；向50ml离心管中加入15ml Lymphoprep密度梯度离心液(StemCell)，再加入稀释的血样，关闭离心机刹车，室温1200g离心，10分钟。离心后可见白膜层，其中含有富集的PBMC细胞，吸取白膜层将其转移到新的离心管中，按红细胞裂解液(Sigma)操作说明在室温下裂解红细胞，用含2mM EDTA和2％胎牛血清的PBS洗涤2次，室温400g，离心10min，弃上清；用含5％胎牛血清的1640完全培养基重悬细胞，将PBMC浓度调节到3×106个/ml；其次，以人胃癌细胞NUGC4作为靶细胞，用人胃癌组织源细胞消化液处理，1000rpm，离心5分钟收集细胞，弃上清；将细胞调节到1.5×105个/ml，每孔加入100μl细胞悬液于E-Plate 96孔板，37℃，5％CO2培养超过24小时后，加入用1640培养基稀释的抗体，使抗体终浓度为2μg/ml，37℃，5％CO2孵育1小时；将效应细胞PBMC按照效靶比20:1的比例，每孔加入3×105个效应细胞，200g，离心2分钟，使效靶细胞充分接触；37℃、5％CO2培养箱中孵育杀伤21小时，使用RTCA检测仪时实记录肿瘤细胞在96孔板的阻抗值(Cell Index，CI)，通过公式cell death％＝[(对照组CI-实验组CI)/对照组CI]×100％，计算人源化抗体肿瘤杀伤百分率。
结果如图6所示，RTCA实时检测效靶细胞共孵育8～21小时内，各组的肿瘤细胞杀伤率随时间延长而增加。体外杀伤第21小时，人源化抗体Hu330-1对NUGC4细胞的最大杀伤率45％，比IMAB362-similar-hG1阳性抗体对肿瘤细胞的ADCC杀伤活性高出10％(P<0.05)。
综上，人源化抗体Hu330-1能够特异性靶向结合CLDN18.2，其结合活性和亲和力在分子水平和细胞水平上，都比阳性抗体IMAB362-similar-hG1高出15-18倍，而由抗体介导的对靶细胞体外ADCC杀伤作用，则表现抗体浓度依赖性质，较低浓度时，Hu330-1即可发挥一定的杀伤肿瘤细胞效应。
实施例19人源化抗体恒定区优化
将Hu330-1人源化抗体可变区序列与包含5个氨基酸位点突变的IgG1恒定区序列组合，构建表达Fc突变型人源化抗体Hu330-1-5M(序列见表14)；另构建包含该Fc突变的阳性抗体5M(序列见表17)作为Fc段的对照。
表17 Fc突变人源化抗体序列表
Figure BDA0002179648780000361
通过FACS鉴定Fc突变的人源化抗体与靶点CLDN18.2结合的影响。胃癌细胞消化液分别消化处理NUGC4细胞，37℃，消化15分钟；完全培养基终止，1000rpm，离心5分钟，弃上清；用2％胎牛血清-PBS稀释液重悬细胞，调节细胞至1×106个/ml，向96孔U底板每孔加入100μl细胞悬液；用2％胎牛血清-PBS将抗体稀释到终浓度5μg/ml、1μg/ml、0.2μg/ml、0.04μg/ml和0.008μg/ml，等体积与细胞混匀，4℃孵育1小时；1000rpm，5分钟离心，弃上清；每孔加入200μl Cell Stain Buffer(Biolegend)洗涤2次，每次1000rpm，5分钟离心，弃上清；加入100μl PE-anti human Fc抗体(Biolegend)，4℃孵育，1小时；Cell Stain Buffer(Biolegend)洗涤2次，每次1000rpm，5分钟离心，弃上清。加入300μl Cell Stain Buffer重悬细胞，BD FACS Jazz流式分析仪检测，结果如表18所示。
表18 FACS检测Fc优化的人源化抗体结合活性
Figure BDA0002179648780000371
Fc突变的人源化抗体与NUGC4靶细胞结合阳性率，随抗体浓度升高而逐渐饱和，其结合曲线与人源化抗体的结合曲线几乎完全重合，并且与阳性对照抗体IMAB362-similar-hG1相比，Hu330-1-5M抗体结合活性提升了15倍，由此表明，恒定区Fc片段的氨基酸发生突变，不改变抗体针对CLDN18.2靶点的特异性和结合活性。
实施例20优化后的人源化抗体体外ADCC杀伤活性检测
1、通过荧光素酶标记测定Fc突变的人源化抗体体外ADCC活性：
以CHO-K1-CLDN18.2细胞(实施例5制得)为靶细胞，将细胞密度调节至1×105个/ml，100μl/孔接种到96孔板，37℃、5％CO2培养箱中培养过夜；将抗体按5倍梯度稀释，使终浓度分别为10μg/ml、2μg/ml、0.4μg/ml、0.08μg/ml、0.016μg/ml和0.0032μg/ml；于37℃、5％CO2孵育1小时；将效应细胞Jurkat-CD16A/NF按照效靶比20:1的比例，每孔板加入2×105个效应细胞，200g，离心2分钟，使效靶细胞充分接触；37℃、5％CO2培养箱中孵育5-6小时；Bio-Turbo萤火虫荧光素酶分析试剂盒检测孔板荧光信号，结果如表19所示。
表19荧光素酶法测定Fc优化的人源化抗体ADCC活性
Figure BDA0002179648780000372
Figure BDA0002179648780000381
Fc突变阳性抗体(5M)以及人源化Hu330-1抗体相比IMAB362-similar-hG1提高ADCC活性均为3倍，而Fc突变后的Hu330-1-5M抗体EC50为0.17nM，比阳性对照抗体IMAB362-similar-hG1的ADCC活性提高了8倍以上，明显地优化了体外ADCC增强效果。
2、采用LDH法测定Fc突变的人源化抗体在体外对肿瘤细胞的ADCC杀伤活性：
采集人外周血从中分离PBMC细胞作为效应细胞，加入等体积含2％胎牛血清的PBS稀释血样；向50ml离心管中加入15ml Lymphoprep密度梯度离心液(StemCell)，再加入稀释的血样，关闭离心机刹车，室温1200g离心，10分钟。离心后可见白膜层，其中含有富集的PBMC细胞，吸取白膜层将其转移到新的离心管中，按红细胞裂解液(Sigma)操作说明在室温下裂解红细胞，用含2mM EDTA和2％胎牛血清的PBS洗涤2次，室温400g，离心10min，弃上清；用热灭活血清配制含2％胎牛血清的1640(以下简称热灭活培养基)重悬细胞，将PBMC浓度调节到3×106个/ml；以人胃癌细胞NUGC4作为靶细胞，用人胃癌组织源细胞消化液处理，1000rpm，离心5分钟收集细胞，弃上清；将细胞调节到1.5×105个/ml，每孔加入100μl细胞悬液于96孔细胞板，37℃，5％CO2培养24小时，吸除培养基，加入用热灭活培养基稀释的抗体，使抗体终浓度分别为10μg/ml、2μg/ml、0.4μg/ml、0.08μg/ml、0.016μg/ml和0.0032μg/ml，37℃，5％CO2孵育1小时；将效应细胞PBMC按照效靶比20:1的比例，向每孔加入3×105个效应细胞，200g，离心2分钟，使效靶细胞充分接触；37℃、5％CO2培养箱中孵育杀伤22小时。孵育结束时，按LDH试剂盒(东仁化学科技(上海)有限公司)说明书步骤，向孔板加入WST底物试剂，避光显色20-30分钟，测定OD450nm值，将原始数据代入公式cell death％＝(实验组吸收值-靶细胞自发值-效应细胞值)/(靶细胞最大值-靶细胞自发值)×100％，实验组及所有对照组吸收值＝该组吸收值-背景值，结果如表20所示。
表20 LDH法测定Fc优化的人源化抗体ADCC活性
Figure BDA0002179648780000391
Fc突变的人源化抗体Hu330-1-5M能够在体外杀伤肿瘤细胞NUGC4，其ADCC杀伤效果与抗体浓度呈剂量依赖性，所计算EC50(0.3nM)比IMAB362-similar-hG1阳性抗体EC50活性提高8倍；同时，Hu330-1-5M对肿瘤细胞的最大杀伤率为130％，相比阳性抗体的80％，表现出显著增强的体外ADCC杀伤效应。
综上，经Fc突变的Hu330-1-5M人源化抗体，一方面，在与CLDN18.2的靶向结合能力上，比阳性抗体IMAB362-similar-hG1的亲和力提高了15倍；另一方面，经Fc优化后介导的体外ADCC杀伤肿瘤细胞的能力得到进一步增强，其EC50活性比阳性抗体提高8倍，最大杀伤效果则提高60％以上。
综上所述，本发明提供的CLDN18.2抗体与CLDN18.2具有显著的结合活性和亲和力，同时对肿瘤细胞具有高效的体外ADCC杀伤活性，提示该抗体具有高效的抗肿瘤作用，可在制备抗肿瘤的药物中应用，具有广阔的市场前景。
尽管以上已经对本发明作了详细描述，但是本领域技术人员理解，在不偏离本发明的精神和范围的前提下可以对本发明进行各种修改和改变。本发明的权利范围并不限于上文所作的详细描述，而应归属于权利要求书。
序列表
<110> 南京圣和药业股份有限公司
<120> 一种抗Claudin18_2抗体及其应用
<150> 2018109847242
<151> 2018-08-27
<160> 116
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 309
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 1
gctagcatgg acgccatgaa gaggggactg tgctgcgtgc tgctgctgtg cggagccgtg 60
ttcgtgtctc ccagcatgga ccagtggagc acccaggatc tgtacaacaa tcctgtgaca 120
gccgtgttta actatcaggg cctgtggcgg tcctgcgtga gagagagctc cggcttcacc 180
gagtgtaggg gctactttac actgctggga ctgccagcaa tgctgcaggc cgtgcgcgag 240
cagaagctga tctccgagga ggacctgaat tctgccgtgg atcatcacca ccaccaccac 300
tgactcgag 309
<210> 2
<211> 98
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 2
Met Asp Ala Met Lys Arg Gly Leu Cys Cys Val Leu Leu Leu Cys Gly
1 5 10 15
Ala Val Phe Val Ser Pro Ser Met Asp Gln Trp Ser Thr Gln Asp Leu
20 25 30
Tyr Asn Asn Pro Val Thr Ala Val Phe Asn Tyr Gln Gly Leu Trp Arg
35 40 45
Ser Cys Val Arg Glu Ser Ser Gly Phe Thr Glu Cys Arg Gly Tyr Phe
50 55 60
Thr Leu Leu Gly Leu Pro Ala Met Leu Gln Ala Val Arg Glu Gln Lys
65 70 75 80
Leu Ile Ser Glu Glu Asp Leu Asn Ser Ala Val Asp His His His His
85 90 95
His His
<210> 3
<211> 444
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 3
gctagcatgg acgccatgaa gaggggactg tgctgcgtgc tgctgctgtg cggagccgtg 60
ttcgtgtctc caagcatggc agtgaccgca tgtcagggac tgggctttgt ggtgagcctg 120
atcggaatcg caggaatcat cgcagcaacc tgcatggacc agtggtccac acaggatctg 180
tacaacaatc ccgtgacagc cgtgttcaac tatcagggcc tgtggcggtc ttgcgtgaga 240
gagagctccg gcttcaccga gtgtaggggc tactttacac tgctgggact gcctgcaatg 300
ctgcaggccg tgcgcgccct gatgatcgtg ggaatcgtgc tgggagcaat cggactgctg 360
gtgtccatct ttgagcagaa gctgatctcc gaggaggacc tgaattctgc cgtggatcat 420
caccaccacc accactgact cgag 444
<210> 4
<211> 143
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 4
Met Asp Ala Met Lys Arg Gly Leu Cys Cys Val Leu Leu Leu Cys Gly
1 5 10 15
Ala Val Phe Val Ser Pro Ser Met Ala Val Thr Ala Cys Gln Gly Leu
20 25 30
Gly Phe Val Val Ser Leu Ile Gly Ile Ala Gly Ile Ile Ala Ala Thr
35 40 45
Cys Met Asp Gln Trp Ser Thr Gln Asp Leu Tyr Asn Asn Pro Val Thr
50 55 60
Ala Val Phe Asn Tyr Gln Gly Leu Trp Arg Ser Cys Val Arg Glu Ser
65 70 75 80
Ser Gly Phe Thr Glu Cys Arg Gly Tyr Phe Thr Leu Leu Gly Leu Pro
85 90 95
Ala Met Leu Gln Ala Val Arg Ala Leu Met Ile Val Gly Ile Val Leu
100 105 110
Gly Ala Ile Gly Leu Leu Val Ser Ile Phe Glu Gln Lys Leu Ile Ser
115 120 125
Glu Glu Asp Leu Asn Ser Ala Val Asp His His His His His His
130 135 140
<210> 5
<211> 43
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 5
agatctatcg actctcgagc gttcttcgtt cgttctcacg cgt 43
<210> 6
<211> 798
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 6
ggatccatgg cagtgacagc atgccaggga ctgggattcg tggtgtctct gatcggcatc 60
gccggcatca tcgccgccac atgtatggac cagtggagca cccaggatct gtacaacaat 120
ccagtgaccg ccgtgtttaa ctatcagggc ctgtggcggt cctgcgtgag agagagctcc 180
ggcttcacag agtgtagggg ctactttacc ctgctgggac tgccagcaat gctgcaggcc 240
gtgcgcgccc tgatgatcgt gggaatcgtg ctgggagcaa tcggactgct ggtgtctatc 300
ttcgccctga agtgcatcag gatcggcagc atggaggact ccgccaaggc caacatgacc 360
ctgacatccg gcatcatgtt tatcgtgtct ggactgtgcg caatcgcagg cgtgagcgtg 420
ttcgccaaca tgctggtgac aaatttttgg atgtccacag ccaatatgta caccggaatg 480
ggaggaatgg tgcagaccgt gcagacacgg tataccttcg gcgccgccct gtttgtggga 540
tgggtggcag gaggactgac actgatcggc ggcgtgatga tgtgcatcgc atgtagagga 600
ctggcaccag aggagaccaa ttacaaggcc gtgagctatc acgcctctgg acacagcgtg 660
gcatacaagc ctggaggctt caaggcctct acaggctttg gcagcaacac caagaataag 720
aagatctatg acggcggcgc cagaaccgag gatgaggtgc agtcctaccc ctctaagcac 780
gattacgtgt gagaattc 798
<210> 7
<211> 794
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 7
ctcgagatgg ccgtgactgc ctgtcagggc ttggggttcg tggtttcact gattgggatt 60
gcgggcatca ttgctgccac ctgcatggac cagtggagca cccaagactt gtacaacaac 120
cccgtaacag ctgttttcaa ctaccagggg ctgtggcgct cctgtgtccg agagagctct 180
ggcttcaccg agtgccgggg ctacttcacc ctgctggggc tgccagccat gctgcaggca 240
gtgcgagccc tgatgatcgt aggcatcgtc ctgggtgcca ttggcctcct ggtatccatc 300
tttgccctga aatgcatccg cattggcagc atggaggact ctgccaaagc caacatgaca 360
ctgacctccg ggatcatgtt cattgtctca ggtctttgtg caattgctgg agtgtctgtg 420
tttgccaaca tgctggtgac taacttctgg atgtccacag ctaacatgta caccggcatg 480
ggtgggatgg tgcagactgt tcagaccagg tacacatttg gtgcggctct gttcgtgggc 540
tgggtcgctg gaggcctcac actaattggg ggtgtgatga tgtgcatcgc ctgccggggc 600
ctggcaccag aagaaaccaa ctacaaagcc gtttcttatc atgcctcagg ccacagtgtt 660
gcctacaagc ctggaggctt caaggccagc actggctttg ggtccaacac caaaaacaag 720
aagatatacg atggaggtgc ccgcacagag gacgaggtac aatcttatcc ttccaagcac 780
gactatgtgg atcc 794
<210> 8
<211> 271
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 8
Met Ala Val Thr Ala Cys Gln Gly Leu Gly Phe Val Val Ser Leu Ile
1 5 10 15
Gly Ile Ala Gly Ile Ile Ala Ala Thr Cys Met Asp Gln Trp Ser Thr
20 25 30
Gln Asp Leu Tyr Asn Asn Pro Val Thr Ala Val Phe Asn Tyr Gln Gly
35 40 45
Leu Trp Arg Ser Cys Val Arg Glu Ser Ser Gly Phe Thr Glu Cys Arg
50 55 60
Gly Tyr Phe Thr Leu Leu Gly Leu Pro Ala Met Leu Gln Ala Val Arg
65 70 75 80
Ala Leu Met Ile Val Gly Ile Val Leu Gly Ala Ile Gly Leu Leu Val
85 90 95
Ser Ile Phe Ala Leu Lys Cys Ile Arg Ile Gly Ser Met Glu Asp Ser
100 105 110
Ala Lys Ala Asn Met Thr Leu Thr Ser Gly Ile Met Phe Ile Val Ser
115 120 125
Gly Leu Cys Ala Ile Ala Gly Val Ser Val Phe Ala Asn Met Leu Val
130 135 140
Thr Asn Phe Trp Met Ser Thr Ala Asn Met Tyr Thr Gly Met Gly Glu
145 150 155 160
Gln Lys Leu Ile Ser Glu Glu Asp Leu Gly Met Val Gln Thr Val Gln
165 170 175
Thr Arg Tyr Thr Phe Gly Ala Ala Leu Phe Val Gly Trp Val Ala Gly
180 185 190
Gly Leu Thr Leu Ile Gly Gly Val Met Met Cys Ile Ala Cys Arg Gly
195 200 205
Leu Ala Pro Glu Glu Thr Asn Tyr Lys Ala Val Ser Tyr His Ala Ser
210 215 220
Gly His Ser Val Ala Tyr Lys Pro Gly Gly Phe Lys Ala Ser Thr Gly
225 230 235 240
Phe Gly Ser Asn Thr Lys Asn Lys Lys Ile Tyr Asp Gly Gly Ala Arg
245 250 255
Thr Glu Asp Glu Val Gln Ser Tyr Pro Ser Lys His Asp Tyr Val
260 265 270
<210> 9
<211> 794
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 9
ctcgagatgt ccaccaccac atgccaagtg gtggcgttcc tcctgtccat cctggggctg 60
gccggctgca tcgcggccac cgggatggac atgtggagca cccaggacct gtacgacaac 120
cccgtcacct ccgtgttcca gtacgaaggg ctctggagga gctgcgtgag gcagagttca 180
ggcttcaccg aatgcaggcc ctatttcacc atcctgggac ttccagccat gctgcaggca 240
gtgcgagccc tgatgatcgt aggcatcgtc ctgggtgcca ttggcctcct ggtatccatc 300
tttgccctga aatgcatccg cattggcagc atggaggact ctgccaaagc caacatgaca 360
ctgacctccg ggatcatgtt cattgtctca ggtctttgtg caattgctgg agtgtctgtg 420
tttgccaaca tgctggtgac taacttctgg atgtccacag ctaacatgta caccggcatg 480
ggtgggatgg tgcagactgt tcagaccagg tacacatttg gtgcggctct gttcgtgggc 540
tgggtcgctg gaggcctcac actaattggg ggtgtgatga tgtgcatcgc ctgccggggc 600
ctggcaccag aagaaaccaa ctacaaagcc gtttcttatc atgcctcagg ccacagtgtt 660
gcctacaagc ctggaggctt caaggccagc actggctttg ggtccaacac caaaaacaag 720
aagatatacg atggaggtgc ccgcacagag gacgaggtac aatcttatcc ttccaagcac 780
gactatgtgg atcc 794
<210> 10
<211> 262
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 10
Met Ser Thr Thr Thr Cys Gln Val Val Ala Phe Leu Leu Ser Ile Leu
1 5 10 15
Gly Leu Ala Gly Cys Ile Ala Ala Thr Gly Met Asp Met Trp Ser Thr
20 25 30
Gln Asp Leu Tyr Asp Asn Pro Val Thr Ser Val Phe Gln Tyr Glu Gly
35 40 45
Leu Trp Arg Ser Cys Val Arg Gln Ser Ser Gly Phe Thr Glu Cys Arg
50 55 60
Pro Tyr Phe Thr Ile Leu Gly Leu Pro Ala Met Leu Gln Ala Val Arg
65 70 75 80
Ala Leu Met Ile Val Gly Ile Val Leu Gly Ala Ile Gly Leu Leu Val
85 90 95
Ser Ile Phe Ala Leu Lys Cys Ile Arg Ile Gly Ser Met Glu Asp Ser
100 105 110
Ala Lys Ala Asn Met Thr Leu Thr Ser Gly Ile Met Phe Ile Val Ser
115 120 125
Gly Leu Cys Ala Ile Ala Gly Val Ser Val Phe Ala Asn Met Leu Val
130 135 140
Thr Asn Phe Trp Met Ser Thr Ala Asn Met Tyr Thr Gly Met Gly Gly
145 150 155 160
Met Val Gln Thr Val Gln Thr Arg Tyr Thr Phe Gly Ala Ala Leu Phe
165 170 175
Val Gly Trp Val Ala Gly Gly Leu Thr Leu Ile Gly Gly Val Met Met
180 185 190
Cys Ile Ala Cys Arg Gly Leu Ala Pro Glu Glu Thr Asn Tyr Lys Ala
195 200 205
Val Ser Tyr His Ala Ser Gly His Ser Val Ala Tyr Lys Pro Gly Gly
210 215 220
Phe Lys Ala Ser Thr Gly Phe Gly Ser Asn Thr Lys Asn Lys Lys Ile
225 230 235 240
Tyr Asp Gly Gly Ala Arg Thr Glu Asp Glu Val Gln Ser Tyr Pro Ser
245 250 255
Lys His Asp Tyr Val Asp
260
<210> 11
<211> 240
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 11
Met Glu Ser Gln Thr Gln Val Leu Met Ser Leu Leu Phe Trp Val Ser
1 5 10 15
Gly Thr Cys Gly Asp Ile Val Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Thr
20 25 30
Val Thr Ala Gly Glu Lys Val Thr Met Ser Cys Lys Ser Ser Gln Ser
35 40 45
Leu Leu Asn Ser Gly Asn Gln Lys Asn Tyr Leu Thr Trp Tyr Gln Gln
50 55 60
Lys Pro Gly Gln Pro Pro Lys Leu Leu Ile Tyr Trp Ala Ser Thr Arg
65 70 75 80
Glu Ser Gly Val Pro Asp Arg Phe Thr Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp
85 90 95
Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Val Gln Ala Glu Asp Leu Ala Val Tyr
100 105 110
Tyr Cys Gln Asn Asp Tyr Ser Tyr Pro Phe Thr Phe Gly Ser Gly Thr
115 120 125
Lys Leu Glu Ile Lys Arg Thr Val Ala Ala Pro Ser Val Phe Ile Phe
130 135 140
Pro Pro Ser Asp Glu Gln Leu Lys Ser Gly Thr Ala Ser Val Val Cys
145 150 155 160
Leu Leu Asn Asn Phe Tyr Pro Arg Glu Ala Lys Val Gln Trp Lys Val
165 170 175
Asp Asn Ala Leu Gln Ser Gly Asn Ser Gln Glu Ser Val Thr Glu Gln
180 185 190
Asp Ser Lys Asp Ser Thr Tyr Ser Leu Ser Ser Thr Leu Thr Leu Ser
195 200 205
Lys Ala Asp Tyr Glu Lys His Lys Val Tyr Ala Cys Glu Val Thr His
210 215 220
Gln Gly Leu Ser Ser Pro Val Thr Lys Ser Phe Asn Arg Gly Glu Cys
225 230 235 240
<210> 12
<211> 467
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 12
Met Gly Trp Ser Cys Ile Ile Leu Phe Leu Val Ala Thr Ala Thr Gly
1 5 10 15
Val His Ser Gln Val Gln Leu Gln Gln Pro Gly Ala Glu Leu Val Arg
20 25 30
Pro Gly Ala Ser Val Lys Leu Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe
35 40 45
Thr Ser Tyr Trp Ile Asn Trp Val Lys Gln Arg Pro Gly Gln Gly Leu
50 55 60
Glu Trp Ile Gly Asn Ile Tyr Pro Ser Asp Ser Tyr Thr Asn Tyr Asn
65 70 75 80
Gln Lys Phe Lys Asp Lys Ala Thr Leu Thr Val Asp Lys Ser Ser Ser
85 90 95
Thr Ala Tyr Met Gln Leu Ser Ser Pro Thr Ser Glu Asp Ser Ala Val
100 105 110
Tyr Tyr Cys Thr Arg Ser Trp Arg Gly Asn Ser Phe Asp Tyr Trp Gly
115 120 125
Gln Gly Thr Thr Leu Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser
130 135 140
Val Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala
145 150 155 160
Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val
165 170 175
Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala
180 185 190
Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val
195 200 205
Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn Val Asn His
210 215 220
Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Lys Val Glu Pro Lys Ser Cys
225 230 235 240
Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly
245 250 255
Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met
260 265 270
Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His
275 280 285
Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val
290 295 300
His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr
305 310 315 320
Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly
325 330 335
Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile
340 345 350
Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val
355 360 365
Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Asp Glu Leu Thr Lys Asn Gln Val Ser
370 375 380
Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu
385 390 395 400
Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro
405 410 415
Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val
420 425 430
Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met
435 440 445
His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser
450 455 460
Pro Gly Lys
465
<210> 13
<211> 239
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 13
Met Glu Thr Asp Thr Leu Leu Leu Trp Val Leu Leu Leu Trp Val Pro
1 5 10 15
Gly Ser Thr Gly Asp Ile Val Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Thr
20 25 30
Val Thr Ala Gly Glu Lys Val Thr Met Ser Cys Lys Ser Ser Gln Ser
35 40 45
Leu Leu Asn Ser Gly Asn Gln Lys Asn Tyr Leu Thr Trp Tyr Gln Gln
50 55 60
Lys Pro Gly Gln Pro Pro Lys Leu Leu Ile Tyr Trp Ala Ser Thr Arg
65 70 75 80
Glu Ser Gly Val Pro Asp Arg Phe Thr Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp
85 90 95
Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Val Gln Ala Glu Asp Leu Ala Val Tyr
100 105 110
Tyr Cys Gln Asn Asp Tyr Ser Tyr Pro Phe Thr Phe Gly Ser Gly Thr
115 120 125
Lys Leu Glu Ile Lys Ala Asp Ala Ala Pro Thr Val Ser Ile Phe Pro
130 135 140
Pro Ser Ser Glu Gln Leu Thr Ser Gly Gly Ala Ser Val Val Cys Phe
145 150 155 160
Leu Asn Asn Phe Tyr Pro Lys Asp Ile Asn Val Lys Trp Lys Ile Asp
165 170 175
Gly Ser Glu Arg Gln Asn Gly Val Leu Asn Ser Trp Thr Asp Gln Asp
180 185 190
Ser Lys Asp Ser Thr Tyr Ser Met Ser Ser Thr Leu Thr Leu Thr Lys
195 200 205
Asp Glu Tyr Glu Arg His Asn Ser Tyr Thr Cys Glu Ala Thr His Lys
210 215 220
Thr Ser Thr Ser Pro Ile Val Lys Ser Phe Asn Arg Asn Glu Cys
225 230 235
<210> 14
<211> 466
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 14
Met Gly Trp Ser Trp Ile Phe Leu Phe Leu Leu Ser Gly Thr Ala Gly
1 5 10 15
Val Leu Ser Gln Val Gln Leu Gln Gln Pro Gly Ala Glu Leu Val Arg
20 25 30
Pro Gly Ala Ser Val Lys Leu Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe
35 40 45
Thr Ser Tyr Trp Ile Asn Trp Val Lys Gln Arg Pro Gly Gln Gly Leu
50 55 60
Glu Trp Ile Gly Asn Ile Tyr Pro Ser Asp Ser Tyr Thr Asn Tyr Asn
65 70 75 80
Gln Lys Phe Lys Asp Lys Ala Thr Leu Thr Val Asp Lys Ser Ser Ser
85 90 95
Thr Ala Tyr Met Gln Leu Ser Ser Pro Thr Ser Glu Asp Ser Ala Val
100 105 110
Tyr Tyr Cys Thr Arg Ser Trp Arg Gly Asn Ser Phe Asp Tyr Trp Gly
115 120 125
Gln Gly Thr Thr Leu Thr Val Ser Ser Lys Thr Thr Ala Pro Ser Val
130 135 140
Tyr Pro Leu Ala Pro Val Cys Gly Asp Thr Thr Gly Ser Ser Val Thr
145 150 155 160
Leu Gly Cys Leu Val Lys Gly Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Leu Thr
165 170 175
Trp Asn Ser Gly Ser Leu Ser Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val
180 185 190
Leu Gln Ser Asp Leu Tyr Thr Leu Ser Ser Ser Val Thr Val Thr Ser
195 200 205
Ser Thr Trp Pro Ser Gln Ser Ile Thr Cys Asn Val Ala His Pro Ala
210 215 220
Ser Ser Thr Lys Val Asp Lys Lys Ile Glu Pro Arg Gly Pro Thr Ile
225 230 235 240
Lys Pro Cys Pro Pro Cys Lys Cys Pro Ala Pro Asn Leu Leu Gly Gly
245 250 255
Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Lys Ile Lys Asp Val Leu Met Ile
260 265 270
Ser Leu Ser Pro Ile Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser Glu Asp
275 280 285
Asp Pro Asp Val Gln Ile Ser Trp Phe Val Asn Asn Val Glu Val His
290 295 300
Thr Ala Gln Thr Gln Thr His Arg Glu Asp Tyr Asn Ser Thr Leu Arg
305 310 315 320
Val Val Ser Ala Leu Pro Ile Gln His Gln Asp Trp Met Ser Gly Lys
325 330 335
Glu Phe Lys Cys Lys Val Asn Asn Lys Asp Leu Pro Ala Pro Ile Glu
340 345 350
Arg Thr Ile Ser Lys Pro Lys Gly Ser Val Arg Ala Pro Gln Val Tyr
355 360 365
Val Leu Pro Pro Pro Glu Glu Glu Met Thr Lys Lys Gln Val Thr Leu
370 375 380
Thr Cys Met Val Thr Asp Phe Met Pro Glu Asp Ile Tyr Val Glu Trp
385 390 395 400
Thr Asn Asn Gly Lys Thr Glu Leu Asn Tyr Lys Asn Thr Glu Pro Val
405 410 415
Leu Asp Ser Asp Gly Ser Tyr Phe Met Tyr Ser Lys Leu Arg Val Glu
420 425 430
Lys Lys Asn Trp Val Glu Arg Asn Ser Tyr Ser Cys Ser Val Val His
435 440 445
Glu Gly Leu His Asn His His Thr Thr Lys Ser Phe Ser Arg Thr Pro
450 455 460
Gly Lys
465
<210> 15
<211> 31
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 15
cgcggatcca tgtccaccac cacatgccaa g 31
<210> 16
<211> 33
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 16
ccggaattct tacacatagt cgtgcttgga agg 33
<210> 17
<211> 798
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 17
ggatccatgt ccaccaccac atgccaagtg gtggcgttcc tcctgtccat cctggggctg 60
gccggctgca tcgcggccac cgggatggac atgtggagca cccaggacct gtacgacaac 120
cccgtcacct ccgtgttcca gtacgaaggg ctctggagga gctgcgtgag gcagagttca 180
ggcttcaccg aatgcaggcc ctatttcacc atcctgggac ttccagccat gctgcaggca 240
gtgcgagccc tgatgatcgt aggcatcgtc ctgggtgcca ttggcctcct ggtatccatc 300
tttgccctga aatgcatccg cattggcagc atggaggact ctgccaaagc caacatgaca 360
ctgacctccg ggatcatgtt cattgtctca ggtctttgtg caattgctgg agtgtctgtg 420
tttgccaaca tgctggtgac taacttctgg atgtccacag ctaacatgta caccggcatg 480
ggtgggatgg tgcagactgt tcagaccagg tacacatttg gtgcggctct gttcgtgggc 540
tgggtcgctg gaggcctcac actaattggg ggtgtgatga tgtgcatcgc ctgccggggc 600
ctggcaccag aagaaaccaa ctacaaagcc gtttcttatc atgcctcagg ccacagtgtt 660
gcctacaagc ctggaggctt caaggccagc actggctttg ggtccaacac caaaaacaag 720
aagatatacg atggaggtgc ccgcacagag gacgaggtac aatcttatcc ttccaagcac 780
gactatgtgt aagaattc 798
<210> 18
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 18
atgrasttsk ggytmarctk grttt 25
<210> 19
<211> 26
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 19
atgraatgsa sctgggtywt yctctt 26
<210> 20
<211> 29
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 20
atggactcca ggctcaattt agttttcct 29
<210> 21
<211> 26
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 21
atggctgtcy trgbgctgyt cytctg 26
<210> 22
<211> 29
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 22
atggvttggs tgtggamctt gcyattcct 29
<210> 23
<211> 26
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 23
atgaaatgca gctggrtyat sttctt 26
<210> 24
<211> 26
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 24
atggrcagrc ttacwtyytc attcct 26
<210> 25
<211> 26
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 25
atgatggtgt taagtcttct gtacct 26
<210> 26
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 26
tgtcaggaac tgcaggtgtc 20
<210> 27
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 27
ggacagggmt ccakagttcc 20
<210> 28
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 28
cctggatgac ttcagtgttg t 21
<210> 29
<211> 24
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 29
atgragwcac akwcycaggt cttt 24
<210> 30
<211> 31
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 30
atgaggrccc ctgctcagwt tyttggwtct t 31
<210> 31
<211> 31
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 31
atgggcwtca agatgragtc acakwyycwg g 31
<210> 32
<211> 29
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 32
atgagtgtgc ycactcaggt cctggsgtt 29
<210> 33
<211> 31
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 33
atgtggggay cgktttyamm cttttcaatt g 31
<210> 34
<211> 28
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 34
atggaagccc cagctcagct tctcttcc 28
<210> 35
<211> 28
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 35
gtcgttcact gccatcaatc ttccactt 28
<210> 36
<211> 357
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 36
cagatccagt tggtgcagtc tggacctgag ctgaagaagc ctggagagac agtcaagatc 60
tcctgcaagg cttctgggta taccttcaca aactatggaa tgaactgggt gaagcaggct 120
ccaggaaagg gtttaaagtg gatgggctgg ataaacacct acactggaga gccaacatat 180
gctgatgact tcaagggacg gtttgccttc tctttggaaa cctctgccag cactgcctat 240
ttgcagatca acaacctcaa aaatgaggac atggctacat atttctgtgc aagagacgga 300
cagctcgggc tacggtttgc ttactggggc caagggactc tggtcactgt ctctgca 357
<210> 37
<211> 336
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 37
aacattatga tgacacagtc gccatcatct ctggctgtgt ctgcaggaga aaaggtcact 60
atgagctgta agtccagtca aagtgtttta tacagttcaa atcagaagaa ctacttggcc 120
tggtaccagc agaaaccagg gcagtctcct aaactgctga tctactgggc atccactagg 180
gaatctggtg tccctgatcg cttcacaggc agtggatctg ggacagattt tactcttacc 240
atcagcagtg tacaagctga agacctggca gtttattact gtcatcaata cctctcctcg 300
cggacgttcg gtggaggcac caagctggaa atcaaa 336
<210> 38
<211> 355
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 38
gaggtgaagc tggtggagtc tgggggaggc ttagtgcagc ctggagggtc cctgaaactc 60
tcctgtgcag cctctggatt cactttcagt gactacggaa tggcgtgggt tcgacaggct 120
ccaaggaagg ggcctgagtg ggtagcattc attagtaatt tggcatatag tatctactat 180
gcagacactg tgacgggccg attcaccatc tctagagaga atgccaagaa caccctgtac 240
ctggaaatga gcagtctgag gtctgaggac acggccatgt attactgtgc aagacttggg 300
tatggtaact cctttgctta ctggggccaa gggactctgg tcactgtctc tgcag 355
<210> 39
<211> 340
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 39
gacattgtga tgacacagtc tccatcctcc ctgactgtga cagcaggaga gaaggtcact 60
atgagctgca agtccagtca gagtctgtta aacagtggaa atcaaaagaa ctacttgacc 120
tggtaccagc agaaaccagg gcagcctcct aaactgttga tctactgggc atccactagg 180
gaatctgggg tccctgatcg cttcacaggc agtggatctg gaacagattt cactctcacc 240
atcagcagtg tgcaggctga agacctggca gtttattact gtcagaatga ttatagttat 300
ccgctcacgt tcggtgctgg gaccaagctg gagctgaaac 340
<210> 40
<211> 345
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 40
aggttcagct gcagcagtct ggagctgagc tggcgaggcc tggggcttca gtgaagctgt 60
cctgcaaggc ttctggctac accttcacaa gctatggtat aagctgggtg aagcagagaa 120
ctggacaggg ccttgagtgg attggagaga tttatcctag aagtggtaat acttactaca 180
atgagaagtt caagggcaag gccacactga ctgcagacaa atcctccagc acagcgtaca 240
tggagctccg cagcctgaca tctgaggact ctgcggtcta tttctgtgca agccttgcct 300
ggtttgctta ctggggccaa gggactctgg tcactgtctc tgcag 345
<210> 41
<211> 337
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 41
gatattgtga tgactcaggc tgcaccctct gtacctgtca ctcctggaga gtcagtatcc 60
atctcctgca ggtctagtaa gagtctcctg catagtaatg gcaacactta cttgtattgg 120
ttcctgcaga ggccaggcca gtctcctcag ctcctgatat atcggatgtc caaccttgcc 180
tcaggagtcc cagacaggtt cagtggcagt gggtcaggaa ctgctttcac actgagaatc 240
agtagagtgg aggctgagga tgtgggtgtt tattactgta tgcaacatct agaatatccg 300
tacacgttcg gaggggggac caagctggaa ataaaac 337
<210> 42
<211> 355
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 42
gaggtccagc tgcaacagtc tggacctgag ctggtgaagc ctggggcttc agtgaagatg 60
tcctgcaagg cttctggata cacattcact gactacaaca tgcactgggt gaagcagagc 120
catggaaaga gccttgagtg gattggatat attaacccta acaatggtgg tactagctac 180
aaccagaagt tcaagggcaa ggccacattg actgtaaaca agtcctccag cacagcctac 240
atggagctcc gcagcctgac atcggaggat tctgcagtct attactgtgc aaggatctac 300
tatggtaact cgtttgctta ctggggccaa gggactctgg tcactgtctc tgcag 355
<210> 43
<211> 340
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 43
gacattgtga tgacacagtc tccatcctcc ctgactgtga cagcaggaga gaaggtcact 60
atgagctgca agtccagtca gagtctgtta aacagtggaa atcaaaagaa ctacttgacc 120
tggtaccagc agaaaccagg gcagcctcct aaactgttga tctactgggc atccactagg 180
gaatctgggg tccctgatcg cttcacaggc agtggatctg gaacagattt cactctcacc 240
atcagcagtg tgcaggctga agacctggca gtttattact gtcagaatga ttatagttat 300
ccattcacgt tcggctcggg gacaaagttg gaaataaaac 340
<210> 44
<211> 348
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 44
aggtgcagct gaaggagtca ggacctggcc tggtggcgcc ctcacagagc ctgtccatca 60
catgcactgt ctcagggttc tcattaacca gctatggtgt aagctgggtt cgccagcctc 120
caggaaaggg tctggagtgg ctgggagtaa tatggggtga cgggagcaca aattatcatt 180
cagctctcat atccagactg agcatcagca aggataactc caagagccaa gttttcttaa 240
aactgaacag tctgcaaact gatgacacag ccacgtacta ctgtgccggg ggattacgac 300
tctggtttgc ttactggggc caagggactc tggtcactgt ctctgcag 348
<210> 45
<211> 340
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 45
gacattgtga tgacacagtc tccatcctcc ctggctatgt cagtaggaca gaaggtcact 60
atgagctgca agtccagtca gagcctttta aatagtagca atcaaaagaa ctatttggcc 120
tggtaccagc agaaaccagg acagtctcct aaacttctgg tatactttgc atccactagg 180
gaatctgggg tccctgatcg cttcataggc agtggatctg ggacagattt cactcttacc 240
atcagcagtg tgcaggctga agacctggca gattacttct gtcagcaaca ttatagcact 300
ccattcacgt tcggctcggg gacaaagttg gaaataaaac 340
<210> 46
<211> 361
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 46
caggttcagc tgcagcagtc tggggctgag ctagtgaagc ctggagcctc agtgaagatg 60
tcctgcaagg cttctggcta caccttcact acctatccta tagagtggat gaagcagaat 120
catggaaaga gcctagagtg gattggaaat tttcatcctt acaatgatga tactaagtac 180
aatgaaaagt tcaagggcaa ggccacattg actgtagaaa aatcctctag cacagtctac 240
ttggagctca gccgattaac atctgatgac tctgctgttt attactgtgc aaggaggggc 300
tacggtagta gctacgctat ggactactgg ggtcaaggaa cctcagtcac cgtctcctca 360
g 361
<210> 47
<211> 340
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 47
gacattgtga tgacacagtc tccatcctcc ctgagtgtgt cagcaggaga gaaggtcact 60
atgagctgca agtccagtca gagtctgtta aacagtggaa atcaaaagaa ctacttggcc 120
tggtaccagc agaaaccagg gcagcctcct aaactgttga tctacggggc atccactagg 180
gaatctgggg tccctgatcg cttcacaggc agtggatctg gaaccgattt cactcttacc 240
atcagcagtg tgcaggctga agacctggca gtttattact gtcagaatga tcatagttat 300
ccgtacacgt tcggaggggg gaccaagctg gaaataaaac 340
<210> 48
<211> 119
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 48
Gln Ile Gln Leu Val Gln Ser Gly Pro Glu Leu Lys Lys Pro Gly Glu
1 5 10 15
Thr Val Lys Ile Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Asn Tyr
20 25 30
Gly Met Asn Trp Val Lys Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Lys Trp Met
35 40 45
Gly Trp Ile Asn Thr Tyr Thr Gly Glu Pro Thr Tyr Ala Asp Asp Phe
50 55 60
Lys Gly Arg Phe Ala Phe Ser Leu Glu Thr Ser Ala Ser Thr Ala Tyr
65 70 75 80
Leu Gln Ile Asn Asn Leu Lys Asn Glu Asp Met Ala Thr Tyr Phe Cys
85 90 95
Ala Arg Asp Gly Gln Leu Gly Leu Arg Phe Ala Tyr Trp Gly Gln Gly
100 105 110
Thr Leu Val Thr Val Ser Ala
115
<210> 49
<211> 112
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 49
Asn Ile Met Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ala Val Ser Ala Gly
1 5 10 15
Glu Lys Val Thr Met Ser Cys Lys Ser Ser Gln Ser Val Leu Tyr Ser
20 25 30
Ser Asn Gln Lys Asn Tyr Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln
35 40 45
Ser Pro Lys Leu Leu Ile Tyr Trp Ala Ser Thr Arg Glu Ser Gly Val
50 55 60
Pro Asp Arg Phe Thr Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr
65 70 75 80
Ile Ser Ser Val Gln Ala Glu Asp Leu Ala Val Tyr Tyr Cys His Gln
85 90 95
Tyr Leu Ser Ser Arg Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys
100 105 110
<210> 50
<211> 118
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 50
Glu Val Lys Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Lys Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Asp Tyr
20 25 30
Gly Met Ala Trp Val Arg Gln Ala Pro Arg Lys Gly Pro Glu Trp Val
35 40 45
Ala Phe Ile Ser Asn Leu Ala Tyr Ser Ile Tyr Tyr Ala Asp Thr Val
50 55 60
Thr Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Glu Asn Ala Lys Asn Thr Leu Tyr
65 70 75 80
Leu Glu Met Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Met Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Arg Leu Gly Tyr Gly Asn Ser Phe Ala Tyr Trp Gly Gln Gly Thr
100 105 110
Leu Val Thr Val Ser Ala
115
<210> 51
<211> 113
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 51
Asp Ile Val Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Thr Val Thr Ala Gly
1 5 10 15
Glu Lys Val Thr Met Ser Cys Lys Ser Ser Gln Ser Leu Leu Asn Ser
20 25 30
Gly Asn Gln Lys Asn Tyr Leu Thr Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln
35 40 45
Pro Pro Lys Leu Leu Ile Tyr Trp Ala Ser Thr Arg Glu Ser Gly Val
50 55 60
Pro Asp Arg Phe Thr Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr
65 70 75 80
Ile Ser Ser Val Gln Ala Glu Asp Leu Ala Val Tyr Tyr Cys Gln Asn
85 90 95
Asp Tyr Ser Tyr Pro Leu Thr Phe Gly Ala Gly Thr Lys Leu Glu Leu
100 105 110
Lys
<210> 52
<211> 355
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 52
gaagtgaaac tggtggagag cggcggcggc ctcgtgcagc ctggaggctc cctgaagctg 60
agctgtgccg ccagcggctt tacctttagc gattacggca tggcctgggt gagacaggcc 120
cctagaaagg gccccgaatg ggtggccttc atctccaacc tggcctacag catctactac 180
gccgacaccg tgaccggaag attcaccatc tccagagaga acgccaagaa caccctgtac 240
ctggagatga gctccctgag gagcgaggac accgccatgt actactgcgc caggctgggc 300
tacggcaaca gcttcgccta ctggggacag ggcaccctgg tgacagtgag cgctg 355
<210> 53
<211> 340
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 53
gacatcgtga tgacccagag cccctcctcc ctgacagtga ccgccggcga gaaggtgacc 60
atgagctgca agagctccca gagcctgctg aacagcggca atcagaagaa ctacctgacc 120
tggtaccagc agaagcccgg ccagcctccc aagctgctga tctactgggc cagcaccaga 180
gagagcggcg tgcctgacag attcaccggc agcggctccg gcaccgactt taccctgacc 240
atctccagcg tgcaggccga ggacctggcc gtgtactatt gccagaacga ctacagctac 300
cccctgacct tcggcgccgg aaccaagctg gagctgaaga 340
<210> 54
<211> 115
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 54
Gln Val Gln Leu Gln Gln Ser Gly Ala Glu Leu Ala Arg Pro Gly Ala
1 5 10 15
Ser Val Lys Leu Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Ser Tyr
20 25 30
Gly Ile Ser Trp Val Lys Gln Arg Thr Gly Gln Gly Leu Glu Trp Ile
35 40 45
Gly Glu Ile Tyr Pro Arg Ser Gly Asn Thr Tyr Tyr Asn Glu Lys Phe
50 55 60
Lys Gly Lys Ala Thr Leu Thr Ala Asp Lys Ser Ser Ser Thr Ala Tyr
65 70 75 80
Met Glu Leu Arg Ser Leu Thr Ser Glu Asp Ser Ala Val Tyr Phe Cys
85 90 95
Ala Ser Leu Ala Trp Phe Ala Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr
100 105 110
Val Ser Ala
115
<210> 55
<211> 112
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 55
Asp Ile Val Met Thr Gln Ala Ala Pro Ser Val Pro Val Thr Pro Gly
1 5 10 15
Glu Ser Val Ser Ile Ser Cys Arg Ser Ser Lys Ser Leu Leu His Ser
20 25 30
Asn Gly Asn Thr Tyr Leu Tyr Trp Phe Leu Gln Arg Pro Gly Gln Ser
35 40 45
Pro Gln Leu Leu Ile Tyr Arg Met Ser Asn Leu Ala Ser Gly Val Pro
50 55 60
Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Ala Phe Thr Leu Arg Ile
65 70 75 80
Ser Arg Val Glu Ala Glu Asp Val Gly Val Tyr Tyr Cys Met Gln His
85 90 95
Leu Glu Tyr Pro Tyr Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys
100 105 110
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<211> 346
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 56
caggtgcagc tgcaacaatc cggcgccgag ctggccaggc ctggagcctc cgtgaagctg 60
agctgcaagg cctccggcta caccttcacc tcctacggca tcagctgggt gaaacagagg 120
acaggccagg gcctggagtg gattggcgag atctacccca gatccggaaa cacctactac 180
aacgagaagt tcaagggcaa ggctaccctg accgctgaca agagcagcag cacagcttac 240
atggagctga gatccctgac cagcgaggat agcgccgtct acttctgcgc cagcctcgct 300
tggtttgctt actggggcca gggaaccctg gtgaccgtga gcgctg 346
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<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 57
gacatcgtga tgacccaggc tgccccttcc gtgcctgtga cccctggaga gagcgtgagc 60
atcagctgca ggagcagcaa gtccctgctg cacagcaacg gcaacaccta cctgtactgg 120
tttctgcaga gacctggcca gagcccccag ctgctgatct acaggatgag caatctggcc 180
tccggcgtgc ccgacagatt tagcggctcc ggcagcggca ccgcctttac cctgaggatc 240
agcagggtgg aggccgagga cgtgggcgtg tactactgta tgcagcacct ggagtacccc 300
tataccttcg gcggcggcac caagctggag atcaaga 337
<210> 58
<211> 118
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 58
Glu Val Gln Leu Gln Gln Ser Gly Pro Glu Leu Val Lys Pro Gly Ala
1 5 10 15
Ser Val Lys Met Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Asp Tyr
20 25 30
Asn Met His Trp Val Lys Gln Ser His Gly Lys Ser Leu Glu Trp Ile
35 40 45
Gly Tyr Ile Asn Pro Asn Asn Gly Gly Thr Ser Tyr Asn Gln Lys Phe
50 55 60
Lys Gly Lys Ala Thr Leu Thr Val Asn Lys Ser Ser Ser Thr Ala Tyr
65 70 75 80
Met Glu Leu Arg Ser Leu Thr Ser Glu Asp Ser Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Arg Ile Tyr Tyr Gly Asn Ser Phe Ala Tyr Trp Gly Gln Gly Thr
100 105 110
Leu Val Thr Val Ser Ala
115
<210> 59
<211> 113
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 59
Asp Ile Val Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Thr Val Thr Ala Gly
1 5 10 15
Glu Lys Val Thr Met Ser Cys Lys Ser Ser Gln Ser Leu Leu Asn Ser
20 25 30
Gly Asn Gln Lys Asn Tyr Leu Thr Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln
35 40 45
Pro Pro Lys Leu Leu Ile Tyr Trp Ala Ser Thr Arg Glu Ser Gly Val
50 55 60
Pro Asp Arg Phe Thr Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr
65 70 75 80
Ile Ser Ser Val Gln Ala Glu Asp Leu Ala Val Tyr Tyr Cys Gln Asn
85 90 95
Asp Tyr Ser Tyr Pro Phe Thr Phe Gly Ser Gly Thr Lys Leu Glu Ile
100 105 110
Lys
<210> 60
<211> 354
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 60
gaggtgcagc tgcagcagag cggacccgaa ctggtgaaac ccggcgcctc cgtgaagatg 60
agctgcaagg ccagcggcta caccttcacc gactacaaca tgcactgggt gaagcagagc 120
cacggcaagt ctttagagtg gattggctac atcaacccca acaacggcgg caccagctac 180
aaccagaaat tcaagggcaa ggccaccctc accgtgaaca agagctccag caccgcctac 240
atggagttac gttctttaac ctccgaggac agcgccgtgt actactgcgc tcgtatctac 300
tacggcaaca gcttcgctta ctggggccaa ggtactttag tgaccgtgag cgcc 354
<210> 61
<211> 340
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 61
gatatcgtga tgacccagtc tccatccagc ctgaccgtga cagccggcga gaaggtgacc 60
atgagctgca agtcttccca gtctctgctg aactccggca atcagaagaa ctacctgaca 120
tggtatcagc agaagccagg ccagccccct aagctgctga tctactgggc tagcaccagg 180
gagtctggag tgccagaccg gttcacaggc agcggctctg gcaccgactt caccctgaca 240
atcagctctg tgcaggccga ggacctggcc gtgtactatt gccagaatga ttactcttat 300
cccttcacat ttggctccgg caccaagctg gagatcaaga 340
<210> 62
<211> 116
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 62
Gln Val Gln Leu Lys Glu Ser Gly Pro Gly Leu Val Ala Pro Ser Gln
1 5 10 15
Ser Leu Ser Ile Thr Cys Thr Val Ser Gly Phe Ser Leu Thr Ser Tyr
20 25 30
Gly Val Ser Trp Val Arg Gln Pro Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Leu
35 40 45
Gly Val Ile Trp Gly Asp Gly Ser Thr Asn Tyr His Ser Ala Leu Ile
50 55 60
Ser Arg Leu Ser Ile Ser Lys Asp Asn Ser Lys Ser Gln Val Phe Leu
65 70 75 80
Lys Leu Asn Ser Leu Gln Thr Asp Asp Thr Ala Thr Tyr Tyr Cys Ala
85 90 95
Gly Gly Leu Arg Leu Trp Phe Ala Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val
100 105 110
Thr Val Ser Ala
115
<210> 63
<211> 113
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 63
Asp Ile Val Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ala Met Ser Val Gly
1 5 10 15
Gln Lys Val Thr Met Ser Cys Lys Ser Ser Gln Ser Leu Leu Asn Ser
20 25 30
Ser Asn Gln Lys Asn Tyr Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln
35 40 45
Ser Pro Lys Leu Leu Val Tyr Phe Ala Ser Thr Arg Glu Ser Gly Val
50 55 60
Pro Asp Arg Phe Ile Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr
65 70 75 80
Ile Ser Ser Val Gln Ala Glu Asp Leu Ala Asp Tyr Phe Cys Gln Gln
85 90 95
His Tyr Ser Thr Pro Phe Thr Phe Gly Ser Gly Thr Lys Leu Glu Ile
100 105 110
Lys
<210> 64
<211> 348
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 64
caagttcagc tgaaggagag cggccccggt ctggtggctc ctagccagtc tttaagcatc 60
acttgtaccg tgagcggctt ctctttaacc agctacggcg tgagctgggt gagacagcct 120
cccggtaagg gtttagagtg gctgggagtg atctggggcg acggcagcac caactaccac 180
agcgctttaa tctctcgtct gtccatcagc aaggacaaca gcaagagcca agttttttta 240
aagctgaact ctttacagac cgacgacacc gccacctact actgcgccgg aggtttaagg 300
ctgtggtttg cctactgggg ccaaggtact ttagtgacag tgagcgcc 348
<210> 65
<211> 339
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 65
gacatcgtga tgacccagtc ccccagctct ttagctatga gcgtgggcca gaaggtgacc 60
atgagctgca agtccagcca gtctttactg aacagcagca accagaagaa ctatttagct 120
tggtaccagc agaagcccgg ccagagcccc aagctgctgg tgtacttcgc cagcactcgt 180
gagagcggcg tgcccgatcg tttcatcggc agcggcagcg gcaccgattt cactttaacc 240
atcagcagcg tgcaagctga ggatctggcc gactacttct gccagcagca ctacagcacc 300
cccttcacct tcggcagcgg caccaagctg gagatcaag 339
<210> 66
<211> 120
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 66
Gln Val Gln Leu Gln Gln Ser Gly Ala Glu Leu Val Lys Pro Gly Ala
1 5 10 15
Ser Val Lys Met Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Thr Tyr
20 25 30
Pro Ile Glu Trp Met Lys Gln Asn His Gly Lys Ser Leu Glu Trp Ile
35 40 45
Gly Asn Phe His Pro Tyr Asn Asp Asp Thr Lys Tyr Asn Glu Lys Phe
50 55 60
Lys Gly Lys Ala Thr Leu Thr Val Glu Lys Ser Ser Ser Thr Val Tyr
65 70 75 80
Leu Glu Leu Ser Arg Leu Thr Ser Asp Asp Ser Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Arg Arg Gly Tyr Gly Ser Ser Tyr Ala Met Asp Tyr Trp Gly Gln
100 105 110
Gly Thr Ser Val Thr Val Ser Ser
115 120
<210> 67
<211> 113
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 67
Asp Ile Val Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Val Ser Ala Gly
1 5 10 15
Glu Lys Val Thr Met Ser Cys Lys Ser Ser Gln Ser Leu Leu Asn Ser
20 25 30
Gly Asn Gln Lys Asn Tyr Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln
35 40 45
Pro Pro Lys Leu Leu Ile Tyr Gly Ala Ser Thr Arg Glu Ser Gly Val
50 55 60
Pro Asp Arg Phe Thr Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr
65 70 75 80
Ile Ser Ser Val Gln Ala Glu Asp Leu Ala Val Tyr Tyr Cys Gln Asn
85 90 95
Asp His Ser Tyr Pro Tyr Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Ile
100 105 110
Lys
<210> 68
<211> 360
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 68
caagttcagc tgcagcagag cggagccgaa ctggtgaagc ccggtgccag cgtgaagatg 60
agctgcaagg ccagcggcta caccttcacc acctacccca tcgagtggat gaagcagaac 120
cacggcaagt ctttagagtg gatcggcaac ttccacccct acaacgacga caccaagtac 180
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ttagagctga gcagactgac cagcgacgac agcgccgtgt actactgcgc tcgtagaggc 300
tacggcagca gctacgccat ggactactgg ggccaaggta ccagcgtgac cgtgagcagc 360
<210> 69
<211> 339
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 69
gacatcgtga tgacccagag ccctagctct ttaagcgtga gcgccggcga gaaggtgacc 60
atgagctgca agagcagcca gtctttactg aacagcggca accagaagaa ctatttagct 120
tggtaccaac agaagcccgg ccagcccccc aagctgctga tctacggcgc cagcaccaga 180
gagagcggag tgcccgatag gtttaccggc agcggcagcg gcaccgactt cactttaacc 240
atcagcagcg tgcaagctga ggatctggcc gtgtactact gccagaacga ccacagctac 300
ccctacacct tcggcggcgg caccaagctg gagatcaag 339
<210> 70
<211> 113
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 70
Asp Ile Val Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Thr Val Thr Ala Gly
1 5 10 15
Glu Lys Val Thr Met Ser Cys Lys Ser Ser Gln Ser Leu Leu Asn Ser
20 25 30
Gly Asn Gln Lys Asn Tyr Leu Thr Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln
35 40 45
Pro Pro Lys Leu Leu Ile Tyr Trp Ala Ser Thr Arg Glu Ser Gly Val
50 55 60
Pro Asp Arg Phe Thr Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr
65 70 75 80
Ile Ser Ser Val Gln Ala Glu Asp Leu Ala Val Tyr Tyr Cys Gln Asn
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Asn Tyr Tyr Tyr Pro Leu Thr Phe Gly Ala Gly Thr Lys Leu Glu Leu
100 105 110
Lys
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<211> 113
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 71
Asp Ile Val Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Thr Val Thr Ala Gly
1 5 10 15
Glu Lys Val Thr Met Ser Cys Lys Ser Ser Gln Ser Leu Leu Asn Ser
20 25 30
Gly Asn Gln Lys Asn Tyr Leu Thr Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln
35 40 45
Pro Pro Lys Leu Leu Ile Tyr Trp Ala Ser Thr Arg Glu Ser Gly Val
50 55 60
Pro Asp Arg Phe Thr Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr
65 70 75 80
Ile Ser Ser Val Gln Ala Glu Asp Leu Ala Val Tyr Tyr Cys Gln Asn
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Asp Tyr Ser Leu Pro Phe Thr Phe Gly Ala Gly Thr Lys Leu Glu Leu
100 105 110
Lys
<210> 72
<211> 118
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 72
Glu Val Lys Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Lys Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Arg Tyr
20 25 30
Gly Met Ala Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Pro Glu Trp Val
35 40 45
Ala Phe Ile Ser Asn Ser Ala Tyr Ser Ile Tyr Tyr Ala Asp Thr Val
50 55 60
Thr Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Glu Asn Ala Lys Asn Thr Leu Tyr
65 70 75 80
Leu Glu Met Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Met Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Arg Leu Gly Tyr Gly Asn Ser Phe Ala Tyr Trp Gly Gln Gly Thr
100 105 110
Leu Val Thr Val Ser Ala
115
<210> 73
<211> 113
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 73
Asp Ile Val Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Thr Val Thr Ala Gly
1 5 10 15
Glu Lys Val Thr Met Ser Cys Lys Ser Ser Gln Ser Leu Leu Asn Ser
20 25 30
Gly Asn Gln Lys Asn Tyr Leu Thr Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln
35 40 45
Pro Pro Lys Leu Leu Ile Tyr Trp Gly Ser Thr Arg Glu Ser Gly Val
50 55 60
Pro Asp Arg Phe Thr Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr
65 70 75 80
Ile Ser Ser Val Gln Ala Glu Asp Leu Ala Val Tyr Tyr Cys Gln Asn
85 90 95
Asp Tyr Ser Tyr Pro Leu Thr Phe Gly Ala Gly Thr Lys Leu Glu Leu
100 105 110
Lys
<210> 74
<211> 118
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 74
Glu Val Lys Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Lys Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Gly Phe Ser Asp Tyr
20 25 30
Gly Met Ala Trp Val Arg Gln Ala Pro Arg Lys Gly Pro Glu Trp Val
35 40 45
Ala Phe Ile Ser Asn Ser Ala Tyr Ser Ile Tyr Tyr Ala Asp Thr Val
50 55 60
Thr Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Glu Asn Ala Lys Asn Thr Leu Tyr
65 70 75 80
Leu Glu Met Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Met Tyr Tyr Cys
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Ala Arg Leu Gly Tyr Gly Asn Ser Phe Ala Tyr Trp Gly Gln Gly Thr
100 105 110
Leu Val Thr Val Ser Ala
115
<210> 75
<211> 113
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 75
Asp Ile Val Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Thr Val Thr Ala Gly
1 5 10 15
Glu Lys Val Thr Met Ser Cys Lys Ser Ser Gln Ser Leu Leu Asn Ser
20 25 30
Gly Asn Gln Lys Asn Tyr Leu Thr Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln
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Pro Pro Lys Leu Leu Ile Tyr Trp Ala Ser Thr Arg Glu Pro Gly Val
50 55 60
Pro Asp Arg Phe Thr Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr
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Asp Tyr Ser Tyr Pro Leu Thr Phe Gly Ala Gly Thr Lys Leu Glu Leu
100 105 110
Lys
<210> 76
<211> 113
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 76
Asp Ile Val Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Thr Val Thr Ala Gly
1 5 10 15
Glu Lys Val Thr Met Ser Cys Lys Ser Ser Gln Ser Leu Leu Asn Ser
20 25 30
Gly Asn Gln Lys Asn Tyr Leu Thr Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln
35 40 45
Pro Pro Lys Leu Leu Ile Tyr Trp Ala Ser Thr Arg Glu Ser Gly Val
50 55 60
Pro Asp Arg Phe Thr Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr
65 70 75 80
Ile Ser Ser Val Gln Ala Glu Asp Leu Ala Val Tyr Tyr Cys Gln Asn
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Glu Leu Phe Tyr Pro Leu Thr Phe Gly Ala Gly Thr Lys Leu Glu Leu
100 105 110
Lys
<210> 77
<211> 118
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 77
Glu Val Lys Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Lys Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Asp Tyr
20 25 30
Gly Met Ala Trp Val Arg Gln Ala Pro Arg Lys Gly Pro Glu Trp Val
35 40 45
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65 70 75 80
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85 90 95
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100 105 110
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115
<210> 78
<211> 113
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 78
Asp Ile Val Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Thr Val Thr Ala Gly
1 5 10 15
Glu Lys Val Thr Met Ser Cys Lys Ser Ser Gln Ser Leu Leu Asn Ser
20 25 30
Gly Asn Gln Lys Asn Tyr Leu Thr Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln
35 40 45
Pro Pro Lys Leu Leu Ile Tyr Trp Ala Ser Thr Arg Glu Ser Gly Val
50 55 60
Pro Asp Arg Phe Thr Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr
65 70 75 80
Ile Ser Ser Val Gln Ala Glu Asp Leu Ala Val Tyr Tyr Cys Gln Asn
85 90 95
Asp Tyr Ser Phe Pro Leu Thr Phe Gly Ala Gly Thr Lys Leu Glu Leu
100 105 110
Lys
<210> 79
<211> 118
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 79
Glu Val Lys Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Lys Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Gly Phe Ser Asp Tyr
20 25 30
Gly Met Ala Trp Val Arg Gln Ala Pro Arg Lys Gly Pro Glu Trp Val
35 40 45
Ala Phe Ile Ser Asn Ser Ala Tyr Ser Ile Tyr Tyr Ala Asp Thr Val
50 55 60
Thr Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Glu Asn Ala Lys Asn Thr Leu Tyr
65 70 75 80
Leu Glu Met Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Met Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Arg Leu Gly Arg Gly Asn Ser Phe Ala Tyr Trp Gly Gln Gly Thr
100 105 110
Leu Val Thr Val Ser Ala
115
<210> 80
<211> 113
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 80
Asp Ile Val Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Thr Val Thr Ala Gly
1 5 10 15
Glu Lys Val Thr Met Ser Cys Lys Ser Ser Gln Ser Leu Leu Asn Ser
20 25 30
Gly Asn Gln Lys Asn Tyr Leu Thr Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln
35 40 45
Pro Pro Lys Leu Leu Ile Tyr Trp Gly Ser Thr Arg Glu Ser Gly Val
50 55 60
Pro Asp Arg Phe Thr Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr
65 70 75 80
Ile Ser Ser Val Gln Ala Glu Asp Leu Ala Val Tyr Tyr Cys Gln Asn
85 90 95
Asn Tyr Tyr Tyr Pro Leu Thr Phe Gly Ala Gly Thr Lys Leu Glu Leu
100 105 110
Lys
<210> 81
<211> 113
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 81
Asp Ile Val Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Thr Val Thr Ala Gly
1 5 10 15
Glu Lys Val Thr Met Ser Cys Lys Ser Ser Gln Ser Leu Leu Asn Ser
20 25 30
Gly Asn Gln Lys Asn Tyr Leu Thr Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln
35 40 45
Pro Pro Lys Leu Leu Ile Tyr Trp Gly Ser Thr Arg Glu Ser Gly Val
50 55 60
Pro Asp Arg Phe Thr Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr
65 70 75 80
Ile Ser Ser Val Gln Ala Glu Asp Leu Ala Val Tyr Tyr Cys Gln Asn
85 90 95
Glu Leu Phe Tyr Pro Leu Thr Phe Gly Ala Gly Thr Lys Leu Glu Leu
100 105 110
Lys
<210> 82
<211> 118
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 82
Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Gly Phe Ser Asp Tyr
20 25 30
Gly Met Ala Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
35 40 45
Ser Phe Ile Ser Asn Ser Ala Tyr Ser Ile Tyr Tyr Ala Asp Thr Val
50 55 60
Thr Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn Ser Leu Tyr
65 70 75 80
Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Arg Leu Gly Arg Gly Asn Ser Phe Ala Tyr Trp Gly Gln Gly Thr
100 105 110
Leu Val Thr Val Ser Ser
115
<210> 83
<211> 354
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 83
gaggtgcagc tggtggagag cggcggcggc ctggtgcagc ccggcggcag cctgagactg 60
agctgcgccg ccagcggctt cggcttcagc gactacggca tggcctgggt gagacaggcc 120
cccggcaagg gcctggagtg ggtgagcttc atcagcaaca gcgcctacag catctactac 180
gccgacaccg tgaccggcag attcaccatc agcagagaca acgccaagaa cagcctgtac 240
ctgcagatga acagcctgag agccgaggac accgccgtgt actactgcgc cagactgggc 300
agaggcaaca gcttcgccta ctggggccag ggcaccctgg tgaccgtgag cagc 354
<210> 84
<211> 113
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 84
Asp Ile Val Met Thr Gln Ser Pro Asp Ser Leu Ala Val Ser Leu Gly
1 5 10 15
Glu Arg Ala Thr Ile Asn Cys Lys Ser Ser Gln Ser Leu Leu Asn Ser
20 25 30
Gly Asn Gln Lys Asn Tyr Leu Thr Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln
35 40 45
Pro Pro Lys Leu Leu Ile Tyr Trp Gly Ser Thr Arg Glu Ser Gly Val
50 55 60
Pro Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr
65 70 75 80
Ile Ser Ser Leu Gln Ala Glu Asp Val Ala Val Tyr Tyr Cys Gln Asn
85 90 95
Glu Leu Phe Tyr Pro Leu Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Leu Glu Ile
100 105 110
Lys
<210> 85
<211> 339
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 85
gacatcgtga tgacccagag ccccgacagc ctggccgtga gcctgggcga gagagccacc 60
atcaactgca agagcagcca gagcctgctg aacagcggca accagaagaa ctacctgacc 120
tggtaccagc agaagcccgg ccagcccccc aagctgctga tctactgggg cagcaccaga 180
gagagcggcg tgcccgacag attcagcggc agcggcagcg gcaccgactt caccctgacc 240
atcagcagcc tgcaggccga ggacgtggcc gtgtactact gccagaacga gctgttctac 300
cccctgacct tcggccaggg caccaagctg gagatcaag 339
<210> 86
<211> 113
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 86
Glu Ile Val Met Thr Gln Ser Pro Pro Thr Leu Ser Leu Ser Pro Gly
1 5 10 15
Glu Arg Val Thr Leu Ser Cys Lys Ser Ser Gln Ser Leu Leu Asn Ser
20 25 30
Gly Asn Gln Lys Asn Tyr Leu Thr Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln
35 40 45
Ala Pro Arg Leu Leu Ile Tyr Trp Gly Ser Thr Arg Glu Ser Ser Ile
50 55 60
Pro Ala Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr
65 70 75 80
Ile Ser Ser Leu Gln Pro Glu Asp Leu Ala Val Tyr Tyr Cys Gln Asn
85 90 95
Glu Leu Phe Tyr Pro Leu Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Leu Glu Ile
100 105 110
Lys
<210> 87
<211> 339
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 87
gagatcgtga tgacccagag cccccccacc ctgagcctga gccccggcga gagagtgacc 60
ctgagctgca agagcagcca gagcctgctg aacagcggca accagaagaa ctacctgacc 120
tggtaccagc agaagcccgg ccaggccccc agactgctga tctactgggg cagcaccaga 180
gagagcagca tccccgccag attcagcggc agcggcagcg gcaccgactt caccctgacc 240
atcagcagcc tgcagcccga ggacctggcc gtgtactact gccagaacga gctgttctac 300
cccctgacct tcggccaggg caccaagctg gagatcaag 339
<210> 88
<211> 118
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 88
Glu Val Gln Leu Leu Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Gly Phe Ser Asp Tyr
20 25 30
Gly Met Ala Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
35 40 45
Ser Phe Ile Ser Asn Ser Ala Tyr Ser Ile Tyr Tyr Ala Asp Thr Val
50 55 60
Thr Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr
65 70 75 80
Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Arg Leu Gly Arg Gly Asn Ser Phe Ala Tyr Trp Gly Gln Gly Thr
100 105 110
Leu Val Thr Val Ser Ser
115
<210> 89
<211> 354
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 89
gaggtgcagc tgctggagag cggcggcggc ctggtgcagc ccggcggcag cctgagactg 60
agctgcgccg ccagcggctt cggcttcagc gactacggca tggcctgggt gagacaggcc 120
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gccgacaccg tgaccggcag attcaccatc agcagagaca acagcaagaa caccctgtac 240
ctgcagatga acagcctgag agccgaggac accgccgtgt actactgcgc cagactgggc 300
agaggcaaca gcttcgccta ctggggccag ggcaccctgg tgaccgtgag cagc 354
<210> 90
<211> 113
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 90
Asp Ile Val Met Thr Gln Ser Pro Leu Ser Leu Pro Val Thr Leu Gly
1 5 10 15
Gln Pro Ala Ser Ile Ser Cys Lys Ser Ser Gln Ser Leu Leu Asn Ser
20 25 30
Gly Asn Gln Lys Asn Tyr Leu Thr Trp Tyr Gln Gln Arg Pro Gly Gln
35 40 45
Ser Pro Arg Leu Leu Ile Tyr Trp Gly Ser Thr Arg Glu Ser Gly Val
50 55 60
Pro Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Lys
65 70 75 80
Ile Ser Arg Val Glu Ala Glu Asp Val Gly Val Tyr Tyr Cys Gln Asn
85 90 95
Glu Leu Phe Tyr Pro Leu Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Leu Glu Ile
100 105 110
Lys
<210> 91
<211> 339
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 91
gacatcgtga tgacccagag ccccctgagc ctgcccgtga ccctgggcca gcccgccagc 60
atcagctgca agagcagcca gagcctgctg aacagcggca accagaagaa ctacctgacc 120
tggtaccagc agagacccgg ccagagcccc agactgctga tctactgggg cagcaccaga 180
gagagcggcg tgcccgacag attcagcggc agcggcagcg gcaccgactt caccctgaag 240
atcagcagag tggaggccga ggacgtgggc gtgtactact gccagaacga gctgttctac 300
cccctgacct tcggccaggg caccaagctg gagatcaag 339
<210> 92
<211> 468
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 92
Met Glu Thr Asp Thr Leu Leu Leu Trp Val Leu Leu Leu Trp Val Pro
1 5 10 15
Gly Ser Thr Gly Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val
20 25 30
Gln Pro Gly Gly Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Gly
35 40 45
Phe Ser Asp Tyr Gly Met Ala Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly
50 55 60
Leu Glu Trp Val Ser Phe Ile Ser Asn Ser Ala Tyr Ser Ile Tyr Tyr
65 70 75 80
Ala Asp Thr Val Thr Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys
85 90 95
Asn Ser Leu Tyr Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala
100 105 110
Val Tyr Tyr Cys Ala Arg Leu Gly Arg Gly Asn Ser Phe Ala Tyr Trp
115 120 125
Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro
130 135 140
Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr
145 150 155 160
Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr
165 170 175
Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro
180 185 190
Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr
195 200 205
Val Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn Val Asn
210 215 220
His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Lys Val Glu Pro Lys Ser
225 230 235 240
Cys Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu Leu
245 250 255
Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu
260 265 270
Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser
275 280 285
His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu
290 295 300
Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr
305 310 315 320
Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn
325 330 335
Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro
340 345 350
Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln
355 360 365
Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Glu Glu Met Thr Lys Asn Gln Val
370 375 380
Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val
385 390 395 400
Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro
405 410 415
Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr
420 425 430
Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val
435 440 445
Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu
450 455 460
Ser Pro Gly Lys
465
<210> 93
<211> 1422
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 93
gaattcgccg ccaccatgga gaccgacacc ctgctgctgt gggtgctgct gctgtgggtg 60
cccggatcca ccggcgaggt gcagctggtg gagagcggcg gcggcctggt gcagcccggc 120
ggcagcctga gactgagctg cgccgccagc ggcttcggct tcagcgacta cggcatggcc 180
tgggtgagac aggcccccgg caagggcctg gagtgggtga gcttcatcag caacagcgcc 240
tacagcatct actacgccga caccgtgacc ggcagattca ccatcagcag agacaacgcc 300
aagaacagcc tgtacctgca gatgaacagc ctgagagccg aggacaccgc cgtgtactac 360
tgcgccagac tgggcagagg caacagcttc gcctactggg gccagggcac cctggtgacc 420
gtgagcagcg ctagcaccaa gggcccatcg gtcttccccc tggcaccctc ctccaagagc 480
acctctgggg gcacagcggc cctgggctgc ctggtcaagg actacttccc cgaaccggtg 540
acggtgtcgt ggaactcagg cgccctgacc agcggcgtgc acaccttccc ggccgtccta 600
cagtcctcag gactctactc cctcagcagc gtggtgaccg tgccctccag cagcttgggc 660
acccagacct acatctgcaa cgtgaatcac aagcccagca acaccaaggt ggacaagaag 720
gttgagccca aatcttgtga caaaactcac acatgcccac cgtgcccagc acctgaactc 780
ctggggggac cgtcagtctt cctcttcccc ccaaaaccca aggacaccct catgatctcc 840
cggacccctg aggtcacatg cgtggtggtg gacgtgagcc acgaagaccc tgaggtcaag 900
ttcaactggt acgtggacgg cgtggaggtg cataatgcca agacaaagcc gcgggaggag 960
cagtacaaca gcacgtaccg tgtggtcagc gtcctcaccg tcctgcacca ggactggctg 1020
aatggcaagg agtacaagtg caaggtctcc aacaaagccc tcccagcccc catcgagaaa 1080
accatctcca aagccaaagg gcagccccga gaaccacagg tgtacaccct gcccccatcc 1140
cgggaggaga tgaccaagaa ccaggtcagc ctgacctgcc tggtcaaagg cttctatccc 1200
agcgacatcg ccgtggagtg ggagagcaat gggcagccgg agaacaacta caagaccacg 1260
cctcccgtgc tggactccga cggctccttc ttcctctaca gcaagctcac cgtggacaag 1320
agcaggtggc agcaggggaa cgtcttctca tgctccgtga tgcatgaggc tctgcacaac 1380
cactacacgc agaagagcct ctccctgtct ccgggtaaat ga 1422
<210> 94
<211> 240
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 94
Met Glu Thr Asp Thr Leu Leu Leu Trp Val Leu Leu Leu Trp Val Pro
1 5 10 15
Gly Ser Thr Gly Asp Ile Val Met Thr Gln Ser Pro Asp Ser Leu Ala
20 25 30
Val Ser Leu Gly Glu Arg Ala Thr Ile Asn Cys Lys Ser Ser Gln Ser
35 40 45
Leu Leu Asn Ser Gly Asn Gln Lys Asn Tyr Leu Thr Trp Tyr Gln Gln
50 55 60
Lys Pro Gly Gln Pro Pro Lys Leu Leu Ile Tyr Trp Gly Ser Thr Arg
65 70 75 80
Glu Ser Gly Val Pro Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp
85 90 95
Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Ala Glu Asp Val Ala Val Tyr
100 105 110
Tyr Cys Gln Asn Glu Leu Phe Tyr Pro Leu Thr Phe Gly Gln Gly Thr
115 120 125
Lys Leu Glu Ile Lys Arg Thr Val Ala Ala Pro Ser Val Phe Ile Phe
130 135 140
Pro Pro Ser Asp Glu Gln Leu Lys Ser Gly Thr Ala Ser Val Val Cys
145 150 155 160
Leu Leu Asn Asn Phe Tyr Pro Arg Glu Ala Lys Val Gln Trp Lys Val
165 170 175
Asp Asn Ala Leu Gln Ser Gly Asn Ser Gln Glu Ser Val Thr Glu Gln
180 185 190
Asp Ser Lys Asp Ser Thr Tyr Ser Leu Ser Ser Thr Leu Thr Leu Ser
195 200 205
Lys Ala Asp Tyr Glu Lys His Lys Val Tyr Ala Cys Glu Val Thr His
210 215 220
Gln Gly Leu Ser Ser Pro Val Thr Lys Ser Phe Asn Arg Gly Glu Cys
225 230 235 240
<210> 95
<211> 738
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 95
gaattcgccg ccaccatgga gaccgacacc ctgctgctgt gggtgctgct gctgtgggtg 60
cccggatcca ccggcgacat cgtgatgacc cagagccccg acagcctggc cgtgagcctg 120
ggcgagagag ccaccatcaa ctgcaagagc agccagagcc tgctgaacag cggcaaccag 180
aagaactacc tgacctggta ccagcagaag cccggccagc cccccaagct gctgatctac 240
tggggcagca ccagagagag cggcgtgccc gacagattca gcggcagcgg cagcggcacc 300
gacttcaccc tgaccatcag cagcctgcag gccgaggacg tggccgtgta ctactgccag 360
aacgagctgt tctaccccct gaccttcggc cagggcacca agctggagat caagcgtacg 420
gtggctgcac catctgtctt catcttcccg ccatctgatg agcagttgaa atctggaact 480
gcctctgttg tgtgcctgct gaataacttc tatcccagag aggccaaagt acagtggaag 540
gtggataacg ccctccaatc gggtaactcc caggagagtg tcacagagca ggacagcaag 600
gacagcacct acagcctcag cagcaccctg acgctgagca aagcagacta cgagaaacac 660
aaagtctacg cctgcgaagt cacccatcag ggcctgagct cgcccgtcac aaagagcttc 720
aacaggggag agtgttga 738
<210> 96
<211> 467
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 96
Met Gly Trp Ser Cys Ile Ile Leu Phe Leu Val Ala Thr Ala Thr Gly
1 5 10 15
Val His Ser Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln
20 25 30
Pro Gly Gly Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Gly Phe
35 40 45
Ser Asp Tyr Gly Met Ala Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu
50 55 60
Glu Trp Val Ser Phe Ile Ser Asn Ser Ala Tyr Ser Ile Tyr Tyr Ala
65 70 75 80
Asp Thr Val Thr Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn
85 90 95
Ser Leu Tyr Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val
100 105 110
Tyr Tyr Cys Ala Arg Leu Gly Arg Gly Asn Ser Phe Ala Tyr Trp Gly
115 120 125
Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser
130 135 140
Val Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala
145 150 155 160
Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val
165 170 175
Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala
180 185 190
Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val
195 200 205
Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn Val Asn His
210 215 220
Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Lys Val Glu Pro Lys Ser Cys
225 230 235 240
Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly
245 250 255
Gly Pro Ser Val Phe Leu Leu Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met
260 265 270
Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His
275 280 285
Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val
290 295 300
His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Pro Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Leu
305 310 315 320
Arg Val Val Ser Ile Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly
325 330 335
Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile
340 345 350
Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val
355 360 365
Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Asp Glu Leu Thr Lys Asn Gln Val Ser
370 375 380
Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu
385 390 395 400
Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Leu
405 410 415
Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val
420 425 430
Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met
435 440 445
His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser
450 455 460
Pro Gly Lys
465
<210> 97
<211> 1422
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 97
cctagggcca ccatgggatg gtcctgcatc attctcttcc tggtggccac cgctaccgga 60
gtgcacagcg aggtgcagct ggtggagagc ggcggcggcc tggtgcagcc cggcggcagc 120
ctgagactga gctgcgccgc cagcggcttc ggcttcagcg actacggcat ggcctgggtg 180
agacaggccc ccggcaaggg cctggagtgg gtgagcttca tcagcaacag cgcctacagc 240
atctactacg ccgacaccgt gaccggcaga ttcaccatca gcagagacaa cgccaagaac 300
agcctgtacc tgcagatgaa cagcctgaga gccgaggaca ccgccgtgta ctactgcgcc 360
agactgggca gaggcaacag cttcgcctac tggggccagg gcaccctggt gaccgtgagc 420
agcgcttcga ccaagggccc atcggtcttc cccctggcac cctcctccaa gagcacctct 480
gggggcacag cggccctggg ctgcctggtc aaggactact tccccgaacc ggtgacggtg 540
tcgtggaact caggcgccct gaccagcggc gtgcacacct tcccggctgt cctacagtcc 600
tcaggactct actccctcag cagcgtggtg accgtgccct ccagcagctt gggcacccag 660
acctacatct gcaacgtgaa tcacaagccc agcaacacca aggtggacaa gaaagttgag 720
cccaaatctt gtgacaaaac tcacacatgc ccaccgtgcc cagcacctga actcctgggg 780
ggaccgtcag tcttcctcct gcccccaaaa cccaaggaca ccctcatgat ctcccggacc 840
cctgaggtca catgcgtggt ggtggacgtg agccacgaag accctgaggt caagttcaac 900
tggtacgtgg acggcgtgga ggtgcataat gccaagacaa agccgcccga ggagcagtac 960
aacagcacgc tgcgtgtggt cagcatcctc accgtcctgc accaggactg gctgaatggc 1020
aaggagtaca agtgcaaggt ctccaacaaa gccctcccag cccccatcga gaaaaccatc 1080
tccaaagcca aagggcagcc ccgagaacca caggtgtaca ccctgccccc atcccgggat 1140
gagctgacca agaaccaggt cagcctgacc tgcctggtca aaggcttcta tcccagcgac 1200
atcgccgtgg agtgggagag caatgggcag ccggagaaca actacaagac cacgcctctg 1260
gtgctggact ccgacggctc cttcttcctc tacagcaagc tcaccgtgga caagagcagg 1320
tggcagcagg ggaacgtctt ctcatgctcc gtgatgcatg aggctctgca caaccactac 1380
acgcagaaga gcctctccct gtctccgggt aaatgagtat ac 1422
<210> 98
<211> 240
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 98
Met Glu Ser Gln Thr Gln Val Leu Met Ser Leu Leu Phe Trp Val Ser
1 5 10 15
Gly Thr Cys Gly Asp Ile Val Met Thr Gln Ser Pro Asp Ser Leu Ala
20 25 30
Val Ser Leu Gly Glu Arg Ala Thr Ile Asn Cys Lys Ser Ser Gln Ser
35 40 45
Leu Leu Asn Ser Gly Asn Gln Lys Asn Tyr Leu Thr Trp Tyr Gln Gln
50 55 60
Lys Pro Gly Gln Pro Pro Lys Leu Leu Ile Tyr Trp Gly Ser Thr Arg
65 70 75 80
Glu Ser Gly Val Pro Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp
85 90 95
Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Ala Glu Asp Val Ala Val Tyr
100 105 110
Tyr Cys Gln Asn Glu Leu Phe Tyr Pro Leu Thr Phe Gly Gln Gly Thr
115 120 125
Lys Leu Glu Ile Lys Arg Thr Val Ala Ala Pro Ser Val Phe Ile Phe
130 135 140
Pro Pro Ser Asp Glu Gln Leu Lys Ser Gly Thr Ala Ser Val Val Cys
145 150 155 160
Leu Leu Asn Asn Phe Tyr Pro Arg Glu Ala Lys Val Gln Trp Lys Val
165 170 175
Asp Asn Ala Leu Gln Ser Gly Asn Ser Gln Glu Ser Val Thr Glu Gln
180 185 190
Asp Ser Lys Asp Ser Thr Tyr Ser Leu Ser Ser Thr Leu Thr Leu Ser
195 200 205
Lys Ala Asp Tyr Glu Lys His Lys Val Tyr Ala Cys Glu Val Thr His
210 215 220
Gln Gly Leu Ser Ser Pro Val Thr Lys Ser Phe Asn Arg Gly Glu Cys
225 230 235 240
<210> 99
<211> 743
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 99
gatatcgcca ccatggagtc ccagacacag gtgctgatga gcctgctgtt ctgggtgtcc 60
ggcacctgtg gcgacatcgt gatgacccag agccccgaca gcctggccgt gagcctgggc 120
gagagagcca ccatcaactg caagagcagc cagagcctgc tgaacagcgg caaccagaag 180
aactacctga cctggtacca gcagaagccc ggccagcccc ccaagctgct gatctactgg 240
ggcagcacca gagagagcgg cgtgcccgac agattcagcg gcagcggcag cggcaccgac 300
ttcaccctga ccatcagcag cctgcaggcc gaggacgtgg ccgtgtacta ctgccagaac 360
gagctgttct accccctgac cttcggccag ggcaccaagc tggagatcaa gcgtacggtg 420
gctgcaccat ctgtcttcat cttcccgcca tctgatgagc agttgaaatc tggaactgcc 480
tctgttgtgt gcctgctgaa taacttctat cccagagagg ccaaagtaca gtggaaggtg 540
gataacgccc tccaatcggg taactcccag gagagtgtca cagagcagga cagcaaggac 600
agcacctaca gcctcagcag caccctgacg ctgagcaaag cagactacga gaaacacaaa 660
gtctacgcct gcgaagtcac ccatcagggc ctgagctcgc ccgtcacaaa gagcttcaac 720
aggggagagt gttgattaat taa 743
<210> 100
<211> 467
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 100
Met Gly Trp Ser Cys Ile Ile Leu Phe Leu Val Ala Thr Ala Thr Gly
1 5 10 15
Val His Ser Gln Val Gln Leu Gln Gln Pro Gly Ala Glu Leu Val Arg
20 25 30
Pro Gly Ala Ser Val Lys Leu Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe
35 40 45
Thr Ser Tyr Trp Ile Asn Trp Val Lys Gln Arg Pro Gly Gln Gly Leu
50 55 60
Glu Trp Ile Gly Asn Ile Tyr Pro Ser Asp Ser Tyr Thr Asn Tyr Asn
65 70 75 80
Gln Lys Phe Lys Asp Lys Ala Thr Leu Thr Val Asp Lys Ser Ser Ser
85 90 95
Thr Ala Tyr Met Gln Leu Ser Ser Pro Thr Ser Glu Asp Ser Ala Val
100 105 110
Tyr Tyr Cys Thr Arg Ser Trp Arg Gly Asn Ser Phe Asp Tyr Trp Gly
115 120 125
Gln Gly Thr Thr Leu Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser
130 135 140
Val Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala
145 150 155 160
Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val
165 170 175
Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala
180 185 190
Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val
195 200 205
Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn Val Asn His
210 215 220
Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Lys Val Glu Pro Lys Ser Cys
225 230 235 240
Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly
245 250 255
Gly Pro Ser Val Phe Leu Leu Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met
260 265 270
Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His
275 280 285
Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val
290 295 300
His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Pro Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Leu
305 310 315 320
Arg Val Val Ser Ile Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly
325 330 335
Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile
340 345 350
Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val
355 360 365
Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Asp Glu Leu Thr Lys Asn Gln Val Ser
370 375 380
Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu
385 390 395 400
Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Leu
405 410 415
Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val
420 425 430
Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met
435 440 445
His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser
450 455 460
Pro Gly Lys
465
<210> 101
<211> 8
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 101
Gly Phe Gly Phe Ser Asp Tyr Gly
1 5
<210> 102
<211> 8
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 102
Gly Phe Thr Phe Ser Asp Tyr Gly
1 5
<210> 103
<211> 8
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 103
Gly Phe Thr Phe Ser Arg Tyr Gly
1 5
<210> 104
<211> 8
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 104
Ile Ser Asn Leu Ala Tyr Ser Ile
1 5
<210> 105
<211> 8
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 105
Ile Ser Asn Ser Ala Tyr Ser Ile
1 5
<210> 106
<211> 11
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 106
Ala Arg Leu Gly Arg Gly Asn Ser Phe Ala Tyr
1 5 10
<210> 107
<211> 11
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 107
Ala Arg Leu Gly Tyr Gly Asn Ser Phe Ala Tyr
1 5 10
<210> 108
<211> 17
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 108
Lys Ser Ser Gln Ser Leu Leu Asn Ser Gly Asn Gln Lys Asn Tyr Leu
1 5 10 15
Thr
<210> 109
<211> 7
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 109
Trp Ala Ser Thr Arg Glu Pro
1 5
<210> 110
<211> 7
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 110
Trp Ala Ser Thr Arg Glu Ser
1 5
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<211> 7
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<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 111
Trp Gly Ser Thr Arg Glu Ser
1 5
<210> 112
<211> 9
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 112
Gln Asn Asp Tyr Ser Phe Pro Leu Thr
1 5
<210> 113
<211> 9
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 113
Gln Asn Asp Tyr Ser Leu Pro Phe Thr
1 5
<210> 114
<211> 9
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 114
Gln Asn Asp Tyr Ser Tyr Pro Leu Thr
1 5
<210> 115
<211> 9
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 115
Gln Asn Glu Leu Phe Tyr Pro Leu Thr
1 5
<210> 116
<211> 9
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 116
Gln Asn Asn Tyr Tyr Tyr Pro Leu Thr
1 5

Claims (11)

1.一种抗Claudin18.2抗体或其抗原结合片段，其包含重链可变区和轻链可变区，其中：
所述重链可变区的氨基酸序列为SEQ ID NO.79，且所述轻链可变区的氨基酸序列为SEQ ID NO.81；
所述重链可变区的氨基酸序列为SEQ ID NO.82，且所述轻链可变区的氨基酸序列为SEQ ID NO.84；
所述重链可变区的氨基酸序列为SEQ ID NO.82，且所述轻链可变区的氨基酸序列为SEQ ID NO.86；
所述重链可变区的氨基酸序列为SEQ ID NO.88，且所述轻链可变区的氨基酸序列为SEQ ID NO.84；
所述重链可变区的氨基酸序列为SEQ ID NO.88，且所述轻链可变区的氨基酸序列为SEQ ID NO.86；
所述重链可变区的氨基酸序列为SEQ ID NO.82，且所述轻链可变区的氨基酸序列为SEQ ID NO.90；或
所述重链可变区的氨基酸序列为SEQ ID NO.88，且所述轻链可变区的氨基酸序列为SEQ ID NO.90。
2.如权利要求1所述的抗Claudin18.2抗体或其抗原结合片段，其中：
所述重链氨基酸序列为SEQ ID NO.92，且所述轻链氨基酸序列为SEQ ID NO.94；或
所述重链氨基酸序列为SEQ ID NO.96，且所述轻链氨基酸序列为SEQ ID NO.98。
3.如权利要求1或2所述的抗Claudin18.2抗体或其抗原结合片段，其中所述抗体是鼠源抗体、嵌合抗体或人源化抗体。
4.一种分离的核苷酸，其编码权利要求1-3之任一项所述的抗Claudin18.2抗体或其抗原结合片段。
5.如权利要求4所述的核苷酸，其中：
(1)编码所述重链氨基酸序列的核苷酸序列如SEQ ID NO.93或SEQ ID NO.97所示；和
(2)编码所述轻链氨基酸序列的核苷酸序列如SEQ ID NO.95或SEQ ID NO.99所示。
6.一种表达载体，其包含如权利要求4或5所述的核苷酸。
7.一种宿主细胞，其转化如权利要求6所述的表达载体，所述宿主细胞选自原核细胞和真核细胞。
8.如权利要求7所述的宿主细胞，其中所述宿主细胞为哺乳动物细胞。
9.制备权利要求1-3任一项所述的抗Claudin18.2抗体或其抗原结合片段的方法，包括在如权利要求7或8所述的宿主细胞中表达抗体，以及从宿主细胞中分离所述抗体的步骤。
10.一种药物组合物，其包含权利要求1-3之任一项所述的抗Claudin18.2抗体或其抗原结合片段和药学可接受的载体。
11.如权利要求1-3之任一项所述的抗Claudin18.2抗体或其抗原结合片段或如权利要求10所述的药物组合物在制备治疗胃癌、食管癌、胰腺癌、肺癌、卵巢癌、结肠癌、肝癌、头颈癌和胆囊癌的药物中的应用。
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