TW202132351A - 抗cd47/抗pd-l1抗體及其應用 - Google Patents
抗cd47/抗pd-l1抗體及其應用 Download PDFInfo
- Publication number
- TW202132351A TW202132351A TW110106865A TW110106865A TW202132351A TW 202132351 A TW202132351 A TW 202132351A TW 110106865 A TW110106865 A TW 110106865A TW 110106865 A TW110106865 A TW 110106865A TW 202132351 A TW202132351 A TW 202132351A
- Authority
- TW
- Taiwan
- Prior art keywords
- amino acid
- seq
- acid sequence
- antibody
- variable region
- Prior art date
Links
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 claims abstract description 12
- 125000003275 alpha amino acid group Chemical group 0.000 claims description 502
- 230000027455 binding Effects 0.000 claims description 196
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 claims description 149
- 239000012634 fragment Substances 0.000 claims description 149
- 108091007433 antigens Proteins 0.000 claims description 148
- 102000036639 antigens Human genes 0.000 claims description 148
- 239000000427 antigen Substances 0.000 claims description 142
- 150000001413 amino acids Chemical class 0.000 claims description 90
- 101000868279 Homo sapiens Leukocyte surface antigen CD47 Proteins 0.000 claims description 89
- 102100032913 Leukocyte surface antigen CD47 Human genes 0.000 claims description 77
- 102000008096 B7-H1 Antigen Human genes 0.000 claims description 61
- 108010074708 B7-H1 Antigen Proteins 0.000 claims description 61
- 238000000034 method Methods 0.000 claims description 29
- 238000012217 deletion Methods 0.000 claims description 25
- 230000037430 deletion Effects 0.000 claims description 25
- 238000007792 addition Methods 0.000 claims description 24
- 238000006467 substitution reaction Methods 0.000 claims description 24
- 239000002253 acid Substances 0.000 claims description 23
- 239000002773 nucleotide Substances 0.000 claims description 23
- 125000003729 nucleotide group Chemical group 0.000 claims description 23
- 239000013604 expression vector Substances 0.000 claims description 22
- 230000000694 effects Effects 0.000 claims description 19
- 108020004707 nucleic acids Proteins 0.000 claims description 15
- 102000039446 nucleic acids Human genes 0.000 claims description 15
- 150000007523 nucleic acids Chemical class 0.000 claims description 15
- 150000001412 amines Chemical class 0.000 claims description 13
- 208000005718 Stomach Neoplasms Diseases 0.000 claims description 11
- 206010017758 gastric cancer Diseases 0.000 claims description 11
- 201000011549 stomach cancer Diseases 0.000 claims description 11
- 239000003814 drug Substances 0.000 claims description 9
- 229940079593 drug Drugs 0.000 claims description 8
- 239000008194 pharmaceutical composition Substances 0.000 claims description 8
- 238000011282 treatment Methods 0.000 claims description 7
- 206010025323 Lymphomas Diseases 0.000 claims description 6
- 239000003937 drug carrier Substances 0.000 claims description 6
- 230000002401 inhibitory effect Effects 0.000 claims description 5
- 206010005003 Bladder cancer Diseases 0.000 claims description 4
- 206010006187 Breast cancer Diseases 0.000 claims description 4
- 208000026310 Breast neoplasm Diseases 0.000 claims description 4
- 208000000461 Esophageal Neoplasms Diseases 0.000 claims description 4
- 208000008839 Kidney Neoplasms Diseases 0.000 claims description 4
- 206010058467 Lung neoplasm malignant Diseases 0.000 claims description 4
- 206010030155 Oesophageal carcinoma Diseases 0.000 claims description 4
- 206010033128 Ovarian cancer Diseases 0.000 claims description 4
- 206010061535 Ovarian neoplasm Diseases 0.000 claims description 4
- 206010061902 Pancreatic neoplasm Diseases 0.000 claims description 4
- 206010038389 Renal cancer Diseases 0.000 claims description 4
- 208000007097 Urinary Bladder Neoplasms Diseases 0.000 claims description 4
- 201000004101 esophageal cancer Diseases 0.000 claims description 4
- 201000010982 kidney cancer Diseases 0.000 claims description 4
- 201000005202 lung cancer Diseases 0.000 claims description 4
- 208000020816 lung neoplasm Diseases 0.000 claims description 4
- 208000015486 malignant pancreatic neoplasm Diseases 0.000 claims description 4
- 201000001441 melanoma Diseases 0.000 claims description 4
- 201000002528 pancreatic cancer Diseases 0.000 claims description 4
- 208000008443 pancreatic carcinoma Diseases 0.000 claims description 4
- 201000005112 urinary bladder cancer Diseases 0.000 claims description 4
- 206010008342 Cervix carcinoma Diseases 0.000 claims description 3
- 201000003741 Gastrointestinal carcinoma Diseases 0.000 claims description 3
- 208000032612 Glial tumor Diseases 0.000 claims description 3
- 206010018338 Glioma Diseases 0.000 claims description 3
- 208000006105 Uterine Cervical Neoplasms Diseases 0.000 claims description 3
- 201000010881 cervical cancer Diseases 0.000 claims description 3
- 201000005787 hematologic cancer Diseases 0.000 claims description 3
- 208000024200 hematopoietic and lymphoid system neoplasm Diseases 0.000 claims description 3
- 201000002313 intestinal cancer Diseases 0.000 claims description 3
- 210000003527 eukaryotic cell Anatomy 0.000 claims description 2
- 210000004962 mammalian cell Anatomy 0.000 claims description 2
- 210000001236 prokaryotic cell Anatomy 0.000 claims description 2
- 230000001568 sexual effect Effects 0.000 claims 1
- 210000003743 erythrocyte Anatomy 0.000 abstract description 30
- 230000000259 anti-tumor effect Effects 0.000 abstract description 16
- 239000000203 mixture Substances 0.000 abstract description 13
- 230000001988 toxicity Effects 0.000 abstract description 2
- 231100000419 toxicity Toxicity 0.000 abstract description 2
- 235000001014 amino acid Nutrition 0.000 description 73
- 230000006870 function Effects 0.000 description 68
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 description 46
- 206010028980 Neoplasm Diseases 0.000 description 45
- 102100035360 Cerebellar degeneration-related antigen 1 Human genes 0.000 description 42
- 108090000765 processed proteins & peptides Proteins 0.000 description 35
- 230000000903 blocking effect Effects 0.000 description 32
- 238000002965 ELISA Methods 0.000 description 26
- 235000018102 proteins Nutrition 0.000 description 25
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 description 24
- 239000006228 supernatant Substances 0.000 description 23
- 239000013613 expression plasmid Substances 0.000 description 22
- 239000013641 positive control Substances 0.000 description 22
- 238000005406 washing Methods 0.000 description 22
- 241001529936 Murinae Species 0.000 description 21
- 239000002671 adjuvant Substances 0.000 description 21
- 210000004408 hybridoma Anatomy 0.000 description 21
- 102000004196 processed proteins & peptides Human genes 0.000 description 21
- 102100029948 Tyrosine-protein phosphatase non-receptor type substrate 1 Human genes 0.000 description 20
- 239000013612 plasmid Substances 0.000 description 20
- 229920001184 polypeptide Polymers 0.000 description 20
- 101000863873 Homo sapiens Tyrosine-protein phosphatase non-receptor type substrate 1 Proteins 0.000 description 19
- 241000699666 Mus <mouse, genus> Species 0.000 description 19
- 229960003852 atezolizumab Drugs 0.000 description 19
- 239000000243 solution Substances 0.000 description 17
- 230000008685 targeting Effects 0.000 description 16
- 241000699670 Mus sp. Species 0.000 description 15
- 238000002474 experimental method Methods 0.000 description 15
- 108010047041 Complementarity Determining Regions Proteins 0.000 description 14
- 102100040678 Programmed cell death protein 1 Human genes 0.000 description 13
- 238000012360 testing method Methods 0.000 description 13
- 101710089372 Programmed cell death protein 1 Proteins 0.000 description 12
- 238000010276 construction Methods 0.000 description 12
- 102000044459 human CD47 Human genes 0.000 description 12
- 239000006285 cell suspension Substances 0.000 description 11
- 238000010790 dilution Methods 0.000 description 11
- 239000012895 dilution Substances 0.000 description 11
- 230000014509 gene expression Effects 0.000 description 11
- 238000012163 sequencing technique Methods 0.000 description 11
- 238000004113 cell culture Methods 0.000 description 10
- 230000004927 fusion Effects 0.000 description 10
- 238000000746 purification Methods 0.000 description 10
- 101001117317 Homo sapiens Programmed cell death 1 ligand 1 Proteins 0.000 description 9
- HEMHJVSKTPXQMS-UHFFFAOYSA-M Sodium hydroxide Chemical compound [OH-].[Na+] HEMHJVSKTPXQMS-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 9
- 238000004458 analytical method Methods 0.000 description 9
- 238000001943 fluorescence-activated cell sorting Methods 0.000 description 9
- 102000048776 human CD274 Human genes 0.000 description 9
- 230000035772 mutation Effects 0.000 description 9
- 239000012091 fetal bovine serum Substances 0.000 description 8
- 239000002609 medium Substances 0.000 description 8
- 241000620209 Escherichia coli DH5[alpha] Species 0.000 description 7
- 108060003951 Immunoglobulin Proteins 0.000 description 7
- 108010021625 Immunoglobulin Fragments Proteins 0.000 description 7
- 102000008394 Immunoglobulin Fragments Human genes 0.000 description 7
- 229960002685 biotin Drugs 0.000 description 7
- 239000011616 biotin Substances 0.000 description 7
- 238000013461 design Methods 0.000 description 7
- 238000005516 engineering process Methods 0.000 description 7
- 108020001507 fusion proteins Proteins 0.000 description 7
- 102000037865 fusion proteins Human genes 0.000 description 7
- 102000018358 immunoglobulin Human genes 0.000 description 7
- 235000020183 skimmed milk Nutrition 0.000 description 7
- 102000006355 CD47 Antigen Human genes 0.000 description 6
- 108010058590 CD47 Antigen Proteins 0.000 description 6
- 238000001712 DNA sequencing Methods 0.000 description 6
- 241001465754 Metazoa Species 0.000 description 6
- 239000012980 RPMI-1640 medium Substances 0.000 description 6
- FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M Sodium chloride Chemical compound [Na+].[Cl-] FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 6
- 238000001042 affinity chromatography Methods 0.000 description 6
- 230000004520 agglutination Effects 0.000 description 6
- 239000003242 anti bacterial agent Substances 0.000 description 6
- 229940088710 antibiotic agent Drugs 0.000 description 6
- 230000015572 biosynthetic process Effects 0.000 description 6
- 230000007541 cellular toxicity Effects 0.000 description 6
- 238000004520 electroporation Methods 0.000 description 6
- 210000002540 macrophage Anatomy 0.000 description 6
- 210000004989 spleen cell Anatomy 0.000 description 6
- 238000002054 transplantation Methods 0.000 description 6
- 210000004881 tumor cell Anatomy 0.000 description 6
- 108010019670 Chimeric Antigen Receptors Proteins 0.000 description 5
- 101000914484 Homo sapiens T-lymphocyte activation antigen CD80 Proteins 0.000 description 5
- 241000282567 Macaca fascicularis Species 0.000 description 5
- 108091034117 Oligonucleotide Proteins 0.000 description 5
- 102100027222 T-lymphocyte activation antigen CD80 Human genes 0.000 description 5
- 230000000295 complement effect Effects 0.000 description 5
- 238000001514 detection method Methods 0.000 description 5
- 238000010586 diagram Methods 0.000 description 5
- 210000004602 germ cell Anatomy 0.000 description 5
- 230000014759 maintenance of location Effects 0.000 description 5
- 210000001519 tissue Anatomy 0.000 description 5
- YBJHBAHKTGYVGT-ZKWXMUAHSA-N (+)-Biotin Chemical compound N1C(=O)N[C@@H]2[C@H](CCCCC(=O)O)SC[C@@H]21 YBJHBAHKTGYVGT-ZKWXMUAHSA-N 0.000 description 4
- 229920001817 Agar Polymers 0.000 description 4
- 108020004705 Codon Proteins 0.000 description 4
- LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N Ethanol Chemical compound CCO LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 239000012739 FreeStyle 293 Expression medium Substances 0.000 description 4
- DHMQDGOQFOQNFH-UHFFFAOYSA-N Glycine Chemical compound NCC(O)=O DHMQDGOQFOQNFH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 102000006496 Immunoglobulin Heavy Chains Human genes 0.000 description 4
- 108010019476 Immunoglobulin Heavy Chains Proteins 0.000 description 4
- 239000008272 agar Substances 0.000 description 4
- 238000010367 cloning Methods 0.000 description 4
- 239000002299 complementary DNA Substances 0.000 description 4
- 238000006471 dimerization reaction Methods 0.000 description 4
- 201000010099 disease Diseases 0.000 description 4
- 208000037265 diseases, disorders, signs and symptoms Diseases 0.000 description 4
- 238000000605 extraction Methods 0.000 description 4
- 238000002744 homologous recombination Methods 0.000 description 4
- 230000006801 homologous recombination Effects 0.000 description 4
- 230000003053 immunization Effects 0.000 description 4
- 230000003993 interaction Effects 0.000 description 4
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 description 4
- 238000005457 optimization Methods 0.000 description 4
- 239000000047 product Substances 0.000 description 4
- 238000012216 screening Methods 0.000 description 4
- 238000003786 synthesis reaction Methods 0.000 description 4
- NHBKXEKEPDILRR-UHFFFAOYSA-N 2,3-bis(butanoylsulfanyl)propyl butanoate Chemical compound CCCC(=O)OCC(SC(=O)CCC)CSC(=O)CCC NHBKXEKEPDILRR-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- QTBSBXVTEAMEQO-UHFFFAOYSA-N Acetic acid Chemical compound CC(O)=O QTBSBXVTEAMEQO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 108010075254 C-Peptide Proteins 0.000 description 3
- 241000282693 Cercopithecidae Species 0.000 description 3
- 241000588724 Escherichia coli Species 0.000 description 3
- 108010067060 Immunoglobulin Variable Region Proteins 0.000 description 3
- 102000017727 Immunoglobulin Variable Region Human genes 0.000 description 3
- AYFVYJQAPQTCCC-GBXIJSLDSA-N L-threonine Chemical compound C[C@@H](O)[C@H](N)C(O)=O AYFVYJQAPQTCCC-GBXIJSLDSA-N 0.000 description 3
- 241000283973 Oryctolagus cuniculus Species 0.000 description 3
- 206010049190 Red blood cell agglutination Diseases 0.000 description 3
- 101150036449 SIRPA gene Proteins 0.000 description 3
- 210000001744 T-lymphocyte Anatomy 0.000 description 3
- 229940037003 alum Drugs 0.000 description 3
- 125000003277 amino group Chemical group 0.000 description 3
- 210000004369 blood Anatomy 0.000 description 3
- 239000008280 blood Substances 0.000 description 3
- 238000004587 chromatography analysis Methods 0.000 description 3
- 238000004140 cleaning Methods 0.000 description 3
- 235000018417 cysteine Nutrition 0.000 description 3
- 230000007423 decrease Effects 0.000 description 3
- 230000001900 immune effect Effects 0.000 description 3
- 210000000987 immune system Anatomy 0.000 description 3
- 230000036039 immunity Effects 0.000 description 3
- 230000002998 immunogenetic effect Effects 0.000 description 3
- 230000005847 immunogenicity Effects 0.000 description 3
- 238000001802 infusion Methods 0.000 description 3
- 238000001990 intravenous administration Methods 0.000 description 3
- 230000007246 mechanism Effects 0.000 description 3
- 230000004048 modification Effects 0.000 description 3
- 238000012986 modification Methods 0.000 description 3
- 229940126619 mouse monoclonal antibody Drugs 0.000 description 3
- 230000000242 pagocytic effect Effects 0.000 description 3
- 238000002823 phage display Methods 0.000 description 3
- 230000035755 proliferation Effects 0.000 description 3
- 230000002829 reductive effect Effects 0.000 description 3
- 238000011160 research Methods 0.000 description 3
- 230000019491 signal transduction Effects 0.000 description 3
- 239000011780 sodium chloride Substances 0.000 description 3
- 238000007920 subcutaneous administration Methods 0.000 description 3
- 238000001890 transfection Methods 0.000 description 3
- 230000009261 transgenic effect Effects 0.000 description 3
- 239000013598 vector Substances 0.000 description 3
- 108091032973 (ribonucleotides)n+m Proteins 0.000 description 2
- GANZODCWZFAEGN-UHFFFAOYSA-N 5-mercapto-2-nitro-benzoic acid Chemical compound OC(=O)C1=CC(S)=CC=C1[N+]([O-])=O GANZODCWZFAEGN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 206010067484 Adverse reaction Diseases 0.000 description 2
- 108091003079 Bovine Serum Albumin Proteins 0.000 description 2
- 210000003771 C cell Anatomy 0.000 description 2
- 108020004414 DNA Proteins 0.000 description 2
- 108090000790 Enzymes Proteins 0.000 description 2
- 102000004190 Enzymes Human genes 0.000 description 2
- 101000998953 Homo sapiens Immunoglobulin heavy variable 1-2 Proteins 0.000 description 2
- 101000604674 Homo sapiens Immunoglobulin kappa variable 4-1 Proteins 0.000 description 2
- 101000611936 Homo sapiens Programmed cell death protein 1 Proteins 0.000 description 2
- 102000013463 Immunoglobulin Light Chains Human genes 0.000 description 2
- 108010065825 Immunoglobulin Light Chains Proteins 0.000 description 2
- 102100036887 Immunoglobulin heavy variable 1-2 Human genes 0.000 description 2
- 102100038198 Immunoglobulin kappa variable 4-1 Human genes 0.000 description 2
- ROHFNLRQFUQHCH-YFKPBYRVSA-N L-leucine Chemical compound CC(C)C[C@H](N)C(O)=O ROHFNLRQFUQHCH-YFKPBYRVSA-N 0.000 description 2
- OUYCCCASQSFEME-QMMMGPOBSA-N L-tyrosine Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CC1=CC=C(O)C=C1 OUYCCCASQSFEME-QMMMGPOBSA-N 0.000 description 2
- ROHFNLRQFUQHCH-UHFFFAOYSA-N Leucine Natural products CC(C)CC(N)C(O)=O ROHFNLRQFUQHCH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 238000011789 NOD SCID mouse Methods 0.000 description 2
- 238000012408 PCR amplification Methods 0.000 description 2
- 229930182555 Penicillin Natural products 0.000 description 2
- JGSARLDLIJGVTE-MBNYWOFBSA-N Penicillin G Chemical compound N([C@H]1[C@H]2SC([C@@H](N2C1=O)C(O)=O)(C)C)C(=O)CC1=CC=CC=C1 JGSARLDLIJGVTE-MBNYWOFBSA-N 0.000 description 2
- 102100024216 Programmed cell death 1 ligand 1 Human genes 0.000 description 2
- 101710094000 Programmed cell death 1 ligand 1 Proteins 0.000 description 2
- 241000700159 Rattus Species 0.000 description 2
- 108020004511 Recombinant DNA Proteins 0.000 description 2
- 101710120037 Toxin CcdB Proteins 0.000 description 2
- 241000711955 Turkey rhinotracheitis virus Species 0.000 description 2
- 238000009825 accumulation Methods 0.000 description 2
- 230000006978 adaptation Effects 0.000 description 2
- 230000006838 adverse reaction Effects 0.000 description 2
- 125000000539 amino acid group Chemical group 0.000 description 2
- 230000006907 apoptotic process Effects 0.000 description 2
- 238000013459 approach Methods 0.000 description 2
- 238000003556 assay Methods 0.000 description 2
- 230000001580 bacterial effect Effects 0.000 description 2
- 238000013357 binding ELISA Methods 0.000 description 2
- 235000020958 biotin Nutrition 0.000 description 2
- 210000001772 blood platelet Anatomy 0.000 description 2
- 238000010805 cDNA synthesis kit Methods 0.000 description 2
- 238000004364 calculation method Methods 0.000 description 2
- 238000004132 cross linking Methods 0.000 description 2
- 238000012258 culturing Methods 0.000 description 2
- XUJNEKJLAYXESH-UHFFFAOYSA-N cysteine Natural products SCC(N)C(O)=O XUJNEKJLAYXESH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 239000002254 cytotoxic agent Substances 0.000 description 2
- 229940127089 cytotoxic agent Drugs 0.000 description 2
- 231100000599 cytotoxic agent Toxicity 0.000 description 2
- 230000003247 decreasing effect Effects 0.000 description 2
- 239000003085 diluting agent Substances 0.000 description 2
- 238000003113 dilution method Methods 0.000 description 2
- 150000004662 dithiols Chemical class 0.000 description 2
- 230000009977 dual effect Effects 0.000 description 2
- 238000010828 elution Methods 0.000 description 2
- 238000013401 experimental design Methods 0.000 description 2
- MHMNJMPURVTYEJ-UHFFFAOYSA-N fluorescein-5-isothiocyanate Chemical compound O1C(=O)C2=CC(N=C=S)=CC=C2C21C1=CC=C(O)C=C1OC1=CC(O)=CC=C21 MHMNJMPURVTYEJ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 230000009036 growth inhibition Effects 0.000 description 2
- 239000001963 growth medium Substances 0.000 description 2
- 231100000226 haematotoxicity Toxicity 0.000 description 2
- 210000005260 human cell Anatomy 0.000 description 2
- 238000000338 in vitro Methods 0.000 description 2
- 239000007927 intramuscular injection Substances 0.000 description 2
- 238000010255 intramuscular injection Methods 0.000 description 2
- 238000007912 intraperitoneal administration Methods 0.000 description 2
- 239000007928 intraperitoneal injection Substances 0.000 description 2
- 238000011005 laboratory method Methods 0.000 description 2
- 239000003446 ligand Substances 0.000 description 2
- 230000000670 limiting effect Effects 0.000 description 2
- 239000007788 liquid Substances 0.000 description 2
- 238000004895 liquid chromatography mass spectrometry Methods 0.000 description 2
- 210000001165 lymph node Anatomy 0.000 description 2
- 239000000463 material Substances 0.000 description 2
- 238000002156 mixing Methods 0.000 description 2
- 239000012452 mother liquor Substances 0.000 description 2
- 239000013642 negative control Substances 0.000 description 2
- 239000008188 pellet Substances 0.000 description 2
- 229940049954 penicillin Drugs 0.000 description 2
- 239000000546 pharmaceutical excipient Substances 0.000 description 2
- 239000000825 pharmaceutical preparation Substances 0.000 description 2
- 238000013094 purity test Methods 0.000 description 2
- 238000005215 recombination Methods 0.000 description 2
- 239000013558 reference substance Substances 0.000 description 2
- 230000003252 repetitive effect Effects 0.000 description 2
- 238000010839 reverse transcription Methods 0.000 description 2
- 238000000926 separation method Methods 0.000 description 2
- 238000003998 size exclusion chromatography high performance liquid chromatography Methods 0.000 description 2
- DAEPDZWVDSPTHF-UHFFFAOYSA-M sodium pyruvate Chemical compound [Na+].CC(=O)C([O-])=O DAEPDZWVDSPTHF-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 2
- 210000000952 spleen Anatomy 0.000 description 2
- 230000006641 stabilisation Effects 0.000 description 2
- 238000011105 stabilization Methods 0.000 description 2
- UCSJYZPVAKXKNQ-HZYVHMACSA-N streptomycin Chemical compound CN[C@H]1[C@H](O)[C@@H](O)[C@H](CO)O[C@H]1O[C@@H]1[C@](C=O)(O)[C@H](C)O[C@H]1O[C@@H]1[C@@H](NC(N)=N)[C@H](O)[C@@H](NC(N)=N)[C@H](O)[C@H]1O UCSJYZPVAKXKNQ-HZYVHMACSA-N 0.000 description 2
- 239000000126 substance Substances 0.000 description 2
- 230000009466 transformation Effects 0.000 description 2
- 102000035160 transmembrane proteins Human genes 0.000 description 2
- 108091005703 transmembrane proteins Proteins 0.000 description 2
- 230000004614 tumor growth Effects 0.000 description 2
- OUYCCCASQSFEME-UHFFFAOYSA-N tyrosine Natural products OC(=O)C(N)CC1=CC=C(O)C=C1 OUYCCCASQSFEME-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 229910021642 ultra pure water Inorganic materials 0.000 description 2
- 238000000108 ultra-filtration Methods 0.000 description 2
- 239000012498 ultrapure water Substances 0.000 description 2
- MTCFGRXMJLQNBG-REOHCLBHSA-N (2S)-2-Amino-3-hydroxypropansäure Chemical compound OC[C@H](N)C(O)=O MTCFGRXMJLQNBG-REOHCLBHSA-N 0.000 description 1
- NFGXHKASABOEEW-UHFFFAOYSA-N 1-methylethyl 11-methoxy-3,7,11-trimethyl-2,4-dodecadienoate Chemical compound COC(C)(C)CCCC(C)CC=CC(C)=CC(=O)OC(C)C NFGXHKASABOEEW-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- QKNYBSVHEMOAJP-UHFFFAOYSA-N 2-amino-2-(hydroxymethyl)propane-1,3-diol;hydron;chloride Chemical compound Cl.OCC(N)(CO)CO QKNYBSVHEMOAJP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- UAIUNKRWKOVEES-UHFFFAOYSA-N 3,3',5,5'-tetramethylbenzidine Chemical compound CC1=C(N)C(C)=CC(C=2C=C(C)C(N)=C(C)C=2)=C1 UAIUNKRWKOVEES-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 208000024893 Acute lymphoblastic leukemia Diseases 0.000 description 1
- 208000014697 Acute lymphocytic leukaemia Diseases 0.000 description 1
- 241000024188 Andala Species 0.000 description 1
- 208000023275 Autoimmune disease Diseases 0.000 description 1
- 108090001008 Avidin Proteins 0.000 description 1
- 241000894006 Bacteria Species 0.000 description 1
- 210000001266 CD8-positive T-lymphocyte Anatomy 0.000 description 1
- 206010009944 Colon cancer Diseases 0.000 description 1
- 102000004127 Cytokines Human genes 0.000 description 1
- 108090000695 Cytokines Proteins 0.000 description 1
- 206010059866 Drug resistance Diseases 0.000 description 1
- KCXVZYZYPLLWCC-UHFFFAOYSA-N EDTA Chemical compound OC(=O)CN(CC(O)=O)CCN(CC(O)=O)CC(O)=O KCXVZYZYPLLWCC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 241000196324 Embryophyta Species 0.000 description 1
- 206010014733 Endometrial cancer Diseases 0.000 description 1
- 206010014759 Endometrial neoplasm Diseases 0.000 description 1
- 206010017993 Gastrointestinal neoplasms Diseases 0.000 description 1
- WQZGKKKJIJFFOK-GASJEMHNSA-N Glucose Natural products OC[C@H]1OC(O)[C@H](O)[C@@H](O)[C@@H]1O WQZGKKKJIJFFOK-GASJEMHNSA-N 0.000 description 1
- 239000004471 Glycine Substances 0.000 description 1
- 101000834898 Homo sapiens Alpha-synuclein Proteins 0.000 description 1
- 101000971171 Homo sapiens Apoptosis regulator Bcl-2 Proteins 0.000 description 1
- 101000998952 Homo sapiens Immunoglobulin heavy variable 1-3 Proteins 0.000 description 1
- 101000998947 Homo sapiens Immunoglobulin heavy variable 1-46 Proteins 0.000 description 1
- 101000998951 Homo sapiens Immunoglobulin heavy variable 1-8 Proteins 0.000 description 1
- 101001037141 Homo sapiens Immunoglobulin heavy variable 3-21 Proteins 0.000 description 1
- 101000839684 Homo sapiens Immunoglobulin heavy variable 4-31 Proteins 0.000 description 1
- 101001138133 Homo sapiens Immunoglobulin kappa variable 1-5 Proteins 0.000 description 1
- 101001047617 Homo sapiens Immunoglobulin kappa variable 3-11 Proteins 0.000 description 1
- 101001005365 Homo sapiens Immunoglobulin lambda variable 3-21 Proteins 0.000 description 1
- 101001005329 Homo sapiens Immunoglobulin lambda variable 3-9 Proteins 0.000 description 1
- 101001005332 Homo sapiens Immunoglobulin lambda variable 4-69 Proteins 0.000 description 1
- 101000652359 Homo sapiens Spermatogenesis-associated protein 2 Proteins 0.000 description 1
- 102000003839 Human Proteins Human genes 0.000 description 1
- 108090000144 Human Proteins Proteins 0.000 description 1
- -1 IgM Proteins 0.000 description 1
- 229940123776 Immuno-oncology therapy Drugs 0.000 description 1
- 102000009786 Immunoglobulin Constant Regions Human genes 0.000 description 1
- 108010009817 Immunoglobulin Constant Regions Proteins 0.000 description 1
- 108010054477 Immunoglobulin Fab Fragments Proteins 0.000 description 1
- 102000001706 Immunoglobulin Fab Fragments Human genes 0.000 description 1
- 102100036886 Immunoglobulin heavy variable 1-3 Human genes 0.000 description 1
- 102100036888 Immunoglobulin heavy variable 1-46 Human genes 0.000 description 1
- 102100040217 Immunoglobulin heavy variable 3-21 Human genes 0.000 description 1
- 102100028310 Immunoglobulin heavy variable 4-31 Human genes 0.000 description 1
- 102100020769 Immunoglobulin kappa variable 1-5 Human genes 0.000 description 1
- 102100025934 Immunoglobulin lambda variable 3-21 Human genes 0.000 description 1
- 102100025864 Immunoglobulin lambda variable 3-9 Human genes 0.000 description 1
- 102100025863 Immunoglobulin lambda variable 4-69 Human genes 0.000 description 1
- 206010062016 Immunosuppression Diseases 0.000 description 1
- QNAYBMKLOCPYGJ-REOHCLBHSA-N L-alanine Chemical compound C[C@H](N)C(O)=O QNAYBMKLOCPYGJ-REOHCLBHSA-N 0.000 description 1
- DCXYFEDJOCDNAF-REOHCLBHSA-N L-asparagine Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CC(N)=O DCXYFEDJOCDNAF-REOHCLBHSA-N 0.000 description 1
- FBOZXECLQNJBKD-ZDUSSCGKSA-N L-methotrexate Chemical compound C=1N=C2N=C(N)N=C(N)C2=NC=1CN(C)C1=CC=C(C(=O)N[C@@H](CCC(O)=O)C(O)=O)C=C1 FBOZXECLQNJBKD-ZDUSSCGKSA-N 0.000 description 1
- QIVBCDIJIAJPQS-VIFPVBQESA-N L-tryptophane Chemical compound C1=CC=C2C(C[C@H](N)C(O)=O)=CNC2=C1 QIVBCDIJIAJPQS-VIFPVBQESA-N 0.000 description 1
- 239000012515 MabSelect SuRe Substances 0.000 description 1
- 108010023356 Nonmuscle Myosin Type IIA Proteins 0.000 description 1
- 108091028043 Nucleic acid sequence Proteins 0.000 description 1
- 239000012271 PD-L1 inhibitor Substances 0.000 description 1
- 229930040373 Paraformaldehyde Natural products 0.000 description 1
- 229920001213 Polysorbate 20 Polymers 0.000 description 1
- 208000006664 Precursor Cell Lymphoblastic Leukemia-Lymphoma Diseases 0.000 description 1
- 206010060862 Prostate cancer Diseases 0.000 description 1
- 208000000236 Prostatic Neoplasms Diseases 0.000 description 1
- 208000015634 Rectal Neoplasms Diseases 0.000 description 1
- 208000006265 Renal cell carcinoma Diseases 0.000 description 1
- 108010039491 Ricin Proteins 0.000 description 1
- 108010084592 Saporins Proteins 0.000 description 1
- MTCFGRXMJLQNBG-UHFFFAOYSA-N Serine Natural products OCC(N)C(O)=O MTCFGRXMJLQNBG-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 206010041067 Small cell lung cancer Diseases 0.000 description 1
- 108010090804 Streptavidin Proteins 0.000 description 1
- 208000007271 Substance Withdrawal Syndrome Diseases 0.000 description 1
- 230000006044 T cell activation Effects 0.000 description 1
- AYFVYJQAPQTCCC-UHFFFAOYSA-N Threonine Natural products CC(O)C(N)C(O)=O AYFVYJQAPQTCCC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000004473 Threonine Substances 0.000 description 1
- 208000024770 Thyroid neoplasm Diseases 0.000 description 1
- 102100023935 Transmembrane glycoprotein NMB Human genes 0.000 description 1
- 102000004142 Trypsin Human genes 0.000 description 1
- 108090000631 Trypsin Proteins 0.000 description 1
- QIVBCDIJIAJPQS-UHFFFAOYSA-N Tryptophan Natural products C1=CC=C2C(CC(N)C(O)=O)=CNC2=C1 QIVBCDIJIAJPQS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 102100033019 Tyrosine-protein phosphatase non-receptor type 11 Human genes 0.000 description 1
- 101710116241 Tyrosine-protein phosphatase non-receptor type 11 Proteins 0.000 description 1
- 102100021657 Tyrosine-protein phosphatase non-receptor type 6 Human genes 0.000 description 1
- 101710128901 Tyrosine-protein phosphatase non-receptor type 6 Proteins 0.000 description 1
- 206010046431 Urethral cancer Diseases 0.000 description 1
- 206010046458 Urethral neoplasms Diseases 0.000 description 1
- 229940122803 Vinca alkaloid Drugs 0.000 description 1
- 230000005856 abnormality Effects 0.000 description 1
- 238000002835 absorbance Methods 0.000 description 1
- 238000010521 absorption reaction Methods 0.000 description 1
- 231100000215 acute (single dose) toxicity testing Toxicity 0.000 description 1
- 238000011047 acute toxicity test Methods 0.000 description 1
- 235000004279 alanine Nutrition 0.000 description 1
- 238000011316 allogeneic transplantation Methods 0.000 description 1
- 208000007502 anemia Diseases 0.000 description 1
- 229940125644 antibody drug Drugs 0.000 description 1
- 239000002246 antineoplastic agent Substances 0.000 description 1
- 229940041181 antineoplastic drug Drugs 0.000 description 1
- 239000003963 antioxidant agent Substances 0.000 description 1
- 239000007864 aqueous solution Substances 0.000 description 1
- 210000003050 axon Anatomy 0.000 description 1
- 230000001588 bifunctional effect Effects 0.000 description 1
- 230000004071 biological effect Effects 0.000 description 1
- 230000033228 biological regulation Effects 0.000 description 1
- 230000006287 biotinylation Effects 0.000 description 1
- 238000007413 biotinylation Methods 0.000 description 1
- 238000004820 blood count Methods 0.000 description 1
- 238000004422 calculation algorithm Methods 0.000 description 1
- 201000011510 cancer Diseases 0.000 description 1
- 230000007681 cardiovascular toxicity Effects 0.000 description 1
- 230000015556 catabolic process Effects 0.000 description 1
- 230000003915 cell function Effects 0.000 description 1
- 230000007910 cell fusion Effects 0.000 description 1
- 230000006037 cell lysis Effects 0.000 description 1
- 230000012292 cell migration Effects 0.000 description 1
- 230000003833 cell viability Effects 0.000 description 1
- 230000008859 change Effects 0.000 description 1
- 239000002738 chelating agent Substances 0.000 description 1
- 238000012412 chemical coupling Methods 0.000 description 1
- 239000007795 chemical reaction product Substances 0.000 description 1
- 239000003153 chemical reaction reagent Substances 0.000 description 1
- 230000004186 co-expression Effects 0.000 description 1
- 230000015271 coagulation Effects 0.000 description 1
- 238000005345 coagulation Methods 0.000 description 1
- 208000029742 colonic neoplasm Diseases 0.000 description 1
- 230000001447 compensatory effect Effects 0.000 description 1
- 239000008139 complexing agent Substances 0.000 description 1
- 239000003431 cross linking reagent Substances 0.000 description 1
- 239000012228 culture supernatant Substances 0.000 description 1
- 238000005520 cutting process Methods 0.000 description 1
- UFULAYFCSOUIOV-UHFFFAOYSA-N cysteamine Chemical compound NCCS UFULAYFCSOUIOV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 150000001945 cysteines Chemical class 0.000 description 1
- 238000007405 data analysis Methods 0.000 description 1
- 230000034994 death Effects 0.000 description 1
- 238000006731 degradation reaction Methods 0.000 description 1
- 210000004443 dendritic cell Anatomy 0.000 description 1
- 238000011033 desalting Methods 0.000 description 1
- 238000011161 development Methods 0.000 description 1
- 230000004069 differentiation Effects 0.000 description 1
- 230000029087 digestion Effects 0.000 description 1
- 238000007865 diluting Methods 0.000 description 1
- 239000000539 dimer Substances 0.000 description 1
- 239000003480 eluent Substances 0.000 description 1
- 238000006911 enzymatic reaction Methods 0.000 description 1
- 210000000981 epithelium Anatomy 0.000 description 1
- 238000011067 equilibration Methods 0.000 description 1
- 238000011156 evaluation Methods 0.000 description 1
- 230000017188 evasion or tolerance of host immune response Effects 0.000 description 1
- 210000003191 femoral vein Anatomy 0.000 description 1
- 238000000684 flow cytometry Methods 0.000 description 1
- 230000037406 food intake Effects 0.000 description 1
- 235000012631 food intake Nutrition 0.000 description 1
- 238000009472 formulation Methods 0.000 description 1
- 238000001502 gel electrophoresis Methods 0.000 description 1
- 238000010353 genetic engineering Methods 0.000 description 1
- 239000008103 glucose Substances 0.000 description 1
- ZDXPYRJPNDTMRX-UHFFFAOYSA-N glutamine Natural products OC(=O)C(N)CCC(N)=O ZDXPYRJPNDTMRX-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 238000000227 grinding Methods 0.000 description 1
- 230000012010 growth Effects 0.000 description 1
- 230000035931 haemagglutination Effects 0.000 description 1
- 201000010536 head and neck cancer Diseases 0.000 description 1
- 208000014829 head and neck neoplasm Diseases 0.000 description 1
- 230000036541 health Effects 0.000 description 1
- 238000005534 hematocrit Methods 0.000 description 1
- 210000003958 hematopoietic stem cell Anatomy 0.000 description 1
- 208000006454 hepatitis Diseases 0.000 description 1
- 231100000283 hepatitis Toxicity 0.000 description 1
- 239000000833 heterodimer Substances 0.000 description 1
- 239000000710 homodimer Substances 0.000 description 1
- 102000048362 human PDCD1 Human genes 0.000 description 1
- 238000009396 hybridization Methods 0.000 description 1
- 229920001477 hydrophilic polymer Polymers 0.000 description 1
- 108091008915 immune receptors Proteins 0.000 description 1
- 102000027596 immune receptors Human genes 0.000 description 1
- 230000028993 immune response Effects 0.000 description 1
- 230000006058 immune tolerance Effects 0.000 description 1
- 238000002649 immunization Methods 0.000 description 1
- 230000016784 immunoglobulin production Effects 0.000 description 1
- 230000001506 immunosuppresive effect Effects 0.000 description 1
- 238000001727 in vivo Methods 0.000 description 1
- 230000005764 inhibitory process Effects 0.000 description 1
- 230000000977 initiatory effect Effects 0.000 description 1
- 239000007924 injection Substances 0.000 description 1
- 238000002347 injection Methods 0.000 description 1
- 230000015788 innate immune response Effects 0.000 description 1
- 238000011081 inoculation Methods 0.000 description 1
- 102000006495 integrins Human genes 0.000 description 1
- 108010044426 integrins Proteins 0.000 description 1
- 238000007918 intramuscular administration Methods 0.000 description 1
- 150000002500 ions Chemical class 0.000 description 1
- 230000001788 irregular Effects 0.000 description 1
- 238000002372 labelling Methods 0.000 description 1
- 208000032839 leukemia Diseases 0.000 description 1
- 238000001638 lipofection Methods 0.000 description 1
- 239000002502 liposome Substances 0.000 description 1
- 201000007270 liver cancer Diseases 0.000 description 1
- 208000014018 liver neoplasm Diseases 0.000 description 1
- 238000011068 loading method Methods 0.000 description 1
- 239000012516 mab select resin Substances 0.000 description 1
- 108010082117 matrigel Proteins 0.000 description 1
- 230000001404 mediated effect Effects 0.000 description 1
- 210000004379 membrane Anatomy 0.000 description 1
- 239000012528 membrane Substances 0.000 description 1
- 229960003151 mercaptamine Drugs 0.000 description 1
- 206010061289 metastatic neoplasm Diseases 0.000 description 1
- 229960000485 methotrexate Drugs 0.000 description 1
- 235000013336 milk Nutrition 0.000 description 1
- 239000008267 milk Substances 0.000 description 1
- 210000004080 milk Anatomy 0.000 description 1
- 239000011259 mixed solution Substances 0.000 description 1
- 239000000178 monomer Substances 0.000 description 1
- 238000010172 mouse model Methods 0.000 description 1
- 210000002200 mouth mucosa Anatomy 0.000 description 1
- 210000004877 mucosa Anatomy 0.000 description 1
- 230000007935 neutral effect Effects 0.000 description 1
- 208000002154 non-small cell lung carcinoma Diseases 0.000 description 1
- 238000002515 oligonucleotide synthesis Methods 0.000 description 1
- 238000011017 operating method Methods 0.000 description 1
- 238000012856 packing Methods 0.000 description 1
- 229920002866 paraformaldehyde Polymers 0.000 description 1
- 238000007911 parenteral administration Methods 0.000 description 1
- 239000002245 particle Substances 0.000 description 1
- 229940121656 pd-l1 inhibitor Drugs 0.000 description 1
- 210000001539 phagocyte Anatomy 0.000 description 1
- 230000026731 phosphorylation Effects 0.000 description 1
- 238000006366 phosphorylation reaction Methods 0.000 description 1
- 239000002504 physiological saline solution Substances 0.000 description 1
- 238000006116 polymerization reaction Methods 0.000 description 1
- 108091033319 polynucleotide Proteins 0.000 description 1
- 102000040430 polynucleotide Human genes 0.000 description 1
- 239000002157 polynucleotide Substances 0.000 description 1
- 239000000256 polyoxyethylene sorbitan monolaurate Substances 0.000 description 1
- 235000010486 polyoxyethylene sorbitan monolaurate Nutrition 0.000 description 1
- 230000035935 pregnancy Effects 0.000 description 1
- 230000002265 prevention Effects 0.000 description 1
- 125000002924 primary amino group Chemical group [H]N([H])* 0.000 description 1
- 230000008569 process Effects 0.000 description 1
- 230000001737 promoting effect Effects 0.000 description 1
- 230000018883 protein targeting Effects 0.000 description 1
- 230000006337 proteolytic cleavage Effects 0.000 description 1
- 239000008213 purified water Substances 0.000 description 1
- 239000002994 raw material Substances 0.000 description 1
- 238000013102 re-test Methods 0.000 description 1
- 238000003259 recombinant expression Methods 0.000 description 1
- 230000006798 recombination Effects 0.000 description 1
- 206010038038 rectal cancer Diseases 0.000 description 1
- 210000000664 rectum Anatomy 0.000 description 1
- 201000001275 rectum cancer Diseases 0.000 description 1
- 230000009467 reduction Effects 0.000 description 1
- 230000002441 reversible effect Effects 0.000 description 1
- 238000005070 sampling Methods 0.000 description 1
- 230000003248 secreting effect Effects 0.000 description 1
- 238000012772 sequence design Methods 0.000 description 1
- 238000013207 serial dilution Methods 0.000 description 1
- 239000012679 serum free medium Substances 0.000 description 1
- 238000002741 site-directed mutagenesis Methods 0.000 description 1
- 208000000587 small cell lung carcinoma Diseases 0.000 description 1
- PTLRDCMBXHILCL-UHFFFAOYSA-M sodium arsenite Chemical compound [Na+].[O-][As]=O PTLRDCMBXHILCL-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 1
- 238000002415 sodium dodecyl sulfate polyacrylamide gel electrophoresis Methods 0.000 description 1
- 229940054269 sodium pyruvate Drugs 0.000 description 1
- 125000006850 spacer group Chemical group 0.000 description 1
- 230000009870 specific binding Effects 0.000 description 1
- 238000010561 standard procedure Methods 0.000 description 1
- 229960005322 streptomycin Drugs 0.000 description 1
- 239000007929 subcutaneous injection Substances 0.000 description 1
- 238000010254 subcutaneous injection Methods 0.000 description 1
- 235000000346 sugar Nutrition 0.000 description 1
- 150000005846 sugar alcohols Chemical class 0.000 description 1
- 150000008163 sugars Chemical class 0.000 description 1
- 239000004094 surface-active agent Substances 0.000 description 1
- 210000000225 synapse Anatomy 0.000 description 1
- 230000009885 systemic effect Effects 0.000 description 1
- 238000002626 targeted therapy Methods 0.000 description 1
- 201000002510 thyroid cancer Diseases 0.000 description 1
- 231100000820 toxicity test Toxicity 0.000 description 1
- 239000003053 toxin Substances 0.000 description 1
- 231100000765 toxin Toxicity 0.000 description 1
- 108700012359 toxins Proteins 0.000 description 1
- 230000010474 transient expression Effects 0.000 description 1
- 108091007466 transmembrane glycoproteins Proteins 0.000 description 1
- 239000012588 trypsin Substances 0.000 description 1
- 208000029729 tumor suppressor gene on chromosome 11 Diseases 0.000 description 1
- 230000002100 tumorsuppressive effect Effects 0.000 description 1
- 230000003827 upregulation Effects 0.000 description 1
- 238000011144 upstream manufacturing Methods 0.000 description 1
- 239000003981 vehicle Substances 0.000 description 1
- 239000007762 w/o emulsion Substances 0.000 description 1
- XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N water Chemical compound O XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 238000005303 weighing Methods 0.000 description 1
- 238000001262 western blot Methods 0.000 description 1
Images
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
- C07K16/18—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans
- C07K16/28—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants
- C07K16/2803—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants against the immunoglobulin superfamily
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P35/00—Antineoplastic agents
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
- C07K16/18—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans
- C07K16/28—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants
- C07K16/2803—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants against the immunoglobulin superfamily
- C07K16/2827—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants against the immunoglobulin superfamily against B7 molecules, e.g. CD80, CD86
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
- C07K16/46—Hybrid immunoglobulins
- C07K16/468—Immunoglobulins having two or more different antigen binding sites, e.g. multifunctional antibodies
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
- A61K2039/505—Medicinal preparations containing antigens or antibodies comprising antibodies
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
- C07K2317/20—Immunoglobulins specific features characterized by taxonomic origin
- C07K2317/24—Immunoglobulins specific features characterized by taxonomic origin containing regions, domains or residues from different species, e.g. chimeric, humanized or veneered
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
- C07K2317/30—Immunoglobulins specific features characterized by aspects of specificity or valency
- C07K2317/31—Immunoglobulins specific features characterized by aspects of specificity or valency multispecific
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
- C07K2317/30—Immunoglobulins specific features characterized by aspects of specificity or valency
- C07K2317/33—Crossreactivity, e.g. for species or epitope, or lack of said crossreactivity
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
- C07K2317/50—Immunoglobulins specific features characterized by immunoglobulin fragments
- C07K2317/55—Fab or Fab'
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
- C07K2317/50—Immunoglobulins specific features characterized by immunoglobulin fragments
- C07K2317/56—Immunoglobulins specific features characterized by immunoglobulin fragments variable (Fv) region, i.e. VH and/or VL
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
- C07K2317/50—Immunoglobulins specific features characterized by immunoglobulin fragments
- C07K2317/56—Immunoglobulins specific features characterized by immunoglobulin fragments variable (Fv) region, i.e. VH and/or VL
- C07K2317/565—Complementarity determining region [CDR]
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
- C07K2317/60—Immunoglobulins specific features characterized by non-natural combinations of immunoglobulin fragments
- C07K2317/62—Immunoglobulins specific features characterized by non-natural combinations of immunoglobulin fragments comprising only variable region components
- C07K2317/622—Single chain antibody (scFv)
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
- C07K2317/60—Immunoglobulins specific features characterized by non-natural combinations of immunoglobulin fragments
- C07K2317/64—Immunoglobulins specific features characterized by non-natural combinations of immunoglobulin fragments comprising a combination of variable region and constant region components
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
- C07K2317/70—Immunoglobulins specific features characterized by effect upon binding to a cell or to an antigen
- C07K2317/73—Inducing cell death, e.g. apoptosis, necrosis or inhibition of cell proliferation
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
- C07K2317/70—Immunoglobulins specific features characterized by effect upon binding to a cell or to an antigen
- C07K2317/76—Antagonist effect on antigen, e.g. neutralization or inhibition of binding
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
- C07K2317/90—Immunoglobulins specific features characterized by (pharmaco)kinetic aspects or by stability of the immunoglobulin
- C07K2317/92—Affinity (KD), association rate (Ka), dissociation rate (Kd) or EC50 value
Abstract
本揭露涉及抗體藥物技術領域，尤其涉及抗CD47/抗PD-L1抗體，包含抗CD47/抗PD-L1抗體的藥物組合物及其應用。本揭露的抗CD47/抗PD-L1抗體具有顯著的抗腫瘤活性，且不具有明顯的紅細胞毒性，可在製備抗腫瘤的藥物中應用。
Description
本揭露涉及抗體藥物技術領域，尤其涉及抗CD47/抗PD-L1抗體，包含抗CD47/抗PD-L1抗體的藥物組合物及其應用。
CD47蛋白又稱整合素相關蛋白(IAP)，屬於IgG超家族(superfamily)的一個五次跨膜糖蛋白，廣泛表達於不同組織細胞。CD47可與配體TSP-1或SIRPα結合，調控不同的細胞功能，包括細胞遷移、粘附、凋亡、軸突延伸、細胞因數產生及T細胞啟動。SIRPα是一個含有典型免疫受體酪氨酸抑制基序(ITIM)跨膜蛋白，主要表達於髓系造血細胞膜表面，如巨噬細胞，樹突狀細胞等。CD47與SIRPα結合後，導致ITIMs的磷酸化，從而招募SHP-1/SHP-2，進而抑制肌球蛋白IIA在吞噬突觸的積累，最終抑制吞噬細胞的吞噬功能。
腫瘤細胞的「免疫逃逸」被認為是腫瘤發生、發展和抗藥的主要機制。腫瘤細胞通過高表達CD47分子，與巨噬細胞表面的SIRPα相互作用，可顯著抑制巨噬細胞的吞噬活性，避免被巨噬細胞吞噬掉。當阻斷CD47與SIRPα的結合時，可消除因腫瘤導致的免疫抑制或免疫耐受，有效殺傷腫瘤細胞。這為CD47的腫瘤免疫靶向治療提供了極為有力的理論依據。
近年來，國內外針對CD47/SIRPα信號通路的各種治療方式進行了大量研究，其中CD47阻斷性抗體被認為是其中最有希望的腫瘤治療方案。人CD47阻斷型單抗的有效性已經在多種臨床前模型中證實。不過，由於紅細胞、血小板也表達CD47分子，當抗體阻斷CD47與SIRPα的相互作用時，可能導致這些細胞失去「別吃我」信號的保護，進而被巨噬細胞吞噬。因此要避免抗CD47抗體的副作用，比如血小板降解，紅細胞凝集，紅細胞耗竭，貧血等也是應用抗CD47抗體需要考慮的一個重點。
程式性死亡配體1(PD-L1)，也稱為分化簇274(CD274)或B7同系物1(B7-H1)，是一種40 kDa的1型跨膜蛋白，其在特定事件(例如妊娠、組織同種異體移植、自身免疫疾病和其他疾病狀態如肝炎)期間在抑制免疫系統的過程中起主要作用。PD-L1與PD-1或B7.1的結合傳遞抑制性信號，該抑制性信號減少CD8+T細胞在淋巴結處的增殖，並且對該PD-1的補充也能夠通過進一步由基因Bcl-2的更低調節介導的細胞凋亡來控制外來抗原特異性T細胞在淋巴結中的積累。
已經顯示PD-L1的上調可以允許癌症逃避宿主免疫系統。對來自腎細胞癌患者的腫瘤樣本的分析發現，PD-L1的高腫瘤表達與增加的腫瘤侵襲性和增加的死亡風險相關。許多PD-L1抑制劑作為免疫腫瘤學療法正在開發中，並且在臨床試驗中正在展現出良好的結果。
CD47-SIRPα信號通路不但啟動固有免疫，巨噬細胞還將腫瘤抗原呈遞給CD8+T、CD4+T細胞，通過促進T細胞啟動，進一步殺傷腫瘤。因此，可以開發一種靶向CD47與PD-L1的雙功能融合蛋白，該融合蛋白包含CD47結合部分和PD-L1結合部分，既能阻斷PD-L1與PD-1的結合，又能阻斷CD47與SIRPα的結合，把先天免疫和獲得性免疫信號通路橋聯在一起，從而具有更好的抗腫瘤活性、腫瘤靶向性和更低的紅細胞毒性。
本揭露提供一種抗CD47/抗PD-L1抗體，其包括抗CD47抗體或其抗原結合片段和抗PD-L1抗體或其抗原結合片段，其中抗CD47抗體或其抗原結合片段包含第一重鏈可變區和/或第一輕鏈可變區，其中第一重鏈可變區包含第一重鏈可變區的互補決定區1(H1CDR1)、第一重鏈可變區的互補決定區2(H1CDR2)和/或第一重鏈可變區的互補決定區3(H1CDR3)，第一輕鏈可變區包含第一輕鏈可變區的互補決定區1(L1CDR1)、第一輕鏈可變區的互補決定區2(L1CDR2)和/或第一輕鏈可變區的互補決定區3(L1CDR3)；和抗PD-L1抗體或其抗原結合片段為特異性結合PD-L1的抗體或其抗原結合片段。
在一些實施方式中，本揭露提供一種抗CD47/抗PD-L1抗體，其包括抗CD47抗體或其抗原結合片段和抗PD-L1抗體或其抗原結合片段，其中抗CD47抗體或其抗原結合片段包含第一重鏈可變區和第一輕鏈可變區，其中：
(1)第一重鏈可變區包含選自如下組的H1CDR1、H1CDR2和H1CDR3：
(a1)如SEQ ID NO:1、2和3所示的胺基酸序列；
(a2)如SEQ ID NO:10、2和11所示的胺基酸序列；
(a3)如SEQ ID NO:4、5和6所示的胺基酸序列；和
(a4)如SEQ ID NO:7、8和9所示的胺基酸序列；
(a5)與(a1)、(a2)、(a3)或(a4)所示的胺基酸序列具有至少85%序列相似性的胺基酸序列；和
(2)第一輕鏈可變區包含選自如下組的L1CDR1、L1CDR2和L1CDR3：
(a6)如SEQ ID NO:12、13和14所示的胺基酸序列；
(a7)如SEQ ID NO:15、16和17所示的胺基酸序列；和
(a8)如SEQ ID NO:18、19和20所示的胺基酸序列；
(a9)與(a6)、(a7)或(a8)所示的胺基酸序列具有至少85%序列相似性的胺基酸序列。
在一些實施方式中，根據本揭露的抗CD47/抗PD-L1抗體，抗CD47抗體或其抗原結合片段具有：
H1CDR1、H1CDR2和H1CDR3分別為SEQ ID NO:1、2和3或與SEQ ID NO:1、2和3所示的胺基酸序列具有至少85%序列相似性的胺基酸序列的第一重鏈可變區，和L1CDR1、L1CDR2和L1CDR3分別為SEQ ID NO:12、13和14或與SEQ ID NO:12、13和14所示的胺基酸序列具有至少85%序列相似性的胺基酸序列的第一輕鏈可變區；
H1CDR1、H1CDR2和H1CDR3分別為SEQ ID NO:10、2和11或與SEQ ID NO:10、2和11所示的胺基酸序列具有至少85%序列相似性的胺基酸序列的第一重鏈可變區，和L1CDR1、L1CDR2和L1CDR3分別為SEQ ID NO:12、13和14或與SEQ ID NO:12、13和14所示的胺基酸序列具有至少85%序列相似性的胺基酸序列的第一輕鏈可變區；
H1CDR1、H1CDR2和H1CDR3分別為SEQ ID NO:4、5和6或與SEQ ID NO:4、5和6所示的胺基酸序列具有至少85%序列相似性的胺基酸序列的第一重鏈可變區，和所述L1CDR1、L1CDR2和L1CDR3分別為SEQ ID NO:15、16和17或與SEQ ID NO:15、16和17所示的胺基酸序列具有至少85%序列相似性的胺基酸序列的第一輕鏈可變區；或
H1CDR1、H1CDR2和H1CDR3分別為SEQ ID NO:7、8和9或與SEQ ID NO:7、8和9所示的胺基酸序列具有至少85%序列相似性的胺基酸序列的第一重鏈可變區，和所述L1CDR1、L1CDR2和L1CDR3分別為SEQ ID NO:18、19和20或與SEQ ID NO:18、19和20所示的胺基酸序列具有至少85%序列相似性的胺基酸序列的第一輕鏈可變區。
在一些實施方式中，根據本揭露的抗CD47/抗PD-L1抗體，抗CD47抗體或其抗原結合片段包含第一重鏈可變區和第一輕鏈可變區，其中：
(1)第一重鏈可變區的胺基酸序列選自：
(b1)如SEQ ID NO:21、SEQ ID NO:22、SEQ ID NO:23、SEQ ID NO:27所示的胺基酸序列；
(b2)及(b1)所示的胺基酸序列經取代、缺失或添加一個或多個胺基酸獲得的、且與(b1)所示的胺基酸序列功能相同或相似的胺基酸序列；和
(b3)與(b1)所示的胺基酸序列具有至少80%序列相似性的胺基酸序列；和
(2)第一輕鏈可變區的胺基酸序列選自：
(b4)如SEQ ID NO:24、SEQ ID NO:25、SEQ ID NO:26、SEQ ID NO:28所示的胺基酸序列；
(b5)及(b4)所示的胺基酸序列經取代、缺失或添加一個或多個胺基酸獲得的、且與(b4)所示的胺基酸序列功能相同或相似的胺基酸序列；和
(b6)與(b4)所示的胺基酸序列具有至少80%序列相似性的胺基酸序列。
在一些實施方式中，根據本揭露的抗CD47/抗PD-L1抗體，抗CD47抗體或其抗原結合片段包含第一重鏈可變區和第一輕鏈可變區，其中：
第一重鏈可變區的胺基酸序列為SEQ ID NO:21，SEQ ID NO:21經取代、缺失或添加一個或多個胺基酸獲得的且與SEQ ID NO:21功能相同的胺基酸序列或與SEQ ID NO:21具有至少85%序列相似性的胺基酸序列，且第一輕鏈可變區的胺基酸序列為SEQ ID NO:24，SEQ ID NO:24經取代、缺失或添加一個或多個胺基酸獲得的且與SEQ ID NO:24功能相同的胺基酸序列或與SEQ ID NO:24具有至少85%序列相似性的胺基酸序列；
第一重鏈可變區的胺基酸序列為SEQ ID NO:22，SEQ ID NO:22經取代、缺失或添加一個或多個胺基酸獲得的且與SEQ ID NO:22功能相同的胺基酸序列或與SEQ ID NO:22具有至少85%序列相似性的胺基酸序列，且第一輕鏈可變區的胺基酸序列為SEQ ID NO:25，SEQ ID NO:25經取代、缺失或添加一個或多個胺基酸獲得的且與SEQ ID NO:25功能相同的胺基酸序列或與SEQ ID NO:25具有至少85%序列相似性的胺基酸序列；
第一重鏈可變區的胺基酸序列為SEQ ID NO:23，SEQ ID NO:23經取代、缺失或添加一個或多個胺基酸獲得的且與SEQ ID NO:23功能相同的胺基酸序列或與SEQ ID NO:23具有至少85%序列相似性的胺基酸序列，且第一輕鏈可變區的胺基酸序列為SEQ ID NO:26，SEQ ID NO:26經取代、缺失或添加一個或多個胺基酸獲得的且與SEQ ID NO:26功能相同的胺基酸序列或與SEQ ID NO:26具有至少85%序列相似性的胺基酸序列；
第一重鏈可變區的胺基酸序列為SEQ ID NO:27，SEQ ID NO:27經取代、缺失或添加一個或多個胺基酸獲得的且與SEQ ID NO:27功能相同的胺基酸序列或與SEQ ID NO:27具有至少85%序列相似性的胺基酸序列，且第一輕鏈可變區的胺基酸序列為SEQ ID NO:24，SEQ ID NO:24經取代、缺失或添加一個或多個胺基酸獲得的且與SEQ ID NO:24功能相同的胺基酸序列或與SEQ ID NO:24具有至少85%序列相似性的胺基酸序列；或
第一重鏈可變區的胺基酸序列為SEQ ID NO:23，SEQ ID NO:23經取代、缺失或添加一個或多個胺基酸獲得的且與SEQ ID NO:23功能相同的胺基酸序列或與SEQ ID NO:23具有至少85%序列相似性的胺基酸序列，且第一輕鏈可變區的胺基酸序列為SEQ ID NO:28，SEQ ID NO:28經取代、缺失或添加一個或多個胺基酸獲得的且與SEQ ID NO:28功能相同的胺基酸序列或與SEQ ID NO:28具有至少85%序列相似性的胺基酸序列。
在一些實施方式中，根據本揭露的抗CD47/抗PD-L1抗體，抗CD47抗體或其抗原結合片段為人源化抗體或其抗原結合片段，其包含第一重鏈可變區和第一輕鏈可變區，其中：
(1)第一重鏈可變區的胺基酸序列選自：
(c1)如SEQ ID NO:29、SEQ ID NO:30、SEQ ID NO:31所示的胺基酸序列；
(c2)及(c1)所示的胺基酸序列經取代、缺失或添加一個或多個胺基酸獲得的、且與(c1)所示的胺基酸序列功能相同或相似的胺基酸序列；和
(c3)與(c1)所示的胺基酸序列具有至少80%序列相似性的胺基酸序列；和
(2)所述第一輕鏈可變區的胺基酸序列選自：
(c4)如SEQ ID NO:32、SEQ ID NO:33、SEQ ID NO:34所示的胺基酸序列；
(c5)及(c4)所示的胺基酸序列經取代、缺失或添加一個或多個胺基酸獲得的、且與(c4)所示的胺基酸序列功能相同或相似的胺基酸序列；和
(c6)與(c4)所示的胺基酸序列具有至少80%序列相似性的胺基酸序列。
在一些實施方式中，根據本揭露的抗CD47/抗PD-L1抗體，抗CD47抗體或其抗原結合片段為人源化抗體或其抗原結合片段，其包含第一重鏈可變區和第一輕鏈可變區，其中：
第一重鏈可變區的胺基酸序列為SEQ ID NO:29，SEQ ID NO:29經取代、缺失或添加一個或多個胺基酸獲得的且與SEQ ID NO:29功能相同的胺基酸序列或與SEQ ID NO:29具有至少85%序列相似性的胺基酸序列，且第一輕鏈可變區的胺基酸序列為SEQ ID NO:32，SEQ ID NO:32經取代、缺失或添加一個或多個胺基酸獲得的且與SEQ ID NO:32功能相同的胺基酸序列或與SEQ ID NO:32具有至少85%序列相似性的胺基酸序列；
第一重鏈可變區的胺基酸序列為SEQ ID NO:30，SEQ ID NO:30經取代、缺失或添加一個或多個胺基酸獲得的且與SEQ ID NO:30功能相同的胺基酸序列或與SEQ ID NO:30具有至少85%序列相似性的胺基酸序列，且第一輕鏈可變區的胺基酸序列為SEQ ID NO:33，SEQ ID NO:33經取代、缺失或添加一個或多個胺基酸獲得的且與SEQ ID NO:33功能相同的胺基酸序列或與SEQ ID NO:33具有至少85%序列相似性的胺基酸序列；或
第一重鏈可變區的胺基酸序列為SEQ ID NO:31，SEQ ID NO:31經取代、缺失或添加一個或多個胺基酸獲得的且與SEQ ID NO:31功能相同的胺基酸序列或與SEQ ID NO:31具有至少85%序列相似性的胺基酸序列，且第一輕鏈可變區的胺基酸序列為SEQ ID NO:34，SEQ ID NO:34經取代、缺失或添加一個或多個胺基酸獲得的且與SEQ ID NO:34功能相同的胺基酸序列或與SEQ ID NO:34具有至少85%序列相似性的胺基酸序列。
在一些實施方式中，本揭露提供一種抗CD47/抗PD-L1抗體，其包括抗CD47抗體或其抗原結合片段和抗PD-L1抗體或其抗原結合片段，其中：
抗CD47抗體或其抗原結合片段包含第一重鏈可變區和第一輕鏈可變區，其中：
(1)第一重鏈可變區包含H1CDR1、H1CDR2和H1CDR3，其胺基酸序列分別為SEQ ID NO:4、5和6或與SEQ ID NO:4、5和6所示的胺基酸序列具有至少85%序列相似性的胺基酸序列；和
(2)第一輕鏈可變區包含L1CDR1、L1CDR2和L1CDR3，其胺基酸序列分別為SEQ ID NO:15、16和17或與SEQ ID NO: 15、16和17所示的胺基酸序列具有至少85%序列相似性的胺基酸序列。
在一些較佳的實施方式中，本揭露提供一種抗CD47/抗PD-L1抗體，其包括抗CD47抗體或其抗原結合片段和抗PD-L1抗體或其抗原結合片段，其中抗CD47抗體或其抗原結合片段如以上實施方式中所限定；和抗PD-L1抗體或其抗原結合片段包含第二重鏈可變區和/或第二輕鏈可變區，其中第二重鏈可變區包含第二重鏈可變區的互補決定區1(H2CDR1)、第二重鏈可變區的互補決定區2(H2CDR2)和/或第二重鏈可變區的互補決定區3(H2CDR3)，第二輕鏈可變區包含第二輕鏈可變區的互補決定區1(L2CDR1)、第二輕鏈可變區的互補決定區2(L2CDR2)和/或第二輕鏈可變區的互補決定區3(L2CDR3)區。
較佳的，在一些實施方式中，本揭露提供一種抗CD47/抗PD-L1抗體，其包括抗CD47抗體或其抗原結合片段和抗PD-L1抗體或其抗原結合片段，其中抗CD47抗體或其抗原結合片段如以上實施方式中所限定，和抗PD-L1抗體或其抗原結合片段包含第二重鏈可變區和第二輕鏈可變區，其中：
(1)第二重鏈可變區包含選自如下組的H2CDR1、H2CDR2和H2CDR3：
(A1)如SEQ ID NO:75、76和77所示的胺基酸序列；
(A2)如SEQ ID NO:81、82和83所示的胺基酸序列；
(A3)如SEQ ID NO:87、88和89所示的胺基酸序列；和
(A4)如SEQ ID NO:93、94和95所示的胺基酸序列；
(A5)與(A1)、(A2)、(A3)或(A4)所示的胺基酸序列具有至少85%序列相似性的胺基酸序列；和
(2)第二輕鏈可變區包含選自如下組的L2CDR1、L2CDR2和L2CDR3：
(A6)如SEQ ID NO:78、79和80所示的胺基酸序列；
(A7)如SEQ ID NO:84、85和86所示的胺基酸序列；
(A8)如SEQ ID NO:90、91和92所示的胺基酸序列；
(A9)如SEQ ID NO:96、97和98所示的胺基酸序列；
(A10)與(A6)、(A7)、(A8)或(A9)所示的胺基酸序列具有至少85%序列相似性的胺基酸序列。
在一些具體的實施方式中，本揭露提供一種抗CD47/抗PD-L1抗體，其包括抗CD47抗體或其抗原結合片段和抗PD-L1抗體或其抗原結合片段，其中：
抗CD47抗體或其抗原結合片段包含第一重鏈可變區和第一輕鏈可變區，其中：
(1)第一重鏈可變區包含H1CDR1、H1CDR2和H1CDR3，其胺基酸序列分別為SEQ ID NO:4、5和6或與SEQ ID NO:4、5和6所示的胺基酸序列具有至少85%序列相似性的胺基酸序列；
(2)第一輕鏈可變區包含L1CDR1、L1CDR2和L1CDR3，其胺基酸序列分別為SEQ ID NO:15、16和17或與SEQ ID NO: 15、16和17所示的胺基酸序列具有至少85%序列相似性的胺基酸序列；和
抗PD-L1抗體或其抗原結合片段包含第二重鏈可變區和第二輕鏈可變區，其中：
(1)第二重鏈可變區包含選自如下組的H2CDR1、H2CDR2和H2CDR3：
(A1)如SEQ ID NO:75、76和77所示的胺基酸序列；
(A2)如SEQ ID NO:81、82和83所示的胺基酸序列；
(A3)如SEQ ID NO:87、88和89所示的胺基酸序列；和
(A4)如SEQ ID NO:93、94和95所示的胺基酸序列；
(A5)與(A1)、(A2)、(A3)或(A4)所示的胺基酸序列具有至少85%序列相似性的胺基酸序列；和
(2)第二輕鏈可變區包含選自如下組的L2CDR1、L2CDR2和L2CDR3：
(A6)如SEQ ID NO:78、79和80所示的胺基酸序列；
(A7)如SEQ ID NO:84、85和86所示的胺基酸序列；
(A8)如SEQ ID NO:90、91和92所示的胺基酸序列；
(A9)如SEQ ID NO:96、97和98所示的胺基酸序列；
(A10)與(A6)、(A7)、(A8)或(A9)所示的胺基酸序列具有至少85%序列相似性的胺基酸序列。
在一個具體的實施方式中，本揭露提供一種抗CD47/抗PD-L1抗體，其包括抗CD47抗體或其抗原結合片段和抗PD-L1抗體或其抗原結合片段，其中抗CD47抗體或其抗原結合片段包含H1CDR1、H1CDR2和H1CDR3分別為SEQ ID NO:4、5和6或與SEQ ID NO:4、5和6所示的胺基酸序列具有至少85%序列相似性的胺基酸序列的第一重鏈可變區，和L1CDR1、L1CDR2和L1CDR3分別為SEQ ID NO: 15、16和17或與SEQ ID NO:15、16和17所示的胺基酸序列具有至少85%序列相似性的胺基酸序列的第一輕鏈可變區；和抗PD-L1抗體或其抗原結合片段包含H2CDR1、H2CDR2和H2CDR3分別為SEQ ID NO:75、76和77或與SEQ ID NO:75、76和77所示的胺基酸序列具有至少85%序列相似性的胺基酸序列的第二重鏈可變區，和L2CDR1、L2CDR2和L2CDR3分別為SEQ ID NO:78、79和80或與SEQ ID NO:78、79和80所示的胺基酸序列具有至少85%序列相似性的胺基酸序列的第二輕鏈可變區。
在一個具體的實施方式中，本揭露提供一種抗CD47/抗PD-L1抗體，其包括抗CD47抗體或其抗原結合片段和抗PD-L1抗體或其抗原結合片段，其中抗CD47抗體或其抗原結合片段包含H1CDR1、H1CDR2和H1CDR3分別為SEQ ID NO:4、5和6或與SEQ ID NO:4、5和6所示的胺基酸序列具有至少85%序列相似性的胺基酸序列的第一重鏈可變區，和L1CDR1、L1CDR2和L1CDR3分別為SEQ ID NO:15、16和17或與SEQ ID NO:15、16和17所示的胺基酸序列具有至少85%序列相似性的胺基酸序列的第一輕鏈可變區；和抗PD-L1抗體或其抗原結合片段包含H2CDR1、H2CDR2和H2CDR3分別為SEQ ID NO:81、82和83或與SEQ ID NO:81、82和83所示的胺基酸序列具有至少85%序列相似性的胺基酸序列的第二重鏈可變區，和L2CDR1、L2CDR2和L2CDR3分別為SEQ ID NO: 84、85和86或與SEQ ID NO:84、85和86所示的胺基酸序列具有至少85%序列相似性的胺基酸序列的第二輕鏈可變區。
在一個具體的實施方式中，本揭露提供一種抗CD47/抗PD-L1抗體，其包括抗CD47抗體或其抗原結合片段和抗PD-L1抗體或其抗原結合片段，其中抗CD47抗體或其抗原結合片段包含H1CDR1、H1CDR2和H1CDR3分別為SEQ ID NO:4、5和6或與SEQ ID NO:4、5和6所示的胺基酸序列具有至少85%序列相似性的胺基酸序列的第一重鏈可變區，和L1CDR1、L1CDR2和L1CDR3分別為SEQ ID NO:15、16和17或與SEQ ID NO:15、16和17所示的胺基酸序列具有至少85%序列相似性的胺基酸序列的第一輕鏈可變區；和抗PD-L1抗體或其抗原結合片段包含H2CDR1、H2CDR2和H2CDR3分別為SEQ ID NO:87、88和89或與SEQ ID NO:87、88和89所示的胺基酸序列具有至少85%序列相似性的胺基酸序列的第二重鏈可變區，和L2CDR1、L2CDR2和L2CDR3分別為SEQ ID NO:90、91和92或與SEQ ID NO:90、91和92所示的胺基酸序列具有至少85%序列相似性的胺基酸序列的第二輕鏈可變區。
在一個具體的實施方式中，本揭露提供一種抗CD47/抗PD-L1抗體，其包括抗CD47抗體或其抗原結合片段和抗PD-L1抗體或其抗原結合片段，其中抗CD47抗體或其抗原結合片段包含H1CDR1、H1CDR2和H1CDR3分別為SEQ ID NO:4、5和6或與SEQ ID NO:4、5和6所示的胺基酸序列具有至少85%序列相似性的胺基酸序列的第一重鏈可變區，和L1CDR1、L1CDR2和L1CDR3分別為SEQ ID NO:15、16和17或與SEQ ID NO:15、16和17所示的胺基酸序列具有至少85%序列相似性的胺基酸序列的第一輕鏈可變區；和抗PD-L1抗體或其抗原結合片段包含H2CDR1、H2CDR2和H2CDR3分別為SEQ ID NO:93、94和95或與SEQ ID NO:93、94和95所示的胺基酸序列具有至少85%序列相似性的胺基酸序列的第二重鏈可變區，和L2CDR1、L2CDR2和L2CDR3分別為SEQ ID NO:96、97和98或與SEQ ID NO:96、97和98所示的胺基酸序列具有至少85%序列相似性的胺基酸序列的第二輕鏈可變區。
在一些具體的實施方式中，根據本揭露的抗CD47/抗PD-L1抗體，抗CD47抗體或其抗原結合片段以及抗PD-L1抗體或其抗原結合片段各自獨立地為鼠源抗體、嵌合抗體、人源化抗體或完全人抗體。
在一些具體的實施方式中，本揭露提供一種抗CD47/抗PD-L1抗體，其中抗CD47抗體或其抗原結合片段包含第一重鏈可變區和第一輕鏈可變區，其中：
(1)第一重鏈可變區的胺基酸序列選自：
(b1)如SEQ ID NO:22和SEQ ID NO:30所示的胺基酸序列；
(b2)及(b1)所示的胺基酸序列經取代、缺失或添加一個或多個胺基酸獲得的且與(b1)所示的胺基酸序列功能相同或相似的胺基酸序列；和
(b3)與(b1)所示的胺基酸序列具有至少80%序列相似性的胺基酸序列；和
(2)第一輕鏈可變區的胺基酸序列選自：
(b4)如SEQ ID NO:25和SEQ ID NO:33所示的胺基酸序列；
(b5)及(b4)所示的胺基酸序列經取代、缺失或添加一個或多個胺基酸獲得的且與(b4)所示的胺基酸序列功能相同或相似的胺基酸序列；和
(b6)與(b4)所示的胺基酸序列具有至少80%序列相似性的胺基酸序列；和
抗PD-L1抗體或其抗原結合片段包含第二重鏈可變區和第二輕鏈可變區，其中：
(1)所述第二重鏈可變區的胺基酸序列選自：
(B1)如SEQ ID NO:99、100、101、102、110、111、112、113、114、119、120、121、122和123所示的胺基酸序列；
(B2)及(B1)所示的胺基酸序列經取代、缺失或添加一個或多個胺基酸獲得的、且與(B1)所示的胺基酸序列功能相同或相似的胺基酸序列；和
(B3)與(B1)所示的胺基酸序列具有至少80%序列相似性的胺基酸序列；和
(2)第二輕鏈可變區的胺基酸序列選自：
(B4)如SEQ ID NO:103、104、105、106、115、116、117、118、124、125、126所示的胺基酸序列；
(B5)及(B4)所示的胺基酸序列經取代、缺失或添加一個或多個胺基酸獲得的、且與(B4)所示的胺基酸序列功能相同或相似的胺基酸序列；和
(B6)與(B4)所示的胺基酸序列具有至少80%序列相似性的胺基酸序列。
在一些具體的實施方式中，本揭露提供一種抗CD47/抗PD-L1抗體，其中所述第一重鏈可變區的胺基酸序列為SEQ ID NO:22，SEQ ID NO:22經取代、缺失或添加一個或多個胺基酸獲得的且與SEQ ID NO:22功能相同的胺基酸序列或與SEQ ID NO:22具有至少85%序列相似性的胺基酸序列，且第一輕鏈可變區的胺基酸序列為SEQ ID NO:25，SEQ ID NO:25經取代、缺失或添加一個或多個胺基酸獲得的且與SEQ ID NO:25功能相同的胺基酸序列或與SEQ ID NO:25具有至少85%序列相似性的胺基酸序列。
在一些具體的實施方式中，本揭露提供一種抗CD47/抗PD-L1抗體，其中第一重鏈可變區的胺基酸序列為SEQ ID NO:22，SEQ ID NO:22經取代、缺失或添加一個或多個胺基酸獲得的且與SEQ ID NO:22功能相同的胺基酸序列或與SEQ ID NO:22具有至少85%序列相似性且H1CDR1、H1CDR2和H1CDR3如SEQ ID NO: 4、5和6所示的胺基酸序列，且第一輕鏈可變區的胺基酸序列為SEQ ID NO:25，SEQ ID NO:25經取代、缺失或添加一個或多個胺基酸獲得的且與SEQ ID NO:25功能相同的胺基酸序列或與SEQ ID NO:25具有至少85%序列相似性且L1CDR1、L1CDR2和L1CDR3如SEQ ID NO: 15、16和17所示的胺基酸序列。
在一些具體的實施方式中，根據本揭露的抗CD47/抗PD-L1抗體，其中抗CD47抗體或抗PD-L1抗體可以為鼠源抗體，其還含有鼠源的IgG1、IgG2、IgG3或IgG4或其變體的重鏈恆定區，和鼠源的κ鏈或其變體的輕鏈恆定區。
在一些較佳的實施方式中，根據本揭露的抗CD47/抗PD-L1抗體，其中抗CD47鼠源抗體還含有鼠源的IgG1或IgG2或其變體的重鏈恆定區，和鼠源κ鏈或其變體的輕鏈恆定區。
在一些具體的實施方式中，本揭露提供抗CD47/抗PD-L1抗體，其中抗CD47抗體或其抗原結合片段包含第一重鏈可變區和第一輕鏈可變區，其中：
(1)第一重鏈可變區的胺基酸序列選自：
(c1)如SEQ ID NO:30所示的胺基酸序列；
(c2)及(c1)所示的胺基酸序列經取代、缺失或添加一個或多個胺基酸獲得的且與(c1)所示的胺基酸序列功能相同或相似的胺基酸序列；和
(c3)與(c1)所示的胺基酸序列具有至少80%序列相似性的胺基酸序列；和
(2)第一輕鏈可變區的胺基酸序列選自：
(c4)如SEQ ID NO:33所示的胺基酸序列；
(c5)及(c4)所示的胺基酸序列經取代、缺失或添加一個或多個胺基酸獲得的且與(c4)所示的胺基酸序列功能相同或相似的胺基酸序列；和
(c6)與(c4)所示的胺基酸序列具有至少80%序列相似性的胺基酸序列；和
抗PD-L1抗體或其抗原結合片段包含第二重鏈可變區和第二輕鏈可變區，其中：
(1)第二重鏈可變區的胺基酸序列選自：
(C1)如SEQ ID NO:110、111、112、113、114、119、120、121、122和123所示的胺基酸序列；
(C2)及(C1)所示的胺基酸序列經取代、缺失或添加一個或多個胺基酸獲得的、且與(C1)所示的胺基酸序列功能相同或相似的胺基酸序列；和
(C3)與(C1)所示的胺基酸序列具有至少80%序列相似性的胺基酸序列；和
(2)第二輕鏈可變區的胺基酸序列選自：
(C4)如SEQ ID NO:115、116、117、118、124、125、126所示的胺基酸序列；
(C5)及(C4)所示的胺基酸序列經取代、缺失或添加一個或多個胺基酸獲得的、且與(C4)所示的胺基酸序列功能相同或相似的胺基酸序列；和
(C6)與(C4)所示的胺基酸序列具有至少80%序列相似性的胺基酸序列。
在一些具體的實施方式中，本揭露提供抗CD47/抗PD-L1抗體，其中第一重鏈可變區的胺基酸序列為SEQ ID NO:30，SEQ ID NO:30經取代、缺失或添加一個或多個胺基酸獲得的且與SEQ ID NO:30功能相同的胺基酸序列或與SEQ ID NO:30具有至少85%序列相似性的胺基酸序列，且第一輕鏈可變區的胺基酸序列為SEQ ID NO:33，SEQ ID NO:33經取代、缺失或添加一個或多個胺基酸獲得的且與SEQ ID NO:33功能相同的胺基酸序列或與SEQ ID NO:33具有至少85%序列相似性的胺基酸序列；和第二重鏈可變區的胺基酸序列為SEQ ID NO:110、111、112、113或114所示的胺基酸序列，SEQ ID NO:110、111、112、113或114經取代、缺失或添加一個或多個胺基酸獲得的且與SEQ ID NO:110、111、112、113或114功能相同的胺基酸序列或與SEQ ID NO:110、111、112、113或114具有至少85%序列相似性的胺基酸序列，且第二輕鏈可變區的胺基酸序列為SEQ ID NO:115、116、117或118，SEQ ID NO:115、116、117或118經取代、缺失或添加一個或多個胺基酸獲得的且與SEQ ID NO:115、116、117或118功能相同的胺基酸序列或與SEQ ID NO:115、116、117或118具有至少85%序列相似性的胺基酸序列。
在一些具體的實施方式中，本揭露提供抗CD47/抗PD-L1抗體，其中第一重鏈可變區的胺基酸序列為SEQ ID NO:30，SEQ ID NO:30經取代、缺失或添加一個或多個胺基酸獲得的且與SEQ ID NO:30功能相同的胺基酸序列或與SEQ ID NO:30具有至少85%序列相似性的胺基酸序列，且第一輕鏈可變區的胺基酸序列為SEQ ID NO:33，SEQ ID NO:33經取代、缺失或添加一個或多個胺基酸獲得的且與SEQ ID NO:33功能相同的胺基酸序列或與SEQ ID NO:33具有至少85%序列相似性的胺基酸序列；和第二重鏈可變區的胺基酸序列為SEQ ID NO: 119、120、121、122或123所示的胺基酸序列，SEQ ID NO:119、120、121、122或123經取代、缺失或添加一個或多個胺基酸獲得的且與SEQ ID NO:119、120、121、122或123功能相同的胺基酸序列或與SEQ ID NO:119、120、121、122或123具有至少85%序列相似性的胺基酸序列，且第二輕鏈可變區的胺基酸序列為SEQ ID NO:124、125或126，SEQ ID NO:124、125或126經取代、缺失或添加一個或多個胺基酸獲得的且與SEQ ID NO:124、125或126功能相同的胺基酸序列或與SEQ ID NO:124、125或126具有至少85%序列相似性的胺基酸序列。
在一些具體的實施方式中，本揭露提供抗CD47/抗PD-L1抗體，其中第一重鏈可變區的胺基酸序列為SEQ ID NO:30，SEQ ID NO:30經取代、缺失或添加一個或多個胺基酸獲得的且與SEQ ID NO:30功能相同的胺基酸序列或與SEQ ID NO:30具有至少85%序列相似性且H1CDR1、H1CDR2和H1CDR3如SEQ ID NO:4、5和6所示的胺基酸序列，且所述第一輕鏈可變區的胺基酸序列為SEQ ID NO:33，SEQ ID NO:33經取代、缺失或添加一個或多個胺基酸獲得的且與SEQ ID NO:33功能相同的胺基酸序列或與SEQ ID NO:33具有至少85%序列相似性且L1CDR1、L1CDR2和L1CDR3如SEQ ID NO: 15、16和17所示的胺基酸序列；和所述第二重鏈可變區的胺基酸序列為SEQ ID NO:110、111、112、113或114所示的胺基酸序列，SEQ ID NO:110、111、112、113或114經取代、缺失或添加一個或多個胺基酸獲得的且與SEQ ID NO:110、111、112、113或114功能相同的胺基酸序列或與SEQ ID NO:110、111、112、113或114具有至少85%序列相似性且H2CDR1、H2CDR2和H2CDR3如SEQ ID NO:75、76和77所示的胺基酸序列，且第二輕鏈可變區的胺基酸序列為SEQ ID NO:115、116、117或118，SEQ ID NO:115、116、117或118經取代、缺失或添加一個或多個胺基酸獲得的且與SEQ ID NO:115、116、117或118功能相同的胺基酸序列或與SEQ ID NO:115、116、117或118具有至少85%序列相似性且L2CDR1、L2CDR2和L2CDR3如SEQ ID NO:78、79和80所示的胺基酸序列。
在一些具體的實施方式中，本揭露提供抗CD47/抗PD-L1抗體，其中第一重鏈可變區的胺基酸序列為SEQ ID NO:30，SEQ ID NO:30經取代、缺失或添加一個或多個胺基酸獲得的且與SEQ ID NO:30功能相同的胺基酸序列或與SEQ ID NO:30具有至少85%序列相似性且H1CDR1、H1CDR2和H1CDR3如SEQ ID NO:4、5和6所示的胺基酸序列，且所述第一輕鏈可變區的胺基酸序列為SEQ ID NO:33，SEQ ID NO:33經取代、缺失或添加一個或多個胺基酸獲得的且與SEQ ID NO:33功能相同的胺基酸序列或與SEQ ID NO:33具有至少85%序列相似性且L1CDR1、L1CDR2和L1CDR3如SEQ ID NO: 15、16和17所示的胺基酸序列；和第二重鏈可變區的胺基酸序列為SEQ ID NO:110、111、112、113或114所示的胺基酸序列，SEQ ID NO:110、111、112、113或114經取代、缺失或添加一個或多個胺基酸獲得的且與SEQ ID NO:110、111、112、113或114功能相同的胺基酸序列或與SEQ ID NO:110、111、112、113或114具有至少85%序列相似性且H2CDR1、H2CDR2和H2CDR3如SEQ ID NO:87、88和89所示的胺基酸序列，且第二輕鏈可變區的胺基酸序列為SEQ ID NO:115、116、117或118，SEQ ID NO:115、116、117或118經取代、缺失或添加一個或多個胺基酸獲得的且與SEQ ID NO:115、116、117或118功能相同的胺基酸序列或與SEQ ID NO:115、116、117或118具有至少85%序列相似性且L2CDR1、L2CDR2和L2CDR3如SEQ ID NO:90、91和92所示的胺基酸序列。
在一些優選的實施方式中，本揭露提供抗CD47/抗PD-L1抗體，其中第一重鏈可變區的胺基酸序列為SEQ ID NO:30，SEQ ID NO:30經取代、缺失或添加一個或多個胺基酸獲得的且與SEQ ID NO:30功能相同的胺基酸序列或與SEQ ID NO:30具有至少85%，或至少90%，或至少95%，或至少98%序列相似性且H1CDR1、H1CDR2和H1CDR3如SEQ ID NO:4、5和6所示的胺基酸序列，且第一輕鏈可變區的胺基酸序列為SEQ ID NO:33，SEQ ID NO:33經取代、缺失或添加一個或多個胺基酸獲得的且與SEQ ID NO:33功能相同的胺基酸序列或與SEQ ID NO:33具有至少85%，或至少90%，或至少95%，或至少98%序列相似性且L1CDR1、L1CDR2和L1CDR3如SEQ ID NO:15、16和17所示的胺基酸序列；和第二重鏈可變區的胺基酸序列為SEQ ID NO:112所示的胺基酸序列，SEQ ID NO:112經取代、缺失或添加一個或多個胺基酸獲得的且與SEQ ID NO:112功能相同的胺基酸序列或與SEQ ID NO:112具有至少85%，或至少90%，或至少95%，或至少98%序列相似性且H2CDR1、H2CDR2和H2CDR3如SEQ ID NO:75、76和77所示的胺基酸序列，且第二輕鏈可變區的胺基酸序列為SEQ ID NO:116，SEQ ID NO:116經取代、缺失或添加一個或多個胺基酸獲得的且與SEQ ID NO:116功能相同的胺基酸序列或與SEQ ID NO:116具有至少85%，或至少90%，或至少95%，或至少98%序列相似性且L2CDR1、L2CDR2和L2CDR3如SEQ ID NO:78、79和80所示的胺基酸序列。
在另一些較佳的實施方式中，本揭露提供抗CD47/抗PD-L1抗體，其中第一重鏈可變區的胺基酸序列為SEQ ID NO:30，SEQ ID NO:30經取代、缺失或添加一個或多個胺基酸獲得的且與SEQ ID NO:30功能相同的胺基酸序列或與SEQ ID NO:30具有至少85%，或至少90%，或至少95%，或至少98%序列相似性且H1CDR1、H1CDR2和H1CDR3如SEQ ID NO:4、5和6所示的胺基酸序列，且第一輕鏈可變區的胺基酸序列為SEQ ID NO:33，SEQ ID NO:33經取代、缺失或添加一個或多個胺基酸獲得的且與SEQ ID NO:33功能相同的胺基酸序列或與SEQ ID NO:33具有至少85%，或至少90%，或至少95%，或至少98%序列相似性且L1CDR1、L1CDR2和L1CDR3如SEQ ID NO: 15、16和17所示的胺基酸序列；和第二重鏈可變區的胺基酸序列為SEQ ID NO:123所示的胺基酸序列，SEQ ID NO:123經取代、缺失或添加一個或多個胺基酸獲得的且與SEQ ID NO:123功能相同的胺基酸序列或與SEQ ID NO:123具有至少85%，或至少90%，或至少95%，或至少98%序列相似性且H2CDR1、H2CDR2和H2CDR3如SEQ ID NO: 87、88和89所示的胺基酸序列，且第二輕鏈可變區的胺基酸序列為SEQ ID NO:126，SEQ ID NO:126經取代、缺失或添加一個或多個胺基酸獲得的且與SEQ ID NO:126功能相同的胺基酸序列或與SEQ ID NO:126具有至少85%，或至少90%，或至少95%，或至少98%序列相似性且L2CDR1、L2CDR2和L2CDR3如SEQ ID NO: 90、91和92所示的胺基酸序列。
在一些實施方式中，本揭露提供一種抗CD47/抗PD-L1人源化抗體，其中重鏈包含人源的IgG1、IgG2、IgG3、IgG4或其變體的重鏈恆定區，所述輕鏈包含人源的κ、λ鏈或其變體的輕鏈恆定區。
在本揭露一個較佳的實施方式中，所述的鼠源抗CD47/抗PD-L1抗體，可進一步包含鼠源κ、λ鏈或其變體的輕鏈恆定區，和/或進一步包含鼠源IgG1，IgG2，IgG3或IgG4或其變體的重鏈恆定區。
在本揭露一個較佳的實施方式中，根據本揭露的抗CD47/抗PD-L1抗體，抗CD47抗體或其抗原結合片段的抗體輕鏈進一步包含鼠源κ、λ鏈或其突變序列的輕鏈恆定區。抗CD47抗體或其抗原結合片段的抗體重鏈進一步包含鼠源IgG1、IgG2、IgG3、IgG4或其突變序列的重鏈恆定區，較佳包含人源IgG1、IgG2、IgG4重鏈恆定區。
在一些具體的實施方式中，根據本揭露的抗CD47/抗PD-L1抗體，抗CD47人源化抗體或其抗原結合片段還包含人源IgG1、IgG2、IgG3或IgG4或其變體的重鏈恆定區，和人源κ、λ鏈或其變體的輕鏈恆定區。在一些較佳的實施方式中，本揭露的抗CD47人源化抗體或其抗原結合片段還包含人源IgG1、IgG2、IgG4或其變體的重鏈恆定區，和人源κ鏈或其變體的輕鏈恆定區。
在本揭露一個較佳的實施方式中，根據本揭露的抗CD47/抗PD-L1抗體，抗PD-L1抗體或其抗原結合片段的抗體重鏈進一步包含鼠源IgG1、IgG2、IgG3、IgG4或其突變序列的重鏈恆定區，較佳包含人源IgG或其突變序列的重鏈恆定區；抗PD-L1抗體或其抗原結合片段的抗體輕鏈進一步包含鼠源κ、λ鏈或其突變序列的輕鏈恆定區。
在一些具體的實施方式中，根據本揭露的抗CD47/抗PD-L1抗體，抗PD-L1人源化抗體或其抗原結合片段還包含人源IgG1、IgG2、IgG3或IgG4或其變體的重鏈恆定區，和人源κ、λ鏈或其變體的輕鏈恆定區。在一些較佳的實施方式中，本揭露的抗CD47人源化抗體或其抗原結合片段還包含人源IgG4或其變體的重鏈恆定區，和人源κ鏈或其變體的輕鏈恆定區。
在一些實施方式中，本揭露提供抗CD47/抗PD-L1抗體，其中抗CD47抗體或其抗原結合片段以及抗PD-L1抗體或其抗原結合片段分別為Fab、Fv、sFv或F(ab)2。在一個具體的實施方式中，本揭露提供的抗CD47/抗PD-L1抗體為scF(ab)2。
較佳的，本揭露以上實施方式中的抗CD47/抗PD-L1抗體是抗CD47/抗PD-L1雙特異性抗體。在一些實施方式中，雙特異性抗體是人抗體或人源化抗體。在一些實施方式中，結合特異性之一是針對CD47，而另一個結合特異性是針對任何其它抗原。在一些實施方式中，結合特異性之一是針對CD47，而另一個結合特異性是針對PD-L1。在一些實施方式中，雙特異性抗體可結合CD47的兩種不同表位。雙特異性抗體還可用於將細胞毒劑定位於表達CD47的細胞。這些抗體擁有CD47結合臂和細胞毒劑結合臂，細胞毒劑例如肥皂草毒蛋白、抗幹擾素-α、長春花生物鹼類、蓖麻毒蛋白A鏈、甲氨蝶呤或放射性同位素半抗原。可將本揭露的雙特異性抗體製備成全長抗體或抗體片段(例如F(ab')2雙特異性抗體)。
製備雙特異性抗體的方法是本領域已知的。傳統上，雙特異性抗體的重組製備基於兩個免疫球蛋白重鏈-輕鏈對的共表達，其中兩個重鏈具有不同的特異性(Millstein and Cuello, Nature 305: 537(1983))。由於免疫球蛋白重鏈和輕鏈的隨機分配，這些雜交瘤(quadroma))可能產生10種不同抗體分子的混合物，其中只有一種分子具有正確的雙特異性結構。該正確分子的純化通常通過親和層析步驟進行，相當麻煩且產物產量低。類似的方法在WO93/08829及Trauneckeretal., EMBOJ. 10: 3655(1991)中有公開。
根據一種不同的方法，具有期望結合特異性(抗體-抗原結合位點)的抗體可變區與免疫球蛋白恆定區序列融合。在一些實施方式中，與包含至少部分鉸鏈、CH2
和CH3
區的免疫球蛋白重鏈恆定區進行融合。在一些實施方式中，包含與輕鏈結合所必需位點的第一重鏈恆定區(CH1)存在於該融合的至少一部分中。將編碼免疫球蛋白重鏈融合片段以及免疫球蛋白輕鏈(如果需要)的DNA插入不同的表達載體中並共轉染入合適的宿主生物體。在用於構建的三種多肽鏈比例不等時提供最佳產量的實施方式中，這為調整三種多肽片段的相互比例提供極大的靈活性。不過，在至少兩種多肽鏈以相同比例表達產生高產量時或比例沒有特別意義時，有可能將兩種或所有三種多肽鏈的編碼序列插入一個表達載體中。
在該方法的一個實施方式中，雙特異性抗體由一個臂中具有第一結合特異性的雜合免疫球蛋白重鏈和另一個臂中的雜合免疫球蛋白重鏈-輕鏈對(提供第二結合特異性)組成。由於免疫球蛋白輕鏈僅在雙特異性分子的一半中存在提供了便利的分離途徑，因此發現不對稱性結構便於將期望的雙特異性物質與不想要的免疫球蛋白鏈組合物分開。該方法在WO 94/04690中公開。關於產生雙特異性抗體的進一步資訊參見例如Sureshetal., Methods in Enzymology 121: 210(1986)。
根據另一種方法，可改造一對抗體分子間的介面以使從重組細胞培養物回收的異二聚體的百分比最大化。該介面包含抗體恆定區CH3結構域的至少一部分。在該方法中，將第一抗體分子介面的一個或多個小胺基酸側鏈用較大側鏈(例如酪氨酸或色氨酸)替換。通過將大胺基酸側鏈用較小胺基酸側鏈(例如丙氨酸或蘇氨酸)替換，在第二抗體分子的介面上產生與大側鏈相同或相似大小的補償性「空腔」。這提供了提高異二聚體相比於其它不想要的終產物諸如同二聚體的產量的機制。
雙特異性抗體包括交聯或「異源綴合」抗體。例如，一種異源綴合抗體可以與親合素偶聯，另一種異源綴合抗體可以與生物素偶聯。可使用任何便利的交聯方法來製備異源綴合抗體。合適的交聯劑是本領域眾所周知的，連同許多交聯技術一起在美國專利No.4,676,980中公開。
本揭露的雙特異性抗體可以由抗體片段生成。例如，可使用化學連接技術來製備雙特異性抗體。Brennanetal., Science 229: 81(1985)描述了通過蛋白水解切割完整抗體以生成F(ab')2片段的方法。將這些片段在存在二硫醇絡合劑亞砷酸鈉的情況下(用以穩定鄰近的二硫醇和防止分子間二硫鍵的形成)分解。然後將產生的Fab'片段轉變為硫代硝基苯甲酸酯(TNB)衍生物。然後將Fab'-TNB衍生物之一通過巰基乙胺的還原重新恢復成Fab'-硫醇，並與等摩爾量的另一種Fab'-TNB衍生物混合，以形成雙特異性抗體。
可以從大腸桿菌直接回收Fab'-SH片段，這些片段可化學偶聯以形成雙特異性抗體。Shalaby et al., J. Exp. Med. 175: 217-225(1992)描述了完全人源化的雙特異性抗體F(ab')2分子的生成。每個Fab'片段由大腸桿菌單獨分泌，並在體外進行定向化學偶聯以形成雙特異性抗體。
在一些實施方式中，本揭露的雙特異性抗體片段可以直接從重組細胞培養物生成和分離。例如，可以使用亮氨酸拉鍊生成雙特異性抗體(Kostelnyetal., J. Immunol. 148(5): 1547-1553(1992))。將來自Fos和Jun蛋白的亮氨酸拉鍊肽通過基因融合與兩種不同抗體的Fab'部分連接。抗體同二聚體在鉸鏈區分解以形成單體，然後重新氧化以形成抗體異二聚體。該方法也可用于生成抗體同二聚體。雙抗體技術提供了製備雙特異性抗體片段的其他機制。雙特異性抗體片段包含通過接頭相連的重鏈可變區(VH)和輕鏈可變區(VL)，接頭太短以使得同一條鏈上的兩個結構域之間不能配對。因此，迫使一個片段上的VH和VL結構域與另一個片段上的互補VL和VH結構域配對，由此形成兩個抗原結合位點。在另一實施方式中，可以通過使用單鏈Fv(sFv)二聚體構建雙特異性抗體片段。
本揭露涵蓋具有超過兩價的多價抗體，例如，可製備三特異性抗體。多價抗體可以比二價抗體更快的受到表達該抗體結合的抗原的細胞的內在化(和/或異化)。本揭露的抗體可以是可容易地通過編碼抗體多肽鏈的核酸的重組表達而生成的、具有三個或更多抗原結合位點(例如四價抗體)的多價抗體。多價抗體可包含二聚化結構域和三個或更多抗原結合位點。在一些實施方式中，二聚化結構域包含(或由其組成)Fc區或鉸鏈區。在這種情況中，抗體會包含Fc區及Fc區氨基末端的三個或更多抗原結合位點。在一些實施方式中，多價抗體包含(或由其組成)三個至大約八個抗原結合位點。在一些實施方式中，多價抗體包含四個抗原結合位點。多價抗體包含至少一條多肽鏈(例如兩條多肽鏈)，其中多肽鏈包含兩個或更多可變區。本揭露的多價抗體可進一步包含至少兩條(例如四條)輕鏈可變區多肽。本揭露的多價抗體可包含例如約兩條至約八條輕鏈可變區多肽。本揭露的輕鏈可變區多肽包含輕鏈可變區，且任選進一步包含CL結構域。
在包含CD47靶向部分和PD-L1靶向部分的雙特異性抗體中，CD47靶向部分和PD-L1靶向部分之一可以是全長抗體，並且另一個可以是包含重鏈CDR、輕鏈CDR或其組合的抗原結合片段(例如scFv)。靶向CD47和PD-L1蛋白之一的全長抗體和靶向另一蛋白的抗原結合片段可以直接或通過肽接頭以化學方式連接(例如共價連接)。抗原結合片段(例如scFv)可以直接或通過肽接頭與全長抗體的N-末端(例如全長抗體的輕鏈或重鏈的N-末端)、全長抗體的C-末端(例如全長抗體的重鏈(或Fc或CH3
結構域)的C-末端)或兩者連接。
在一個實施方式中，雙特異性抗體可以包含全長抗CD47抗體、抗PD-L1抗體的抗原結合片段(例如scFab、scFv)以及它們之間的肽接頭。在其他實施方式中，雙特異性抗體可以包含全長抗CD47抗體、抗PD-L1抗體的抗原結合片段(例如scFab、scFv)以及它們之間的肽接頭。
在一個實施方式中，雙特異性抗體中包含的scFv可以按任何順序包含重鏈可變區和輕鏈可變區。例如，雙特異性抗體中包含的scFv可以在從N-末端到C-末端的方向上包含重鏈可變區和輕鏈可變區以及任選地在它們之間的肽接頭，或者可替代地，雙特異性抗體中包含的scFv可以在從N-末端到C-末端的方向上包含輕鏈可變區和重鏈可變區以及任選地在它們之間的肽接頭。
在一些實施方式中，肽接頭可包括例如Gly、Asn和/或Ser殘基，並且還可以包括中性胺基酸，例如Thr和/或Ala。適用於肽接頭的胺基酸序列可以是相關領域中已知的那些。同時，可以在使得融合蛋白功能不受影響的這樣的限度內不同地確定肽接頭的長度。例如，肽接頭可以通過包括總共約1至約100、約2至約50、或約5至約25個選自由Gly、Asn、Ser、Thr、和Ala組成的組的一種或多種來形成。在一個實施方式中，肽接頭可以表示為(GmSl)n(m、l和n獨立地是約1至約10的整數，特別是約2至約5的整數)。
在另一個實施方式中，PD-L1靶向部分和CD47靶向部分可以均是全長抗體或包含重鏈CDR、輕鏈CDR或其組合的抗原結合片段。
在另一個實施方式中，雙特異性抗體可以是異二聚體形式，其包含第一臂和第二臂，該第一臂包括靶向CD47和PD-L1之一的一對第一重鏈和第一輕鏈，該第二臂包括靶向另一者的一對第二重鏈和第二輕鏈。
在一個實施方式中，全長抗體可以是全長免疫球蛋白形式(例如IgG、IgM、IgA、IgE或IgD，例如人IgG、人IgM、人IgA、人IgE或人IgD)，並且抗原結合片段可以選自由Fab、Fab’、F(ab’)2、Fd、Fv、scFv、scFab、單鏈抗體、sdFv等組成的組。例如，全長抗體可以是全長人IgG (人IgG1、人IgG2、人IgG3或人IgG4)形式，並且抗原結合片段可以是scFv。
例如，本文描述的抗體可以包含柔性接頭序列，或者可以被修飾以添加功能部分(例如PEG、藥物、毒素或標記)。
在一些具體的實施方式中，根據本揭露的抗CD47/抗PD-L1雙特異性抗體，所述抗CD47抗體或其抗原結合片段的結構為(VL-CL)-肽接頭-(VH)-IgG4CH，抗PD-L1抗體或其抗原結合片段的結構為(VL-CL)-肽接頭-(VH)-IgG4CH。在一些具體的實施方式中，肽接頭為(GGGGS)n形式，其中n為1-12，較佳為3-10，更佳為6-8，例如6、7、8個GGGGS重複序列。在另一些具體的實施方式中，靶向CD47部分的(VL-CL)-肽接頭-(VH)-IgG4CH中的IgG4CH為含有S228P、L235E、Y349C、T366S、L368A、Y407V突變形成「Hole」結構的IgG4 CH段，靶向PD-L1部分的(VL-CL)-肽接頭-(VH)-IgG4CH中的IgG4CH為含有S228P、L235E、T366W、S354C突變形成「Knob」結構的IgG4 CH段。在一些具體的實施方式中，靶向CD47部分的(VL-CL)-肽接頭-(VH)-IgG4CH中的VL的胺基酸序列為SEQ ID NO：33，CL的胺基酸序列為SEQ ID NO:131，VH的胺基酸序列為SEQ ID NO：30，IgG4 CH的胺基酸序列為SEQ ID NO: 133；和/或靶向PD-L1部分的(VL-CL)-肽接頭-(VH)-IgG4CH中的VL的胺基酸序列為SEQ ID NO：116，CL的胺基酸序列為SEQ ID NO:131，VH的胺基酸序列為SEQ ID NO：112，IgG4 CH的胺基酸序列為SEQ ID NO: 132。在另一些具體的實施方式中，靶向CD47部分的(VL-CL)-肽接頭-(VH)-IgG4CH中的VL的胺基酸序列為SEQ ID NO：33，CL的胺基酸序列為SEQ ID NO: 131，VH的胺基酸序列為SEQ ID NO：30，IgG4 CH的胺基酸序列為SEQ ID NO:133；和/或靶向PD-L1部分的(VL-CL)-肽接頭-(VH)-IgG4CH中的VL的胺基酸序列為SEQ ID NO：126，CL的胺基酸序列為SEQ ID NO:131，VH的胺基酸序列為SEQ ID NO：123，IgG4 CH的胺基酸序列為SEQ ID NO: 132。
本揭露的另一方面提供抗PD-L1抗體或其抗原結合片段，其包含重鏈可變區和輕鏈可變區，其中：
(1)重鏈可變區包含選自如下組的CDR1、CDR2和CDR3：
(A1)如SEQ ID NO:75、76和77所示的胺基酸序列；
(A2)如SEQ ID NO:81、82和83所示的胺基酸序列；
(A3)如SEQ ID NO:87、88和89所示的胺基酸序列；和
(A4)如SEQ ID NO:93、94和95所示的胺基酸序列；
(A5)與(A1)、(A2)、(A3)或(A4)所示的胺基酸序列具有至少85%序列相似性的胺基酸序列；和
(2)輕鏈可變區包含選自如下組的CDR1、CDR2和CDR3：
(A6)如SEQ ID NO:78、79和80所示的胺基酸序列；
(A7)如SEQ ID NO:84、85和86所示的胺基酸序列；
(A8)如SEQ ID NO:90、91和92所示的胺基酸序列；
(A9)如SEQ ID NO:96、97和98所示的胺基酸序列；
(A10)與(A6)、(A7)、(A8)或(A9)所示的胺基酸序列具有至少85%序列相似性的胺基酸序列。
在一些實施方式中，根據本揭露的抗PD-L1抗體或其抗原結合片段，其中抗PD-L1抗體或其抗原結合片段包含：
CDR1、CDR2和CDR3分別為SEQ ID NO:75、76和77或與SEQ ID NO:75、76和77所示的胺基酸序列具有至少85%序列相似性的胺基酸序列的重鏈可變區，和CDR1、CDR2和CDR3分別為SEQ ID NO:78、79和80或與SEQ ID NO:78、79和80所示的胺基酸序列具有至少85%序列相似性的胺基酸序列的輕鏈可變區；
CDR1、CDR2和CDR3分別為SEQ ID NO:87、88和89或與SEQ ID NO:87、88和89所示的胺基酸序列具有至少85%序列相似性的胺基酸序列的重鏈可變區，和CDR1、CDR2和CDR3分別為SEQ ID NO:90、91和92或與SEQ ID NO:90、91和92所示的胺基酸序列具有至少85%序列相似性的胺基酸序列的輕鏈可變區；或者
CDR1、CDR2和CDR3分別為SEQ ID NO:93、94和95或與SEQ ID NO:93、94和95所示的胺基酸序列具有至少85%序列相似性的胺基酸序列的重鏈可變區，和CDR1、CDR2和CDR3分別為SEQ ID NO:96、97和98或與SEQ ID NO:96、97和98所示的胺基酸序列具有至少85%序列相似性的胺基酸序列的輕鏈可變區。
在一些實施方式中，根據本揭露的抗PD-L1抗體或其抗原結合片段，其中：
(1)重鏈可變區的胺基酸序列選自：
(B1)如SEQ ID NO:99、100、101、102、110、111、112、113、114、119、120、121、122和123所示的胺基酸序列；
(B2)及(B1)所示的胺基酸序列經取代、缺失或添加一個或多個胺基酸獲得的、且與(B1)所示的胺基酸序列功能相同或相似的胺基酸序列；和
(B3)與(B1)所示的胺基酸序列具有至少80%序列相似性的胺基酸序列；和
(2)輕鏈可變區的胺基酸序列選自：
(B4)如SEQ ID NO:103、104、105、106、115、116、117、118、124、125、126所示的胺基酸序列；
(B5)及(B4)所示的胺基酸序列經取代、缺失或添加一個或多個胺基酸獲得的、且與(B4)所示的胺基酸序列功能相同或相似的胺基酸序列；和
(B6)與(B4)所示的胺基酸序列具有至少80%序列相似性的胺基酸序列。
在一些實施方式中，根據本揭露的抗PD-L1抗體或其抗原結合片段，其中：
重鏈可變區的胺基酸序列為SEQ ID NO:110、111、112、113或114所示的胺基酸序列，SEQ ID NO:110、111、112、113或114經取代、缺失或添加一個或多個胺基酸獲得的且與SEQ ID NO:110、111、112、113或114功能相同的胺基酸序列或與SEQ ID NO:110、111、112、113或114具有至少85%序列相似性的胺基酸序列，且輕鏈可變區的胺基酸序列為SEQ ID NO:115、116、117或118，SEQ ID NO:115、116、117或118經取代、缺失或添加一個或多個胺基酸獲得的且與SEQ ID NO:115、116、117或118功能相同的胺基酸序列或與SEQ ID NO:115、116、117或118具有至少85%序列相似性的胺基酸序列。
在一些實施方式中，根據本揭露的抗PD-L1抗體或其抗原結合片段，其中：
重鏈可變區的胺基酸序列為SEQ ID NO: 119、120、121、122或123所示的胺基酸序列，SEQ ID NO:119、120、121、122或123經取代、缺失或添加一個或多個胺基酸獲得的且與SEQ ID NO:119、120、121、122或123功能相同的胺基酸序列或與SEQ ID NO:119、120、121、122或123具有至少85%序列相似性的胺基酸序列，且輕鏈可變區的胺基酸序列為SEQ ID NO:124、125或126，SEQ ID NO:124、125或126經取代、缺失或添加一個或多個胺基酸獲得的且與SEQ ID NO:124、125或126功能相同的胺基酸序列或與SEQ ID NO:124、125或126具有至少85%序列相似性的胺基酸序列。
在一些實施方式中，根據本揭露的抗PD-L1抗體或其抗原結合片段，其中重鏈可變區的胺基酸序列為SEQ ID NO:112所示的胺基酸序列，SEQ ID NO:112經取代、缺失或添加一個或多個胺基酸獲得的且與SEQ ID NO:112功能相同的胺基酸序列或與SEQ ID NO:112具有至少85%，或至少90%，或至少95%，或至少98%序列相似性且H2CDR1、H2CDR2和H2CDR3如SEQ ID NO:75、76和77所示的胺基酸序列，且輕鏈可變區的胺基酸序列為SEQ ID NO:116，SEQ ID NO:116經取代、缺失或添加一個或多個胺基酸獲得的且與SEQ ID NO:116功能相同的胺基酸序列或與SEQ ID NO:116具有至少85%，或至少90%，或至少95%，或至少98%序列相似性且L2CDR1、L2CDR2和L2CDR3如SEQ ID NO:78、79和80所示的胺基酸序列。
在一些實施方式中，根據本揭露的抗PD-L1抗體或其抗原結合片段，其中重鏈可變區的胺基酸序列為SEQ ID NO:123所示的胺基酸序列，SEQ ID NO:123經取代、缺失或添加一個或多個胺基酸獲得的且與SEQ ID NO:123功能相同的胺基酸序列或與SEQ ID NO:123具有至少85%，或至少90%，或至少95%，或至少98%序列相似性且H2CDR1、H2CDR2和H2CDR3如SEQ ID NO: 87、88和89所示的胺基酸序列，且輕鏈可變區的胺基酸序列為SEQ ID NO:126，SEQ ID NO:126經取代、缺失或添加一個或多個胺基酸獲得的且與SEQ ID NO:126功能相同的胺基酸序列或與SEQ ID NO:126具有至少85%，或至少90%，或至少95%，或至少98%序列相似性且L2CDR1、L2CDR2和L2CDR3如SEQ ID NO:90、91和92所示的胺基酸序列。
在一些實施方式中，根據本揭露的抗PD-L1抗體或其抗原結合片段，其中抗體是人源化抗體或完全人抗體。
本揭露的另一方面提供分離的核酸。在一些實施方式中，根據本揭露的分離的核酸編碼本揭露的抗CD47/抗PD-L1抗體或抗PD-L1抗體。在一些實施方式中，根據本揭露的分離的核酸編碼本揭露的抗CD47抗體或其抗原結合片段。在另一些實施方式中，根據本揭露的分離的核酸編碼本揭露的抗PD-L1抗體或其抗原結合片段。
在一個具體的實施方式中，根據本揭露的分離的核酸，編碼第一重鏈可變區SEQ ID NO:30的核苷酸序列如SEQ ID NO:36所示，且編碼第一輕鏈可變區SEQ ID NO:33的核苷酸序列如SEQ ID NO:39所示。在另一個具體的實施方式中，根據本揭露的分離的核酸，編碼第二重鏈可變區SEQ ID NO:112的核苷酸序列如SEQ ID NO:127所示，且編碼第二輕鏈可變區SEQ ID NO:116的核苷酸序列如SEQ ID NO:129所示。在再一個具體的實施方式中，根據本揭露的分離的核酸，編碼第二重鏈可變區SEQ ID NO:123的核苷酸序列如SEQ ID NO:128所示，且編碼第二輕鏈可變區SEQ ID NO:126的核苷酸序列如SEQ ID NO:130所示。
本揭露的另一方面提供表達載體。在一些實施方式中，本揭露的表達載體表達本揭露的抗CD47/抗PD-L1雙特異性抗體或抗PD-L1抗體。在一些實施方式中，本揭露的表達載體表達本揭露的抗CD47抗體或其抗原結合片段。在另一些實施方式中，本揭露的表達載體表達本揭露的抗PD-L1抗體或其抗原結合片段。在一些實施方式中，根據本揭露的表達載體，表達本揭露的抗CD47抗體或其抗原結合片段的載體和表達本揭露的抗PD-L1抗體或其抗原結合片段的載體是同種表達載體。根據本揭露的表達載體其包含本揭露的分離的核酸分子。
本揭露的另一方面提供一種如上所述的表達載體轉化的宿主細胞。
在一些實施方式中，根據本揭露的宿主細胞選自原核細胞和真核細胞。在一些實施方式中，宿主細胞為細菌，較佳為大腸桿菌。在另一個較佳的實施方式中，的宿主細胞為哺乳動物細胞。
本揭露的另一方面提供製備本揭露的抗CD47/抗PD-L1雙特異性抗體或抗PD-L1抗體的方法，包括在宿主細胞中表達抗體以及從宿主細胞中分離抗體的步驟。
本揭露的另一方面提供一種藥物組合物，其包含本揭露的抗CD47/抗PD-L1雙特異性抗體和藥學可接受的載體。在一些實施方式中，本揭露提供藥物組合物，其包含本揭露的抗CD47/抗PD-L1雙特異性抗體，還包含其他活性組分，如其他抗體、靶向藥物等。在一些實施方式中，藥學可接受的載體選自抗氧化劑、多肽、蛋白質、親水性聚合物、胺基酸、糖、螯合劑、糖醇、離子和表面活性劑。在一個具體的實施方式中，藥學可接受的載體為緩衝水溶液。在另一個具體的實施方式中，藥學可接受的載體為脂質體的形式。
本揭露的另一方面提供一種嵌合抗原受體(CAR)融合蛋白，其包含本揭露的抗CD47抗體或其抗原結合片段和/或抗PD-L1抗體或其抗原結合片段。在一些實施方式中，嵌合抗原受體融合蛋白包含本揭露的抗CD47抗體或其抗原結合片段，其為針對CD47抗原的VH和VL的單鏈可變片段(scFv)。在另一些實施方式中，嵌合抗原受體融合蛋白包含本揭露的抗PD-L1抗體或其抗原結合片段，其為針對PD-L1抗原的VH和VL的單鏈可變片段(scFv)。在另一些實施方式中，嵌合抗原受體融合蛋白包含針對CD47抗原的VH和VL的第一單鏈可變片段(scFv)和針對PD-L1抗原的VH和VL的第二單鏈可變片段(scFv)。針對CD47抗原的VH和VL的第一scFv具有以上實施方式中描述的第一重鏈可變區的H1CDR1、H1CDR2和H1CDR3和第一輕鏈可變區的L1CDR1、L1CDR2和L1CDR3。針對PD-L1抗原的VH和VL的第二scFv具有以上實施方式中描述的第二重鏈可變區的H2CDR1、H2CDR2和H2CDR3和第二輕鏈可變區的L2CDR1、L2CDR2和L2CDR3。
可以將本揭露的抗CD47/抗PD-L1雙特異性抗體與藥學上可接受的載體、稀釋劑或賦形劑混合製備成藥物製劑，以適合於經口或胃腸外給藥。給藥方法包括，但不限於經口、皮內、肌內、腹膜內、靜脈內、腦內、眼內、氣管內、皮下、鼻內途徑。製劑可以通過任何途徑施用，例如通過輸注或推注，通過經上皮或皮膚粘膜(例如口腔粘膜或直腸等)吸收的途徑施用。給藥可以是全身的或局部的。製劑可通過本領域已知的方法製備，且包含藥物製劑領域常規使用的載體、稀釋劑或賦形劑。
本揭露的另一方面提供治療和/或預防與CD47、PD-L1或兩者相關的疾病的方法，方法包括向有此需要的個體施用本揭露的抗CD47/抗PD-L1雙特異性抗體或本揭露的藥物組合物。
本揭露的另一方面提供本揭露的抗CD47/抗PD-L1雙特異性抗體或抗PD-L1抗體或本揭露的藥物組合物在製備治療和/或預防與CD47、PD-L1或兩者相關的疾病的藥物中的應用。在一些實施方式中，所述與CD47、PD-L1或兩者相關的疾病包括血液腫瘤、淋巴瘤、乳腺癌、肺癌、胃癌、腸癌、食管癌、卵巢癌、宮頸癌、腎癌、膀胱癌、胰腺癌、神經膠質瘤和/或黑素瘤。所述腫瘤可以是任何表達PD-L1蛋白的腫瘤，例如膀胱癌、肝癌、結腸癌、直腸癌、子宮內膜癌、白血病、淋巴瘤、胰腺癌、肺癌(例如小細胞肺癌、非小細胞肺癌等)、乳腺癌、尿道癌、頭頸癌、胃腸癌、胃癌、食道癌、卵巢癌、腎癌、黑素瘤、前列腺癌、甲狀腺癌等。所述腫瘤可以是原發性或轉移性腫瘤。在一些實施方式中，本揭露提供上述抗CD47/抗PD-L1雙特異性抗體或本揭露的藥物組合物在製備抗腫瘤的藥物中的應用，例如所述腫瘤選自血液腫瘤、淋巴瘤、乳腺癌、肺癌、胃癌、腸癌、食管癌、卵巢癌、宮頸癌、腎癌、膀胱癌、胰腺癌、神經膠質瘤和黑素瘤。
本揭露提供的抗CD47/抗PD-L1雙特異性抗體具有顯著的抗腫瘤作用，可明顯抑制腫瘤生長，且不具有明顯的紅細胞毒性，人源化後的抗體免疫原性大大降低，有效消除人體免疫系統對外源性單抗的排異反應，可在製備用於治療各類腫瘤疾病的藥物中應用，具有廣闊的市場前景。
定義
除非另有定義，本文中使用的科學和技術術語的含義是本領域技術人員所通常理解的含義。本文中所述的細胞和組織培養、分子生物學以及蛋白質和寡或多核苷酸化學及雜交中使用的命名和技術是本領域公知且普遍使用的。對於重組DNA、寡核苷酸合成和組織培養與轉化(如電穿孔、脂質轉染)，使用了標準技術。酶促反應和純化技術根據生產商的說明書或本領域普遍使用或本文所述的方法進行。前述技術和方法通常根據本領域公知且本說明書中引用和討論的多部綜合和較具體的文獻中描述的那樣使用。參見例如Sambrook等，MolecµLar Cloning: A Laboratory Manual) (第2版，Cold Spring Harbor Laboratory Press，紐約冷泉港(1989))。本文所述的分析化學、合成有機化學以及醫學和藥學化學中使用的命名以及實驗室方法和技術是本領域公知且普遍使用的。
在本揭露中，術語「至少80%序列相似性」是指至少80%，81%，82%，83%，84%，85%，86%，87%，88%，89%，90%，91%，92%，93%，94%，95%，96%，97%，98%，99%，100%的序列相似性。在本揭露中，術語「至少85%序列相似性」是指至少85%，86%，87%，88%，89%，90%，91%，92%，93%，94%，95%，96%，97%，98%，99%，100%的序列相似性。在一些優選的實施方式中，本揭露所述的序列相似性可以至少為90%，91%，92%，93%，94%，95%，96%，97%，98%，99%，100%。兩個序列之間的序列比較和相似性百分比測定可以通過National Center For Biotechnology Instutute網站上的BLASTN/BLASTP演算法來進行。
在抗體分子中，輕鏈的三個高變區和重鏈的三個高變區在三維空間中以相對彼此的位置排列以形成抗原結合表面。抗原結合表面與所結合抗原的三維表面互補，且每條重鏈和輕鏈的三個高變區均被稱作「互補決定區」或「CDR」。胺基酸向每個結構域的分配是根據Kabat《免疫學感興趣的蛋白質的序列》(國立衛生研究院，馬裡蘭州貝塞斯達(1987和1991))或Chothia和Lesk，J.Mol.Biol.196:901-917(1987)，Chothia等，Nature 342:878-883(1989)定義。
本揭露的「抗體」是指特異性地識別並結合抗原的多肽或多肽複合物。抗體可以是完整抗體和其任何抗原結合片段或單鏈。本揭露的「抗體」包括含有Ig分子的具有結合抗原的生物活性的至少一部分的任何蛋白質或肽。本揭露「抗體」的實例包括但不限於重鏈或輕鏈的CDR或其配體結合部分、重鏈或輕鏈可變區、重鏈或輕鏈恆定區、框架區或其任何部分。
本揭露所述的「抗原結合片段」包括具有抗原結合活性的Fab片段、Fab’片段、F(ab’)2片段及與人CD47或PD-L1結合的Fv片段、scFv片段。Fv片段含有抗體第一重鏈可變區和第一輕鏈可變區，但沒有恆定區，並具有全部抗原結合位元元點的最小抗體片段。一般地，Fv抗體還包含在VH和VL結構域之間的多肽接頭，且能夠形成抗原結合所需的結構。也可以用不同的連接物將兩個抗體可變區連接成一條多肽鏈，稱為單鏈抗體或單鏈Fv (scFv)。本揭露的抗CD47或抗PD-L1抗體可以是單鏈可變區片段(scFv)，其源自抗體的單鏈多肽，保留了結合抗原的能力。scFv的實例包括通過重組DNA技術形成的抗體多肽，其中免疫球蛋白重鏈(H鏈)和輕鏈(L鏈)片段的Fv區經由間隔序列連接。製備scFv的各種方法是本領域技術人員所熟知的。
本揭露所述的抗體指免疫球蛋白分子或其免疫活性部分，即包含特異性結合抗原(與其免疫反應)的抗原結合位點的分子。「特異性結合」指抗體與抗原的一種或多種抗原決定簇反應而不與其他多肽反應或以很低的親和性(Kd＞10-6)結合其他多肽。抗體包括但不限於多株、單株、嵌合、dAb(結構域抗體)、單鏈、Fab、Fab’和F(ab’)2片段、Fv、scFv及Fab表達文庫。單株抗體(mAb)是由單一的選殖細胞株得到的抗體，所述的細胞株不限於真核的、原核的或噬菌體的選殖細胞株。單株抗體或抗原結合片段可以用如雜交瘤技術、重組技術、噬菌體展示技術及合成技術如CDR grafting或其它現有技術進行重組得到。
本揭露所述的「鼠源抗體」為根據本領域知識和技能製備的對人CD47的單株抗體。製備時用CD47抗原注射試驗物件，然後分離表達具有所需序列或功能特性的抗體的雜交瘤。
本揭露所述的「嵌合抗體」是將鼠源性抗體的可變區與人抗體的恆定區融合而成的抗體，可以減輕鼠源性抗體誘發的免疫應答反應。建立嵌合抗體，要先建立分泌鼠源性特異性單抗的雜交瘤，然後從小鼠雜交瘤細胞中選殖可變區基因，再根據需要選殖人抗體的恆定區基因，將小鼠可變區基因與人恆定區基因連接成嵌合基因後插入人載體中，最後在真核工業系統或原核工業系統中表達嵌合抗體分子。
本揭露所述的「人源化抗體」也稱為CDR移植抗體，是將小鼠的CDR序列移植到人的抗體可變區框架(FR)中產生的抗體。此類可變區框架序列可以從公共的DNA資料庫或公開的參考文獻獲得，例如從ImMunoGeneTics (IMGT)網站http://imgt.cines.fr得到或從免疫球蛋白雜誌，2001ISBN012441351上獲得。
本揭露所述的「雙特異性抗體」指對至少兩種不同抗原具有結合特異性的單株抗體。
本揭露所述的「肽接頭」可以是包括1至10，特別是2至50個任何胺基酸的那些，並且可以包括任何種類的胺基酸而沒有任何限制。
下面代表性的實施例是為了更好地說明本揭露，而非用於限制本揭露的保護範圍。以下實施例中未注明條件的實驗方法通常按照常規條件，如冷泉港的抗體技術實驗手冊、分子選殖手冊等，或按照原料或商品製造廠商所建議的條件進行。實施例中使用的材料、試劑如無特殊說明均為商購獲得。
實施例1:CD47抗原蛋白及抗CD47陽性對照抗體的製備
1、抗原蛋白及陽性對照抗體的表達載體構建
(1)抗原蛋白的表達載體構建
合成編碼CD47蛋白全長的基因片段，胺基酸序列設計如SEQ ID NO:41所示，然後選殖到真核表達質粒pTargeT上，獲得其表達質粒pTargeT-CD47。
融合人源CD47蛋白胞外區胺基酸序列與hIgG1-Fc或his標籤胺基酸序列，胺基酸序列設計分別如SEQ ID NO:42和SEQ ID NO:43所示。對上述胺基酸序列進行密碼子優化後合成帶有標籤的CD47蛋白胞外區基因片段CD47-hFc、CD47-his，並將其分別選殖至真核表達質粒pHR中，獲得其表達質粒pHR-CD47-hFc、pHR-CD47-his。
融合人源CD47蛋白胞外區胺基酸序列與mIgG1-Fc胺基酸序列，胺基酸序列設計如SEQ ID NO:44所示。對該胺基酸序列進行密碼子優化後合成完整的表達質粒pcDNA3.1(+)-TPA-CD47-mIgG1-Fc。
SIRPα的序列如SEQ ID NO:45所示，對所述序列進行密碼子優化後合成完整的表達質粒pcDNA3.1(+)-SIRPα-myc-His。
(2)陽性對照抗體的表達載體構建
使用專利申請WO2013/119714中公開的抗體AB6.12-IgG4P (本文簡稱AB06.12-4P)作為陽性對照抗體，AB06.12-4P的胺基酸序列如下所示：
AB06.12-4P重鏈胺基酸序列：SEQ ID NO:46；
AB06.12-4P輕鏈胺基酸序列：SEQ ID NO:47。
對上述抗體序列所對應的胺基酸序列進行密碼子人工優化，獲得陽性對照抗體AB06.12-4P的重鏈及輕鏈表達質粒pcDNA3.1(+)-SHC025-hG4、pcDNA3.1(+)-SHC025-hk。並將其重鏈基因片段選殖到含有IgG4輕鏈恆定區的真核表達質粒pHR上，獲得AB06.12-4P的重鏈真核表達質粒pHR-SHC025-hG4-4PE，其輕鏈表達質粒為pcDNA3.1(+)-SHC025-hk。
2、抗原蛋白及陽性對照抗體的表達與純化
(1)抗原蛋白的穩轉細胞株的構建
將真核表達質粒pTargeT-CD47在160V電壓，15msec的方形脈衝下以電轉的方式轉染到CHO-K1細胞(中國科學院上海細胞生物學研究所)，置37°C，5% CO2
的培養箱中培養。24hr後採用含500 µg/mL G418的培養基加壓培養。16天後採用FACS檢測pool陽性率，將電轉質粒後的細胞鋪板(1x106
個/ml的細胞密度，100µl/孔)，採用PE mouse anti-human CD47抗體(BD，556046)與細胞孵育，以流式細胞儀(BD，FACSJazz)讀取585 nm波長下mean值，使用GraphPad 進行資料分析。將陽性細胞株進行亞選殖，挑選出選殖化(cloning)的CHO-K1細胞株，該細胞株高水準表達CD47分子，命名為CHO-K1-E5。
(2)標籤抗原蛋白及陽性對照抗體的表達
在1L細胞培養瓶中接種密度為0.5 x 106
個細胞/ml的293F細胞，加入新鮮的預熱的FreeStyle 293表達培養基，使接種後總體積達到250mL，置37°C，8% CO2
，加濕的CO2
培養箱中培養過夜。取8.5 mL FreeStyle 293表達培養基，加入1 mg/ml的PEI溶液500 µL，混合均勻，取250µg待轉染質粒加入8.5 mL FreeStyle 293表達培養基中，混合均勻，其中標籤抗原蛋白質粒pHR-CD47-hFc、pHR-CD47-his、pcDNA3.1(+)-TPA-CD47-mIgG1-Fc、pcDNA3.1(+)-SIRPα-myc-His分別轉染；陽性對照抗體AB06.12-4P重鏈質粒pHR-SHC025-hG4-4PE和輕鏈質粒pcDNA3.1(+)-SHC025-hk共同轉染。將PEI與FreeStyle 293表達培養基的混合溶液加入到質粒中，混合均勻，然後加入細胞培養物中，置37°C，8% CO2
，加濕的CO2
培養箱中培養。在細胞轉染後第1天和第3天對細胞進行補料，每瓶加入2.5 mL的穀氨醯胺(母液濃度為200 mM)和5 mL的葡萄糖(母液濃度為180 g/L)。當細胞細胞活力降至65%~75%時，收集細胞上清。將細胞培養物1500 rpm離心5 min，收集上清，再8000 rpm離心20 min，收集上清。
(3)親和層析柱純化
利用AKTA(GE，AKTA pure-150)根據蛋白性質採用不同的親和層析柱進行純化(不同蛋白適配的親和層析柱見表1)，具體純化步驟如下：
表1 不同蛋白適配的親和層析柱
清洗：超純水清洗設備及管路2 min，流速10 mL/min，後用0.1 M NaOH清洗層析系統；
接柱：將層析柱接入層析設備，並用超純水沖洗5 min；後0.1 M NaOH沖洗30min，保留時間5 min；
平衡：20 mM PB+0.15M NaCl，pH 7.2 平衡5個CV(柱體積)；
上樣：將細胞表達上清上樣，保留時間5 min；
後平衡：20 mM PB+ 0.15M NaCl，pH 7.2 平衡5個CV；
洗脫：50 mM醋酸，pH =3.4洗脫，保留時間5 min。UV280至50 mAu左右時開始收集，降至50 mAu左右時停止收集。用1 M Tris-HCl，pH 9.0將樣品pH調節至7.0；
再平衡：20 mM PB+ 0.15M NaCl，pH 7.2 平衡3個CV，保留時間5 min；
線上清洗：0.1 M NaOH清洗30 min，保留時間5min；
清洗保存：純化水清洗10min，後20%乙醇2個CV。
| 蛋白屬性 | 適配柱子 | 品牌 | 型號 |
| 鼠單抗(雜交瘤)/CD47-mFc | Protein G 預裝柱 | 柏格隆 | Ezfast Protein G 4FF |
| CD47-his/ SIRPα-myc-His | NI柱預裝柱 | GE | His Trap, HP 5ml |
| CD47-hFc/嵌合抗體、人源化抗體 | Protein A 預裝柱 | GE | Hi Trap, Mabselect SuRe 5ml |
| Protein A 自裝柱 | GE | Mabselect LX 18ml |
實施例2:抗CD47單株抗體的製備
1、雜交瘤單株的製備
(1)動物免疫
採用不同標籤的抗CD47抗原蛋白與佐劑共同免疫的方法免疫SJL品系的實驗小鼠，首次抗原使用50 µg抗原，後期使用25 µg抗原免疫。
免疫佐劑可以是Quick Antibody-Mouse5W(北京博奧龍免疫技術有限公司)或Titer Max(Sigma)與CpG(金斯瑞生物科技有限合成)/Alum(thermo)佐劑間隔。將不同標籤的CD47抗原蛋白樣品逐滴加入到佐劑溶液中，邊滴加邊渦旋以充分混合，佐劑使用劑量參考說明書進行。混合均勻形成油包水的乳狀後免疫SJL小鼠。
高水準表達CD47分子的細胞系如CCRF-CEM和CHO-K1-E5也用來免疫小鼠，使之產生抗體。用胰蛋白酶消化處理正在培養的人急性淋巴白血病細胞(CCRF-CEM)和實施例1中獲得的CHO-K1-E5陽性單細胞，1000 rpm離心5 min，棄上清，用PBS重懸細胞沉澱，取樣用細胞計數儀計數，剩餘樣品1000 rpm離心5 min，棄上清，用PBS重懸細胞沉澱，計入適量的PBS以獲得1x108
個細胞/mL的細胞懸液。實驗組小鼠每只免疫1x107
個細胞。
免疫方案如表2所示：
表2 小鼠免疫方案
* i.m. 肌內注射；s.c. 皮下注射；i.p. 腹腔注射。
| 組別 | 抗原 | 佐劑 | 免疫途徑* |
| 1 | PBS | 無 | |
| 2 | CD47-his/CD47-mFc | Quick Antibody-Mouse5W | i.m. |
| 3 | CD47-his/CD47-mFc | Titer Max/CpG/Alum | s.c./i.m. |
| 4 | CD47-mFc | Quick Antibody-Mouse5W | i.m. |
| 5 | CD47-mFc | Titer Max/CpG/Alum | s.c./i.m. |
| 6 | CCRF-CEM/CHO-K1-E5 | 無 | i.p. |
(2)雜交瘤融合
脾細胞的獲取和製備：將加強免疫後的小鼠處死後浸泡75%的酒精中。解剖取出脾臟，用研磨棒研磨後，經細胞篩網過濾後製備成單細胞懸液。將脾細胞懸液2000 rpm離心5 min，棄上清。加入2 mL紅細胞裂解液，室溫裂解紅細胞2 min，加入PBS至20 mL，1500 rpm離心7 min，棄上清，重懸後進行活細胞計數。收集培養瓶中的Sp2/0細胞，1000rpm離心5min後棄上清，重懸後進行活細胞計數。按脾細胞：Sp2/0細胞=1:1的比例混合細胞，1500 rpm離心7 min後棄上清。用20 mL電轉緩衝液重懸細胞，1500 rpm 離心7 min。棄上清，重複一次。分別用適量電轉緩衝液重懸細胞，保證細胞濃度2×107
個細胞/mL左右。把細胞懸液加入9 mL 電轉融合槽中融合。融合後將細胞懸液轉入到含有20% FBS的15 mL RPMI 1640完全培養基中，室溫放置20 min。用含1×HAT、1×BIOMYC3、20% FBS的RPMI 1640培養基重懸融合細胞。按100 μL/孔將細胞懸液加到若干塊96孔細胞培養板中，保證每孔細胞量約為4×104個細胞/孔，置於37°C細胞培養箱中培養。5天後補加100 µL/孔RPMI 1640完全培養基(含20% FBS，1×HAT，1×BIOMYC-3)。
(3)雜交瘤及亞選殖上清的篩選
融合一周後，取細胞上清，通過ELISA篩選出能結合CD47-his蛋白或細胞表面CD47的雜交瘤上清，利用CD47-his篩選針對CD47而非hFc、mFc的抗體。然後利用ELISA分析雜交瘤上清阻斷CD47-SIRPα相互作用的能力。包被SIRPα-myc-his於酶標板上，加入重組人源蛋白CD47-hFc與雜交瘤上清的混合物孵育2 h，加入HRP標記的anti human IgG Fc特異性抗體(Jackson Immuno Research)孵育1 hr，利用酶標儀檢測450nm處的吸光值。將篩選獲得的具有結合能力及阻斷能力的雜交瘤母株擴大培養，進行結合活性及阻斷活性的複測，再次篩選獲得具有結合及阻斷能力的雜交瘤陽性株。
利用有限稀釋法將陽性細胞株進行亞選殖，培養一周後利用ELISA檢測亞選殖上清與CD47分子的結合活性以及阻斷CD47-SIRPα相互作用的活性，獲得3種雙陽性細胞株，分別標記為SHC025-26、SHC025-34、SHC025-58。
2、亞型的鑒定
參照鼠抗體亞型鑒定試劑盒SBA Clonotyping Systerm-C57BL/6-HRP(SouthernBiotech，貨號：5300-05B)說明書對抗體進行亞型鑒定，結果如表3所示：
表3 抗體亞型鑒定結果
| 命名 | 抗體亞型 |
| SHC025-26 | IgG1/k |
| SHC025-34 | IgG2c/k |
| SHC025-58 | IgG2b/k |
3、單株抗體的製備
根據亞選殖上清活性分析結果確定單株抗體母選殖株SHC025-26、SHC025-34、SHC025-58，將其擴大培養。培養條件是含有10%胎牛血清、1x NAEE、1x 丙酮酸鈉、1%青鏈黴素雙抗的1640培養基，待細胞匯合度大於＞80%時，進將細胞傳代擴培，待培養至約50 ml時收集上清，純化抗體。獲得抗體經SDS-PAGE凝膠電泳確定純度良好。
4、單株抗體測序
將經亞選殖操作的陽性雜交瘤細胞進行擴大培養，取適量細胞按RNeasy Plus Mini Kit (Qiagen，74134)試劑盒說明書提取總RNA，利用Prime Script 1st strand cDNA Synthesis Kit (Takara，6110A)反轉錄試劑盒合成cDNA第一條鏈。
根據小鼠抗體亞型可變區設計特異性引物(5’端含有用於與真核表達載體發生同源重組的同源臂序列)，以cDNA為範本進行抗體可變區基因的PCR擴增，從而分別獲得小鼠抗體輕鏈與重鏈可變區的基因片段；設計引物(參考文獻：1. Anke Krebber, Susanne Bornhauser, Jorg Burmester etal. Reliable cloning of functional antibody variable domains from hybridomas and spleen cell repertoires employing a reengineered phage display system. Journal of Immunological Methods, 1997, 201: 35–55;2. Simon KorenMiha KosmačAnja Colja Venturini etal. Antibody variable-region sequencing as a method for hybridoma cell-line authentication, 2008, 78: 1071–1078)，進行DNA測序獲得序列，測序結果見表4。
表4 抗CD47鼠源單株抗體序列表
| 抗體 | 重鏈可變區胺基酸序列 | 輕鏈可變區胺基酸序列 |
| SHC025-26 | SEQ ID NO:21 | SEQ ID NO:24 |
| SHC025-34 | SEQ ID NO:22 | SEQ ID NO:25 |
| SHC025-58 | SEQ ID NO:23 | SEQ ID NO:26 |
抗體SHC025-34的VH的CDR序列：CDR1、CDR2、CDR3的序列分別為SEQ ID NO: 4、5、6，VL的CDR序列：CDR1、CDR2、CDR3的序列分別為SEQ ID NO:15、16、17。
實施例3:抗CD47嵌合抗體的構建
將純化後(純化步驟見實施例1)的小鼠抗體輕鏈與重鏈可變區基因片段分別與線性化的含有人抗體輕鏈或重鏈恆定區的真核表達質粒共轉化大腸桿菌DH5α感受態細胞，將混合液均勻塗布於含有相應抗生素的瓊脂平板表面，於37°C恆溫培養箱過夜培養後分別挑取若干單菌落進行DNA測序；將測序正確的嵌合抗體分別標記為SHC025-26CHI、SHC025-34CHI、SHC025-58CHI。
將測序正確的陽性株接種於含有相應抗生素的2×YT液體培養基中，於37°C振盪培養12小時以上，然後收集菌體進行質粒提取，從而獲得嵌合抗體輕鏈與重鏈表達質粒，使用核酸定量分析儀檢測質粒的濃度與純度。
將嵌合抗體轉染HEK293E細胞，表達純化獲得大量抗體，進行純度檢測、活性分析及親和力的檢測。
測序發現，在SHC025-26的重鏈CDR第118位，以及SHC025-58的輕鏈CDR第56位各自含有一個半胱氨酸，CDR區域的半胱氨酸在表達時會與抗體分子上的其他半胱氨酸隨機配對氧化形成二硫橋，從而極大的影響抗體純度。為解決之一問題，對SHC025-26CHI、SHC025-58CHI胺基酸序列進行如下改造：將SHC025-26CHI重鏈之C118突變為T，標記為SHC025-26CHI-T；將SHC025-58CHI輕鏈之C56突變為A，標記為SHC025-58CHI-A，利用定點突變的方法構建突變基因。嵌合抗體測序結果見表5。
表5 抗CD47嵌合抗體序列表
| 嵌合抗體 | 重鏈可變區胺基酸序列 | 輕鏈可變區胺基酸序列 |
| SHC025-26CHI | SEQ ID NO:21 | SEQ ID NO:24 |
| SHC025-26CHI-T | SEQ ID NO:27 | SEQ ID NO:24 |
| SHC025-34CHI | SEQ ID NO:22 | SEQ ID NO:25 |
| SHC025-58CHI | SEQ ID NO:23 | SEQ ID NO:26 |
| SHC025-58CHI-A | SEQ ID NO:23 | SEQ ID NO:28 |
抗體SHC025-34CHI的VH的CDR序列：CDR1、CDR2、CDR3的序列分別為SEQ ID NO:4、5、6，VL的CDR序列：CDR1、CDR2、CDR3的序列分別為SEQ ID NO:15、16、17。
實施例4:抗CD47人源化抗體的構建及生產
根據嵌合抗體的活性分析、親和力KD值等結果選擇SHC025-34CHI、SHC025-58CHI-A、SHC025-26CHI-T進行人源化抗體改造。
抗體的人源化改造，首先是通過與免疫基因資料庫(IMGT)中的小鼠抗體序列進行比對，確認SHC025-34CHI、SHC025-58CHI-A、SHC025-26CHI-T抗體可變區的鼠源種系，經過同源比對，SHC025-34CHI、SHC025-58CHI-A、SHC025-26CHI-T抗體的重鏈可變區序列的FR區分別與人抗體胚系基因IGHV1-8*01、IGHV3-21*04以及IGHV1-2*02最為相似；抗體輕鏈可變區的FR序列則分別與人抗體胚系基因IGKV3-11*01、IGKV1-5*01以及IGKV4-1*01最為相似。以SHC025-34CHI/SHC025-58CHI-A抗體框架區序列FR1-FR3作為範本，在人框架區庫中尋找3D結構相似但是免疫原性較低的全人框架替代SHC025-34CHI/SHC025-58CHI-A的FR1-FR3序列，重鏈/輕鏈全長序列進行3D建模並和原抗體重鏈/輕鏈序列進行結構比對分析，綜合考慮抗原性和3D結構相似度，最終選擇SHC025-34CHI的6條人源化重鏈可變區(參見SEQ ID NO:48、49、50、51、52、53)和4條人源化輕鏈可變區(參見SEQ ID NO: 54、55、56、57)及SHC025-58CHI-A的6條人源化重鏈可變區(參見SEQ ID NO: 58、59、60、61、62、63)和5條人源化輕鏈可變區(參見SEQ ID NO: 64、65、66、67、68)進行下一步優化。SHC025-34CHI/SHC025-58CHI-A人源化抗體非CDR區序列均達到95%以上人源化。用SHC025-26CHI-T重輕鏈的可變區序列，在Protein Data Bank中進行結構比對分析，選擇最相近的FR1-FR3序列替換掉鼠源序列，並將在結構類比中顯示對抗體結構穩定起到關鍵作用的的胺基酸位點回突變為鼠源性胺基酸殘基。最終獲得SHC025-26CHI-T的4條人源化重鏈可變區(參見SEQ ID NO:69、70、71、72)和2條人源化輕鏈可變區(參見SEQ ID NO: 73、74)。
將以上設計好的人源化抗體輕鏈與重鏈可變區胺基酸序列反轉錄成相對應的核苷酸序列，並生成相鄰片段之間含有互補序列的寡核苷酸片段，通過Overlap PCR將寡核苷酸片段退火後連接起來，再利用特異性引物(5’端含有用於與真核表達載體發生同源重組的同源臂序列)擴增出完整的輕鏈與重鏈可變區核苷酸片段；將純化後的輕鏈可變區核苷酸片段與線性化的含有IgG4輕鏈恆定區的真核表達質粒共轉化大腸桿菌DH5α感受態細胞，將純化後的重鏈可變區核苷酸片段與含S228P/L235E突變的IgG4重鏈恆定區的真核表達質粒共轉化大腸桿菌DH5α感受態細胞，分別將轉化質粒的感受態細胞均勻塗布於含有相應抗生素的瓊脂平板表面，於37°C恆溫培養箱過夜培養後分別挑取若干單菌落進行DNA測序。
將測序正確的陽性株接種於含有相應抗生素的2×YT液體培養基中，於37°C振盪培養12小時以上，然後收集菌體進行質粒提取，從而獲得人源化抗體輕鏈與重鏈表達質粒，使用核酸定量分析儀檢測質粒的濃度與純度。
將質粒轉染HEK293E細胞，表達純化獲得大量抗體，進行純度檢測、活性分析及親和力的檢測。
挑選純度、活性和親和力均較好的人源化抗體，標記為Hu26T-31-PE、Hu34-39-PE、Hu58A-14-PE，序列見表6。人源化抗體來源見表7。
表6 抗CD47人源化抗體序列表
| 人源化抗體 | 胺基酸序列 | 核苷酸序列 | ||
| 重鏈可變區 | 輕鏈可變區 | 重鏈可變區 | 輕鏈可變區 | |
| Hu26T-31-PE | SEQ ID NO:29 | SEQ ID NO:32 | SEQ ID NO:35 | SEQ ID NO:38 |
| Hu34-39-PE | SEQ ID NO:30 | SEQ ID NO:33 | SEQ ID NO:36 | SEQ ID NO:39 |
| Hu58A-14-PE | SEQ ID NO:31 | SEQ ID NO:34 | SEQ ID NO:37 | SEQ ID NO:40 |
抗體Hu34-39-PE的VH的CDR序列：CDR1、CDR2、CDR3的序列分別為SEQ ID NO: 4、5、6，VL的CDR序列：CDR1、CDR2、CDR3的序列分別為SEQ ID NO:15、16、17。
表7 人源化序列設計資訊
| 重鏈人源化設計 | |
| 人源序列來源 | 重組人源化序列 |
| X62106 Homsap IGHV1-2*02 F | SEQ ID NO:29 |
| X92343 Homsap IGHV1-46*01 F | SEQ ID NO:30 |
| HM855688 Homsap IGHV3-21*04 F | SEQ ID NO:31 |
| 輕鏈人源化設計 | |
| 人源序列來源 | 重組人源化序列 |
| X97473 Homsap IGLV3-9*01 F | SEQ ID NO:32 |
| X71966 Homsap IGLV3-21*01 F | SEQ ID NO:33 |
| Z73648 Homsap IGLV4-69*01 F | SEQ ID NO:34 |
實施例5:抗CD47抗體與猴CD47結合活性測定(ELISA)
採用protein based Elisa分析抗體的結合活性。食蟹猴CD47-His(0.1 μg/孔，ACRO Biosystems，Cat.No. CD7-C52H1-50µg)包被96孔酶標板。本揭露提供的抗CD47抗體作為一抗從2 μg/mL開始，5倍梯度稀釋加入酶標板，共8個濃度，濃度分別為2000 ng/mL、400ng/mL、80 ng/mL、16 ng/mL、3.2 ng/mL、0.64 ng/mL、0.128 ng/mL、0 ng/mL，37°C孵育1.5 hr，陽性對照抗體為AB06.12-4P。二抗使用Anti-Human IgG HRP (Jackson，109-035-003，1:10000)，加入顯色液TMB(3,3',5,5'-四甲基聯苯胺)，終止後利用酶標儀(thermo，MµLtiskan FC)讀取OD450值。使用GraphPad生成EC50，結果如圖1所示。
實驗結果顯示本揭露提供的人源化抗CD47抗體Hu26T-31-PE、Hu34-39-PE、Hu58A-14-PE均具有與食蟹猴CD47結合的能力，且結合能力與陽性對照抗體AB06.12-4P相當。
實施例6:抗CD47抗體與人CD47結合活性測定(ELISA)
採用ELISA分析抗體的結合活性。將人CD47-His蛋白(0.1 µg/孔，實施例1、2中制得)包被到96孔酶標板，37°C孵育2 hr。用1xPBST清洗3次後用5%的脫脂牛奶4°C封閉過夜。用1xPBST清洗3次後，本揭露提供的抗CD47抗體作為一抗從2 μg/mL開始，5倍梯度稀釋加入酶標板，共8個濃度，濃度分別為2000 ng/mL、400 ng/mL、80 ng/mL、16 ng/mL、3.2 ng/mL、0.64 ng/mL、0.128 ng/mL、0 ng/mL，37°C孵育1.5 hr，陽性對照抗體為AB06.12-4P；用1xPBST清洗5次後，二抗使用Anti-Human IgG HRP (Jackson，109-035-003，1:10000)，37°C孵育40 min。用1xPBST清洗5次後，加入顯色液TMB，終止後利用酶標儀(thermo，MµLtiskan FC)讀取OD450值。使用GraphPad生成EC50，結果如圖2所示。
實驗結果顯示本揭露提供的人源化抗CD47抗體Hu26T-31-PE、Hu34-39-PE、Hu58A-14-PE均具有與人CD47結合的能力，且結合能力與陽性對照抗體AB06.12-4P相當。
實施例7 抗CD47抗體與細胞表面CD47結合的測定(ELISA)
採用Cell based Elisa分析抗體的結合活性。CHO-K1-E5細胞以每孔1x105個細胞的方式鋪細胞板，置於37°C，5% CO2
的條件下過夜培養；第二天用4%的多聚甲醛固定後用脫脂牛奶封閉1 hr；用1xPBS輕柔清洗細胞板；本揭露提供的抗CD47抗體作為一抗從2 μg/mL開始，5倍梯度稀釋加入細胞板，共8個濃度，濃度分別為2000 ng/mL、400 ng/mL、80 ng/mL、16 ng/mL、3.2 ng/mL、0.64 ng/mL、0.128 ng/mL、0 ng/mL，37°C孵育1.5 hr，陽性對照抗體為AB06.12-4P；二抗使用Anti-Human IgG HRP (Jackson，109-035-003，1:10000)，加入顯色液TMB，終止後利用酶標儀(thermo，MµLtiskan FC)讀取OD450值。使用GraphPad生成EC50，結果如圖3所示。
實驗結果顯示，本揭露提供的人源化抗CD47抗體Hu26T-31-PE、Hu34-39-PE、Hu58A-14-PE均可與細胞表面CD47結合，且結合能力與陽性對照抗體AB06.12-4P相當。
實施例8:抗CD47抗體與人CD47蛋白的親和力測定
利用Fortebio Octet對實施例1、2中制得的人源化抗CD47抗體結合抗原CD47(19-136)-hFC的親和力進行測定。先將抗原CD47(19-136)-hFc生物素化標記，然後用10 kD的超濾管，PBS離心超濾脫鹽3-4次，Nanodrop測定生物素標記後抗原CD47-hFc-Biotin的實際濃度。將CD47-hFc-Biotin用SD緩衝液(0.02%Tween20+0.1%BSA溶液)稀釋到濃度5 µg/ml，所述人源化抗CD47抗體用SD緩衝液4倍濃度梯度稀釋，使其濃度為10 µg/ml、2.5 µg/ml、0.625 µg/ml、0 µg/ml，選用SA感測器固化該抗原，按fortebio Octet RED96的操作規程進行親和力測定，具體參數及實驗結果如表8所示。
表8 與人CD47蛋白的親和力測定
| 抗體 | KD (M) | kon(1/Ms) | kdis(1/s) |
| Hu26T-31-PE | 5.87E-11** | 1.04E+06 | 6.13E-05 |
| Hu34-39-PE | 1.13E-10 | 6.69E+06 | 7.58E-04 |
| Hu58A-14-PE | 9.46E-11 | 1.78E+06 | 1.68E-04 |
| AB06.12-4P | 1.01E-10 | 4.80E+06 | 4.85E-04 |
實驗結果顯示，與陽性對照抗體相比，人源化抗CD47抗體Hu26T-31-PE與人CD47蛋白結合具有更高的親和力。
實施例9:抗CD47抗體的紅細胞凝集實驗
取5 mL血液加入40 mL PBS，2000 rpm輕柔離心5 min，棄上清，用PBS洗滌三次，然後用PBS重懸紅細胞，按紅細胞積壓，配製2%的紅細胞懸液。待分析抗體起始濃度為1-20 µM之間，2倍梯度稀釋，共24個濃度梯度。圓底96孔板中加入上述50 µL不同濃度抗體，然後加入50 µL上述2%的紅細胞懸液，混勻，室溫放置。2 hr後觀察是否有凝集現象。兔多株抗體RBC抗體(Rockland，109-4139)作為紅細胞凝集發生的陽性對照，結果如圖4所示。如圖4所示，96孔板從左至右加入的抗體(兔多株抗體RBC抗體、AB06.12-4P抗體及本揭露待測抗體)濃度從20 µM起始2倍梯度依次稀釋，其中RBC表示陽性對照組(使用兔多株抗體RBC抗體，顯著引起紅細胞凝集)，PBS表示空白對照組。孔中紅細胞小圓點狀，邊緣整齊表示不引起細胞凝集；邊緣略不整齊表示少量紅細胞凝集；片狀，佈滿孔底表示大部分紅細胞凝集。
經測定，專利申請WO2011/143624中公開的抗CD47抗體Hu5F9-G4在相同濃度範圍內能引起顯著的大部分紅細胞凝集，此為抗CD47抗體的普遍不良現象。而在相同的條件下，如實驗結果顯示，本揭露的Hu26T-31-PE、Hu34-39-PE、Hu58A-14-PE均不會引起紅細胞凝集現象，本揭露的抗體在此方面明顯優於抗體Hu5F9-G4。
實施例10:抗CD47抗體對CD47阻斷活性的測定
採用FACS檢測本揭露提供的抗CD47抗體阻斷SIRPa結合到細胞表面CD47的能力。
CHO-K1-E5陽性細胞株作為CD47提供者，在梯度稀釋的抗CD47抗體存在的情況下，觀察CD47與SIRPa的結合能力。二抗使用PE Streptavidin (Biolegend，405203，1:200)來監測SIRPa-Biotin的變化。AB06.12-4P作為阻斷SIRPa結合到細胞表面CD47的陽性對照。流式細胞儀(BD，FACSJazz)讀取585nm波長下mean值，使用GraphPad生成IC50，結果如圖5所示。
實驗結果顯示，阻斷活性依次排序為Hu26T-31-PE≧ Hu34-39-PE≧ AB06.12-P﹥ Hu58A-14-PE。
實施例11:抗CD47抗體在人胃癌NµGC-4移植瘤模型中抗腫瘤試驗
1、實驗材料
(1)實驗細胞及動物
NuGC-4人胃癌細胞購自美國典型培養物保藏中心(ATCC)；
NOD-Scid小鼠，雌性，5-8周齡，體重18-20克，購自上海靈暢生物科技有限公司；
(2)供試品及對照品
對照品Isotype IgG4(貨號AB170091)購自中美冠科生物技術有限公司，用作陰性對照品；
試驗前，將本揭露的人源化抗CD47抗體用PBS配製為0.6 mg/mL和0.3 mg/mL兩個濃度，Isotype IgG4和AB 06.12-4P配製為0.6 mg/mL。
(3)實驗方法
用含有10%胎牛血清，100 µg/mL的青黴素和100 µg/mL的鏈黴素的RMPI1640培養基在37ºC、5% CO2
的培養箱中培養NuGC-4人胃癌細胞。一週一次用2 mL 1×EDTA溶液消化處理傳代。當細胞飽和度為80%-90%時，收取細胞，計數，接種。將含有5×106
細胞PBS同100 µL的Matrigel混合(終體積200 μL)接種於小鼠的右後邊，接種細胞數目為5×106
/隻。待腫瘤生長至體積達150-200 mm3
時開始分組，腹腔給藥每週3次，每週三次用遊標卡尺測量腫瘤直徑，計算腫瘤體積，腫瘤體積的計算公式為：V= 0.5a×b2
，a和b分別表示腫瘤的長徑和短徑。抗體的抑瘤療效用相對腫瘤增殖率T/C (%)評價。相對腫瘤增殖率 T/C(%)：計算公式如下：T/C % = TRTV / CRTV × 100 %(TRTV：治療組RTV；CRTV：陰性對照組RTV)。RTV = V21
/ V0
，其中V0
是分組給藥時(即d0
)測量所得腫瘤體積，V21
為給藥21天測量時的腫瘤體積。將給藥組與溶媒組最後一天(day21)瘤體積用T-test進行分析，用GraphPad Prism進行。結果如表9所示。
表9 人胃癌NµGC-4移植瘤模型抗腫瘤試驗結果
*** p＜0.001 vs. Isotype IgG4; ** p＜0.005 vs. Isotype IgG4
| 抗體 | 劑量( mg/kg) | T/C (%) | p (vs. Isotype IgG4) |
| Isotype IgG4 | 6 | 86.61 | - |
| AB06.12-4P | 6 | 18.82 | ** |
| Hu26T-31-PE | 3 | 12.24 | *** |
| Hu26T-31-PE | 6 | 2.96 | *** |
| Hu34-39-PE | 3 | 15.29 | *** |
| Hu34-39-PE | 6 | 3.45 | *** |
實驗結果顯示，本揭露提供的抗體在人胃癌NuGC-4細胞接種NOD-SCID小鼠移植瘤模型中具有較顯著的抗腫瘤作用。3mg/kg劑量的Hu26T-31-PE和Hu34-39-PE與6mg/kg的參照抗體AB06.12-4P抑瘤作用相當，而6mg/kg劑量Hu26T-31-PE和Hu34-39-PE抑瘤作用優於6mg/kg參照抗體AB06.12-4P。停藥一周後，6mg/kg的參照抗體組出現腫瘤復發現象，而Hu26T-31-PE和Hu34-39-PE組無復發現象(圖6、圖7)。提示本揭露提供的抗CD47抗體出乎意料的具有更加顯著抑制腫瘤生長的作用。
實施例12:抗人PD-L1抗體的獲得
1.動物免疫
採用mFc標籤的PD-L1抗原蛋白(購於北京百普賽斯生物科技有限公司)與佐劑共同免疫的方法免疫BALB/c、SJL品系的實驗小鼠和SD品系的實驗大鼠。
免疫佐劑首次是Freund’s Adjuvant, Complete (SIGMA, F5881-10ML)，後期用Freund’s Adjuvant, Incomplete (SIGMA, F5506-10ML)。將不同標籤的PD-L1抗原蛋白樣品逐滴加入到佐劑溶液中，邊滴加邊渦旋以充分混合，佐劑使用劑量參考說明書進行。混合均勻形成油包水的乳狀後免疫小鼠或大鼠。免疫方案如表10所示：
表10 免疫方案
* i.m. 肌內注射
| 組別 | 品系 | 抗原 | 佐劑 | 劑量 | 免疫途徑* |
| 1 | BALB/c | PBS | 無 | ||
| 2 | BALB/c | PD-L1-mFc | Freund’s Adjuvant, Complete(首次) Freund’s Adjuvant, Inomplete | 50 μg 25 μg | i.m. |
| 3 | SJL | PBS | 無 | ||
| 4 | SJL | PD-L1-mFc | Freund’s Adjuvant, Complete(首次) Freund’s Adjuvant, Inomplete | 50 μg 25 μg | i.m. |
| 5 | SD | PBS | 無 | ||
| 6 | SD | PD-L1-mFc | Freund’s Adjuvant, Complete(首次) Freund’s Adjuvant, Inomplete | 100 μg 50 μg | i.m. |
2.細胞融合
無菌取小鼠脾臟並製成細胞懸液，按脾細胞：Sp2/0細胞=1:1的比例進行細胞融合。將融合後的細胞懸液轉入到含有20% FBS的15 mL RPMI 1640完全培養基中，室溫放置20 min。用含1×HAT、1×BIOMYC3、20%FBS的RPMI 1640培養基重懸融合細胞。按100 μl/孔將細胞懸液加到若干塊96孔細胞培養板中，保證每孔細胞量約為4×104
個細胞/孔，置於37°C細胞培養箱中培養。5天後補加100 µL/孔RPMI 1640完全培養基(含20% FBS，1×HAT，1×BIOMYC-3)。
3.陽性株篩選
融合一周後，取細胞上清，通過ELISA篩選出具有結合及阻斷能力的雜交瘤母株細胞並進行擴大培養，複測結合活性及阻斷活性，再次篩選獲得具有結合及阻斷能力的雜交瘤陽性細胞株。利用有限稀釋法將陽性細胞株進行亞選殖，培養一周後用ELISA檢測亞選殖上清與PD-L1分子的結合活性以及阻斷PD-L1/PD-1相互作用的活性，獲得PL-7、PL-15、PL-16、PL-18四株優選雙陽性細胞株。
4.抗PD-L1抗體可變區序列的獲得
將經亞選殖操作的陽性雜交瘤細胞進行擴大培養，取適量細胞按RNeasy Plus Mini Kit (Qiagen，74134)試劑盒說明書提取總RNA，利用Prime Script 1st strand cDNA Synthesis Kit (Takara，6110A)反轉錄試劑盒合成cDNA第一條鏈。
根據小鼠抗體亞型可變區設計特異性引物(5’端含有用於與真核表達載體發生同源重組的同源臂序列)，以cDNA為範本進行抗體可變區基因的PCR擴增，從而分別獲得小鼠抗體輕鏈與重鏈可變區的基因片段，命名為SHS009PL-7、SHS009PL-15、SHS009PL-16、SHS009PL-18；設計引物(參考文獻：1. Anke Krebber, Susanne Bornhauser, Jorg Burmester etal. Reliable cloning of functional antibody variable domains from hybridomas and spleen cell repertoires employing a reengineered phage display system. Journal of Immunological Methods, 1997, 201: 35–55; 2. Simon KorenMiha KosmačAnja Colja Venturini etal. Antibody variable-region sequencing as a method for hybridoma cell-line authentication, 2008, 78: 1071–1078)，進行DNA測序獲得序列，測序結果見表11。
表11 抗PD-L1鼠源單株抗體序列表
| 抗體 | 重鏈可變區胺基酸序列 | 輕鏈可變區胺基酸序列 | H2CDR1/H2CDR2/H2CDR3 | L2CDR1/L2CDR2/L2CDR3 |
| SHS009PL-7 | SEQ ID NO：99 | SEQ ID NO：103 | SEQ ID NO: 75、76和77 | SEQ ID NO: 78、79和80 |
| SHS009PL-15 | SEQ ID NO：100 | SEQ ID NO：104 | SEQ ID NO:81、82和83 | SEQ ID NO: 84、85和86 |
| SHS009PL-16 | SEQ ID NO：101 | SEQ ID NO：105 | SEQ ID NO: 87、88和89 | SEQ ID NO: 90、91和92 |
| SHS009PL-18 | SEQ ID NO：102 | SEQ ID NO：106 | SEQ ID NO:93、94和95 | SEQ ID NO: 96、97和98 |
5.嵌合抗體的構建
將純化後的小鼠抗體輕鏈與重鏈可變區基因片段分別與線性化的含有人抗體輕鏈或重鏈恆定區基因片段的真核表達質粒共轉化大腸桿菌DH5α感受態細胞，挑取測序正確的嵌合抗體分別標記為PL-7CHI、PL-15CHI、PL-16CHI、PL-18CHI，嵌合抗體測序結果見表12。
PL-7CHI、PL-15CHI、PL-16CHI、PL-18CHI輕重鏈可變區胺基酸序列，分別同鼠源性抗體SHS009PL-7、SHS009PL-15、SHS009PL-16、SHS009PL-18輕重鏈可變區胺基酸序列一致。
提取嵌合抗體輕鏈質粒與重鏈質粒轉染HEK 293F細胞，表達純化獲得大量抗體，進行純度檢測、活性分析及親和力的檢測。
表12 抗PD-L1嵌合抗體序列表
| 嵌合抗體 | 重鏈可變區胺基酸序列 | 輕鏈可變區胺基酸序列 |
| PL-7CHI | SEQ ID NO：99 | SEQ ID NO：103 |
| PL-15CHI | SEQ ID NO：100 | SEQ ID NO：104 |
| PL-16CHI | SEQ ID NO：101 | SEQ ID NO：105 |
| PL-18CHI | SEQ ID NO：102 | SEQ ID NO：106 |
6.抗PD-L1抗體人源化改造
根據嵌合抗體的活性分析、親和力KD值等結果選擇PL-7CHI、PL-16CHI進行人源化抗體改造。
鼠源單株嵌合抗體PL-7CHI、PL-16CHI的人源化參照經典的CDR移植策略進行，以PL-7CHI、PL-16CHI抗體框架區序列FR1-FR3作為範本，在人框架區庫中尋找3D結構相似但是免疫原性較低的全人框架替代PL-7CHI/PL-16CHI的FR1-FR3序列。經同源比對分析，PL-7CHI、PL-16CHI抗體重鏈可變區FR區分別與人抗體種系基因M99683|IGHV4-31*02 (SEQ ID NO:107)、X62109|IGHV1-3*01 (SEQ ID NO: 108)最為相似，PL-7CHI、PL-16CHI抗體輕鏈可變區FR區與人抗體種系基因Z00023|IGKV4-1*01(SEQ ID NO:109)最為相似。人源化後的重鏈/輕鏈全長序列進行3D建模並和原抗體重鏈/輕鏈序列進行結構比對分析，綜合考慮抗原性和3D結構相似度，並將在結構類比中顯示對抗體結構穩定起到關鍵作用的的胺基酸位點回突變為鼠源性胺基酸殘基。最後得到PL-7CHI人源化重鏈5條(PL-7CHI人源化重鏈可變區序列：VH1-0 (SEQ ID NO:110)、VH1-1(SEQ ID NO:111)、VH1-2(SEQ ID NO:112)、VH1-3(SEQ ID NO:113)或VH1-4(SEQ ID NO:114))、人源化輕鏈4條(PL-7CHI人源化輕鏈可變區序列：VL1-0 (SEQ ID NO:115)、VL1-1(SEQ ID NO:116)、VL1-2(SEQ ID NO:117)或VL1-3(SEQ ID NO:118))；PL-16CHI人源化重鏈5條(PL-16CHI人源化重鏈可變區序列：VH1-0 (SEQ ID NO:119)、VH1-1(SEQ ID NO:120)、VH1-2(SEQ ID NO:121)、VH1-3(SEQ ID NO:122)或VH1-4(SEQ ID NO:123))、人源化輕鏈3條(PL-16CHI人源化輕鏈可變區序列：VL1-0 (SEQ ID NO:124)、VL1-1(SEQ ID NO:125)或VL1-2(SEQ ID NO:126))。在此基礎上，通過不同的輕重鏈組合，我們得到了多個人源化抗體。經活性檢測後，確定其中評分最高的抗PD-L1人源化抗體序列分別為HuPL7-21、HuPL16-42。
實施例13:人源化抗PD-L1抗體生產
將以上設計好的人源化抗體輕鏈與重鏈可變區胺基酸序列合成相對應的核苷酸編碼序列，並生成相鄰片段之間含有互補序列的寡核苷酸片段，通過Overlap PCR將寡核苷酸片段退火後連接起來，再利用特異性引物(5’端含有用於與真核表達載體發生同源重組的同源臂序列)擴增出完整的輕鏈與重鏈可變區核苷酸片段；將純化後的輕鏈可變區核苷酸片段與線性化的含有IgG4輕鏈恆定區的真核表達質粒共轉化大腸桿菌DH5α感受態細胞，將純化後的重鏈可變區核苷酸片段與含S228P/L235E突變的IgG4重鏈恆定區的真核表達質粒共轉化大腸桿菌DH5α感受態細胞，分別將轉化質粒的感受態細胞均勻塗布於含有相應抗生素的瓊脂平板表面，於37°C恆溫培養箱過夜培養後分別挑取若干單菌落進行DNA測序。
將測序正確的陽性株進行質粒提取，從而獲得人源化抗體輕鏈與重鏈表達質粒，使用核酸定量分析儀檢測質粒的濃度與純度。
將質粒轉染HEK293 F細胞，表達純化獲得大量抗體，進行純度檢測、活性分析及親和力的檢測。序列見表13。
表13 抗PD-L1人源化抗體序列表
| 人源化抗體 | 胺基酸序列 | 核苷酸序列 | ||
| 重鏈可變區 | 輕鏈可變區 | 重鏈可變區 | 輕鏈可變區 | |
| HuPL7-21 | SEQ ID NO：112 | SEQ ID NO：116 | SEQ ID NO：127 | SEQ ID NO：129 |
| HuPL16-42 | SEQ ID NO：123 | SEQ ID NO：126 | SEQ ID NO：128 | SEQ ID NO：130 |
抗體HuPL7-21的VH的CDR序列：CDR1、CDR2、CDR3的序列分別為SEQ ID NO:75、76和77，VL的CDR序列：CDR1、CDR2、CDR3的序列分別為SEQ ID NO: 78、79和80。抗體HuPL16-42的VH的CDR序列：CDR1、CDR2、CDR3的序列分別為SEQ ID NO: 87、88和89，VL的CDR序列：CDR1、CDR2、CDR3的序列分別為SEQ ID NO: 90、91和92。
實施例14:抗CD47/PD-L1雙特異性抗體的構建、表達及純化
雙特異性抗CD47/抗PD-L1抗體表達載體的構建
運用基因工程手段構建抗CD47/抗PD-L1的雙特異性抗體，其結構形式如圖8所示：該雙特異性抗體是由兩條分別抗PD-L1和抗CD47的抗體單鏈通過異源二聚化而形成；區別於天然IgG抗體，該雙特異性抗體中抗PD-L1和抗CD47抗體的輕鏈都通過額外添加的柔性連接肽連接至抗體重鏈N端，該連接肽是含甘氨酸(G)和絲氨酸(S)殘基的GGGGS重複序列，優選包含8個GGGGS的重複序列；此外，為促進異源二聚體的形成，在上述S228P/L235E突變的基礎上，在抗PD-L1抗體單鏈的CH3 domain 再增加S354C/T366W突變，在抗CD47抗體單鏈的CH3
domain 再增加Y349C/T366S/L368A/Y407V突變。根據該結構形式，利用上述抗PD-L1抗體HuPL7-21(輕鏈可變區SEQ ID NO：116和恆定區CL SEQ ID NO: 131)或HuPL16-42(輕鏈可變區SEQ ID NO：126和恆定區CL SEQ ID NO:131)序列，通過基因合成獲得抗PD-L1的抗體單鏈的核苷酸片段，即ScFabHuPL7-21Ks或ScFabHuPL16-42Ks；利用將上述抗CD47抗體Hu34-39(輕鏈可變區SEQ ID NO：33和和恆定區CL SEQ ID NO:131)序列，通過基因合成獲得抗CD47的抗體單鏈的核苷酸片段，即ScFabHu34-39Hs。將該ScFabHuPL7-21Ks(或ScFabHuPL16-42Ks)、ScFabHu34-39Hs核苷酸片段(上下游均含有適當長度的同源臂)分別與線性化的真核表達質粒pHR共轉化大腸桿菌DH5α感受態細胞，分別將轉化質粒的感受態細胞均勻塗布於含有相應抗生素的瓊脂平板表面，於37°C恆溫培養箱過夜培養後分別挑取若干單菌落進行DNA測序。將測序正確的陽性株進行質粒提取，從而獲得ScFabHuPL7-21Ks(或ScFabHuPL16-42Ks)、ScFabHu34-39Hs表達載體。
ScFabHuPL7-21Ks序列示意圖如圖9所示，其中：
HuPL7-21VL-CL：人源化PD-L1單抗HuPL7-21輕鏈；
(GGGGS)8：8個GGGGS重複序列的柔性連接肽；
HuPL7-21VH：人源化PD-L1單抗HuPL7-21 重鏈可變區；
IgG4CH/Ks：含有S228P/L235E/S354C/T366W突變形成「Knobs」結構的IgG4 重鏈恆定區(具體序列例如SEQ ID NO:132)；
ScFabHu34-39Hs序列示意圖如圖10所示，其中：
Hu34-39VL-CL：人源化CD47單抗Hu34-39輕鏈；
(GGGGS)6：6個GGGGS重複序列的柔性連接肽；
Hu34-39VH：人源化CD47單抗Hu34-39重鏈可變區；
IgG4CH/Hs：含有S228P/L235E/Y349C/T366S/L368A/Y407V突變形成「Hole」結構的IgG4重鏈恆定區(具體序列如SEQ ID NO: 133)。
以上結構中的CL序列如SEQ ID NO: 131所示。
2.抗CD47/抗PD-L1雙特異性抗體在Expi-CHO細胞中的暫態表達
利用Expi-Fectamine CHO Transfection Kit質粒轉染試劑盒將上述的ScFabHuPL7-21Ks(或ScFabHuPL16-42Ks)和ScFabHu34-39Hs兩個表達載體共重組質粒轉染Expi-CHO細胞，在無血清培養基中培養14天後收集Expi-CHO細胞上清液，免疫印跡檢測雙特異性抗體的表達情況。其中，將由ScFabHuPL7-21Ks和ScFabHu34-39Hs兩個單鏈二聚化而形成的雙特異性抗體命名為ScFab(HuPL7-21Ks/Hu34-39Hs)，將由ScFabHuPL16-42Ks和ScFabHu34-39Hs兩個單鏈二聚化而形成的雙特異性抗體命名為ScFab(HuPL16-42Ks/Hu34-39Hs)。
3.雙特異性抗CD47/抗PD-L1抗體的純化
本揭露的雙特異性抗體在Expi-CHO細胞中表達並分泌後，採用Protein A親和層析的方法對其進行純化，具體方法如下：Protein A親和層析柱用緩衝液平衡後，將超濾器濃縮過的Expi-CHO細胞培養液上清液進行進樣，並以A280(nm)進行監測，用清洗液洗至未結合的蛋白全部被洗脫，然後用洗脫液進行洗脫，以獲得相應的雙特異性抗體。純化後的雙特異性抗體SEC-HPLC檢測純度，LC-MS檢測分子量，進行品質鑒定後用於後續的藥學研究。SEC-HPLC、LC-MS鑒定結果表明，雙抗ScFab(HuPL7-21Ks/Hu34-39Hs)和ScFab(HuPL16-42Ks/Hu34-39Hs)的純度均達到95%以上，分子量測定值與理論值匹配。
實施例15 高表達hPD-L1穩轉細胞株的構建
1.高表達hPD-L1穩轉細胞株CHO-K1-hPD-L1、Raji-hPD-L1的構建：
將含hPD-L1(人PD-L1)胞外區序列(UniProtKB-Q9NZQ7(PD-L1 Human)＞sp|Q9NZQ7|19-238，SEQ ID NO: 134)的真核表達質粒pTargeT-hPD-L1以電轉的方式轉染到CHO-K1細胞(來自中國科學院上海細胞生物學研究所)及Raji細胞(來自宜明昂科生物醫藥技術有限公司)中，置37°C，5% CO2
的培養箱中培養。24 hr後採用含500 µg/ml G418的培養基加壓培養。12天後採用FACS檢測pool陽性率，將電轉質粒後的細胞鋪板(1x106
個/mL的細胞密度，100 µL/孔)，將FITC anti-human PD-L1抗體(SINO BIOLOGICAL，10084-MMB6-F)與細胞在4°C孵育60 min，以流式細胞儀讀取FITC通道下mean值，對結果進行資料分析後，挑出陽性細胞株進行亞選殖，挑選出選殖化的CHO-K1/Raji細胞株，該細胞株高水準表達PD-L1分子，命名為CHO-K1-hPD-L1和Raji-hPD-L1。
實施例16:抗CD47/抗PD-L1雙特異性抗體ELISA體外結合與阻斷實驗
1.抗CD47/抗PD-L1雙特異性抗體PD-L1結合ELISA實驗
將人PD-L1-His蛋白(0.5µg/ml，100µL/孔)包被到96孔酶標板，37°C孵育2 hr。用1xPBST清洗3次後用5%的脫脂牛奶4°C封閉過夜，用1xPBST清洗3次。雙抗濃度從10 μg/mL開始，5倍梯度稀釋加入酶標板，37°C孵1.5 hr，對照抗體為Atezolizumab (Sino Biological，Cat:68049-H001，簡寫Ate)；用1xPBST清洗5次後，加入 HRP-Anti-Human IgG二抗(Jackson，109-035-003，1:10000)，37°C孵育40 min。用1xPBST清洗5次，加入顯色液TMB，終止後利用酶標儀(thermo，MµLtiskan FC)讀取OD450值，EC50結果如圖11所示。
實驗結果顯示，雙特異性抗體ScFab(HuPL7-21Ks/Hu34-39Hs)、ScFab(HuPL16-42Ks/Hu34-39Hs)均具有與人PD-L1結合的能力。與人PD-L1結合能力與Atezolizumab相當。
2.抗CD47/抗PD-L1雙特異性抗體與PD-1競爭ELISA實驗
採用ELISA分析抗體阻斷PD1與PD-L1結合的活性。將人PD-L1-hFC蛋白(2µg/ml，100µL/孔)包被到96孔酶標板，37°C孵育2 hr。用1xPBST清洗3次後用5%的脫脂牛奶4°C封閉過夜。用1xPBST清洗3次後，用雙特異性抗體ScFab(HuPL7-21Ks/Hu34-39Hs)或ScFab(HuPL16-42Ks/Hu34-39Hs)作為一抗從10 μg/mL開始，3倍梯度稀釋，共8個濃度，在梯度稀釋的抗PD-L1抗體存在的情況下，與1 μg/mL的PD-1-mFc共同加入酶標板37°C孵1.5 hr，對照抗體為Atezolizumab；用1xPBST清洗5次後，二抗使用Anti-Mouse IgG HRP (Jackson，109-035-003，1:10000)，37°C孵育1 hr。用1xPBST清洗5次後，加入顯色液TMB，終止後利用酶標儀讀取OD450值。結果如圖11所示。
實驗結果顯示，雙特異性抗體ScFab(HuPL7-21Ks/Hu34-39Hs)、ScFab(HuPL16-42Ks/Hu34-39Hs)均具有阻斷PD-L1與PD-1結合的能力，且阻斷能力與Atezolizumab相當。
3.抗CD47/抗PD-L1雙特異性抗體CD47結合ELISA實驗
採用ELISA分析抗體與CD47結合活性。將人CD47-His蛋白(0.5µg/ml，100µL/孔)包被到96孔酶標板，37°C 孵育2 hr。用1xPBST清洗3次後用5%的脫脂牛奶4°C封閉過夜。用1xPBST清洗3次後，本揭露提供的抗CD47/抗PD-L1雙抗濃度從50 μg/mL開始，5倍梯度稀釋加入酶標板，共8個濃度，37°C孵育1.5 hr，對照抗體為Hu34-39-PE；用1xPBST清洗5次後，二抗使用HRP-Anti-Human IgG(1:10000)，37°C孵育40 min。用1xPBST清洗5次後，加入顯色液TMB，終止後利用酶標儀(thermo，MµLtiskan FC)讀取OD450值。EC50結果如圖11所示。
實驗結果顯示，雙特異性抗體ScFab(HuPL7-21Ks/Hu34-39Hs)、ScFab(HuPL16-42Ks/Hu34-39Hs)均具有與人CD47結合的能力，結合活性均有不同程度的降低，ScFab(HuPL7-21Ks/Hu34-39Hs)結合EC50值較Hu34-39-PE的EC50值高40倍。
4.抗CD47/抗PD-L1雙特異性抗體與SIRPα競爭ELISA實驗
採用ELISA分析抗體的阻斷活性。將人CD47-His蛋白(0.4µg/ml，100µL/孔)包被到96孔酶標板，37°C孵育2 hr。用1xPBST清洗3次後用5%的脫脂牛奶4°C封閉過夜。用1xPBST清洗3次後，雙特異性抗體ScFab(HuPL7-21Ks/Hu34-39Hs)或ScFab(HuPL16-42Ks/Hu34-39Hs)作為一抗從10 μg/mL開始，3倍梯度稀釋，共8個濃度，在梯度稀釋的抗CD47抗體存在的情況下，與2 μg/mL的SIRPα-biotin共同加入酶標板37°C孵1.5 hr，對照抗體為Hu34-39-PE；用1xPBST清洗5次後，二抗使用SA-HRP (Jackson，109-035-003，1:10000)，37°C孵育1 hr。用1xPBST清洗5次後，加入顯色液TMB，終止後利用酶標儀讀取OD450值，結果如圖11所示。
實驗結果顯示，雙特異性抗體ScFab(HuPL7-21Ks/Hu34-39Hs)、ScFab(HuPL16-42Ks/Hu34-39Hs)均具有阻斷CD47與SIRPα結合的能力，且阻斷能力較Hu34-39-PE有所下降，IC50值升高約40倍。
5.抗CD47/抗PD-L1雙特異性抗體與CD80競爭ELISA實驗
採用ELISA分析抗體阻斷PD-L1與CD80結合的活性。將CD80-hFc蛋白(8µg/ml，100µL/孔)包被到96孔酶標板，4°C過夜孵育。用1xPBST清洗3次後用5%的脫脂牛奶37°C封閉2 hr。用1xPBST清洗3次後，雙特異性抗體ScFab(HuPL7-21Ks/Hu34-39Hs)或ScFab(HuPL16-42Ks/Hu34-39Hs)作為一抗從30 μg/mL開始，3倍梯度稀釋，共8個濃度，在梯度稀釋的抗PD-L1抗體存在的情況下，與PD-L1-mFc共同加入酶標板37°C孵1.5 hr，對照抗體為Atezolizumab；用1xPBST清洗5次後，二抗使用Anti-Mouse IgG HRP，37°C孵育1 hr。用1xPBST清洗5次後，加入顯色液TMB，終止後利用酶標儀讀取OD450值。結果如圖11所示。
實驗結果顯示，雙特異性抗體ScFab(HuPL7-21Ks/Hu34-39Hs)、ScFab(HuPL16-42Ks/Hu34-39Hs)均具有阻斷PD-L1與CD80結合的能力，且阻斷能力與Atezolizumab相當。
以上實驗結果表明，本揭露的雙抗可以差異性結合PD-L1/CD47，從而在保證抗腫瘤活性的同時，可能降低抗體的毒性反應，如血液方面的毒性等。
實施例17:抗CD47/抗PD-L1雙特異性抗體細胞水準的結合/阻斷實驗
1.採用FACS檢測雙特異性抗體ScFab(HuPL7-21Ks/Hu34-39Hs)、ScFab(HuPL16-42Ks/Hu34-39Hs)結合細胞表面PD-L1/CD47的能力。
CHO-K1-hPD-L1/CHO-K1-hCD47穩轉細胞株作為PD-L1/CD47提供者，將梯度稀釋的抗PD-L1/抗CD47雙抗作為一抗加入細胞板，4°C孵育1.5 hr。二抗使用PE Anti-Human IgG，4°C孵育1 hr。Atezolizumab、Hu34-39-PE作為陽性對照。流式細胞儀讀取585 nm波長下mean值和Parent值的乘積，結果如圖12所示。
實驗結果顯示，雙特異性抗體ScFab(HuPL7-21Ks/Hu34-39Hs)、ScFab(HuPL16-42Ks/Hu34-39Hs)均具有與細胞表面的人PD-L1結合能力，且結合能力與Atezolizumab相當。雙抗ScFab(HuPL7-21Ks/Hu34-39Hs)、ScFab(HuPL16-42Ks/Hu34-39Hs)與細胞表面CD47結合活性較Hu34-39-PE單抗結合活性降低，EC50升高約4倍，Emax 降低約2倍。
2.採用FACS檢測雙特異性抗體ScFab(HuPL7-21Ks/Hu34-39Hs)、ScFab(HuPL16-42Ks/Hu34-39Hs)阻斷PD-1/SIRPα結合到細胞表面的能力。
CHO-K1-hPD-L1/CHO-K1-hCD47穩轉細胞株作為PD-L1/CD47提供者，在梯度稀釋的抗PD-L1抗體/抗CD47抗體存在的情況下，觀察PD-L1與PD-1結合、CD47與SIRPα結合的能力情況。雙特異性抗體ScFab(HuPL7-21Ks/Hu34-39Hs)或ScFab(HuPL16-42Ks/Hu34-39Hs)作為一抗，梯度稀釋後，分別與1 μg/mL的PD-1-mFc、SIRPα-biotin共同加入細胞板中37°C孵1.5 hr，二抗使用PE-Anti-Mouse IgG/PE-SA。Atezolizumab作為阻斷PD-1-mFc結合到細胞表面PD-L1的陽性對照，Hu34-39-PE作為阻斷SIRPα結合到細胞表面CD47的陽性參照，結果如圖12所示。
實驗結果顯示，雙特異性抗體ScFab(HuPL7-21Ks/Hu34-39Hs)、ScFab(HuPL16-42Ks/Hu34-39Hs)均具有阻斷人PD-1與CHO-K1-PD-L1、SIRPα與CHO-K1-CD47結合的能力，且阻斷PD-1與CHO-K1-PD-L1結合的能力與Atezolizumab相當。雙抗阻斷SIRPα與CHO-K1-CD47結合的能力較Hu34-39-PE有所降低，IC50值增加3倍。
根據ELISA及FACS檢測的結果，雙抗分子ScFab(HuPL7-21Ks/Hu34-39Hs)、ScFab(HuPL16-42Ks/Hu34-39Hs)與PD-L1結合與阻斷能力與Atezolizumab一致。而雙抗分子同CD47的結合能力有所下降。ELISA檢測EC50升高約40倍，FACS檢測EC50升高約4倍，Emax 降低2倍。即雙抗分子ScFab(HuPL7-21Ks/Hu34-39Hs)、ScFab(HuPL16-42Ks/Hu34-39Hs)差異性結合PD-L1/CD47，這有助於增強雙抗的腫瘤靶向性和降低雙抗的不良反應，特別是針對紅細胞的不良反應。
實施例18:FACS檢測抗CD47/抗PD-L1雙特異性抗體與Raji-hPD-L1細胞雙結合及雙阻斷實驗
Raji-hPD-L1腫瘤細胞購自宜明昂科生物醫藥技術有限公司，Raji-hPD-L1細胞表面除了hPD-L1高表達之外，hCD47也同樣高表達，雙特異性抗體ScFab(HuPL7-21Ks/Hu34-39Hs)、ScFab(HuPL16-42Ks/Hu34-39Hs)與Raji-hPD-L1細胞表面的hPD-L1和hCD47都結合，而且也能同時阻斷CD47/SIRPα的結合和PD-1/PD-L1的結合，表現出雙臂結合及雙臂阻斷的活性。雙臂阻斷：U型板底每孔鋪2.4×105
個Raji-hPD-L1細胞，加入一抗，抗體工作濃度從2.5 μg/mL開始，2倍梯度稀釋，共9個梯度，抗原終濃度1 μg/mL的SIRPα-mFc與終濃度1 μg/mL的PD-1-mFc均勻混合，抗體50 μL與抗原50 μL每孔預混，共100 μL加入細胞孔中，於4°C孵育1.5 hr，加入二抗，200 μL cell stain buffer洗滌三遍後，加每孔0.8μL PE-anti-mouse-IgG-Fc，於4°C孵育1 hr，200 μL cell stain buffer 洗滌三次，100 μl cell stain buffer重懸，使用流式細胞儀檢測；雙臂結合：U型板底每孔鋪1.5x106
個Raji-hPD-L1細胞，加入一抗，抗體工作濃度從10 μg/mL開始，5倍梯度稀釋，共8個梯度，於4°C孵育1.5 hr，加入二抗，200 μL cell stain buffer洗滌三遍後，加每孔0.8μL PE-anti-human-IgG-Fc，於4°C孵育1 hr，200 μL cell stain buffer洗滌三次，100 μL cell stain buffer重懸，使用流式細胞儀檢測。
實驗結果如圖13所示。表明，本揭露的雙特異性抗體與雙靶點細胞均結合，且能同時阻斷雙靶點細胞表面CD47/SIRPα結合及PD-1/PD-L1結合。
實施例19:抗CD47/抗PD-L1雙特異性抗體對小鼠體內移植瘤生長抑制的檢測
NSG小鼠具有NOD、Prkdcscid、IL2rgnµLl缺失/變異特徵，是目前免疫缺陷程度最高、最適合人源細胞移植的工具小鼠，對人源細胞和組織幾乎沒有排斥反應。本揭露利用NSG小鼠(購自北京百奧賽圖基因生物技術有限公司)、Raji-hPD-L1腫瘤細胞建立腫瘤移植模型－Raji-PBMC-NSG模型，研究抗CD47/抗PD-L1雙抗分子ScFab(HuPL7-21Ks/Hu34-39Hs)在Raji-hPD-L1淋巴瘤皮下移植模型中的抗腫瘤作用。CD47單抗5F9購自Sino Biological Inc.(Cat：68063-H001)。表14為測試藥物在Raji-PBMC-NSG腫瘤模型中的抗腫瘤作用實驗設計方案。
表14 Raji-PBMC-NSG模型測試藥物實驗設計方案
a：N是指每組小鼠的數量； b：BiAb指雙抗ScFab(HuPL7-21Ks/Hu34-39Hs)
| 組別 | N | 抗體 | 小鼠品系 | 劑量(mg/kg) | 給藥容積(µL/g) | 給藥途徑 | 給藥頻次 |
| 1 | 6 | PBS | NSG | --- | 10 | i.v. | q.w×3 |
| 2 | 6 | Atezolizumab | NSG | 10 | 10 | i.v. | q.w×3 |
| 3 | 6 | Atezolizumab+5F9 | NSG | 10+10 | 10 | i.v. | q.w×3 |
| 4 | 6 | BiAb | NSG | 10 | 10 | i.v. | q.w×3 |
| 5 | 6 | BiAb | NSG | 20 | 10 | i.v. | q.w×3 |
各組的腫瘤體積隨時間的變化情況如圖14所示。本揭露的雙抗體內抑瘤效果顯著優於Atezolizumab，優於單抗聯用(Atezolizumab+5F9)。
實施例20:抗CD47/抗PD-L1雙特異性抗體食蟹猴急性毒性實驗
本實施例為本揭露的抗CD47/抗PD-L1雙特異性抗體ScFab(HuPL7-21Ks/Hu34-39Hs) (簡稱BiAb)單次靜脈輸注給予食蟹猴的毒性試驗。雙抗的給藥劑量為10、30、100 mg/kg，食蟹猴每組雌雄各1隻。抗CD47單抗Hu34-39-PE的給藥劑量為30mg/kg，Hu5F9的給藥劑量為20 mg/kg，每組2隻食蟹猴。
單次靜脈輸注，觀察週期為21天。不同時間點經股靜脈采血用於血細胞計數、凝血功能指標、血液生化指標等的檢測。
藥物安全性評價結果顯示，截止第21天，所有組無猴死亡，一般狀態觀察、攝食量、體重等各組均無異常。
給予雙抗ScFab(HuPL7-21Ks/Hu34-39Hs)的動物，RBC計數、HGB含量、RET%無變化。雙抗ScFab(HuPL7-21Ks/Hu34-39Hs)在10、30、100 mg/kg給藥劑量下，未顯示紅細胞毒性及其它血液性毒性。
給予單抗Hu5F9(20 mg/kg)的動物，RBC計數和HGB含量明顯下降，RET%明顯增加。給予單抗Hu34-39-PE (30 mg/kg)的動物，RBC計數和HGB含量有一定程度的下降，RET%也有增加，但弱於單抗Hu5F9。Hu5F9顯示出明顯的紅細胞毒性，Hu34-39-PE紅細胞毒性弱於Hu5F9。雙抗ScFab(HuPL7-21Ks/Hu34-39Hs)的紅細胞安全性顯著優於單抗Hu34-39-PE和Hu5F9。
上述實施例表明，本揭露的抗CD47/抗PD-L1雙特異性抗體分子ScFab(HuPL7-21Ks/Hu34-39Hs)差異性結合CD47和PD-L1，較好地保留了與PD-L1的結合和阻斷活性，同時沒有紅細胞毒性及其它血液性毒性，安全性優異。
實施例21:抗PD-L1抗體對小鼠體內移植瘤生長抑制的檢測
本揭露利用NSG小鼠(購自北京百奧賽圖基因生物技術有限公司，中國)、Raji-PD-L1腫瘤細胞(購自宜明昂科生物醫藥技術有限公司，中國)建立腫瘤移植模型——Raji-PBMC-NSG模型，研究本揭露的抗體在Raji-hPD-L1淋巴瘤皮下移植模型中的抗腫瘤作用。抗PD-L1陽性對照抗體為Atezolizumab(Sino Biological，Cat:68049-H001)。每組6隻小鼠。陰性對照組給予生理鹽水(PBS)。本揭露的抗PD-L1抗體HuPL7-21和Atezolizumab的給藥劑量分別為10 mg/kg。給藥途徑腹腔注射，給藥頻次為每週2次，連續給藥3周。
實驗結束，計算各組的腫瘤抑制率(TGITV)%，如表15所示。
表15 各抗體對Raji-PBMC-NSG模型小鼠腫瘤體積的影響
| 組別 | 劑量(mg/kg) | TGITV (%) |
| PBS | - | 0.00 |
| Atezolizumab | 10 | 37.40 |
| HuPL7-21 | 10 | 48.75 |
本揭露的抗PD-L1抗體HuPL7-21體內抑瘤效果顯著優於Atezolizumab。
儘管以上已經對本揭露作了詳細描述，但是本領域技術人員理解，在不偏離本揭露的精神和範圍的前提下可以對本揭露進行各種修改和改變。本揭露的權利範圍並不限於上文所作的詳細描述，而應歸屬於請求項書。
無
圖1是抗CD47人源化抗體與猴CD47結合活性測定(ELISA)結果。
圖2是抗CD47人源化抗體與人CD47結合活性測定(ELISA)結果。
圖3是抗CD47人源化抗體與細胞表面CD47結合活性測定(ELISA)結果。
圖4是紅細胞凝集實驗結果，其中RBC：陽性對照；PBS：空白對照。
圖5是FACS檢測抗CD47人源化抗體阻斷活性實驗結果。
圖6是抗CD47人源化抗體Hu34-39-PE人胃癌NµGC-4移植瘤模型抗腫瘤試驗結果。
圖7是抗CD47人源化抗體Hu26T-31-PE人胃癌NµGC-4移植瘤模型抗腫瘤試驗結果。
圖8是雙抗ScFab(HuPL7-21Ks/Hu34-39Hs)的結構示意圖。
圖9是ScFabHuPL7-21Ks序列示意圖。
圖10是ScFabHu34-39Hs序列示意圖。
圖11是雙抗ScFab(HuPL7-21Ks/Hu34-39Hs)、ScFab(HuPL16-42Ks/Hu34-39Hs)與PD-L1結合(A)、與PD-1競爭(B)、與CD47結合(C)、與SIRPα競爭(D)以及與CD80競爭(E)實驗結果。
圖12是在細胞水準雙抗ScFab(HuPL7-21Ks/Hu34-39Hs)、ScFab(HuPL16-42Ks/Hu34-39Hs)與細胞表面PD-L1結合(A)、與細胞表面CD47結合(B)以及阻斷PD-1與PD-L1結合(C)、阻斷SIRPα與CD47結合(D)的實驗結果。
圖13是雙抗ScFab(HuPL7-21Ks/Hu34-39Hs)、ScFab(HuPL16-42Ks/Hu34-39Hs)在Raji-hPD-L1細胞上的CD47/PD-L1雙結合(A、B)及CD47/PD-L1雙阻斷(B)實驗結果。
圖14是雙抗ScFab(HuPL7-21Ks/Hu34-39Hs)對小鼠體內移植瘤生長抑制實驗結果。
國內寄存資訊(請依寄存機構、日期、號碼順序註記)
無
國外寄存資訊(請依寄存國家、機構、日期、號碼順序註記)
無
Claims (17)
- 一種抗CD47/抗PD-L1抗體，其包括一抗CD47抗體或其抗原結合片段和一抗PD-L1抗體或其抗原結合片段，其中： 該抗CD47抗體或其抗原結合片段包含一第一重鏈可變區和一第一輕鏈可變區，其中： (1)該第一重鏈可變區包含一H1CDR1、一H1CDR2和一H1CDR3，其胺基酸序列分別為SEQ ID NO:4、5和6或與SEQ ID NO:4、5和6所示的胺基酸序列具有至少85%序列相似性的胺基酸序列； (2)該第一輕鏈可變區包含一L1CDR1、一L1CDR2和一L1CDR3，其胺基酸序列分別為SEQ ID NO:15、16和17或與SEQ ID NO:15、16和17所示的胺基酸序列具有至少85%序列相似性的胺基酸序列。
- 如請求項1所述的抗CD47/抗PD-L1抗體，其中該抗PD-L1抗體或其抗原結合片段包含一第二重鏈可變區和一第二輕鏈可變區，其中： (1)該第二重鏈可變區包含選自如下組的一H2CDR1、一H2CDR2和一H2CDR3： (A1)如SEQ ID NO:75、76和77所示的胺基酸序列； (A2)如SEQ ID NO:81、82和83所示的胺基酸序列； (A3)如SEQ ID NO:87、88和89所示的胺基酸序列；和 (A4)如SEQ ID NO:93、94和95所示的胺基酸序列； (A5)與(A1)、(A2)、(A3)或(A4)所示的胺基酸序列具有至少85%序列相似性的胺基酸序列；和 (2)該第二輕鏈可變區包含選自如下組的一L2CDR1、一L2CDR2和一L2CDR3： (A6)如SEQ ID NO:78、79和80所示的胺基酸序列； (A7)如SEQ ID NO:84、85和86所示的胺基酸序列； (A8)如SEQ ID NO:90、91和92所示的胺基酸序列； (A9)如SEQ ID NO:96、97和98所示的胺基酸序列； (A10)與(A6)、(A7)、(A8)或(A9)所示的胺基酸序列具有至少85%序列相似性的胺基酸序列。
- 如請求項2所述的抗CD47/抗PD-L1抗體，其中該抗PD-L1抗體或其抗原結合片段包含： 該H2CDR1、該H2CDR2和該H2CDR3分別為SEQ ID NO:75、76和77或與SEQ ID NO:75、76和77所示的胺基酸序列具有至少85%序列相似性的胺基酸序列的第二重鏈可變區，和該L2CDR1、該L2CDR2和該L2CDR3分別為SEQ ID NO: 78、79和80或與SEQ ID NO:78、79和80所示的胺基酸序列具有至少85%序列相似性的胺基酸序列的該第二輕鏈可變區； 該H2CDR1、該H2CDR2和該H2CDR3分別為SEQ ID NO:87、88和89或與SEQ ID NO:87、88和89所示的胺基酸序列具有至少85%序列相似性的胺基酸序列的第二重鏈可變區，和該L2CDR1、該L2CDR2和該L2CDR3分別為SEQ ID NO:90、91和92或與SEQ ID NO:90、91和92所示的胺基酸序列具有至少85%序列相似性的胺基酸序列的該第二輕鏈可變區； 該H2CDR1、該H2CDR2和該H2CDR3分別為SEQ ID NO:81、82和83或與SEQ ID NO:81、82和83所示的胺基酸序列具有至少85%序列相似性的胺基酸序列的第二重鏈可變區，和該L2CDR1、L2CDR2和L2CDR3分別為SEQ ID NO:84、85和86或與SEQ ID NO: 84、85和86所示的胺基酸序列具有至少85%序列相似性的胺基酸序列的該第二輕鏈可變區；或者 該H2CDR1、該H2CDR2和該H2CDR3分別為SEQ ID NO:93、94和95或與SEQ ID NO:93、94和95所示的胺基酸序列具有至少85%序列相似性的胺基酸序列的第二重鏈可變區，和該L2CDR1、該L2CDR2和該L2CDR3分別為SEQ ID NO:96、97和98或與SEQ ID NO:96、97和98所示的胺基酸序列具有至少85%序列相似性的胺基酸序列的該第二輕鏈可變區。
- 如請求項1至3中任一項所述的抗CD47/抗PD-L1抗體，其中： (1)該第一重鏈可變區的胺基酸序列選自： (b1)如SEQ ID NO:22和SEQ ID NO:30所示的胺基酸序列； (b2)及(b1)所示的胺基酸序列經取代、缺失或添加一個或多個胺基酸獲得的且與(b1)所示的胺基酸序列功能相同或相似的胺基酸序列；和 (b3)與(b1)所示的胺基酸序列具有至少80%序列相似性的胺基酸序列；和 (2)該第一輕鏈可變區的胺基酸序列選自： (b4)如SEQ ID NO:25和SEQ ID NO:33所示的胺基酸序列； (b5)及(b4)所示的胺基酸序列經取代、缺失或添加一個或多個胺基酸獲得的且與(b4)所示的胺基酸序列功能相同或相似的胺基酸序列；和 (b6)與(b4)所示的胺基酸序列具有至少80%序列相似性的胺基酸序列。
- 如請求項1至4中任一項所述的抗CD47/抗PD-L1抗體，其包括該抗PD-L1抗體或其抗原結合片段，其中： 該抗PD-L1抗體或其抗原結合片段包含一第二重鏈可變區和一第二輕鏈可變區，其中： (1)該第二重鏈可變區的胺基酸序列選自： (B1)如SEQ ID NO:99、100、101、102、110、111、112、113、114、119、120、121、122和123所示的胺基酸序列； (B2)及(B1)所示的胺基酸序列經取代、缺失或添加一個或多個胺基酸獲得的、且與(B1)所示的胺基酸序列功能相同或相似的胺基酸序列；和 (B3)與(B1)所示的胺基酸序列具有至少80%序列相似性的胺基酸序列；和 (2)該第二輕鏈可變區的胺基酸序列選自： (B4)如SEQ ID NO:103、104、105、106、115、116、117、118、124、125、126所示的胺基酸序列； (B5)及(B4)所示的胺基酸序列經取代、缺失或添加一個或多個胺基酸獲得的、且與(B4)所示的胺基酸序列功能相同或相似的胺基酸序列；和 (B6)與(B4)所示的胺基酸序列具有至少80%序列相似性的胺基酸序列。
- 如請求項1至5中任一項所述的抗CD47/抗PD-L1抗體，其中： (1)該第一重鏈可變區的胺基酸序列選自： (c1)如SEQ ID NO:30所示的胺基酸序列； (c2)及(c1)所示的胺基酸序列經取代、缺失或添加一個或多個胺基酸獲得的且與(c1)所示的胺基酸序列功能相同或相似的胺基酸序列；和 (c3)與(c1)所示的胺基酸序列具有至少80%序列相似性的胺基酸序列；和 (2)該第一輕鏈可變區的胺基酸序列選自： (c4)如SEQ ID NO:33所示的胺基酸序列； (c5)及(c4)所示的胺基酸序列經取代、缺失或添加一個或多個胺基酸獲得的且與(c4)所示的胺基酸序列功能相同或相似的胺基酸序列；和 (c6)與(c4)所示的胺基酸序列具有至少80%序列相似性的胺基酸序列。
- 如請求項1至6中任一項所述的抗CD47/抗PD-L1抗體，其包括該抗PD-L1抗體或其抗原結合片段，其中： 該抗PD-L1抗體或其抗原結合片段包含該第二重鏈可變區和該第二輕鏈可變區，其中： 該第二重鏈可變區的胺基酸序列為SEQ ID NO:110、111、112、113或114所示的胺基酸序列，SEQ ID NO:110、111、112、113或114經取代、缺失或添加一個或多個胺基酸獲得的且與SEQ ID NO:110、111、112、113或114功能相同的胺基酸序列或與SEQ ID NO:110、111、112、113或114具有至少85%序列相似性的胺基酸序列且該H2CDR1、該H2CDR2和該H2CDR3如SEQ ID NO:75、76和77所示的胺基酸序列，且該第二輕鏈可變區的胺基酸序列為SEQ ID NO:115、116、117或118，SEQ ID NO:115、116、117或118經取代、缺失或添加一個或多個胺基酸獲得的且與SEQ ID NO:115、116、117或118功能相同的胺基酸序列或與SEQ ID NO:115、116、117或118具有至少85%序列相似性的胺基酸序列且該L2CDR1、該L2CDR2和該L2CDR3如SEQ ID NO:78、79和80所示的胺基酸序列；或者 該第二重鏈可變區的胺基酸序列為SEQ ID NO: 119、120、121、122或123所示的胺基酸序列，SEQ ID NO:119、120、121、122或123經取代、缺失或添加一個或多個胺基酸獲得的且與SEQ ID NO:119、120、121、122或123功能相同的胺基酸序列或與SEQ ID NO:119、120、121、122或123具有至少85%序列相似性的胺基酸序列且該H2CDR1、H2CDR2和H2CDR3如SEQ ID NO: 87、88和89所示的胺基酸序列，且該第二輕鏈可變區的胺基酸序列為SEQ ID NO:124、125或126，SEQ ID NO:124、125或126經取代、缺失或添加一個或多個胺基酸獲得的且與SEQ ID NO:124、125或126功能相同的胺基酸序列或與SEQ ID NO:124、125或126具有至少85%序列相似性的胺基酸序列且該L2CDR1、該L2CDR2和該L2CDR3如SEQ ID NO: 90、91和92所示的胺基酸序列。
- 如請求項1至6中任一項所述的抗CD47/抗PD-L1抗體，其包括該抗PD-L1抗體或其抗原結合片段，其中： 該抗PD-L1抗體或其抗原結合片段包含該第二重鏈可變區和該第二輕鏈可變區，其中： 該第二重鏈可變區的胺基酸序列為SEQ ID NO:112所示的胺基酸序列，SEQ ID NO:112經取代、缺失或添加一個或多個胺基酸獲得的且與SEQ ID NO:112功能相同的胺基酸序列或與SEQ ID NO:112具有至少85%，或至少90%，或至少95%，或至少98%序列相似性且該H2CDR1、該H2CDR2和該H2CDR3如SEQ ID NO:75、76和77所示的胺基酸序列，且該第二輕鏈可變區的胺基酸序列為SEQ ID NO:116，SEQ ID NO:116經取代、缺失或添加一個或多個胺基酸獲得的且與SEQ ID NO:116功能相同的胺基酸序列或與SEQ ID NO:116具有至少85%，或至少90%，或至少95%，或至少98%序列相似性且該L2CDR1、該L2CDR2和該L2CDR3如SEQ ID NO:78、79和80所示的胺基酸序列； 該第二重鏈可變區的胺基酸序列為SEQ ID NO:123所示的胺基酸序列，SEQ ID NO:123經取代、缺失或添加一個或多個胺基酸獲得的且與SEQ ID NO:123功能相同的胺基酸序列或與SEQ ID NO:123具有至少85%，或至少90%，或至少95%，或至少98%序列相似性且該H2CDR1、該H2CDR2和該H2CDR3如SEQ ID NO:87、88和89所示的胺基酸序列，且該第二輕鏈可變區的胺基酸序列為SEQ ID NO:126，SEQ ID NO:126經取代、缺失或添加一個或多個胺基酸獲得的且與SEQ ID NO:126功能相同的胺基酸序列或與SEQ ID NO:126具有至少85%，或至少90%，或至少95%，或至少98%序列相似性且該L2CDR1、該L2CDR2和該L2CDR3如SEQ ID NO: 90、91和92所示的胺基酸序列；或者 該第二重鏈可變區的胺基酸序列為SEQ ID NO:102所示的胺基酸序列，SEQ ID NO:102經取代、缺失或添加一個或多個胺基酸獲得的且與SEQ ID NO:102功能相同的胺基酸序列或與SEQ ID NO:102具有至少85%，或至少90%，或至少95%，或至少98%序列相似性且該H2CDR1、該H2CDR2和該H2CDR3如SEQ ID NO:93、94和95所示的胺基酸序列，且該第二輕鏈可變區的胺基酸序列為SEQ ID NO:106，SEQ ID NO:106經取代、缺失或添加一個或多個胺基酸獲得的且與SEQ ID NO:106功能相同的胺基酸序列或與SEQ ID NO:106具有至少85%，或至少90%，或至少95%，或至少98%序列相似性且該L2CDR1、該L2CDR2和該L2CDR3如SEQ ID NO:96、97和98所示的胺基酸序列。
- 如請求項1至8中任一項所述的抗CD47/抗PD-L1抗體，其中該CD47/抗PD-L1抗體是人源化抗體或完全人抗體。
- 如請求項1至9中任一項所述的抗CD47/抗PD-L1抗體，其中該抗CD47/抗PD-L1體是雙特異性抗體。
- 一種分離的核酸，其編碼如請求項1至10中任一項所述的抗CD47/抗PD-L1抗體。
- 如請求項10所述的核酸，其中： (1)編碼該第一重鏈可變區胺基酸序列的核苷酸序列如SEQ ID NO:36所示； (2)編碼該第一輕鏈可變區胺基酸序列的核苷酸序列如SEQ ID NO:39所示； (3)編碼該第二重鏈可變區胺基酸序列的核苷酸序列如SEQ ID NO:127或SEQ ID NO:128所示； (4)編碼該第二輕鏈可變區胺基酸序列的核苷酸序列如SEQ ID NO:129或SEQ ID NO:130所示。
- 一種表達載體，其包含如請求項11或12中所述的核酸。
- 一種宿主細胞，其轉化如請求項13所述的表達載體，該宿主細胞源自一原核細胞和一真核細胞，優先為一哺乳動物細胞。
- 一種製備如請求項1至10中任一項所述的抗CD47/抗PD-L1抗體的方法，包括在如請求項14所述的該宿主細胞中表達抗體，以及該從宿主細胞中分離該抗體的步驟。
- 一種藥物組合物，其包含請求項1至10中任一項所述的抗CD47/抗PD-L1抗體和藥學可接受的一載體。
- 一種如請求項1至10中任一項所述的抗CD47/抗PD-L1抗體或如請求項16的藥物組合物在製備用於抑制CD47和/或PD-L1活性的藥物中的應用，優選該藥物用於治療血液腫瘤、淋巴瘤、乳腺癌、肺癌、胃癌、腸癌、食管癌、卵巢癌、宮頸癌、腎癌、膀胱癌、胰腺癌、神經膠質瘤和/或黑素瘤。
Applications Claiming Priority (2)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| CN202010128900.X | 2020-02-28 | ||
| CN202010128900 | 2020-02-28 |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| TW202132351A true TW202132351A (zh) | 2021-09-01 |
Family
ID=77414560
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| TW110106865A TW202132351A (zh) | 2020-02-28 | 2021-02-26 | 抗cd47/抗pd-l1抗體及其應用 |
Country Status (5)
| Country | Link |
|---|---|
| US (1) | US20230090014A1 (zh) |
| EP (1) | EP4112647A4 (zh) |
| CN (1) | CN113321734A (zh) |
| TW (1) | TW202132351A (zh) |
| WO (1) | WO2021170082A1 (zh) |
Families Citing this family (3)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| WO2019109876A1 (zh) * | 2017-12-04 | 2019-06-13 | 北京韩美药品有限公司 | 抗pd‐l1/抗cd47天然抗体结构样异源二聚体形式双特异抗体及其制备 |
| WO2023051680A1 (zh) * | 2021-09-30 | 2023-04-06 | 正大天晴药业集团股份有限公司 | 针对免疫检查点的双特异性抗体 |
| WO2024022384A1 (en) * | 2022-07-28 | 2024-02-01 | Shenzhen Enduring Biotech , Ltd. | Peg based anti-cd47/anit-pd-l1 bispecific antibody-drug conjugate |
Family Cites Families (10)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US4676980A (en) | 1985-09-23 | 1987-06-30 | The United States Of America As Represented By The Secretary Of The Department Of Health And Human Services | Target specific cross-linked heteroantibodies |
| WO1993008829A1 (en) | 1991-11-04 | 1993-05-13 | The Regents Of The University Of California | Compositions that mediate killing of hiv-infected cells |
| CA2140280A1 (en) | 1992-08-17 | 1994-03-03 | Avi J. Ashkenazi | Bispecific immunoadhesins |
| JP6166177B2 (ja) | 2010-05-14 | 2017-07-19 | ザ ボード オブ トラスティーズ オブ ザ レランド スタンフォード ジュニア ユニバーシティー | Ｃｄ４７に対するヒト化及びキメラモノクローナル抗体 |
| EA034778B1 (ru) | 2012-02-06 | 2020-03-19 | Инхибркс, Инк. | Антитела к cd47 и способы их применения |
| CN107459578B (zh) * | 2016-05-31 | 2021-11-26 | 泰州迈博太科药业有限公司 | 一种靶向cd47与pd-l1的双功能融合蛋白 |
| US11518810B2 (en) * | 2017-05-08 | 2022-12-06 | Shanghai Jmt-Bio Technology Co., Ltd. | Bispecific recombinant protein and use thereof |
| PL3697819T3 (pl) * | 2017-10-18 | 2023-03-06 | Forty Seven, Inc. | Leczenie nowotworu złośliwego jajnika anty-cd47 i anty-pd-l1 |
| WO2019109876A1 (zh) * | 2017-12-04 | 2019-06-13 | 北京韩美药品有限公司 | 抗pd‐l1/抗cd47天然抗体结构样异源二聚体形式双特异抗体及其制备 |
| CN109970860A (zh) * | 2017-12-27 | 2019-07-05 | 信达生物制药(苏州)有限公司 | 三链抗体、其制备方法及其用途 |
-
2021
- 2021-02-26 US US17/802,904 patent/US20230090014A1/en active Pending
- 2021-02-26 EP EP21760510.4A patent/EP4112647A4/en active Pending
- 2021-02-26 TW TW110106865A patent/TW202132351A/zh unknown
- 2021-02-26 WO PCT/CN2021/078132 patent/WO2021170082A1/zh unknown
- 2021-02-27 CN CN202110221785.5A patent/CN113321734A/zh active Pending
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| EP4112647A1 (en) | 2023-01-04 |
| WO2021170082A1 (zh) | 2021-09-02 |
| US20230090014A1 (en) | 2023-03-23 |
| CN113321734A (zh) | 2021-08-31 |
| EP4112647A4 (en) | 2024-03-27 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| KR102587442B1 (ko) | 항-cd47 항체 또는 그 적용 | |
| JP6983371B2 (ja) | 抗ｐｄ−ｌ１抗体、その抗原結合フラグメントおよびその医療用途 | |
| JP7393337B2 (ja) | 抗ｂ７－ｈ４抗体、その抗原結合断片及びその医薬用途 | |
| WO2021170082A1 (zh) | 抗cd47/抗pd-l1抗体及其应用 | |
| TWI821699B (zh) | 抗b7h4抗體及其雙抗和應用 | |
| WO2022152144A1 (zh) | 结合cd73的蛋白及其应用 | |
| CA3206835A1 (en) | Mesothelin binding molecule and application thereof | |
| TW202222840A (zh) | Ｃｄ７３的抗原結合蛋白及其應用 | |
| WO2022100694A1 (zh) | 抗体及其制备方法 | |
| US20230235090A1 (en) | Bispecific antibody and use thereof | |
| WO2022063100A1 (zh) | 抗tigit抗体及双抗体和它们的应用 | |
| WO2022247826A1 (zh) | 靶向pd-l1和cd73的特异性结合蛋白 | |
| TWI833227B (zh) | 靶向pd-l1和cd73的特異性結合蛋白及其應用 | |
| WO2024078558A1 (zh) | 抗cd100抗体及其用途 | |
| TWI830774B (zh) | 抗cd47抗體及其應用 | |
| WO2023036215A1 (zh) | 双特异性抗原结合分子及其应用 | |
| RU2807484C2 (ru) | Антитело к pd-1, его антигенсвязывающий фрагмент и его фармацевтическое применение | |
| WO2023041065A1 (zh) | 一种靶向人ceacam5/6的抗体、制备方法和应用 | |
| TW202246340A (zh) | 抗ctla-4抗體及其應用 | |
| JP2024502091A (ja) | Ｐｄ－１結合分子およびその使用 | |
| TW202317631A (zh) | 抗crtam抗體及其應用 | |
| TW202305007A (zh) | 靶向pd-l1和cd73的特異性結合蛋白 | |
| CN117186235A (zh) | 抗4-1BB/抗EGFRvⅢ的双特异抗体及其制备方法和应用 | |
| KR20230169942A (ko) | 항-pd-l1 항체 및 이의 용도 | |
| TW202413414A (zh) | 抗ｉｌｔ４抗體及其醫藥用途 |