TW202146458A - 一種抗PD-L1/TGF-β融合蛋白 - Google Patents

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Abstract

本發明涉及融合蛋白技術領域，具體而言，涉及抗PD-L1/TGF-β融合蛋白。所述融合蛋白包含抗PD-L1抗體、胜肽連接子和TGFβRII胞外結構域，所述TGFβRII胞外結構域透過胜肽連接子接合至抗PD-L1抗體重鏈的C末端。本發明的融合蛋白具有治療PD-L1和TGF-β活性相關的疾病的潛力。

Description

一種抗PD-L1/TGF-β融合蛋白
本發明涉及融合蛋白技術領域，更具體地，涉及一種抗PD-L1/TGF-β融合蛋白。
人程式性細胞死亡受體-1 (PD-1)是一種有288個胺基酸的I型膜蛋白，是已知的主要免疫檢查點(Immune Checkpoint)之一(Blank et al, 2005, Cancer Immunotherapy, 54:307-314)。PD-1表現在已經活化的T淋巴細胞，它與配體PD-L1 (程式性細胞死亡受體-配體1，programmed cell death-Ligand 1)和PD-L2 (程式性細胞死亡受體-配體2，programmed cell death-Ligand 2)結合可以抑制T淋巴細胞的活性及相關的體內細胞免疫反應。PD-L2主要表現在巨噬細胞和樹突狀細胞，而PD-L1則廣泛表現於B、T淋巴細胞及周邊細胞如微血管上皮細胞，肺、肝、心等組織細胞中。大量研究表明，PD-1和PD-L1的相互作用不但是維持體內免疫系統平衡所必須，也是導致PD-L1表現陽性腫瘤細胞規避免疫監視的主要機制和原因。透過阻斷癌細胞對PD-1/PD-L1訊息途徑的負調控，活化免疫系統，能够促進T細胞相關的腫瘤特異性細胞免疫反應，從而打開了一扇新的腫瘤治療方法的大門-腫瘤免疫療法。
PD-1 (由基因Pdcd1編碼)爲與CD28和CTLA-4有關的免疫球蛋白超家族成員。研究成果顯示，當PD-1與其配體(PD-L1和/或PD-L2)結合時會負調節抗原受體訊息傳遞。目前已弄清鼠PD-1結構以及小鼠PD-1與人PD-L1的共結晶結構(Zhang，X.等，Immunity 20：337-347 (2004)； Lin等，Proc. Natl. Acad. Sci. USA 105：3011-6 (2008))。PD-1及類似的家族成員爲I型跨膜糖蛋白，其含有負責配體結合的Ig可變型(V-型)結構域和負責結合訊息傳遞分子的細胞質尾部。PD-1細胞質尾部含有兩個基於酪胺酸的訊息傳遞模體ITIM (免疫受體酪胺酸抑制作用模體)和ITSM (免疫受體酪胺酸轉換作用模體)。
PD-1在腫瘤的免疫逃脫機制中起到了重要的作用。腫瘤免疫療法，即利用人體自身的免疫系統抵禦癌症，是一種突破性的腫瘤治療方法，但是腫瘤微環境可保護腫瘤細胞免受有效的免疫破壞，因此如何打破腫瘤微環境成爲抗腫瘤研究的重點。現有研究成果已確定了PD-1在腫瘤微環境中的作用：PD-L1在許多小鼠和人腫瘤中表現(並在大多數PD-L1陰性腫瘤細胞株中可由IFN-γ誘導)，並被推定爲媒介腫瘤免疫逃脫的重要標的(Iwai Y.等，Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 99：12293-12297 (2002)；Strome S.E.等，Cancer Res.，63：6501-6505 (2003))。透過免疫組織化學評估活組織檢查，已經在人的很多原發性腫瘤中發現PD-1 (在腫瘤浸潤淋巴細胞上)和/或PD-L1在腫瘤細胞上的表現。這樣的組織包括肺癌、肝癌、卵巢癌、子宮頸癌、皮膚癌、結腸癌、神經膠質瘤、膀胱癌、乳腺癌、腎癌、食道癌、胃癌、口腔鱗狀細胞癌、尿道上皮細胞癌和胰腺癌以及頭頸腫瘤等。由此可見，阻斷PD-1/PD-L1的相互作用可以提高腫瘤特異性T細胞的免疫活性，有助於免疫系統清除腫瘤細胞，因此PD-L1成爲開發腫瘤免疫治療藥物的熱門標的。
轉化生長因子-β (transforming growth factor-β，TGF-β)屬於調節細胞生長和分化的TGF-β超家族。TGF-β透過異源四聚體受體複合物傳遞訊息，這個受體複合物是由兩個I型和兩個II型的跨膜絲胺酸/蘇胺酸激酶受體組成。TGF-β是一種多功能的細胞激素，以細胞或背景依賴的方式發揮腫瘤抑制或腫瘤促進的作用。TGF-β訊息的腫瘤抑制作用源於其誘導多個基因表現的能力，當腫瘤發展過程中引入突變或表觀遺傳修飾時，癌細胞逐漸耐受TGF-β訊息的抑制作用，最終導致腫瘤的發展。研究發現阻斷TGF-β訊息傳遞途徑能夠減少腫瘤的轉移。
本領域迫切開發一種特異性佳、療效好且易於製備的抗腫瘤的融合蛋白。
本發明的目的在於提供一種新的抗PD-L1/TGF-β融合蛋白，能同時阻斷PD-L1和TGF-β訊息途徑。本發明的目的還在於提供編碼所述融合蛋白的多核苷酸分子；提供包含所述多核苷酸分子的表現載體；提供包含所述表現載體的宿主細胞；提供所述融合蛋白的製備方法；提供包含所述融合蛋白的藥物組成物；提供所述融合蛋白或所述藥物組成物在製備治療癌症藥物中的應用；提供所述融合蛋白或所述藥物組成物用於治療癌症的方法。
爲了達到上述目的，本發明提供了以下技術方案：
本發明的第一個方面提供了一種抗PD-L1/TGF-β融合蛋白，具有如下通式： Ab-L-TGFβRII ECD (I)
其中Ab爲抗PD-L1抗體，L爲胜肽連接子，TGFβRII ECD爲TGFβRII胞外結構域；所述TGFβRII胞外結構域的N末端透過胜肽連接子接合至抗PD-L1抗體重鏈的C末端；所述抗PD-L1抗體的重鏈包含互補决定區HCDR1-3，其中HCDR1的胺基酸序列如SEQ ID NO：10所示，HCDR2的胺基酸序列如SEQ ID NO：11所示，HCDR3的胺基酸序列如SEQ ID NO：12所示；所述抗PD-L1抗體的輕鏈包含互補决定區LCDR1-3，其中LCDR1的胺基酸序列如SEQ ID NO：13所示，LCDR2的胺基酸序列如SEQ ID NO：14所示，LCDR3的胺基酸序列如SEQ ID NO：15所示。
在一個優選的實施方案中，所述抗PD-L1抗體的重鏈可變區的胺基酸序列如SEQ ID NO：16所示，所述抗PD-L1抗體的輕鏈可變區的胺基酸序列如SEQ ID NO：17所示。
在一個優選的實施方案中，所述抗PD-L1抗體的重鏈胺基酸序列選自SEQ ID NO：1 - SEQ ID NO：3，所述抗PD-L1抗體的輕鏈胺基酸序列如SEQ ID NO：4所示。
在一個優選的實施方案中，所述抗PD-L1抗體爲單株抗體。
在一個優選的實施方案中，所述抗PD-L1抗體爲人源化抗體。
在一個優選的實施方案中，所述抗PD-L1抗體爲IgG類抗體。
在一個優選的實施方案中，所述TGFβRII胞外結構域選自以下組中的一種或其組合： 1) 全長TGFβRII胞外結構域； 2) C端截短6-10個胺基酸的TGFβRII胞外結構域，更優選的，C端截短8個胺基酸的TGFβRII胞外結構域； 3) N端截短18-22個胺基酸的TGFβRII胞外結構域，更優選的，N端截短20個胺基酸的TGFβRII胞外結構域； 4) 包括至少1個糖基化位址突變的全長或截短的TGFβRII胞外結構域，所述突變選自S8P、T16P、T16V、N71Q。
在一個優選的實施方案中，所述TGFβRII胞外結構域的胺基酸序列選自SEQ ID NO：5 - SEQ ID NO：9。
在一個優選的實施方案中，所述胜肽連接子選自(G4 S)3 T或(G4 S)3 XDYTHTP，其中X爲G或S，Y爲K或A。
在更優選的實施方案中，所述融合蛋白選自以下組：869、869F、869J15、869J16、869J17、869M1、869M3。
在更優選的實施方案中，所述融合蛋白選自以下組： 1) 所述融合蛋白的重鏈胺基酸序列如SEQ ID NO：18所示，所述融合蛋白的輕鏈胺基酸序列如SEQ ID NO：4所示； 2) 所述融合蛋白的重鏈胺基酸序列如SEQ ID NO：19所示，所述融合蛋白的輕鏈胺基酸序列如SEQ ID NO：4所示； 3) 所述融合蛋白的重鏈胺基酸序列如SEQ ID NO：20所示，所述融合蛋白的輕鏈胺基酸序列如SEQ ID NO：4所示； 4) 所述融合蛋白的重鏈胺基酸序列如SEQ ID NO：21所示，所述融合蛋白的輕鏈胺基酸序列如SEQ ID NO：4所示； 5) 所述融合蛋白的重鏈胺基酸序列如SEQ ID NO：22所示，所述融合蛋白的輕鏈胺基酸序列如SEQ ID NO：4所示； 6) 所述融合蛋白的重鏈胺基酸序列如SEQ ID NO：23所示，所述融合蛋白的輕鏈胺基酸序列如SEQ ID NO：4所示； 7) 所述融合蛋白的重鏈胺基酸序列如SEQ ID NO：24所示，所述融合蛋白的輕鏈胺基酸序列如SEQ ID NO：4所示。
本發明的第二個方面提供了一種多核苷酸分子，所述多核苷酸分子編碼所述融合蛋白。
本領域技術人員知曉，編碼上述融合蛋白胺基酸序列的多核苷酸分子可以適當引入替換、缺失、改變、插入或增加來提供一個多核苷酸的同系物。
本發明的第三個方面提供了一種表現載體，所述表現載體含有上述的多核苷酸分子。
本發明的第四個方面提供了一種宿主細胞，所述宿主細胞含有上述的表現載體。
本發明的第五個方面提供了一種融合蛋白的製備方法，所述製備方法包括以下步驟： a) 在表現條件下，培養如上所述宿主細胞，從而表現抗PD-L1/TGF-β融合蛋白； b) 分離並純化步驟a)所述的融合蛋白。
本發明的第六個方面提供了一種藥物組成物，所述藥物組成物包含有效量的上述的融合蛋白和一種或多種藥學上可接受的載劑、稀釋劑或賦形劑。
在另一優選例中，所述藥物組成物中還含有抗腫瘤劑。
在另一優選例中，所述藥物組成物爲單位劑型。
在另一優選例中，所述的抗腫瘤劑可以與所述融合蛋白單獨存在於獨立的包裝內，或所述抗腫瘤劑可以與所述融合蛋白偶聯。
在另一優選例中，所述藥物組成物的劑型包括胃腸給藥劑型或胃腸外給藥劑型。
在另一優選例中，所述的胃腸外給藥劑型包括靜脈注射、靜脈滴注、皮下注射、局部注射、肌肉注射、瘤內注射、腹腔內注射、顱內注射、或腔內注射。
本發明的第七個方面提供了上述的融合蛋白、藥物組成物在製備治療癌症的藥物中的用途。
根據本發明，所述癌症選自：結直腸癌、膽管癌、膽囊癌、食道癌、胃癌、肺癌、肝癌、乳腺癌、卵巢癌、子宮頸癌、胰腺癌、前列腺癌、腎癌、膀胱癌、頭頸癌、淋巴瘤、黑色素瘤、皮膚癌、膠質瘤、間皮瘤等。
本發明的第八個方面提供了一種治療癌症的方法，包括向有需要的受試者施用上述的融合蛋白、或其免疫偶聯物、或藥物組成物。
根據本發明，所述癌症選自：結直腸癌、膽管癌、膽囊癌、食道癌、胃癌、肺癌、肝癌、乳腺癌、卵巢癌、子宮頸癌、胰腺癌、前列腺癌、腎癌、膀胱癌、頭頸癌、淋巴瘤、黑色素瘤、皮膚癌、膠質瘤、間皮瘤等。
本發明的第九個方面提供了一種免疫偶聯物，所述免疫偶聯物包括： (a) 如本發明第一方面所述的融合蛋白；和 (b) 選自下組的偶聯部分：可檢測標記物、藥物、毒素、細胞激素、放射性核種、或酶。
在另一優選例中，所述偶聯物部分選自：螢光或發光標記物、放射性標記物、MRI (核磁共振成像)或CT (電腦X射線斷層掃描技術)造影劑、或能夠產生可檢測產物的酶、放射性核種、生物毒素、細胞激素(如IL-2等)。
在另一優選例中，所述的免疫偶聯物包括抗體－藥物偶聯物(ADC)。
在另一優選例中，所述的免疫偶聯物用於製備治療腫瘤的藥物組成物。
本發明的積極效果在於：本發明的融合蛋白具有改善的電荷異質性，能與PD-L1和TGF-β高親和力結合，其與PD-L1的親和力與抗PD-L1單抗陽性對照M8相當，其與TGF-β的親和力與融合蛋白陽性對照M7824相當。本發明的融合蛋白能有效阻斷PD-1與PD-L1的結合，其阻斷能力與抗PD-L1單抗陽性對照M8相當，且能以劑量依賴性形式抑制TGF-β誘導的pSMAD3報導子活性，其抑制活性與融合蛋白陽性對照M7824能力相當。本發明的融合蛋白在人黑色素瘤移植瘤模型中展現出了顯著抑制腫瘤生長的效果。本發明的融合蛋白具有治療PD-L1和TGF-β活性相關的疾病的潛力。
具體實施方式
本發明人透過廣泛而深入的研究，首次建構了一種抗PD-L1/TGF-β融合蛋白。具體地，在申請人自主開發的抗PD-L1抗體(參見PCT/CN2020/090442)的基礎上，在單抗重鏈的C-末端用柔性胜肽連接子連接了TGFβRII胞外結構域，獲得結合PD-L1和TGF-β分子的雙標的融合蛋白。此外，本發明人透過改造融合蛋白中的TGFβRII胞外結構域的糖基化位址，獲得電荷異質性明顯改善的融合蛋白，進而提高並改善融合蛋白的穩定性及其免疫原性。本發明的融合蛋白在小鼠體內具有顯著的抗腫瘤活性，因此有望被開發爲一種療效優越的抗腫瘤藥物。在此基礎上，本發明人完成了本發明。術語
本發明中，術語“融合蛋白”是指由兩個或多個相同或不同的多肽序列融合得到的新的多肽序列。術語“融合”是指由肽鍵直接連接或借助一個或多個連接胜肽(胜肽連接子)有效連接。術語“連接胜肽(胜肽連接子)”是指可以連接兩個多肽序列的短鏈胜肽，一般是長度爲2-30個胺基酸的胜肽。
如本文所用，術語“胜肽連接子(linker)”是指插入免疫球蛋白結構域中爲輕鏈和重鏈的結構域提供足夠的可動性以折疊成交換雙重可變區免疫球蛋白的一個或多個胺基酸殘基。在本發明中，優選的胜肽連接子是指胜肽連接子L，其中L連接TGFβRII胞外結構域的N末端至抗PD-L1抗體重鏈的C末端。
合適的胜肽連接子實例包括單甘胺酸(Gly)、或絲胺酸(Ser)殘基，胜肽連接子中胺基酸殘基的標識和序列可隨著胜肽連接子中需要實現的次級結構要素的類型而變化。在本發明中，所述胜肽連接子選自(G4 S)3 T或(G4 S)3 XDYTHTP，其中X爲G或S，Y爲K或A。
本發明中，術語“抗體(Antibody，縮寫Ab)”是有相同結構特徵的約150000道爾頓的異四聚糖蛋白，其由兩條相同的輕鏈(L)和兩條相同的重鏈(H)組成。每條重鏈的一端有可變區(VH)，其後是恆定區，重鏈恆定區由三個結構域CH1、CH2、以及CH3構成。每條輕鏈的一端有可變區(VL)，另一端有恆定區，輕鏈恆定區包括一個結構域CL；輕鏈的恆定區與重鏈恆定區的CH1結構域配對，輕鏈的可變區與重鏈的可變區配對。恆定區不直接參與抗體與抗原的結合，但是它們表現出不同的效應功能，例如參與抗體依賴的細胞媒介的細胞毒性作用(ADCC，antibody-dependent cell-mediated cytotoxicity)等。重鏈恆定區包括IgG1、IgG2、IgG3、IgG4亞型；輕鏈恆定區包括κ (Kappa)或λ (Lambda)。抗體的重鏈和輕鏈透過重鏈的CH1結構域和輕鏈的CL結構域之間的二硫鍵共價連接在一起，抗體的兩條重鏈透過樞紐區之間形成的多肽間二硫鍵共價連接在一起。
本發明中，術語“單株抗體(單抗)”指從一類基本均一的群體獲得的抗體，即該群體中包含的單個抗體是相同的，除少數可能存在的天然發生的突變外。單株抗體高特異性地針對單個抗原位址。而且，與常規多株抗體製劑(通常是具有針對不同抗原决定簇的不同抗體的混合物)不同，各單株抗體是針對抗原上的單個决定簇。除了它們的特異性外，單株抗體的好處還在於它們可以透過融合瘤培養來合成，不會被其它免疫球蛋白污染。
本發明中，術語“人源化”是指其CDR來源於非人物種(優選小鼠)抗體，抗體分子中殘餘的部分(包括框架區和恆定區)來源於人抗體。此外，框架區殘基可被改變以維持結合親和性。
如本文所用，術語“框架區”(FR)指免疫球蛋白可變區內高度變異區之外的胺基酸組成和排列順序變化相對較小的部分。免疫球蛋白的輕鏈和重鏈各具有四個FR，分別稱爲FR1-L、FR2-L、FR3-L、FR4-L和FR1-H、FR2-H、FR3-H、FR4-H。相應地，輕鏈可變結構域可因此稱作(FR1-L)-(CDR1-L)-(FR2-L)-(CDR2-L)-(FR3-L)-(CDR3-L)-(FR4-L)且重鏈可變結構域可因此表示爲(FR1-H)-(CDR1-H)-(FR2-H)-(CDR2-H)-(FR3-H)-(CDR3-H)-(FR4-H)。優選地，本發明的FR是人抗體FR或其衍生物，所述人抗體FR的衍生物與天然存在的人抗體FR基本相同，即序列相同性達到85%、90%、95%、96%、97%、98%或99%。
獲知CDR的胺基酸序列，本領域的技術人員可輕易確定框架區FR1-L、FR2-L、FR3-L、FR4-L和/或FR1-H、FR2-H、FR3-H、FR4-H。
如本文所用，術語“人框架區”是與天然存在的人抗體的框架區基本相同的(約85%或更多，具體地90%、95%、97%、99%或100%)框架區。雙功能融合蛋白
本發明的雙功能融合蛋白是一種抗PD-L1×TGF-β的雙功能融合蛋白，包括抗PD-L1抗體部分以及負責捕獲TGF-β的TGFβRII胞外結構域部分。
優選地，本發明抗PD-L1抗體的序列如專利申請PCT/CN2020/090442中所述，本領域技術人員也可以透過本領域熟知的技術對本發明抗PD-L1抗體進行修飾或改造，例如添加、缺失和/或取代一個或幾個胺基酸殘基，從而進一步增加抗PD-L1的親和力或結構穩定性，並透過常規的測定方法獲得修飾或改造後的結果。
在本發明中，本發明雙功能融合蛋白還包括其保守性變異體，指與本發明雙功能融合蛋白的胺基酸序列相比，有至多10個，較佳地至多8個，更佳地至多5個，最佳地至多3個胺基酸被性質相似或相近的胺基酸所替換而形成多肽。這些保守性變異多肽最好根據表A進行胺基酸替換而産生。 表 A
最初的殘基 代表性的取代 優選的取代
Ala (A) Val； Leu； Ile Val
Arg (R) Lys； Gln； Asn Lys
Asn (N) Gln； His； Lys； Arg Gln
Asp (D) Glu Glu
Cys (C) Ser Ser
Gln (Q) Asn Asn
Glu (E) Asp Asp
Gly (G) Pro； Ala Ala
His (H) Asn； Gln； Lys； Arg Arg
Ile (I) Leu； Val； Met； Ala； Phe Leu
Leu (L) Ile； Val； Met； Ala； Phe Ile
Lys (K) Arg； Gln； Asn Arg
Met (M) Leu； Phe； Ile Leu
Phe (F) Leu； Val； Ile； Ala； Tyr Leu
Pro (P) Ala Ala
Ser (S) Thr Thr
Thr (T) Ser Ser
Trp (W) Tyr； Phe Tyr
Tyr (Y) Trp； Phe； Thr； Ser Phe
Val (V) Ile； Leu； Met； Phe； Ala Leu
本發明中，術語“抗”和“結合”是指兩分子間的非隨機的結合反應，如抗體和其所針對的抗原之間的反應。通常，抗體以小於大約10-7 M，例如小於大約10-8 M、10-9 M、10-10 M、10-11 M或更小的平衡解離常數(KD)結合該抗原。術語“KD”是指特定抗體-抗原相互作用的平衡解離常數，其用於描述抗體與抗原之間的結合親和力。平衡解離常數越小，抗體-抗原結合越緊密，抗體與抗原之間的親和力越高。例如，使用表面電漿共振術(Surface Plasmon Resonance，縮寫SPR)在BIACORE儀中測定抗體與抗原的結合親和力或使用ELISA測定抗體與抗原結合的相對親和力。
本發明的雙功能融合蛋白可以單獨使用，也可與可檢測標記物(爲診斷目的)、治療劑、或任何以上這些物質的組合結合或偶聯。編碼核酸和表現載體
本發明還提供了編碼上述抗體或其片段或其融合蛋白的多核苷酸分子。本發明的多核苷酸可以是DNA形式或RNA形式。DNA形式包括cDNA、基因組DNA或人工合成的DNA。DNA可以是單鏈的或是雙鏈的。DNA可以是編碼鏈或非編碼鏈。本發明中，術語“表現載體”是指攜帶表現匣用於表現特定目標蛋白或其他物質的載體，如質體、病毒載體(如腺病毒、反轉錄病毒)、噬菌體、酵母質體或其他載體。例如包含適當的調控序列，例如啓動子、終止子、增強子等的本領域的常規表現載體，所述表現載體包括但並不限於：病毒載體(如腺病毒、反轉錄病毒)、質體、噬菌體、酵母質體或其他載體。所述表現載體較佳地包括pDR1、pcDNA3.4(+)、pDHFR或pTT5。
一旦獲得了有關的序列，就可以用重組法來大批量地獲得有關序列。這通常是將其選殖入載體，再轉入細胞，然後透過常規方法從增殖後的宿主細胞中分離得到有關序列。
本發明還涉及包含上述的適當DNA序列以及適當啓動子或者控制序列的載體。這些載體可以用於轉形適當的宿主細胞，以使其能夠表現蛋白質。
本發明中，術語“宿主細胞”爲本領域常規的各種宿主細胞，只要能使載體穩定地自行複製，且所攜帶的多核苷酸分子可被有效表現即可。其中所述宿主細胞包括原核表現細胞和真核表現細胞，所述宿主細胞較佳地包括：COS、CHO、NS0、sf9、sf21、DH5α、BL21(DE3)、TG1、BL21(DE3)、293F或293E細胞。藥物組成物和應用
本發明還提供了一種組成物。優選地，所述的組成物是藥物組成物，它含有上述的抗體或其活性片段或其融合蛋白，以及藥學上可接受的載劑。通常，可將這些物質配製於無毒的、惰性的和藥學上可接受的水性載劑介質中，其中pH通常約爲4-8，較佳地pH約爲5-7，儘管pH值可隨被配製物質的性質以及待治療的病症而有所變化。配製好的藥物組成物可以透過常規途徑進行給藥，其中包括(但並不限於)：靜脈注射、靜脈滴注、皮下注射、局部注射、肌肉注射、瘤內注射、腹腔內注射(如腹膜內)、顱內注射、或腔內注射。
本發明中，術語“藥物組成物”是指本發明的雙功能融合蛋白可以和藥學上可以接受的載劑一起組成藥物製劑組成物從而更穩定地發揮療效，這些製劑可以保證本發明揭示的雙功能融合蛋白的胺基酸核心序列的構象完整性，同時還保護蛋白質的多官能基防止其降解(包括但不限於凝聚、脫胺或氧化)。
本發明的藥物組成物含有安全有效量(如0.001-99 wt%，較佳地0.01-90 wt%，更佳地0.1-80 wt%)的本發明上述的雙功能融合蛋白(或其偶聯物)以及藥學上可接受的載劑或賦形劑。這類載劑包括(但並不限於)：鹽水、緩衝液、葡萄糖、水、甘油、乙醇、及其組合。藥物製劑應與給藥方式相匹配。本發明的藥物組成物可以被製成針劑形式，例如用生理鹽水或含有葡萄糖和其他佐劑的水溶液透過常規方法進行製備。藥物組成物如針劑、溶液宜在無菌條件下製造。活性成分的給藥量是治療有效量，例如每天約10微克/千克體重-約50毫克/千克體重。此外，本發明的雙功能融合蛋白還可與其他治療劑一起使用。
使用藥物組成物時，是將安全有效量的雙功能融合蛋白或其免疫偶聯物施用於哺乳動物，其中該安全有效量通常至少約10微克/千克體重，而且在大多數情况下不超過約50毫克/千克體重，較佳地該劑量是約10微克/千克體重-約10毫克/千克體重。當然，具體劑量還應考慮給藥途徑、病人健康狀况等因素，這些都是熟練醫師技能範圍之內的。
本發明中，術語“有效量”是指本發明的藥物組成物施用受試者後，在治療的個體中産生預期效果的量或劑量，該預期效果包括個體病症的改善。術語“受試者”包括但不限於哺乳動物，例如人、非人靈長類動物、大鼠和小鼠等。
以下實施例涉及的序列資訊總結在序列表表1中。 表1 序列表
SEQ ID NO： 序列說明與具體序列
1 M8重鏈胺基酸序列
QVQLQQSGGGLVKPSQSLSLTCTVSGFSLTSYGVHWVRQPPGKGLEWIGLIWSGGGTDYNPSLKSRLTISRDTSKNQVSFKISSLTAADTAVYYCARQLGLRAMDYWGQGTSVTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSCDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK
2 M8重鏈胺基酸序列(K447G)
QVQLQQSGGGLVKPSQSLSLTCTVSGFSLTSYGVHWVRQPPGKGLEWIGLIWSGGGTDYNPSLKSRLTISRDTSKNQVSFKISSLTAADTAVYYCARQLGLRAMDYWGQGTSVTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSCDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGG
3 M8重鏈胺基酸序列(447位删除)
QVQLQQSGGGLVKPSQSLSLTCTVSGFSLTSYGVHWVRQPPGKGLEWIGLIWSGGGTDYNPSLKSRLTISRDTSKNQVSFKISSLTAADTAVYYCARQLGLRAMDYWGQGTSVTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSCDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPG
4 M8輕鏈胺基酸序列(即融合蛋白的輕鏈胺基酸序列)
EIVLTQSPDFLSVTPKEKVTITCRASQSIGTTIHWYQQKPDQSPKLLIKYASQSFSGVPSRFSGSGSGTDFTLTINSVEAEDAATYYCQQSNSWPLTFGAGTKLEIKRTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC
5 TGFβRII胞外結構域序列：ECD (1-136)
IPPHVQKS VNNDMIVT DNNGAVKFPQLCKFCDVRFSTCDNQKSCMSN CSITSICEKPQEVCVAVWRKNDEN ITLETVCHDPKLPYHDFILEDAASPKCIMKEKKKPGETFFMCSCSSDECNDNIIFSEEYN TSNPD
6 TGFβRII胞外結構域序列：ECD (21-128)/N71Q
AVKFPQLCKFCDVRFSTCDNQKSCMSN CSITSICEKPQEVCVAVWRKNDEQ ITLETVCHDPKLPYHDFILEDAASPKCIMKEKKKPGETFFMCSCSSDECNDNIIFSE
7 TGFβRII胞外結構域序列：ECD (1-128)/N71Q
IPPHVQKS VNNDMIVT DNNGAVKFPQLCKFCDVRFSTCDNQKSCMSN CSITSICEKPQEVCVAVWRKNDEQ ITLETVCHDPKLPYHDFILEDAASPKCIMKEKKKPGETFFMCSCSSDECNDNIIFSE
8 TGFβRII胞外結構域序列：ECD (1-128)/S8P, T16P, N71Q
IPPHVQKP VNNDMIVP DNNGAVKFPQLCKFCDVRFSTCDNQKSCMSN CSITSICEKPQEVCVAVWRKNDEQ ITLETVCHDPKLPYHDFILEDAASPKCIMKEKKKPGETFFMCSCSSDECNDNIIFSE
9 TGFβRII胞外結構域序列：ECD (1-128)/S8P, T16V, N71Q
IPPHVQKP VNNDMIVV DNNGAVKFPQLCKFCDVRFSTCDNQKSCMSN CSITSICEKPQEVCVAVWRKNDEQ ITLETVCHDPKLPYHDFILEDAASPKCIMKEKKKPGETFFMCSCSSDECNDNIIFSE
10 M8重鏈互補决定區HCDR1胺基酸序列
GFSLTSYGVH
11 M8重鏈互補决定區HCDR2胺基酸序列
LIWSGGGTDYNPSLKS
12 M8重鏈互補决定區HCDR3胺基酸序列
QLGLRAMDY
13 M8輕鏈互補决定區LCDR1胺基酸序列
RASQSIGTTIH
14 M8輕鏈互補决定區LCDR2胺基酸序列
YASQSFS
15 M8輕鏈互補决定區LCDR3胺基酸序列
QQSNSWPLT
16 M8重鏈可變區胺基酸序列QVQLQQSGGGLVKPSQSLSLTCTVSGFSLTSYGVHWVRQPPGKGLEWIGLIWSGGGTDYNPSLKSRLTISRDTSKNQVSFKISSLTAADTAVYYCARQLGLRAMDYWGQGTSVTVSS
17 M8輕鏈可變區胺基酸序列
EIVLTQSPDFLSVTPKEKVTITCRASQSIGTTIHWYQQKPDQSPKLLIKYASQSFSGVPSRFSGSGSGTDFTLTINSVEAEDAATYYCQQSNSWPLTFGAGTKLEIK
18 融合蛋白869重鏈胺基酸序列 QVQLQQSGGGLVKPSQSLSLTCTVSGFSLTSYGVHWVRQPPGKGLEWIGLIWSGGGTDYNPSLKSRLTISRDTSKNQVSFKISSLTAADTAVYYCARQLGLRAMDYWGQGTSVTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSCDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGKGGGGSGGGGSGGGGSTIPPHVQKSVNNDMIVTDNNGAVKFPQLCKFCDVRFSTCDNQKSCMSNCSITSICEKPQEVCVAVWRKNDENITLETVCHDPKLPYHDFILEDAASPKCIMKEKKKPGETFFMCSCSSDECNDNIIFSEEYNTSNPD
19 融合蛋白869F重鏈胺基酸序列 QVQLQQSGGGLVKPSQSLSLTCTVSGFSLTSYGVHWVRQPPGKGLEWIGLIWSGGGTDYNPSLKSRLTISRDTSKNQVSFKISSLTAADTAVYYCARQLGLRAMDYWGQGTSVTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSCDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGKGGGGSGGGGSGGGGSTIPPHVQKSVNNDMIVTDNNGAVKFPQLCKFCDVRFSTCDNQKSCMSNCSITSICEKPQEVCVAVWRKNDEQITLETVCHDPKLPYHDFILEDAASPKCIMKEKKKPGETFFMCSCSSDECNDNIIFSE
20 融合蛋白869J15重鏈胺基酸序列 QVQLQQSGGGLVKPSQSLSLTCTVSGFSLTSYGVHWVRQPPGKGLEWIGLIWSGGGTDYNPSLKSRLTISRDTSKNQVSFKISSLTAADTAVYYCARQLGLRAMDYWGQGTSVTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSCDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGGGGGGSGGGGSGGGGSGDATHTPAVKFPQLCKFCDVRFSTCDNQKSCMSNCSITSICEKPQEVCVAVWRKNDEQITLETVCHDPKLPYHDFILEDAASPKCIMKEKKKPGETFFMCSCSSDECNDNIIFSE
21 融合蛋白869J16重鏈胺基酸序列 QVQLQQSGGGLVKPSQSLSLTCTVSGFSLTSYGVHWVRQPPGKGLEWIGLIWSGGGTDYNPSLKSRLTISRDTSKNQVSFKISSLTAADTAVYYCARQLGLRAMDYWGQGTSVTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSCDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGGGGGSGGGGSGGGGSGDATHTPAVKFPQLCKFCDVRFSTCDNQKSCMSNCSITSICEKPQEVCVAVWRKNDEQITLETVCHDPKLPYHDFILEDAASPKCIMKEKKKPGETFFMCSCSSDECNDNIIFSE
22 融合蛋白869J17重鏈胺基酸序列 QVQLQQSGGGLVKPSQSLSLTCTVSGFSLTSYGVHWVRQPPGKGLEWIGLIWSGGGTDYNPSLKSRLTISRDTSKNQVSFKISSLTAADTAVYYCARQLGLRAMDYWGQGTSVTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSCDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGGGGGSGGGGSGGGGSSDKTHTPAVKFPQLCKFCDVRFSTCDNQKSCMSNCSITSICEKPQEVCVAVWRKNDEQITLETVCHDPKLPYHDFILEDAASPKCIMKEKKKPGETFFMCSCSSDECNDNIIFSE
23 融合蛋白869M1重鏈胺基酸序列 QVQLQQSGGGLVKPSQSLSLTCTVSGFSLTSYGVHWVRQPPGKGLEWIGLIWSGGGTDYNPSLKSRLTISRDTSKNQVSFKISSLTAADTAVYYCARQLGLRAMDYWGQGTSVTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSCDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGKGGGGSGGGGSGGGGSTIPPHVQKPVNNDMIVPDNNGAVKFPQLCKFCDVRFSTCDNQKSCMSNCSITSICEKPQEVCVAVWRKNDEQITLETVCHDPKLPYHDFILEDAASPKCIMKEKKKPGETFFMCSCSSDECNDNIIFSE
24 融合蛋白869M3重鏈胺基酸序列 QVQLQQSGGGLVKPSQSLSLTCTVSGFSLTSYGVHWVRQPPGKGLEWIGLIWSGGGTDYNPSLKSRLTISRDTSKNQVSFKISSLTAADTAVYYCARQLGLRAMDYWGQGTSVTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSCDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGKGGGGSGGGGSGGGGSTIPPHVQKPVNNDMIVVDNNGAVKFPQLCKFCDVRFSTCDNQKSCMSNCSITSICEKPQEVCVAVWRKNDEQITLETVCHDPKLPYHDFILEDAASPKCIMKEKKKPGETFFMCSCSSDECNDNIIFSE
25 M7824重鏈胺基酸序列 EVQLLESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSSYIMMWVRQAPGKGLEWVSSIYPSGGITFYADTVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCARIKLGTVTTVDYWGQGTLVTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKRVEPKSCDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGAGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSGIPPHVQKSVNNDMIVTDNNGAVKFPQLCKFCDVRFSTCDNQKSCMSNCSITSICEKPQEVCVAVWRKNDENITLETVCHDPKLPYHDFILEDAASPKCIMKEKKKPGETFFMCSCSSDECNDNIIFSEEYNTSNPD
26 M7824輕鏈胺基酸序列 QSALTQPASVSGSPGQSITISCTGTSSDVGGYNYVSWYQQHPGKAPKLMIYDVSNRPSGVSNRFSGSKSGNTASLTISGLQAEDEADYYCSSYTSSSTRVFGTGTKVTVLGQPKANPTVTLFPPSSEELQANKATLVCLISDFYPGAVTVAWKADGSPVKAGVETTKPSKQSNNKYAASSYLSLTPEQWKSHRSYSCQVTHEGSTVEKTVAPTECS
以下實施例中使用的抗人PD-L1抗體陽性對照M8來源於PCT/CN2020/090442，其重鏈和輕鏈胺基酸序列分別爲序列表表1中的SEQ ID NO：1和SEQ ID NO：4。
以下實施例中使用的抗PD-L1/TGF-β融合蛋白陽性對照M7824來源於US20150225483A1，其重鏈和輕鏈胺基酸序列分別爲序列表表1中的SEQ ID NO：25和SEQ ID NO：26。
以下實施例中所用試劑和原料若無特殊說明，均可從商業途徑購得。
以下實驗例是對本發明進行進一步的說明，不應理解爲對本發明的限制。實施例不包括對傳統方法或本領域常規方法的詳細描述，如多核苷酸分子的製備方法、用於建構載體和質體的方法、將編碼蛋白的基因插入到這樣的載體和質體的方法或將質體引入宿主細胞的方法、宿主細胞的培養方法等，這樣的方法對於本領域中具有普通技術的人員是衆所周知的，並且在許多出版物中都有所描述，包括Sambrook, J., Fritsch,E.F. and Maniais，T. (1989) Molecular Cloning：A Laboratory Manual，2nd edition，Cold spring Harbor Laboratory Press。下列實施例中未註明具體條件的實驗方法，通常按照常規條件，或按照製造廠商所建議的條件。除非另外說明，否則百分比和份數是重量百分比和重量份數。實施例 1. 抗 PD-L1/TGF-β 雙功能融合蛋白建構
採用TGFβRII胞外結構域作爲融合蛋白中免疫調節分子部分，將抗PD-L1抗體M8作爲融合蛋白的標靶部分，形成抗PD-L1/TGFβ雙功能融合蛋白(結構示意圖如圖1A)，結構通式如下： Ab-L-TGFβRII ECD(I)
其中TGFβRII ECD爲TGFβRII胞外結構域，包括全長形式、截短形式或突變體形式的TGFβRII胞外結構域。其中Ab爲M8抗體或M8抗體的突變體。其中L爲胜肽連接子，包括(G4 S)3 T或(G4 S)3 XDYTHTP，其中X爲G或S，Y爲K或A。
發明人對融合蛋白結構進行了持續研究與改進，首先利用同源重組技術將抗PD-L1抗體M8的重鏈C末端胺基酸透過胜肽連接子(G4 S)3 T與TGFβRII胞外結構域N末端連接，並與M8的輕鏈一起表現，得到融合蛋白869。由於869的電荷異質性較爲嚴重，發明人對此進行了最佳化，研究發現，TGFβRII胞外結構域有3個N-糖基化位址，分別爲N47、N71、N131 (底線表示)，以及N端的O-糖基化位址S8、T16 (底線表示)。糖基化導致抗PD-L1/TGF-β雙功能融合蛋白電荷異質性非常複雜。爲了減少糖基化修飾的複雜程度，將糖基化位址進行N71Q突變，C端截短8個胺基酸，得到序列869F；將糖基化位址進行S8P、T16P、N71Q突變，C端截短8個胺基酸，得到序列869M1；將N端的糖基化位址進行S8P、T16V、N71Q突變，C端截短8個胺基酸，得到序列869M3；此外截短N端20個胺基酸，C端8個胺基酸，並加入不同胜肽連接子得到869J15-17系列蛋白。加入胜肽連接子(G4 S)3 GDATHTP得到869J15，加入胜肽連接子(G4 S)3 GDATHTP得到869J16，加入胜肽連接子(G4 S)3 SDKTHTP得到869J17 (以上建構的融合蛋白序列描述見表2)。電荷異質性檢測結果(圖1B-圖1E)發現融合蛋白869F的電荷異質性相比融合蛋白869，得到明顯改善，而869M1，869M3，869J15-17系列融合蛋白電荷異質性的改善，則更加顯著。電荷異質性是重組蛋白藥物的重要品質屬性，改善的電荷異質性有利於提高融合蛋白的穩定性、改善免疫原性等。 表2. 融合蛋白序列描述
融合蛋白例 融合蛋白序列描述
869 M8-LSPGK(G4S)3T-ECD(1-136)
869F M8-LSPGK(G4S)3T-ECD(1-128)/N71Q
869J15 M8-LSPGG(G4S)3GDATHTP-ECD(21-128)/N71Q
869J16 M8-LSPG(G4S)3GDATHTP-ECD(21-128)/N71Q
869J17 M8-LSPG(G4S)3SDKTHTP-ECD(21-128)/N71Q
869M1 M8-LSPGK(G4S)3T-ECD(1-128)/S8P, T16P, N71Q
869M3 M8-LSPGK(G4S)3T-ECD(1-128)/S8P, T16V, N71Q
註：M8-LSPGK表示M8的重鏈，M8-LSPGG表示M8的重鏈的447位胺基酸殘基K突變成G，M8-LSPG表示M8的重鏈的447位胺基酸殘基K删除。 ECD (1-136)表示全長136個胺基酸的TGFβRII胞外結構域。 ECD (21-128)表示N端截短20個胺基酸，C端截短8個胺基酸的TGFβRII胞外結構域。 ECD (1-128)表示C端截短8個胺基酸的TGFβRII胞外結構域。實施例 2. 抗 PD-L1/TGF-β 雙功能融合蛋白表現與純化
將以上建構的抗PD-L1/TGF-β雙功能融合蛋白重鏈和輕鏈的DNA片段分別次選殖到pTT5載體中，萃取重組質體共轉染CHO細胞和/或293F細胞。細胞培養7天後，將培養液透過高速離心、微孔濾膜抽真空過濾後上樣至HiTrap MabSelect SuRe管柱，用100 mM檸檬酸，pH3.5的洗提液一步洗提蛋白，回收目標樣品並透析換液至PBS。將純化後的蛋白用HPLC檢測，圖2A-圖2B檢測結果表明融合蛋白分子狀態均一，單體純度達到97%以上。實施例 3. 酵素連結免疫吸附法 (ELISA) 測定抗 PD-L1/TGF-β 雙功能融合蛋白對抗原的親和力 3.1 ELISA 檢測抗 PD-L1/TGF-β 雙功能融合蛋白與 PD-L1 的親和力
製備重組PD-L1-ECD-Fc蛋白(製備方法參照WO2018/137576A1)，以100 ng/孔塗覆盤，4℃過夜。PBST洗盤3次，加入200 μl/孔封阻液，37℃放置1小時後PBST洗盤1次待用。用稀釋液稀釋抗體至100 nM，4倍比稀釋形成12個濃度梯度，依次加入封阻後的酵素標示盤，100 μl/孔，37℃放置1小時。PBST洗盤3次，加入HRP標記的羊抗人Fab抗體(購自abcam，Cat.#ab87422)，37℃放置30分鐘。PBST洗盤3次後，在吸水紙上儘量拍乾殘留液滴，每孔加入100 μl的TMB，室溫(20±5℃)避光放置5分鐘；每孔加入終止液終止基質反應，酵素標示讀取儀450 nm處讀取OD值，GraphPad Prism 6進行數據分析，作圖並計算EC50 。
實驗結果如圖3A所示，抗PD-L1/TGFβ雙功能融合蛋白869M1，869M3，869J15和陽性對照M8單抗均能有效結合PD-L1-ECD，EC50 (nM)值分別爲0.2374、0.3278、0.399和0.3335，親和力相當。3.2 ELISA 檢測抗 PD-L1/TGF-β 雙功能融合蛋白與 TGF-β1 的親和力
爲了檢測抗PD-L1/TGF-β雙功能融合蛋白與TGF-β1的結合能力，將TGF-β1蛋白(購自acrobiosystems，Cat.#TG1-H4212)以20 ng/孔塗覆盤，4℃過夜。PBST洗盤3次，加入200μl/孔封阻液，37℃放置1小時後PBST洗盤1次待用。用稀釋液稀釋抗PD-L1/TGF-β雙功能融合蛋白至起始濃度分別爲327 nM (869J15)，418 nM (869J16)，582 nM (869J17)及200 nM (869M1、869M3及M7824)，3倍比(圖3B)或4倍比(圖3C)稀釋形成12個濃度梯度，依次加入封阻後的酵素標示盤，100 μl/孔，37℃放置1小時。PBST洗盤3次，加入HRP標記的鼠抗人Fab抗體，37℃放置30分鐘。PBST洗盤3次後，在吸水紙上儘量拍乾殘留液滴，每孔加入100 μl的TMB，室溫(20±5℃)避光放置5分鐘；每孔加入50 μl 2 M H2 SO4 終止液終止基質反應，酵素標示讀取儀450 nm處讀取OD值，GraphPad Prism 6進行數據分析，作圖並計算EC50 。
實驗結果如圖3B和3C所示，抗PD-L1/TGF-β雙功能融合蛋白可以特異性的結合TGF-β1，抗PD-L1/TGF-β雙功能融合蛋白869J15、869J16、869J17、869M1、869M3及陽性對照M7824的EC50 (nM)值分別爲1.466、1.508、1.552、0.8196、0.8983和1.475，親和力與陽性對照M7824相當。3.3 ELISA 檢測抗 PD-L1/TGF-β 雙功能融合蛋白同時結合 PD-L1 和 TGF-β1 的能力
空間位阻可能會影響抗PD-L1/TGF-β雙功能融合蛋白同時結合兩種抗原的能力。爲了檢測抗PD-L1/TGF-β雙功能融合蛋白同時結合PD-L1和TGF-β1的能力，將TGF-β1以20 ng/孔塗覆盤，4℃過夜。PBST洗盤3次，加入200 μl/孔封阻液，37℃放置1小時後PBST洗盤1次待用。用稀釋液稀釋抗PD-L1/TGF-β雙功能融合蛋白至起始濃度爲130 nM (869J15)，167 nM (869J16)，233 nM (869J17)及139 nM (M8)，4倍比稀釋形成10個濃度梯度，依次加入封阻後的酵素標示盤，100 μl/孔，37℃放置1小時。PBST洗盤3次，按150 ng/孔加入PD-L1-ECD-Fc-biotin，37℃放置1小時。PBST洗盤3次後加入HRP標記的Streptavidin，37℃放置30分鐘。PBST洗盤3次後，在吸水紙上儘量拍乾殘留液滴，每孔加入100 μl的TMB，室溫(20±5℃)避光放置5分鐘；每孔加入50 μl 2 M H2 SO4 終止液終止基質反應，酵素標示讀取儀450 nm處讀取OD值，GraphPad Prism 6進行數據分析，作圖並計算EC50 。
實驗結果如圖3D所示，抗PD-L1/TGF-β雙功能融合蛋白869J15、869J16、869J17均能同時結合PD-L1和TGF-β1，EC50 (nM)值分別爲1.556、1.303、0.9251。實施例 4.  FACS 法測定抗 PD-L1/TGF-β 雙功能融合蛋白對標靶細胞表面抗原 PD-L1 的結合親和力
本實驗以細胞表面表現PD-L1的PD-L1aAPC/CHO-K1細胞(購自promega，Cat.#J1252)作爲標靶細胞，將標靶細胞按照2×105 /孔接種於96孔盤，用含有0.5% BSA的PBS洗滌三次，每次300 g離心5分鐘，棄上清液。將100 μl按照3倍梯度從起始濃度爲65 nM (869J15)，84 nM (869J16)，及69 nM (M8)連續稀釋11個梯度的抗體作爲一抗加入96孔盤，將細胞懸浮後於4℃培育1h。用含有0.5% BSA的PBS洗滌細胞兩次以去除未結合的抗體，再將細胞與100 μl的1 μg/ml羊抗人IgG-FITC (購自sigma，Cat.#F9512)於4℃培育30分鐘。300 g離心5分鐘，用含有0.5% BSA的PBS洗滌細胞兩次以去除未結合的二抗，最後將細胞重新懸浮在200 μl PBS中，透過Beckman Coμlter CytoFLEX流式細胞儀測定抗體對CHO細胞表面PD-L1的結合親和力。所得數據透過GraphPad Prism 6軟體擬合分析。
實驗結果如圖4所示，抗PD-L1/TGF-β雙功能融合蛋白869J15、869J16和陽性對照M8均可特異性的結合細胞表面表現的PD-L1，EC50 (nM)分別爲0.4600、0.5763和0.7123，親和力相當。實施例 5. 抗 PD-L1/TGF-β 雙功能融合蛋白阻斷 PD-1 與 PD-L1 結合的細胞實驗
取對數期生長的PD-L1 aAPC/CHO-K1細胞(購自promega，Cat.#J1252)，胰蛋白酶消化成單個細胞後轉移到白色底透96孔盤，100 μl/孔，40000 細胞/孔，置於37°C，5%CO2 ，培育過夜。將抗PD-L1/TGF-β雙功能融合蛋白、陽性對照M8和陰性對照NC (同型陰性對照抗體IgG1)按起始濃度爲32 nM (869J15)，42 nM (869J16)，34 nM (M8)三倍梯度稀釋成2×工作液，共8個濃度梯度(圖5A)，及起始濃度200 nM (869M1、869M3及M8)三倍梯度稀釋成2×工作液，共10個濃度梯度(圖5B)。同時，取密度在1.4-2×106 /ml，細胞活率在95%以上的PD-1效應細胞(購自promega，Cat.#J1252)胰蛋白酶消化成1.25×106 細胞/ml的單細胞懸浮液。取前一天舖好的PD-L1 aAPC/CHO-K1細胞，棄掉上清液，加入40 μl梯度稀釋的抗體工作液，再加入等體積的PD-1效應細胞。置於37°C，5%CO2 ，培育6小時。細胞於37°C培育6小時後，每孔加入80 μl檢測試劑Bio-Glo (購自promega，Cat.#G7940)。室溫培育10分鐘後，用SpectraMax i3讀取luminescence。所有數據均爲雙複孔，所得訊號值取平均值後用4-parameter法擬合，用GraphPad Prism 6進行數據分析。
實驗結果如圖5所示，在圖5A中，抗PD-L1/TGF-β雙功能融合蛋白869J15、869J16以及陽性對照M8均能有效阻斷PD-1與PD-L1之間的相互作用，IC50 (nM)分別是0.1977、0.1592和0.154，三者的阻斷能力相當。在圖5B中，抗PD-L1/TGF-β雙功能融合蛋白869M1、869M3以及陽性對照M8均能有效阻斷PD-1與PD-L1之間的相互作用，IC50 (nM)值分別是1.559、1.846以及1.169，三者的阻斷能力相當。實施例 6.  SMAD3 報導基因抑制實驗
SBE Reporter HEK293 Cell (購自BPS bioscience，Cat.#60653)表現帶螢光素酶報導基因的Smad3結合要素(SBE)，透過研究抗體蛋白對該細胞中TGF-β1誘導的Smad3活化的抑制作用，可評估抗體的體外活性。取貼壁培養的對數期生長的SBE293細胞，用DPBS洗一次後，用胰蛋白酶消化，中和胰蛋白酶。Trypan藍細胞計數，300 g離心5 min。用MEM (10%FBS、1%非必需胺基酸、1 mM丙酮酸鈉)培養基(均購自Gibico公司，Cat.#10095-098,10091-148,11140-050,11360-070)重新懸浮後計數平盤培養，調整密度爲35000個/孔，100 µl/孔，置於37°C，5%CO2 ，培育過夜，約24h。用MEM (0.5%FBS、1%非必需胺基酸、1 mM丙酮酸鈉)培養基稀釋TGF-β1 (10 ng/ml)，以及稀釋融合蛋白至200 nM，4倍稀釋，10個梯度，室溫放置1h後，置換細胞盤原來的培養基，37°C培養箱過夜。加入100 µL/孔檢測試劑Bio-Glo (提前30 min放25℃水浴鍋解凍平衡溫度)。室溫培育10分鐘後，用SpectraMax i3讀取luminescence。
實驗結果如圖6所示，融合蛋白以劑量依賴性形式抑制TGF-β誘導的pSMAD3報導子活性，融合蛋白869F、869M1及陽性對照M7824的IC50 (nM)值分別爲0.236、0.1324及0.1404，抑制活性相當。實施例 7. 人源 PBMC 重建免疫系統接種人黑色素瘤 A375 移植瘤模型上的抗腫瘤作用
人黑色素瘤A375細胞株購自ATCC，NPG小鼠購自北京維通達生物技術有限公司。受試樣品869M1的給藥劑量爲25 mg/kg，對照藥品IMFINZI (Durvalumab，anti-PD-L1單抗，購自阿斯利康公司)給藥劑量爲20.5 mg/kg，M7824的給藥劑量爲25 mg/kg。空白對照組給以相同體積的生理鹽水。收集體外培養的人黑色素瘤A375細胞，將細胞懸浮液濃度調整爲2×108 /ml，與等體積的基質膠混合。復蘇凍存的人源PBMC細胞，調整細胞濃度爲1×108 /ml。將等體積的A375細胞懸浮液與PBMC懸浮液混合，在無菌條件下，接種200μl細胞懸浮液於NPG小鼠右側肋部皮下。移植瘤用游標卡尺測量移植瘤直徑，待平均腫瘤體積生長至70 mm3 左右後將動物隨機分組。IMFINZI、M7824和869M1按照上述劑量給藥，對照組給等量生理鹽水，每周腹腔注射給藥2次，共給藥4次。整個實驗過程中，每周2次測量移植瘤直徑，同時稱小鼠體重。腫瘤體積(tumor volume，TV)的計算公式爲：TV=1/2×a×b2 。其中a、b分別表示長、寬。根據測量的結果計算出相對腫瘤體積(relative tumor volume，RTV)，計算公式爲：RTV=Vt /V0 。其中V0 爲分組給藥時(即d0 )測量所得腫瘤體積，Vt 爲每一次測量時的腫瘤體積。抗腫瘤活性的評估指標爲相對腫瘤增殖率T/C(%)，計算公式如下：T/C (%)=(TRTV /CRTV )×100 (TRTV ：治療組RTV；CRTV ：陰性對照組RTV)。
實驗結果如圖7所示，在人源PBMC小鼠A375移植瘤模型上IMFINZI抑瘤率TGI爲69.79%，M7824抑瘤率TGI爲96.33%，869M1抑瘤率TGI爲98.52%。結果表明，在此移植瘤模型上，869M1能夠顯著抑制腫瘤生長，藥效優於anti-PD-L1單抗。實施例 8. 抗 PD-L1/TGF-β 雙功能融合蛋白的物理穩定性
利用DSC (Differential scanning calorimetry，差示掃描量熱法)檢測869M1在PBS緩衝體系下的熱穩定性。將樣品置換到PBS緩衝液中，控制樣品濃度在1 mg/ml，利用MicroCal*Vp-Capillary DSC (Malvern)進行檢測。檢測前，將樣品及空白緩衝液用0.22 μm濾膜過濾。樣品盤每個孔加入400 μl樣品或空白緩衝液(設置6組空白緩衝對)，最後三對孔盤加入ddH2 O，以備清洗用。樣品盤加樣完畢後，套上塑料軟蓋板。掃描溫度從25℃開始到100℃結束，掃描速率150℃/h。具體結果如下表3所示，869M1蛋白表現出良好的熱穩定性。 表3. 869M1蛋白的熱穩定性
Sample TmOnset (℃) Tm1 (℃)
869M1 64.59 77.11
在本發明提及的所有文獻都在本申請中引用作爲參考，就如同每一篇文獻被單獨引用作爲參考那樣。此外應理解，在閱讀了本發明的上述講授內容之後，本領域技術人員可以對本發明作各種改動或修改，這些等價形式同樣落於本申請所附申請專利範圍所限定的範圍。
圖1A：融合蛋白結構示意圖 圖1B：融合蛋白869電荷異質性檢測圖 圖1C：融合蛋白869F電荷異質性檢測圖 圖1D：融合蛋白869M1電荷異質性檢測圖 圖1E：融合蛋白869J15電荷異質性檢測圖 圖2A：融合蛋白869M1HPLC檢測圖 圖2B：融合蛋白869J15HPLC檢測圖 圖3A：融合蛋白869M1、869M3、869J15與PD-L1親和力的ELISA檢測圖 圖3B：融合蛋白869J15、869J16、869J17與TGF-β1的親和力ELISA檢測圖 圖3C：融合蛋白869M1、869M3與TGF-β1的親和力ELISA檢測圖 圖3D：融合蛋白869J15、869J16、869J17同時結合PD-L1和TGF-β1的ELISA檢測圖 圖4：融合蛋白869J15、869J16對標靶細胞表面抗原PD-L1親和力的FACS檢測圖 圖5A：融合蛋白869J15、869J16阻斷PD-1與PD-L1結合的細胞實驗檢測圖 圖5B：融合蛋白869M1、869M3阻斷PD-1與PD-L1結合的細胞實驗檢測圖 圖6：融合蛋白869F、869M1抑制SMAD3報導基因檢測圖 圖7：融合蛋白869M1在人黑色素瘤A375移植瘤模型上的抗腫瘤作用圖

Claims (18)

  1. 一種抗PD-L1/TGF-β融合蛋白，其特徵在於，具有如下通式： Ab-L-TGFβRII ECD (I) 其中Ab爲抗PD-L1抗體，L爲胜肽連接子，TGFβRII ECD爲TGFβRII胞外結構域；所述TGFβRII胞外結構域的N末端透過胜肽連接子接合至抗PD-L1抗體重鏈的C末端；所述抗PD-L1抗體的重鏈包含互補决定區HCDR1-3，其中HCDR1的胺基酸序列如SEQ ID NO：10所示，HCDR2的胺基酸序列如SEQ ID NO：11所示，HCDR3的胺基酸序列如SEQ ID NO：12所示；所述抗PD-L1抗體的輕鏈包含互補决定區LCDR1-3，其中LCDR1的胺基酸序列如SEQ ID NO：13所示，LCDR2的胺基酸序列如SEQ ID NO：14所示，LCDR3的胺基酸序列如SEQ ID NO：15所示。
  2. 根據請求項1所述的融合蛋白，其特徵在於，所述抗PD-L1抗體的重鏈可變區的胺基酸序列如SEQ ID NO：16所示，所述抗PD-L1抗體的輕鏈可變區的胺基酸序列如SEQ ID NO：17所示。
  3. 根據請求項2所述的融合蛋白，其特徵在於，所述抗PD-L1抗體的重鏈胺基酸序列選自SEQ ID NO：1 - SEQ ID NO：3，所述抗PD-L1抗體的輕鏈胺基酸序列如SEQ ID NO：4所示。
  4. 根據請求項1所述的融合蛋白，其特徵在於，所述TGFβRII胞外結構域選自以下組中的一種或其組合： 1) 全長TGFβRII胞外結構域； 2) C端截短6-10個胺基酸的TGFβRII胞外結構域； 3) N端截短18-22個胺基酸的TGFβRII胞外結構域； 4) 包括至少1個糖基化位址突變的全長或截短的TGFβRII胞外結構域，所述突變選自S8P、T16P、T16V、N71Q。
  5. 根據請求項4所述的融合蛋白，其特徵在於，所述TGFβRII胞外結構域的胺基酸序列選自SEQ ID NO：5 - SEQ ID NO：9。
  6. 根據請求項1所述的融合蛋白，其特徵在於，所述胜肽連接子選自(G4 S)3 T或(G4 S)3 XDYTHTP，其中X爲G或S，Y爲K或A。
  7. 根據請求項1-6任一項所述的融合蛋白，其特徵在於，所述融合蛋白選自以下組： 1) 所述融合蛋白的重鏈胺基酸序列如SEQ ID NO：18所示，所述融合蛋白的輕鏈胺基酸序列如SEQ ID NO：4所示； 2) 所述融合蛋白的重鏈胺基酸序列如SEQ ID NO：19所示，所述融合蛋白的輕鏈胺基酸序列如SEQ ID NO：4所示； 3) 所述融合蛋白的重鏈胺基酸序列如SEQ ID NO：20所示，所述融合蛋白的輕鏈胺基酸序列如SEQ ID NO：4所示； 4) 所述融合蛋白的重鏈胺基酸序列如SEQ ID NO：21所示，所述融合蛋白的輕鏈胺基酸序列如SEQ ID NO：4所示； 5) 所述融合蛋白的重鏈胺基酸序列如SEQ ID NO：22所示，所述融合蛋白的輕鏈胺基酸序列如SEQ ID NO：4所示； 6) 所述融合蛋白的重鏈胺基酸序列如SEQ ID NO：23所示，所述融合蛋白的輕鏈胺基酸序列如SEQ ID NO：4所示； 7) 所述融合蛋白的重鏈胺基酸序列如SEQ ID NO：24所示，所述融合蛋白的輕鏈胺基酸序列如SEQ ID NO：4所示。
  8. 一種多核苷酸分子，其特徵在於，所述多核苷酸分子編碼根據請求項1-7任一項所述的融合蛋白。
  9. 一種表現載體，其特徵在於，所述表現載體含有根據請求項8所述的多核苷酸分子。
  10. 一種宿主細胞，其特徵在於，所述宿主細胞含有根據請求項9所述的表現載體。
  11. 一種根據請求項1-7任一項所述的融合蛋白的製備方法，其特徵在於，所述製備方法包括以下步驟： a)  在表現條件下，培養根據請求項10所述的宿主細胞，從而表現抗PD-L1/TGF-β融合蛋白； b) 分離並純化步驟a)所述的融合蛋白。
  12. 一種藥物組成物，其特徵在於，所述藥物組成物包含有效量的根據請求項1-7任一項所述的融合蛋白和一種或多種藥學上可接受的載劑、稀釋劑或賦形劑。
  13. 根據請求項1-7任一項所述的融合蛋白、或根據請求項12所述的藥物組成物在製備治療癌症的藥物中的用途。
  14. 根據請求項13所述的用途，其特徵在於，所述癌症選自：結直腸癌、膽管癌、膽囊癌、食道癌、胃癌、肺癌、肝癌、乳腺癌、卵巢癌、子宮頸癌、胰腺癌、前列腺癌、腎癌、膀胱癌、頭頸癌、淋巴瘤、黑色素瘤、皮膚癌、膠質瘤、間皮瘤。
  15. 一種治療癌症的方法，其特徵在於，所述方法包括向有需要的受試者施用根據請求項1-7任一項所述的融合蛋白、或其免疫偶聯物、或根據請求項12所述的藥物組成物。
  16. 根據請求項15所述的方法，其特徵在於，所述癌症選自：結直腸癌、膽管癌、膽囊癌、食道癌、胃癌、肺癌、肝癌、乳腺癌、卵巢癌、子宮頸癌、胰腺癌、前列腺癌、腎癌、膀胱癌、頭頸癌、淋巴瘤、黑色素瘤、皮膚癌、膠質瘤、間皮瘤。
  17. 一種免疫偶聯物，其特徵在於，所述免疫偶聯物包括： (a) 如請求項1-7任一項所述的融合蛋白；和 (b) 選自下組的偶聯部分：可檢測標記物、藥物、毒素、細胞激素、放射性核種、或酶。
  18. 如請求項17所述的免疫偶聯物的用途，其特徵在於，用於製備治療腫瘤的藥物組成物。
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