CN116574189A - 针对人il-36r和/或人il-1r3的多种抗体及其用途 - Google Patents

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Abstract

本申请提供了抗人IL‑36R和人IL‑1R3的双特异性抗体、结合人IL‑36R的单克隆抗体、结合人IL‑1R3的单克隆抗体及它们的用途。

Description

针对人IL-36R和/或人IL-1R3的多种抗体及其用途
发明领域
本发明通常涉及基因工程和抗体药物领域；具体而言，本申请涉及抗人IL-36R和人IL-1R3的双特异性抗体、结合人IL-36R的单克隆抗体、结合人IL-1R3的单克隆抗体及它们的用途。
发明背景
白细胞介素36(IL-36)主要在上皮细胞和免疫细胞中表达，包含3种促炎细胞因子IL-36α(IL-1F6)、IL-36β(IL-1F8)和IL-36γ(IL1F9)以及两种抑炎细胞因子IL-36Ra(IL-1F5)和IL-38(IL-1F10)1-2。IL-36促炎因子(IL-36α、IL-36β和IL-36γ)首先结合细胞表面第一受体IL-36R(IL-1Rrp2)，进而招募第二受体IL-1R3(IL-1RAcP)，形成三元复合物后通过细胞内TIR结构域激活下游NF-κB和MAPK信号3。IL-36抑炎因子(IL-36Ra和IL-38)通过结合IL-36R阻止IL-36促炎因子的结合，进而阻断下游信号的传导，平衡体内的炎症反应。
IL-36α、IL-36β和IL-36γ过表达或者IL-36Ra和IL-18低表达会导致IL-36信号通路失调，进而引起多种自身免疫疾病和炎症性疾病的发生，例如寻常型银屑病、炎症性肠病、肾损伤和炎症、肺炎、关节炎、化脓性汗腺炎、泛发性脓疱型银屑病、掌跖性脓疱型银屑病等2-4。阻断IL-36信号通路，在治疗脓疱型银屑病的临床研究中表现出显著的治疗效果5-6，同时对重症掌跖性脓疱型银屑病患者也表现出积极的治疗效果7。
脓疱型银屑病是银屑病的特殊类型，临床表现为红斑基础上的无菌性脓疱，表型分为3种，分别为泛发性脓疱型银屑病、掌跖性脓疱型银屑病和连续性肢端皮炎8。目前针对脓疱型银屑病的治疗方法包括口服类视黄醇和外用类固醇，但是治疗效果有限并且有副作用。
双特异性抗体(bispecific antibody，BsAb)是一类人工抗体，其包含两个不同的抗原结合位点，能在靶细胞和功能分子(细胞)之间架起桥梁，激发具有导向性的免疫反应，现已成为抗体工程领域的研究热点，在疾病的免疫治疗中具有广阔的应用前景。
新的抗人IL-36R和/或人IL-1R3抗体的开发和应用是本领域所需要的。因此，鉴于抗人IL-36R和/或人IL-1R3抗体具有广泛的适用性，基于临床需求，探索和研发新的抗人IL-36R和/或人IL-1R3的抗体具有重要的生物学和医学意义。
发明概述
第一方面，本申请提供了双特异性抗体，其包含结合人IL-36R的第一抗原结合片段和结合人IL-1R3的第二抗原结合片段。
在第一方面的一些实施方案中，所述双特异性抗体能够抑制IL-36介导的炎症反应。
在第一方面的一些实施方案中，所述第一抗原结合片段包含：
氨基酸序列为SSWIH(SEQ ID NO：1)的HCDR1，氨基酸序列为EINPGNVRSNYNENFRN(SEQ ID NO：2)的HCDR2，氨基酸序列为INYGEPYFAS(SEQ ID NO：3)的HCDR3，氨基酸序列为RASQSVIGSYLA(SEQ ID NO：4)的LCDR1，氨基酸序列为SASKLAS(SEQ ID NO：5)的LCDR2，和氨基酸序列为QQDTRYPIT(SEQ ID NO：6)的LCDR3；或者
氨基酸序列为SSWIH(SEQ ID NO：1)的HCDR1，氨基酸序列为EINPGSGRSNYNENFQG(SEQ ID NO：7)的HCDR2，氨基酸序列为VFYGEPYFPF(SEQ ID NO：8)的HCDR3，氨基酸序列为RASQSVIYSYLA(SEQ ID NO：9)的LCDR1，氨基酸序列为SASKRAS(SEQ ID NO：10)的LCDR2，和氨基酸序列为QQHAGIPVT(SEQ ID NO：11)的LCDR3；
其中，HCDR和LCDR的氨基酸序列根据Kabat定义。
在第一方面的一些实施方案中，所述第二抗原结合片段包含：
氨基酸序列为SYAMS(SEQ ID NO：12)的HCDR1，氨基酸序列为EISRGGSHTYYPDTVTG(SEQ ID NO：13)的HCDR2，氨基酸序列为SYGNYPFDY(SEQ ID NO：14)的HCDR3，氨基酸序列为RASQSVIGSYLA(SEQ ID NO：4)的LCDR1，氨基酸序列为SASKLAS(SEQ ID NO：5)的LCDR2，和氨基酸序列为QQDTRYPIT(SEQ ID NO：6)的LCDR3；或
氨基酸序列为SYAMS(SEQ ID NO：12)的HCDR1，氨基酸序列为EISRGGSHTYYPDTVTG(SEQ ID NO：13)的HCDR2，氨基酸序列为SYGNYPFDY(SEQ ID NO：14)的HCDR3，氨基酸序列为SASSSVSYMY(SEQ ID NO：15)的LCDR1，氨基酸序列为DTSNLAS(SEQ ID NO：16)的LCDR2，和氨基酸序列为QQWSSYPLT(SEQ ID NO：17)的LCDR3；
其中，HCDR和LCDR的氨基酸序列根据Kabat定义。
在第一方面的一些实施方案中，所述第一抗原结合片段的重链可变区的氨基酸序列如SEQ ID NO：18所示，轻链可变区的氨基酸序列如SEQ ID NO：19所示；或者
所述第一抗原结合片段的重链可变区的氨基酸序列如SEQ ID NO：20所示，轻链可变区的氨基酸序列如SEQ ID NO：21所示。
在第一方面的一些实施方案中，所述第二抗原结合片段的重链可变区的氨基酸序列如SEQ ID NO：22所示，轻链可变区的氨基酸序列如SEQ ID NO：1 9所示；或者
所述第二抗原结合片段的重链可变区的氨基酸序列如SEQ ID NO：22所示，轻链可变区的氨基酸序列如SEQ ID NO：23所示。
在第一方面的一些实施方案中，所述第一抗原结合片段包含SEQ ID NO：18所示的重链可变区和SEQ ID NO：1 9所示的轻链可变区，以及所述第二抗原结合片段包含SEQ IDNO：22所示的重链可变区和SEQ ID NO：1 9所示的轻链可变区；或者
所述第一抗原结合片段包含SEQ ID NO：20所示的重链可变区和SEQ ID NO：21所示的轻链可变区，以及所述第二抗原结合片段包含SEQ ID NO：22所示的重链可变区和SEQID NO：23所示的轻链可变区。
在第一方面的一些实施方案中，所述双特异性抗体是IgG1抗体，其包含第一重链恒定区和第二重链恒定区，其中，所述第一重链恒定区的第354和366位的氨基酸分别为C和W，所述第二重链恒定区的第349、366、368和407位的氨基酸分别为C、S、A和V；抗体恒定区氨基酸位置按照EU numbering确定。
在第一方面的一些实施方案中，所述双特异性抗体是IgG1抗体，其包含第一重链恒定区和第二重链恒定区，其中，所述第一重链恒定区和所述第二重链恒定区的第234、235和331位的氨基酸分别为F、E和S；抗体恒定区氨基酸位置按照EU numbering确定。
在第一方面的一些实施方案中，所述第一抗原结合片段和所述第二抗原结合片段独立地选自单链抗体(scFv)或者Fab片段。
第二方面，本申请提供了结合人IL-36R的单克隆抗体，其包含如SEQ ID NO：1所示的HCDR1，
如SEQ ID NO：7所示的HCDR2，
如SEQ ID NO：8所示的HCDR3，
如SEQ ID NO：9所示的LCDR1，
如SEQ ID NO：10所示的LCDR2，和
如SEQ ID NO：11所示的LCDR3；或者
如SEQ ID NO：1所示的HCDR1，
如SEQ ID NO：2所示的HCDR2，
如SEQ ID NO：3所示的HCDR3，
如SEQ ID NO：4所示的LCDR1，
如SEQ ID NO：5所示的LCDR2，和
如SEQ ID NO：6所示的LCDR3；或者
如SEQ ID NO：1所示的HCDR1，
如SEQ ID NO：7所示的HCDR2，
如SEQ ID NO：8所示的HCDR3，
如SEQ ID NO：4所示的LCDR1，
如SEQ ID NO：5所示的LCDR2，和
如SEQ ID NO：6所示的LCDR3；
其中，HCDR和LCDR的氨基酸序列根据Kabat定义。
第三方面，本申请提供了结合人IL-1R3的单克隆抗体，其包含如SEQ ID NO：12所示的HCDR1，
如SEQ ID NO：1 3所示的HCDR2，
如SEQ ID NO：1 4所示的HCDR3，
如SEQ ID NO：1 5所示的LCDR1，
如SEQ ID NO：1 6所示的LCDR2，和
如SEQ ID NO：1 7所示的LCDR3；
其中，HCDR和LCDR的氨基酸序列根据Kabat定义。
第四方面，本申请提供了药物组合物，其包含第一方面所述的双特异性抗体、或者第二或第三方面所述的单克隆抗体以及药学上可接受的赋形剂、稀释剂或载体。
第五方面，本申请提供了第一方面所述的双特异性抗体、第二或第三方面所述的单克隆抗体、或者第四方面所述的药物组合物在制备用于预防或治疗IL-36介导的疾病的药物中的用途。
附图简述
图1显示了抗IL-36R抗体抑制IL-36刺激HEK-BlueTM IL-36细胞分泌SEAP的能力。其中，A为抑制IL-36α，B为抑制IL-36β，C为抑制IL-36γ。
图2显示了IL-36R抗体抑制IL-36刺激HaCAT细胞分泌IL-8的能力。其中，A为抑制IL-36α，B为抑制IL-36β，C为抑制IL-36γ。
图3显示了IL-1R3鼠单克隆抗体识别HaCAT细胞表面IL-1R3的能力。
图4显示了IL-1R3人源化抗体识别HaCAT细胞表面IL-1R3的能力。
图5显示了IL-36R×IL-1R3Crossmab结构双特异性抗体抑制IL-36刺激HaCAT细胞分泌IL-8的能力。其中，A为抑制IL-36α，B为抑制IL-36β，C为抑制IL-36γ。
图6显示了共同轻链双特异性抗体抑制IL-36刺激HaCAT细胞分泌IL-8的能力。其中，A为抑制IL-36α，B为抑制IL-36β，C为抑制IL-36γ。
图7显示了IL-36R单克隆抗体和IL-36R×IL-1R3共同轻链双特异性抗体抑制IL-36γ刺激人单核细胞分泌IL-8的能力。
图8显示了共同轻链结构IL-36R×IL-1R3双特异性抗体抑制IL-33和IL-12刺激人NK细胞分泌IL-8的能力。
图9显示了共同轻链结构IL-36R×IL-1R3双特异性抗体抑制IL-1刺激MRC-5细胞分泌IL-8的结果。其中，A为抑制IL-1α，B为抑制IL-1β。
序列说明
SEQ ID NO：1显示重链可变区R49E11VH-h3和R72B7的CDR1的氨基酸序列。
SEQ ID NO：2-3分别显示重链可变区R72B7的CDR2和CDR3的氨基酸序列。
SEQ ID NO：4-6分别显示轻链可变区L36E9VK的CDR1、CDR2和CDR3的氨基酸序列。
SEQ ID NO：7-8分别显示重链可变区R49E11VH-h3的CDR2和CDR3的氨基酸序列。
SEQ ID NO：9-11分别轻链可变区L26B11VK的CDR1、CDR2和CDR3的氨基酸序列。
SEQ ID NO：12-14分别显示重链可变区R1B9VH-h1的CDR1、CDR2和CDR3的氨基酸序列。
SEQ ID NO：15-17分别显示轻链可变区R1B9VK-h1的CDR1、CDR2和CDR3的氨基酸序列。
SEQ ID NO：18显示重链可变区R72B7的氨基酸序列。
SEQ ID NO：19显示轻链可变区L36E9VK的氨基酸序列。
SEQ ID NO：20显示重链可变区R49E11Ⅷ-h3的氨基酸序列。
SEQ ID NO：21显示轻链可变区L26B11VK的氨基酸序列。
SEQ ID NO：22显示重链可变区R1B9VH-h1的氨基酸序列。
SEQ ID NO：23显示轻链可变区R1B9VK-h1的氨基酸序列。
SEQ ID NO：24显示人(homo sapiens)IL-36R胞外区(hIL-36R)的氨基酸序列。
SEQ ID NO：25显示猴(Macacafascicularis)IL-36R胞外区(mfIL-36R)的氨基酸序列。
SEQ ID NO：26显示人(homo sapiens)IL-1R3胞外区(hIL-1R3)的氨基酸序列。
SEQ ID NO：27显示猴(Macacafascicularis)IL-1R3胞外区(mfIL-1R3)的氨基酸序列。
SEQ ID NO：28显示人(homo sapiens)IL-1α成熟肽(hIL-1α)的氨基酸序列。
SEQ ID NO：29显示人(homo sapiens)IL-1β成熟肽(hIL-1β)的氨基酸序列。
SEQ ID NO：30显示人(homo sapiens)IL-33成熟肽(hIL-33)的氨基酸序列。
SEQ ID NO：31显示人(homo sapiens)IL-36α成熟肽(hIL-36α)的氨基酸序列。
SEQ ID NO：32显示人(homo sapiens)IL-36β成熟肽(hIL-36β)的氨基酸序列。
SEQ ID NO：33显示人(homo sapiens)IL-36γ成熟肽(hIL-36γ)的氨基酸序列。
SEQ ID NO：34显示His标签(His)的氨基酸序列。
SEQ ID NO：35显示小鼠(mus musculus)IgG2a抗体的Fc段(mFc)的氨基酸序列。
SEQ ID NO：36显示人(homo sapiens)IgG1亚型重链恒定区的氨基酸序列。
SEQ ID NO：37显示人IgG1亚型重链恒定区突变体IgG1m3的氨基酸序列。
SEQ ID NO：38显示人IgG1亚型重链恒定区突变体IgG1m3-H1的氨基酸序列。
SEQ ID NO：39显示人IgG1亚型重链恒定区突变体IgG1m3-K的氨基酸序列。
SEQ ID NO：40显示人(homo sapiens)κ亚型轻链恒定区的氨基酸序列。
SEQ ID NO：41显示人(homo sapiens)λ亚型轻链恒定区的氨基酸序列。
SEQ ID NO：42显示单克隆抗体Spesolimab的重链可变区的氨基酸序列。
SEQ ID NO：43显示单克隆抗体Spesolimab的轻链可变区的氨基酸序列。
SEQ ID NO：44显示R49E11VH-h3-IgG1m3-H1的氨基酸序列。
SEQ ID NO：45显示R1B9VH-h1-IgG1m3-K的氨基酸序列。
SEQ ID NO：46显示L36E9VK-CK的氨基酸序列。
SEQ ID NO：47显示L26B11VK-CK的氨基酸序列。
SEQ ID NO：48显示R1B9VH-h1-CK-cross-IgG1m3-K的氨基酸序列。
SEQ ID NO：49显示R1B9VK-h1-CH1-cross的氨基酸序列。
SEQ ID NO：50显示R72B7VH-IgG1m3-H1的氨基酸序列。
SEQ ID NO：51显示重链可变区R1B9VH的氨基酸序列。
SEQ ID NO：52显示轻链可变区R1B9VK的氨基酸序列。
SEQ ID NO：53显示DP47-IgG1m3抗体的重链可变区的氨基酸序列。
SEQ ID NO：54显示DP47-IgG1m3抗体的轻链可变区的氨基酸序列。
SEQ ID NO：55显示引物PmCGR的核苷酸序列。
SEQ ID NO：56显示引物PmCKR的核苷酸序列。
发明详述
本申请的发明人对结合人IL-36R和/或人IL-1R3的抗体药物进行了深入研发，并通过抗体工程技术得到了新的结合人IL-36R和/或人IL-1R3P的双特异性抗体和单克隆抗体。在本申请的多个方面，提供了新的结合人IL-36R和/或人IL-1R3的双特异性抗体和单克隆抗体，编码所述双特异性抗体或单克隆抗体的多核苷酸、包含所述多核苷酸的载体、包含所述多核苷酸或载体的宿主细胞、制备和纯化所述双特异性抗体或单克隆抗体的方法及所述双特异性抗体或单克隆抗体的医学和生物学应用。根据本申请提供的双特异性抗体或单克隆抗体的可变区的序列，可构建全长的双特异性抗体分子或单克隆抗体分子作为药物在临床上用于预防或治疗IL-36介导的疾病。
除非另外指明，本申请的实施采用本领域常规的分子生物学、微生物学、细胞生物学、生物化学以及免疫学技术。
除非另外指明，本申请中所用的术语具有本领域技术人员通常所理解的含义。
定义
如本文所用的术语“抗体”，是指能够经由至少一个位于免疫球蛋白分子的可变区中的抗原识别位点特异性结合到靶标的免疫球蛋白分子。靶标包括但不限于碳水化合物、多聚核苷酸、脂质、多肽等。本文所使用的“抗体”不仅包括完整的(即全长的)抗体，而且还包括其结合片段(例如Fab、Fab’、F(ab’)2、Fv)、其变异体、包含抗体部分的融合蛋白、人源化抗体、嵌合抗体、双特异性抗体体、线性抗体、单链抗体、VHH抗体、多特异性抗体(例如双特异性抗体)及任何其他包含所需特异性的抗原识别位点的免疫球蛋白分子的修改配置，包括抗体的糖基化变体、抗体的氨基酸序列变体及共价修饰的抗体。
通常，完整或全长的抗体包含两个重链和两个轻链。每个重链含有重链可变区(VH)和第一、第二及第三恒定区(CH1、CH2及CH3)。每个轻链含有轻链可变区(VL)和恒定区(CL)。全长的抗体可以是任何种类的抗体，例如IgD、IgE、IgG、IgA或IgM(或上述的子类)，但抗体不需要属于任何特定的类别。根据重链的恒定区的抗体氨基酸序列，可以将免疫球蛋白指定为不同的类别。通常，免疫球蛋白有五种主要的类别：IgA、IgD、IgE、IgG及IgM，而且这些类别中有几个可以再被进一步区分成子类(同型)，例如IgG1、IgG2、IgG3、IgG4、IgA1及IgA2。对应于不同免疫球蛋白类别的重链恒定区分别称为α、δ、ε、γ、以及μ。不同类别的免疫球蛋白的子单元结构和三维结构是公知的。
如本文所用的术语“双特异性抗体”是指同时具有两种抗原表位结合能力的抗体。两种抗原表位可以在不同抗原上，也可是在同一抗原上。双特异性抗体可以具有多种结构构型。例如，双特异性抗体可以由两个Fc片段以及分别与其融合的两个结合部分组成(与天然抗体相似，区别在于两个臂结合不同的抗原靶标或表位)，抗原结合部可以为单链抗体(scFv)或者Fab片段。当针对给定的同一抗原的两个非重叠表位时，双特异性抗体的两个不同的结合部各自与一个Fc片段的N端结合，两个臂的抗原结合部配置可以具有四种组合方式：scFv+Fab片段、Fab片段+scFv、scFv+scFv和Fab片段+Fab片段。Fc片段可以包含能够确保重链异聚化的突变，KIH技术(knob-in-hole，KIH)是解决重链异聚化的一种策略。通常，KIH技术是指通过改造CH3区的氨基酸序列，形成有利于异种半抗体相互配对的结构，可以在构成双特异性抗体的同时又尽可能地保持正常抗体的结构。关于KIH技术的指导，例如可参见“An efficient route to human bispecific IgG”，A.Margaret Merchant et al.，Nature Biotechnology，Volume 16，1998，通过引用的方式将该文献全文并入本文。此外，双特异性抗体的结构可以是结合抗原的第一个表位的抗体(例如天然抗体形式)从CH3区的C端延伸出(可以通过柔性连接子)能结合抗原的第二个表位的抗原结合部分。
如本文所用的术语“结合部分”或“结合片段”可互换使用，是指负责结合抗原的完整抗体分子的一部分或区域。抗原结合域可以包含重链变异区(VH)、轻链变异区(VL)或上述两者。VH和VL中的每个通常含有三个互补决定区CDR1、CDR2及CDR3。
本领域技术人员公知，互补决定区(CDR，通常有CDR1、CDR2及CDR3)是可变区中对抗体的亲和力和特异性影响最大的区域。VH或VL的CDR序列有两种常见的定义方式，即Kabat定义和Chothia定义。(参阅例如Kabat，“Sequences of Proteins of ImmunologicalInterest”，National Institutes of Health，Bethesda，Md.(1991)；A1-Lazikani eta1.，J.Mol.Biol.273：927-948(1997)；以及Martin et al.，Proc.Natl.Acad.Sci.USA86：9268-9272(1989))。对于给定抗体的可变区序列，可以根据Kabat定义或者Chothia定义来确定VH和VL序列中CDR区序列。在本申请的实施方案中，利用Kabat定义CDR序列。
对于给定抗体的可变区序列，可以通过多种方式分析可变区序列中CDR区序列，例如可以利用在线软件Abysis确定(http：//www.abysis.org/)。
对于一般抗体而言，抗原结合片段的实例包括但不限于：(1)Fab片段，其可以是具有VL-CL链和VH-CH1链的单价片段；(2)F(ab’)2片段，其可以是具有两个Fab’片段的二价片段，该两个Fab’片段由铰链区的二硫桥(即Fab’的二聚物)连接；(3)具有抗体的单臂的VL和VH域的Fv片段；(4)单链Fv(scFv)，其可以是由VH域和VL域经由胜肽连接符组成的单一多胜肽链；(5)(scFv)2，其可以包含两个由胜肽连接符连接的VH域和两个VL域，该两个VL域是经由二硫桥与该两个VH域组合；以及(6)VHH抗体形式。
在双特异性抗体构建中，“结合部分”包括但不限于Fab片段形式或单链抗体(scFv)形式。
如本文所用的术语“单链抗体(scFv，single chain fragment variable)”是指一般利用基因工程技术构建的单链结构的抗体，包含重链可变区(VH)和轻链可变区(VL)的一条多肽链。在重链可变区和轻链可变区之间通常会设计一段柔性的连接肽(linker)以便重链可变区和轻链可变区可以折叠成为能够结合抗原的正确构象。
如本文所用的术语“Fab(fragment antigen binding)片段”、“Fab部分”或类似的术语是指完整的抗体用木瓜蛋白酶处理后产生的能够与抗原结合的抗体片段，包括完整的轻链(VL-CL)、重链可变区和CH1片段(VH-CH1)。
如本文所用的术语“第一重链恒定区”和“第二重链恒定区”均指“Fc片段”、“Fc结构域”、“Fc部分”或类似的术语，是指抗体重链恒定区的一部分，包括铰链区(hinge)、重链恒定区的CH2片段和CH3片段，并且参照人IgG1抗体的EU numbering确定。
如本文所用的术语“单克隆抗体”是指由基本同质的抗体群体获得的抗体，即，除了可能在少量个体中存在自然发生的突变以外，组成群体的各个抗体是相同的。本文所述单克隆抗体特别包括“嵌合”抗体，其中重链和/或轻链的一部分与来源于具体物种或属于具体抗体类或亚类的抗体中的对应序列相同或同源，而重链和/或轻链的余下部分与来源于另一物种或属于另一抗体类或亚类的抗体中的对应序列相同或同源，并且还包括这样的抗体的片段，只要它们能表现出所期望的生物学活性(美国专利号4,816,567；和Morrison等人，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 81：6851-6855(1984))。
如本文所用术语“特异性结合”，是指两个分子之间的非随机结合反应，例如抗体至抗原表位的结合。
第一方面，本申请提供了双特异性抗体，其包含结合人IL-36R的第一抗原结合片段和结合人IL-1R3的第二抗原结合片段。
在第一方面的一些实施方案中，所述双特异性抗体能够抑制IL-36介导的炎症反应。
在第一方面的一些实施方案中，所述双特异性抗体能够抑制IL-36α、IL-36β和/或IL-36γ与IL-36R的结合。
在第一方面的一些实施方案中，所述双特异性抗体能够抑制细胞分泌SEAP。
在第一方面的一些实施方案中，所述双特异性抗体能够抑制细胞分泌IL-8。
在第一方面的一些实施方案中，所述第一抗原结合片段包含：
氨基酸序列为SSWIH(SEQ ID NO：1)的HCDR1，氨基酸序列为EINPGNVRSNYNENFRN(SEQ ID NO：2)的HCDR2，氨基酸序列为INYGEPYFAS(SEQ ID NO：3)的HCDR3，氨基酸序列为RASQSVIGSYLA(SEQ ID NO：4)的LCDR1，氨基酸序列为SASKLAS(SEQ ID NO：5)的LCDR2，和氨基酸序列为QQDTRYPIT(SEQ ID NO：6)的LCDR3；或
氨基酸序列为SSWIH(SEQ ID NO：1)的HCDR1，氨基酸序列为EINPGSGRSNYNENFQG(SEQ ID NO：7)的HCDR2，氨基酸序列为VFYGEPYFPF(SEQ ID NO：8)的HCDR3，氨基酸序列为RASQSVIYSYLA(SEQ ID NO：9)的LCDR1，氨基酸序列为SASKRAS(SEQ ID NO：10)的LCDR2，和氨基酸序列为QQHAGIPVT(SEQ ID NO：11)的LCDR3；
其中，HCDR和LCDR的氨基酸序列根据Kabat定义。
在第一方面的一些实施方案中，所述第二抗原结合片段包含：
氨基酸序列为SYAMS(SEQ ID NO：12)的HCDR1，氨基酸序列为EISRGGSHTYYPDTVTG(SEQ ID NO：13)的HCDR2，氨基酸序列为SYGNYPFDY(SEQ ID NO：14)的HCDR3，氨基酸序列为RASQSVIGSYLA(SEQ ID NO：4)的LCDR1，氨基酸序列为SASKLAS(SEQ ID NO：5)的LCDR2，和氨基酸序列为QQDTRYPIT(SEQ ID NO：6)的LCDR3；或
氨基酸序列为SYAMS(SEQ ID NO：12)的HCDR1，氨基酸序列为EISRGGSHTYYPDTVTG(SEQ ID NO：13)的HCDR2，氨基酸序列为SYGNYPFDY(SEQ ID NO：14)的HCDR3，氨基酸序列为SASSSVSYMY(SEQ ID NO：15)的LCDR1，氨基酸序列为DTSNLAS(SEQ ID NO：16)的LCDR2，和氨基酸序列为QQWSSYPLT(SEQ ID NO：17)的LCDR3；
其中，HCDR和LCDR的氨基酸序列根据Kabat定义。
在第一方面的一些实施方案中，所述第一抗原结合片段的重链可变区的氨基酸序列如SEQ ID NO：18所示，轻链可变区的氨基酸序列如SEQ ID NO：19所示。
在第一方面的一些实施方案中，所述第一抗原结合片段的重链可变区的氨基酸序列如SEQ ID NO：20所示，轻链可变区的氨基酸序列如SEQ ID NO：21所示。
在第一方面的一些实施方案中，所述第二抗原结合片段的重链可变区的氨基酸序列如SEQ ID NO：22所示，轻链可变区的氨基酸序列如SEQ ID NO：19所示。
在第一方面的一些实施方案中，所述第二抗原结合片段的重链可变区的氨基酸序列如SEQ ID NO：22所示，轻链可变区的氨基酸序列如SEQ ID NO：23所示。
在第一方面的一些实施方案中，所述第一抗原结合片段包含SEQ ID NO：18所示的重链可变区和SEQ ID NO：19所示的轻链可变区，以及所述第二抗原结合片段包含SEQ IDNO：22所示的重链可变区和SEQ ID NO：19所示的轻链可变区。
在第一方面的一些实施方案中，所述第一抗原结合片段包含SEQ ID NO：20所示的重链可变区和SEQ ID NO：21所示的轻链可变区，以及所述第二抗原结合片段包含SEQ IDNO：22所示的重链可变区和SEQ ID NO：23所示的轻链可变区。
在第一方面的一些实施方案中，所述第一抗原结合片段包含SEQ ID NO：50所示的重链和SEQ ID NO：46所示的轻链，以及所述第二抗原结合片段包含SEQ ID NO：45所示的重链和SEQ ID NO：46所示的轻链。
在第一方面的一些实施方案中，所述第一抗原结合片段包含SEQ ID NO：44所示的重链和SEQ ID NO：47所示的轻链，以及所述第二抗原结合片段包含SEQ ID NO：48所示的重链和SEQ ID NO：49所示的轻链。
在第一方面的一些实施方案中，所述双特异性抗体是IgG1抗体，其包含第一重链恒定区和第二重链恒定区，其中，所述第一重链恒定区的第354和366位的氨基酸分别为C和W，所述第二重链恒定区的第349、366、368和407位的氨基酸分别为C、S、A和V；抗体恒定区氨基酸位置按照EU numbering确定。
在第一方面的一些实施方案中，所述双特异性抗体是IgG1抗体，其包含第一重链恒定区和第二重链恒定区，其中，所述第一重链恒定区和所述第二重链恒定区的第234、235和331位的氨基酸分别为F、E和S；抗体恒定区氨基酸位置按照EU numbering确定。
在第一方面的一些实施方案中，所述第一抗原结合片段和所述第二抗原结合片段独立地选自单链抗体(scFv)或者Fab片段。
在第一方面的一些实施方案中，所述第一抗原结合片段和所述第二抗原结合片段均为Fab片段。
在第一方面的一些实施方案中，所述第一抗原结合片段的重链可变区的氨基酸序列与SEQ ID NO：18或20所示的氨基酸序列相差约1、2、3、4、5、6、7、8、9、或10个氨基酸的取代、缺失和/或添加。
在第一方面的一些实施方案中，所述第一抗原结合片段的轻链可变区的氨基酸序列与SEQ ID NO：19或21所示的氨基酸序列相差约1、2、3、4、5、6、7、8、9、或10个氨基酸的取代、缺失和/或添加。
在第一方面的一些实施方案中，所述第一抗原结合片段的重链可变区的氨基酸序列与SEQ ID NO：18或20所示的氨基酸序列具有至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或更高的同源性。
在第一方面的一些实施方案中，所述第一抗原结合片段的轻链可变区的氨基酸序列与SEQ ID NO：19或21所示的氨基酸序列具有至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或更高的同源性。
在第一方面的一些实施方案中，SEQ ID NO：18或20所示的氨基酸序列的C端或N端区域还可以被截短约1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、20、25或更多个氨基酸，而仍然保持类似的所述第一抗原结合片段的重链可变区的功能。
在第一方面的一些实施方案中，还可以在SEQ ID NO：18或20所示的氨基酸序列的C端或N端区域添加1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、20、25或更多个氨基酸，得到的氨基酸序列仍然保持类似的所述第一抗原结合片段的重链可变区的功能。
在第一方面的一些实施方案中，还可以在SEQ ID NO：18或20所示的氨基酸序列的C端或N端以外的区域添加或缺失1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、20、25或更多个氨基酸，只要改变后的氨基酸序列基本上保持类似的所述第一抗原结合片段的重链可变区的功能。
在第一方面的一些实施方案中，SEQ ID NO：19或21所示的氨基酸序列的C端或N端区域还可以被截短约1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、20、25或更多个氨基酸，而仍然保持类似的所述第一抗原结合片段的轻链可变区的功能。
在第一方面的一些实施方案中，还可以在SEQ ID NO：19或21所示的氨基酸序列的C端或N端区域添加1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、20、25或更多个氨基酸，得到的氨基酸序列仍然保持类似的所述第一抗原结合片段的轻链可变区的功能。
在第一方面的一些实施方案中，还可以在SEQ ID NO：19或21所示的氨基酸序列的C端或N端以外的区域添加或缺失1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、20、25或更多个氨基酸，只要改变后的氨基酸序列基本上保持类似的所述第一抗原结合片段的轻链可变区的功能。
在第一方面的一些实施方案中，所述第二抗原结合片段的重链可变区的氨基酸序列与SEQ ID NO：22所示的氨基酸序列相差约1、2、3、4、5、6、7、8、9、或10个氨基酸的取代、缺失和/或添加。
在第一方面的一些实施方案中，所述第二抗原结合片段的轻链可变区的氨基酸序列与SEQ ID NO：19或23所示的氨基酸序列相差约1、2、3、4、5、6、7、8、9、或10个氨基酸的取代、缺失和/或添加。
在第一方面的一些实施方案中，所述第二抗原结合片段的重链可变区的氨基酸序列与SEQ ID NO：22所示的氨基酸序列具有至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或更高的同源性。
在第一方面的一些实施方案中，所述第二抗原结合片段的轻链可变区的氨基酸序列与SEQ ID NO：19或23所示的氨基酸序列具有至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或更高的同源性。
在第一方面的一些实施方案中，SEQ ID NO：22所示的氨基酸序列的C端或N端区域还可以被截短约1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、20、25或更多个氨基酸，而仍然保持类似的所述第二抗原结合片段的重链可变区的功能。
在第一方面的一些实施方案中，还可以在SEQ ID NO：22所示的氨基酸序列的C端或N端区域添加1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、20、25或更多个氨基酸，得到的氨基酸序列仍然保持类似的所述第二抗原结合片段的重链可变区的功能。
在第一方面的一些实施方案中，还可以在SEQ ID NO：22所示的氨基酸序列的C端或N端以外的区域添加或缺失1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、20、25或更多个氨基酸，只要改变后的氨基酸序列基本上保持类似的所述第二抗原结合片段的重链可变区的功能。
在第一方面的一些实施方案中，SEQ ID NO：19或23所示的氨基酸序列的C端或N端区域还可以被截短约1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、20、25或更多个氨基酸，而仍然保持类似的所述第二抗原结合片段的轻链可变区的功能。
在第一方面的一些实施方案中，还可以在SEQ ID NO：19或23所示的氨基酸序列的C端或N端区域添加1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、20、25或更多个氨基酸，得到的氨基酸序列仍然保持类似的所述第二抗原结合片段的轻链可变区的功能。
在第一方面的一些实施方案中，还可以在SEQ ID NO：19或23所示的氨基酸序列的C端或N端以外的区域添加或缺失1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、20、25或更多个氨基酸，只要改变后的氨基酸序列基本上保持类似的所述第二抗原结合片段的轻链可变区的功能。
第二方面，本申请提供了结合人IL-36R的单克隆抗体，其包含
如SEQ ID NO：1所示的HCDR1，
如SEQ ID NO：7所示的HCDR2，
如SEQ ID NO：8所示的HCDR3，
如SEQ ID NO：9所示的LCDR1，
如SEQ ID NO：10所示的LCDR2，和
如SEQ ID NO：11所示的LCDR3；或者
如SEQ ID NO：1所示的HCDR1，
如SEQ ID NO：2所示的HCDR2，
如SEQ ID NO：3所示的HCDR3，
如SEQ ID NO：4所示的LCDR1，
如SEQ ID NO：5所示的LCDR2，和
如SEQ ID NO：6所示的LCDR3；或者
如SEQ ID NO：1所示的HCDR1，
如SEQ ID NO：7所示的HCDR2，
如SEQ ID NO：8所示的HCDR3，
如SEQ ID NO：4所示的LCDR1，
如SEQ ID NO：5所示的LCDR2，和
如SEQ ID NO：6所示的LCDR3；
其中，HCDR和LCDR的氨基酸序列根据Kabat定义。
在第二方面的一些实施方案中，所述单克隆抗体的重链可变区的氨基酸序列如SEQ ID NO：20所示，轻链可变区的氨基酸序列如SEQ ID NO：21所示。
在第二方面的一些实施方案中，所述抗体的重链可变区的氨基酸序列如SEQ IDNO：18所示，轻链可变区的氨基酸序列如SEQ ID NO：19所示。
在第二方面的一些实施方案中，所述抗体的重链可变区的氨基酸序列如SEQ IDNO：20所示，轻链可变区的氨基酸序列如SEQ ID NO：19所示。
在第二方面的一些实施方案中，所述单克隆抗体的重链可变区的氨基酸序列与SEQ ID NO：18或20所示的氨基酸序列相差约1、2、3、4、5、6、7、8、9、或10个氨基酸的取代、缺失和/或添加。
在第二方面的一些实施方案中，所述单克隆抗体的轻链可变区的氨基酸序列与SEQ ID NO：19或21所示的氨基酸序列相差约1、2、3、4、5、6、7、8、9、或10个氨基酸的取代、缺失和/或添加。
在第二方面的一些实施方案中，所述单克隆抗体的重链可变区的氨基酸序列与SEQ ID NO：18或20所示的氨基酸序列具有至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或更高的同源性。
在第二方面的一些实施方案中，所述单克隆抗体的轻链可变区的氨基酸序列与SEQ ID NO：19或21所示的氨基酸序列具有至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或更高的同源性。
在第二方面的一些实施方案中，SEQ ID NO：18或20所示的氨基酸序列的C端或N端区域还可以被截短约1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、20、25或更多个氨基酸，而仍然保持类似的所述单克隆抗体的重链可变区的功能。
在第二方面的一些实施方案中，还可以在SEQ ID NO：18或20所示的氨基酸序列的C端或N端区域添加1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、20、25或更多个氨基酸，得到的氨基酸序列仍然保持类似的所述单克隆抗体的重链可变区的功能。
在第二方面的一些实施方案中，还可以在SEQ ID NO：18或20所示的氨基酸序列的C端或N端以外的区域添加或缺失1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、20、25或更多个氨基酸，只要改变后的氨基酸序列基本上保持类似的所述单克隆抗体的重链可变区的功能。
在第二方面的一些实施方案中，SEQ ID NO：19或21所示的氨基酸序列的C端或N端区域还可以被截短约1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、20、25或更多个氨基酸，而仍然保持类似的所述单克隆抗体的轻链可变区的功能。
在第二方面的一些实施方案中，还可以在SEQ ID NO：19或21所示的氨基酸序列的C端或N端区域添加1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、20、25或更多个氨基酸，得到的氨基酸序列仍然保持类似的所述单克隆抗体的轻链可变区的功能。
在第二方面的一些实施方案中，还可以在SEQ ID NO：19或21所示的氨基酸序列的C端或N端以外的区域添加或缺失1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、20、25或更多个氨基酸，只要改变后的氨基酸序列基本上保持类似的所述单克隆抗体的轻链可变区的功能。
第三方面，本申请提供了结合人IL-1R3的单克隆抗体，其包含
如SEQ ID NO：12所示的HCDR1，
如SEQ ID NO：13所示的HCDR2，
如SEQ ID NO：14所示的HCDR3，
如SEQ ID NO：15所示的LCDR1，
如SEQ ID NO：16所示的LCDR2，和
如SEQ ID NO：17所示的LCDR3；
其中，HCDR和LCDR的氨基酸序列根据Kabat定义。
在第三方面的一些实施方案中，所述单克隆抗体的重链可变区的氨基酸序列如SEQ ID NO：22所示，轻链可变区的氨基酸序列如SEQ ID NO：23所示。
在第三方面的一些实施方案中，所述抗体的重链可变区的氨基酸序列如SEQ IDNO：51所示，轻链可变区的氨基酸序列如SEQ ID NO：52所示。
在第三方面的一些实施方案中，所述单克隆抗体的重链可变区的氨基酸序列与SEQ ID NO：22或51所示的氨基酸序列相差约1、2、3、4、5、6、7、8、9、或10个氨基酸的取代、缺失和/或添加。
在第三方面的一些实施方案中，所述单克隆抗体的轻链可变区的氨基酸序列与SEQ ID NO：23或52所示的氨基酸序列相差约1、2、3、4、5、6、7、8、9、或10个氨基酸的取代、缺失和/或添加。
在第三方面的一些实施方案中，所述单克隆抗体的重链可变区的氨基酸序列与SEQ ID NO：22或51所示的氨基酸序列具有至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或更高的同源性。
在第三方面的一些实施方案中，所述单克隆抗体的轻链可变区的氨基酸序列与SEQ ID NO：23或52所示的氨基酸序列具有至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或更高的同源性。
在第三方面的一些实施方案中，SEQ ID NO：22或51所示的氨基酸序列的C端或N端区域还可以被截短约1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、20、25或更多个氨基酸，而仍然保持类似的所述单克隆抗体的重链可变区的功能。
在第三方面的一些实施方案中，还可以在SEQ ID NO：22或51所示的氨基酸序列的C端或N端区域添加1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、20、25或更多个氨基酸，得到的氨基酸序列仍然保持类似的所述单克隆抗体的重链可变区的功能。
在第三方面的一些实施方案中，还可以在SEQ ID NO：22或51所示的氨基酸序列的C端或N端以外的区域添加或缺失1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、20、25或更多个氨基酸，只要改变后的氨基酸序列基本上保持类似的所述单克隆抗体的重链可变区的功能。
在第三方面的一些实施方案中，SEQ ID NO：23或52所示的氨基酸序列的C端或N端区域还可以被截短约1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、20、25或更多个氨基酸，而仍然保持类似的所述单克隆抗体的轻链可变区的功能。
在第三方面的一些实施方案中，还可以在SEQ ID NO：23或52所示的氨基酸序列的C端或N端区域添加1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、20、25或更多个氨基酸，得到的氨基酸序列仍然保持类似的所述单克隆抗体的轻链可变区的功能。
在第三方面的一些实施方案中，还可以在SEQ ID NO：23或52所示的氨基酸序列的C端或N端以外的区域添加或缺失1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、20、25或更多个氨基酸，只要改变后的氨基酸序列基本上保持类似的所述单克隆抗体的轻链可变区的功能。
第四方面，本申请提供了药物组合物，其包含第一方面所述的双特异性抗体、或者第二或第三方面所述的单克隆抗体以及药学上可接受的赋形剂、稀释剂或载体。
在第四方面的一些实施方案中，所述药物组合物用于预防或治疗IL-36介导的疾病。
在第四方面的一些实施方案中，所述IL-36介导的疾病选自：寻常型银屑病、炎症性肠病、肾损伤和炎症、肺炎、关节炎、化脓性汗腺炎、泛发性脓疱型银屑病和掌跖性脓疱型银屑病。
在第四方面的一些实施方案中，所述药物组合物还可包含下述物质中的一种或多种：润滑剂，如滑石粉、硬脂酸镁和矿物油；润湿剂；乳化剂；悬浮剂；防腐剂，如苯甲酸、山梨酸和丙酸钙；增甜剂和/或调味剂等。
在第四方面的一些实施方案中，可以将本申请中的药物组合物配制为片剂、丸剂、粉剂、锭剂、酏剂、悬液、乳剂、溶液、糖浆、栓剂或胶囊等形式。
在第四方面的一些实施方案中，可以利用任何生理上可接受的给药方式递送本申请的药物组合物，这些给药方式包括但不限于：口服给药、肠胃外给药、经鼻给药、直肠给药、腹膜内给药、血管内注射、皮下给药、经皮给药、吸入给药等。
在第四方面的一些实施方案中，可以通过混合具有所需纯度的试剂与视情况的药学上可接受的载体、赋形剂等，以冻干制剂或水溶液的形式配制用于治疗用途的药物组合物用于存储。
第五方面，本申请提供了第一方面所述的双特异性抗体、第二或第三方面所述的单克隆抗体、或第四方面所述的药物组合物在制备用于预防或治疗IL-36介导的疾病的药物中的用途。
在第五方面的一些实施方案中，所述IL-36介导的疾病选自：寻常型银屑病、炎症性肠病、肾损伤和炎症、肺炎、关节炎、化脓性汗腺炎、泛发性脓疱型银屑病和掌跖性脓疱型银屑病。
第六方面，本申请提供了预防或治疗IL-36介导的疾病的方法，包括向有需要的个体给予第一方面所述的双特异性抗体、第二或第三方面所述的单克隆抗体、或者第四方面所述的药物组合物。
在第六方面的一些实施方案中，所述IL-36介导的疾病选自：寻常型银屑病、炎症性肠病、肾损伤和炎症、肺炎、关节炎、化脓性汗腺炎、泛发性脓疱型银屑病和掌跖性脓疱型银屑病。
在其他方面，本申请提供了核酸分子，其编码第一方面所述的双特异性抗体、或者第二或第三方面所述的单克隆抗体。在一些实施方案中，所述核酸分子可操作地连接到调控序列，调控序列可以被用所述载体转化过的宿主细胞识别。
本申请还提供包含编码第一方面所述的双特异性抗体、或者第二或第三方面所述的单克隆抗体的分离的核酸分子的载体以及包含所述核酸分子或载体的宿主细胞。在其他方面，本申请还提供产生第一方面所述的双特异性抗体、或者第二或第三方面所述的单克隆抗体的方法。在一些实施方案中，产生第一方面所述的双特异性抗体、或者第二或第三方面所述的单克隆抗体的方法包括培养宿主细胞以便于表达核酸分子。在一些实施方案中，产生第一方面所述的双特异性抗体、或者第二或第三方面所述的单克隆抗体的方法还包括从宿主细胞培养基中回收双特异性抗体或单克隆抗体。
应当理解，以上详细描述仅为了使本领域技术人员更清楚地了解本申请的内容，而并非意图在任何方面加以限制。本领域技术人员能够对所述实施方案进行各种改动和变化。
以下实施例仅用于说明而非限制本申请范围的目的。
实施例
实施例1：重组蛋白的制备
制备和鉴定IL-36R×IL-1R3双特异性抗体的过程中需要用到多种不同的重组蛋白，包括人IL-36R胞外区(hIL-36R，SEQ ID NO：24)、猴IL-36R胞外区(mfIL-36R，SEQ IDNO：25)、人IL-1R3胞外区(hIL-1R3，SEQ ID NO：26)、猴IL-1R3胞外区(mfIL-1R3，SEQ IDNO：27)、人IL-1 α成熟肽(hIL-1 α，SEQ ID NO：28)、人IL-1β成熟肽(hIL-1β，SEQ ID NO：29)、人IL-33成熟肽(hIL-33，SEQ ID NO：30)、人IL-36α成熟肽(hIL-36α，SEQ ID NO：31)、人IL-36β成熟肽(hIL-36β，SEQ ID NO：32)和人IL-36γ成熟肽(hIL-36γ，SEQ ID NO：33)。在这些重组蛋白的C端添加His标签(His，SEQ ID NO：34)，或者小鼠抗体IgG2a的Fc段(mFc，SEQ ID NO：35)，有利于重组蛋白的纯化和功能鉴定。在制备重组抗体时，抗体重链恒定区可以是人IgG1亚型(SEQ ID NO：36)或者选定的人IgG1亚型的各种突变体，如IgG1m3(SEQID NO：37)、IgG1m3-H1(SEQ ID NO：38)或者IgG1m3-K(SEQ ID NO：39)；轻链恒定区可以是人K亚型(SEQ ID NO：40)或者人λ亚型(SEQ ID NO：41)。
根据Uniprot数据库中重组蛋白的氨基酸序列，设计并合成上述各种重组蛋白的基因(包含His标签或者mFc)。利用常规的分子生物学技术将合成的各种重组蛋白基因克隆至合适的真核表达载体(如invitrogen公司的pcDNA3.1等)，然后利用脂质体(如invitrogen公司的293fectin等)或者其他阳离子转染试剂(如PEI等)将制备的重组蛋白表达质粒转染入HEK293细胞(如invitrogen公司的HEK293F)，在无血清悬浮培养条件下培养3-4天。然后通过离心等方式收获培养上清。
His标签融合表达的重组蛋白利用金属螯合亲和层析柱(如GE公司的HisTrap FF等)对培养上清中的重组蛋白进行一步纯化。而抗体和Fc融合表达的重组蛋白用ProteinA/G亲和层析柱(如GE公司的Mabselect SURE等)进行一步纯化。然后利用脱盐柱(如GE公司的Hitrap desaulting等)将重组蛋白保存缓冲液置换为PBS(pH7.0)或者其他合适的缓冲液。过滤除菌后，分装保存于-20℃备用。
实施例2：IL-36R全人源抗体的筛选和活性评价
2.1全人源Fab库的筛选
以实施例1制备的重组hIL-36R-His为抗原，利用固相筛选策略(实验方案参考噬菌体展示：通用实验指南，(美)克拉克森(Clackson，T.)，(美)洛曼(Lowman，H.B.)编；马岚等译，化学工业出版社，2008.5)筛选制备的全人源Fab噬菌体文库(参见中国专利申请第202210871809.6号)。通过结合、洗脱、中和、感染、扩增的方式共进行了3轮筛选，最终获得1株特异性结合人IL-36R的单克隆抗体R49E11VH-h3+L26B11VK(R49E11VH-h3，氨基酸序列如SEQ ID NO：20所示；L26B11VK，氨基酸序列如SEQ ID NO：21所示)。
利用常规分子生物学手段，将R49E11VH-h3+L26B11VK制备成IgG1m3亚型全抗体，同时参照美国专利申请第US9023995B2号，合成Spesolimab的重链可变区(SEQ ID NO：42)和轻链可变区(SEQ ID NO：43)，制备成IgG1m3亚型全抗体用于对照研究。
2.2全人源单克隆抗体的亲和力测定
利用Biacore T200通过表面等离子共振技术测定抗人IL-36R单克隆抗体的亲和力。氨基偶联试剂盒(BR-1000-50)、人抗体捕获试剂盒(BR-1008-39)、S系列CM5芯片(14100530)和pH7.4的10×HBS-EP(BR100669)等相关试剂和耗材均购自GE healthcare。依照试剂盒中的说明书，用1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐(1-Ethyl-3-(3-dimethylaminopropyl)carbodiimide hydrochloride，EDC)和N-羟基琥珀酰亚胺(N-Hydroxysuccinimide，NHS)对羧基化CM5芯片表面进行活化，将抗人IgG(Fc)抗体(捕获抗体)用10mM乙酸钠(pH5.0)稀释至25μg/mL，之后以流速10μL/min注射以实现大约10000个响应单位(RU)的偶联量。注射捕获抗体之后，注射1M乙醇胺以封闭未反应的基团。对于动力学测量，将抗IL-36R的单克隆抗体稀释至1μg/mL，以10μL/min注射，保证200RU左右的抗体被抗人Fc的抗体捕获。然后将hIL-36R-His设置一系列的浓度梯度(例如6.17nM、18.5nM、55.6nM、166.7nM和500nM)，于25℃以30μL/min从低浓度到高浓度进行注射，结合时间为90s，解离时间为2400s，以10μL/min注射3M的MgCl2 30s以对芯片表面进行再生。使用Biacore T200评估软件第3.2.1版，通过1∶1结合模型拟合结合和解离传感图来计算结合速率(Ka)和解离速率(Kd)。以比率Kd/Ka计算解离平衡常数(KD)。拟合结果如表1所示。
表1.IL-36R单克隆抗体结合hIL-36R-His的亲和力常数
Ka(M-1s-1) Kd(s-1) KD(M)
R49E11VH-h3+L26B11VK 2.282E+4 6.630E-5 2.905E-9
Spesolimab 2.883E+4 7.388E-5 2.562E-9
2.3基于HEK-BlueTMIL-36细胞分析IL-36R单克隆抗体的生物学活性
HEK-BlueTM IL-36细胞(Invivogen，货号hkb-hil36r)为InvivoGen公司基于HEK293细胞开发的一个报告基因细胞株。该细胞株稳定转入人IL-36R、人IL-1R3和SEAP(碱性磷酸酶)基因，当使用IL-36α、IL-36β、IL-36γ刺激细胞时，细胞内的NF-κB信号通路被激活，诱导SEAP报告基因表达并分泌SEAP到细胞上清中，通过酶标仪630nm可以定量分析上清中SEAP的浓度，反映刺激物的活性。
本实施例用HEK-BlueTMIL-36细胞评价IL-36R单克隆抗体抑制IL-36α、IL-36β和IL-36γ的能力。HEK-BlueTMIL-36用HEK-BlueTMIL-36细胞维持培养基(DMEM+5％灭活FBS+1％青霉素-链霉素(P/S))稀释至5×105个/mL的单细胞悬液，100μL/孔接种至96孔板中，用一定浓度的IL-36α(0.2nM)、IL-36β(0.01nM)或IL-36γ(0.05nM)刺激HEK-BlueTMIL-36，再加入一系列浓度梯度(66.67nM起始，3倍梯度稀释)的IL-36R单克隆抗体(R49E11VH-h3+L26B11VK和Spesolimab)以及阴性同型对照抗体(DP47-IgG1m3，参照美国专利申请US20160200833A1制备，其中重链可变区和轻链可变区的氨基酸序列分别如SEQ ID NO：53和54所示)，置于细胞培养箱(37±1℃，5±1％CO2)培养20h后，取20μL上清，转移至新的96孔ELISA板中，加入180μL配置的QUANTI-BlueTM(Invivogen，货号rep-qbs)溶液，置于细胞培养箱(37±1℃，5±1％CO2)孵育30min后，使用吸收光酶标仪检测，检测波长630nm。结果显示，R49E11VH-h3+L26B11VK抑制IL-36α、IL-36β和IL-36γ对HEK-BlueTM IL-36细胞的刺激，活性和Spesolimab相当(图1A-图1C)。
2.4基于HaCAT细胞分析IL-36R单克隆抗体的生物学活性
HaCAT是永生化人表皮细胞系也称为表皮角质形成细胞系，由角质形成细胞培育而来，是保留了角质形成细胞分化能力的永生细胞。细胞因子IL-36(IL-36α/IL-36β/IL-36γ)能刺激HaCAT细胞分泌IL-8。
本实施例用HaCAT细胞评价IL-36R单克隆抗体抑制IL-36α、IL-36β、IL-36γ的能力。HaCAT细胞用维持培养基(MEM/EBSS+5％FBS灭活+1％P/S)稀释至5×105个/mL的单细胞悬液，100μL/孔接种至96孔板中，用一定浓度的IL-36α(1nM)或IL-36β(0.277nM)或IL-36γ(4.432nM)刺激HaCAT细胞，再加入一系列浓度梯度(66.67nM起始，4倍梯度稀释)的抗IL-36R单克隆抗体(R49E11VH-h3+L26B11VK、Spesolimab)和阴性同型对照抗体(DP47-IgG1m3)，置于细胞培养箱(37±1℃，5±1％CO2)培养20h后，采用人IL-8预包被ELISA试剂盒(达科为生物技术有限公司，货号1110802)对上清液稀释后检测。结果显示，R49E11VH-h3+L26B11VK抑制IL-36α、IL-36β和IL-36γ刺激HaCAT细胞分泌hIL-8，活性和Spesolimab相当(图2A-图2C)。
实施例3：IL-1R3鼠单克隆抗体的制备和活性评价
3.1小鼠免疫以及抗体库的制备
取6-8周龄BALB/c小鼠，免疫之前小鼠尾静脉采血留本底血清。首次免疫取hIL-1R3-His融合蛋白以弗氏完全佐剂乳化，每只小鼠腹腔注射50μg融合蛋白。间隔两周加强免疫，第一次和第三次加强免疫取hIL-1R3-His融合蛋白以弗氏不完全佐剂乳化，每只小鼠腹腔注射50μg融合蛋白，注射前断尾采血。第二次和第四次加强免疫取mfIL-1R3-His以弗式不完全佐剂乳化，每只小鼠腹腔注射100μg融合蛋白。第六次免疫以不加佐剂的hIL-1R3-His重组抗原作为免疫原，每只小鼠腹腔注射50μg融合蛋白，冲击免疫后3天处死小鼠，收集脾细胞。
使用小鼠淋巴细胞分离液(达科为生物技术有限公司，CAT#DKW33-R0100)分离小鼠脾脏淋巴细胞，利用细胞总RNA提取试剂盒(天根生化科技(北京)有限公司，CAT#DP430)提取淋巴细胞总RNA。以提取的总RNA为模板，利用第一链cDNA合成试剂盒(Thermoscientific，CAT#K1621)分别合成重链可变区和轻链可变区的cDNA，反转录引物采取基因特异性引物，引物配对区分别位于抗体重链恒定区和抗体轻链恒定区，具体序列分别为PmCGR：TGCATTTGAACTCCTTGCC(SEQ ID NO：55)和PmCKR：CCATCAATCTTCCACTTGAC(SEQ IDNO：56)。合成的cDNA立即存放于-70℃保存备用。然后以反转录得到的cDNA为模板，参考文献9合成引物，并利用PCR分别扩增鼠抗体VH和VK基因，然后利用重叠延伸PCR技术，构建单链抗体(scFv)基因。最后将制备的小鼠单链抗体基因克隆至载体pADSCFV-S(参见中国专利申请第201510097117.0号)，构建scFv库。此抗体库的库容达到1.0E8，正确率为70％。
3.2小鼠单链抗体库的筛选
以实施例1制备的hIL-1R3-His和mIIL-1R3-His为抗原，利用固相筛选策略(实验方案参考噬菌体展示：通用实验指南，(美)克拉克森(Clackson，T.)，(美)洛曼(Lowman，H.B.)编；马岚等译，化学工业出版社，2008.5)筛选上述构建的展示小鼠单链抗体的噬菌体库，通过结合、洗脱、中和、感染、扩增的方式共进行3轮筛选，最终获得多株序列不同的单链抗体，其中R1B9特异性结合人IL-1R3的效果最好。
3.3鼠单克隆抗体的亲和力分析
利用Biacore T200通过表面等离子共振技术测定抗人IL-1R3鼠单克隆抗体的亲和力。氨基偶联试剂盒(BR-1000-50)、人抗体捕获试剂盒(BR-1008-39)、S系列CM5芯片(14100530)和pH7.4的10×HBS-EP(BR100669)等相关试剂和耗材均购自GE healthcare。依照试剂盒中的说明书，用1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐(1-Ethyl-3-(3-dimethylaminopropyl)carbodiimide hydrochloride，EDC)和N-羟基琥珀酰亚胺(N-Hydroxysuccinimide，NHS)对羧基化CM5芯片表面进行活化，将抗人IgG(Fc)抗体(捕获抗体)用10mM乙酸钠(pH5.0)稀释至25μg/mL，之后以流速10μL/min注射以实现大约10000个响应单位(RU)的偶联量。注射捕获抗体之后，注射1M乙醇胺以封闭未反应的基团。对于动力学测量，将抗IL-1R3的单克隆抗体稀释至1μg/mL，以10μL/min注射，保证100RU左右的抗体被抗人Fc的抗体捕获。然后将hIL-1R3-His设置一系列的浓度梯度(例如6.17nM、18.5nM、55.6nM、166.7nM和500nM)，于25℃以30μL/min从低浓度到高浓度进行注射，结合时间为90s，解离时间为600s-1200s，以10μL/min注射3M的MgCl2 30s以对芯片表面进行再生。使用Biacore T200评估软件第3.2.1版，通过1∶1结合模型拟合结合和解离传感图来计算结合速率(Ka)和解离速率(Kd)。以比率Kd/Ka计算解离平衡常数(KD)，拟合结果如表2所示。
表2.鼠单克隆抗体结合hIL-1R3-His的亲和力常数
Ka(M-1s-1) Kd(s-1) KD(M)
R1B9 1.032E+5 1.101E-4 1.067E-9
3.4鼠单克隆抗体识别细胞表面IL-1R3的能力鉴定
取对数生长期的HaCAT细胞，离心后用含1％BSA的PBS缓冲液重悬至2×106个/mL的单细胞悬液，100μL/孔铺于96孔V底板中。取100μL的IL-1R3鼠单克隆抗体R1B9和阴性同型对照抗体(DP47-IgG1m3)，以133.34nM作为起始浓度，3倍梯度稀释，加入含细胞的96孔板中，4℃孵育1小时。然后用200μL PBS溶液洗涤3遍，加入羊抗人IgG-FITC(中杉金桥，ZF-0308)，100μL每孔，4℃避光孵育30分钟后，用200μL PBS溶液洗涤3遍，之后用100μL PBS溶液重悬，并用流式细胞仪(ACEA，Novocyte)进行FITC荧光检测。结果如图3所示：抗人IL-1R3鼠单克隆抗体R1B9具有优异的结合HaCAT细胞表面IL-1R3的活性。
实施例4：IL-1R3鼠单克隆抗体的人源化和活性评价
4.1R1B9鼠单克隆抗体的人源化
对鼠源单克隆抗体R1B9进行人源化研究以降低其免疫原性。人源化方案采取经典的框架移植策略10。将编码R1B9的重链可变区和轻链可变区的核苷酸序列分别与IMGT数据库中的人抗体胚系基因序列相比较，选择合适的胚系基因序列以提供抗体的框架区1至3(FR1+FR2+FR3)，选择合适的J区基因序列以提供框架区4(FR4)。这个模板可以根据多种因素选出，如：抗体的相对总长度、CDR的大小、位于抗体框架区(FR)和超变区(CDR)之间连接处的氨基酸残基、序列整体的同源性等。所选的模板可以是多个序列的混合物或者可以是共有模板，目的是尽可能维持亲本互补决定区(CDR)的合适构象。最终得到了1个人源化的重链突变体R1B9VH-h1(SEQ ID NO：22)和1个人源化的轻链突变体R1B9VK-h1(SEQ ID NO：23)。
4.2人源化抗体的亲和力分析
参照实施例3.3，使用Biacore T200对IL-1R3人源化抗体R1B9VH-h1+R1B9VK-h1的亲和力进行分析，结果如表3所示。
表3.人源化抗体结合hIL-1R3-His的亲和力常数
Ka(M-1s-1) Kd(s-1) KD(M)
R1B9 7.499E+4 9.318E-5 1.243E-9
R1B9VH-h1+R1B9VK-h1 9.916E+4 1.115E-4 1.125E-9
4.3IL-1R3人源化抗体识别细胞表面IL-1R3的能力鉴定
具体实施方法参见实施例3.4。结果如图4所示：人源化抗体R1B9VH-h1+R1B9VK-h1保持了亲本R1B9的结合活性。
实施例5：IL-36R×IL-1R3Crossmab结构双特异性抗体的制备和表征
5.1Crossmab结构双特异性抗体的制备
基于亲本抗体R49E11VH-h3+L26B11VK和R1B9VH-h1+R1B9VK-h1，制备Crossmab结构双特异抗体，将编码R49E11VH-h3的核苷酸序列克隆至含有编码Hole突变的IgG1恒定区IgG1m3-H1的核苷酸序列的真核表达载体，将编码R1B9VH-h1的核苷酸序列克隆至含有编码Knob突变的IgG1恒定区IgG1m3-K的核苷酸序列的真核表达载体，将编码L26B11VK和R1B9VK-h1的核苷酸序列克隆至含有编码人轻链恒定区CK的核苷酸序列的真核表达载体。之后，将编码R1B9VH-h1重链CH1部分核苷酸序列和编码R1B9VK-h1轻链CK部分核苷酸序列进行置换，将构建的表达R49E11VH-h3-IgG1m3-H1、表达L26B11VK-CK(SEQ IN NO：47)、表达R1B9VH-h1-CK-cross-IgG1m3-K(SEQ IN NO：48)和表达R1B9VK-h1-CH1-cross(SEQ IN NO：49)的4个真核表达载体利用脂质体共转染入HEK293F细胞，在无血清悬浮培养条件下培养3-5天，然后通过离心等方式收获培养上清。
培养上清中双特异性抗体用ProteinA/G亲和层析柱(如GE公司的Mabselect SURE等)进行纯化，然后利用脱盐柱(如GE公司的Hitrap desaulting等)将重组蛋白保存缓冲液置换为PBS(pH7.0)或者其它合适的缓冲液。将脱盐后蛋白溶液通过尺寸排阻层析(SEC)使用Superdex200(GE)纯化得到目的蛋白。必要时，可以对抗体样品进行过滤除菌，然后分装保存于-20℃备用。
5.2IL-36R×IL-1R3 Crossmab结构双特异性抗体亲和力分析
参照实施例2.2和3.3，使用Biacore T200对IL-36R×IL-1R3Crossmab结构双特异性抗体进行亲和力分析，结果见表4和表5。
表4.IL-36R×IL-1R3 Crossmab结构双特异性抗体结合hIL-1R3-His的亲和力常数
表5.IL-36R×IL-1R3 Crossmab结构双特异性抗体结合人hIL-36R-His的亲和力常数
5.3基于HaCAT细胞分析IL-36R×IL-1R3 Crossmab结构双特异性抗体的生物学活性
具体实施方法参见实施例2.4。结果如图5A-图5C和表6所示：与R49E11VH-h3+L26B11VK单克隆抗体相比，Crossmab结构双特异性抗体(R1B9VH-h1+R1B9VK-h1-Fab-cross+R49E11VH-h3+L26B11VK-Fab)表现出协同作用，根据IC50值，IL-36α方向活性提高约3倍，IL-36β方向活性提高约13倍，IL-36γ方向活性提高约103倍。
表6.IL-36R×IL-1R3 Crossmab结构双特异性抗体抑制IL-36细胞因子刺激HaCAT细胞分泌hIL-8的IC50值
注：“/”代表无活性。
实施例6：共同轻链结构IL36R×IL-1R3双特异性抗体亲和力成熟
6.1筛选共同轻链
基于双载体噬菌体呈现系统(实验技术流程可参见中国专利申请第201510097117.0号)，以抗人IL-36R单克隆抗体R49E11VH-h3+L26B11VK的重链R49E11VH-h3为基础，采用轻链置换的策略，用hIL-36R-His作为筛选抗原，对原始轻链库进行2轮的筛选和富集；然后以抗人IL-1R3单克隆抗体R1B9VH-h1+R1B9VK-h1的重链R1B9VH-h1为基础，用hIL-1R3-His作为筛选抗原，对上述经hIL-36R-His富集后的轻链库进行2轮筛选和富集，最后对获得的轻链进行鉴定，最终得到共同轻链可变区L36E9VK(SEQ ID NO：19)。
6.2共同轻链双特异性抗体的制备
基于共同轻链可变区L36E9VK制备双特异抗体，将编码R49E11VH-h3的核苷酸序列克隆至含有编码Hole突变的IgG1恒定区IgG1m3-H1的核苷酸序列的真核表达载体，将编码R1B9VH-h1的核苷酸序列克隆至含有编码Knob突变的IgG1恒定区IgG1m3-K的核苷酸序列的真核表达载体，将编码共同轻链L36E9VK的核苷酸序列克隆至含有编码人轻链恒定区CK的核苷酸序列的真核表达载体，将构建的表达R49E11VH-h3-IgG1m3-H1(SEQ ID NO：44)、表达R1B9VH-h1-IgG1m3-K(SEQ ID NO：45)和表达L36E9VK-CK(SEQ ID NO：46)的3个真核表达载体利用脂质体共转染入HEK293F细胞，在无血清悬浮培养条件下培养3-5天，然后通过离心等方式收获培养上清。
培养上清中的双特异性抗体用ProteinA/G亲和层析柱(如GE公司的MabselectSURE等)进行纯化，然后利用脱盐柱(如GE公司的Hitrap desaulting等)将重组蛋白保存缓冲液置换为PBS(pH7.0)或者其它合适的缓冲液。将脱盐后蛋白溶液通过尺寸排阻层析(SEC)使用Superdex200(GE)纯化得到目的蛋白。必要时，可以对抗体样品进行过滤除菌，然后分装保存于-20℃备用。
6.3亲和力成熟方案
为了增加双特异抗体在IL-36R方向的结合能力，提高IL-36R×IL-1R3双特异性抗体阻断IL-36细胞因子的活性，对R49E11VH-h3重链可变区进行了体外亲和力成熟。利用常规分子生物学手段，通过在R49E11VH-h3重链可变区的CDR2和CDR3中引入突变，构建了基于R49E11VH-h3的CDR23突变库。设计的突变方案如表7所示，构建库容为1.4E8，正确率70％。
表7.R49E11VH-h3-CDR23突变库设计方案
6.4亲和力成熟突变库筛选
基于双载体噬菌体展示系统(实验技术流程参见中国专利申请第201510097117.0号中的实施例5)，固定轻链L36E9VK，利用h1L36R-His抗原对构建的R49E11VH-h3-CDR23突变库共进行3轮筛选富集，最终得到1株亲和力提高的重链可变区突变体R72B7(SEQ ID NO：18)。
参照实施例1和实施例5，制备基于R72B7的单克隆抗体和双特异性抗体分子。
6.5突变体亲和力分析
参照实施例2.2和3.3，使用Biacore T200对IL-36R×IL-1R3双特异性抗体进行亲和力分析，结果如表8和表9所示。
表8.IL-36R×IL-1R3共同轻链双特异性抗体结合hIL-36R-His的亲和力常数
Ka(M-1s-1) Kd(s-1) KD(M)
共同轻链双特异性抗体(R72B7VH/R1B9VH-h1+L36E9VK) 3.072E+4 3.979E-5 1.295E-9
R72B7VH+L36E9VK 3.279E+4 5.400E-5 1.647E-9
R49E11VH-h3+L36E9VK 8.686E+3 9.944E-5 1.145E-8
表9.IL-36R×IL-1R3双特异性抗体结合hIL-1R3-His的亲和力常数
Ka(M-1s-1) Kd(s-1) KD(M)
共同轻链双特异性抗体(R72B7VH/R1B9VH-h1+L36E9VK) 3.835E+4 5.532E-5 1.443E-9
R1B9VH-h1+R1B9VK-h1 1.061E+5 1.534E-4 1.446E-9
6.6基于HaCAT细胞分析亲和力成熟的共同轻链双特异性抗体的生物学活性
具体实施方法参见实施例2.4。结果如图6A-图6C和表10所示：与R72B7VH+L36E9VK单克隆抗体相比，亲和力成熟的共同轻链双特异性抗体(R72B7VH/R1B9VH-h1+L36E9VK)表现出明显的协同作用，与Spesolimab相比，根据IC50值，IL-36α方向活性提高约12倍，IL-36β方向活性提高约4倍，IL-36γ方向活性提高约15倍。
表10.IL-36R×IL-1R3共同轻链双特异性抗体抑制IL-36刺激HaCAT细胞分泌hIL-8的IC50值
注：“/”代表无活性。
6.7基于人单核细胞分析亲和力成熟的共同轻链双特异性抗体的生物学活性
6.7.1人外周血单个核细胞(PBMC)的分离
采集正常志愿者的血液(各50mL)，所有志愿者均已签订知情同意书。
志愿者入选标准为：
1.年龄大于18周岁；
2.无HIV、HBV感染；
3.血常规检测正常；
4.非孕妇或哺乳期妇女。
利用Ficoll密度梯度离心法从志愿者全血细胞中分离得到PBMC，并培养于1640培养基中。
6.7.2基于人单核细胞分析亲和力成熟的共同轻链双特异性抗体的生物学活性
外周血单个核细胞(PBMC)，是指外周血中具有单个核的细胞，包括淋巴细胞、单核细胞、树突状细胞和少量其他细胞。IL-36细胞因子(IL-36α/IL-36β/IL-36γ)能刺激人单核细胞分泌h1L-8。
本实施例用人单核细胞评价IL-36R单克隆抗体和IL-36R×IL-1R3双特异性抗体抑制IL-36γ的能力。对健康人的外周血进行PBMC的分离，基于磁珠阳选法获得CD14+单核细胞(抗人CD14磁性颗粒-DM，BD Bioscience，货号557769)，用单核细胞维持培养基(1640+10％灭活FBS+1％P/S)将CD14+单核细胞稀释至5×105个/mL的单细胞悬液，100μL/孔接种至96孔板中，用一定浓度的IL-36γ(16.62nM)刺激CD14+单核细胞，再加入一系列浓度梯度(以50nM作为起始浓度，5倍梯度稀释)的测试抗体(R72B7VH/R1B9VH-h1+L36E9VK、R49E11VH-h3+L26B11VK、Spesolimab)和阴性同型对照抗体(DP47-IgG1m3)，置于细胞培养箱(37±1℃，5±1％CO2)培养48h后，采用人IL-8预包被ELISA试剂盒(达科为生物技术有限公司，货号1110802)对上清液稀释后检测。结果如图7和表11所示：与R49E11VH-h3+L26B11VK单克隆抗体相比，亲和力成熟的共同轻链双特异性抗体R72B7VH/R1B9VH-h1+L36E9VK表现出明显的协同作用，与Spesolimab相比，根据IC50值，IL-36γ方向活性提高约17倍。表11.亲和力成熟的共同轻链双特异性抗体抑制IL-36γ刺激人单核细胞分泌hIL-8的IC50值
注：“/”代表无活性。
实施例7：共同轻链结构IL-36R×IL-1R3双特异性抗体对IL-33信号通路活性影响的分析
IL-33和IL-12各自不能单独激活NK细胞，但IL-12可以显著增加NK细胞表面ST2的表达，用IL-33和IL-12刺激新鲜分离的NK细胞，IL-33与NK细胞表面ST2结合，可以激活NK细胞大量释放IFN-γ。通过检测抗体对IFN-γ表达水平的影响可以评价抗ST2抗体和抗IL-1R3抗体的活性。
对健康人的外周血进行PBMC的分离(具体实施方法参见实施例6.5.1)，用PBMC维持培养基(1640+10％灭活FBS+1％P/S)将PBMC稀释至1×106个/mL的单细胞悬液，100μL/孔接种至96孔板中，用一定浓度的IL-12(175pM)和IL-33(1110pM)刺激PBMC，再加入一系列浓度梯度(以10nM作为起始浓度，5倍梯度稀释)的测试抗体(R72B7VH/R1B9VH-h1+L36E9VK和抗ST2单克隆抗体H5G3VH+L1D1VK(参见中国专利申请CN110357963A)和阴性同型对照抗体(DP47-IgG1m3)，置于细胞培养箱(37±1℃，5±1％CO2)培养24h后，采用干扰素γ匹配的ELISA抗体对(Sino Biological，货号SEKA11725)对上清液稀释后检测。结果如图8所示：R72B7VH/R1B9VH-h1+L36E9VK不能抑制IL-33和IL-12刺激NK细胞释放人hIFN-γ。
实施例8：共同轻链结构IL-36RxIL-1R3双特异性抗体对IL-1信号通路活性影响的分析
MRC-5是人肺成纤维细胞，IL-1α和IL-1β能刺激MRC-5细胞分泌IL-8。通过检测抗体对IL-8表达水平的影响可以评价抗IL-1R1抗体和抗IL-1R3抗体的活性。
MRC-5用MRC-5细胞维持培养基(MEM/EBSS+5％灭活FBS+1％P/S)稀释至1×105个/mL的单细胞悬液，100μL/孔接种至96孔板中，用一定浓度的IL-1α(50pM)或IL-1β(5pM)刺激MRC-5细胞，再加入一系列浓度梯度(以66.67nM作为起始浓度，3倍梯度稀释)的测试抗体(R72B7VH/R1B9VH-h1+L36E9VK和抗IL1R1单克隆抗体WM1R1-C1(参见美国专利申请US8236559B2中的15C4))和阴性同型对照抗体(DP47-IgG1m3)，置于细胞培养箱(37±1℃，5±1％CO2)培养20h后，采用人IL-8预包被ELISA试剂盒(达科为生物技术有限公司，货号1110802)对上清液稀释后检测。结果如图9A和图9B所示，R72B7/R1B9VH-h1+L36E9VK不能抑制IL-1α或IL-1β刺激MRC-5细胞释放hIL-8。
上文对本申请的各项发明的示例性实施方案进行了描述，但是，在不脱离本申请的实质和范围的情况下，本领域技术人员能够对本申请描述的示例性实施方案进行修改或改进，由此得到的变形方案或等同方案也属于本申请的范围。
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序列
SEQ ID NO：1
SSWIH
SEQ ID NO：2
EINPGNVRSNYNENFRN
SEQ ID NO：3
INYGEPYFAS
SEQ ID NO：4
RASQSVIGSYLA
SEQ ID NO：5
SASKLAS
SEQ ID NO：6
QQDTRYPIT
SEQ ID NO：7
EINPGSGRSNYNENFQG
SEQ ID NO：8
VFYGEPYFPF
SEQ ID NO：9
RASQSVIYSYLA
SEQ ID NO：10
SASKRAS
SEQ ID NO：11
QQHAGIPVT
SEQ ID NO：12
SYAMS
SEQ ID NO：13
EISRGGSHTYYPDTVTG
SEQ ID NO:14
SYGNYPFDY
SEQ ID NO:15
SASSSVSYMY
SEQ ID NO:16
DTSNLAS
SEQ ID NO:17
QQWSSYPLT
SEQ ID NO:18
QVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASGYSFTSSWIHWVKQAPGQGLEWMGEINPGNVRSN
YNENFRNKVTMTVDTSISTAYMELSRLRSDDTAVYYCTVINYGEPYFASWGQGTLVTVSSSEQ IDNO:19
EIVLTQSPGTLSLSPGERATLSCRASQSVIGSYLAWYQQKPGQAPRLLIYSASKLASGIPDRF
SGSGSGTDFTLTISRLEPEDFAVYYCQQDTRYPITFGQGTKVEIK
SEQ ID NO:20
QVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASGYSFTSSWIHWVRQAPGQGLEWMGEINPGSGRSN
YNENFQGRVTMTVDTSISTAYMELSRLRSDDTAVYYCTVVFYGEPYFPFWGQGTLVTVSSSEQ IDNO:21
EIVLTQSPGTLSLSPGERATLSCRASQSVIYSYLAWYQQKPGQAPRLLIYSASKRASGIPDRF
SGSGSGTDFTLTISRLEPEDFAVYYCQQHAGIPVTFGQGTKVEIK
SEQ ID NO:22
EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSSYAMSWVRQAPGKGLVWVAEISRGGSHTYY
PDTVTGRFTISRDNAKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCARSYGNYPFDYWGQGTTVTVSSSEQ ID NO:23
EIVLTQSPATLSLSPGERATLSCSASSSVSYMYWYQQKPGQAPRLLIYDTSNLASGIPARFSG
SGSGTDFTLTISSLEPEDFAVYYCQQWSSYPLTFGQGTKLEIK
SEQ ID NO:24
DGCKDIFMKNEILSASQPFAFNCTFPPITSGEVSVTWYKNSSKIPVSKIIQSRIHQDETWILFL
PMEWGDSGVYQCVIKGRDSCHRIHVNLTVFEKHWCDTSIGGLPNLSDEYKQILHLGKDDSL
TCHLHFPKSCVLGPIKWYKDCNEIKGERFTVLETRLLVSNVSAEDRGNYACQAILTHSGKQ
YEVLNGITVSITERAGYGGSVPKIIYPKNHSIEVQLGTTLIVDCNVTDTKDNTNLRCWRVNN
TLVDDYYDESKRIREGVETHVSFREHNLYTVNITFLEVKMEDYGLPFMCHAGVSTAYIILQL
PAPDFR
SEQ ID NO:25
DGCNDIFMKNEMLSASQPFAFNCTFPPITSGEVSVTWYKNSSKIPVSKIIQSRIHQDETWILF
LPMEWGDSGVYQCVIKGRDSCHRIHVNLTVFEKQWCDTSVKGLPNLSDEYKQILHLGKDD
SLTCHLHFPKSCILGPIKWYKDCNEITGERFTVLETRLLVSNVSAEDRGNYACQVILTHSGK
QYEVLNGITVSITERAGYGGSVPKIIYPKNNSIEVQLGTTLIVDCNITDTKDNTNLRCWRVN
NTLVDDYYNESKRIREGVETHASFREYNLYTVNITFLEVKMEDYGLPFMCHAGVSAAYIML
QLPAPDFR
SEQ ID NO:26
SERCDDWGLDTMRQIQVFEDEPARIKCPLFEHFLKFNYSTAHSAGLTLIWYWTRQDRDLEE
PINFRLPENRISKEKDVLWFRPTLLNDTGNYTCMLRNTTYCSKVAFPLEVVQKDSCFNSPM
KLPVHKLYIEYGIQRITCPNVDGYFPSSVKPTITWYMGCYKIQNFNNVIPEGMNLSFLIALIS
NNGNYTCVVTYPENGRTFHLTRTLTVKVVGSPKNAVPPVIHSPNDHVVYEKEPGEELLIPCT
VYFSFLMDSRNEVWWTIDGKKPDDITIDVTINESISHSRTEDETRTQILSIKKVTSEDLKRSY
VCHARSAKGEVAKAAKVKQKVPAPRYTVE
SEQ ID NO:27
SERCDDWGLDTMRQIQVFEDEPARIKCPLFEHFLKFNYSTAHSAGLTLIWYWTRQDRDLEE
PINFRLPENRISKEKDVLWFRPTLLNDTGNYTCMLRNTTYCSKVAFPLEVVQKDSCFNSPM
KLPVHKLYIEYGIQRITCPNVDGYFPSSVKPTITWYMGCYKIQNFNNVIPEGMNLSFLIAFIS
NNGNYTCVVTYPENGRTFHLTRTLTVKVVGSPKNAVPPVIHSPNDHVVYEKEPGEELLIPCT
VYFSFLMDSRNEVWWTIDGKKPDDIPIDVTINESISHSRTEDETRTQILSIKKVTSEDLKRSY
VCHARSAKGEVAKAATVKQKVPAPRYTVE
SEQ ID NO:28
SAPFSFLSNVKYNFMRIIKYEFILNDALNQSIIRANDQYLTAAALHNLDEAVKFDMGAYKSS
KDDAKITVILRISKTQLYVTAQDEDQPVLLKEMPEIPKTITGSETNLLFFWETHGTKNYFTSV
AHPNLFIATKQDYWVCLAGGPPSITDFQILENQA
SEQ ID NO:29
APVRSLNCTLRDSQQKSLVMSGPYELKALHLQGQDMEQQVVFSMSFVQGEESNDKIPVAL
GLKEKNLYLSCVLKDDKPTLQLESVDPKNYPKKKMEKRFVFNKIEINNKLEFESAQFPNWY
ISTSQAENMPVFLGGTKGGQDITDFTMQFVSS
SEQ ID NO:30
SITGISPITEYLASLSTYNDQSITFALEDESYEIYVEDLKKDEKKDKVLLSYYESQHPSNESG
DGVDGKMLMVTLSPTKDFWLHANNKEHSVELHKCEKPLPDQAFFVLHNMHSNCVSFECK
TDPGVFIGVKDNHLALIKVDSSENLCTENILFKLSET
SEQ ID NO:31
KIDTPQQGSIQDINHRVWVLQDQTLIAVPRKDRMSPVTIALISCRHVETLEKDRGNPIYLGL
NGLNLCLMCAKVGDQPTLQLKEKDIMDLYNQPEPVKSFLFYHSQSGRNSTFESVAFPGWFI
AVSSEGGCPLILTQELGKANTTDFGLTMLF
SEQ ID NO:32
REAAPKSYAIRDSRQMVWVLSGNSLIAAPLSRSIKPVTLHLIACRDTEFSDKEKGNMVYLGI
KGKDLCLFCAEIQGKPTLQLKEKNIMDLYVEKKAQKPFLFFHNKEGSTSVFQSVSYPGWFI
ATSTTSGQPIFLTKERGITNNTNFYLDSVE
SEQ ID NO:33
SMCKPITGTINDLNQQVWTLQGQNLVAVPRSDSVTPVTVAVITCKYPEALEQGRGDPIYLGI
QNPEMCLYCEKVGEQPTLQLKEQKIMDLYGQPEPVKPFLFYRAKTGRTSTLESVAFPDWFI
ASSKRDQPIILTSELGKSYNTAFELNIND
SEQ ID NO:34
HHHHHH
SEQ ID NO:35
PRGPTIKPCPPCKCPAPNLLGGPSVFIFPPKIKDVLMISLSPIVTCVVVDVSEDDPDVQISWFV
NNVEVHTAQTQTHREDYNSTLRVVSALPIQHQDWMSGKEFKCKVNNKDLPAPIERTISKPK
GSVRAPQVYVLPPPEEEMTKKQVTLTCMVTDFMPEDIYVEWTNNGKTELNYKNTEPVLDS
DGSYFMYSKLRVEKKNWVERNSYSCSVVHEGLHNHHTTKSFSRTPGK
SEQ ID NO:36
ASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGL
YSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKRVEPKSCDKTHTCPPCPAPELLGGPSVF
LFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYR
VVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQ
VSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVF
SCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK
SEQ ID NO:37
ASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGL
YSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKRVEPKSCDKTHTCPPCPAPEFEGGPSVF
LFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYR
VVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPASIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQ
VSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVF
SCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK
SEQ ID NO:38
ASTKGPSVFPLAPSSKSTSEGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGL
YSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVDHKPSNTKVDKTVEPKSCDKTHTCPPCPAPEFEGGPSVF
LFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSQEDPEVQFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYR
VVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPASIEKTISKAKGQPREPQVCTLPPSQEEMTKNQ
VSLSCAVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLVSKLTVDKSRWQEGNVF
SCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK
SEQ ID NO:39
ASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGL
YSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKRVEPKSCDKTHTCPPCPAPEFEGGPSVF
LFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYR
VVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPASIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPCREEMTKN
QVSLWCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGN
VFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK
SEQ ID NO:40
RTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDS
KDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC
SEQ ID NO:41
GQPKAAPSVTLFPPSSEELQANKATLVCLISDFYPGAVTVAWKADSSPVKAGVETTTPSKQS
NNKYAASSYLSLTPEQWKSHRSYSCQVTHEGSTVEKTVAPTECS
SEQ ID NO:42
QVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASGYSFTSSWIHWVKQAPGQGLEWMGEINPGNVRTN
YNENFRNKVTMTVDTSISTAYMELSRLRSDDTAVYYCTVVFYGEPYFPYWGQGTLVTVSSSEQ IDNO:43
QIVLTQSPGTLSLSPGERATMTCTASSSVSSSYFHWYQQKPGQAPRLWIYRTSRLASGVPDR
FSGSGSGTDFTLTISRLEPEDAATYYCHQFHRSPLTFGAGTKLEIK
SEQ ID NO:44
QVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASGYSFTSSWIHWVRQAPGQGLEWMGEINPGSGRSN
YNENFQGRVTMTVDTSISTAYMELSRLRSDDTAVYYCTVVFYGEPYFPFWGQGTLVTVSSA
STKGPSVFPLAPSSKSTSEGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYS
LSSVVTVPSSSLGTQTYICNVDHKPSNTKVDKTVEPKSCDKTHTCPPCPAPEFEGGPSVFLFP
PKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSQEDPEVQFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVS
VLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPASIEKTISKAKGQPREPQVCTLPPSQEEMTKNQVSL
SCAVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLVSKLTVDKSRWQEGNVFSCS
VMHEALHNHYTQKSLSLSPGK
SEQ ID NO:45
EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSSYAMSWVRQAPGKGLVWVAEISRGGSHTYY
PDTVTGRFTISRDNAKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCARSYGNYPFDYWGQGTTVTVSSAS
TKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYS
LSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKRVEPKSCDKTHTCPPCPAPEFEGGPSVFLFP
PKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVS
VLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPASIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPCREEMTKNQVSL
WCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCS
VMHEALHNHYTQKSLSLSPGK
SEQ ID NO:46
EIVLTQSPGTLSLSPGERATLSCRASQSVIGSYLAWYQQKPGQAPRLLIYSASKLASGIPDRF
SGSGSGTDFTLTISRLEPEDFAVYYCQQDTRYPITFGQGTKVEIKRTVAAPSVFIFPPSDEQLK
SGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADY
EKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC
SEQ ID NO:47
EIVLTQSPGTLSLSPGERATLSCRASQSVIYSYLAWYQQKPGQAPRLLIYSASKRASGIPDRF
SGSGSGTDFTLTISRLEPEDFAVYYCQQHAGIPVTFGQGTKVEIKRTVAAPSVFIFPPSDEQLK
SGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADY
EKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC
SEQ ID NO:48
EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSSYAMSWVRQAPGKGLVWVAEISRGGSHTYY
PDTVTGRFTISRDNAKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCARSYGNYPFDYWGQGTTVTVSSAS
VAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKD
STYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGECDKTHTCPPCPAPEFEGGP
SVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNS
TYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPASIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPCREEMT
KNQVSLWCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQ
GNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK
SEQ ID NO:49
EIVLTQSPATLSLSPGERATLSCSASSSVSYMYWYQQKPGQAPRLLIYDTSNLASGIPARFSG
SGSGTDFTLTISSLEPEDFAVYYCQQWSSYPLTFGQGTKLEIKSSASTKGPSVFPLAPSSKSTS
GGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTY
ICNVNHKPSNTKVDKRVEPKSC
SEQ ID NO:50
QVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASGYSFTSSWIHWVKQAPGQGLEWMGEINPGNVRSN
YNENFRNKVTMTVDTSISTAYMELSRLRSDDTAVYYCTVINYGEPYFASWGQGTLVTVSSA
STKGPSVFPLAPSSKSTSEGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYS
LSSVVTVPSSSLGTQTYICNVDHKPSNTKVDKTVEPKSCDKTHTCPPCPAPEFEGGPSVFLFP
PKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSQEDPEVQFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVS
VLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPASIEKTISKAKGQPREPQVCTLPPSQEEMTKNQVSL
SCAVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLVSKLTVDKSRWQEGNVFSCS
VMHEALHNHYTQKSLSLSPGK
SEQ ID NO:51
EVKLVESGGGLVKPGGSLKLSCAASGFTFSSYAMSWVRQSPEKRLEWVAEISRGGSHTYYP
DTVTGRFTISRDNAKNTLYLEMTSLRSEDTALYYCARSYGNYPFDYWGQGTTLTVSS
SEQ ID NO:52
DIVMTQSPAIMSASPGEKVTMTCSASSSVSYMYWYQQKPGSSPRLLIYDTSNLASGVPVRF
SGSGSGTSYSLTISRMEAEDAATYYCQQWSSYPLTFGAGTKLEIK
SEQ ID NO:53
EVQLLESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSSYAMSWVRQAPGKGLEWVSAISGSGGSTYYADS
VKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCAKGSGFDYWGQGTLVTVSS
SEQ ID NO:54
EIVLTQSPGTLSLSPGERATLSCRASQSVSSSYLAWYQQKPGQAPRLLIYGASSRATGIPDRFSGS
GSGTDFTLTISRLEPEDFAVYYCQQYGSSPLTFGQGTKVEIK
SEQ ID NO:55
TGCATTTGAACTCCTTGCC
SEQ ID NO:56
CCATCAATCTTCCACTTGAC

Claims (10)

1.双特异性抗体，其包含结合人IL-36R的第一抗原结合片段和结合人IL-1R3的第二抗原结合片段；
任选地，所述双特异性抗体能够抑制IL-36介导的炎症反应，例如抑制IL-36α、IL-36β和/或IL-36γ与IL-36R的结合，抑制细胞分泌SEAP，和/或抑制细胞分泌IL-8。
2.如权利要求1所述的双特异性抗体，其中
所述第一抗原结合片段包含：
氨基酸序列为SSWIH(SEQ ID NO：1)的HCDR1，氨基酸序列为EINPGNVRSNYNENFRN(SEQID NO：2)的HCDR2，氨基酸序列为INYGEPYFAS(SEQ ID NO：3)的HCDR3，氨基酸序列为RASQSVIGSYLA(SEQ ID NO：4)的LCDR1，氨基酸序列为SASKLAS(SEQ ID NO：5)的LCDR2，和氨基酸序列为QQDTRYPIT(SEQ ID NO：6)的LCDR3；或者
氨基酸序列为SSWIH(SEQ ID NO：1)的HCDR1，氨基酸序列为EINPGSGRSNYNENFQG(SEQID NO：7)的HCDR2，氨基酸序列为VFYGEPYFPF(SEQ ID NO：8)的HCDR3，氨基酸序列为RASQSVIYSYLA(SEQ ID NO：9)的LCDR1，氨基酸序列为SASKRAS(SEQ ID NO：10)的LCDR2，和氨基酸序列为QQHAGIPVT(SEQ ID NO：11)的LCDR3；和/或
所述第二抗原结合片段包含：
氨基酸序列为SYAMS(SEQ ID NO：12)的HCDR1，氨基酸序列为EISRGGSHTYYPDTVTG(SEQID NO：13)的HCDR2，氨基酸序列为SYGNYPFDY(SEQ ID NO：14)的HCDR3，氨基酸序列为RASQSVIGSYLA(SEQ ID NO：4)的LCDR1，氨基酸序列为SASKLAS(SEQ ID NO：5)的LCDR2，和氨基酸序列为QQDTRYPIT(SEQ ID NO：6)的LCDR3；或者
氨基酸序列为SYAMS(SEQ ID NO：12)的HCDR1，氨基酸序列为EISRGGSHTYYPDTVTG(SEQID NO：13)的HCDR2，氨基酸序列为SYGNYPFDY(SEQ ID NO：14)的HCDR3，氨基酸序列为SASSSVSYMY(SEQ ID NO：15)的LCDR1，氨基酸序列为DTSNLAS(SEQ ID NO：16)的LCDR2，和氨基酸序列为QQWSSYPLT(SEQ ID NO：17)的LCDR3；
其中，HCDR和LCDR的氨基酸序列根据Kabat定义。
3.如权利要求2所述的双特异性抗体，其中
所述第一抗原结合片段的重链可变区的氨基酸序列如SEQ ID NO：18所示，轻链可变区的氨基酸序列如SEQ ID NO：19所示；或者
所述第一抗原结合片段的重链可变区的氨基酸序列如SEQ ID NO：20所示，轻链可变区的氨基酸序列如SEQ ID NO：21所示；和/或
所述第二抗原结合片段的重链可变区的氨基酸序列如SEQ ID NO：22所示，轻链可变区的氨基酸序列如SEQ ID NO：19所示；或者
所述第二抗原结合片段的重链可变区的氨基酸序列如SEQ ID NO：22所示，轻链可变区的氨基酸序列如SEQ ID NO：23所示。
4.如权利要求1-3中任一项所述的双特异性抗体，其中
所述第一抗原结合片段包含SEQ ID NO：18所示的重链可变区和SEQ ID NO：19所示的轻链可变区，以及所述第二抗原结合片段包含SEQ ID NO：22所示的重链可变区和SEQ IDNO：19所示的轻链可变区；或者
所述第一抗原结合片段包含SEQ ID NO：20所示的重链可变区和SEQ ID NO：21所示的轻链可变区，以及所述第二抗原结合片段包含SEQ ID NO：22所示的重链可变区和SEQ IDNO：23所示的轻链可变区；
优选地，所述第一抗原结合片段包含SEQ ID NO：50所示的重链和SEQ ID NO：46所示的轻链，以及所述第二抗原结合片段包含SEQ ID NO：45所示的重链和SEQ ID NO：46所示的轻链；或者
所述第一抗原结合片段包含SEQ ID NO：44所示的重链和SEQ ID NO：47所示的轻链，以及所述第二抗原结合片段包含SEQ ID NO：48所示的重链和SEQ ID NO：49所示的轻链。
5.如权利要求1-4中任一项所述的双特异性抗体，其中
所述双特异性抗体是IgG1抗体，其包含第一重链恒定区和第二重链恒定区，其中，
所述第一重链恒定区的第354和366位的氨基酸分别为C和W，所述第二重链恒定区的第349、366、368和407位的氨基酸分别为C、S、A和V；和/或
所述第一重链恒定区和所述第二重链恒定区的第234、235和331位的氨基酸分别为F、E和S；
抗体恒定区氨基酸位置按照EU numbering确定。
6.如权利要求1-5中任一项所述的双特异性抗体，其中
所述第一抗原结合片段和所述第二抗原结合片段独立地选自单链抗体(scFv)或者Fab片段；优选地，所述第一抗原结合片段和所述第二抗原结合片段均为Fab片段。
7.结合人IL-36R的单克隆抗体，其包含
如SEQ ID NO：1所示的HCDR1，
如SEQ ID NO：7所示的HCDR2，
如SEQ ID NO：8所示的HCDR3，
如SEQ ID NO：9所示的LCDR1，
如SEQ ID NO：10所示的LCDR2，和
如SEQ ID NO：11所示的LCDR3；或者
如SEQ ID NO：1所示的HCDR1，
如SEQ ID NO：2所示的HCDR2，
如SEQ ID NO：3所示的HCDR3，
如SEQ ID NO：4所示的LCDR1，
如SEQ ID NO：5所示的LCDR2，和
如SEQ ID NO：6所示的LCDR3；或者
如SEQ ID NO：1所示的HCDR1，
如SEQ ID NO：7所示的HCDR2，
如SEQ ID NO：8所示的HCDR3，
如SEQ ID NO：4所示的LCDR1，
如SEQ ID NO：5所示的LCDR2，和
如SEQ ID NO：6所示的LCDR3；
其中，HCDR和LCDR的氨基酸序列根据Kabat定义；
优选地，所述抗体的重链可变区的氨基酸序列如SEQ ID NO：20所示，轻链可变区的氨基酸序列如SEQ ID NO：21所示；或者
所述抗体的重链可变区的氨基酸序列如SEQ ID NO：18所示，轻链可变区的氨基酸序列如SEQ ID NO：19所示；或者
所述抗体的重链可变区的氨基酸序列如SEQ ID NO：20所示，轻链可变区的氨基酸序列如SEQ ID NO：19所示。
8.结合人IL-1R3的单克隆抗体，其包含
如SEQ ID NO：12所示的HCDR1，
如SEQ ID NO：13所示的HCDR2，
如SEQ ID NO：14所示的HCDR3，
如SEQ ID NO：15所示的LCDR1，
如SEQ ID NO：16所示的LCDR2，和
如SEQ ID NO：17所示的LCDR3；
其中，HCDR和LCDR的氨基酸序列根据Kabat定义；
优选地，所述抗体的重链可变区的氨基酸序列如SEQ ID NO：22所示，轻链可变区的氨基酸序列如SEQ ID NO：23所示；或者
所述抗体的重链可变区的氨基酸序列如SEQ ID NO：51所示，轻链可变区的氨基酸序列如SEQ ID NO：52所示。
9.药物组合物，其包含权利要求1-6中任一项所述的双特异性抗体、或者权利要求7或8所述的单克隆抗体以及药学上可接受的赋形剂、稀释剂或载体。
10.权利要求1-6中任一项所述的双特异性抗体、权利要求7或8所述的单克隆抗体、或者权利要求9所述的药物组合物在制备用于预防或治疗IL-36介导的疾病的药物中的用途；
优选地，所述IL-36介导的疾病选自：寻常型银屑病、炎症性肠病、肾损伤和炎症、肺炎、关节炎、化脓性汗腺炎、泛发性脓疱型银屑病和掌跖性脓疱型银屑病。
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