JP2021535744A - 抗クローディン18.2抗体及びその使用 - Google Patents
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Abstract
Description
(1)前記重鎖可変領域はHCDR1、HCDR2及びHCDR3を含み、
(a1)前記HCDR1のアミノ酸配列は配列番号101、配列番号102、配列番号103及びそれらと少なくとも85%の配列同一性を有するアミノ酸配列から選択され、
(a2)前記HCDR2のアミノ酸配列は配列番号104、配列番号105及びそれらと少なくとも85%の配列同一性を有するアミノ酸配列から選択され、
(a3)前記HCDR3のアミノ酸配列は配列番号106、配列番号107及びそれらと少なくとも85%の配列同一性を有するアミノ酸配列から選択され、及び
(2)前記軽鎖可変領域はLCDR1、LCDR2及びLCDR3を含み、但し
(a4)前記LCDR1のアミノ酸配列は配列番号108であり、
(a5)前記LCDR2のアミノ酸配列は配列番号109、配列番号110、配列番号111及びそれらと少なくとも85%の配列同一性を有するアミノ酸配列から選択され、
(a6)前記LCDR3のアミノ酸配列は配列番号112、配列番号113、配列番号114、配列番号115、配列番号116及びそれらと少なくとも85%の配列同一性を有するアミノ酸配列から選択される、抗CLDN18.2抗体又はその抗原結合フラグメントを提供する。
(1)前記重鎖可変領域のアミノ酸配列は、
(b1)配列番号50、配列番号72、配列番号74、配列番号77、配列番号79で示されるアミノ酸配列、
(b2)(b1)で示されるアミノ酸配列において1又は複数個のアミノ酸が置換、欠失又は付加され、且つ(b1)で示されるアミノ酸配列と機能が同一又は類似するアミノ酸配列、及び
(b3)(b1)で示されるアミノ酸配列と少なくとも80%の配列同一性を有するアミノ酸配列から選択され、及び
(2)前記軽鎖可変領域のアミノ酸配列は、
(b4)配列番号51、配列番号70、配列番号71、配列番号73、配列番号75、配列番号76、配列番号78、配列番号80、配列番号81で示されるアミノ酸配列、
(b5)(b4)で示されるアミノ酸配列において1又は複数個のアミノ酸が置換、欠失又は付加され、且つ(b4)で示されるアミノ酸配列と機能が同一又は類似するアミノ酸配列、及び
(b6)(b4)で示されるアミノ酸配列と少なくとも80%の配列同一性を有するアミノ酸配列から選択される、抗CLDN18.2抗体又はその抗原結合フラグメントを提供する。
(c1)K3Q、L19R、R42G、P45L、A49S、E73D、T78S、E82Q、S84N、S88A、M93V、A118Sのアミノ酸置換を行い、置換後のアミノ酸配列は配列番号82で示され、
(c2)K3Q、V5L、L19R、R42G、P45L、A49S、E73D、A75S、E82Q、S8N、S88A、M93V、A118Sのアミノ酸置換を行い、置換後のアミノ酸配列は配列番号88で示され、
且つ配列番号81で示されるアミノ酸配列の軽鎖可変領域に対して、
(c3)D1E、S9P、S10T、T12S、V13L、T14S、A15P、K18R、K21L、P49A、K51L、G63S、V64I、D66A、T69S、V84L、A86P、A106Q、L112Iのアミノ酸置換を行い、置換後のアミノ酸配列は配列番号84で示され、
(c4)S9D、T12A、T14S、A15L、K18R、V19A、M21I、S22N、T69S、V84L、L89V、A106Q、L112Iのアミノ酸置換を行い、置換後のアミノ酸配列は配列番号86で示され、
(c5)A9L、T12P、A15L、E17Q、K18P、V19A、T20S、M21I、K45R、P49S、K51R、T69S、T80K、S83R、Q85E、L89V、A90G、A106Q、L112Iのアミノ酸置換を行い、置換後のアミノ酸配列は配列番号90で示される、抗CLDN18.2抗体又はその抗原結合フラグメントを提供する。
(1)前記重鎖可変領域のアミノ酸配列は、
(c1)配列番号82、配列番号88で示されるアミノ酸配列、
(c2)(c1)で示されるアミノ酸配列において1又は複数個のアミノ酸が置換、欠失又は付加され、且つ(c1)で示されるアミノ酸配列と機能が同一又は類似するアミノ酸配列、及び
(c3)(c1)で示されるアミノ酸配列と少なくとも80%の配列同一性を有するアミノ酸配列から選択され、及び
(2)前記軽鎖可変領域のアミノ酸配列は、
(c4)配列番号84、配列番号86、配列番号90で示されるアミノ酸配列、
(c5)(c4)で示されるアミノ酸配列において1又は複数個のアミノ酸が置換、欠失又は付加され、且つ(c4)で示されるアミノ酸配列と機能が同一又は類似するアミノ酸配列、及び
(c6)(c4)で示されるアミノ酸配列と少なくとも80%の配列同一性を有するアミノ酸配列から選択される、抗CLDN18.2抗体又はその抗原結合フラグメントを提供する。
(1) 前記重鎖アミノ酸配列をコードするヌクレオチド配列は配列番号93又は配列番号97で示され、
(2) 前記軽鎖アミノ酸配列をコードするヌクレオチド配列は配列番号95又は配列番号99で示される、本発明の抗CLDN18.2抗体又はその抗原結合フラグメントをコードするヌクレオチド配列を提供する。
一部の具体的な実施形態において、本発明は、
(1) 前記重鎖アミノ酸配列配列番号92をコードするヌクレオチド配列は配列番号93で示され、及び
(2) 前記軽鎖アミノ酸配列配列番号94をコードするヌクレオチド配列は配列番号95で示される、本発明の抗CLDN18.2抗体又はその抗原結合フラグメントをコードするヌクレオチド配列を提供する。
(1) 前記重鎖アミノ酸配列配列番号96をコードするヌクレオチド配列は配列番号97で示され、及び
(2) 前記軽鎖アミノ酸配列配列番号98をコードするヌクレオチド配列は配列番号99で示される、本発明の抗CLDN18.2抗体又はその抗原結合フラグメントをコードするヌクレオチド配列を提供する。
本文で使用される科学及び技術用語の意味は別途定義がある場合を除き、当業者が通常理解する意味である。本文に記載の細胞及び組織培養、分子生物学およびタンパク質及びオリゴ又はポリヌクレオチド化学及びハイブリダイゼーションで使用する命名及び技術は当分野で公知であり且つ普遍的に使用されるものである。組み換えDNA、オリゴヌクレオチド合成及び組織培養と形質転換(例えばエレクトロポレーション、脂質トランスフェクション)については標準技術を用いる。酵素反応及び精製技術はメーカーの説明書又は当分野で普遍的に使用される又は本文に記載の方法に基づき行う。前述の技術及び方法は通常、当分野で公知であり且つ本明細書で引用及び検討された複数の総合的な及び比較的具体的な文献に記載されているように使用される。例えばSambrook等、Molecular Cloning: A Laboratory Manual) (第2版、Cold Spring Harbor Laboratory Press、ニューヨークコールドスプリングハーバー(1989))を参照できる。本文に記載の分析化学、合成有機化学および医学及び薬学化学において使用される命名および実験室方法及び技術は当分野で公知であり且つ普遍的に使用されるものである。
1、陽性対照抗体IMAB362−similar−hG1の調製:
特許出願WO2007/059997が提供する175D10クローン(IMAB362)抗体配列(即ち本公開の配列番号11及び配列番号12)に基づき、南京金斯瑞生物科技有限公司に依頼し、コドン最適化後、pcDNA3.1(+)ベクターに合成した。構築されたプラスミドはpcDNA3.1−hG1及びpcDNA3.1−hKを含む。プラスミドを1:1の割合でexpiCHO細胞にコトランスフェクションして一過性発現させ、回転速度110rpm、37℃、8% のCO2で4日間培養した後、32℃のシェーカーに移して引き続き8−10日間培養した。4500rpmで、25分間遠心分離し、採取したタンパク質の上澄みをProteinAアフィニティークロマトグラフィーで精製した:0.1MのNaOH溶液でAKTAクロマトグラフィーシステム及びクロマトグラフィーカラムを30 分間洗浄し、超純水できれいにすすぎ、pH7.4の20mMのリン酸ナトリウム緩衝液で10カラム体積で平衡化し、流速を2 ml/分間とし、サンプルをロードし、平衡化バッファーで10カラム体積でクロマトグラフィーカラムを洗浄し、pH3.4の50mMの酢酸緩衝液で3−5カラム体積で溶出し、溶出したタンパク質を採取し、限外濾過濃縮して抗体をpH7.0の20mMのリン酸塩緩衝液に置換して保存した。
即ち、陽性抗体可変領域配列とマウスIgG2a定常領域を組み合わせた抗体配列配列番号13及び配列番号14である。コドン最適化後、pcDNA3.1(+)ベクターに合成した。構築されたプラスミドはpcDNA3.1−mG2a及びpcDNA3.1−mKを含む。プラスミドを1:1の割合でexpiCHO細胞にコトランスフェクションして陽性抗体タンパク質を一過性発現させた。得られた上澄みタンパク質をProteinAアフィニティークロマトグラフィーで精製した:0.1MのNaOH溶液でAKTAクロマトグラフィーシステム及びクロマトグラフィーカラムを30 分間洗浄し、超純水できれいにすすぎ、pH7.4の20mMのリン酸ナトリウム緩衝液で10カラム体積で平衡化し、流速を2 ml/分間とし、サンプルをロードし、平衡化バッファーで10カラム体積でクロマトグラフィーカラムを洗浄し、pH3.4の50mMの酢酸緩衝液で3−5カラム体積で溶出し、溶出したタンパク質を採取し、限外濾過濃縮して抗体をpH7.0の20mMのリン酸塩緩衝液に置換して保存した。
1、プラスミドDNA体外一過性トランスフェクション
実施例2で増幅培養したプラスミドをHEK293T細胞(中国科学院生物化学及び細胞生物学研究所、以下上海細胞所と略す)に体外一過性トランスフェクションし、タンパク質レベルで分析した。具体的な実験ステップは以下のとおり:トランスフェクションの前日、3×105個/cm2の接種密度でHEK293T細胞を6ウェルプレートに平らに敷き、一晩培養し(培地成分:10%のウシ胎児血清DMEM培地+1%のペニシリン−ストレプトマイシン)、細胞はトランスフェクション当日、完全に壁に付着し、細胞の豊富さは70%−90%に達し(6ウェルプレートの各ウェルの大きさは9cm2であり、細胞コンフルエントは約2−2.5×106個/ウェルである)、PEI陽イオントランスフェクション試薬(sigma)又はリポソーム(Lipo3000, Thermo)を使用してDNAプラスミドと混合し、DNAプラスミドトランスフェクション複合体を調製し、細胞を加えて室温で5−20分間静置し、37℃、5%の CO2で、4−5時間インキュベートし、6ウェルプレートに血清を含む完全培地を補充し、48−72時間培養し、外来遺伝子を体外で真核細胞において一過性発現させた。
一過性トランスフェクションした後のHEK293T細胞を採取し、標的タンパク質とウサギ抗ヒトクローディン18抗体(Thermo, Cat: 700178)を室温で2時間ハイブリダイゼーションし、PBSTで3回洗浄し、アルカリ性リン酸酵素標識ヤギ抗ウサギIgG(Thermo, Cat: 31346)と室温で1時間ハイブリダイゼーションし、Western Blotで標的タンパク質の発現状況を検出した:Lipoリポソームトランスフェクションシステムを用いて、プラスミドは標的タンパク質CLDN18.2−loop1及びCLDN18.2−TM−loop1の発現に成功し、分子量はそれぞれ11KD及び14KDであり、pcDNA3.1−CLDN18.2−FLプラスミドは標的タンパク質CLDN18.2の発現に成功し、分子量の大きさは29KDであった。
1、動物免疫:
QIAGENエンドトキシンフリープラスミドマキシ抽出キット説明書に基づき、プラスミドDNA抽出調製し、これにはpcDNA3.1−loop1(以下Loop1と略す)、pcDNA3.1−TM−Loop1(以下TMLと略す)、pcDNA3.1−CpG−loop1(以下Loop1−Cと略す)が含まれる。各プラスミドは以下の表2の実験群に基づきマウス免疫を行い、但しSJLマウスは北京維通利華実験動物技術有限公司から購入し、BALB/cマウス及びC57マウスは南京市玄武区華阜康生物製品中心から購入した。免疫はZhiwei Chen等に記載の方法(Z.Chen., et al., J Clin Invest. 123(6):2629−2642(2013))を参照し、適切に修正した。具体的には以下のとおり:DNAプラスミドをインビボ遺伝子導入装置(上海塔瑞莎生物技術有限公司)により2点に分け、マウス左右後肢の筋肉にそれぞれに注射し、各点で等量のDNAプラスミドを注射し、注射体積は50μlであった。注射後、すぐに導入装置の電極でマウスの注射部位に電気パルス刺激を入力し、電圧を36Vとし、合計6回パルスした。電気パルス刺激はマウス筋肉細胞のDNAプラスミド吸収を促進し、マウスDNA免疫応答、特に体液免疫応答レベルを高めることができる。DNA免疫は2週間毎に1回注射し、合計3回免疫した。2回目及び3回目の免疫の7日後、マウス眼底静脈叢から採血し、フローサイトメトリー分析を行い、血清抗体中に明らかなCLDN18陽性シグナルが検出された時、マウスに対してHEK293−CLDN18.2細胞を抗原として採用し、5×107個/ml細胞懸濁液を調製し、100μl即ち5×106個の細胞でマウスに腹腔注射し、免疫を追加した。
マウスの2回目、3回目のDNA免疫の一週間後、それぞれマウス眼底静脈叢を採集し、免疫血清を調製した。ブロッキング溶液(2%BSAのPBS)で1:50の体積で血清を希釈した。ヒト胃癌細胞NUGC4(南京科佰生物科技有限公司)を早期蘇生させて培養し、10%ウシ胎児血清含有1640培地、37℃、5% CO2で培養した。細胞状態が良好で、成長集密度が70−80%である時、胃癌細胞消化液(斉氏生物科技有限公司)、37℃で、細胞を15分間消化処理した。完全な1640培地で消化を終了し、1000rpmで、5分間遠心分離し、上澄みを廃棄した。適量のブロッキング溶液を加え、細胞を再懸濁し、細胞密度を1×106個/mlに調節した。100μlの NUGC4細胞と100μlの希釈マウス血清を混合し、4℃で1時間インキュベートし、Cell Stain Buffer(Biolegend)で2回洗浄し、毎回1000rpmで、5分間遠心分離し、上澄みを廃棄した。100μl のPE標識ヤギ抗マウス抗体(Biolegend)を加え、4℃で1時間インキュベートし、Cell Stain Buffer(Biolegend)で2回洗浄し、毎回1000rpmで、5分間遠心分離し、上澄みを廃棄した。300μlの Cell Stain Bufferを加えて細胞を再懸濁し、フローサイトメトリー分析装置で検出した。
マウス骨髓瘤細胞懸濁液の調製:2週間前にマウス骨髓瘤細胞SP2/0を蘇生させ、10%ウシ胎児血清含有1640培地で、37℃、5%の CO2で培養、継代した。融合当日、SP2/0細胞状態を観察した。顕微鏡検査によりSP2/0細胞集密度は70%−80%であったため、細胞は対数生長期にあると判断した。300g、5分間の遠心分離によりSP2/0細胞を採取し、20mlの PBS、1000rpm、5分間で1回洗浄し、上澄みを廃棄した。適量の1640培地で再懸濁し、SP2/0細胞濃度を1×107個/mlに調節し、使用に備える。
a.CHO−K1−CLDN18.2安定細胞株の構築
1週間前にCHO−K1細胞(上海細胞所)を蘇生させ、10%ウシ胎児血清含有DME/F12完全培地で、37℃、5% のCO2で培養した。細胞をトランスフェクションしたプラスミドはpcDNA3.1−CLDN18.2−FLであった(合成配列は配列番号6を参照)。トランスフェクション当日、CHO−K1細胞の成長密度は80%−90%に達し、Biorad Gene Pulser Xcellエレクトロポレーション操作の説明に基づき、プラスミドをCHO−K1細胞にトランスフェクションし、トランスフェクションした細胞を予熱されている完全培地を有する培養皿に全部移し、37℃、5%の CO2で一晩静置して培養した。2日目、最終濃度1mg/mlのG418(Sigma)耐性を加えて3−4日間スクリーニングし、G418耐性を含む完全培地で少なくとも5回継代し、クローンが安定した後、細胞CLDN18.2の発現状況を検出した。その結果、陽性抗体IMAB362−similar−hG1(最終濃度10μg/ml)で細胞をインキュベートし、フローサイトメトリーで分析し、CHO−K1ブランク細胞と比較し、トランスフェクション細胞は5回継代した後、トランスフェクション細胞はヒトクローディン18.2を安定発現することを示した。
pLVX−CLDN18.1−ZsGreenプラスミドをテンプレートとし、プライマー配列配列番号15及び配列番号16を設計し、PrimeStar(Takara)説明書に基づきPCR系を設定し、PCR工程は98℃で30秒変性し、60℃で30秒アニーリングし、72℃で1分間伸長し、30回サイクルで増幅してCLDN18.1−FL標的遺伝子フラグメントを得た(配列番号17を参照)。BamHI及びEcoRIの両酵素で標的遺伝子及びpcDNA3.1(+)ベクターを切断し、T4連結酵素(Takara)を16℃で一晩連結した。連結した生成物をE.coli大腸菌に形質転換し、ミニ抽出キットでプラスミドpcDNA3.1−CLDN18.1を抽出する。プラスミドを上記ステップでCHO−K1細胞にエレクトロポレーションし、G418耐性培地で培養し、細胞を継代し、WesternBlotの結果、トランスフェクションした細胞は抗CLDN18抗体(Thermo)により染色されて陽性反応を呈し、FACS分析では、トランスフェクション細胞はCLDN18.2陽性抗体IMAB362−similar−hG1と10μg/mlの濃度でインキュベートした後、陰性蛍光シグナルを示した。これはトランスフェクションCLDN18.1細胞の構築が成功したことを表す。
融合後に得られた母クローンハイブリドーマ細胞に対して一次スクリーニングを行い、スクリーニング方法は以下を含む:細胞ELISA及びFACSでハイブリドーマ細胞培養の上澄みをそれぞれ検出し、その中からCLDN18陽性ハイブリドーマ母クローンがスクリーニングされる。一次スクリーニングでCLDN18陽性を示したクローンを拡大培養した後、二次スクリーニングを行い、その中からFACSでCLDN18.2陽性CLDN18.1陰性を示すハイブリドーマ母クローンがスクリーニングされる。ハイブリドーマ抗体は2回の細胞ELISA及びFACSによってスクリーニングされ、数百株の母クローン細胞から合計9株のCLDN18.2特異性抗体を分泌する母クローン細胞がスクリーニングされ、HEK293−CLDN18.2細胞と陽性結合できるが、HEK293−CLDN18.1細胞との結合は陰性であった。
1、サブクローンの培養
実施例6のスクリーニングで得られたハイブリドーマ細胞で単クローンを調製した。24ウェルプレートでハイブリドーマ細胞を再懸濁し、細胞懸濁液を調製した。1個のクローン細胞毎にカウントし、1640完全培地は細胞最終濃度を1×104個/mlに調節し、それぞれ60μlの細胞懸濁液を取り140μlの 1640完全培地を加え、合計200μlとし、均一に混合し、前日−20℃で保存した半固形培地D(StemCell)を取り出し、4℃で解凍し、37℃で1時間予熱してから使用した。2.5mlの半固形培地を取り、200μlの細胞懸濁液で十分に均一に混合し、室温で15分間静置し、均一に混合された半固形培地細胞懸濁液を6ウェル細胞培養板(Corning)に移し、接種数はウェル毎に細胞600個であり、ウェルプレートの周りに適量の滅菌水を加え、37℃、5%のCO2に置いて5−7日間培養した。ウェルプレート内の細胞が緻密な球形単クローン細胞群体に成長したら、10μlのピペットチップで吸い取り、200μl 1×HT、10%CloneEasy及び10%のウシ胎児血清を敷き詰めた1640培地に移し、細胞懸濁液を十分に混合し、37℃、5% のCO2で2−3日間培養した。
サブクローン細胞培養上澄み抗体のCLDN18.2特異性同定に採用するスクリーニング方法は、細胞ELISAにより、CLDN18.2及びCLDN18.1安定的にトランスフェクションされた細胞に対する上澄み抗体の陽性結合状況をそれぞれ検出した。具体的な実施方法は以下のとおり:
10%ウシ胎児血清含有DMEM完全培地を用いて、37℃、5% のCO2でHEK293−CLDN18.1及びHEK293−CLDN18.2細胞をそれぞれ培養した。細胞成長集密度が80%−90%に達した時、0.5mM のEDTA−PBS非トリプシン消化液で、室温で、細胞を消化し、1000rpmで、5分間遠心分離し、上澄みを廃棄した。DMEM完全培地で再懸濁し、細胞濃度を6×105個/mlに調節した。細胞を予めポリリジンでコーティングされた96ウェルプレート(Corning)に平らに敷き、各ウェル100μl、37℃、5%のCO2で24時間培養し、細胞をウェル底で均一にコンフルエントにさせた。培養上澄みを吸い捨て、4%のパラホルムアルデヒドで、室温で、細胞20分間固定し、200μl のPBSで3回、毎回2分間洗浄した。200μl の3%のBSA−PBSでウェルプレートを、37℃で、1時間ブロッキングした。サブクローン培養上澄み100μlを取り、ウェルプレートに入れ、37℃で1時間インキュベートし、PBSで5回洗浄した。ブロッキング溶液1:10000で希釈したHRP−anti mouse IgG+IgM(Jackson)を37℃で1時間インキュベートした。PBSで5回洗浄した。100μlの TMB単一成分発色溶液を加え、室温で5−10分間光を避け、2Mの硫酸で終止し、マイクロプレートリーダーOD450で読み取った。結果は表3に示されるように、ハイブリドーマ培養上澄みのCLDN18.2との結合が強い陽性サブクローン(即ちOD値が陽性対照OD値より50%高いもの)はS3F10C5、S5H3A6、S5H3B6、S5H3D6、S6F10E7、S6H9B8、S6H9C8、C40B10D9、C42B12D10及びC58B11E11を含む。これらサブクローンにおいて、S5H3A6、S5H3B6、S5H3D6、C40B10D9、C42B12D10及びC58B11E11はCLDN18.1細胞との結合が陰性であることを示した。
マウス抗体サブタイプ同定キットSBA Clonotyping System(SouthernBiotech)説明書操作手順に従って、被検サブクローン細胞培養上澄みを加えてマウス抗体のサブタイプを同定した。同定結果は以下のとおり:
サブクローンB4B10G3は、抗体重鎖定常領域サブタイプはマウスIgG2bであり、抗体軽鎖定常領域サブタイプはマウスKappa鎖である、
サブクローンS5H3B6は、抗体重鎖定常領域サブタイプはマウスIgMであり、抗体軽鎖定常領域サブタイプはマウスKappa鎖である、
サブクローンS6H9B8は、抗体重鎖定常領域サブタイプはマウスIgG3であり、抗体軽鎖定常領域サブタイプはマウスKappa鎖である、
サブクローンC58B11E11は、抗体重鎖定常領域サブタイプはマウスIgG2cであり、抗体軽鎖定常領域サブタイプはマウスKappa鎖である、
サブクローンC40B10D9は、抗体重鎖定常領域サブタイプはマウスIgMであり、抗体軽鎖定常領域サブタイプはマウスKappa鎖である、
サブクローンC42B12D10は、抗体重鎖定常領域サブタイプはマウスIgMであり、抗体軽鎖定常領域サブタイプはマウスKappa鎖である。
24ウェルプレートからモノクローナルハイブリドーマ細胞を採取し、1×106個/ml、合計1mlに調節し、1000rpmで、5分間遠心分離し、上澄みを廃棄した。QIAGEN社のRNA抽出キット(Cat:#74134)説明書操作手順に従って、細胞の全RNAのミニ抽出を行い、NanoDrop核酸定量分析装置でRNA濃度を測定する。続いて、Takara逆転写キット(Cat:#6110A)に従って、2μgの全RNAをcDNAに逆転写し、−80℃で保存し、使用に備える。cDNAをテンプレートとし、Takara社のPremixTaq酵素操作説明書に従って、抗体軽重鎖シーケンスのPCR系及びPCR装置プログラムをそれぞれセットする。PCR系で使用されるプライマーは蘇州金唯智公司により合成され、具体的なプライマー配列は以下のとおり:
重鎖シーケンスプライマーVH−Fは以下を含む:
VH−F1(プライマー配列配列番号18及び配列番号19を含む)、VH−F2(プライマー配列配列番号20、配列番号21、配列番号22、およびプライマー配列配列番号23、配列番号24、配列番号25を含む)、VH−F3(プライマー配列配列番号26)
重鎖シーケンスプライマーVH−Rは以下を含む:
VH−R1(プライマー配列配列番号27)、VH−R2(プライマー配列配列番号28)
軽鎖シーケンスプライマーVL−Fは以下を含む:
VL−F1(プライマー配列配列番号29)、VL−F2(プライマー配列配列番号30及び配列番号31を含む)、VL−F3(プライマー配列配列番号32、配列番号33、配列番号34を含む)
軽鎖シーケンスプライマーVL−Rは以下を含む:
VL−R(プライマー配列配列番号35)
PCR増幅して得られたPCR生成物を蘇州金唯智公司に委託してシーケンスし、シーケンス結果は表4を参照。
実施例9で得られたマウス由来抗体可変領域配列に基づき、ヒトIgG1定常領域をマウス抗体可変領域と組み合わせ、遺伝子合成方式によりヒトマウスキメラ抗体を構築し、さらに抗体の親和性及び抗体性質を研究した。
蘇州金唯智生物科技有限公司に委託し、キメラ抗体遺伝子を合成、最適化し、真核発現ベクターpcDNA3.1(+)に構築し、キメラ抗体をそれぞれ1CHI、3CHI、7CHI、17CHI、18CHI、19CHIと命名した。各キメラ抗体に対応する抗体可変領域配列は以下の表5に示される:
上記キメラ抗体軽重鎖遺伝子を含むプラスミドを1:1の割合でHEK293E細胞(上海細胞所)に一過性トランスフェクションした。回転速度110rpmで、37℃、8% のCO2で7日間振動培養した。4500rpmで、20分間遠心分離し、上澄みタンパク質を得て、ProteinAアフィニティークロマトグラフィーにより精製した:0.1MのNaOH溶液でAKTAクロマトグラフィーシステム及びクロマトグラフィーカラムを30 分間洗浄し、超純水できれいにすすぎ、pH7.4の20mMのリン酸ナトリウム緩衝液で10カラム体積で平衡化し、流速を2 ml/分間とし、サンプルをロードし、平衡化バッファーで10カラム体積でクロマトグラフィーカラムを洗浄し、pH3.4の50mMの酢酸緩衝液で3−5カラム体積で溶出し、溶出したタンパク質を採取し、限外濾過濃縮して抗体をpH5.55の50mMの酢酸塩緩衝液に置換して保存した。
2週間前にHEK293−CLDN18.2及びHEK293−CLDN18.1細胞を蘇生させ、10%ウシ胎児血清を含むDMEM完全培地で、37℃、5% CO2で培養した。細胞成長集密度が80%−90%に達したら、0.5mMの EDTA−PBS(Sigma)で、室温で細胞を消化し、1000rpmで、5分間遠心分離し、上澄みを廃棄した。DMEM完全培地で再懸濁し、細胞濃度を6×105個/mlに調節した。細胞を予め2.5μg/ウェルのポリリジン(Corning)でコーティングされた96ウェルプレートにそれぞれ平らに敷き詰め、各ウェル100μl、37℃、5% CO2で24時間培養し、細胞をウェル底で均一にコンフルエントにさせた。培養上澄みを吸い捨て、4%のパラホルムアルデヒドで、室温で、細胞を20分間固定し、200μl のPBSで3回、毎回2分間洗浄した。200μl の3%のBSA−PBSでウェルプレートを、37℃で、1時間ブロッキングした。3%のBSA−PBSで各キメラ抗体濃度を6μg/mlに希釈し、6倍の勾配で希釈し、7つの濃度に希釈した。同時に同じ濃度の勾配で希釈したIMAB362−similar−hG1を陽性対照とし、ヒトIgG1, kappa同型対照抗体(以下Isotypeと称す、中美冠科生物技術(太倉)有限公司から提供)を陰性対照とし、それぞれHEK293−CLDN18.2及びHEK293−CLDN18.1プレートに入れる。37℃で1時間インキュベートし、PBSで5回洗浄した。ブロッキング溶液を1:10000で希釈したHRP−anti human IgG(Jackson)を37℃で1時間インキュベートした。PBSで5回洗浄した。100μlの TMB単一成分発色溶液を加えて室温で5−10分間光を避け、50μlの 2M硫酸を加えて終止し、マイクロプレートリーダーOD450で読み取った。データ処理:オリジナルデータをGraphPad 5.0ソフトウエアに入れてプロットして計算した。結果は表6を参照。
実施例11から、親和性が陽性対照抗体と最も近いキメラ抗体3CHIを選び、体外で親和性成熟及びスクリーニングを行った。主にファージFab抗体ライブラリーを用いてCLDN18.2特異性を維持する同時に親和性を向上させる抗体をスクリーニングした。
測定実験の前日、CHO−K1−CLDN18.2(実施例5で調製した)細胞を消化し、完全培地で細胞を再懸濁し、細胞をカウントし、密度を1×105個/mlに調整し、100μl/ウェルで96ウェルプレートに接種し、37℃、5%の CO2の培養箱で一晩培養し、測定当日、フェノールレッド不含1640培地(Gibco)を37℃までインキュベートし、抗体を5倍の勾配で希釈し、CHO−K1−CLDN18.2が敷かれた96ウェルプレートを取り出し、培地を破棄し、各ウェルに25μlのフェノールレッド不含1640を加え、希釈した抗体をサンプルウェルに入れ、抗体の最終濃度をそれぞれ10μg/ml、2μg/ml、0.4μg/ml、0.08μg/ml、0.016μg/ml及び0.0032μg/mlにし、対照ウェルに等量のIMAB362−similar−hG1及びヒトIgG1同型の対照抗体(CrownBio)をそれぞれ加え、37℃、5%の CO2の培養箱で1時間インキュベートした。
実施例12において体外親和性成熟改造後の抗体330CHIをヒト化配列の最適化を行った。ヒト化配列の最適化及び抗体の物理化学性質の同定は杭州皓陽生物技術有限公司に委託して行った。ヒト化配列の最適化は免疫遺伝子データベース(IMGT)により、3CHI抗体及び330CHI抗体可変領域のマウス由来の配列ソースを確認し、相同性アラインメント により、3CHI抗体及び330CHI抗体の重鎖可変領域配列のFR領域はマウス抗体IGHV5−15*01に由来し、抗体軽鎖可変領域のFR配列はマウス抗体IGKV8−19*01に由来する。マウス抗体CDR領域とヒト由来抗体FR領域を組み換えてヒト化抗体を形成する、但し採用するヒト由来抗体軽重鎖テンプレートと対応するマウス抗体可変領域配列の類似度は65%又はそれ以上に達し、ヒト由来抗体のソースは表12を参照。最終的なヒト化抗体の名称及び配列は表13に示される。
胃癌細胞消化液でCHO−K1−CLDN18.2細胞及びCHO−K1−CLDN18.1細胞(実施例5で調製された)をそれぞれ消化処理し、37℃で、15分間消化し、完全培地で終止し、1000rpmで、5分間遠心分離し、上澄みを廃棄し、2%のウシ胎児血清−PBS希釈液で細胞を再懸濁し、細胞を1×106個/mlに調節し、96ウェルUベースプレートにウェル毎に100μlの細胞懸濁液を加え、2%のウシ胎児血清−PBSでヒト化抗体及び対照抗体をそれぞれ最終濃度10μg/ml、2μg/ml、0.4μg/ml、0.08μg/ml及び0.016μg/mlまで希釈し、同体積を細胞と均一に混合し、4℃で1時間インキュベートし、1000rpmで、5分間遠心分離し、上澄みを廃棄し、各ウェルに200μlの Cell Stain Buffer(Biolegend)を加え2回洗浄し、毎回1000rpmで、5分間遠心分離し、上澄みを廃棄し、100μlの PE−anti human Fc抗体(Biolegend)を加え、4℃で1時間インキュベートし、Cell Stain Buffer(Biolegend)で2回洗浄し、毎回1000rpmで、5分間遠心分離し、上澄みを廃棄した。300μlの Cell Stain Bufferを加えて細胞を再懸濁し、BD FACS Jazzフローサイトメトリー分析装置で検出した。
別の方法は、上記ヒト化抗体のタンパク質レベルにおける親和性を検証し、AHCセンサを選択して抗体を固定化し、異なる濃度の抗原と結合させ、Octet RED96の操作説明書に従って親和性測定を行った。結果は表15に示されるように、ヒト化抗体 Hu330−1が37℃のときCLDN18.2タンパク質と結合した平衡解離定数(KD)は5.26nMであり、陽性対照に比べ、その抗体親和性は顕著に約18倍向上した。
CHO−K1−CLDN18.2細胞(実施例5で調製された)をターゲット細胞とし、細胞密度を1×105個/mlに調節し、100μl/ウェルで96ウェルプレートに接種し、37℃、5%の CO2培養箱で一晩培養し、ヒト化抗体を5倍の勾配で希釈し、抗体の最終濃度をそれぞれ10μg/ml、2μg/ml、0.4μg/ml、0.08μg/ml、0.016μg/ml及び0.0032μg/mlとし、対照ウェルに等量のIMAB362−similar−hG1及び 330CHIのキメラ抗体を加え、37℃、5% CO2の培養箱で1時間インキュベートし、エフェクター細胞Jurkat−CD16A/NFをエフェクター/ターゲット比20:1の割合で、各ウェルに2×105個のエフェクター細胞を入れ、200gで、2分間遠心分離し、エフェクター・ターゲット細胞を十分に接触させ、37℃、5% のCO2の培養箱で5−6時間インキュベートし、Bio−Turboホタルルシフェラーゼアッセイキットでウェルプレート蛍光シグナルを検出し、測定結果は表16に示される。
ヒト末梢血からPBMC細胞を単離し、同体積の2%のウシ胎児血清を含むPBSを加えて血液サンプルを希釈し、50mlの遠心分離管に15mlの Lymphoprep密度勾配遠心分離液(StemCell)を加え、それから希釈した血液サンプルを加え、遠心分離機のブレーキをオフにし、室温で、1200g、10分間遠心分離した。遠心分離後、白膜層が見え、その中に濃縮されたPBMC細胞が含まれ、白膜層を吸い取り、新しい遠心分離管に移し、赤血球溶解液(Sigma)の操作説明書に従って、室温で赤血球を溶解し、2mMの EDTA及び2%のウシ胎児血清を含むPBSで2回洗浄し、室温で、400g、10分間遠心分離し、上澄みを廃棄し、5%のウシ胎児血清を含む1640完全培地で細胞を再懸濁し、PBMC濃度を3×106個/mlに調節し、次に、ヒト胃癌細胞NUGC4をターゲット細胞とし、ヒト胃癌組織由来細胞消化液で処理し、1000rpmで、5分間遠心分離し、細胞を採集し、上澄みを廃棄し、細胞を1.5×105個/mlに調節し、E−Plate 96ウェルプレートの各ウェルに100μlの細胞懸濁液を加え、37℃、5%の CO2で培養し、24時間超えた後、1640培地で希釈した抗体を加え、抗体最終濃度を2μg/mlとし、37℃、5%の CO2で1時間インキュベートし、エフェクター細胞PBMCをエフェクター/ターゲット比20:1の割合で、各ウェルに3×105個のエフェクター細胞を加え、200g、2分間遠心分離し、エフェクター・ターゲット細胞を十分に接触させ、37℃、5% CO2の培養箱で21時間インキュベート・殺傷し、RTCA検出装置により腫瘍細胞の96ウェルプレートにおける抵抗値(Cell Index、CI)をリアルタイムに記録し、式cell death%=[(対照群CI−実験群CI)/対照群CI]×100%により、ヒト化抗体腫瘍殺傷パーセンテージを計算した。
Hu330−1ヒト化抗体可変領域配列と5個のアミノ酸部位変異を含むIgG1定常領域配列を組み合わせ、Fc変異型ヒト化抗体 Hu330−1−5M(配列は表14を参照)を構築発現し、当該Fc変異を含む陽性抗体5Mを別途構築し(配列は表17を参照)、Fc段の対照とした。
1、ルシフェラーゼ標識によるFc変異のヒト化抗体の体外ADCC活性の測定:
CHO−K1−CLDN18.2細胞(実施例5で調製された)をターゲット細胞とし、細胞密度を1×105個/mlに調節し、100μl/ウェルで96ウェルプレートに接種し、37℃、5% のCO2の培養箱で一晩培養し、抗体を5倍の勾配で希釈し、最終濃度をそれぞれ10μg/ml、2μg/ml、0.4μg/ml、0.08μg/ml、0.016μg/ml及び0.0032μg/mlとし、37℃、5%の CO2で1時間インキュベートし、エフェクター細胞Jurkat−CD16A/NFをエフェクター/ターゲット比20:1の割合で、各ウェルプレートに2×105個のエフェクター細胞を加え、200gで2分間遠心分離し、エフェクター・ターゲット細胞を十分に接触させ、37℃、5% CO2の培養箱で5−6時間インキュベートし、Bio−Turboホタルルシフェラーゼアッセイキットでウェルプレート蛍光シグナルを検出し、結果は表19に示される。
ヒト末梢血からPBMC細胞を単離してエフェクター細胞とし、同体積の2%のウシ胎児血清を含むPBSを加えて血液サンプルを希釈し、50mlの遠心分離管に15mlの Lymphoprep密度勾配遠心分離液(StemCell)を加え、それから希釈した血液サンプルを加え、遠心分離機のブレーキをオフにし、室温で、1200g、10分間遠心分離した。遠心分離後、白膜層が見え、その中に濃縮されたPBMC細胞が含まれ、白膜層を吸い取り、新しい遠心分離管に移し、赤血球溶解液(Sigma)の操作説明書に従って、室温で赤血球を溶解し、2mM のEDTA及び2%ウシ胎児血清を含むPBSで2回洗浄し、室温で、400g、10分間遠心分離し、上澄みを廃棄し、熱不活化血清で2%のウシ胎児血清を含む1640(以下熱不活化培地を称す)を調製し、細胞を再懸濁し、PBMC濃度を3×106個/mlに調節し、ヒト胃癌細胞NUGC4をターゲット細胞とし、ヒト胃癌組織由来細胞消化液で処理し、1000rpmで、5分間遠心分離し、細胞を採集し、上澄みを廃棄し、細胞を1.5×105個/mlに調節し、96ウェルプレートの各ウェルに100μlの細胞懸濁液を加え、37℃、5% CO2で24時間培養し、培地を吸い捨て、熱不活化培地で希釈した抗体を加え、抗体最終濃度をそれぞれ10μg/ml、2μg/ml、0.4μg/ml、0.08μg/ml、0.016μg/ml及び0.0032μg/mlとし、37℃、5% CO2で1時間インキュベートし、エフェクター細胞PBMCをエフェクター/ターゲット比20:1の割合で、各ウェルに3×105個のエフェクター細胞を加え、200gで、2分間遠心分離し、エフェクター・ターゲット細胞を十分に接触させ、37℃、5% CO2の培養箱で22時間インキュベート・殺傷した。インキュベート終了時、LDHキット(東仁化学科技(上海)有限公司)説明書の手順に従って、ウェルプレートにWST基質試薬を加え、光を避けて20−30分間発色させ、OD450nm値を測定し、オリジナルデータを式cell death%=(実験群吸收値−ターゲット細胞自発値−エフェクター細胞値)/(ターゲット細胞最大値−ターゲット細胞自発値)×100%に入れ、実験群及びすべての対照群吸收値=当該群吸收値−バックグラウンド 値であり、結果は表20に示される。
Hu330−1ヒト化抗体可変領域配列と5個のアミノ酸部位変異を含むIgG1定常領域配列を組み合わせ、Fc変異型ヒト化抗体 Hu330−1−5M(配列は表17を参照)を構築発現し、当該Fc変異を含む陽性抗体5Mを別途構築し(配列は表17を参照)、Fc段の対照とした。
Claims (16)
- 重鎖可変領域及び軽鎖可変領域を含む抗クローディン18.2抗体又はその抗原結合フラグメントであって、
(1)前記重鎖可変領域はHCDR1、HCDR2及びHCDR3を含み、但し
(a1)前記HCDR1のアミノ酸配列は配列番号101、配列番号102、配列番号103及びそれらと少なくとも85%の配列同一性を有するアミノ酸配列から選択され、
(a2)前記HCDR2のアミノ酸配列は配列番号104、配列番号105及びそれらと少なくとも85%の配列同一性を有するアミノ酸配列から選択され、
(a3)前記HCDR3のアミノ酸配列は配列番号106、配列番号107及びそれらと少なくとも85%の配列同一性を有するアミノ酸配列から選択され、及び
(2)前記軽鎖可変領域はLCDR1、LCDR2及びLCDR3を含み、但し
(a4)前記LCDR1のアミノ酸配列は配列番号108であり、
(a5)前記LCDR2のアミノ酸配列は配列番号109、配列番号110、配列番号111及びそれらと少なくとも85%の配列同一性を有するアミノ酸配列から選択され、
(a6)前記LCDR3のアミノ酸配列は配列番号112、配列番号113、配列番号114、配列番号115、配列番号116及びそれらと少なくとも85%の配列同一性を有するアミノ酸配列から選択される、
抗クローディン18.2抗体又はその抗原結合フラグメント。 - (1)前記重鎖可変領域は配列番号101で示されるアミノ酸配列のHCDR1、配列番号105で示されるアミノ酸配列のHCDR2及び配列番号106で示されるアミノ酸配列のHCDR3を含み、及び
(2)前記軽鎖可変領域は配列番号108で示されるアミノ酸配列のLCDR1、配列番号111で示されるアミノ酸配列のLCDR2及び配列番号115で示されるアミノ酸配列のLCDR3を含む、
請求項1に記載の抗クローディン18.2抗体又はその抗原結合フラグメント。 - 前記抗体はマウス由来抗体、キメラ抗体又はヒト化抗体である、請求項1又は2に記載の抗クローディン18.2抗体又はその抗原結合フラグメント。
- (1)前記重鎖可変領域のアミノ酸配列は、
(b1)配列番号50、配列番号72、配列番号74、配列番号77、配列番号79、配列番号82、配列番号88で示されるアミノ酸配列、
(b2)(b1)で示されるアミノ酸配列において1又は複数個のアミノ酸が置換、欠失又は付加され、且つ(b1)で示されるアミノ酸配列と機能が同一又は類似するアミノ酸配列、及び
(b3)(b1)で示されるアミノ酸配列と少なくとも80%の配列同一性を有するアミノ酸配列から選択され、及び
(2)前記軽鎖可変領域のアミノ酸配列は、
(b4)配列番号51、配列番号70、配列番号71、配列番号73、配列番号75、配列番号76、配列番号78、配列番号80、配列番号81、配列番号84、配列番号86、配列番号90で示されるアミノ酸配列、
(b5)(b4)で示されるアミノ酸配列において1又は複数個のアミノ酸が置換、欠失又は付加され、且つ(b4)で示されるアミノ酸配列と機能が同一又は類似するアミノ酸配列、及び
(b6)(b4)で示されるアミノ酸配列と少なくとも80%の配列同一性を有するアミノ酸配列から選択される、
請求項1〜3のいずれか一項に記載の抗クローディン18.2抗体又はその抗原結合フラグメント。 - 前記重鎖可変領域のアミノ酸配列は配列番号79、配列番号79において1又は複数個のアミノ酸が置換、欠失又は付加され且つ配列番号79と機能が同一のアミノ酸配列又は配列番号79と少なくとも85%の配列同一性を有するアミノ酸配列であり、且つ前記軽鎖可変領域のアミノ酸配列は配列番号81、配列番号81において1又は複数個のアミノ酸が置換、欠失又は付加され且つ配列番号81と機能が同一のアミノ酸配列又は配列番号81と少なくとも85%の配列同一性を有するアミノ酸配列である、請求項4に記載の抗クローディン18.2抗体又はその抗原結合フラグメント。
- (1)前記重鎖可変領域のアミノ酸配列は、
(c1)配列番号82、配列番号88で示されるアミノ酸配列、
(c2)(c1)で示されるアミノ酸配列において1又は複数個のアミノ酸が置換、欠失又は付加され、且つ(c1)で示されるアミノ酸配列と機能が同一又は類似するアミノ酸配列、及び
(c3)(c1)で示されるアミノ酸配列と少なくとも80%の配列同一性を有するアミノ酸配列から選択され、及び
(2)前記軽鎖可変領域のアミノ酸配列は、
(c4)配列番号84、配列番号86、配列番号90で示されるアミノ酸配列、
(c5)(c4)で示されるアミノ酸配列において1又は複数個のアミノ酸が置換、欠失又は付加され、且つ(c4)で示されるアミノ酸配列と機能が同一又は類似するアミノ酸配列、及び
(c6)(c4)で示されるアミノ酸配列と少なくとも80%の配列同一性を有するアミノ酸配列から選択される、
請求項4に記載の抗クローディン18.2抗体又はその抗原結合フラグメント。 - 前記重鎖可変領域のアミノ酸配列は配列番号82、配列番号82において1又は複数個のアミノ酸が置換、欠失又は付加され且つ配列番号82と機能が同一のアミノ酸配列又は配列番号82と少なくとも85%の配列同一性を有するアミノ酸配列であり、且つ前記軽鎖可変領域のアミノ酸配列は配列番号84、配列番号84において1又は複数個のアミノ酸が置換、欠失又は付加され且つ配列番号84と機能が同一のアミノ酸配列又は配列番号84と少なくとも85%の配列同一性を有するアミノ酸配列であり、
前記重鎖可変領域のアミノ酸配列は配列番号82、配列番号82において1又は複数個のアミノ酸が置換、欠失又は付加され且つ配列番号82と機能が同一のアミノ酸配列又は配列番号82と少なくとも85%の配列同一性を有するアミノ酸配列であり、且つ前記軽鎖可変領域のアミノ酸配列は配列番号86、配列番号86において1又は複数個のアミノ酸が置換、欠失又は付加され且つ配列番号86と機能が同一のアミノ酸配列又は配列番号86と少なくとも85%の配列同一性を有するアミノ酸配列であり、
前記重鎖可変領域のアミノ酸配列は配列番号88、配列番号88において1又は複数個のアミノ酸が置換、欠失又は付加され且つ配列番号88と機能が同一のアミノ酸配列又は配列番号88と少なくとも85%の配列同一性を有するアミノ酸配列であり、且つ前記軽鎖可変領域のアミノ酸配列は配列番号84、配列番号84において1又は複数個のアミノ酸が置換、欠失又は付加され且つ配列番号84と機能が同一のアミノ酸配列又は配列番号84と少なくとも85%の配列同一性を有するアミノ酸配列であり、
前記重鎖可変領域のアミノ酸配列は配列番号88、配列番号88において1又は複数個のアミノ酸が置換、欠失又は付加され且つ配列番号88と機能が同一のアミノ酸配列又は配列番号88と少なくとも85%の配列同一性を有するアミノ酸配列であり、且つ前記軽鎖可変領域のアミノ酸配列は配列番号86、配列番号86において1又は複数個のアミノ酸が置換、欠失又は付加され且つ配列番号86と機能が同一のアミノ酸配列又は配列番号86と少なくとも85%の配列同一性を有するアミノ酸配列であり、
前記重鎖可変領域のアミノ酸配列は配列番号82、配列番号82において1又は複数個のアミノ酸が置換、欠失又は付加され且つ配列番号82と機能が同一のアミノ酸配列又は配列番号82と少なくとも85%の配列同一性を有するアミノ酸配列であり、且つ前記軽鎖可変領域のアミノ酸配列は配列番号90、配列番号90において1又は複数個のアミノ酸が置換、欠失又は付加され且つ配列番号90と機能が同一のアミノ酸配列又は配列番号90と少なくとも85%の配列同一性を有するアミノ酸配列であり、又は
前記重鎖可変領域のアミノ酸配列は配列番号88、配列番号88において1又は複数個のアミノ酸が置換、欠失又は付加され且つ配列番号88と機能が同一のアミノ酸配列又は配列番号88と少なくとも85%の配列同一性を有するアミノ酸配列であり、且つ前記軽鎖可変領域のアミノ酸配列は配列番号90、配列番号90において1又は複数個のアミノ酸が置換、欠失又は付加され且つ配列番号90と機能が同一のアミノ酸配列又は配列番号90と少なくとも85%の配列同一性を有するアミノ酸配列である、
請求項6に記載の抗クローディン18.2抗体又はその抗原結合フラグメント。 - 前記重鎖アミノ酸配列は配列番号92、配列番号92において1又は複数個のアミノ酸が置換、欠失又は付加され且つ配列番号92と機能が同一のアミノ酸配列又は配列番号92と少なくとも85%の配列同一性を有するアミノ酸配列であり、且つ前記軽鎖アミノ酸配列は配列番号94、配列番号94において1又は複数個のアミノ酸が置換、欠失又は付加され且つ配列番号94と機能が同一のアミノ酸配列又は配列番号94と少なくとも85%の配列同一性を有するアミノ酸配列であり、又は
前記重鎖アミノ酸配列は配列番号96、配列番号96において1又は複数個のアミノ酸が置換、欠失又は付加され且つ配列番号96と機能が同一のアミノ酸配列又は配列番号96と少なくとも85%の配列同一性を有するアミノ酸配列であり、且つ前記軽鎖アミノ酸配列は配列番号98、配列番号98において1又は複数個のアミノ酸が置換、欠失又は付加され且つ配列番号98と機能が同一のアミノ酸配列又は配列番号98と少なくとも85%の配列同一性を有するアミノ酸配列である、請求項7に記載の抗クローディン18.2抗体又はその抗原結合フラグメント。 - 請求項1〜8のいずれか一項に記載の抗クローディン18.2抗体又はその抗原結合フラグメントをコードする単離されたヌクレオチド。
- (1) 前記重鎖アミノ酸配列をコードするヌクレオチド配列は配列番号93又は配列番号97で示され、及び
(2) 前記軽鎖アミノ酸配列をコードするヌクレオチド配列は配列番号95又は配列番号99で示される、
請求項9に記載のヌクレオチド。 - 請求項9又は10に記載のヌクレオチドを含む発現ベクター。
- 原核細胞及び真核細胞から選択され、好ましくは哺乳類細胞である、請求項11に記載の発現ベクターで形質転換された宿主細胞。
- 請求項1〜8のいずれか一項に記載の抗クローディン18.2抗体又はその抗原結合フラグメントを調製する方法であって、請求項12に記載の宿主細胞において抗体を発現させるステップ、および宿主細胞から前記抗体を単離するステップを含む、方法。
- 請求項1〜8のいずれか一項に記載の抗クローディン18.2抗体又はその抗原結合フラグメント及び薬学的に許容される担体を含む医薬組成物。
- クローディン18.2を標的とする医薬を製造するための、請求項1〜8のいずれか一項に記載の抗クローディン18.2抗体又はその抗原結合フラグメントの使用。
- 前記クローディン18.2を標的とする医薬は胃癌、食道癌、膵臓癌、肺癌、卵巣癌、結腸癌、肝臓癌、頭頚部癌及び胆嚢癌の治療に使用される、請求項15に記載の使用。
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