TW202023613A - 一種抗Claudin18_2抗體及其應用 - Google Patents

一種抗Claudin18_2抗體及其應用 Download PDF

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Abstract

本發明涉及抗體藥物技術領域，具體涉及一種抗Claudin18.2抗體或其抗原結合片段，包含抗Claudin18.2抗體或其抗原結合片段的藥物組合物以及它們的應用。所述抗體與Claudin18.2具有顯著的結合活性和親和力，同時對腫瘤細胞具有高效的體外ADCC殺傷活性，可在製備抗腫瘤的藥物中應用，具有廣闊的市場前景。

Description

一種抗Claudin18_2抗體及其應用
本發明涉及抗體藥物技術領域，具體涉及一種抗Claudin18.2抗體或其抗原結合片段，包含抗Claudin18.2抗體或其抗原結合片段的藥物組合物以及它們的應用。
胃癌是全球發病率第五高的癌症類型，其致死率更是達到第三高。目前，化療是晚期或復發性胃癌的標準一線治療。90%以上癌症病人會接受普通的化療和靶向化療，但化療一般不能治癒癌症，只能延長患者生存期和改善生活質量，而且易產生抗藥性。生物靶向治療，通常以腫瘤特異性抗原或腫瘤相關抗原為靶點，依賴抗體對靶點的結合或阻斷從而引發機體免疫反應，選擇性殺傷腫瘤而不波及周圍正常細胞和組織。靶向治療特異性強，副反應少，療效確切。
然而由於惡性腫瘤異質性，不同癌症表現出不一致的分子生物學特性。尤其對於胃癌，其異質程度較高，以往開發的針對胃癌的生物靶向治療藥物，作為單藥使用基本無效或對極少部分患者有效。究其原因是這些單抗藥物所針對的靶點僅在胃癌患者中特定亞型中表現。典型的例如曲妥珠單抗（Trastuzumab），其結合化療有好的療效，但只能適用於僅占所有胃癌患者15%的HER2陽性個體。
緊密連接蛋白（Claudins）是決定細胞間緊密連接結構的最重要的骨架蛋白，其參與黏附連接，並且在腫瘤細胞的轉移和侵襲中起到重要作用。Claudin蛋白廣泛存在於哺乳動物上皮和內皮細胞中，其分佈主要是上皮細胞側面以及基底細胞質膜上。
不同的Claudin蛋白在不同組織中具有各自特異性表現，其中Claudin18（CLDN18）基因定位於3q22.3，分子量24kDa，包含261個氨基酸殘基，屬Claudins超家族成員，其蛋白結構包含2個細胞外環和4個穿膜區。人CLDN18蛋白的兩個亞型分別是CLDN18.1（NM_016369.3）和CLDN18.2（NM_001002026.2），在二者蛋白的一級結構序列中，僅N端信號肽至細胞外環1（Loop1）結構的某些位置的氨基酸殘基上有所區別，尤其是在細胞外環1上，CLDN18.1和CLDN18.2僅8個氨基酸不同。此外，CLDN18的兩種亞型蛋白的種屬間序列同源性也非常高。其中CLDN18.2的細胞外環1在人、小鼠、獼猴等不同物種上序列完全一致，而人與小鼠的CLDN18.2蛋白同源性達到84%，表明CLDN18.2蛋白序列極端保守性（O.Tureci., et al., Gene 481: 83-92, 2011）。
CLDN18的兩種亞型蛋白，分別在不同組織表現和發揮生理學功能。CLDN18.1組成性表現於正常的肺組織細胞；而CLDN18.2蛋白表現於正常胃上皮細胞膜，在除胃以外的各種組織中均不表現或極低表現。Salin等（U. Salin., et al., Clin Cancer Res 14(23): 7624-34, 2008）應用RT-PCR和免疫組化方法檢測包括胃癌、胰腺癌、食管癌等多種癌症組織為CLDN18.2陽性，總體表現陽性率達62.7%。另有研究顯示，正常胃壁細胞表現的CLDN18.2蛋白具有均一的糖基化修飾，細胞間結構緻密。而胃癌細胞間結構鬆散，細胞易侵襲轉移，其上表現的CLDN18.2蛋白糖基化不完全，可能導致靶點暴露（WO2004/047863）。因此，CLDN18.2可能是理想的腫瘤相關抗原靶點。
目前，安斯泰來公司（Astellas Pharma Inc.）開發了以人Claudin18.2為靶點的單株抗體藥物Zolbetuximab（又名IMAB362）在臨床療效顯著。Ⅱ期臨床試驗顯示（S.Batran. et al., Journal of Clinical Oncology 34 (no.18_suppl), 2016），單抗藥物與化藥聯合治療晚期或復發性胃癌，其患者中位生存期13.2個月，顯著長於僅用化療的8.4個月。初步證實靶向CLDN18.2的特異性抗體可以明顯改善晚期胃、胃食管結合部腺癌患者的無進展生存期和總生存期。
WO2004/047863描述一種人鼠嵌合單株抗體的製備是全球首個針對人Claudin18.2靶點開發的治療性抗體（以下簡稱抗CLDN18.2抗體）。該專利申請所述抗體主要透過抗體依賴的細胞介導的細胞毒作用（Antibody-dependent cell-mediated cytotoxicity, ADCC）途徑特異性殺傷CLDN18.2陽性腫瘤細胞。然而，該專利申請所述抗體與腫瘤細胞之間的特異性識別和殺傷，主要依賴於CLDN18.2靶點在腫瘤細胞上表現豐度，當細胞表面高表CLDN18.2，才體現出較明顯的結合和殺傷活性。這說明有必要製備一種高親和力單株抗體，提高其選擇性殺傷腫瘤細胞的能力。
基於以上現有技術，本發明現提供一種高效的CLDN18.2抗體或其抗原結合片段，其具有優異的抗腫瘤活性。
本發明一方面提供一種抗CLDN18.2抗體或其抗原結合片段，其包含重鏈可變區和/或輕鏈可變區，其中所述重鏈可變區包含重鏈可變區的互補決定區1（HCDR1）、重鏈可變區的互補決定區2（HCDR2）和/或重鏈可變區的互補決定區3（HCDR3），所述輕鏈可變區包含輕鏈可變區的互補決定區1（LCDR1）、輕鏈可變區的互補決定區2（LCDR2）和/或輕鏈可變區的互補決定區3（LCDR3）。
在一些實施方案中，本發明提供一種抗CLDN18.2抗體或其抗原結合片段，其包含重鏈可變區和輕鏈可變區，其中： （1）所述重鏈可變區包含HCDR1、HCDR2和HCDR3： （a1）所述HCDR1的氨基酸序列選自SEQ ID NO 101、SEQ ID NO 102、SEQ ID NO 103和與它們具有至少85%序列同一性的氨基酸序列； （a2）所述HCDR2的氨基酸序列選自SEQ ID NO 104、SEQ ID NO 105和與它們具有至少85%序列同一性的氨基酸序列； （a3）所述HCDR3的氨基酸序列選自SEQ ID NO 106、SEQ ID NO 107和與它們具有至少85%序列同一性的氨基酸序列；和 （2）所述輕鏈可變區包含LCDR1、LCDR2和LCDR3，其中： （a4）所述LCDR1的氨基酸序列為SEQ ID NO 108； （a5）所述LCDR2的氨基酸序列選自SEQ ID NO 109、SEQ ID NO 110、SEQ ID NO 111和與它們具有至少85%序列同一性的氨基酸序列； （a6）所述LCDR3的氨基酸序列選自SEQ ID NO 112、SEQ ID NO 113、SEQ ID NO 114、SEQ ID NO 115、SEQ ID NO 116和與它們具有至少85%序列同一性的氨基酸序列。
在一個具體的實施方案中，本發明提供一種抗CLDN18.2抗體或其抗原結合片段，其具有所述HCDR1、HCDR2和HCDR3分別為SEQ ID NO 101、105和106或與SEQ ID NO 101、105和106所示的氨基酸序列具有至少85%序列同一性的CDR的重鏈可變區，和所述LCDR1、LCDR2和LCDR3分別為SEQ ID NO 108、111和115或與SEQ ID NO 108、111和115所示的氨基酸序列具有至少85%序列同一性的CDR的輕鏈可變區。
在一些具體的實施方案中，根據本發明的抗CLDN18.2抗體或其抗原結合片段是單株抗體或其抗原結合片段。
在一些具體的實施方案中，根據本發明的抗CLDN18.2抗體或其抗原結合片段是鼠源抗體或其抗原結合片段、嵌合抗體或其抗原結合片段或人源化抗體或其抗原結合片段。
在一些具體的實施方案中，本發明提供一種抗CLDN18.2抗體或其抗原結合片段，其包含重鏈可變區和輕鏈可變區，其中 （1）所述重鏈可變區的氨基酸序列選自： （b1）如SEQ ID NO 50、SEQ ID NO 72、SEQ ID NO 74、SEQ ID NO 77、SEQ ID NO 79所示的氨基酸序列； （b2）（b1）所示的氨基酸序列經取代、缺失或添加一個或多個氨基酸獲得的、且與（b1）所示的氨基酸序列功能相同或相似的氨基酸序列；和 （b3）與（b1）所示的氨基酸序列具有至少80%序列同一性的氨基酸序列；和 （2）所述輕鏈可變區的氨基酸序列選自： （b4）如SEQ ID NO 51、SEQ ID NO 70、SEQ ID NO 71、SEQ ID NO 73、SEQ ID NO 75、SEQ ID NO 76、SEQ ID NO 78、SEQ ID NO 80、SEQ ID NO 81所示的氨基酸序列； （b5）（b4）所示的氨基酸序列經取代、缺失或添加一個或多個氨基酸獲得的、且與（b4）所示的氨基酸序列功能相同或相似的氨基酸序列；和 （b6）與（b4）所示的氨基酸序列具有至少80%序列同一性的氨基酸序列。
在一些具體的實施方案中，本發明提供一種抗CLDN18.2抗體或其抗原結合片段，其中所述重鏈可變區的氨基酸序列為SEQ ID NO:50，SEQ ID NO:50經取代、缺失或添加一個或多個氨基酸獲得的且與SEQ ID NO:50功能相同的氨基酸序列或與SEQ ID NO:50具有至少85%序列同一性的氨基酸序列，且所述輕鏈可變區的氨基酸序列為SEQ ID NO:51，SEQ ID NO:51經取代、缺失或添加一個或多個氨基酸獲得的且與SEQ ID NO:51功能相同的氨基酸序列或與SEQ ID NO:51具有至少85%序列同一性的氨基酸序列。
在一些具體的實施方案中，本發明提供一種抗CLDN18.2抗體或其抗原結合片段，其中所述重鏈可變區的氨基酸序列為SEQ ID NO:50，SEQ ID NO:50經取代、缺失或添加一個或多個氨基酸獲得的且與SEQ ID NO:50功能相同的氨基酸序列或與SEQ ID NO:50具有至少85%序列同一性的氨基酸序列，且所述輕鏈可變區的氨基酸序列為SEQ ID NO:70，SEQ ID NO:70經取代、缺失或添加一個或多個氨基酸獲得的且與SEQ ID NO:70功能相同的氨基酸序列或與SEQ ID NO:70具有至少85%序列同一性的氨基酸序列。
在一些具體的實施方案中，本發明提供一種抗CLDN18.2抗體或其抗原結合片段，其中所述重鏈可變區的氨基酸序列為SEQ ID NO:50，SEQ ID NO:50經取代、缺失或添加一個或多個氨基酸獲得的且與SEQ ID NO:50功能相同的氨基酸序列或與SEQ ID NO:50具有至少85%序列同一性的氨基酸序列，且所述輕鏈可變區的氨基酸序列為SEQ ID NO:71，SEQ ID NO:71經取代、缺失或添加一個或多個氨基酸獲得的且與SEQ ID NO:71功能相同的氨基酸序列或與SEQ ID NO:71具有至少85%序列同一性的氨基酸序列。
在一些具體的實施方案中，本發明提供一種抗CLDN18.2抗體或其抗原結合片段，其中所述重鏈可變區的氨基酸序列為SEQ ID NO:72，SEQ ID NO:72經取代、缺失或添加一個或多個氨基酸獲得的且與SEQ ID NO:72功能相同的氨基酸序列或與SEQ ID NO:72具有至少85%序列同一性的氨基酸序列，且所述輕鏈可變區的氨基酸序列為SEQ ID NO:73，SEQ ID NO:73經取代、缺失或添加一個或多個氨基酸獲得的且與SEQ ID NO:73功能相同的氨基酸序列或與SEQ ID NO:73具有至少85%序列同一性的氨基酸序列。
在一些具體的實施方案中，本發明提供一種抗CLDN18.2抗體或其抗原結合片段，其中所述重鏈可變區的氨基酸序列為SEQ ID NO:74，SEQ ID NO:74經取代、缺失或添加一個或多個氨基酸獲得的且與SEQ ID NO:74功能相同的氨基酸序列或與SEQ ID NO:74具有至少85%序列同一性的氨基酸序列，且所述輕鏈可變區的氨基酸序列為SEQ ID NO:75，SEQ ID NO:75經取代、缺失或添加一個或多個氨基酸獲得的且與SEQ ID NO:75功能相同的氨基酸序列或與SEQ ID NO:75具有至少85%序列同一性的氨基酸序列。
在一些具體的實施方案中，本發明提供一種抗CLDN18.2抗體或其抗原結合片段，其中所述重鏈可變區的氨基酸序列為SEQ ID NO:50，SEQ ID NO:50經取代、缺失或添加一個或多個氨基酸獲得的且與SEQ ID NO:50功能相同的氨基酸序列或與SEQ ID NO:50具有至少85%序列同一性的氨基酸序列，且所述輕鏈可變區的氨基酸序列為SEQ ID NO:76，SEQ ID NO:76經取代、缺失或添加一個或多個氨基酸獲得的且與SEQ ID NO:76功能相同的氨基酸序列或與SEQ ID NO:76具有至少85%序列同一性的氨基酸序列。
在一些具體的實施方案中，本發明提供一種抗CLDN18.2抗體或其抗原結合片段，其中所述重鏈可變區的氨基酸序列為SEQ ID NO:77，SEQ ID NO:77經取代、缺失或添加一個或多個氨基酸獲得的且與SEQ ID NO:77功能相同的氨基酸序列或與SEQ ID NO:77具有至少85%序列同一性的氨基酸序列，且所述輕鏈可變區的氨基酸序列為SEQ ID NO:78，SEQ ID NO: 78經取代、缺失或添加一個或多個氨基酸獲得的且與SEQ ID NO: 78功能相同的氨基酸序列或與SEQ ID NO: 78具有至少85%序列同一性的氨基酸序列。
在一些具體的實施方案中，本發明提供一種抗CLDN18.2抗體或其抗原結合片段，其中所述重鏈可變區的氨基酸序列為SEQ ID NO:74，SEQ ID NO:74經取代、缺失或添加一個或多個氨基酸獲得的且與SEQ ID NO:74功能相同的氨基酸序列或與SEQ ID NO:74具有至少85%序列同一性的氨基酸序列，且所述輕鏈可變區的氨基酸序列為SEQ ID NO:70，SEQ ID NO:70經取代、缺失或添加一個或多個氨基酸獲得的且與SEQ ID NO:70功能相同的氨基酸序列或與SEQ ID NO:70具有至少85%序列同一性的氨基酸序列。
在一些具體的實施方案中，本發明提供一種抗CLDN18.2抗體或其抗原結合片段，其中所述重鏈可變區的氨基酸序列為SEQ ID NO:74，SEQ ID NO:74經取代、缺失或添加一個或多個氨基酸獲得的且與SEQ ID NO:74功能相同的氨基酸序列或與SEQ ID NO:74具有至少85%序列同一性的氨基酸序列，且所述輕鏈可變區的氨基酸序列為SEQ ID NO:71，SEQ ID NO:71經取代、缺失或添加一個或多個氨基酸獲得的且與SEQ ID NO:71功能相同的氨基酸序列或與SEQ ID NO:71具有至少85%序列同一性的氨基酸序列。
在一些具體的實施方案中，本發明提供一種抗CLDN18.2抗體或其抗原結合片段，其中所述重鏈可變區的氨基酸序列為SEQ ID NO:74，SEQ ID NO:74經取代、缺失或添加一個或多個氨基酸獲得的且與SEQ ID NO:74功能相同的氨基酸序列或與SEQ ID NO:74具有至少85%序列同一性的氨基酸序列，且所述輕鏈可變區的氨基酸序列為SEQ ID NO:76，SEQ ID NO:76經取代、缺失或添加一個或多個氨基酸獲得的且與SEQ ID NO:76功能相同的氨基酸序列或與SEQ ID NO:76具有至少85%序列同一性的氨基酸序列。
在一些具體的實施方案中，本發明提供一種抗CLDN18.2抗體或其抗原結合片段，其中所述重鏈可變區的氨基酸序列為SEQ ID NO:72，SEQ ID NO:72經取代、缺失或添加一個或多個氨基酸獲得的且與SEQ ID NO:72功能相同的氨基酸序列或與SEQ ID NO:72具有至少85%序列同一性的氨基酸序列，且所述輕鏈可變區的氨基酸序列為SEQ ID NO:76，SEQ ID NO: 76經取代、缺失或添加一個或多個氨基酸獲得的且與SEQ ID NO: 76功能相同的氨基酸序列或與SEQ ID NO: 76具有至少85%序列同一性的氨基酸序列。
在一些具體的實施方案中，本發明提供一種抗CLDN18.2抗體或其抗原結合片段，其中所述重鏈可變區的氨基酸序列為SEQ ID NO:77，SEQ ID NO:77經取代、缺失或添加一個或多個氨基酸獲得的且與SEQ ID NO:77功能相同的氨基酸序列或與SEQ ID NO:77具有至少85%序列同一性的氨基酸序列，且所述輕鏈可變區的氨基酸序列為SEQ ID NO:70，SEQ ID NO: 70經取代、缺失或添加一個或多個氨基酸獲得的且與SEQ ID NO: 70功能相同的氨基酸序列或與SEQ ID NO: 70具有至少85%序列同一性的氨基酸序列。
在一些具體的實施方案中，本發明提供一種抗CLDN18.2抗體或其抗原結合片段，其中所述重鏈可變區的氨基酸序列為SEQ ID NO:77，SEQ ID NO:77經取代、缺失或添加一個或多個氨基酸獲得的且與SEQ ID NO:77功能相同的氨基酸序列或與SEQ ID NO:77具有至少85%序列同一性的氨基酸序列，且所述輕鏈可變區的氨基酸序列為SEQ ID NO:76，SEQ ID NO:76經取代、缺失或添加一個或多個氨基酸獲得的且與SEQ ID NO:76功能相同的氨基酸序列或與SEQ ID NO:76具有至少85%序列同一性的氨基酸序列。
在一些具體的實施方案中，本發明提供一種抗CLDN18.2抗體或其抗原結合片段，其中所述重鏈可變區的氨基酸序列為SEQ ID NO:79，SEQ ID NO:79經取代、缺失或添加一個或多個氨基酸獲得的且與SEQ ID NO:79功能相同的氨基酸序列或與SEQ ID NO:79具有至少85%序列同一性的氨基酸序列，且所述輕鏈可變區的氨基酸序列為SEQ ID NO:70，SEQ ID NO: 70經取代、缺失或添加一個或多個氨基酸獲得的且與SEQ ID NO: 70功能相同的氨基酸序列或與SEQ ID NO: 70具有至少85%序列同一性的氨基酸序列。
在一些具體的實施方案中，本發明提供一種抗CLDN18.2抗體或其抗原結合片段，其中所述重鏈可變區的氨基酸序列為SEQ ID NO:79，SEQ ID NO:79經取代、缺失或添加一個或多個氨基酸獲得的且與SEQ ID NO:79功能相同的氨基酸序列或與SEQ ID NO:79具有至少85%序列同一性的氨基酸序列，且所述輕鏈可變區的氨基酸序列為SEQ ID NO:76，SEQ ID NO: 76經取代、缺失或添加一個或多個氨基酸獲得的且與SEQ ID NO: 76功能相同的氨基酸序列或與SEQ ID NO: 76具有至少85%序列同一性的氨基酸序列。
在一些具體的實施方案中，本發明提供一種抗CLDN18.2抗體或其抗原結合片段，其中所述重鏈可變區的氨基酸序列為SEQ ID NO:50，SEQ ID NO: 50經取代、缺失或添加一個或多個氨基酸獲得的且與SEQ ID NO: 50功能相同的氨基酸序列或與SEQ ID NO: 50具有至少85%序列同一性的氨基酸序列，且所述輕鏈可變區的氨基酸序列為SEQ ID NO:80，SEQ ID NO:80經取代、缺失或添加一個或多個氨基酸獲得的且與SEQ ID NO:80功能相同的氨基酸序列或與SEQ ID NO:80具有至少85%序列同一性的氨基酸序列。
在一些具體的實施方案中，本發明提供一種抗CLDN18.2抗體或其抗原結合片段，其中所述重鏈可變區的氨基酸序列為SEQ ID NO:50，SEQ ID NO: 50經取代、缺失或添加一個或多個氨基酸獲得的且與SEQ ID NO: 50功能相同的氨基酸序列或與SEQ ID NO: 50具有至少85%序列同一性的氨基酸序列，且所述輕鏈可變區的氨基酸序列為SEQ ID NO:81，SEQ ID NO:81經取代、缺失或添加一個或多個氨基酸獲得的且與SEQ ID NO:81功能相同的氨基酸序列或與SEQ ID NO:81具有至少85%序列同一性的氨基酸序列。
在一些具體的實施方案中，本發明提供一種抗CLDN18.2抗體或其抗原結合片段，其中所述重鏈可變區的氨基酸序列為SEQ ID NO:79，SEQ ID NO:79經取代、缺失或添加一個或多個氨基酸獲得的且與SEQ ID NO:79功能相同的氨基酸序列或與SEQ ID NO:79具有至少85%序列同一性的氨基酸序列，且所述輕鏈可變區的氨基酸序列為SEQ ID NO:80，SEQ ID NO:80經取代、缺失或添加一個或多個氨基酸獲得的且與SEQ ID NO:80功能相同的氨基酸序列或與SEQ ID NO:80具有至少85%序列同一性的氨基酸序列。
在一些具體的實施方案中，本發明提供一種抗CLDN18.2抗體或其抗原結合片段，其中所述重鏈可變區的氨基酸序列為SEQ ID NO:79，SEQ ID NO:79經取代、缺失或添加一個或多個氨基酸獲得的且與SEQ ID NO:79功能相同的氨基酸序列或與SEQ ID NO:79具有至少85%序列同一性的氨基酸序列，且所述輕鏈可變區的氨基酸序列為SEQ ID NO:81，SEQ ID NO:81經取代、缺失或添加一個或多個氨基酸獲得的且與SEQ ID NO:81功能相同的氨基酸序列或與SEQ ID NO:81具有至少85%序列同一性的氨基酸序列。
在一些具體的實施方案中，本發明提供一種抗CLDN18.2抗體或其抗原結合片段，其中所述抗體還含有人源的IgG1或其變體的重鏈恆定區，人源的kappa鏈或其變體的輕鏈恆定區。
在一些具體的實施方案中，本發明提供一種抗CLDN18.2抗體或其抗原結合片段，對氨基酸序列如SEQ ID NO 79所示的重鏈可變區作如下氨基酸替換： （c1）K3Q、L19R、R42G、P45L、A49S、E73D、T78S、E82Q、S84N、S88A、M93V、A118S，替換後的氨基酸序列如SEQ ID NO 82所示； （c2）K3Q、V5L、L19R、R42G、P45L、A49S、E73D、A75S、E82Q、S8N、S88A、M93V、A118S，替換後的氨基酸序列如SEQ ID NO 88所示。
且對氨基酸序列如SEQ ID NO 81所示的輕鏈可變區作如下氨基酸替換： （c3）D1E、S9P、S10T、T12S、V13L、T14S、A15P、K18R、K21L、P49A、K51L、G63S、V64I、D66A、T69S、V84L、A86P、A106Q、L112I，替換後的氨基酸序列如SEQ ID NO 84所示； （c4）S9D、T12A、T14S、A15L、K18R、V19A、M21I、S22N、T69S、V84L、L89V、A106Q、L112I，替換後的氨基酸序列如SEQ ID NO 86所示； （c5）A9L、T12P、A15L、E17Q、K18P、V19A、T20S、M21I、K45R、P49S、K51R、T69S、T80K、S83R、Q85E、L89V、A90G、A106Q、L112I，替換後的氨基酸序列如SEQ ID NO 90所示。
在一些具體的實施方案中，本發明提供一種抗CLDN18.2抗體或其抗原結合片段，其中： （1）所述重鏈可變區的氨基酸序列選自： （c1）如SEQ ID NO 82、SEQ ID NO 88所示的氨基酸序列； （c2）（c1）所示的氨基酸序列經取代、缺失或添加一個或多個氨基酸獲得的、且與（c1）所示的氨基酸序列功能相同或相似的氨基酸序列；和 （c3）與（c1）所示的氨基酸序列具有至少80%序列同一性的氨基酸序列；和 （2）所述輕鏈可變區的氨基酸序列選自： （c4）SEQ ID NO 84、SEQ ID NO 86、SEQ ID NO 90所示的氨基酸序列； （c5）（c4）所示的氨基酸序列經取代、缺失或添加一個或多個氨基酸獲得的、且與（c4）所示的氨基酸序列功能相同或相似的氨基酸序列；和 （c6）與（c4）所示的氨基酸序列具有至少80%序列同一性的氨基酸序列。
在一些具體的實施方案中，本發明提供一種抗CLDN18.2抗體或其抗原結合片段，所述重鏈可變區的氨基酸序列為SEQ ID NO 82，SEQ ID NO 82經取代、缺失或添加一個或多個氨基酸獲得的且與SEQ ID NO 82功能相同的氨基酸序列或與SEQ ID NO 82具有至少85%序列同一性的氨基酸序列，且所述輕鏈可變區的氨基酸序列為SEQ ID NO 84，SEQ ID NO 84經取代、缺失或添加一個或多個氨基酸獲得的且與SEQ ID NO 84功能相同的氨基酸序列或與SEQ ID NO 84具有至少85%序列同一性的氨基酸序列。
在一些具體的實施方案中，本發明提供一種抗CLDN18.2抗體或其抗原結合片段，所述重鏈可變區的氨基酸序列為SEQ ID NO 82，SEQ ID NO 82經取代、缺失或添加一個或多個氨基酸獲得的且與SEQ ID NO 82功能相同的氨基酸序列或與SEQ ID NO 82具有至少85%序列同一性的氨基酸序列，且所述輕鏈可變區的氨基酸序列為SEQ ID NO 86，SEQ ID NO 86經取代、缺失或添加一個或多個氨基酸獲得的且與SEQ ID NO 86功能相同的氨基酸序列或與SEQ ID NO 86具有至少85%序列同一性的氨基酸序列。
在一些具體的實施方案中，本發明提供一種抗CLDN18.2抗體或其抗原結合片段，所述重鏈可變區的氨基酸序列為SEQ ID NO 88，SEQ ID NO 88經取代、缺失或添加一個或多個氨基酸獲得的且與SEQ ID NO 88功能相同的氨基酸序列或與SEQ ID NO 88具有至少85%序列同一性的氨基酸序列，且所述輕鏈可變區的氨基酸序列為SEQ ID NO 84，SEQ ID NO 84經取代、缺失或添加一個或多個氨基酸獲得的且與SEQ ID NO 84功能相同的氨基酸序列或與SEQ ID NO 84具有至少85%序列同一性的氨基酸序列。
在一些具體的實施方案中，本發明提供一種抗CLDN18.2抗體或其抗原結合片段，所述重鏈可變區的氨基酸序列為SEQ ID NO 88，SEQ ID NO 88經取代、缺失或添加一個或多個氨基酸獲得的且與SEQ ID NO 88功能相同的氨基酸序列或與SEQ ID NO 88具有至少85%序列同一性的氨基酸序列，且所述輕鏈可變區的氨基酸序列為SEQ ID NO 86，SEQ ID NO 86經取代、缺失或添加一個或多個氨基酸獲得的且與SEQ ID NO 86功能相同的氨基酸序列或與SEQ ID NO 86具有至少85%序列同一性的氨基酸序列。
在一些具體的實施方案中，本發明提供一種抗CLDN18.2抗體或其抗原結合片段，所述重鏈可變區的氨基酸序列為SEQ ID NO 82，SEQ ID NO 82經取代、缺失或添加一個或多個氨基酸獲得的且與SEQ ID NO 82功能相同的氨基酸序列或與SEQ ID NO 82具有至少85%序列同一性的氨基酸序列，且所述輕鏈可變區的氨基酸序列為SEQ ID NO 90，SEQ ID NO 90經取代、缺失或添加一個或多個氨基酸獲得的且與SEQ ID NO 90功能相同的氨基酸序列或與SEQ ID NO 90具有至少85%序列同一性的氨基酸序列。
在一些具體的實施方案中，本發明提供一種抗CLDN18.2抗體或其抗原結合片段，所述重鏈可變區的氨基酸序列為SEQ ID NO 88 SEQ ID NO 88經取代、缺失或添加一個或多個氨基酸獲得的且與SEQ ID NO 88功能相同的氨基酸序列或與SEQ ID NO 88具有至少85%序列同一性的氨基酸序列，且所述輕鏈可變區的氨基酸序列為SEQ ID NO 90，SEQ ID NO 90經取代、缺失或添加一個或多個氨基酸獲得的且與SEQ ID NO 90功能相同的氨基酸序列或與SEQ ID NO 90具有至少85%序列同一性的氨基酸序列。
在一些具體的實施方案中，本發明提供一種抗CLDN18.2抗體或其抗原結合片段，其包含重鏈氨基酸序列為SEQ ID NO 92，SEQ ID NO 92經取代、缺失或添加一個或多個氨基酸獲得的且與SEQ ID NO 92功能相同的氨基酸序列或與SEQ ID NO 92具有至少85%序列同一性的氨基酸序列，且輕鏈氨基酸序列為SEQ ID NO 94，SEQ ID NO 94經取代、缺失或添加一個或多個氨基酸獲得的且與SEQ ID NO 94功能相同的氨基酸序列或與SEQ ID NO 94具有至少85%序列同一性的氨基酸序列。
在一些具體的實施方案中，本發明提供一種抗CLDN18.2抗體或其抗原結合片段，其包含重鏈氨基酸序列為SEQ ID NO 96，SEQ ID NO 96經取代、缺失或添加一個或多個氨基酸獲得的且與SEQ ID NO 96功能相同的氨基酸序列或與SEQ ID NO 96具有至少85%序列同一性的氨基酸序列，且輕鏈氨基酸序列為SEQ ID NO 98，SEQ ID NO 98經取代、缺失或添加一個或多個氨基酸獲得的且與SEQ ID NO 98功能相同的氨基酸序列或與SEQ ID NO 98具有至少85%序列同一性的氨基酸序列。
本發明的另一方面提供一種分離的核苷酸，其編碼本發明的抗CLDN18.2抗體或其抗原結合片段。
在一些具體的實施方案中，本發明提供了編碼本發明的抗CLDN18.2抗體或其抗原結合片段的核苷酸序列，其中， (1) 編碼所述重鏈氨基酸序列的核苷酸序列如SEQ ID NO 93或SEQ ID NO 97所示； (2) 編碼所述輕鏈氨基酸序列的核苷酸序列如SEQ ID NO 95或SEQ ID NO 99所示。
在一些具體的實施方案中，本發明提供了編碼本發明的抗CLDN18.2抗體或其抗原結合片段的核苷酸序列，其中， (1) 編碼所述重鏈氨基酸序列SEQ ID NO 92的核苷酸序列如SEQ ID NO 93所示；和 (2) 編碼所述輕鏈氨基酸序列SEQ ID NO 94的核苷酸序列如SEQ ID NO 95所示。
在一些具體的實施方案中，本發明提供了編碼本發明的抗CLDN18.2抗體或其抗原結合片段的核苷酸序列，其中， (1) 編碼所述重鏈氨基酸序列SEQ ID NO 96的核苷酸序列如SEQ ID NO 97所示；和 (2) 編碼所述輕鏈氨基酸序列SEQ ID NO 98的核苷酸序列如SEQ ID NO 99所示。
本發明的另一方面提供一種表現載體，其表現本發明的抗CLDN18.2抗體或其抗原結合片段。根據本發明的表現載體其包含本發明的分離的核苷酸分子。
本發明的另一方面提供一種如上所述的表現載體轉化的宿主細胞。
在一些實施方案中，根據本發明的宿主細胞選自原核細胞和真核細胞。在一些實施方案中，所述的宿主細胞為細菌，較佳為大腸桿菌。在另一個較佳的實施方案中，所述的宿主細胞為哺乳動物細胞。
本發明的另一方面提供製備本發明的抗CLDN18.2抗體或其抗原結合片段的方法，包括在所述宿主細胞中表現抗體以及從宿主細胞中分離所述抗體的步驟。
本發明的另一方面提供一種藥物組合物，其包含本發明的抗CLDN18.2人源化抗體或其抗原結合片段和藥學可接受的載體。在一些實施方案中，本發明提供藥物組合物，其包含本發明的抗CLDN18.2人源化抗體或其抗原結合片段，還包含其他活性組分，如其他抗體、靶向藥物等。在一些實施方案中，所述藥學可接受的載體選自抗氧化劑、多肽、蛋白質、親水性聚合物、氨基酸、糖、螯合劑、糖醇、離子和表面活性劑。在一個具體的實施方案中，所述藥學可接受的載體為緩衝水溶液。在另一個具體的實施方案中，所述藥學可接受的載體為脂質體的形式。
可以將本發明的抗CLDN18.2人源化抗體或其抗原結合片段與藥學上可接受的載體、稀釋劑或賦形劑混合製備成藥物製劑，以適合於經口或胃腸外給藥。給藥方法包括，但不限於經口、皮內、肌內、腹膜內、靜脈內、腦內、眼內、氣管內、皮下、鼻內途徑。所述製劑可以透過任何途徑施用，例如透過輸注或推注，透過經上皮或皮膚黏膜(例如口腔黏膜或直腸等)吸收的途徑施用。給藥可以是全身的或局部的。所述製劑可透過本領域已知的方法製備，且包含藥物製劑領域常規使用的載體、稀釋劑或賦形劑。
本發明的另一方面提供靶向CLDN18.2治療的方法，所述方法包括向有此需要的個體施用本發明的抗CLDN18.2抗體或其抗原結合片段或本發明的藥物組合物。
本發明的另一方面提供本發明的抗CLDN18.2抗體或其抗原結合片段或本發明的藥物組合物在製備靶向CLDN18.2的藥物中的應用。在一些實施方案中，所述靶向CLDN18.2的藥物用於治療胃癌、食管癌、胰腺癌、肺癌、卵巢癌、結腸癌、肝癌、頭頸癌和膽囊癌。在一些實施方案中，本發明提供上述抗CLDN18.2抗體或其抗原結合片段或本發明的藥物組合物在製備抗腫瘤的藥物中的應用，較佳地，所述腫瘤選自胃癌、食管癌、胰腺癌、肺癌、卵巢癌、結腸癌、肝癌、頭頸癌和膽囊癌。
本發明提供的抗CLDN18.2抗體或其抗原結合片段具有顯著的抗腫瘤作用，親和力高，體外ADCC殺傷腫瘤細胞的能力強，具有顯著的技術優勢。
定義：
除非另有定義，本文中使用的科學和技術術語的含義是本領域技術人員所通常理解的含義。本文中所述的細胞和組織培養、分子生物學以及蛋白質和寡或多核苷酸化學及雜交中使用的命名和技術是本領域公知且普遍使用的。對於重組DNA、寡核苷酸合成和組織培養與轉化(如電穿孔、脂質轉染)，使用了標準技術。酶促反應和純化技術根據生產商的說明書或本領域普遍使用或本文所述的方法進行。前述技術和方法通常根據本領域公知且本說明書中引用和討論的多部綜合和較具體的文獻中描述的那樣使用。參見例如Sambrook等，Molecular Cloning: A Laboratory Manual) (第2版，Cold Spring Harbor Laboratory Press，紐約冷泉港(1989))。本文所述的分析化學、合成有機化學以及醫學和藥學化學中使用的命名以及實驗室方法和技術是本領域公知且普遍使用的。
在本發明中，術語「至少80%序列同一性」是指至少80%，81%，82%，83%，84%，85%，86%，87%，88%，89%，90%，91%，92%，93%，94%，95%，96%，97%，98%，99%，100%的序列同一性。在本發明中，術語「至少85%序列同一性」是指至少85%，86%，87%，88%，89%，90%，91%，92%，93%，94%，95%，96%，97%，98%，99%，100%的序列同一性。在一些較佳的實施方案中，本發明所述的序列同一性可以至少為90%，91%，92%，93%，94%，95%，96%，97%，98%，99%，100%。兩個序列之間的序列比較和同一性百分比測定可以透過National Center For Biotechnology Instutute網站上的BLASTN/BLASTP算法來進行。
在抗體分子中，輕鏈的三個高變區和重鏈的三個高變區在三維空間中以相對彼此的位置排列以形成抗原結合表面。抗原結合表面與所結合抗原的三維表面互補，且每條重鏈和輕鏈的三個高變區均被稱作「互補決定區」或「CDR」。氨基酸向每個結構域的分配是根據Kabat《免疫學感興趣的蛋白質的序列》(國立衛生研究院，馬裡蘭州貝塞斯達(1987和1991))或Chothia和Lesk，J.Mol.Biol.196:901-917(1987)，Chothia等，Nature 342:878-883(1989)定義。
本發明所述的「抗原結合片段」是指具有抗原結合活性的Fab片段、Fab’片段、F(ab’)2片段及與人Claudin18.2結合的Fv片段、scFv片段。Fv片段含有抗體重鏈可變區和輕鏈可變區，但沒有恆定區，並具有全部抗原結合位點的最小抗體片段。一般地，Fv抗體還包含在VH和VL結構域之間的多肽接頭，且能夠形成抗原結合所需的結構。也可以用不同的連接物將兩個抗體可變區連接成一條多肽鏈，稱為單鏈抗體或單鏈Fv (scFv)。
本發明所述的抗體指免疫球蛋白分子或其免疫活性部分，即包含特異性結合抗原(與其免疫反應)的抗原結合位點的分子。「特異性結合」指抗體與抗原的一種或多種抗原決定簇反應而不與其他多肽反應或以很低的親和性(Kd>10-6)結合其他多肽。抗體包括但不限於多複製、單複製、嵌合、dAb(結構域抗體)、單鏈、Fab、Fab’和F(ab’)2片段、Fv、scFv及Fab表現文庫。單株抗體（mAb）是由單一的複製細胞株得到的抗體，所述的細胞株不限於真核的、原核的或噬菌體的複製細胞株。單株抗體或抗原結合片段可以用如雜交瘤技術、重組技術、噬菌體展示技術及合成技術如CDR grafting或其它現有技術進行重組得到。
本發明所述的「鼠源抗體」為根據本領域知識和技能製備的對人CLDN18.2的單株抗體。製備時用CLDN18.2抗原注射試驗對象，然後分離表現具有所需序列或功能特性的抗體的雜交瘤。
本發明所述的「嵌合抗體」是將鼠源性抗體的可變區與人抗體的恆定區融合而成的抗體，可以減輕鼠源性抗體誘發的免疫應答反應。建立嵌合抗體，要先建立分泌鼠源性特異性單抗的雜交瘤，然後從小鼠雜交瘤細胞中複製可變區基因，再根據需要複製人抗體的恆定區基因，將小鼠可變區基因與人恆定區基因連接成嵌合基因後插入表現載體中，最後在真核工業系統或原核工業系統中表現嵌合抗體分子。
本發明所述的「人源化抗體」也稱為CDR移植抗體，是將小鼠的CDR序列移植到人的抗體可變區框架（FR）中產生的抗體。此類可變區框架序列可以從公共的DNA數據庫或公開的參考文獻獲得，例如從ImMunoGeneTics （IMGT）網站http://imgt.cines.fr得到或從免疫球蛋白雜誌，2001ISBN012441351上獲得。
下面代表性的實施例是為了更好地說明本發明，而非用於限制本發明的保護範圍。以下實施例中未注明條件的實驗方法通常按照常規條件，如冷泉港的抗體技術實驗手冊、分子複製手冊等，或按照原料或商品製造廠商所建議的條件進行。實施例中使用的材料、試劑如無特殊說明均為商購獲得。
實施例1  陽性對照抗體的製備
1、陽性對照抗體IMAB362-similar-hG1的製備：
根據專利申請WO2007/059997提供的175D10複製(IMAB362)抗體序列(即本公開中的SEQ ID NO 11和SEQ ID NO 12)，委託南京金斯瑞生物科技有限公司進行密碼子優化後合成在pcDNA3.1(+)載體中。構建質體包括pcDNA3.1-hG1和pcDNA3.1-hK。將質體按1:1比例共轉染expiCHO細胞瞬時表現，轉速110rpm，37℃，8% CO2 培養4天后，轉移到32℃搖床中繼續培養8-10天。4500rpm，25分鐘離心，收穫蛋白上清經ProteinA親和層析純化：0.1M NaOH溶液清洗AKTA層析系統及層析柱30 min，超純水沖洗乾淨；pH7.4的20mM磷酸鈉緩衝液平衡10個柱體積；設定流速2 ml/min，上樣；平衡液清洗層析柱10個柱體積；pH3.4的50mM醋酸緩衝液洗脫3-5個柱體積，收集洗脫蛋白；超濾濃縮將抗體置換於pH7.0的20mM磷酸鹽緩衝液中保存。
SDS-PAGE凝膠電泳結果顯示：陽性抗體IMAB362-similar-hG1的分子量約155KD，SDS-PAGE純度大於90%。
2、鼠源陽性對照抗體IMAB362-similar-mG2a的製備：
即陽性抗體可變區序列與小鼠IgG2a恆定區組合的抗體序列SEQ ID NO 13和SEQ ID NO14。密碼子優化後合成在pcDNA3.1(+)載體中。構建質體包括pcDNA3.1-mG2a和pcDNA3.1-mK。將質體按1:1比例共轉染expiCHO細胞瞬時表現陽性抗體蛋白。收穫的上清蛋白經ProteinA親和層析純化：0.1M NaOH 溶液清洗AKTA層析系統及層析柱30 min，超純水沖洗乾淨；pH7.4的20mM磷酸鈉緩衝液平衡10個柱體積；設定流速2 ml/min，上樣；平衡液清洗層析柱10個柱體積；pH3.4的50mM醋酸緩衝液洗脫3-5個柱體積，收集洗脫蛋白；超濾濃縮將抗體置換於pH7.0的20mM磷酸鹽緩衝液中保存。
SDS-PAGE凝膠電泳結果顯示：陽性抗體IMAB362-similar-mG2a的非還原電泳顯示蛋白分子量約155KD，SDS-PAGE純度大於90%。
實施例2  CLDN18.2抗原基因合成及表現載體構建
表現人CLDN18.2抗原的融合蛋白序列設計如下表1所示： 表1  CLDN18.2序列設計
序號 序列名稱 序列含義 氨基酸序列 核苷酸序列
1 18A2-loop1 編碼CLDN18.2細胞外環1的序列 SEQ ID NO 2 SEQ ID NO 1
2 18A2-TM-Loop1 編碼包含CLDN18.2穿膜區的細胞外環1的序列  SEQ ID NO 4 SEQ ID NO 3
3 CpG 未甲基化的胞嘧啶鳥嘌呤二核苷酸回文序列   SEQ ID NO 5
4 CLDN18.2-FL 編碼人CLDN18.2全長蛋白序列 SEQ ID NO 8 SEQ ID NO 6 SEQ ID NO 7
5 CLDN18.1-FL 編碼人CLDN18.1全長蛋白序列 SEQ ID NO 10 SEQ ID NO 9
上述設計的人CLDN18.2抗原的融合蛋白序列進行真核密碼子優化，並在基因5’端加入Not I等酶切位點及tPA信號肽序列，在基因3’端加入Xho I等酶切位點以及Myc-His融合蛋白標簽。合成上述SEQ ID NO 1、3、5、6序列並構建到pcDNA3.1(+)載體中，獲得表現人CLDN18.2抗原的DNA質體。質體包括：pcDNA3.1-loop1、pcDNA3.1-TML、pcDNA3.1-CpG-loop1以及pcDNA3.1-CLDN18.2-FL。
上述SEQ ID NO 7、9序列由寶生物工程（大連）有限公司（以下簡稱：寶生物公司）優化後合成，構建到慢病毒載體pLVX-NS-ZsGreen上（寶生物公司）。所構建慢病毒質體pLVX-CLDN18.2-ZsGreen及pLVX-CLDN18.1-ZsGreen用於進一步構建HEK293-CLDN18.2融合綠色熒光蛋白穩定表現細胞株，以及構建HEK293-CLDN18.1融合綠色熒光蛋白穩定表現細胞株。
將擴增培養的質體用於酶切鑒定，鑒定結果顯示酶切目的條帶與預期大小一致，表明構建正確。
實施例3  CLDN18.2抗原蛋白的表現
1、質體DNA體外瞬時轉染
將實施例2中擴增培養的質體透過體外瞬間轉染HEK293T細胞（中國科學院生物化學與細胞生物學研究所，以下簡稱上海細胞所），在蛋白程度鑒定。具體實驗步驟如下：轉染前一天，按3×105 個/cm2 的接種密度將HEK293T細胞平鋪在六孔盤中，培養（培養基成分：10%胎牛血清DMEM培養基+1%青黴素-鏈黴素）過夜，使細胞在轉染當日完全貼壁，並使細胞豐度達70%-90%（六孔盤每孔大小為9cm2 ，細胞長滿約2-2.5×106 個/孔）；使用PEI陽離子轉染試劑（sigma）或脂質體（Lipo3000, Thermo）與DNA質體混合，製備DNA質體轉染複合物，加入細胞室溫靜置5-20分鐘，37℃，5% CO2 孵育4-5小時；向六孔盤中補加含血清的完全培養基，培養48-72小時，使外源基因在體外真核細胞瞬時表現。
2、WesternBlot免疫印跡雜交
收集瞬時轉染後的HEK293T細胞，將目的蛋白與兔抗人Claudin18抗體（Thermo, Cat: 700178）室溫雜交，2小時；PBST洗滌3次，鹼性磷酸酶標記的山羊抗兔IgG（Thermo, Cat: 31346）室溫雜交，1小時；Western Blot免疫印跡鑒定目的蛋白表現情況：使用Lipo脂質體轉染系統，質體可成功表現目的蛋白CLDN18.2-loop1和CLDN18.2-TM-loop1，分子量分別為11KD和14KD，pcDNA3.1-CLDN18.2-FL質體成功表現目的蛋白CLDN18.2，分子量大小29KD。
實施例4 小鼠雜交瘤的製備
1、動物免疫：
按QIAGEN無內毒素質體大量提取試劑盒說明書提取製備質體DNA，包括pcDNA3.1-loop1（以下簡稱Loop1）、pcDNA3.1-TM-Loop1（以下簡稱TML）、pcDNA3.1-CpG-loop1（以下簡稱Loop1-C）。各質體按照如下表2實驗分組進行小鼠免疫，其中SJL小鼠購自北京維通利華實驗動物技術有限公司，BALB/c小鼠和C57小鼠購自南京市玄武區華阜康生物製品中心。免疫參考Zhiwei Chen等描述的方法（Z.Chen., et al., J Clin Invest. 123(6):2629-2642(2013)），並進行了適當的修改，具體如下：DNA質體透過活體基因導入儀（上海塔瑞莎生物技術有限公司）分兩點分別注射小鼠左右後肢肌肉，每點注射等量DNA質體，注射體積50µl。注射後立即用導入儀的電極向小鼠注射位點處輸入電脈衝刺激，電壓設置36V，共脈衝6次。電脈衝刺激可以促進小鼠肌肉細胞吸收DNA質體並提高小鼠DNA免疫應答尤其是體液免疫應答程度。DNA免疫每2周注射一次，共免疫三次。在第2次及第3次免疫7天后，小鼠眼底靜脈叢采血進行流式分析，當檢測到血清抗體中明顯的CLDN18陽性信號時，則對小鼠採用HEK293-CLDN18.2細胞作為抗原，製備成5×107 個/ml細胞懸液，小鼠腹腔注射100µl即5×106 個細胞加強免疫。
表2 小鼠免疫分組
分組 小鼠種類 小鼠只數 DNA初免 細胞加強免疫
第0周 第2周 第4周
1 BALB/c，雌性，SPF級，6-8周 3 Loop1, 50µg/只 脾細胞融合前3-4天，腹腔注射HEK293-CLDN18.2細胞5×106 個/只
2 3 Loop1-C, 50µg/只
3 3 TML, 50µg/只
4 SJL，雌性，SPF級，4-6周 3 Loop1, 100µg/只
5 4 Loop1-C, 100µg/只
6 3 TML,100µg/只
7 C57，雌性，SPF級，6-8周 3 Loop1, 25µg/只
8 3 Loop1-C, 25µg/只
9 3 TML, 25µg/只
2、FACS檢測免疫血清：
小鼠第二次、第三次DNA免疫後一周，分別採集小鼠眼底靜脈叢血，製備免疫血清。封閉液（2%BSA的PBS）按1:50體積稀釋血清。提前復甦並培養人胃癌細胞NUGC4（南京科佰生物科技有限公司），含10%胎牛血清的1640培養基培養，37℃，5% CO2 。當細胞狀態良好，生長匯合度在70-80%時，使用胃癌細胞消化液（齊氏生物科技有限公司）消化處理細胞，37℃，15分鐘。完全1640培養基終止消化，1000rpm，5分鐘離心，棄上清。加入適量的封閉液重懸細胞，調節細胞密度至1×106 個/ml。將100µl NUGC4細胞與100µl稀釋的小鼠血清混合，4℃孵育，1小時；Cell Stain Buffer（Biolegend）洗滌2次，每次1000rpm，5分鐘離心，棄上清。加入100µl PE標記的山羊抗鼠抗體（Biolegend），4℃孵育，1小時；Cell Stain Buffer（Biolegend）洗滌2次，每次1000rpm，5分鐘離心，棄上清。加入300µl Cell Stain Buffer重懸細胞，以流式分析儀檢測。
DNA免疫第2次後，編號#0103小鼠即檢測到明顯陽性信號偏移，表明該號小鼠產生抗CLDN18特異性抗體反應。而DNA免疫第3次後，所有小鼠都檢測到陽性信號，其中編號#0101、#0102、#0103、#0203、#0301，#0303小鼠CLDN18陽性率大於50%，顯示第三次DNA免疫後這些小鼠體內產生明顯抗體免疫應答，血清中存在較高程度的抗CLDN18抗體。
3、小鼠雜交瘤細胞的製備：
製備小鼠骨髓瘤細胞懸液：提前兩周復甦小鼠骨髓瘤細胞SP2/0，用含10%胎牛血清的1640培養基37℃，5% CO2 培養、傳代。融合當天，觀察SP2/0細胞狀態。鏡檢SP2/0細胞匯合度70%-80%，由此判斷細胞處於對數生長期。300g，5分鐘離心收集SP2/0細胞，用20ml PBS洗滌1次，1000rpm，5min，棄上清；用適量的1640培養基重懸，調節SP2/0細胞濃度至1×107 個/ml，待用。
製備小鼠飼養層細胞懸液：融合前一天，拉頸處死20只周齡在10-12周的健康Balb/c小鼠，無菌手術剪打開小鼠腹部皮膚，先在腹部橫剪一小口，再縱向向胸部剪開，使小鼠腹部暴露。收集腹腔巨噬細胞：先用酒精棉球消毒小鼠腹部，再用注射器往小鼠腹腔注射5ml的1640基礎培養基，輕柔按摩小鼠腹部5分鐘，然後用注射器回吸腹腔的液體。重複一次，注射3ml 1640基礎培養基後回吸（或者剪開腹膜後，再用巴氏吸管回吸剩下的巨噬細胞）。將收集的巨噬細胞離心1500rpm，10min，棄上清，用10ml（含10%胎牛血清的1640培養基）重懸細胞，待用。
製備小鼠脾淋巴細胞懸液：細胞加強免疫後第3-4天，取免疫小鼠脾細胞與SP2/0融合。小鼠拉頸處死，無菌剪開腹膜，取出脾臟並剝去周圍結締組織。研磨小鼠脾細胞後70µm篩網過濾至事先裝有15ml 1640培養基的50ml離心管中，製備單細胞懸液；1500rpm，5min，1640培養基洗滌，棄上清；加入4ml紅細胞裂解液（Sigma）裂解紅細胞約2min；加入等體積1640培養基至，1500rpm,5min離心，棄上層紅細胞層；用20ml PBS重懸，洗滌2次，1500rpm,5min離心。第2次洗滌後，用15ml PBS重懸細胞，此時如果有結塊的結締組織殘留，可以將細胞全部過篩，轉移到新的50ml離心管；對脾淋巴細胞計數，用適量的1640培養基重懸，調節脾細胞至1×107 個/ml。
取1×108 個脾細胞按1:1比例與SP2/0細胞混合，1500rpm，5分鐘離心，棄上清。用BTX電融合緩衝液重懸混勻，按照BTX電融合儀說明書步驟進行電融合操作。將融合後的細胞室溫靜置30分鐘，向其中加入含有1×HAT，10%胎牛血清的1640選擇培養基中，再加入事先製備的飼養層細胞懸液，鋪96孔盤共200塊，37℃，5% CO2 培養5-7天。其後使用含1×HT的培養基換液培養融合後的雜交瘤細胞複製。
實施例5 陽性細胞株的製備
a.構建CHO-K1-CLDN18.2穩定細胞株
提前一周復甦CHO-K1細胞（上海細胞所），用含10%胎牛血清的DME/F12完全培養基，37℃，5% CO2 培養。轉染細胞的質體為pcDNA3.1-CLDN18.2-FL（合成序列見SEQ ID NO 6）。轉染當天，CHO-K1細胞生長密度達80%-90%，按Biorad Gene Pulser Xcell電轉儀操作說明，將質體轉入CHO-K1細胞，將轉染後細胞全部轉移到事先預熱有完全培養基的培養皿中，37℃，5% CO2 靜置過夜培養。第二天，加入終濃度為1mg/ml的G418（Sigma）抗性篩選3-4天，使用含G418抗性的完全培養基至少傳5代使複製穩定後，檢測細胞CLDN18.2表現情況。結果顯示，使用陽性抗體IMAB362-similar-hG1（終濃度10µg/ml）與細胞孵育檢測流式，與CHO-K1空細胞相比，轉染細胞顯示傳代5代後，轉染細胞穩定表現人Claudin18.2。
b.構建CHO-K1-CLDN18.1穩定細胞株
以pLVX-CLDN18.1-ZsGreen質體為模板，設計引子序列SEQ ID NO 15和SEQ ID NO 16，按PrimeStar（Takara）說明書配製PCR體系，PCR程序設置98℃變性30秒，60℃退火30秒，72℃延伸1分鐘，30次循環擴增獲得CLDN18.1-FL目的基因片段（見SEQ ID NO 17）。BamHI和EcoRI雙酶切目的基因和pcDNA3.1(+)載體，T4連接酶（Takara）16℃連接過夜。將連接產物轉化入E.coli大腸桿菌，小量提取試劑盒提取質體pcDNA3.1-CLDN18.1。將質體按上述步驟電轉導入CHO-K1細胞，G418抗性培養基培養和傳代細胞，WesternBlot結果顯示，轉染後細胞可被抗CLDN18抗體（Thermo）染色呈陽性反應，而FACS分析轉染細胞與CLDN18.2陽性抗體IMAB362-similar-hG1以10µg/ml濃度孵育後，顯示為陰性熒光信號。表明轉染CLDN18.1細胞構建成功。
實施例6 母複製雜交瘤抗體篩選
對融合後獲得的母複製雜交瘤細胞進行第一輪初篩，篩選方法包括細胞ELISA和FACS分別檢測雜交瘤細胞培養上清，從中篩選CLDN18陽性的雜交瘤母複製。對初篩顯示CLDN18陽性複製擴大培養後，進行第二輪複篩，從中篩選FACS顯示CLDN18.2陽性CLDN18.1陰性的雜交瘤母複製。經過兩輪細胞ELISA和FACS篩選雜交瘤抗體，從幾百株母複製細胞中共篩選獲得9株母複製細胞分泌CLDN18.2特異性抗體，能與HEK293-CLDN18.2細胞產生陽性結合，而與HEK293-CLDN18.1細胞結合為陰性。
實施例7 亞複製的培養及篩選
1、亞複製的培養
由實施例6中篩選獲得的雜交瘤細胞製備單複製。重懸24孔盤中雜交瘤細胞，製備成細胞懸液。對每個複製細胞計數，1640完全培養基將細胞終濃度調節到1×104 個/ml；分別取60µl細胞懸液加入140µl 1640完全培養基，共200µl，混勻；提前一天取出-20℃保存的半固體培養基D（StemCell），4℃化凍，使用前放置於37℃預熱1小時。取2.5ml半固體培養基與200µl細胞懸液充分混勻，室溫靜置15分鐘；將混勻的半固體培養基細胞懸液轉移到6孔細胞培養板（Corning），接種數量為每孔600個細胞，孔盤四周加入適量無菌水，置於37℃，5% CO2 中培養5-7天。待孔盤中細胞生長為密實的球形單複製細胞群落，則用10µl槍頭吸取，轉移到鋪有200µl 1×HT，10%CloneEasy及10%胎牛血清的1640培養基中，充分混勻細胞懸液，37℃，5% CO2 培養2-3天。
2、亞複製的篩選
鑒定亞複製細胞培養上清抗體的CLDN18.2特異性，所採用篩選方法為細胞ELISA分別檢測上清抗體與CLDN18.2和CLDN18.1穩轉細胞陽性結合情況。具體實施方法如下：
用含10%胎牛血清的DMEM完全培養基37℃，5% CO2 ，分別培養HEK293-CLDN18.1和HEK293-CLDN18.2細胞。當細胞生長匯合度達80%-90%時，0.5mM EDTA-PBS無胰酶消化液室溫消化細胞，1000rpm，5分鐘離心，棄上清。DMEM完全培養基重懸，調節細胞濃度至6×105 個/ml。將細胞平鋪在預先包被多聚賴氨酸的96孔細胞盤（Corning），每孔100µl，37℃，5% CO2 培養24小時，使細胞均勻鋪滿孔底。吸走培養上清，4%多聚甲醛室溫固定細胞20分鐘，200µl PBS洗滌3次，每次2分鐘。200µl 3%BSA-PBS封閉孔盤，37℃，1小時。取亞複製培養上清100µl加入孔盤，37℃孵育1小時，PBS洗滌5次。封閉液1:10000稀釋的HRP-anti mouse IgG+IgM（Jackson）37℃孵育1小時。PBS洗滌5次。加入100µl TMB單組份顯色液室溫避光5-10分鐘，2M硫酸終止，酶標儀OD450讀數。結果如表3所示，雜交瘤培養上清與CLDN18.2結合強陽性亞複製（即OD值高於陽性對照OD值50%）包括：S3F10C5、S5H3A6、S5H3B6、S5H3D6、S6F10E7、S6H9B8、S6H9C8、C40B10D9、C42B12D10和C58B11E11。在這些亞複製中，S5H3A6、S5H3B6、S5H3D6、C40B10D9、C42B12D10和C58B11E11顯示與CLDN18.1細胞結合為陰性。
表3  細胞ELISA篩選亞複製結果
序號 亞複製編號 OD450 (CLDN18.2) OD450 (CLDN18.1)
1 mG2a（陽性對照） 1.286 0.168
2 B4B10G3 0.343 0.200
3 S3F10B5 0.615 0.198
4 S3F10C5 0.948 0.278
5 S3F10E5 0.504 0.213
6 S5H3A6 1.928 0.192
7 S5H3B6 1.379 0.152
8 S5H3D6 1.636 0.166
9 S6F10E7 0.818 0.350
10 S6F10H7 0.452 0.205
11 S6H9B8 2.353 1.495
12 S6H9C8 2.165 1.303
13 C40B10D9 0.664 0.114
14 C42B12D10 0.760 0.172
15 C58B11E11 0.671 0.197
將亞複製B4B10G3、S5H3B6、S6H9B8、C40B10D9、C42B12D10和C58B11E11進行複製擴大培養。用200µL移液器重懸96孔盤中的細胞，細胞懸液全部轉移到24孔細胞盤（Corning）中，加入1ml含2%CloneEasy，10%胎牛血清的1640培養基，置於37℃，5% CO2 培養箱中培養3-4天。
實施例8 抗體亞型鑒定
按小鼠抗體亞型鑒定試劑盒SBA Clonotyping System（SouthernBiotech）說明書操作步驟，加入待測亞複製細胞培養上清鑒定小鼠抗體的亞型。鑒定結果如下：
亞複製B4B10G3，抗體重鏈恆定區亞型為鼠IgG2b；抗體輕鏈恆定區亞型為鼠Kappa鏈；
亞複製S5H3B6，抗體重鏈恆定區亞型為鼠IgM，抗體輕鏈恆定區亞型為鼠Kappa鏈；
亞複製S6H9B8，抗體重鏈恆定區亞型為鼠IgG3，抗體輕鏈恆定區亞型為鼠Kappa鏈；
亞複製C58B11E11，抗體重鏈恆定區亞型為鼠IgG2c，抗體輕鏈恆定區亞型為鼠Kappa鏈；
亞複製C40B10D9，抗體重鏈恆定區亞型為鼠IgM，抗體輕鏈恆定區亞型為鼠Kappa鏈；
亞複製C42B12D10，抗體重鏈恆定區亞型為鼠IgM，抗體輕鏈恆定區亞型為鼠Kappa鏈。
實施例9 抗體可變區定序
收集24孔盤中單複製化雜交瘤細胞，調節至1×106 個/ml，共1ml，1000rpm，5分鐘離心，棄上清。按照QIAGEN公司的RNA提取試劑盒（Cat:#74134）說明書操作步驟進行細胞總RNA的小量提取，使用NanoDrop核酸定量分析儀測定RNA濃度。接下來，按照Takera逆轉錄試劑盒（Cat:#6110A）將2µg的總RNA逆轉錄成cDNA，-80℃保存，待用。以cDNA為模板，按Takara公司的PremixTaq酶操作說明分別配製抗體輕重鏈定序的PCR體系及設置PCR儀程序。PCR體系中所用引子合成自蘇州金唯智公司，具體引子序列如下：
重鏈定序引子VH-F包括:
VH-F1（包含引子序列SEQ ID NO 18和SEQ ID NO19）、VH-F2（包含引子序列SEQ ID NO 20，SEQ ID NO 21，SEQ ID NO 22，以及引子序列SEQ ID NO 23，SEQ ID NO 24，SEQ ID NO 25）、VH-F3（引子序列SEQ ID NO 26）
重鏈定序引子VH-R包括:
VH-R1（引子序列SEQ ID NO 27）、VH-R2（引子序列SEQ ID NO 28）
輕鏈定序引子VL-F包括:
VL-F1（引子序列SEQ ID NO 29）、VL-F2（包含引子序列SEQ ID NO 30和SEQ ID NO 31）、VL-F3（包含引子序列SEQ ID NO 32，SEQ ID NO33，SEQ ID NO 34）
輕鏈定序引子VL-R包括:
VL-R（引子序列SEQ ID NO 35）
將PCR擴增所獲得PCR產物委託蘇州金唯智公司定序，定序結果見表4。
表4 亞複製核苷酸序列表 表4 亞複製核苷酸序列表
亞複製 核苷酸序列
重鏈可變區 輕鏈可變區
B4B10G3 SEQ ID NO 36 SEQ ID NO 37
S5H3B6 SEQ ID NO 38 SEQ ID NO 39
S6H9B8 SEQ ID NO 40 SEQ ID NO 41
C58B11E11 SEQ ID NO 42 SEQ ID NO 43
C40B10D9 SEQ ID NO 44 SEQ ID NO 45
C42B12D10 SEQ ID NO 46 SEQ ID NO 47
實施例10 嵌合抗體的製備
根據實施例9中獲得的鼠源抗體可變區序列，將人IgG1恆定區與小鼠抗體可變區組合，透過基因合成方式構建人鼠嵌合抗體，以進一步研究抗體親和力和抗體性質。
a. 人鼠嵌合抗體基因合成
委託蘇州金唯智生物科技有限公司合成嵌合抗體基因優化並構建到真核表現載體pcDNA3.1(+)，嵌合抗體分別命名為1CHI、3CHI、7CHI、17CHI、18CHI、19CHI。各嵌合抗體所對應抗體可變區序列如下表5所示： 表5  嵌合抗體的序列
單抗 嵌合抗體 氨基酸序列 核苷酸序列
重鏈可變區 輕鏈可變區 重鏈可變區 輕鏈可變區
B4B10G3 1CHI SEQ ID NO 48 SEQ ID NO 49 SEQ ID NO 36 SEQ ID NO 37
S5H3B6 3CHI SEQ ID NO 50 SEQ ID NO 51 SEQ ID NO 52 SEQ ID NO 53
S6H9B8 7CHI SEQ ID NO 54 SEQ ID NO 55 SEQ ID NO 56 SEQ ID NO 57
C58B11E11 17CHI SEQ ID NO 58 SEQ ID NO 59 SEQ ID NO 60 SEQ ID NO 61
C40B10D9 18CHI SEQ ID NO 62 SEQ ID NO 63 SEQ ID NO 64 SEQ ID NO 65
C42B12D10 19CHI SEQ ID NO 66 SEQ ID NO 67 SEQ ID NO 68 SEQ ID NO 69
b. 嵌合抗體表現和蛋白純化
將包含上述嵌合抗體輕重鏈基因的質體按1:1比例瞬時轉染HEK293E細胞（上海細胞所）。轉速110rpm，37℃，8% CO2 振盪培養7天。4500rpm，20分鐘離心，收穫上清蛋白。經ProteinA親和層析純化：0.1M NaOH 溶液清洗AKTA層析系統及層析柱30 min，超純水沖洗乾淨；pH7.4的20mM磷酸鈉緩衝液平衡10個柱體積；設定流速2 ml/min，上樣；平衡液清洗層析柱10個柱體積；pH3.4的50mM醋酸緩衝液洗脫3-5個柱體積，收集洗脫蛋白；超濾濃縮將抗體置換於pH5.55的50mM醋酸鹽緩衝液中保存。
其中，嵌合抗體3CHI、18CHI 和19CHI的 SDS-PAGE凝膠電泳顯示嵌合抗體3CHI、18CHI 和19CHI的SDS-PAGE純度均大於90%。
實施例11  嵌合抗體與CLDN18.2特異性結合測定
提前兩周復甦HEK293-CLDN18.2和HEK293-CLDN18.1細胞，用含10%胎牛血清的DMEM完全培養基37℃，5% CO2 培養。當細胞生長匯合度達80%-90%時，0.5mM EDTA-PBS（Sigma）室溫消化細胞，1000rpm，5分鐘離心，棄上清。DMEM完全培養基重懸，調節細胞濃度至6×105 個/ml。將細胞分別平鋪在預先包被2.5µg/孔的多聚賴氨酸（Corning）的96孔細胞盤，每孔100µl，37℃，5% CO2 培養24小時，使細胞均勻長滿孔底。吸走培養上清，4%多聚甲醛室溫固定細胞20分鐘，200µl PBS洗滌3次，每次2分鐘。200µl 3%BSA-PBS封閉孔盤，37℃，1小時。以3%BSA-PBS稀釋各嵌合抗體濃度至6µg/ml，並按6倍梯度稀釋，共稀釋7個濃度。同時以相同濃度梯度稀釋的IMAB362-similar-hG1作為陽性對照，以人IgG1, kappa同型對照抗體（以下簡稱Isotype，中美冠科生物技術(太倉)有限公司提供）作為陰性對照，分別加入到HEK293-CLDN18.2和HEK293-CLDN18.1細胞盤中。37℃孵育1小時，PBS洗滌5次。封閉液1:10000稀釋的HRP-anti human IgG（Jackson）37℃孵育1小時。PBS洗滌5次。加入100µl TMB單組份顯色液室溫避光5-10分鐘，加入50µl 2M硫酸終止，酶標儀OD450讀數。數據處理：將原始數據代入GraphPad 5.0軟體作圖並計算。結果見表6。
表6 嵌合抗體與CLDN18.2特異性結合測定
抗體編號 EC50（nM）
陽性對照（IMAB362-similar-hG1） 0.09
陰性對照（Isotype） N.A
1CHI 0.55
3CHI 0.08
17CHI 2.44
18CHI 1.75
19CHI 29.90
各嵌合抗體與CLDN18.2細胞和CLDN18.1細胞結合情況如圖1和圖2所示，其中isotype為陰性對照，IMAB362-similar-hG1為陽性對照。結果顯示，各嵌合抗體的結合曲線均呈濃度梯度依賴性。其中，17CHI表現出與CLDN18.2及CLDN18.1均為強陽性結合，19CHI則與CLDN18.2，CLDN18.1呈弱陽性結合，而1CHI、3CHI及18CHI抗體能特異性與CLDN18.2結合而不與CLDN18.1結合。同時，抗CLDN18.2特異性抗體中，3CHI抗體EC50數值較小，且與陽性對照抗體IMAB362-similar-hG1 EC50值相近，顯示出較強的與CLDN18.2特異性結合活性。
實施例12 嵌合抗體親和力成熟
選取實施例11中，親和力與陽性對照抗體最為接近的嵌合抗體3CHI在體外進行親和力成熟及篩選。主要採用噬菌體Fab抗體庫來篩選獲得能保持CLDN18.2特異性，同時親和力提高的抗體。
噬菌體篩選結果如圖3所示，噬菌體抗體C1-22、A1-18等均表現出比原始的3CHI噬菌體抗體（WT）更高的CLDN18.2結合活性。噬菌體經定序後獲得氨基酸位點突變的CDR序列，將這些突變位點重新組合，構建為帶有人IgG1恆定區的嵌合抗體。將來源於噬菌體的嵌合抗體進行重新編號和命名後，透過細胞ELISA鑒定上述30個嵌合抗體與CLDN18.2是否特異性結合，鑒定結果如表7所示，表中符合與CLDN18.1結合陰性且與CLDN18.2結合陽性的特異性抗體共有18個，氨基酸序列分別如表11所示。
表7 噬菌體來源的嵌合抗體篩選結果
鑒定內容 抗體名稱
CLDN18.1陽性且CLDN18.2陽性 310CHI、 311CHI、 314CHI、 316CHI、 317CHI、 318CHI、 320CHI、 323CHI、 325CHI、 326CHI、 327CHI、 329CHI
CLDN18.1陰性且CLDN18.2陽性 301CHI、 302CHI、 303CHI、 304CHI、 305CHI、 306CHI、 307CHI、 308CHI、 309CHI、 312CHI、 313CHI、 315CHI、 319CHI、 321CHI、 322CHI、 324CHI、 328CHI 、 330CHI
表8  特異性嵌合抗體的氨基酸序列表
序號 抗體名稱 重鏈可變區 輕鏈可變區
1 301CHI SEQ ID NO 50 SEQ ID NO 70
2 302CHI SEQ ID NO 50 SEQ ID NO 71
3 303CHI SEQ ID NO 72 SEQ ID NO 73
4 304CHI SEQ ID NO 74 SEQ ID NO 75
5 305CHI SEQ ID NO 50 SEQ ID NO 76
6 306CHI SEQ ID NO 77 SEQ ID NO 78
7 307CHI SEQ ID NO 74 SEQ ID NO 70
8 308CHI SEQ ID NO 74 SEQ ID NO 71
9 309CHI SEQ ID NO 74 SEQ ID NO 76
10 312CHI SEQ ID NO 72 SEQ ID NO 76
11 313CHI SEQ ID NO 77 SEQ ID NO 70
12 315CHI SEQ ID NO 77 SEQ ID NO 76
13 319CHI SEQ ID NO 79 SEQ ID NO 70
14 321CHI SEQ ID NO 79 SEQ ID NO 76
15 322CHI SEQ ID NO 50 SEQ ID NO 80
16 324CHI SEQ ID NO 50 SEQ ID NO 81
17 328CHI SEQ ID NO 79 SEQ ID NO 80
18 330CHI SEQ ID NO 79 SEQ ID NO 81
分別使用人胃癌細胞NUGC4以及穩轉細胞CHO-K1-CLDN18.1（實施例5製得），透過FACS技術驗證上述抗CLDN18.2抗體在細胞程度上的特異性和親和力。結果如表9所示，經過體外抗體親和力成熟與篩選，與原始的3CHI抗體相比，各抗體都能與NUGC4細胞上CLDN18.2靶點結合，而不與CHO-K1-CLDN18.1細胞結合。根據FACS的MFI（平均熒光強度）所提示的抗體親和力程度，與陽性對照抗體IMAB362-similar-hG1相比，330CHI抗體顯示其靶向NUGC4細胞的親和力有顯著提高。
表9 親和力成熟抗體FACS檢測結果
抗體編號 MFI (CLDN18.2) MFI (CLDN18.1)
Isotype 93 219
IMAB362-similar-hG1 2179 59
3CHI 2509 76
17CHI N.A 14455
301CHI 44420 114
303CHI 38241 85
305CHI 38913 68
309CHI 42495 78
315CHI 42301 65
321CHI 46327 299
322CHI 44777 57
324CHI 36030 248
330CHI 63666 49
透過Fortebio分子相互作用儀驗證上述抗CLDN18.2抗體在蛋白程度上的親和力：首先，配製抗體溶液及抗原稀釋液，用SD緩衝液（含0.02%Tween20和0.1%BSA的PBS溶液）將嵌合抗體稀釋到終濃度為5µg/ml；抗原蛋白Claudin18.2-His則用SD緩衝液按照4倍濃度梯度稀釋，使濃度分別為10µg/ml、2.5µg/ml、0.625µg/ml、0µg/ml。其後，選擇AHC感測器固化抗體，再結合不同濃度的抗原，按Octet RED96的操作說明進行親和力測定。
結果表明，陽性對照抗體IMAB362-similar-hG1在37℃時與CLDN18.2蛋白結合的平衡解離常數（KD）為7.14nM，330CHI和305CHI抗體KD值分別為0.84nM和0.87nM，與陽性對照相比，其抗體親和力顯著地提高了一個數量級（見表10）。
表10 親和力成熟抗體親和力測試結果
序號 抗體名稱 感測器類型 KD(M) Kon(M-1 ·s-1 ) Kdis(s-1 )
1 IMAB362-similar-hG1 AHC 7.14×10-9 5.59×104 3.99×10-4
2 330CHI 8.40×10-10 1.39×105 1.17×10-4
3 305CHI 8.65×10-10 5.13×104 4.44×10-5
實施例13  嵌合抗體體外ADCC活性測定
測定實驗前一天，將CHO-K1-CLDN18.2（實施例5製得）細胞消化，以完全培養基重懸細胞，對細胞進行計數，並調整密度至1×105 個/ml，100μl/孔接種到96孔盤，於37℃、5% CO2 培養箱中培養過夜；測試當天，將無酚紅1640培養基（Gibco）孵育至37℃，將抗體按5倍梯度稀釋；取出鋪有CHO-K1-CLDN18.2的96孔盤，棄培養基，向每孔加入25μl無酚紅1640，將稀釋好的抗體加入到樣品孔中，使抗體終濃度分別為10µg/ml、2µg/ml、0.4µg/ml、0.08µg/ml、0.016µg/ml和0.0032µg/ml；對照孔分別加入等量的IMAB362-similar-hG1和人IgG1同型對照抗體（CrownBio），於37℃、5% CO2 培養箱中孵育1h；
將穩轉表現人CD16A蛋白和NFAT報告基因蛋白的Jurkat細胞（以下簡稱Jurkat-CD16A/NF）作為效應細胞，轉移至離心管中，室溫，1000rpm離心5min，棄上清；5ml無酚紅1640培養基重懸洗滌1次，1000rpm，離心5min，棄上清；無酚紅1640重懸細胞，並調整細胞密度至8×106 個/ml；
按照20:1的效靶比（即效應細胞與靶細胞數比例為20:1），向孔盤中加入Jurkat-CD16A/NF細胞2×105 個，200g，離心2分鐘，使效靶細胞充分接觸；37℃、5% CO2 培養箱中孵育5-6小時；檢測前30分鐘，將細胞盤恢復至室溫，按照Bio-Turbo螢火蟲熒光素酶分析試劑盒（江蘇瑞安生物技術有限公司）操作說明書加入檢測試劑，將待測上清轉移至白色平底96孔盤，Thermo Floskan Ascent FL熒光酶標儀檢測孔盤熒光信號。將原始數據代入Graphpad 5.0軟體計算分析，結果如表11所示。
表11 嵌合抗體體外ADCC活性測定結果
組別 EC50（nM） Top
Isotype 13.48 6190
IMAB362-similar-hG1 0.72 215966
3CHI 0.54 211611
305CHI 0.28 215996
330CHI 0.22 214800
與Isotype陰性對照相比，各嵌合抗體熒光信號隨濃度梯度呈劑量依賴性。在實驗組中，嵌合抗體 330CHI的EC50為0.22nM，嵌合抗體 305CHI的EC50為0.28nM，其抗體的ADCC EC50活性比陽性對照抗體IMAB362-similar-hG1（0.72nM）提高3倍以上。由此可見，嵌合抗體針對CLDN18.2的細胞結合活性及親和力提升的同時，也能有效提高抗體體外ADCC活性作用。
實施例14 抗體人源化
將實施例12中體外親和力成熟改造後的抗體330CHI進行人源化序列優化。人源化序列優化及抗體理化性質鑒定委託杭州皓陽生物技術有限公司開展。人源化序列優化透過免疫基因數據庫（IMGT），確認3CHI抗體及330CHI抗體可變區的鼠源序列來源，經過同源比對，3CHI抗體及330CHI抗體的重鏈可變區序列的FR區來源於小鼠抗體IGHV5-15*01；抗體輕鏈可變區的FR序列則來源於小鼠抗體IGKV8-19*01。將小鼠抗體CDR區與人源抗體FR區重組形成人源化抗體，其中所採用人源抗體輕重鏈模板與所對應鼠抗可變區序列相似度達到65%或以上，人源抗體來源見表12。最終人源化抗體名稱及序列見表13所示。
表12 人源化序列設計資訊
重鏈人源化設計
人源序列來源 相似度 是否與鼠抗一致的CDR長度 重組人源化序列
IGHV3-48*01 77.55% 是 SEQ ID NO 82
IGHV3-23*01 75.51% 是 SEQ ID NO 88
輕鏈人源化設計
人源序列來源 相似度 是否與鼠抗一致的CDR長度 重組人源化序列
IGKV4-1*01 81.91% 是 SEQ ID NO 84
IGKV3-7*01 65.96% 否 SEQ ID NO 86
IGKV2-30*01 64.89% 否 SEQ ID NO 90
表13  人源化抗體序列表
序號 抗體名稱 氨基酸序列 核苷酸序列
重鏈可變區 輕鏈可變區 重鏈可變區 輕鏈可變區
1 Hu330-1 SEQ ID NO 82 SEQ ID NO 84 SEQ ID NO 83 SEQ ID NO 85
2 Hu330-2 SEQ ID NO 82 SEQ ID NO 86 SEQ ID NO 83 SEQ ID NO 87
3 Hu330-3 SEQ ID NO 88 SEQ ID NO 84 SEQ ID NO 89 SEQ ID NO 85
4 Hu330-4 SEQ ID NO 88 SEQ ID NO 86 SEQ ID NO 89 SEQ ID NO 87
5 Hu330-5 SEQ ID NO 82 SEQ ID NO 90 SEQ ID NO 83 SEQ ID NO 91
6 Hu330-6 SEQ ID NO 88 SEQ ID NO 90 SEQ ID NO 89 SEQ ID NO 91
將包含人源化抗體輕重鏈基因的質體載體按1:1比例共轉染於HEK293E細胞，110rpm，37℃，8% CO2 振盪培養7天。4500rpm，20分鐘離心，收穫上清蛋白。經Protein A親和層析純化：0.1M NaOH 溶液清洗AKTA層析系統及層析柱30 min，超純水沖洗乾淨；pH7.4的20mM磷酸鈉緩衝液平衡10個柱體積；設定流速2 ml/min，上樣；平衡液清洗層析柱10個柱體積；pH3.4的50mM醋酸緩衝液洗脫3-5個柱體積，收集洗脫蛋白；超濾濃縮將抗體置換於pH6.5的20mM磷酸鹽緩衝液中保存。透過尺寸排阻高效液相色譜（SEC-HPLC）測定純化後抗體純度，人源化抗體 Hu330-1、 Hu330-2和 Hu330-4的單體蛋白純度都達到95%以上，其中，Hu330-1為例，抗體重鏈分子量為48.72KD，輕鏈分子量為24.21KD。
實施例15  FACS檢測人源化抗體在細胞程度上與人CLDN18.2結合的特異性和親和力
胃癌細胞消化液分別消化處理CHO-K1-CLDN18.2細胞和CHO-K1-CLDN18.1細胞（實施例5製得），37℃，消化15分鐘；完全培養基終止，1000rpm，離心5分鐘，棄上清；用2%胎牛血清-PBS稀釋液重懸細胞，調節細胞至1×106 個/ml，向96孔U形底盤每孔加入100µl細胞懸液；用2%胎牛血清-PBS將人源化抗體及對照抗體分別稀釋到終濃度10µg/ml、2µg/ml、0.4µg/ml、0.08µg/ml和0.016µg/ml，等體積與細胞混勻，4℃孵育1小時；1000rpm，5分鐘離心，棄上清；每孔加入200µl Cell Stain Buffer（Biolegend）洗滌2次，每次1000rpm，5分鐘離心，棄上清；加入100µl PE-anti human Fc抗體（Biolegend），4℃孵育，1小時；Cell Stain Buffer（Biolegend）洗滌2次，每次1000rpm，5分鐘離心，棄上清。加入300µl Cell Stain Buffer重懸細胞，BD FACS Jazz流式分析儀檢測。
結果如圖4和圖5所示，各人源化抗體Hu330-1、Hu330-3、Hu330-5和Hu330-6都與CLDN18.2表現為特異性結合，與CLDN18.1細胞結合則為陰性。其中，人源化抗體Hu330-1的結合曲線幾乎與嵌合抗體330CHI完全重合，表明抗體在人源化後，其親和力與嵌合抗體沒有明顯差異，基本保持一致程度。根據Graphpad擬合曲線計算的抗體相對平衡解離常數Kd值如表14所示，人源化抗體Hu330-1的Kd值為1.7nM，顯著低於陽性對照抗體（28.7nM），表明人源化抗體與表現CLDN18.2細胞的結合活性比陽性對照抗體IMAB362-similar-hG1高出約15倍。
表14  人源化抗體FACS測定相對平衡解離常數Kd擬合結果
序號 抗體名稱 Kd(nM) Hill slope Bmax(MFI)
1 IMAB362-similar-hG1 28.7 4.816 8224
2 330CHI 1.6 7.566 10760
3 Hu330-1 1.7 6.781 11321
實施例16  Fortebio檢測人源化抗體在蛋白程度上與人CLDN18.2結合的特異性和親和力
另一方法是透過驗證上述人源化抗體在蛋白程度上的親和力，選擇AHC感測器固化抗體，並與不同濃度的抗原結合，按Octet RED96的操作說明進行親和力測定。結果如表15所示，人源化抗體 Hu330-1在37℃時與CLDN18.2蛋白結合的平衡解離常數（KD）為5.26nM，與陽性對照相比，其抗體親和力顯著地提高約18倍。
表15 人源化抗體Fortebio測定平衡解離常數KD值
序號 抗體名稱 KD(M) Kon(M-1 ·s-1 ) Kdis(s-1 )
1 IMAB362-similar-hG1 9.44×10-9 2.35×105 2.22×10-3
2 330CHI 2.49×10-10 1.30×105 3.23×10-5
3 Hu330-1 5.26×10-10 1.75×105 9.22×10-5
實施例17  熒光素酶標記測定人源化抗體體外ADCC活性
以CHO-K1-CLDN18.2細胞（實施例5製得）為靶細胞，將細胞密度調節至1×105 個/ml，100μl/孔接種到96孔盤，37℃、5% CO2 培養箱中培養過夜；將人源化抗體按5倍梯度稀釋，使抗體終濃度分別為10µg/ml、2µg/ml、0.4µg/ml、0.08µg/ml、0.016µg/ml和0.0032µg/ml；對照孔分別加入等量的IMAB362-similar-hG1和 330CHI嵌合抗體，於37℃、5% CO2 培養箱中孵育1h；將效應細胞Jurkat-CD16A/NF按照效靶比20:1的比例，每孔加入2×105 個效應細胞，200g，離心2分鐘，使效靶細胞充分接觸；37℃、5% CO2 培養箱中孵育5-6小時；Bio-Turbo螢火蟲熒光素酶分析試劑盒檢測孔盤熒光信號，測試結果如表16所示。
表16  熒光素酶標記測定人源化抗體ADCC活性
組別 EC50（nM） Top
IMAB362-similar-hG1 0.69 63575
330CHI 0.18 64473
Hu330-1 0.12 68271
Hu330-2 0.11 65144
與IMAB362-similar-hG1陽性抗體相比，人源化抗體Hu330-1和Hu330-2的EC50降低6倍以上，且與嵌合抗體ADCC活性基本持平。由此說明人源化抗體在具有高親和力的同時，也比陽性抗體顯示出較高的ADCC生物學活性。
實施例18  RTCA測定人源化抗體在體外對腫瘤細胞的ADCC殺傷活性
採集人外周血從中分離PBMC細胞，加入等體積含2%胎牛血清的PBS稀釋血樣；向50ml離心管中加入15ml Lymphoprep密度梯度離心液（StemCell），再加入稀釋的血樣，關閉離心機刹車，室溫1200g離心，10分鐘。離心後可見白膜層，其中含有富集的PBMC細胞，吸取白膜層將其轉移到新的離心管中，按紅細胞裂解液（Sigma）操作說明在室溫下裂解紅細胞，用含2mM EDTA和2%胎牛血清的PBS洗滌2次，室溫400g，離心10min，棄上清；用含5%胎牛血清的1640完全培養基重懸細胞，將PBMC濃度調節到3×106 個/ml；其次，以人胃癌細胞NUGC4作為靶細胞，用人胃癌組織源細胞消化液處理，1000rpm，離心5分鐘收集細胞，棄上清；將細胞調節到1.5×105 個/ml，每孔加入100µl細胞懸液於E-Plate 96孔盤，37℃，5% CO2 培養超過24小時後，加入用1640培養基稀釋的抗體，使抗體終濃度為2µg/ml，37℃，5% CO2 孵育1小時；將效應細胞PBMC按照效靶比20:1的比例，每孔加入3×105 個效應細胞，200g，離心2分鐘，使效靶細胞充分接觸；37℃、5% CO2 培養箱中孵育殺傷21小時，使用RTCA檢測儀時實記錄腫瘤細胞在96孔盤的阻抗值（Cell Index，CI），透過公式cell death%=[（對照組CI-實驗組CI）/對照組CI]×100%，計算人源化抗體腫瘤殺傷百分率。
結果如圖6所示，RTCA實時檢測效靶細胞共孵育8~21小時內，各組的腫瘤細胞殺傷率隨時間延長而增加。體外殺傷第21小時，人源化抗體Hu330-1對NUGC4細胞的最大殺傷率45%，比IMAB362-similar-hG1陽性抗體對腫瘤細胞的ADCC殺傷活性高出10%（P>0.05）。
綜上，人源化抗體Hu330-1能夠特異性靶向結合CLDN18.2，其結合活性和親和力在分子程度和細胞程度上，都比陽性抗體IMAB362-similar-hG1高出15-18倍，而由抗體介導的對靶細胞體外ADCC殺傷作用，則表現抗體濃度依賴性質，較低濃度時， Hu330-1即可發揮一定的殺傷腫瘤細胞效應。
實施例19 人源化抗體恆定區優化
將 Hu330-1人源化抗體可變區序列與包含5個氨基酸位點突變的IgG1恆定區序列組合，構建表現Fc突變型人源化抗體 Hu330-1-5M（序列見表14）；另構建包含該Fc突變的陽性抗體5M（序列見表17）作為Fc段的對照。
表17  Fc突變人源化抗體序列表
序序號 抗體名稱 氨基酸序列 核苷酸序列
重鏈 輕鏈 重鏈 輕鏈
1 Hu330-1 SEQ ID NO 92 SEQ ID NO 94 SEQ ID NO 93 SEQ ID NO 95
2 Hu330-1-5M SEQ ID NO 96 SEQ ID NO 98 SEQ ID NO 97 SEQ ID NO 99
3 5M SEQ ID NO 100 SEQ ID NO 11    
透過FACS鑒定Fc突變的人源化抗體與靶點CLDN18.2結合的影響。胃癌細胞消化液分別消化處理NUGC4細胞，37℃，消化15分鐘；完全培養基終止，1000rpm，離心5分鐘，棄上清；用2%胎牛血清-PBS稀釋液重懸細胞，調節細胞至1×106 個/ml，向96孔U形底盤每孔加入100µl細胞懸液；用2%胎牛血清-PBS將抗體稀釋到終濃度5µg/ml、1µg/ml、0.2µg/ml、0.04µg/ml和0.008µg/ml，等體積與細胞混勻，4℃孵育1小時；1000rpm，5分鐘離心，棄上清；每孔加入200µl Cell Stain Buffer（Biolegend）洗滌2次，每次1000rpm，5分鐘離心，棄上清；加入100µl PE-anti human Fc抗體（Biolegend），4℃孵育，1小時；Cell Stain Buffer（Biolegend）洗滌2次，每次1000rpm，5分鐘離心，棄上清。加入300µl Cell Stain Buffer重懸細胞，BD FACS Jazz流式分析儀檢測，結果如表18所示。
表18  FACS檢測Fc優化的人源化抗體結合活性
組別 EC50（nM） Top（%）
IMAB362-similar-hG1 9.78 58.8
Hu330-1 0.80 92.1
Hu330-1-5M 0.76 92.4
Fc突變的人源化抗體與NUGC4靶細胞結合陽性率，隨抗體濃度升高而逐漸飽和，其結合曲線與人源化抗體的結合曲線幾乎完全重合，並且與陽性對照抗體IMAB362-similar-hG1相比，Hu330-1-5M抗體結合活性提升了15倍，由此表明，恆定區Fc片段的氨基酸發生突變，不改變抗體針對CLDN18.2靶點的特異性和結合活性。
實施例20 優化後的人源化抗體體外ADCC殺傷活性檢測
1、透過熒光素酶標記測定Fc突變的人源化抗體體外ADCC活性：
以CHO-K1-CLDN18.2細胞（實施例5製得）為靶細胞，將細胞密度調節至1×105 個/ml，100μl/孔接種到96孔盤，37℃、5% CO2 培養箱中培養過夜；將抗體按5倍梯度稀釋，使終濃度分別為10µg/ml、2µg/ml、0.4µg/ml、0.08µg/ml、0.016µg/ml和0.0032µg/ml；於37℃、5% CO2 孵育1小時；將效應細胞Jurkat-CD16A/NF按照效靶比20:1的比例，每孔盤加入2×105 個效應細胞，200g，離心2分鐘，使效靶細胞充分接觸；37℃、5% CO2 培養箱中孵育5-6小時；Bio-Turbo螢火蟲熒光素酶分析試劑盒檢測孔盤熒光信號，結果如表19所示。
表19  熒光素酶法測定Fc優化的人源化抗體ADCC活性
組別 EC50（nM） Top
IMAB362-similar-hG1 1.49 89555
Hu330-1 0.45 89817
Hu330-1-5M 0.17 100434
5M 0.44 98368
Fc突變陽性抗體（5M）以及人源化Hu330-1抗體相比IMAB362-similar-hG1提高ADCC活性均為3倍，而Fc突變後的Hu330-1-5M抗體EC50為0.17nM，比陽性對照抗體IMAB362-similar-hG1的ADCC活性提高了8倍以上，明顯地優化了體外ADCC增強效果。
2、採用LDH法測定Fc突變的人源化抗體在體外對腫瘤細胞的ADCC殺傷活性：
採集人外周血從中分離PBMC細胞作為效應細胞，加入等體積含2%胎牛血清的PBS稀釋血樣；向50ml離心管中加入15ml Lymphoprep密度梯度離心液（StemCell），再加入稀釋的血樣，關閉離心機刹車，室溫1200g離心，10分鐘。離心後可見白膜層，其中含有富集的PBMC細胞，吸取白膜層將其轉移到新的離心管中，按紅細胞裂解液（Sigma）操作說明在室溫下裂解紅細胞，用含2mM EDTA和2%胎牛血清的PBS洗滌2次，室溫400g，離心10min，棄上清；用熱滅活血清配製含2%胎牛血清的1640（以下簡稱熱滅活培養基）重懸細胞，將PBMC濃度調節到3×106 個/ml；以人胃癌細胞NUGC4作為靶細胞，用人胃癌組織源細胞消化液處理，1000rpm，離心5分鐘收集細胞，棄上清；將細胞調節到1.5×105 個/ml，每孔加入100µl細胞懸液於96孔細胞盤，37℃，5% CO2 培養24小時，吸除培養基，加入用熱滅活培養基稀釋的抗體，使抗體終濃度分別為10µg/ml、2µg/ml、0.4µg/ml、0.08µg/ml、0.016µg/ml和0.0032µg/ml，37℃，5% CO2 孵育1小時；將效應細胞PBMC按照效靶比20:1的比例，向每孔加入3×105 個效應細胞，200g，離心2分鐘，使效靶細胞充分接觸；37℃、5% CO2 培養箱中孵育殺傷22小時。孵育結束時，按LDH試劑盒（東仁化學科技（上海）有限公司）說明書步驟，向孔盤加入WST底物試劑，避光顯色20-30分鐘，測定OD450nm值，將原始數據代入公式cell death%=（實驗組吸收值-靶細胞自發值-效應細胞值）/（靶細胞最大值-靶細胞自發值）×100%，實驗組及所有對照組吸收值=該組吸收值-背景值，結果如表20所示。
表20  LDH法測定Fc優化的人源化抗體ADCC活性
組別 EC50（nM） Max（%）
Isotype N.A 52
IMAB362-similar-hG1 2.47 80.13
Hu330-1-5M 0.31 129.9
Fc突變的人源化抗體Hu330-1-5M能夠在體外殺傷腫瘤細胞NUGC4，其ADCC殺傷效果與抗體濃度呈劑量依賴性，所計算EC50（0.3nM）比IMAB362-similar-hG1陽性抗體EC50活性提高8倍；同時，Hu330-1-5M對腫瘤細胞的最大殺傷率為130%，相比陽性抗體的80%，表現出顯著增強的體外ADCC殺傷效應。
綜上，經Fc突變的Hu330-1-5M人源化抗體，一方面，在與CLDN18.2的靶向結合能力上，比陽性抗體IMAB362-similar-hG1的親和力提高了15倍；另一方面，經Fc優化後介導的體外ADCC殺傷腫瘤細胞的能力得到進一步增強，其EC50活性比陽性抗體提高8倍，最大殺傷效果則提高60%以上。
綜上所述，本發明提供的CLDN18.2抗體與CLDN18.2具有顯著的結合活性和親和力，同時對腫瘤細胞具有高效的體外ADCC殺傷活性，提示該抗體具有高效的抗腫瘤作用，可在製備抗腫瘤的藥物中應用，具有廣闊的市場前景。
儘管以上已經對本發明作了詳細描述，但是本領域技術人員理解，在不偏離本發明的精神和範圍的前提下可以對本發明進行各種修改和改變。本發明的申請專利範圍並不限於上文所作的詳細描述，而應歸屬於申請專利範圍。
無
圖1是嵌合抗體與CLDN18.2細胞的結合，其中橫坐標為抗體濃度，單位是ng/ml；縱坐標為450nm的OD值。 圖2是嵌合抗體與CLDN18.1細胞的結合，其中橫坐標為抗體濃度，單位是ng/ml；縱坐標為450nm的OD值。 圖3是噬菌體Fab與CLDN18.2蛋白的結合，其中橫坐標為噬菌體滴度；縱坐標為450nm的OD值。 圖4是人源化抗體與CHO-K1-CLDN18.2細胞的結合，其中橫坐標為抗體濃度，單位是mg/ml；縱坐標為與細胞結合的平均熒光強度MFI。 圖5是人源化抗體與CHO-K1-CLDN18.1細胞的結合，其中橫坐標為抗體濃度，單位是mg/ml；縱坐標為與細胞結合的平均熒光強度MFI。 圖6是人源化抗體的ADCC活性。
無
Figure 12_A0101_SEQ_0001
Figure 12_A0101_SEQ_0002
Figure 12_A0101_SEQ_0003
Figure 12_A0101_SEQ_0004
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Claims (16)

  1. 一種抗Claudin18.2抗體或其抗原結合片段，其包含重鏈可變區和輕鏈可變區，其中： （1）所述重鏈可變區包含HCDR1、HCDR2和HCDR3，其中： （a1）所述HCDR1的氨基酸序列選自SEQ ID NO 101、SEQ ID NO 102、SEQ ID NO 103和與它們具有至少85%序列同一性的氨基酸序列； （a2）所述HCDR2的氨基酸序列選自SEQ ID NO 104、SEQ ID NO 105和與它們具有至少85%序列同一性的氨基酸序列； （a3）所述HCDR3的氨基酸序列選自SEQ ID NO 106、SEQ ID NO 107和與它們具有至少85%序列同一性的氨基酸序列；和 （2）所述輕鏈可變區包含LCDR1、LCDR2和LCDR3，其中： （a4）所述LCDR1的氨基酸序列為SEQ ID NO 108； （a5）所述LCDR2的氨基酸序列選自SEQ ID NO 109、SEQ ID NO 110、SEQ ID NO 111和與它們具有至少85%序列同一性的氨基酸序列； （a6）所述LCDR3的氨基酸序列選自SEQ ID NO 112、SEQ ID NO 113、SEQ ID NO 114、SEQ ID NO 115、SEQ ID NO 116和與它們具有至少85%序列同一性的氨基酸序列。
  2. 如請求項1所述的抗Claudin18.2抗體或其抗原結合片段，其中： （1）所述重鏈可變區包含氨基酸序列如SEQ ID NO 101所示的HCDR1、氨基酸序列如SEQ ID NO 105所示的HCDR2和氨基酸序列如SEQ ID NO 106所示的HCDR3；和 （2）所述輕鏈可變區包含氨基酸序列如SEQ ID NO 108所示的LCDR1、氨基酸序列如SEQ ID NO 111所示的LCDR2和氨基酸序列如SEQ ID NO 115所示的LCDR3。
  3. 如請求項1或2所述的抗Claudin18.2抗體或其抗原結合片段，其中所述抗體是鼠源抗體、嵌合抗體或人源化抗體。
  4. 如請求項1-3之任一項所述的抗Claudin18.2抗體或其抗原結合片段，其中： （1）所述重鏈可變區的氨基酸序列選自： （b1）如SEQ ID NO 50、SEQ ID NO 72、SEQ ID NO 74、SEQ ID NO 77、SEQ ID NO 79、SEQ ID NO 82、SEQ ID NO 88所示的氨基酸序列； （b2）（b1）所示的氨基酸序列經取代、缺失或添加一個或多個氨基酸獲得的、且與（b1）所示的氨基酸序列功能相同或相似的氨基酸序列；和 （b3）與（b1）所示的氨基酸序列具有至少80%序列同一性的氨基酸序列；和 （2）所述輕鏈可變區的氨基酸序列選自： （b4）如SEQ ID NO 51、SEQ ID NO 70、SEQ ID NO 71、SEQ ID NO 73、SEQ ID NO 75、SEQ ID NO 76、SEQ ID NO 78、SEQ ID NO 80、SEQ ID NO 81、SEQ ID NO 84、SEQ ID NO 86、SEQ ID NO 90所示的氨基酸序列； （b5）（b4）所示的氨基酸序列經取代、缺失或添加一個或多個氨基酸獲得的、且與（b4）所示的氨基酸序列功能相同或相似的氨基酸序列；和 （b6）與（b4）所示的氨基酸序列具有至少80%序列同一性的氨基酸序列。
  5. 如請求項4所述的抗Claudin18.2抗體或其抗原結合片段，其中所述重鏈可變區的氨基酸序列為SEQ ID NO 79，SEQ ID NO 79經取代、缺失或添加一個或多個氨基酸獲得的且與SEQ ID NO 79功能相同的氨基酸序列或與SEQ ID NO 79具有至少85%序列同一性的氨基酸序列，且所述輕鏈可變區的氨基酸序列為SEQ ID NO 81，SEQ ID NO 81經取代、缺失或添加一個或多個氨基酸獲得的且與SEQ ID NO 81功能相同的氨基酸序列或與SEQ ID NO 81具有至少85%序列同一性的氨基酸序列。
  6. 如請求項4所述的抗Claudin18.2抗體或其抗原結合片段，其中： （1）所述重鏈可變區的氨基酸序列選自： （c1）如SEQ ID NO 82、SEQ ID NO 88所示的氨基酸序列； （c2）（c1）所示的氨基酸序列經取代、缺失或添加一個或多個氨基酸獲得的、且與（c1）所示的氨基酸序列功能相同或相似的氨基酸序列；和 （c3）與（c1）所示的氨基酸序列具有至少80%序列同一性的氨基酸序列；和 （2）所述輕鏈可變區的氨基酸序列選自： （c4）SEQ ID NO 84、SEQ ID NO 86、SEQ ID NO 90所示的氨基酸序列； （c5）（c4）所示的氨基酸序列經取代、缺失或添加一個或多個氨基酸獲得的、且與（c4）所示的氨基酸序列功能相同或相似的氨基酸序列；和 （c6）與（c4）所示的氨基酸序列具有至少80%序列同一性的氨基酸序列。
  7. 如請求項6所述的抗Claudin18.2抗體或其抗原結合片段，其中： 所述重鏈可變區的氨基酸序列為SEQ ID NO 82，SEQ ID NO 82經取代、缺失或添加一個或多個氨基酸獲得的且與SEQ ID NO 82功能相同的氨基酸序列或與SEQ ID NO 82具有至少85%序列同一性的氨基酸序列，且所述輕鏈可變區的氨基酸序列為SEQ ID NO 84，SEQ ID NO 84經取代、缺失或添加一個或多個氨基酸獲得的且與SEQ ID NO 84功能相同的氨基酸序列或與SEQ ID NO 84具有至少85%序列同一性的氨基酸序列； 所述重鏈可變區的氨基酸序列為SEQ ID NO 82，SEQ ID NO 82經取代、缺失或添加一個或多個氨基酸獲得的且與SEQ ID NO 82功能相同的氨基酸序列或與SEQ ID NO 82具有至少85%序列同一性的氨基酸序列，且所述輕鏈可變區的氨基酸序列為SEQ ID NO 86，SEQ ID NO 86經取代、缺失或添加一個或多個氨基酸獲得的且與SEQ ID NO 86功能相同的氨基酸序列或與SEQ ID NO 86具有至少85%序列同一性的氨基酸序列； 所述重鏈可變區的氨基酸序列為SEQ ID NO 88，SEQ ID NO 88經取代、缺失或添加一個或多個氨基酸獲得的且與SEQ ID NO 88功能相同的氨基酸序列或與SEQ ID NO 88具有至少85%序列同一性的氨基酸序列，且所述輕鏈可變區的氨基酸序列為SEQ ID NO 84，SEQ ID NO 84經取代、缺失或添加一個或多個氨基酸獲得的且與SEQ ID NO 84功能相同的氨基酸序列或與SEQ ID NO 84具有至少85%序列同一性的氨基酸序列； 所述重鏈可變區的氨基酸序列為SEQ ID NO 88，SEQ ID NO 88經取代、缺失或添加一個或多個氨基酸獲得的且與SEQ ID NO 88功能相同的氨基酸序列或與SEQ ID NO 88具有至少85%序列同一性的氨基酸序列，且所述輕鏈可變區的氨基酸序列為SEQ ID NO 86，SEQ ID NO 86經取代、缺失或添加一個或多個氨基酸獲得的且與SEQ ID NO 86功能相同的氨基酸序列或與SEQ ID NO 86具有至少85%序列同一性的氨基酸序列； 所述重鏈可變區的氨基酸序列為SEQ ID NO 82，SEQ ID NO 82經取代、缺失或添加一個或多個氨基酸獲得的且與SEQ ID NO 82功能相同的氨基酸序列或與SEQ ID NO 82具有至少85%序列同一性的氨基酸序列，且所述輕鏈可變區的氨基酸序列為SEQ ID NO 90，SEQ ID NO 90經取代、缺失或添加一個或多個氨基酸獲得的且與SEQ ID NO 90功能相同的氨基酸序列或與SEQ ID NO 90具有至少85%序列同一性的氨基酸序列；或 所述重鏈可變區的氨基酸序列為SEQ ID NO 88，SEQ ID NO 88經取代、缺失或添加一個或多個氨基酸獲得的且與SEQ ID NO 88功能相同的氨基酸序列或與SEQ ID NO 88具有至少85%序列同一性的氨基酸序列，且所述輕鏈可變區的氨基酸序列為SEQ ID NO 90，SEQ ID NO 90經取代、缺失或添加一個或多個氨基酸獲得的且與SEQ ID NO 90功能相同的氨基酸序列或與SEQ ID NO 90具有至少85%序列同一性的氨基酸序列。
  8. 如請求項7所述的抗Claudin18.2抗體或其抗原結合片段，其中： 所述重鏈氨基酸序列為SEQ ID NO 92，SEQ ID NO 92經取代、缺失或添加一個或多個氨基酸獲得的且與SEQ ID NO 92功能相同的氨基酸序列或與SEQ ID NO 92具有至少85%序列同一性的氨基酸序列，且所述輕鏈氨基酸序列為SEQ ID NO 94，SEQ ID NO 94經取代、缺失或添加一個或多個氨基酸獲得的且與SEQ ID NO 94功能相同的氨基酸序列或與SEQ ID NO 94具有至少85%序列同一性的氨基酸序列；或 所述重鏈氨基酸序列為SEQ ID NO 96，SEQ ID NO 96經取代、缺失或添加一個或多個氨基酸獲得的且與SEQ ID NO 96功能相同的氨基酸序列或與SEQ ID NO 96具有至少85%序列同一性的氨基酸序列，且所述輕鏈氨基酸序列為SEQ ID NO 98，SEQ ID NO 98經取代、缺失或添加一個或多個氨基酸獲得的且與SEQ ID NO 98功能相同的氨基酸序列或與SEQ ID NO 98具有至少85%序列同一性的氨基酸序列。
  9. 一種分離的核苷酸，其編碼請求項1-8之任一項所述的抗Claudin18.2抗體或其抗原結合片段。
  10. 如請求項9所述的核苷酸，其中： (1) 編碼所述重鏈氨基酸序列的核苷酸序列如SEQ ID NO 93或SEQ ID NO 97所示；和 (2) 編碼所述輕鏈氨基酸序列的核苷酸序列如SEQ ID NO 95或SEQ ID NO 99所示。
  11. 一種表現載體，其包含如請求項9或10所述的核苷酸。
  12. 一種宿主細胞，其轉化如請求項11所述的表現載體，所述宿主細胞選自原核細胞和真核細胞，優先為哺乳動物細胞。
  13. 一種製備請求項1-8任一項所述的抗Claudin18.2抗體或其抗原結合片段的方法，包括在如請求項12所述的宿主細胞中表現抗體，以及從宿主細胞中分離所述抗體的步驟。
  14. 一種藥物組合物，其包含請求項1-8之任一項所述的抗Claudin18.2抗體或其抗原結合片段和藥學可接受的載體。
  15. 一種如請求項1-8之任一項所述的抗Claudin18.2抗體或其抗原結合片段在製備靶向Claudin18.2的藥物中的應用。
  16. 如請求項15所述的應用，所述靶向Claudin18.2的藥物用於治療胃癌、食管癌、胰腺癌、肺癌、卵巢癌、結腸癌、肝癌、頭頸癌和膽囊癌。
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