TW202305007A - 靶向pd-l1和cd73的特異性結合蛋白 - Google Patents

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Abstract

本發明涉及靶向PD-L1和CD73的特異性結合蛋白，所述特異性結合蛋白能夠與PD-L1和/或其片段，以及CD73和/或其片段特異性結合。本發明還涉及所述特異性結合蛋白在治療、預防和/或診斷疾病中的用途，所述疾病例如為免疫性疾病，急性和慢性炎性疾病，以及腫瘤疾病。

Description

靶向PD-L1和CD73的特異性結合蛋白
本發明關於生物醫藥領域，更具體地關於抗體治療領域。
程式性死亡配體1(Programmed cell death 1 ligand 1；PD-L1)，是程式性死亡受體1（PD-1）的兩種細胞表面糖蛋白配體之一(另一種是PD-L2)，其在結合PD-1時下調T細胞啟動和細胞因子的分泌。PD-L1也稱為分化簇274(CD274)或B7同系物1(B7-H1)，是一種40kDa的I型跨膜蛋白，PD-L1含IgV（免疫球蛋白可變區）樣區、IgC（免疫球蛋白恆定區）樣區、跨膜區和細胞質尾區，其中細胞質尾區與細胞內的訊號轉導相關；IgV區和IgC區則參與細胞間的訊號轉導。PD-L1與PD-1結合時，募集Src同源區2蛋白酪胺酸磷酸酶（SHP-2），從而減弱淋巴細胞特異性蛋白酪胺酸激酶（LCK）誘導的ζ鏈-相關蛋白（ZAP70）磷酸化和抑制RAS-MEK-ERK/PI3K-Akt-mTOR通路，進而有效抑制T細胞的轉錄，最終抑制T細胞的免疫功能，在免疫應答的負性調控方面發揮著重要作用。因此，通常認為，阻斷PD-1/PD-L1 訊號通路可使T 細胞活化上調，啟動內源性抗腫瘤免疫反應，從而發揮對腫瘤的治療作用。
以PD-1/PD-L1、CTLA-4單抗為代表的第一代免疫檢查點抑制劑已逐漸成為腫瘤免疫治療的代表，特別是在過繼細胞轉移治療和免疫檢查點阻斷(ICB)中發揮重要作用。靶向PD-1/PD-L1的腫瘤免疫治療已被批准用於多種不同的實體腫瘤治療，並於2018年獲得諾貝爾生理學或醫學獎。然而，抗PD-1/PD-L1治療的臨床資料顯示其應答率有限。一些患者產生原發耐藥，對PD-1/PD-L1治療沒有應答，一些應答者則在最初反應後也出現了獲得性耐藥。
而尋找安全有效，並且能與PD-1/PD-L1產生協同效應的新一代腫瘤免疫靶點，是現階段腫瘤免疫治療關注的焦點，也由此湧現出如LAG3，TIGIT，TIM3，CD47，OX40，4-1BB等一系列免疫抑制性或激動性靶點。
白細胞分化抗原73（CD73），也稱為5'-核苷酸酶，是人體中由NT5E基因編碼的酶。CD73是由兩個相同的70-KD亞基組成的二聚體，由一個糖基磷脂醯肌醇連接到質膜的外表面。已知CD73催化細胞外單磷酸核苷去磷酸化成核苷，例如腺苷。癌組織中細胞外腺苷的積累構成腫瘤免疫逃逸的重要機制。其他作用中，腫瘤來源的腺苷通過腺苷酸環化酶啟動的A2A受體很大程度上抑制浸潤的效應T細胞(Ohta等人, (2006) Proc Natl Acad Sci USA 103:13132-13137)。已報導CD73在多種腫瘤細胞中表達，包括白血病，膀胱癌，神經膠質瘤，成膠質細胞瘤，卵巢癌，黑色素瘤，前列腺癌，甲狀腺癌，食道癌和乳腺癌 (Jin等人, Cancer Res 2010; 70:2245-55 和 Stagg等人, PNAS 2010; 107:1547-52)。
對於實體瘤治療而言，要克服耐藥性提高療效，很重要的一個方面就是解除腫瘤微環境（Tumor micro-environment，TME）對免疫效應細胞的抑制作用。TME是非常複雜的系統，由多種細胞、胞間質、酶、細胞因子、代謝產物等構成，有顯著的低氧、低pH以及高壓的特點，與正常組織差異巨大。其間很重要的一個免疫抑制機制由CD73-腺苷代謝訊號途徑介導。腺苷可以通過腺苷受體（A2AR）抑制T細胞的免疫殺傷作用，使腫瘤實現免疫逃逸，而CD73則是催化腺苷產生的關鍵酶。
PD-1/PD-L1的免疫檢查點阻斷已成為免疫治療的里程碑。但是，儘管抗PD-1/PD-L1治療在實體瘤治療中顯示出令人印象深刻的效果，持久的應答卻只在一小部分患者中發生，一些最初對治療有反應的患者最終產生了後天抵抗力，因此，亟待出現療效更好的PD-1/PD-L1抑制劑以及能與PD-1/PD-L1產生協同效應的腫瘤免疫靶點。
本發明提供了能夠特異性結合PD-L1或其片段的抗原結合蛋白，其能夠阻斷PD-1與PD-L1的結合。本發明還提供了多特異性結合蛋白，所述多特異性結合蛋白能夠以高親和力、高特異性與一種或多種抗原結合，所述抗原為PD-L1或其片段，和/或CD73或其片段。本發明還提供了編碼所述抗原結合蛋白，以及所述多特異性結合蛋白的核酸分子，用於產生所述抗原結合蛋白，以及所述多特異性結合蛋白的表達載體，宿主細胞以及用於製備所述抗原結合蛋白，以及所述特異性結合蛋白的方法。本發明還涉及所述抗原結合蛋白，以及多特異性結合蛋白在治療、預防和/或診斷疾病中的用途，所述疾病例如為免疫性疾病，急性和慢性炎性疾病，以及腫瘤疾病。
第一方面，本發明提供了一種特異性結合PD-L1或其片段的分離的抗原結合蛋白。
所述特異性結合PD-L1或其片段的分離的抗原結合蛋白具有以下一種或者多種特性：(a) 能夠以高親和力結合人PD-L1和/或食蟹猴PD-L1；(b) 對PD-1訊號通路有抑制作用；(c) 能夠增強啟動T淋巴細胞；以及(d) 顯示體內腫瘤抑制活性。
在一些實施方案中，所述特異性結合PD-L1和/或其片段的分離的抗原結合蛋白包含抗體重鏈可變區VH，所述VH包含以下的互補決定區或其突變體： SEQ ID NO：9的胺基酸序列所示的HCDR1； SEQ ID NO：23的胺基酸序列所示的HCDR2；和/或 SEQ ID NO：36的胺基酸序列所示的HCDR3。
所述突變體為在所述VH的HCDR1、HCDR2、HCDR3的胺基酸序列的基礎上分別具有1、2、3或4個胺基酸的插入、缺失或取代。本領域技術人員知曉，可以對HCDR1、HCDR2和HCDR3中的1個，2個或3個CDR分別進行1、2或3個胺基酸的插入、缺失或取代突變。例如，可以對HCDR1進行1個胺基酸的突變，對HCDR2和HCDR3不進行胺基酸的突變，或者，對HCDR1和HCDR2分別進行1個胺基酸的突變，對HCDR3不進行胺基酸的突變。
在一些實施方案中，所述HCDR1的胺基酸序列為GFX 1FSX 2Y，所述HCDR2的胺基酸序列為X 3YX 4GX 5X 6，所述HCDR3的胺基酸序列為NRAX 7FGVX 8PDX 9SDI，其中，X 1、X 2、X 3、X 4、X 5、X 6、X 7、X 8或X 9為選自N、T、D、S、W、R、K、E、I、A、V和L中的任一種。在一些實施方案中，X 1為T、D或N；X 2為N或S；X 3為W或R；X 4為D或T；X 5為T或S；X 6為K、R或E；X 7為I或L；X 8為V或I；和/或，X 9為A或D。
在一些實施方案中，所述HCDR1的胺基酸序列為GF(N/T/D)FS(N/S)Y。在一些實施方案中，所述HCDR2的胺基酸序列為(W/R)Y(D/T)G(T/S)(K/R/E)。在一些實施方案中，所述HCDR3的胺基酸序列為NRA(I/L)FGV(V/I)PD(A/D)SDI。
在一些實施方案中，HCDR1的突變體具有SEQ ID NO：10、SEQ ID NO：11、SEQ ID NO：13和SEQ ID NO：14中任一項所示的胺基酸序列。
在一些實施方案中，HCDR2的突變體具有SEQ ID NO：24或SEQ ID NO：27所示的胺基酸序列。
在一些實施方案中，HCDR3的突變體具有SEQ ID NO：39、SEQ ID NO：40和SEQ ID NO：41中任一項所示的胺基酸序列。
較佳地，所述特異性結合PD-L1和/或其片段的分離的抗原結合蛋白包含抗體重鏈可變區VH，所述VH包含以下的互補決定區或其突變體： SEQ ID NO：9-11和SEQ ID NO：13-14中任一項的胺基酸序列所示的HCDR1； SEQ ID NO：23-24和SEQ ID NO：27中任一項的胺基酸序列所示的HCDR2；和/或 SEQ ID NO：36和SEQ ID NO：39-41中任一項的胺基酸序列所示的HCDR3。
在一些實施方案中，所述特異性結合PD-L1和/或其片段的分離的抗原結合蛋白包含抗體重鏈可變區VH，所述VH包含HCDR1，HCDR2和HCDR3，其胺基酸序列分別為SEQ ID NO：9，SEQ ID NO：23和SEQ ID NO：36所示。
在一些實施方案中，所述特異性結合PD-L1和/或其片段的分離的抗原結合蛋白包含抗體重鏈可變區VH，所述VH包含HCDR1，HCDR2和HCDR3，其胺基酸序列分別為SEQ ID NO：10，SEQ ID NO：23和SEQ ID NO：36所示。
在一些實施方案中，所述特異性結合PD-L1和/或其片段的分離的抗原結合蛋白包含抗體重鏈可變區VH，所述VH包含HCDR1，HCDR2和HCDR3，其胺基酸序列分別為SEQ ID NO：11，SEQ ID NO：24和SEQ ID NO：36所示。
在一些實施方案中，所述特異性結合PD-L1和/或其片段的分離的抗原結合蛋白包含抗體重鏈可變區VH，所述VH包含HCDR1，HCDR2和HCDR3，其胺基酸序列分別為SEQ ID NO：11，SEQ ID NO：23和SEQ ID NO：36所示。
在一些實施方案中，所述特異性結合PD-L1和/或其片段的分離的抗原結合蛋白包含抗體重鏈可變區VH，所述VH包含HCDR1，HCDR2和HCDR3，其胺基酸序列分別為SEQ ID NO：13，SEQ ID NO：23和SEQ ID NO：36所示。
在一些實施方案中，所述特異性結合PD-L1和/或其片段的分離的抗原結合蛋白包含抗體重鏈可變區VH，所述VH包含HCDR1，HCDR2和HCDR3，其胺基酸序列分別為SEQ ID NO：10，SEQ ID NO：23和SEQ ID NO：39所示。
在一些實施方案中，所述特異性結合PD-L1和/或其片段的分離的抗原結合蛋白包含抗體重鏈可變區VH，所述VH包含HCDR1，HCDR2和HCDR3，其胺基酸序列分別為SEQ ID NO：10，SEQ ID NO：23和SEQ ID NO：40所示。
在一些實施方案中，所述特異性結合PD-L1和/或其片段的分離的抗原結合蛋白包含抗體重鏈可變區VH，所述VH包含HCDR1，HCDR2和HCDR3，其胺基酸序列分別為SEQ ID NO：10，SEQ ID NO：23和SEQ ID NO：41所示。
在一些實施方案中，所述特異性結合PD-L1和/或其片段的分離的抗原結合蛋白包含抗體重鏈可變區VH，所述VH包含HCDR1，HCDR2和HCDR3，其胺基酸序列分別為SEQ ID NO：10，SEQ ID NO：27和SEQ ID NO：36所示。
在一些實施方案中，所述特異性結合PD-L1和/或其片段的分離的抗原結合蛋白包含抗體重鏈可變區VH，所述VH包含HCDR1，HCDR2和HCDR3，其胺基酸序列分別為SEQ ID NO：10，SEQ ID NO：27和SEQ ID NO：39所示。
在一些實施方案中，所述特異性結合PD-L1和/或其片段的分離的抗原結合蛋白包含抗體重鏈可變區VH，所述VH包含HCDR1，HCDR2和HCDR3，其胺基酸序列分別為SEQ ID NO：10，SEQ ID NO：27和SEQ ID NO：40所示。
在一些實施方案中，所述特異性結合PD-L1和/或其片段的分離的抗原結合蛋白包含抗體重鏈可變區VH，所述VH包含HCDR1，HCDR2和HCDR3，其胺基酸序列分別為SEQ ID NO：10，SEQ ID NO：27和SEQ ID NO：41所示。
在一些實施方案中，所述特異性結合PD-L1和/或其片段的分離的抗原結合蛋白包含抗體重鏈可變區VH，所述VH包含HCDR1，HCDR2和HCDR3，其胺基酸序列分別為SEQ ID NO：14，SEQ ID NO：27和SEQ ID NO：36所示。
在一些實施方案中，所述特異性結合PD-L1和/或其片段的分離的抗原結合蛋白包含抗體重鏈可變區VH，所述VH包含HCDR1，HCDR2和HCDR3，其胺基酸序列分別為SEQ ID NO：14，SEQ ID NO：27和SEQ ID NO：39所示。
在一些實施方案中，所述特異性結合PD-L1和/或其片段的分離的抗原結合蛋白包含抗體重鏈可變區VH，所述VH包含HCDR1，HCDR2和HCDR3，其胺基酸序列分別為SEQ ID NO：14，SEQ ID NO：27和SEQ ID NO：40所示。
在一些實施方案中，所述特異性結合PD-L1和/或其片段的分離的抗原結合蛋白包含抗體重鏈可變區VH，所述VH包含HCDR1，HCDR2和HCDR3，其胺基酸序列分別為SEQ ID NO：14，SEQ ID NO：27和SEQ ID NO：41所示。
較佳地，所述VH還包含重鏈可變區框架區（VH FWR），所述VH FWR可以包含VH FWR1，VH FWR2，VH FWR3和VH FWR4。
在一些實施方案中，所述VH FWR1具有SEQ ID NO：3-5中任一項所示的胺基酸序列。
在一些實施方案中，所述VH FWR2具有SEQ ID NO：17或SEQ ID NO：20所示的胺基酸序列。
在一些實施方案中，所述VH FWR3具有SEQ ID NO：30或SEQ ID NO：31所示的胺基酸序列。
在一些實施方案中，所述VH FWR4具有SEQ ID NO：43所示的胺基酸序列。
較佳地，所述VH包含SEQ ID NO：74-77，SEQ ID NO：79-80和SEQ ID NO：82-92中任一項所示的胺基酸序列，或與其具有至少80%、85%、88%、90%、92%、95%、97%、98%、99%或100%一致性的胺基酸序列。
在一些實施方案中，所述特異性結合PD-L1和/或其片段的分離的抗原結合蛋白還包含Fc區，或者與免疫球蛋白的Fc區等同的區域，較佳地，所述Fc區為人Fc。更佳地，所述人Fc為人IgG1 Fc。
較佳地，所述Fc包含L234A、L235A和P329G突變，或L234A和L235A突變，或者包含S298A，E333A和K334A中的一個、兩個或三個突變，更佳地同時包含S298A，E333A和K334A三個突變。
在一些實施方案中，所述特異性結合PD-L1或其片段的分離的抗原結合蛋白包含與SEQ ID NO：99、100、101、102、104、105、107、108、109、110、111、112、113、114、115、116或117具有至少80%、85%、88%、90%、92%、95%、97%、98%、99%或100%一致性的胺基酸序列的重鏈。在一些實施方案中，所述特異性結合PD-L1或其片段的分離的抗原結合蛋白包含SEQ ID NO：99-102，SEQ ID NO：104-105和SEQ ID NO：107-117中任一項所示重鏈的胺基酸序列。
在一些實施方案中，所述抗原結合蛋白還可以是抗原結合片段，例如可以為Fab、Fab’、F(ab’) 2、Fv、scFv、VH、或者HCAb的形式。所述Fab、Fab’、F(ab’) 2、Fv、scFv或VH的數量優選為一個或多個。
第二方面，本發明提供了分離的核酸，其編碼本發明第一方面所述的分離的抗原結合蛋白。
第三方面，本發明提供了表達載體，其包含本發明第二方面所述的分離的核酸，能夠將其表達為第一方面的分離的抗原結合蛋白。
所述表達載體可以是真核細胞表達載體和/或原核細胞表達載體，例如為質粒。
第四方面，本發明提供了宿主細胞，所述宿主細胞包含第二方面的分離的核酸，或第三方面的表達載體。
第五方面，本發明提供了抗體藥物偶聯物，其包含：本發明第一方面所述的分離的抗原結合蛋白；和，與所述抗原結合蛋白共價連接的藥物。在一些實施方案中，所述藥物選自化學治療劑、放射治療劑、免疫抑制劑和細胞毒性藥物。
第六方面，本發明提供了嵌合抗原受體，其包括胞外抗原結合結構域、跨膜結構域和胞內訊號傳導結構域，其中所述胞外抗原結合結構域包含本發明第一方面所述的分離的抗原結合蛋白。
第七方面，本發明提供了修飾的免疫細胞，其包含本發明第六方面所述的嵌合抗原受體。
第八方面，本發明提供了多特異性抗體，其包含兩個或兩個以上的抗原結合結構域，其中一個抗原結合結構域包含本發明第一方面所述的分離的抗原結合蛋白。
第九方面，本發明提供了第一方面的分離的抗原結合蛋白的製備方法。
在一些實施方案中，利用雜交瘤技術或者本領域的其他常規技術製備，例如人源化技術等製備第一方面的分離的抗原結合蛋白。
在一些實施方案中，所述製備方法包括培養第四方面的宿主細胞的步驟。
在一些實施方案中，利用Harbour HCAb轉基因小鼠（以下簡稱HCAb轉基因小鼠）製備第一方面的分離的抗原結合蛋白。
所述HCAb轉基因小鼠是一種攜帶人免疫球蛋白免疫庫的轉基因小鼠，能夠產生全新的僅“重鏈”抗體，該抗體的大小只有傳統IgG抗體的一半。其產生的抗體僅具有人的抗體“重鏈”可變結構域和小鼠Fc恆定結構域。
較佳地，所述利用HCAb轉基因小鼠製備第一方面的分離的抗原結合蛋白的方法包括如下步驟： (a) 利用人PD-L1抗原免疫HCAb轉基因小鼠，更佳地，所述人PD-L1抗原為重組人PD-L1-mFc，具體地，所述抗原為人PD-L1連接Fc構成的重組融合蛋白； (b) 利用免疫後的HCAb轉基因小鼠脾B細胞的RNA反轉錄後的cDNA，以及特異性引物擴增人VH基因； (c) 將擴增的VH基因構建到編碼人IgG抗體重鏈Fc結構域序列的哺乳動物細胞表達載體中；和 (d) 純化步驟(c)獲得的全人源PD-L1單抗。
較佳地，所述IgG抗體為IgG1抗體或IgG4抗體。
在一些實施方案中，所述方法還包括通過對CDR區域進行突變對全人源PD-L1單抗進行親和力改造的步驟。
較佳地，通過胚系化回復突變和/或轉譯後修飾（PTM）去除對全人源PD-L1單抗進行優化。
第十方面，本發明提供了一種藥物組合物，所述藥物組合物包含：第一方面所述的分離的抗原結合蛋白，第五方面所述的抗體藥物偶聯物，第六方面所述的嵌合抗原受體，第七方面所述的修飾的免疫細胞或第八方面所述的多特異性抗體；以及，藥學上可接受的載體。
所述藥物組合物還可以包含其他治療劑，包括但不限於，化學治療劑、放射治療劑、免疫抑制劑、細胞毒性藥物等。在一些實施方案中，所述藥物組合物中的化學治療劑、放射治療劑、免疫抑制劑或細胞毒性藥物，與第五方面所述的抗體藥物偶聯物中的藥物相同或不同。
第十一方面，本發明提供了第一方面所述的分離的抗原結合蛋白、第二方面所述的分離的核酸、第五方面所述的抗體藥物偶聯物，第六方面所述的嵌合抗原受體，第七方面所述的修飾的免疫細胞或第八方面所述的多特異性抗體或第十方面的藥物組合物在製備用於預防、治療和/或診斷免疫性疾病，急性和慢性炎性疾病，以及腫瘤疾病的藥物中的應用。
所述腫瘤可以為乳腺癌、腎細胞癌、黑色素瘤、結腸癌，以及B細胞淋巴瘤，黑色素瘤，頭頸癌，膀胱癌，胃癌，卵巢癌，惡性肉瘤，尿路上皮癌，肝癌，食道癌，胃食道交界癌，鼻咽癌，小細胞肺癌，子宮頸癌，子宮內膜癌，胰腺癌，前列腺癌，膠質瘤，非小細胞肺癌，急性粒細胞白血病，霍奇金淋巴瘤，皮膚鱗狀細胞癌，局部晚期或轉移性惡性腫瘤等。
所述炎性疾病可以為特應性皮炎、潰瘍性結腸炎等。
所述免疫性疾病可以為移植物抗宿主病、類風濕性關節炎、系統性紅斑狼瘡、哮喘等。
第十二方面，本發明提供了用於檢測樣品中的PD-L1的方法，所述方法包括用第一方面的分離的抗原結合蛋白檢測樣品中的PD-L1的步驟。
所述樣品可以是生物學樣品，例如，全血，紅血細胞濃縮物，血小板濃縮物，白細胞濃縮物，組織，骨髓吸出物，血漿，血清，腦脊液，糞便，尿液，培養的細胞，唾液，口腔分泌物，和鼻腔分泌物等生物學樣品。
在一些實施方案中，所述檢測樣品中的PD-L1的方法可以為非診斷目的的。
第十三方面，本發明提供了多特異性結合蛋白，所述特異性結合蛋白包含至少兩個結構域，能夠結合PD-L1或其片段，和/或CD73或其片段。
在一些實施方案中，所述特異性結合蛋白包含第一結構域和第二結構域，所述第一結構域結合CD73或其片段，並且所述第二結構域結合PD-L1或其片段。所述第一結構域與所述第二結構域連接形成雙特異性結合蛋白。
在一些實施方案中，所述第一結構域為CD73抗體或其抗原結合片段。
在一些實施方案中，所述第二結構域為PD-L1抗體或其抗原結合片段。
在一些實施方案中，所述第一結構域和/或所述第二結構域為IgG、Fab、Fab’、F(ab’) 2、Fv、scFv、VH、或者HCAb的形式。
所述Fab、Fab’、F(ab’) 2、Fv、scFv、VH的數量為一個或多個。
在一些實施方案中，所述第一結構域為IgG的形式。較佳地，所述IgG的重鏈恆定區為人重鏈恆定區，更佳為人IgG1、人IgG2、人IgG3或人IgG4重鏈恆定區；其中人IgG優選包含L234A、L235A和P329G中的一個、兩個或三個突變，更佳地包含L234A和L235A的突變，或者包含S298A，E333A和K334A中的一個、兩個或三個突變，更佳地包含S298A，E333A和K334A突變。
較佳地，所述第一結構域中IgG的Fc為人IgG1的Fc，更佳地，所述Fc包含L234A、L235A和P329G突變，或L234A和L235A突變，或者包含S298A，E333A和K334A中的一個、兩個或三個突變，更佳地包含S298A，E333A和K334A突變。
在一些實施方案中，所述第一結構域為Fab的形式，更佳地，所述第一結構域包括2個Fab。
在一些實施方案中，所述第二結構域包含一個或多個VH。
較佳地，所述VH為人VH。更佳地，所述第二結構域具有兩個VH。
在一些實施方案中，所述第二結構域還包含Fc，與免疫球蛋白的Fc區等同的區域，較佳地，所述Fc為人IgG1的Fc，更佳地，所述Fc包含L234A、L235A和P329G突變，或L234A和L235A突變，或者包含S298A，E333A和K334A中的一個、兩個或三個突變，更佳地包含S298A，E333A和K334A突變。
在一些實施方案中，所述第一結構域與所述第二結構域直接連接或經連接肽L連接形成雙特異性結合蛋白。
在一些實施方案中，所述第二結構域連接在所述第一結構域的C末端或N末端。
在一些實施方案中，所述雙特異性結合蛋白包含短鏈和長鏈。
較佳地，所述短鏈具有N’-VL 1-CL 1-C’所示的結構；所述長鏈具有N’-VH 1-CH1-h-CH2-CH3-L-VH 2-C’所示的結構； 或者，所述短鏈具有N’-VL 1-CL 1-C’所示的結構；所述長鏈具有N’-VH 2-L-VH 1-CH1-h-CH2-CH3-C’所示的結構； 或者，所述短鏈具有N’-VH 1-CH-C’所示的結構；所述長鏈具有N’-VL 1-CL 1-L-VH 2-CH2-CH3-C’所示的結構， 其中，所述VL 1和VH 1分別為第一結構域的VL和VH，所述VH 2為第二結構域的VH，所述h為鉸鏈區，所述的L為連接肽，所述CL 1是第一結構域的CL。其中，所述的鉸鏈區為免疫球蛋白領域常見的鉸鏈區，通常含大量脯胺酸，具有撓性，形成2-5個二硫鍵。
較佳地，所述L為長度為0-30個胺基酸長度的肽。在一些實施方案中，所述L的胺基酸序列如SEQ ID NO：136-157任一所示。
在一些實施方案中，所述長鏈的CH3與VH 2直接連接，即L的長度為0。
在一些實施方案中，所述長鏈的CH3經由連接肽L連接到VH 2。在一些實施方案中，所述連接肽L為長度為0-30個胺基酸長度的肽。在一些實施方案中，所述連接肽L可以是如SEQ ID NO. 136-157中任一項所示的胺基酸序列。
在一些實施方案中，所述長鏈的VH 1與VH 2直接連接，即L的長度為0。
在一些實施方案中，所述長鏈的VH 1經由連接肽L連接到VH 2。在一些實施方案中，所述連接肽L為長度為0-30個胺基酸長度的肽。在一些實施方案中，所述連接肽L可以是如SEQ ID NO. 136-157中任一項所示的胺基酸序列。
在一些實施方案中，所述長鏈的VH 2與CL 1直接連接，即L的長度為0。
在一些實施方案中，所述長鏈的VH 2經由連接肽L連接到CL 1。在一些實施方案中，所述連接肽L為長度為0-30個胺基酸長度的肽。在一些實施方案中，所述連接肽L可以是如SEQ ID NO. 136-157中任一項所示的胺基酸序列。
在一些實施方案中，所述第一結構域包含輕鏈可變區（VL）和重鏈可變區（VH），所述VL包含選自如下的互補決定區： SEQ ID NO：51，SEQ ID NO：52和SEQ ID NO：53中任一項的胺基酸序列所示的LCDR1； SEQ ID NO：57，SEQ ID NO：58和SEQ ID NO：59中任一項的胺基酸序列所示的LCDR2；和/或 SEQ ID NO：65，SEQ ID NO：66和SEQ ID NO：67中任一項的胺基酸序列所示的LCDR3； 所述VH包含選自如下的互補決定區： SEQ ID NO：8，SEQ ID NO：12和SEQ ID NO：10中任一項的胺基酸序列所示的HCDR1； SEQ ID NO：22，SEQ ID NO：25和SEQ ID NO：26中任一項的胺基酸序列所示的HCDR2；和/或 SEQ ID NO：35，SEQ ID NO：37和SEQ ID NO：38中任一項的胺基酸序列所示的HCDR3。
較佳地，所述第一結構域包含輕鏈可變區（VL）和重鏈可變區（VH），所述VL和VH包含選自如下的互補決定區： 分別如SEQ ID NO：51，SEQ ID NO：57和SEQ ID NO：65所示的LCDR1，LCDR2和LCDR3；和，分別如SEQ ID NO：8，SEQ ID NO：22和SEQ ID NO：35所示的HCDR1，HCDR2和HCDR3； 分別如SEQ ID NO：52，SEQ ID NO：58和SEQ ID NO：66所示的LCDR1，LCDR2和LCDR3；和，分別如SEQ ID NO：12，SEQ ID NO：25和SEQ ID NO：37所示的HCDR1，HCDR2和HCDR3； 分別如SEQ ID NO：53，SEQ ID NO：59和SEQ ID NO：67所示的LCDR1，LCDR2和LCDR3；和，分別如SEQ ID NO：10，SEQ ID NO：26和SEQ ID NO：38所示的HCDR1，HCDR2和HCDR3。
在一些實施方案中，所述第一結構域包含VL和VH，其中，所述VL的胺基酸序列與SEQ ID NO：94，SEQ ID NO：95或SEQ ID NO：96具有至少80%、85%、88%、90%、92%、95%、97%、98%、99%或100%一致性；所述VH的胺基酸序列與SEQ ID NO：73，SEQ ID NO：78或SEQ ID NO：81具有至少80%、85%、88%、90%、92%、95%、97%、98%、99%或100%一致性。
較佳地，所述第一結構域包含VL和VH，其中所述VL具有SEQ ID NO：94，SEQ ID NO：95和SEQ ID NO：96中任一項所示的胺基酸序列；所述VH具有SEQ ID NO：73，SEQ ID NO：78和SEQ ID NO：81中任一項所示的胺基酸序列。
較佳地，所述第一結構域包含VL和VH，所述VL和VH的胺基酸序列分別如SEQ ID NO: 94和SEQ ID NO: 73所示；或分別如SEQ ID NO: 95和SEQ ID NO: 78所示；或分別如SEQ ID NO: 96和SEQ ID NO: 81所示。
在一些實施方案中，所述第一結構域包含胺基酸序列與SEQ ID NO: 119，SEQ ID NO: 120或SEQ ID NO: 121具有至少80%、85%、88%、90%、92%、95%、97%、98%、99%或100%一致性的輕鏈；以及胺基酸序列與SEQ ID NO: 98，SEQ ID NO: 103或SEQ ID NO: 106具有至少80%、85%、88%、90%、92%、95%、97%、98%、99%或100%一致性的重鏈。
較佳地，所述第一結構域包含SEQ ID NO: 119，SEQ ID NO: 120和SEQ ID NO: 121中任一項所示的輕鏈；以及SEQ ID NO: 98，SEQ ID NO: 103和SEQ ID NO: 106中任一項所示的重鏈。
較佳地，所述第一結構域包含SEQ ID NO: 119所示的輕鏈和SEQ ID NO: 98所示的重鏈。
較佳地，所述第一結構域包含SEQ ID NO: 120所示的輕鏈和SEQ ID NO: 103所示的重鏈。
較佳地，所述第一結構域包含SEQ ID NO: 121所示的輕鏈和SEQ ID NO: 106所示的重鏈。
在一些實施方案中，所述第二結構域包含抗體重鏈可變區VH，所述VH包含以下的互補決定區或其突變體： SEQ ID NO：9的胺基酸序列所示的HCDR1； SEQ ID NO：23的胺基酸序列所示的HCDR2；和/或 SEQ ID NO：36的胺基酸序列所示的HCDR3。
所述突變體為在所述VH的HCDR1、HCDR2、HCDR3的胺基酸序列的基礎上分別具有1、2或3個胺基酸的插入、缺失或取代。本領域技術人員知曉，可以對HCDR1、HCDR2和HCDR3中的1個，2個或3個CDR分別進行1、2或3個胺基酸的插入、缺失或取代突變。例如，可以對HCDR1進行1個胺基酸的突變，對HCDR2和HCDR3不進行胺基酸的突變，或者，對HCDR1和HCDR2分別進行1個胺基酸的突變，對HCDR3不進行胺基酸的突變。
在一些實施方案中，所述HCDR1的胺基酸序列為GFX 1FSX 2Y，所述HCDR2的胺基酸序列為X 3YX 4GX 5X 6，所述HCDR3的胺基酸序列為NRAX 7FGVX 8PDX 9SDI，其中，X 1、X 2、X 3、X 4、X 5、X 6、X 7、X 8或X 9為選自N、T、D、S、W、R、K、E、I、A、V和L中的任一種。在一些實施方案中，X 1為T、D或N；X 2為N或S；X 3為W或R；X 4為D或T；X 5為T或S；X 6為K、R或E；X 7為I或L；X 8為V或I；和/或，X 9為A或D。
在一些實施方案中，所述HCDR1的胺基酸序列為GF(N/T/D)FS(N/S)Y。在一些實施方案中，所述HCDR2的胺基酸序列為(W/R)Y(D/T)G(T/S)(K/R/E)。在一些實施方案中，所述HCDR3的胺基酸序列為NRA(I/L)FGV(V/I)PD(A/D)SDI。
在一些實施方案中，HCDR1的突變體具有SEQ ID NO：10、SEQ ID NO：11、SEQ ID NO：13和SEQ ID NO：14中任一項所示的胺基酸序列。
在一些實施方案中，HCDR2的突變體具有SEQ ID NO：24或SEQ ID NO：27所示的胺基酸序列。
在一些實施方案中，HCDR3的突變體具有SEQ ID NO：39，SEQ ID NO：40和SEQ ID NO：41中任一項所示的胺基酸序列。
較佳地，所述第二結構域包含抗體重鏈可變區VH，所述VH包含以下的互補決定區或其突變體： SEQ ID NO：9-11和SEQ ID NO：13-14中任一項的胺基酸序列所示的HCDR1； SEQ ID NO：23-24和SEQ ID NO：27中任一項的胺基酸序列所示的HCDR2；和/或 SEQ ID NO：36和SEQ ID NO：39-41中任一項的胺基酸序列所示的HCDR3.
在一些實施方案中，所述第二結構域包含抗體重鏈可變區VH，所述VH包含HCDR1，HCDR2和HCDR3，其胺基酸序列分別為SEQ ID NO：9，SEQ ID NO：23和SEQ ID NO：36所示。
在一些實施方案中，所述第二結構域包含抗體重鏈可變區VH，所述VH包含HCDR1，HCDR2和HCDR3，其胺基酸序列分別為SEQ ID NO：10，SEQ ID NO：23和SEQ ID NO：36所示。
在一些實施方案中，所述第二結構域包含抗體重鏈可變區VH，所述VH包含HCDR1，HCDR2和HCDR3，其胺基酸序列分別為SEQ ID NO：11，SEQ ID NO：24和SEQ ID NO：36所示。
在一些實施方案中，所述第二結構域包含抗體重鏈可變區VH，所述VH包含HCDR1，HCDR2和HCDR3，其胺基酸序列分別為SEQ ID NO：11，SEQ ID NO：23和SEQ ID NO：36所示。
在一些實施方案中，所述第二結構域包含抗體重鏈可變區VH，所述VH包含HCDR1，HCDR2和HCDR3，其胺基酸序列分別為SEQ ID NO：13，SEQ ID NO：23和SEQ ID NO：36所示。
在一些實施方案中，所述第二結構域包含抗體重鏈可變區VH，所述VH包含HCDR1，HCDR2和HCDR3，其胺基酸序列分別為SEQ ID NO：10，SEQ ID NO：23和SEQ ID NO：39所示。
在一些實施方案中，所述第二結構域包含抗體重鏈可變區VH，所述VH包含HCDR1，HCDR2和HCDR3，其胺基酸序列分別為SEQ ID NO：10，SEQ ID NO：23和SEQ ID NO：40所示。
在一些實施方案中，所述第二結構域包含抗體重鏈可變區VH，所述VH包含HCDR1，HCDR2和HCDR3，其胺基酸序列分別為SEQ ID NO：10，SEQ ID NO：23和SEQ ID NO：41所示。
在一些實施方案中，所述第二結構域包含抗體重鏈可變區VH，所述VH包含HCDR1，HCDR2和HCDR3，其胺基酸序列分別為SEQ ID NO：10，SEQ ID NO：27和SEQ ID NO：36所示。
在一些實施方案中，所述第二結構域包含抗體重鏈可變區VH，所述VH包含HCDR1，HCDR2和HCDR3，其胺基酸序列分別為SEQ ID NO：10，SEQ ID NO：27和SEQ ID NO：39所示。
在一些實施方案中，所述第二結構域包含抗體重鏈可變區VH，所述VH包含HCDR1，HCDR2和HCDR3，其胺基酸序列分別為SEQ ID NO：10，SEQ ID NO：27和SEQ ID NO：40所示。
在一些實施方案中，所述第二結構域包含抗體重鏈可變區VH，所述VH包含HCDR1，HCDR2和HCDR3，其胺基酸序列分別為SEQ ID NO：10，SEQ ID NO：27和SEQ ID NO：41所示。
在一些實施方案中，所述第二結構域包含抗體重鏈可變區VH，所述VH包含HCDR1，HCDR2和HCDR3，其胺基酸序列分別為SEQ ID NO：14，SEQ ID NO：27和SEQ ID NO：36所示。
在一些實施方案中，所述第二結構域包含抗體重鏈可變區VH，所述VH包含HCDR1，HCDR2和HCDR3，其胺基酸序列分別為SEQ ID NO：14，SEQ ID NO：27和SEQ ID NO：39所示。
在一些實施方案中，所述第二結構域包含抗體重鏈可變區VH，所述VH包含HCDR1，HCDR2和HCDR3，其胺基酸序列分別為SEQ ID NO：14，SEQ ID NO：27和SEQ ID NO：40所示。
在一些實施方案中，所述第二結構域包含抗體重鏈可變區VH，所述VH包含HCDR1，HCDR2和HCDR3，其胺基酸序列分別為SEQ ID NO：14，SEQ ID NO：27和SEQ ID NO：41所示。
較佳地，所述VH還包含重鏈可變區框架區（VH FWR），所述VH FWR可以包含VH FWR1，VH FWR2，VH FWR3和VH FWR4。
在一些實施方案中，所述VH FWR1具有SEQ ID NO：3-5中任一項所示的胺基酸序列。
在一些實施方案中，所述VH FWR2具有SEQ ID NO：17或SEQ ID NO：20所示的胺基酸序列。
在一些實施方案中，所述VH FWR3具有SEQ ID NO：30或SEQ ID NO：31所示的胺基酸序列。
在一些實施方案中，所述VH FWR4具有SEQ ID NO：43所示的胺基酸序列。
較佳地，所述VH包含SEQ ID NO：74-77，SEQ ID NO：79-80和SEQ ID NO：82-92中任一項所示的胺基酸序列，或與其具有至少80%、85%、88%、90%、92%、95%、97%、98%、99%或100%一致性的胺基酸序列。
在一些實施方案中，所述第二結構域還包含Fc區，或與免疫球蛋白的Fc區等同的區域，較佳地，所述Fc區為人Fc。更佳地，所述人Fc為人IgG1 Fc。
較佳地，所述Fc包含L234A、L235A和P329G突變，或L234A和L235A突變，或者包含S298A，E333A和K334A中的一個、兩個或三個突變，更佳地包含S298A，E333A和K334A突變。
在一些實施方案中，所述第二結構域包含與SEQ ID NO：99、100、101、102、104、105、107、108、109、110、111、112、113、114、115、116或117具有至少80%、85%、88%、90%、92%、95%、97%、98%、99%或100%一致性的胺基酸序列的重鏈。在一些實施方案中，所述第二結構域包含SEQ ID NO：99-102，SEQ ID NO：104-105和SEQ ID NO：107-117中任一項所示重鏈的胺基酸序列。
在一些實施方案中，所述特異性結合蛋白的長鏈包含與SEQ ID NO：122、123、124、125、126、127、128、129、130、132或133具有至少80%、85%、88%、90%、92%、95%、97%、98%、99%或100%一致性的胺基酸序列；以及所述特異性結合蛋白的短鏈包含與SEQ ID NO：119、120、121或131具有至少80%、85%、88%、90%、92%、95%、97%、98%、99%或100%一致性的胺基酸序列。在一些實施方案中，所述特異性結合蛋白的長鏈具有選自SEQ ID NO：122-130和SEQ ID NO：132-133中任一項所示的胺基酸序列；以及所述特異性結合蛋白的短鏈具有選自SEQ ID NO：119-121和SEQ ID NO：131中任一項所示的胺基酸序列。
在一些實施方案中，所述特異性結合蛋白具有SEQ ID NO：122所示的長鏈以及SEQ ID NO：119所示的短鏈。
在一些實施方案中，所述特異性結合蛋白具有SEQ ID NO：123所示的長鏈以及SEQ ID NO：120所示的短鏈。
在一些實施方案中，所述特異性結合蛋白具有SEQ ID NO：124所示的長鏈以及SEQ ID NO：121所示的短鏈。
在一些實施方案中，所述特異性結合蛋白具有SEQ ID NO：125所示的長鏈以及SEQ ID NO：119所示的短鏈。
在一些實施方案中，所述特異性結合蛋白具有SEQ ID NO：126所示的長鏈以及SEQ ID NO：119所示的短鏈。
在一些實施方案中，所述特異性結合蛋白具有SEQ ID NO：127所示的長鏈以及SEQ ID NO：119所示的短鏈。
在一些實施方案中，所述特異性結合蛋白具有SEQ ID NO：128所示的長鏈以及SEQ ID NO：119所示的短鏈。
在一些實施方案中，所述特異性結合蛋白具有SEQ ID NO：129所示的長鏈以及SEQ ID NO：119所示的短鏈。
在一些實施方案中，所述特異性結合蛋白具有SEQ ID NO：132所示的長鏈以及SEQ ID NO：131所示的短鏈。
在一些實施方案中，所述特異性結合蛋白具有SEQ ID NO：130所示的長鏈以及SEQ ID NO：119所示的短鏈。
在一些實施方案中，所述特異性結合蛋白具有SEQ ID NO：133所示的長鏈以及SEQ ID NO：131所示的短鏈。
在一些實施方案中，所述雙特異性結合蛋白為包含兩條第一多肽鏈以及兩條第二多肽鏈形成的四價對稱結構。
第十四方面，本發明提供了分離的核酸，其編碼本發明第十三方面所述的特異性結合蛋白或其片段。
第十五方面，本發明提供了表達載體，其能夠將第十四方面所述的分離核酸表達為第十三方面的多特異性結合蛋白或其片段。
所述表達載體可以是真核細胞表達載體和/或原核細胞表達載體，例如為質粒。
第十六方面，本發明提供了宿主細胞，所述宿主細胞包含第十四方面的分離的核酸，或第十五方面的表達載體。
所述宿主細胞為本領域常規的宿主細胞，只要能使第十五方面的表達載體穩定地將所攜帶的核酸表達為第十三方面的特異性結合蛋白或其片段。較佳地，所述宿主細胞為原核細胞和/或真核細胞，所述原核細胞優選E. coli細胞如TG1、BL21（表達單鏈抗體或Fab抗體），所述真核細胞優選HEK293細胞或CHO細胞（表達全長IgG抗體）。將第十五方面的表達載體轉化至宿主細胞中，即可得本發明的宿主細胞。其中所述轉化方法為本領域的常規轉化方法，較佳地為化學轉化法，熱激法或電轉法。
第十七方面，本發明提供了包含第十三方面的特異性結合蛋白或其片段的抗體藥物偶聯物。所述抗體藥物偶聯物還包含與所述結合蛋白或其片段共價連接的藥物。在一些實施方案中，所述藥物選自化學治療劑、放射治療劑、免疫抑制劑和細胞毒性藥物。
第十八方面，本發明提供了第十三方面的特異性結合蛋白或其片段的製備方法。
在一些實施方案中，利用雜交瘤技術或者本領域的其他常規技術製備，例如人源化技術等製備第十三方面的特異性結合蛋白或其片段。
在一些實施方案中，所述製備方法包括培養第十六方面的宿主細胞的步驟。
在一些實施方案中，利用Harbour HCAb轉基因小鼠（以下簡稱HCAb轉基因小鼠）製備第十三方面的特異性結合蛋白的第二結構域。
所述HCAb轉基因小鼠是一種攜帶人免疫球蛋白免疫庫的轉基因小鼠，能夠產生全新的僅“重鏈”抗體，該抗體的大小只有傳統IgG抗體的一半。其產生的抗體僅具有人的抗體“重鏈”可變結構域和小鼠Fc恆定結構域。
較佳地，所述利用HCAb轉基因小鼠製備第十三方面的特異性結合蛋白的第二結構域的方法包括如下步驟： (a) 利用人PD-L1免疫HCAb轉基因小鼠，更佳地，所述人PD-L1抗原為重組人PD-L1- Fc，具體地，所述抗原為PD-L1連接Fc構成的重組融合蛋白； (b) 利用免疫後的HCAb轉基因小鼠脾B細胞的RNA反轉錄後的cDNA，以及特異性引物擴增人VH基因； (c) 將擴增的VH基因構建到編碼人IgG抗體重鏈Fc結構域序列的哺乳動物細胞表達載體中；和 (d) 純化步驟(c)獲得的全人源PD-L1單抗。
在一些實施方案中，所述方法還包括通過對CDR區域進行突變對全人源PD-L1單抗進行親和力改造的步驟。
較佳地，還可以通過胚系化回復突變和/或轉譯後修飾（PTM）去除對全人源PD-L1單抗進行優化。
在一些實施方案中，利用Harbour H2L2轉基因小鼠（以下簡稱H2L2轉基因小鼠）製備第十三方面的特異性結合蛋白的第一結構域。
所述H2L2轉基因小鼠是一種攜帶人免疫球蛋白免疫庫的轉基因小鼠，其產生的抗體具有完整的人的抗體可變結構域和大鼠恆定結構域。
較佳地，所述利用H2L2轉基因小鼠製備第十三方面的特異性結合蛋白的第一結構域的方法包括如下步驟： (a) 利用人CD73免疫H2L2轉基因小鼠，更佳地，所述人CD73抗原為可溶性的重組人CD73-hFc，具體地，所述抗原為CD73連接Fc構成的重組融合蛋白； (b) 免疫後的H2L2轉基因小鼠脾細胞與骨髓瘤細胞系融合得到雜交瘤細胞，分離的雜交瘤表達具有完整的人可變結構域和大鼠恆定結構域的重鏈和輕鏈的抗體分子； (c) 將步驟(b)獲得的抗體輕鏈可變結構域序列（VL）通過基因合成並選殖到編碼人抗體 κ輕鏈恆定結構域序列的哺乳動物細胞表達載體中，以編碼產生抗體的全長輕鏈； (d) 將步驟(b)獲得的抗體重鏈可變結構域序列（VH）通過基因合成並選殖到編碼人IgG抗體重鏈恆定結構域序列的哺乳動物細胞表達載體中，以編碼產生IgG抗體的全長重鏈； (e) 將步驟(c)和(d)的表達載體同時轉染哺乳動物宿主細胞，利用常規的重組蛋白表達和純化技術，可以得到輕重鏈正確配對組裝的重組抗體。
較佳地，將步驟(b)獲得的抗體重鏈可變結構域序列（VH）通過基因合成並選殖到編碼人IgG1抗體重鏈恆定結構域序列的哺乳動物細胞表達載體中，以編碼產生IgG1抗體的全長重鏈。
在一些實施方案中，所述方法還包括通過對CDR區域進行突變對全人源CD73單抗進行親和力改造的步驟。
較佳地，還可以通過胚系化回復突變和/或轉譯後修飾（PTM）去除對全人源CD73單抗進行優化。
在一些實施方案中，將所製備的第二結構域和所製備的第一結構域組合成雙特異性結合蛋白。所述雙特異性結合蛋白可以同時結合兩個靶點，其中第一結構域可以識別腫瘤細胞表面特異表達的CD73，而第二結構域可以結合T細胞上的PD-L1分子，所述特異性結合蛋白結合到腫瘤細胞表面後，可以招募並啟動腫瘤細胞附近的T細胞，從而殺死腫瘤細胞。
在一些實施方案中，將所製備的第二結構域和所製備的第一結構域構建成雙特異性結合蛋白。所述雙特異性結合蛋白可以同時結合兩個靶點，其中第一結構域可以識別腫瘤細胞表面特異表達的CD73，而第二結構域可以結合細胞表達的PD-L1分子。所述雙特異性結合蛋白能夠有效結合可溶性以及細胞表面的CD73和PD-L1，能夠抑制CD73的酶活，而且還能阻斷PD-L1與PD-1的結合，還能夠啟動T細胞。
較佳地，所述雙特異性結合蛋白為四價對稱結構。
較佳地，所述雙特異性結合蛋白具有第十三方面中所述的結構和序列。
第十九方面，本發明提供了一種藥物組合物，所述藥物組合物包含第十三方面所述的特異性結合蛋白或第十七方面的抗體藥物偶聯物，以及藥學上可接受的載體。
在一些實施方案中，所述藥物組合物還包括其他的成分作為活性成分，例如其他的小分子藥物或者抗體或多肽作為活性成分。
在一些實施方案中，所述藥物組合物還包含選自化學治療劑、放射治療劑、免疫抑制劑和細胞毒性藥物的治療劑。在一些實施方案中，所述藥物組合物的化學治療劑、放射治療劑、免疫抑制劑和細胞毒性藥物的治療劑，與第十七方面的抗體藥物偶聯物中的藥物不同或者相同。
所述的藥學上可接受的載體可為本領域常規的載體，所述的載體可以為任意合適的生理學或藥學上可接受的藥物輔料。所述的藥物輔料為本領域常規的藥物輔料，較佳地包括藥學上可接受的賦形劑、填充劑或稀釋劑等。更佳地，所述的藥物組合物包括0.01~99.99%的所述特異性結合蛋白和/或其他的小分子藥物或者抗體或多肽，以及0.01~99.99%的藥用載體，所述百分比為占所述藥物組合物的品質百分比。
所述的藥物組合物的給藥途徑可以是經腸胃外、注射或口服給藥。所述藥物組合物可以製備成適於給藥的形式，例如固體、半固體或液體的形式，可以為水溶液、非水溶液或混懸液，粉末、片劑、膠囊、顆粒、注射劑或輸注劑的形式。可以經血管內、皮下、腹膜內、肌內、吸入、鼻內、氣道滴注或胸腔內滴注施用。所述藥物組合物還可以氣霧劑或噴霧劑的形式施用，例如經鼻施用；或者，鞘內、髓內或心室內施用，還可以經透皮、經皮、局部、腸內、陰道內、舌下或經直腸施用。所述的藥物組合物可根據需要製成各種劑型，並可由醫師根據患者種類、年齡、體重和大致疾病狀況、給藥方式等因素確定對病人有益的劑量進行施用。
在一些實施方案中，所述特異性結合蛋白中的第一結構域和第二結構域可以同時給藥或者按順序給藥。
在一些實施方案中，所述藥物組合物中的特異性結合蛋白與其他的活性成分可以同時給藥或者按順序給藥。
在一些實施方案中，所述特異性結合蛋白是雙特異性結合蛋白。
第二十方面，本發明提供了第十三方面所述的特異性結合蛋白、第十四方面所述的分離的核酸、第十七方面的抗體藥物偶聯物或第十九方面的藥物組合物在製備用於預防、治療和/或診斷免疫性疾病，急性和慢性炎性疾病，以及腫瘤疾病的藥物中的應用。
所述腫瘤可以為乳腺癌、腎細胞癌、黑色素瘤、結腸癌，以及B細胞淋巴瘤，黑色素瘤，頭頸癌，膀胱癌，胃癌，卵巢癌，惡性肉瘤，尿路上皮癌，肝癌，食道癌，胃食道交界癌，鼻咽癌，小細胞肺癌，子宮頸癌，子宮內膜癌，胰腺癌，前列腺癌，膠質瘤，非小細胞肺癌，急性粒細胞白血病，霍奇金淋巴瘤，皮膚鱗狀細胞癌，局部晚期或轉移性惡性腫瘤等。
所述炎性疾病可以為特應性皮炎、潰瘍性結腸炎等。
所述免疫性疾病可以為移植物抗宿主病、類風濕性關節炎、系統性紅斑狼瘡、哮喘等。
第二十一方面，本發明提供了用於檢測樣品中的PD-L1和CD73的方法，所述方法包括用第十三方面的特異性結合蛋白檢測樣品中的PD-L1和CD73的步驟。
所述樣品可以是生物學樣品，例如，全血，紅血細胞濃縮物，血小板濃縮物，白細胞濃縮物，組織，骨髓吸出物，血漿，血清，腦脊液，糞便，尿液，培養的細胞，唾液，口腔分泌物，和鼻腔分泌物等生物學樣品。
第二十二方面，本發明提供了一種套裝藥盒，該套裝藥盒包括一個或多個藥盒，包含第一方面所述的抗原結合蛋白、第五方面的抗體藥物偶聯物或第十方面所述的藥物組合物。
在一些實施方案中，所述套裝藥盒包括第一藥盒和第二藥盒，所述第一藥盒包括第一方面所述的抗原結合蛋白、第五方面的抗體藥物偶聯物或第十方面所述的藥物組合物，且所述第二藥盒包含其他治療劑，所述其他治療劑包括，但不限於化學治療劑、放射治療劑、免疫抑制劑和細胞毒性藥物。在一些實施方案中，所述套裝藥盒中的化學治療劑、放射治療劑、免疫抑制劑和細胞毒性藥物，與第五方面的抗體藥物偶聯物相同或不同。
在一些實施方案中，上述第一藥盒和第二藥盒可以同時使用，也可以先使用上述第一藥盒再使用上述第二藥盒，還可以先使用上述第二藥盒再使用上述第一藥盒，可以根據具體應用時的實際需求而定。
第二十三方面，本發明提供了一種套裝藥盒，該套裝藥盒包括一個或多個藥盒，包含第十三方面所述的特異性結合蛋白、第十七方面的抗體藥物偶聯物或第十九方面所述的藥物組合物。
在一些實施方案中，所述套裝藥盒包括第一藥盒，所述第一藥盒包括第十三方面所述的第一結構域和第二結構域組成的雙特異性結合蛋白、第十七方面的抗體藥物偶聯物或第十九方面所述的藥物組合物。
在一些實施方案中，所述套裝藥盒可以進一步包括第二藥盒，所述第二藥盒包括其他治療劑，所述其他治療劑包括，但不限於化學治療劑、放射治療劑、免疫抑制劑和細胞毒性藥物。在一些實施方案中，所述套裝藥盒中的化學治療劑、放射治療劑、免疫抑制劑和細胞毒性藥物，與第十七方面的抗體藥物偶聯物相同或不同。
在一些實施方案中，上述第一藥盒和第二藥盒可以同時使用，也可以先使用上述第一藥盒再使用上述第二藥盒，還可以先使用上述第二藥盒再使用上述第一藥盒，可以根據具體應用時的實際需求而定。
第二十四方面，本發明提供了給藥裝置，其包含第一方面的抗原結合蛋白，第五方面的抗體藥物偶聯物，或第十方面的藥物組合物。在一些實施方案中，所述給藥裝置是預填充注射器。
第二十五方面，本發明提供了給藥裝置，其包含第十三方面的抗原結合蛋白，第十七方面的抗體藥物偶聯物，或第十九方面的藥物組合物。在一些實施方案中，所述給藥裝置是預填充注射器。
第二十六方面，本發明提供了預防、治療和/或診斷免疫性疾病、急性和慢性炎性疾病以及腫瘤疾病的方法，其包括向受試者施用治療有效量的第一方面的抗原結合蛋白，第五方面的抗體藥物偶聯物，或第十方面的藥物組合物。
第二十七方面，本發明提供了預防、治療和/或診斷免疫性疾病、急性和慢性炎性疾病以及腫瘤疾病的方法，其包括向受試者施用治療有效量的第十三方面的抗原結合蛋白，第十七方面的抗體藥物偶聯物，或第十九方面的藥物組合物。
本發明的雙特異性結合蛋白具有如下的一種或多種特性： (a) 雙特異性結合蛋白能夠以高親和力特異性結合人PD-L1和CD73； (b) 能夠抑制CD73的酶活性； (c) 雙特異性結合蛋白對PD-1訊號途徑具有抑制作用； (d) 雙特異性結合蛋白能夠增強啟動T淋巴細胞分泌細胞因子IL-2和IFN-γ；以及 (e) 顯示體內腫瘤抑制活性。
定義
除非另有定義，否則本發明使用的所有技術術語和科技術語都具有如在本發明所屬領域中通常使用的相同含義。出於解釋本說明書的目的，將應用以下定義，並且在適當時，以單數形式使用的術語也將包括複數形式，反之亦然。
“約”和“大約”通常意指鑒於測量的性質或精度，所測量值的可接受誤差範圍。通常誤差範圍在所給出的值或值範圍的20%範圍內，一般在10%的範圍內，甚至更一般在5%的範圍內。
術語“抗原結合分子”或“特異性結合蛋白”泛指特異性結合抗原決定簇的分子。抗原結合分子或特異性結合蛋白包括例如抗體、抗體片段和骨架抗原結合蛋白。
本發明的術語“抗體”涵蓋各種抗體結構，包括但不限於單株抗體、多株抗體、單特異性和多特異性抗體(例如，雙特異性抗體或三特異性抗體)，單鏈分子以及抗體片段，只要表現出所需的抗原結合活性即可。
本發明的術語“單株抗體”是指從基本上同質的抗體群獲得的抗體，即，除了可能微量存在的變異抗體(例如含有天然存在的突變或在單株抗體製劑的生產過程中產生的，通常以少量存在)之外，所述抗體群所包含的各個抗體是相同的和/或結合相同的表位。與通常包括針對不同抗原決定簇(表位)的不同抗體的多株抗體製劑不同，單株抗體製劑中的每種單株抗體針對抗原上的單個決定簇。
本發明的術語“多特異性抗體”按其最廣義使用，涵蓋具有多表位特異性的抗體。這些多特異性抗體包括但不限於：包含重鏈可變區（VH）和輕鏈可變區（VL）的抗體，其中該VH-VL單元具有多表位特異性；具有兩個或多個VL和VH區的抗體，每個VH-VL單元與不同的靶點或同一個靶點的不同表位結合；具有兩個或更多個單可變區的抗體，每個單可變區與不同的靶點或同一個靶點的不同的表位結合；全長抗體、抗體片段、雙特異性抗體（diabodies）、和三抗體（triabodies）、共價或非共價連接在一起的抗體片段等。
本發明的術語“雙特異性結合蛋白”或“雙特異性抗體”是指能夠特異性結合至少兩種不同的抗原決定簇，例如各自由一對抗體重鏈可變結構域(VH)和抗體輕鏈可變結構域(VL)形成的兩個結合位點與不同抗原或同一抗原上的不同表位結合。雙特異性抗體可以是1+1形式，2+1形式(包含第一抗原或表位的兩個結合位點和第二抗原或表位的一個結合位點)或2+2形式(包含第一抗原或表位的兩個結合位點和第二抗原或表位的兩個結合位點)。通常，雙特異性抗體包含兩個抗原結合位點，每個抗原結合位點特異性針對不同的抗原決定簇。
本發明的術語“價”表示抗原結合分子存在指定數目的結合結構域。因此，術語“二價”“四價”和“六價”分別表示抗原結合分子中存在兩個結合結構域、四個結合結構域和六個結合結構域。所述雙特異性抗體至少是 “二價的”，並且可以是“三價的”，“四價的”或“更多價的”)。在一些情況下，所述抗體具有兩個或更多個結合位點並且是雙特異性的。也就是說，即使在存在多於兩個結合位點(即抗體是三價的或多價的)的情況下，抗體也可以是雙特異性的。
本發明的術語“全長抗體”和“完整抗體”在本文中可互換使用，指代與天然抗體結構基本上相似的抗體。“天然抗體”是指天然存在的免疫球蛋白分子。例如，天然IgG類抗體是約150,000道爾頓的異四聚體糖蛋白，由二硫鍵鍵合的兩條輕鏈和兩條重鏈組成。從N末端到C末端，每條重鏈具有可變區(VH)(也稱為可變重鏈結構域或重鏈可變結構域)和三個恆定結構域(CH1、CH2和CH3)(也稱為重鏈恆定區)。從N末端到C末端，每條輕鏈具有可變區(VL)(也稱為可變輕鏈結構域或輕鏈可變結構域)和輕鏈恆定結構域(CL)(也稱為輕鏈恆定區)。抗體的重鏈可以是五種類型中的一種，所述五種類型為α(IgA)、δ(IgD)、ɛ(IgE)、γ(IgG)或μ(IgM)，還可以進一步分為亞型，例如γ1(IgG1)、γ2(IgG2)、γ3(IgG3)、γ4(IgG4)、α1(IgA1)和α2(IgA2)。抗體的輕鏈基於其恆定結構域的胺基酸序列，可以是兩種類型中的一種，所述兩種類型為κ輕鏈和λ輕鏈。
在輕鏈和重鏈內，可變區和恆定區通過大約12或更多個胺基酸的“J”區連接，重鏈還包含大約3個或更多個胺基酸的“D”區。各重鏈由重鏈可變區 (VH) 和重鏈恆定區(CH)組成。重鏈恆定區由3個結構域(CH1、CH2和CH3) 組成。各輕鏈由輕鏈可變區 (VL)和輕鏈恆定區(CL)組成。輕鏈恆定區由一個結構域CL組成。抗體的恆定區可介導免疫球蛋白與宿主組織或因數，包括免疫系統的各種細胞（例如，效應細胞）和經典補體系統的第一組分(C1q)的結合。
“抗體片段”包含完整抗體的一部分。抗體片段的示例包括但不限於Fab、Fab’、F(ab’) 2和Fv；雙體抗體、三體抗體、四體抗體、交叉Fab片段；線性抗體；單鏈抗體分子(例如scFv)；由抗體片段和單結構域抗體（單域抗體）形成的多特異性抗體。
本發明的術語“抗原結合結構域”或“抗原結合位點”是指抗原結合分子中特異性結合抗原決定簇的部分。更具體地，術語“抗原結合結構域”是指抗體的一部分，所述部分包含與抗原的一部分或全部特異性結合並互補的區域。在抗原分子很大的情況下，抗原結合分子可以僅結合抗原的特定部分，該部分稱為表位。抗原結合結構域可以由例如一個或多個可變結構域(也稱為可變區)提供。較佳地，抗原結合結構域包含抗體輕鏈可變區(VL)和抗體重鏈可變區(VH)。在一個方面，抗原結合結構域能夠結合其抗原並阻斷或部分阻斷所述抗原的功能。
本發明的術語“抗原決定簇”與“抗原”和“表位”同義，並且是指多肽大分子上的位點(例如一段連續的胺基酸或由非連續胺基酸的不同區域組成的構象構型)，抗原結合部分與所述位點結合，從而形成抗原結合部分-抗原複合物。抗原決定簇可以存在於例如腫瘤細胞的表面、微生物感染細胞的表面、其他患病細胞的表面、免疫細胞的表面、血清中游離物和/或細胞外基質(ECM)中。除非另有說明，本發明中用作抗原的蛋白可以是任何脊椎動物來源的任何天然形式的蛋白質，所述脊椎動物來源包括諸如靈長類動物(例如人類)和齧齒類動物(例如小鼠和大鼠)等哺乳動物。抗原也可以是人蛋白質，或者抗原為“全長”、未加工的蛋白質，以及由細胞內加工而產生的任何形式的蛋白質，或者為天然存在的蛋白質變體，例如剪接變體或等位基因變體。
“特異性結合”是指對於抗原具有結合選擇性，並且可以與不需要的或非特異性的結合區分開來。抗原結合分子與特定抗原結合的能力可以通過酶聯免疫吸附測定(ELISA)或本領域技術人員熟悉的其他技術(例如表面電漿共振(SPR)技術以及傳統的結合測定進行測量。在一個實施例中，例如通過SPR所測得的，抗原結合分子與不相關蛋白的結合程度小於所述抗原結合分子與抗原的結合程度的約10%。在某些實施例中，與抗原結合的分子的解離常數(Kd)為≤1μM、≤100nM、≤10nM、≤1nM、≤0.1nM、≤0.01nM或≤0.001nM(例如10 -7M或更低，例如10 -7M至10 -13M，例如10 -9M至10 -13M)。
“親和力”或“結合親和力”是指分子(例如抗體)的單個結合位點與其結合配體(例如抗原)之間的非共價相互作用的強度。結合親和力通常可以用解離常數(Kd)表示，解離常數(Kd)是解離速率常數與締合速率常數(分別為K off和K on)的比率。因此，等效親和力可以包括不同的速率常數，只要速率常數的比率保持相同即可。親和力可以通過本領域已知的常規方法測量，例如表面電漿共振(SPR)。
本發明的術語“高親和力”是指抗體對靶抗原的Kd為10- 9M或更低，甚至10 -10M或更低。本發明的術語“低親和力”是指抗體的Kd為10 -8M或更高。
“親和力成熟的”的抗體是指在一個或多個高變區(HVR)中具有一個或多個修飾的抗體，與不具有此類修飾的親本抗體相比，此類修飾導致了抗體對抗原的親和力的改善。
本發明的術語“單域抗體”和“奈米抗體”具有相同的含義，指僅具有抗體重鏈的可變區，構建僅由一個重鏈可變區組成的單域抗體，它是具有完整功能的最小的抗原結合片段。
本發明的術語“重鏈抗體”也稱為HCAb抗體，是指相對雙鏈抗體（免疫球蛋白）來說，缺失抗體輕鏈，只包含重鏈的抗體，具體來說包含重鏈可變結構域和Fc恆定結構域。
特異性結合蛋白包含第一結構域和第二結構域，所述第一結構域結合CD73或其片段，並且所述第二結構域結合PD-L1或其片段。
術語“包含特異性結合CD73的第一結構域和特異性結合PD-L1的第二結構域的雙特異性抗體”“特異性結合CD73和PD-L1的雙特異性抗體”“特異於CD73和PD-L1的雙特異性抗原結合分子”或“抗CD73/抗PD-L1抗體”在本文中可互換使用，並且是指能夠以足夠的親和力結合CD73和PD-L1，使得該抗體可用作靶向CD73和PD-L1的診斷和/或治療劑的雙特異性抗體。
本發明的術語“T效應細胞”指具有細胞溶解活性的T細胞(例如，CD4+及CD8+T細胞)以及T輔助(Th)細胞，T效應細胞分泌細胞因子、且啟動並引導其他免疫細胞，但不包括調控性T細胞(Treg細胞)。
本發明的術語“調節性T細胞”或“Treg細胞”是指特殊類型的CD4+T細胞，能阻斷其它T細胞的應答。Treg細胞特徵在於表達CD4，IL-2受體的α亞基(CD25)和轉錄因數FOXP3，並且在誘導和維持外周自體耐受中發揮至關重要作用，所述耐受針對腫瘤表達的抗原。
本發明的術語術語“CD73”，即分化簇73，也稱為5’-外切核苷酸酶，通常是指能夠將細胞外核苷5‘單磷酸轉化為核苷，即單磷酸腺苷（AMP）轉化為腺苷的酶（核苷酸酶）。CD73是一種由糖基磷脂醯肌醇（GPI）連接的細胞表面酶，CD73廣泛表達於人體內皮細胞、淋巴細胞，如Treg，DC，MDSC，NK等細胞的表面。CD73也可在癌細胞上表達，包括結腸癌、肺癌、胰腺癌、卵巢癌、膀胱癌、白血病、膠質瘤、膠質母細胞瘤、黑色素瘤、甲狀腺癌、食道癌、前列腺癌和乳腺癌等。據報導，高CD73表達與多種癌症適應症（例如，肺癌、黑色素瘤、乳腺癌、鱗狀頭頸癌和結直腸癌）的不良預後相關。CD73的主要功能是將細胞外核苷酸（例如5'-AMP）轉化為高度免疫抑制分子腺苷。本發明的術語“CD73”包括細胞天然表達的CD73的任何變體或同工型。CD73或其任何變體和同工型可以從天然表達它們的細胞或組織中分離，或者可以使用本領域中熟知的技術和/或本文所述的技術重組產生。相應地，本文所述的抗原結合蛋白可以與人以外的物種（例如食蟹猴CD73）交叉反應。或者，本發明的針對CD73的抗原結合蛋白，抗體或結構域可以對人CD73具有特異性，並且可以不與其他物種表現出任何交叉反應性。
本發明的術語“CD73抗體”或者“特異性結合CD73和/或其片段的分離的抗原結合蛋白”能夠結合CD73，並具有足夠的親和力以使得所述抗體可用作靶向CD73的診斷和/或治療劑。通常情況下，經放射免疫測定(RIA)或流式細胞術(FACS)或使用生物感測器系統通過表面電漿共振測定，CD73抗體與不相關的CD73蛋白的結合能力小於所述抗體與CD73的結合能力的約10%。在某些實施方案中，結合CD73的抗體具有≤1μM，≤100nM，≤10nM，≤1nM，≤0.1nM，≤0.01nM，或≤0.001nM(例如10 -8M或更低，例如10 -13M到10 -8M，例如10 -13M到10 -9M)的解離常數(KD)。
本發明的術語程式性細胞死亡1配體1(PD-L1)，也稱為分化簇CD274或B7同系物1(B7-H1)，是調節PD-1受體的活化或抑制的B7家族中的一員。PD-L1的開放閱讀框編碼290個胺基酸的I型跨膜蛋白，其包括胞外Ig結構域(N端V樣結構域和IgC樣結構域)、疏水性跨膜結構域和30個胺基酸的細胞質尾區。30個胺基酸胞內(細胞質)結構域不含明顯的訊號傳導，但確實具有用於蛋白激酶C磷酸化的潛在位點。研究表明，在干擾素γ刺激的作用下，PD-L1在免疫細胞上的表達增強。PD-L1還在非免疫細胞上表達，包括胰島、肝臟的庫普弗細胞(Kupffer cells)、脈管內皮和選定上皮，例如氣管上皮和腎小管上皮，其中其表達在炎症發作期間增強。在多種腫瘤上還發現增大水平的PD-L1表達，所述腫瘤包括但不限於乳癌、卵巢癌、子子宮頸癌、結腸癌、結腸直腸癌、包括非小細胞肺癌的肺癌、包括腎細胞癌的腎癌、胃癌、食道癌、膀胱癌、肝細胞癌、頭部和頸部鱗狀細胞癌(SCCHN)和胰臟癌、黑素瘤和葡萄膜黑素瘤(uveal melanoma)。
本發明的術語“PD-L1抗體”或者“特異性結合PD-L1和/或其片段的分離的抗原結合蛋白”能夠結合PD-L1，尤其是在細胞表面上表達的PD-L1多肽，並具有足夠的親和力以使得所述抗體可用作靶向PD-L1的診斷和/或治療劑。通常情況下，經放射免疫測定(RIA)或流式細胞術(FACS)或使用生物感測器系統通過表面電漿共振測定，PD-L1抗體與不相關的非PD-L1蛋白的結合能力小於所述抗體與PD-L1的結合能力的約10%。在某些實施方案中，結合人PD-L1的抗原結合蛋白的KD值≤1μM、≤100nM、≤10nM、≤1nM、≤0.1nM、≤0.01nM或≤0.001nM(例如10 -8M或更低，例如10 -13M至10 -8M，例如10 -13M至10 -9M)。在一些實施方案中，在表面電漿共振測定中，使用人PD-L1，尤其是帶有組胺酸標籤的人PD-L1測定結合親和力的相應KD值，以獲得PD-L1結合親和力。PD-1/PD-L1抗體的治療策略是幾種轉移性腫瘤中的標準治療策略，並已顯示出它們在早期疾病階段和輔助治療中的作用，尤其是黑色素瘤和非小細胞肺癌。
本發明中的術語“H2L2轉基因小鼠”或“Harbour H2L2小鼠”是一種攜帶人免疫球蛋白免疫庫的轉基因小鼠，所述小鼠產生具有完全人可變區的由兩條重鏈和兩條輕鏈(H2L2)組成的傳統四聚體抗體，具有完整的人抗體可變結構域和大鼠恆定結構域。由所述轉基因小鼠所產生的抗體親和力成熟，可變區完全人源化，並且具有優異的溶解性。
本發明中的術語“Harbour HCAb小鼠”（WO2002/085945A2）是一種攜帶人免疫球蛋白免疫庫的轉基因小鼠，能夠產生全新的僅“重鏈”抗體，該抗體的大小只有傳統IgG抗體的一半。其產生的抗體僅具有人的抗體“重鏈”可變結構域和小鼠Fc的恆定結構域。由於不含輕鏈這一特點，所述抗體幾乎解決了輕鏈錯配和異源二聚化的問題，使得這一技術平臺能夠開發出傳統抗體平臺難以實現的產品。
本發明的術語“可變區”或“可變結構域”是指參與抗原結合分子與抗原結合的抗體重鏈或輕鏈的結構域。天然抗體的重鏈和輕鏈的可變結構域(分別為VH和VL)通常具有相似的結構，其中每個結構域包含四個保守框架區(FR)和三個高變區(HVR)。單個VH或VL結構域可足以賦予抗原結合特異性。
本發明的術語“可變”是指可變域的某些區段在抗體之間在序列上普遍不同。V結構域介導抗原結合並限定特定抗體對於其特定抗原的特異性。然而，可變性在整個可變域並非均勻分佈的。相反，集中於輕鏈與重鏈可變域內三個稱為高變區(HVR)的區段中。可變域的更高度保守部分被稱作框架區(FR)。天然重鏈與輕鏈的可變域各自包含四個FR區，大部分採用β-折疊構型，由三個HVR連接，其形成環連接，並且在一些情況下形成β-折疊結構的一部分。每條鏈中的HVR通過FR區緊密保持在一起，並且與其它鏈的HVR一起促成抗體的抗原結合位點的形成(參見Kabat等, Sequences of Immunological Interest, 第5版, National Institute of Health, Bethesda, MD(1991))。恆定域不直接參與抗體與抗原的結合，具有其他效應功能，例如參與抗體的抗體依賴性細胞毒性。
本發明的術語“高變區”或“HVR”是指在抗體可變結構域區域中序列上高變和/或形成結構上限定的環(“高變環”)的區域。通常，天然四鏈抗體包含六個HVR：三個存在於VH中(H1、H2、H3)，三個存在於VL中(L1、L2、L3)。HVR通常包含來自高變環和/或來自“互補決定區(CDR)”的胺基酸殘基，來自“互補決定區(CDR)”的胺基酸殘基具有最高的序列可變性和/或參與抗原識別。示例性CDR(CDR-L1、CDR-L2、CDR-L3、CDR-H1、CDR-H2和CDR-H3)發生在胺基酸殘基26-32(L1)、50-52(L2)、91-96(L3)、26-32(H1)、53-55(H2)和96-101(H3)處(Chothia等人, J. Mol. Biol. 196:901-917(1987)。示例性CDR(CDR-L1、CDR-L2、CDR-L3、CDR-H1、CDR-H2和CDR-H3)發生在胺基酸殘基24-34(L1)、胺基酸殘基50-56(L2)、胺基酸殘基89-97(L3)、胺基酸殘基31-35(H1)、胺基酸殘基50-65(H2)，以及胺基酸殘基95-102(H3)處(Kabat等人, Sequences of Proteins of Immunological Interest, 第5版, Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, MD(1991)。作為比較，在下表1中列出了包含上文引用的參考文獻中所定義的CDR的相應胺基酸殘基。在本發明中，上述所列CDR的胺基酸序列均是按照Chothia定義規則所示出的（本發明的權利要求中也是按照Chothia定義規則所示出的序列）。但是，本領域人員公知，在本領域中可以通過多種方法來定義抗體的CDR，例如基於序列可變性的Kabat定義規則和基於結構環區域位置的Chothia定義規則（參見J Mol Biol 273:927-48, 1997）。在本發明中，還可以使用包含了Kabat定義和Chothia定義的Combined定義規則確定可變結構域序列中的胺基酸殘基。其中Combined定義規則即是將Kabat定義和Chothia定義的範圍相結合，基於此取了一個更大的範圍。本領域技術人員應當理解的是，除非另有規定，否則術語給定抗體或其區（例如可變區）的 “CDR” 及“互補決定區”應瞭解為涵蓋如通過本發明描述的上述已知方案中的任何一種界定的互補決定區。雖然本發明中請求保護的範圍是基於Chothia定義規則所示出的序列，但是根據其他CDR的定義規則所對應的胺基酸序列也應當落在本發明的保護範圍中。
表1：不同編號下本發明的CDR定義在抗體輕鏈或重鏈中的位置
CDR\編號體系 Kabat Chothia Combined
LCDR1 24-34 26-32 24-34
LCDR2 50-56 50-52 50-56
LCDR3 89-97 91-96 89-97
HCDR1 31-35 26-32 26-35
HCDR2 50-65 52-58 50-65
HCR3 95-102 95-102 95-102
“框架”或“FR”是指除高變區(HVR)殘基之外的可變結構域殘基。可變結構域的FR通常由以下四個FR結構域組成：FR1、FR2、FR3和FR4。因此，HVR和FR序列通常在VH(或VL)中以如下序列出現：FR1-H1(L1)-FR2-H2(L2)-FR3-H3(L3)-FR4。
抗體的“類別”是指抗體的重鏈所具有的恆定結構域或恆定區的類型。存在五類抗體：IgA、IgD、IgE、IgG和IgM，並且這些類別中的若干可以進一步分為亞類(同種型)，例如IgG1、IgG2、IgG3、IgG4、IgA1和IgA2。對應於不同類別的免疫球蛋白的重鏈恆定結構域分別稱為α、δ、ɛ、γ和μ。
“人源化抗體”包含來自非人HVR的胺基酸殘基和來自人FR的胺基酸殘基。在某些實施例中，人源化抗體包含至少一個，通常兩個可變結構域，其中所有或基本上所有HVR(例如CDR)對應於非人抗體的HVR，並且所有或基本上所有的FR對應於人抗體的FR。人源化抗體任選地可以包含來源於人抗體的抗體恆定區的至少一部分。“人源化形式”的抗體，例如非人抗體，是指已經經歷了人源化的抗體。
“人抗體”具有的胺基酸序列與由人或人細胞產生的或來源於利用人抗體庫或其他人抗體編碼序列的非人來源的抗體的胺基酸序列相對應。人抗體的該定義特別地排除了包含非人抗原結合殘基的人源化抗體。
本發明的術語“Fc結構域”或“Fc區”用於定義含有恆定區的至少一部分的抗體重鏈C末端區域。該術語包括天然序列Fc區和變體Fc區。IgG Fc區包含IgG CH2結構域和IgG CH3結構域。本文的CH2結構域可以是天然序列CH2結構域或變體CH2結構域。本文的CH3區可以是天然序列CH3結構域或變體CH3結構域。CH2結構域可包含一種或多種減少或消除CH2結構域結合一種或多種Fcγ受體(例如FcγRI、FcγRIIa、FcγRIIb、FcγRIII)和/或補體的突變。推測減少或消除與Fc受體γ的結合將減少或消除抗體分子介導的ADCC。類似地，減少或消除與補體的結合預期將減少或消除抗體分子介導的CDC。減少或消除CH2結構域與一種或多種Fcγ受體和/或補體結合的突變是本領域已知的(Wang等，2018)。這些突變包括所謂的LALA突變”，所述突變涉及將CH2域的IMGT位置的1.3和1.2處的白胺酸殘基替換為丙胺酸(L1.3A和L1.2A)。或者，通過將CH2結構域中IMGT位置的84.4位的天冬醯胺(N)突變為丙胺酸、甘胺酸或麩醯胺酸(N84.4A、N84.4G或N84.4Q)，從而將保守的N-鏈糖基化位點突變產生a-糖基抗體，以降低IgG1效應子功能也是已知的(Wang等，2018)。作為另一選擇，已知補體啟動(C1q結合)和ADCC可通過將CH2結構域的IMGT位置114位的脯胺酸突變為丙胺酸或甘胺酸(P114A或P114G)而降低(Idusogie等，2000；Klein等，2016)。這些突變可以被組合，以產生具有進一步降低或沒有ADCC或CDC活性的抗體分子 。
“與免疫球蛋白的Fc區等同的區域”包括免疫球蛋白Fc區的天然存在等位基因的變體，以及具有產生取代、添加或缺失但基本上不降低免疫球蛋白介導的效應子功能(諸如抗體依賴性細胞毒性)的能力的修飾變體。例如，可以使一個或多個胺基酸從免疫球蛋白的Fc區的N末端或C末端缺失，而基本上不喪失生物學功能。可以根據本領域中已知的一般規則來選擇此類變體，以便對活性具有最小的影響(參見例如Bowie,J.U.等人，Science 247:1306-10(1990))。
本發明的術語“效應子功能”可歸因於抗體的Fc區，是隨著抗體同種型的變化而變化的生物活性。抗體效應子功能的示例包括：C1q結合和補體依賴性細胞毒性(CDC)、Fc受體結合、抗體依賴性細胞介導的細胞毒性(ADCC)、抗體依賴性細胞吞噬作用(ADCP)、細胞因子分泌、免疫複合物介導的抗原呈遞細胞的抗原攝取、下調細胞表面受體(例如B細胞受體)，以及B細胞啟動等。
本發明的術語“肽接頭”或者“連接肽”是指包含一個或多個胺基酸，通常為約2至20個胺基酸的肽。肽接頭是本領域中已知的或在本文中描述的。
本發明的術語“融合至”，“融合聯結”或“連接至”是指區段(例如抗原結合結構域和FC結構域)或者直接地或經由一個或多個肽接頭而通過肽鍵連接。
本發明還涉及本發明的雙特異性抗體的胺基酸序列變體。雙特異性抗體的胺基酸序列變體可以通過向編碼分子的核苷酸序列中引入適當的修飾或通過肽合成來製備。這類修飾包括例如抗體胺基酸序列中殘基的缺失、插入和/或取代。可以進行缺失、插入和取代的任何組合獲得最終的構建體，最終構建體具有所需的特性，例如抗原結合活性。用於取代的位點通常包括HVR和框架(FR)。參見下表2中胺基酸的可能取代。
表2：保守胺基酸取代
胺基酸殘基 保守取代 優選保守取代
Ala(A) Val; Leu; Ile Val
Arg(R) Lys; Gln; Asn Lys
Asn(N) Gln; His; Asp; Lys; Arg Gln
Asp(D) Glu; Asn Glu
Cys(C) Ser; Ala Ser
Gln(Q) Asn; Glu Asn
Glu(E) Asp; Gln Asp
Gly(G) Ala Ala
His(H) Asn; Gln; Lys; Arg Arg
Ile(I) Leu; Val; Met; Ala; Phe; Nle Leu
Leu(L) Nle; Ile; Val; Met; Ala; Phe Ile
Lys(K) Arg; Gln; Asn Arg
Met(M) Leu; Phe; Ile Leu
Phe(F) Trp; Leu; Val; Ile; Ala; Tyr Tyr
Pro(P) Ala Ala
Ser(S) Thr Thr
Thr(T) Val; Ser Ser
Trp(W) Tyr; Phe Tyr
Tyr(Y) Trp; Phe; Thr; Ser Phe
Val(V) Ile; Leu; Met; Phe; Ala; Nle Leu
本發明的術語“多核苷酸”或“核酸”或“核苷酸序列”指分離的核酸分子或構建物，例如信使RNA(mRNA)，病毒衍生的RNA或質粒DNA(pDNA)。多核苷酸可包含常規的磷酸二酯鍵或非常規鍵(例如醯胺鍵,諸如在肽核酸(PNA)中找到的)。術語“核酸分子”指多核苷酸中存在的任一個或多個核酸區段，例如DNA或RNA片段。
本發明的術語“分離的”核酸分子或多核苷酸是指已經與其天然環境分隔開的核酸分子，DNA或RNA。在本發明中，載體中包含的編碼多肽的重組多核苷酸也是分離的。分離的多核苷酸的其他實例包括在異源宿主細胞中的重組多核苷酸或溶液中純化的多核苷酸。分離的多核苷酸包括通常是含有該多核苷酸分子的細胞中所含有的多核苷酸分子,但是該多核苷酸分子存在於染色體外或與其天然染色體位置不同的染色體位置。分離的RNA分子包括本發明的體內或體外RNA轉錄物，為正和負鏈形式，和雙鏈形式。本發明的分離的多核苷酸或核酸進一步包括合成生成的此類分子。另外，多核苷酸或核酸可以為或可以包括調節元件，諸如啟動子，核糖體結合位點，或轉錄終止子。
本發明的術語“表達盒”指重組或合成生成的多核苷酸，具有允許特定核酸在靶細胞中轉錄的一系列核酸元件。重組表達盒可導入質粒，染色體，線粒體DNA，質體DNA，病毒或核酸片段。典型地，在其它序列以外，表達載體的重組表達盒部分包括要轉錄的核酸序列和啟動子。在某些實施方案中，本發明的表達盒包含編碼本發明的雙特異性抗原結合分子或其片段的多核苷酸序列。
本發明的術語“載體”或“表達載體”與“表達構建物”可以互換使用，將與其可操作連接的特定基因導入靶細胞並指導表達的DNA分子。所述載體包括作為自身複製性核酸結構的載體以及併入其已經導入的宿主細胞的基因組的載體。本發明的表達載體包含表達盒。表達載體可以進行大量穩定mRNA的轉錄。一旦表達載體在靶細胞內，則由細胞轉錄和/或轉譯機制生成由該基因編碼的核糖核酸分子或蛋白質。在一個實施方案中，本發明的表達載體包括含有編碼本發明的雙特異性抗原結合分子或其片段的多核苷酸序列的表達盒。
術語“宿主細胞”，“宿主細胞系”和“宿主細胞培養物”可互換使用，是指其中已經導入外源核酸的細胞，還包括這類細胞的後代。宿主細胞包括“轉化體/轉化子”和“轉化細胞”，包括原代轉化細胞以及由其衍生的後代。後代的核酸與親本細胞可以不完全一致，可含有突變。宿主細胞是可用於生成本發明的雙特異性抗原結合分子的任何類型的細胞。宿主細胞包括培養的細胞，例如培養的哺乳動物細胞，諸如CHO細胞，HEK293細胞，BHK細胞，NS0細胞，SP2/0細胞，YO骨髓瘤細胞，P3X63小鼠骨髓瘤細胞，PER細胞，PER.C6細胞或雜交瘤細胞，酵母細胞，昆蟲細胞和植物細胞，還包括轉基因動物，轉基因植物或培養的植物或動物組織內所包含的細胞。
胚系化回復突變是指將抗體的超體細胞突變回復突變為相應胚系序列的過程。抗體的重鏈可變結構域序列來源於染色體上重鏈基因群的胚系基因V、D、J基因片段的基因重排和體細胞高頻突變等事件；輕鏈可變結構域序列來源於輕鏈基因群的胚系基因V、J基因片段的基因重排和體細胞高頻突變等事件。基因重排和體細胞高頻突變是增加抗體多樣性的主要因素。來源於相同胚系V基因片段的抗體也可能產生不同的序列，但總體上相似性較高。利用一些演算法，例如IMGT/DomainGapAlign (http://imgt.org/3Dstructure-DB/cgi/DomainGapAlign.cgi) 或者NCBI/IgBLAST (https://www.ncbi.nlm.nih.gov/igblast/)，可以從抗體的可變結構域序列推測出其發生基因重排時可能的胚系基因片段。
術語“轉譯後修飾（PTM）”是指蛋白質或多肽胺基酸鏈在細胞中轉譯合成後，引入化學修飾的過程。對於抗體而言，一些PTM的位點是非常保守的，例如，在人的IgG1抗體的恆定結構域的第297位（EU編號）的保守胺基酸天冬醯胺Asn通常會發生糖基化修飾形成糖鏈，而該糖鏈結構對於抗體結構和相關的效應子功能是至關重要的。但是，如果在抗體的可變結構域尤其是抗原結合區域（如CDR）中存在PTM，那麼這些PTM的存在有可能會對抗原的結合有較大的影響，也可能對抗體的物理化學性質帶來變化。例如，糖基化、脫醯胺、異構化、氧化等都可能增加抗體分子的不穩定性或異質性，從而增加抗體開發的難度和風險。因而去除PTM以降低序列不穩定性的過程，從而避免一些潛在的PTM對於治療性抗體的開發是非常重要的。隨著經驗的積累，人們發現一些PTM與胺基酸序列的組成，尤其與相鄰胺基酸組成的“模式”是高度相關的，這樣使得可以從蛋白質的一級胺基酸序列預測出潛在的PTM。例如，N-x-S/T（第一位是天冬醯胺，第二位是非脯胺酸以外的任意胺基酸，第三位是絲胺酸或者蘇胺酸）的序列模式預測出N-連接糖基化位點。引起PTM的胺基酸序列模式有可能來源於胚系基因序列，例如人胚系基因片段IGHV3-33天然地在FR3區域存在糖基化模式NST；也可能來源於體細胞高頻突變。可以通過胺基酸突變來破壞PTM的胺基酸序列模式，從而降低或者去除特定PTM的形成。根據抗體序列和PTM序列模式的不同，有不同的突變設計方法。一種方法是將“熱點”胺基酸（如NS模式中的N或S）替換成物理化學性質相似的胺基酸（如把N突變為Q）。如果PTM序列模式來源於體細胞高頻突變，而並不存在於胚系基因序列中，那麼另一種方法可以是把該序列模式替換成對應的胚系基因序列。實際操作中，對同一個PTM序列模式可能採用多種突變設計方法。
術語“抗體藥物偶聯物”或“ADC”指與一個或多個化學藥物化學連接的結合蛋白（如抗體或其抗原結合片段）。在優選的實施方案中，ADC包括結合蛋白，藥物，和連接所述結合蛋白與藥物的接頭。
術語“嵌合抗原受體”或“CAR”指具有期望抗原特異性和訊號傳導結構域，以在抗原結合時傳播細胞內訊號的受體。例如，T淋巴細胞經由T細胞受體（TCR）與由I類或II類主要組織相容性複合物（MHC）分子呈遞的短肽的相互作用來識別特異性抗原。對於初始活化和選殖擴增來說，初始T細胞依賴於提供額外共刺激訊號的抗原呈遞細胞（APC）。在一些實施方案中，可將單核細胞和巨噬細胞工程化以例如表達嵌合抗原受體（CAR）。修飾細胞可募集至腫瘤微環境，在此其通過浸潤腫瘤並殺傷靶標癌細胞而用作強力免疫效應物。CAR可包括抗原結合結構域、跨膜結構域和細胞內結構域。抗原結合結構域結合至靶細胞上的抗原。可用作結合至CAR的抗原結合結構域的抗原的細胞表面標誌物的實例包括與病毒、細菌、寄生蟲感染、自身免疫疾病和癌細胞相關者（例如腫瘤抗原）。
術語“修飾的免疫細胞”指免疫細胞已經被基因修飾，以表達CAR。在一些實施方案中，所述免疫細胞是T細胞，或由其衍生的細胞。在一些實施方案中，所述免疫細胞是自然殺傷（NK）細胞，或由其衍生的細胞。在一些實施方案中，所述免疫細胞是B細胞，或由其衍生的細胞。在一些實施方案中，所述免疫細胞是B細胞，或由其衍生的細胞。在一些實施方案中，所述免疫細胞是單核細胞或巨噬細胞，或由其衍生的細胞。
術語“套裝藥盒”指一種或多種活性成分存在於多以一個單位的組合。套裝藥盒中存在多種活性成分時，各活性成分可以同時或順序給藥。
術語“給藥裝置”指用於向受試者給藥的任何工具。
術語“預填充注射器(prefilled syringe)”是指在注射器的操作者接近或使用之前已經裝載有藥物的注射器。預填充注射器可以是任何材料(例如，玻璃、塑膠或金屬)。在一些實施方案中，預填充注射器是玻璃注射器。
藥物的“有效量”指在接受其施用的細胞或組織中導致生理變化所必需的量。“有效量”包含足以改善或預防醫學疾病的症狀或病症的量。有效量還意指足以允許或促進診斷的量。用於特定患者或獸醫學受試者的有效量可依據以下因素而變化：例如，待治療的病症、患者的總體健康情況、給藥的方法途徑和劑量以及副作用的嚴重性。有效量可以是避免顯著副作用或毒性作用的最大劑量或給藥方案。
依照本發明的雙特異性抗體具有協同效應。“協同效應”是指兩種藥物的組合效果大於它們單獨的效果之和且在統計學上不同於對照和單一藥物。本發明的疊加效應是指兩種藥物的組合效果是它們單獨的效果之和且在統計學上不同於對照和/或單一藥物。
藥物(例如藥用組合物)的“治療有效量”指在劑量和給藥間隔和時間上有效實現想要的治療或預防效果必需的量。例如，治療有效量的藥物消除、減輕/減少、延遲、最小化或預防疾病的不利影響。
術語“個體”或“受試者”是指哺乳動物。哺乳動物包括但不限於馴養的動物(例如牛，綿羊，貓，犬和馬)，靈長類動物(例如人和非人靈長類，諸如猴)，家兔和齧齒類動物(例如小鼠和大鼠)。具體地，個體或受試者是人。
術語“藥物組合物”表示含有一種或多種本公開的抗體或其抗原結合片段與其他化學組分的混合物，所述其他組分例如生理學/可藥用的載體或賦形劑。藥物組合物的目的是促進對生物體的給藥，利於活性成分的吸收進而發揮生物活性。
術語“藥學可接受的載體”指藥用組合物中除了活性組分以外，對受試者無毒的組分。藥學可接受賦形劑包括但不限於緩衝劑，穩定劑和/或防腐劑。
術語“癌症”是指描述哺乳動物中以細胞生長不受調節為特徵的疾患。癌症的例子包括但不限於腫瘤，淋巴瘤、母細胞瘤、肉瘤和白血病或淋巴樣惡性腫瘤。癌症更具體的實例包括但不限於鱗狀細胞癌(例如上皮鱗狀細胞癌)、肺癌(包括小細胞肺癌、非小細胞肺癌、腺癌和肺的鱗癌)、腹膜癌、肝細胞癌、胃癌(包括胃腸癌和胃腸基質癌)、骨癌、胰腺癌、成膠質細胞瘤、子宮頸癌、卵巢癌、肝癌、膀胱癌、尿道癌、乳腺癌、結腸癌、直腸癌、結腸直腸癌、子宮內膜癌或子宮頸癌、唾液腺癌、腎癌或輸尿管癌、前列腺癌、陰道癌、外陰癌、甲狀腺癌、肛門癌、陰莖癌、黑素瘤、膽管癌、中樞神經系統(CNS)腫瘤、脊椎軸腫瘤、腦幹膠質瘤、多形性成膠質細胞瘤、星形細胞瘤、神經鞘瘤、室管膜瘤、成髓細胞瘤、腦膜瘤、鱗狀細胞癌、垂體腺瘤和尤文氏肉瘤、淺表擴散性黑素瘤、惡性雀斑樣痣黑素瘤、肢端黑素瘤、結節性黑素瘤、多發性骨髓瘤和B細胞淋巴瘤、慢性淋巴細胞白血病(CLL)、急性成淋巴細胞性白血病(ALL)、毛細胞性白血病、慢性成髓細胞性白血病和移植後淋巴增殖性疾病(PTLD)、以及與瘢痣病(phakomatoses)、水腫(諸如與腦瘤有關的)和梅格斯氏(Meigs)綜合征有關的異常血管增殖、腦瘤和腦癌、以及頭或頸癌和相關的轉移癌。
術語“治療”是指給予患者內用或外用治療劑，例如包含本公開的任一種抗體或其抗原結合片段的組合物或編碼抗體或其抗原結合片段的核酸分子，所述患者具有一種或多種疾病或症狀，所述治療劑對這些疾病或症狀具有治療作用。通常，在受治療患者或群體中以有效緩解一種或多種疾病或症狀的量給予治療劑，以誘導這類症狀退化或抑制這類症狀發展到任何臨床可測量的程度。
術語“預防癌症”是指在哺乳動物中延遲、抑制或防止癌症發作，所述哺乳動物中癌發生或腫瘤發生的起始尚未得到證實，但是通過例如遺傳篩查或其它方法確定，已鑒定其具有癌症易感性。該術語還包括治療具有癌變前病症的哺乳動物以終止所述癌變前病症向惡性腫瘤的進展或導致其消退。
本發明的抗體的序列編號（SEQ ID NO:）見下表3。
表3：
蛋白編號 輕鏈 重鏈 VL VH LCDR1 LCDR2 LCDR3 HCDR1 HCDR2 HCDR3
PR000151 118 97 93 72 50 56 64 7 21 34
PR000960   99   74       9 23 36
PR001058   100   75       10 23 36
PR001061   101   76       11 24 36
PR001065   102   77       11 23 36
PR002079   104   79       13 23 36
PR002082   105   80       10 23 36
PR005867   108   83       10 23 39
PR005868   109   84       10 23 40
PR005869   110   85       10 23 41
PR005263   107   82       10 27 36
PR005872   111   86       10 27 39
PR005875   112   87       10 27 40
PR005878   113   88       10 27 41
PR006245   114   89       14 27 36
PR006246   115   90       14 27 39
PR006247   116   91       14 27 40
PR006248   117   92       14 27 41
PR000846 119 98 94 73 51 57 65 8 22 35
PR001408 120 103 95 78 52 58 66 12 25 37
PR003836 121 106 96 81 53 59 67 10 26 38
本發明的雙抗的序列編號（SEQ ID NO:）見下表4。
表4：
蛋白編號 多肽鏈1 多肽鏈2
PR003569 122 119
PR003739 123 120
PR004295 124 121
PR006268 125 119
PR006269 126 119
PR006270 127 119
PR006271 128 119
PR006663 129 119
PR006667 132 131
PR006664 130 119
PR006668 133 131
下面顯示的實施例意在說明本發明的具體實施方案，並且不意在以任何方式限制本說明書或申請專利範圍的範圍。實施例不包括對傳統方法的詳細描述，如那些用於構建載體和質粒的方法，將編碼蛋白的基因插入到這樣的載體和質粒的方法或將質粒引入宿主細胞的方法．這樣的方法對於本領域中具有普通技術的人員是眾所周知的，並且在許多出版物中都有所描述，包括Sambrook，J.，Fritsch，E．F．和 Maniais，T．（1989） MolecuLar Cloning： A Laboratory Manual，2nd edition，Cold spring Harbor Laboratory Press。
實施例
實施例1. PD-L1抗原結合蛋白的製備
為獲得針對PD-L1特異性結合的抗體分子，通常可以利用PD-L1抗原對實驗動物進行免疫，該實驗動物可以是小鼠、大鼠、兔、羊、駱駝等，但是得到的抗體分子是非人源的。在獲得非人源抗體後，需要對這些分子利用抗體工程技術進行人源化改造，以降低免疫原性並提高成藥性。然而，抗體的人源化過程有其技術複雜性，經過人源化改造的分子往往會降低對抗原的親和力。另一方面，轉基因技術的進步使得可以培育出基因工程化小鼠，其攜帶人免疫球蛋白免疫庫並使其內源的鼠的免疫庫缺失。這種轉基因小鼠產生的抗體具有全人源的序列，因而無需再進一步做人源化改造，大大提高了治療性抗體開發的效率。
Harbour HCAb小鼠（Harbour Antibodies BV，WO 2002/085945 A3）是一種攜帶人免疫球蛋白免疫庫的轉基因小鼠，能夠產生全新的僅“重鏈”抗體，該抗體的大小只有傳統IgG抗體的一半。其產生的抗體僅具有人的抗體“重鏈”可變結構域和小鼠Fc恆定結構域。由於不含輕鏈的這一特點，該抗體幾乎解決了輕鏈錯配和異源二聚化的問題，使得這一技術平臺能夠開發出傳統抗體平臺難以實現的產品。
1.1  PD-L1免疫HCAb小鼠
用可溶的重組人PD-L1-mFc融合蛋白（Novo Protein Inc. #CM06，批號0330837）對6～8周齡Harbour HCAb人源抗體轉基因小鼠進行多輪免疫。每只小鼠每次免疫時通過皮下經腹股溝注射或通過腹腔注射接受的總注射劑量是100μL。在首輪免疫中，每只小鼠接受用50μg抗原蛋白與完全弗氏佐劑（Sigma, #F5881）以體積比1:1混合配製的免疫原試劑的免疫。在隨後的每輪增強免疫中，每只小鼠接受用25μg抗原蛋白與Ribi佐劑（Sigma Adjuvant System, #S6322）混合配製的免疫原試劑的免疫。每輪增強免疫的間隔時間至少為兩周，通常不超過五輪增強免疫。免疫時間為第0天、第14天、第28天、第42天、第56天、第70天；並且在第49天、第77天，檢測小鼠血清抗體滴度。在進行HCAb小鼠脾B細胞分離前5天，以每只小鼠25μg抗原蛋白的劑量進行最後一次增強免疫。
1.2  獲得抗PD-L1的HCAb抗體序列
當檢測小鼠血清中PD-L1特異的抗體滴度達到一定的水平後，將小鼠的脾細胞取出分離B細胞，用BD FACS AriaII Cell Sorter分選CD138陽性的漿細胞和人PD-L1抗原陽性的B細胞群。提取B細胞的RNA，反轉錄cDNA (SuperScript IV First-Strand synthesis system, Invitrogen, #18091200)，然後用特異性的引物PCR擴增人VH基因。PCR引物5’- GGTGTCCA GTGTSAGGTGCAGCTG-3’（SEQ ID NO: 134），5’- AATCCCTGGGCACTGAAGAGACGG TGACC-3’ （SEQ ID NO: 135）。將擴增的VH基因片段，構建到編碼人IgG1抗體重鏈Fc結構域序列的哺乳動物細胞表達質粒pCAG載體中。
構建好的質粒轉染哺乳動物宿主細胞（如人胚腎細胞HEK293），以表達獲得的HCAb抗體。檢測表達HCAb的上清與過表達人PD-L1的CHO-K1/hPD-L1（GenScript，#M00543）穩定細胞系的結合，同時用陽性抗體PR000151（Atezolizumab類似物，申請人根據Atezolizumab序列合成表達）作為陽性對照，進行Miroball 螢光流式儀器（Sptlabtech）篩選。
具體步驟是：用無血清的F12K培養基（Thermofisher，#21127022）洗滌CHO-K1/hPD-L1細胞，將其用無血清的培養基重懸至1×10 6/mL。加入Draq5螢光探針（CTS，#4048L）（1 µL Draq5 至1mL CHO-K1/hPD-L1細胞中，1:1000稀釋），在避光處培養30分鐘。離心細胞後用培養基洗滌細胞，調整細胞密度至1.0×10 5細胞/mL。再加入1:1000稀釋後的Alexa Fluor® 488 AffiniPure Goat Anti-Human IgG, Fcγ Fragment Specific二抗（Jackson ImmunoResearch，#109-545-098），取每孔30μL的該混合物加入384孔板（Greiner，#781091）。再在384孔板中加入10 µL陽性對照或者表達HCAb的上清，培養2小時。在Miroball 螢光流式儀器上讀取螢光值。陽性植株抗體進一步用FACS檢測與CHO-K1/hPD-L1細胞的結合，以及和食蟹猴PD-L1-his蛋白（Acrobiosystems，#PD-1-C52H4）的ELISA檢測來驗證結合交叉結合活性。利用常規的測序手段對陽性抗體進行測序，獲得編碼抗體分子可變結構域的核苷酸序列以及對應的胺基酸序列。
1.3  重組全人源抗體的製備
上述實施例1.2中得到編碼抗體分子的重鏈可變結構域序列以後，可以採用常規的重組DNA技術，將重鏈可變結構域序列和相應的人的抗體重鏈恆定結構域序列進行融合表達，得到重組抗體分子。
將編碼抗體重鏈的質粒轉染哺乳動物宿主細胞（如人胚腎細胞HEK293），利用常規的重組蛋白表達和純化技術，可以得到具有HCAb重鏈重組抗體。
具體說來，將HEK293細胞在FreeStyle™ F17 Expression Medium培養基（Thermo，#A1383504）中擴培。暫態轉染開始之前，調節細胞濃度至(6~8)×10 5細胞/mL，於37°C，8% CO 2搖床中培養24小時，細胞濃度在1.2×10 6細胞/mL。準備30mL培養的細胞。將上述編碼HCAb的重鏈質粒溶解於1.5 mL Opti-MEM減血清培養基（Thermo，#31985088），並用0.22µm濾膜過濾除菌。再取1.5 mL Opti-MEM 溶入1 mg/mL PEI（Polysciences Inc，#23966-2）120 µL，靜置5分鐘。將PEI緩慢加入質粒中，室溫培養10分鐘，邊搖晃培養瓶邊緩慢滴入質粒PEI混合溶液，於37°C 8% CO 2搖床中培養5天。5天後觀測細胞活率。收集培養物，以3300 g轉速離心10分鐘後取上清；然後將上清高速離心去除雜質。用PBS（pH7.4）平衡含有MabSelect ™（GE Healthcare Life Science，#71-5020-91 AE）的重力柱（Bio-Rad，#7311550），2-5倍柱體積沖洗。將上清樣品過柱。用5-10倍柱體積的PBS沖洗柱子。再用pH3.5的0.1M甘胺酸洗脫目的蛋白，後用pH 8.0的Tris-HCl調節至中性，最後用超濾管（Millipore，#UFC901024）濃縮換液至PBS緩衝液，得到純化的抗體溶液。然後用NanoDrop （Thermo Scientific™ NanoDrop™ One）測定濃度，分裝、存儲備用。
1.4  PD-L1全人重組抗體的序列
表5列出了本實施例中PD-L1抗體的重鏈可變結構域胺基酸序列，重鏈全長胺基酸序列和根據Chothia定義規則定義的CDR的胺基酸序列。同時，本發明的抗PD-L1的陽性對照抗體Atezolizumab類似物，其相應的胺基酸序列來源於IMGT資料庫，抗體重鏈序列SEQ ID NO: 97，抗體輕鏈序列SEQ ID NO: 118。
表5  抗PD-L1 HCAb抗體的序列編號（SEQ ID NO:）
重組抗體 重鏈序列 VH 序列 VH CDR1 VH CDR2 VH CDR3
PR000960 99 74 9 23 36
PR001058 100 75 10 23 36
PR001061 101 76 11 24 36
PR001065 102 77 11 23 36
1.5 利用HPLC-SEC分析蛋白純度和多聚體
使用分析型分子尺寸排阻層析色譜法（SEC）來分析蛋白樣品的純度和聚體形式。將分析型色譜柱TSKgel G3000SWxl（Tosoh Bioscience, #08541, 5 µm, 7.8 mm × 30 cm）連接到高壓液相色譜儀（HPLC）（型號：Agilent Technologies, Agilent 1260 Infinity II），用PBS緩衝液室溫下平衡至少1小時。適量蛋白樣品（至少10µg，樣品濃度調整到1 mg/mL）用0.22 µm濾膜過濾後注射入系統，並設定HPLC程式：用PBS（pH 7.4）緩衝液將樣品以1.0 mL/min的流速流過色譜柱，最長時間為25分鐘；檢測波長280nm。採集後用ChemStation軟體對色譜圖進行積分並計算相關資料，生成分析報告，報告出樣品內不同分子尺寸組份的滯留時間。
PD-L1抗體的產量和純度分析結果見表6。
表6： PD-L1抗體的產量和純度分析
序號 重組抗體 表達體系 和體積 第一步純化後 產量 (mg/L) HPLC-SEC 純度 (%)
1 PR000960 HEK293-6E (40 mL) 48.25 95
2 PR001058 HEK293-F (30 mL) 26 100
3 PR001061 HEK293-F (30 mL) 60.33 71.75
4 PR001065 HEK293-F (30 mL) 66.67 71
實施例2 抗體序列的優化
2.1  PTM位點的去除
將實施例1中的抗體序列進行分析，其重鏈可變結構域（VH）的胚系基因V基因片段，以及可變結構域VH預測的PTM，列於表7。
序號 重組抗體 分子結構 IgG 亞型 VH 胚系 V 基因 VH PTM
1 PR000960 HCAb 人 IgG IGHV3-33 NxS/T (HCDR1); DG (HCDR2)
2 PR001058 HCAb 人 IgG IGHV3-33 DG (HCDR2)
3 PR001061 HCAb 人 IgG IGHV3-33 NxS/T (HCDR1); DG (HCDR2)
4 PR001065 HCAb 人 IgG IGHV3-33 NxS/T (HCDR1); DG (HCDR2)
表7  抗PD-L1 HCAb抗體的序列胚系基因分析
表8列出了對自實施例1的具有潛在PTM位點的PR000960抗體的序列，進行胺基酸突變得到的新的抗體分子（稱為PTM變體）。表9列出了PR000960的PTM變體的CDR、VH和HC的胺基酸序列，和根據Chothia定義規則定義的CDR的胺基酸序列。所有設計出來的PTM變體按照實施例1.3中描述的方法得到純化的重組抗體，並在後續的功能實驗中進一步驗證。PR000960的PTM變體的產量和純度分析結果見表10。
表8 PR000960的突變位點設計
初始抗體 PTM變體 突變點 變體分子的VH PTMs
PR000960 PR002079 N28T DG (HCDR2)
PR002082 N28T, N31S DG (HCDR2)
表9 PR000960的PTM變體的CDR、VH和HC的胺基酸序列
初始抗體 PTM變體 HC VH HCDR1 HCDR2 HCDR3
PR000960 PR002079 104 79 13 23 36
PR002082 105 80 10 23 36
表10：PR000960轉譯後修飾 (PTM) 變體的產量和純度分析
抗體編號 濃度 (mg/mL) 純度 HPLC-SEC (%) 內毒素水平 (EU/mg) 產量 (mg/L) HPLC-HIC 滯留時間 (min) DSF Tm1
PR002079 3.64 97.85 0.1 182 18.342 54.00
PR002082 2.27 97.25 0.1 113.5 18.456 52.20
2.2 優化HCAb抗體序列提高結合PD-L1的親和力
通過對CDR區域進行隨機突變的方法建立酵母展示抗體突變庫，借助於BD FACS AriaIII 分選平臺對PR002082分子進行親和力的改造。此親和力成熟的方法分為三輪。
首先，對母本分子PR002082的三個CDRs隨機引入突變，建立3 CDRs (CDR1、CDR2、CDR3)酵母展示突變庫；然後用MACS分選方法進行富集；隨後用流式FACS進行多輪分選，富集高親和力的突變分子。在本實施例中，抗體可變結構域的CDR序列通過Chothia規則進行分析。
第一輪，用0.1nM生物素化的PD-L1-his分選出結合力更高的酵母細胞；然後繼續培養誘導。
第二輪，用0.01nM生物素化的PD-L1-his進一步分選出結合力更高的酵母細胞；然後繼續培養誘導。
第三輪，繼續降低分選時抗原的濃度，用0.003nM生物素化的PD-L1-his進行最後一輪分選。
最後，將前面三輪分選到的分子測序，找到突變位點進行隨機組合，建立組合突變庫。然後用FACS繼續以更低的抗原濃度分選出更高親和力突變分子。在本實施例中，經親和力成熟得到的抗體重鏈可變結構域序列（VH）通過基因合成，並選殖到編碼Flag和6xHis標籤的哺乳動物細胞表達質粒載體中，以編碼產生重組HCAb單域抗體分子。
得到PR002082變體（均為單域抗體）的序列如下表11所示。
表11：PR002082變體的序列編號表(SEQ ID NO:)
初始抗體 重組抗體 （變體） 可變區突變 IgG 亞型 Fc 突變 VH (SEQ ID NO:) HC (SEQ ID NO:)
PR002082 PR005867 V106I, A109D HCAb none 83 108
PR002082 PR005868 I102L, V106I HCAb none 84 109
PR002082 PR005869 I102L, V106I, A109D HCAb none 85 110
PR002082 PR005263 I50S, W52R, D54T, K57E HCAb none 82 107
PR002082 PR005872 I50S, W52R, D54T, K57E, V106I, A109D HCAb   none 86 111
PR002082 PR005875 I50S, W52R, D54T, K57E, I102L, V106I HCAb   none 87 112
PR002082 PR005878 I50S, W52R, D54T, K57E, I102L, V106I, A109D HCAb     none 88 113
PR002082 PR006245 T28D, I50S, W52R, D54T, K57E, HCAb   none 89 114
PR002082 PR006246 T28D, I50S, W52R, D54T, K57E, V106I, A109D HCAb   none 90 115
PR002082 PR006247 T28D, I50S, W52R, D54T, K57E, I102L, V106I HCAb   none 91 116
PR002082 PR006248 T28D, I50S, W52R, D54T, K57E, I102L, V106I, A109D HCAb   none 92 117
2.3 PR002082親和力變體的生產和純化
上述實施例2.2中得到編碼PR002082親和力變體可變結構域的序列以後，可以採用常規的重組DNA技術，將重鏈可變結構域序列和相應的純化標籤進行融合表達，得到重組HCAb單域抗體分子。
將編碼重組HCAb單域抗體的質粒轉染哺乳動物宿主細胞（如中國倉鼠卵巢細胞CHO），利用常規的重組蛋白表達和純化技術，可以得到相應的純化重組抗體。
具體說來，將ExpiCHO-S™細胞 (Gibco, #A29127) 在ExpiCHO™ Expression Medium培養基 (Gibco, #A2910001)擴培。暫態轉染開始之前，調節細胞濃度至(3~4)×10 6細胞/mL，於37°C 8% CO 2搖床中培養24小時，細胞濃度至(7~10)×10 6細胞/mL，再稀釋至6×10 6細胞/mL，準備10 mL培養的細胞。將上述編碼HCAb單域抗體的質粒8 µg（質粒與細胞的比例為 0.8 µg : 1 mL）溶解於0.4 mL OptiPRO™ SFM培養基 (Gibco, #12309019)，並用0.22 µm濾膜過濾除菌。再取32 µL ExpiFectamine™ CHO試劑(Gibco, #A29129) 加入0.37 mL OptiPRO™ SFM培養基 (Gibco, #12309019)。立即將ExpiFectamine™ CHO試劑溶液緩慢加入質粒溶液中，顛倒混勻，邊搖晃培養瓶邊緩慢滴入質粒和轉染試劑混合溶液，於37℃ 8% CO 2搖床中培養8-9天。8天後觀測細胞活率。收集培養物，以3300g轉速離心10分鐘後取上清，然後將上清用0.22 µm濾膜過濾去除雜質。用PBS（pH7.4）平衡含有Ni Sepharose excel（GE Healthcare Life Science，#17531802）的重力柱（Bio-Rad，#7311550），2-5倍柱體積沖洗。將上清樣品過柱。先後用5-10倍柱體積的PBS和5-10倍柱體積的20mM咪唑溶液（pH7.4）沖洗柱子。再用500mM咪唑溶液（pH7.4）洗脫目的蛋白，最後用超濾管（Millipore，#UFC901024）濃縮換液至PBS緩衝液，得到純化的抗體溶液。然後用NanoDrop （Thermo Scientific™ NanoDrop™ One）測定濃度，分裝、存儲備用。PR002082親和力成熟變體的製備見表12。
表12：PR002082親和力成熟變體的製備
抗體編號 濃度 (mg/mL) 分子量 (kDa) 緩衝液
PR005263 6.69 78.8 PBS
PR005867 0.78 79.1 PBS
PR005868 1.11 79.0 PBS
PR005869 1.13 79.1 PBS
PR005872 1.96 78.9 PBS
PR005875 1.91 78.8 PBS
PR005878 1.29 78.9 PBS
PR006245 6.42 78.8 PBS
PR006246 6.56 78.9 PBS
PR006247 6.42 78.9 PBS
PR006248 6.48 78.9 PBS
實施例3 抗原結合蛋白與過表達人/食蟹猴PD-L1的細胞的結合（FACS）
本實施例為了研究PD-L1抗原結合蛋白在體外結合人/食蟹猴PD-L1的活性，採用過表達人PD-L1的CHO-K1細胞株（CHO-K1/hPD-L1，南京金斯瑞，M00543）或過表達食蟹猴PD-L1的CHO-K1細胞株（CHO-K1/cynoPD-L1，南京金斯瑞，M00573）進行細胞水平的結合實驗。簡言之，消化PD-L1細胞，並用F-12K完全培養基重懸，將細胞密度調整為1×10 6細胞/mL。以100 µL細胞/孔接種於96孔V底板（Corning, 3894），隨後加入100 µL/孔，2倍於終濃度的5倍濃度梯度稀釋的待測抗原結合蛋白，混合均勻，其中抗原結合蛋白最高終濃度為100 nM，共8個濃度，同型抗體hIgG1 iso作為對照。將細胞放置於4℃，避光培養1小時。之後，加入100 µL/孔預冷PBS漂洗細胞兩次，於500 g 4℃下離心5分鐘，棄上清。再加入100 µL/孔螢光二抗（山羊抗人IgG (H+L) 第二抗體，Alexa Fluor 488 conjugate, Invitrogen, A11013, 1:1000稀釋），4℃，避光培養30分鐘。用200 µL /孔預冷PBS洗滌細胞兩次，於500 g 4℃下離心5分鐘，棄上清。最後，200 µL/孔預冷PBS重懸細胞。使用BD FACS CANTOII讀取螢光發光訊號值。使用流式細胞儀BD FACS CANTOII或FACS ACEA讀取螢光發光訊號值，並用軟體 FlowJo v10 (FlowJo, LLC) 處理和分析資料。應用軟體GraphPad Prism 8進行資料處理和作圖分析，通過四參數非線性擬合，得到結合曲線及EC 50值等參數。
圖1（A、B）結果顯示，本發明所述PD-L1抗原結合蛋白均能結合過表達人PD-L1的CHO-K1細胞。
圖1（C）結果顯示，本發明所述PR000960轉譯後修飾（PTM）變體均能結合過表達人PD-L1的CHO-K1細胞。
圖1（D、E、F）結果顯示，本發明所述PR002082親和力成熟變體均能結合過表達人PD-L1的CHO-K1細胞，且作用均強於親本序列抗體PR002082。
圖2（A）結果顯示，本發明所述PD-L1抗原結合蛋白均能結合過表達食蟹猴PD-L1的CHO-K1細胞。
圖2（B）結果顯示，本發明所述PR000960轉譯後修飾（PTM）變體均能結合過表達食蟹猴PD-L1的CHO-K1細胞。
圖2（C）結果顯示，本發明所述PR002082親和力成熟變體均能結合過表達猴PD-L1的CHO-K1細胞，且作用均強於親本序列抗體PR002082。
實施例4. 利用BLI方法測定抗原結合蛋白與人PD-L1的親和力
該實施例利用Octet Red96e儀器對PR002082親和力成熟突變體進行了親和力的測定。具體方法是，帶有組胺酸標籤的人PD-L1蛋白購自廠家ACROBiosystems （# PD-1-H5258，測試緩衝液為1×動力學緩衝液（從10×動力學緩衝液（ForteBio，#18-1105）稀釋），用於親和力測試以及抗原、抗體的稀釋。通過生物膜干涉（BLI）技術，使用Octet分子相互作用分析儀（ForteBio，型號Octet Red96e），來進行抗原抗體之間的結合動力學分析。
測定抗原和抗體的親和力時，感測器轉動速度為1000 轉/分鐘。先將置於一列的2個HIS1K感測器在測試緩衝液中平衡10分鐘，然後用HIS1K感測器捕獲His PD-L1，捕獲高度0.9-1.1 nm，然後將HIS1K感測器在測試緩衝液中平衡2分鐘，然後將HIS1K感測器與抗原結合蛋白（60 nM以及 0 nM）結合3分鐘，最後解離15分鐘。將HIS1K感測器浸入10 mM 甘胺酸（pH 1.5）溶液進行再生，以洗脫結合在感測器上的蛋白。
使用Octet Data Analysis軟體（Fortebio，版本11.0）進行資料分析時，選擇單扣除模式（reference well）扣除參照訊號，選擇“1:1 Local/full fitting”方法進行資料擬合，計算出抗原與抗體結合的動力學參數，得到K on（1/Ms）值、K dis（1/s）值和KD（M）值。
結果如表13所示，PR02082的親和力成熟變體與PD-L1均能結合，且多數變體的親和力較PR002082有明顯提高。
表13：PR002082親和力成熟變體與人PD-L1蛋白的親和力
抗體編號 KD (M) K on(1/Ms) K dis(1/s) Full R^2
PR002082 5.61E-09 2.10E+05 1.18E-03 0.9982
Atezolizumab 8.18E-10 3.79E+05 3.10E-04 0.9975
PR005867 1.85E-09 2.53E+05 4.68E-04 0.9991
PR005868 1.92E-09 2.01E+05 3.86E-04 0.9975
PR005869 1.09E-09 2.41E+05 2.62E-04 0.9989
PR005263 1.94E-09 1.17E+05 2.27E-04 0.9983
PR005872 8.61E-10 2.18E+05 1.87E-04 0.9993
PR005875 1.04E-09 1.72E+05 1.79E-04 0.9987
PR005878 6.71E-10 1.80E+05 1.21E-04 0.9990
PR006245 1.09E-09 1.49E+05 1.62E-04 0.9959
PR006246 5.46E-10 3.01E+05 1.64E-04 0.9956
PR006247 1.18E-09 1.85E+05 2.19E-04 0.998
PR006248 6.34E-10 1.82E+05 1.15E-04 0.998
實施例5. 利用報導基因細胞系檢測抗原結合蛋白對PD-1訊號通路的抑制作用
將表達PD-L1和OS8（CD3單鏈抗體跨膜蛋白）的293T（eBioscience）細胞鋪到96孔板上，細胞量為1.25×10 4/孔，100 µL/孔。37℃在5% CO 2環境下培養過夜。去除上清液，加入50 µL /孔的待測抗原結合蛋白稀釋液，起始濃度為100 nM，5倍濃度稀釋，hlgG1為對照組。加入5×10 4/孔的可持續表達PD-1和NFAT-螢光素酶報導基因的Jurkat報告細胞（UPharm）50 µL /孔。37℃在5% CO 2環境下培養6小時。加入ONE-GloTM螢光素酶試劑 （Promega, #E6110），室溫培養5分鐘，酶標儀檢測發光值。結果如圖3所示。結果顯示本發明所述HCAb抗體對PD-1訊號通路有抑制作用。
圖3（A）結果顯示，本發明所述PD-L1抗原結合蛋白均對PD-1訊號通路有抑制作用。
圖3（B）結果顯示，本發明所述PR000960轉譯後修飾（PTM）變體均對PD-1訊號通路有抑制作用。
圖3（C、D）結果顯示，本發明所述PR002082親和力成熟變體均對PD-1訊號通路有抑制作用，且多數變體的抑制作用較PR002082有明顯提高。
實施例6. 抗原結合蛋白在混合淋巴細胞反應（MLR）中刺激細胞因子分泌
購買AllCells PBMC細胞，分離單核細胞，加入重組人源白介素4（IL-4）（R&D，#204-GMP）和人源GM-CSF（R&D，#215-GM/CF）誘導6天後，獲得未成熟的人CD14+樹突狀細胞（iDC細胞）。加入1 μg/mL的脂多糖（Lipopolysaccharide, LPS; Sigma, #L2630），誘導24小時，獲得成熟的樹突狀細胞（mDC細胞）。採用T細胞分離試劑盒（StemCell，#17951）從第二供體PBMC細胞中分離得到T淋巴細胞。將1×10 5/孔的T淋巴細胞和1×10 4/孔的mDC細胞按10：1比例接種至96孔板，加入10倍或者對應倍數的稀釋的各抗原結合蛋白及陰陽性對照抗體。於37℃ 5% CO 2培養箱培養5天。收集第三天和第五天的上清液，採用ELISA試劑盒，分別檢測IL-2（ThermoFisher，#88-7025-88）和IFN-γ（ThermoFisher，#88-7316-88）的分泌量。
本實施例使用了18個供體的PBMC分成了9組供體配對進行混合淋巴細胞反應（MLR）。
圖4和圖5結果顯示，在兩次獨立的MLR實驗中，本發明所述PD-L1抗原結合蛋白均能 增強啟動的T淋巴細胞分泌細胞因子IL-2和IFN-γ。
圖6結果顯示，本發明所述PR000960轉譯後修飾（PTM）變體均能增強啟動的T淋巴細胞 分泌細胞因子IL-2和IFN-γ。
圖7、圖8、圖9、圖10、圖11、圖12結果顯示，在6次獨立的MLR實驗中，本發明所述PR002082親和力成熟變體均能增強啟動的T淋巴細胞分泌細胞因子IL-2和IFN-γ。
實施例7. 抗原結合蛋白的體內抑制腫瘤活性
NCG小鼠重建人PBMC免疫系統的A375腫瘤模型的體內抗瘤效果參見圖13之A。具體地，溶媒對照組小鼠在給藥後第23天平均腫瘤體積為1336 mm 3。測試藥Atezolizumab（10mg/kg）治療組在接種後第23天平均腫瘤體積為343 mm 3，相較溶媒對照組有顯著性差異（p值=0.002），腫瘤抑制率TGI (%) 為74.33%。測試藥PR002079（5mg/kg）治療組在接種後第23天平均腫瘤體積為728 mm 3，相較溶媒 對照組有顯著性差異（p值=0.021），腫瘤抑制率TGI (%) 為45.51%。測試藥PR002082（5mg/kg）治療組在接種後第23天平均腫瘤體積為891mm 3，相較溶媒對照組沒有顯著性差異（p值=0.139），腫瘤抑制率TGI (%) 為33.31%。
圖13之B結果顯示，在實驗過程中，各組動物體重均出現增長，表明動物對受試品耐受良好。未對動物產生明顯毒性作用，安全性較好。
實施例8. CD73抗體的獲得
CD73抗體的 獲得參見公開申請WO2021032173A1的說明書中實施例1，實施例2和實施例3的記載。
具體而言，使用Harbour H2L2小鼠，將CD73蛋白用作免疫原以產生抗CD73抗體。通過皮下注射和腹膜內注射，與佐劑一起使用（Sigma，S6322）給每只小鼠第一次加強用 50μg蛋白質，隨後加強用25μg蛋白質。每兩周進行1次這種免疫，共6次。最終免疫是通過經腹膜內注射用PBS稀釋的免疫原進行。使用ELISA和FACS測試針對人CD73的血清效價。在指定的時間點，對小鼠血清進行採樣並滴定以進行ELISA和FACS分析，以測試與CD73蛋白或CD73穩定細胞系的結合。在蛋白質免疫陣列（protein immunization cohort）中觀察到良好的血清效價。
使用細胞融合 發生器（BEX-LF301），通過基於電場的電穿孔器，將從免疫小鼠中分離的小鼠脾細胞與小鼠骨髓瘤細胞系SP2/0（ATCC，CRL-1581）融合，以獲得雜交瘤。在融合後9-14天，在各個孔中篩選人抗CD73抗體。雜交瘤亞選殖後，選擇對CD73表現出良好結合活性的單株38H6進行測序。鑒定並獲得重鏈可變區和輕鏈可變區。然後合成重鏈可變區和輕鏈可變區，並分別選殖到編碼人IgG1恆定區的質粒和編碼人Igκ區的質粒中。
使用PEI（Polyscience，24885）將編碼目標抗體的重組質粒暫態共轉染到HEK293-6E或HEK293-F細胞培養物中。30 µg質粒與120 µL PEI在室溫下混合並培養15分鐘。接下來，將混合物逐滴加入以1×106 細胞/毫升的濃度懸浮於Opti-MEM的293 細胞中。轉染後，將細胞在37°C、5%CO2的條件下，以120 rpm搖床培養。 在第6-7天收集的細胞培養上清液用於純化。
在轉染後6-7天通過離心和過濾收穫含有目標抗體的上清液。使單株抗體通過rProtein A（ GE，17-1279-02）預裝柱（Bio-Rad，7311550）進行純化。通過將0.2 mL rProtein A樹脂裝填到一個柱中，然後用10柱體積的ddH2O和10柱體積的PBS沖洗來製備Protein A柱。將細胞培養上清液過柱，然後用10倍柱體積的PBS洗滌。然後用8倍柱體積的洗脫緩衝液（Thermo，21004）洗脫蛋白質，並在洗脫後立即與640μL的中和緩衝液（1M Tris-HCl，pH 9.0； Teknova，T1090）進行混合。在濃縮器（Millipore，UFC903024）中，通過3800 rpm（Eppendorf，5810R）4℃離心，將緩衝液與DPBS進行500倍以上的交換，最後濃縮至合適的體積。純化的抗CD73抗體的濃度通過在280 nm（NanoDrop）處的UV吸光度確定。通過SEC-HPLC和SDS-PAGE測定抗體純度。重組抗體PR000506被成功表達並純化用於表徵。
抗CD73抗體的VH和VL序列通過胚系化回復突變和PTM去除操作進行了進一步優化：
在胚系化程式中，抗體VH或VL序列首先通過例如 NCBI / Ig-BLAST的演算法比對到最接近的人類胚系序列，然後將框架區的具有不同於胚系序列的殘基反轉為胚系序列中的對應殘基。然後通過成熟的分子生物學技術重組產生胚系化後的由序列變體組成的抗體。
在哺乳動物細胞中表達的蛋白質中廣泛觀察到轉譯後修飾（PTM）。除了抗體中保守的PTM位點（例如 IgG1抗體CH2結構域上的N-糖基化保守位點）外，在抗體抗原結合位點（即CDR區）內發生的其他PTM位點可能會降低抗原結合活性或降低化學穩定性。例如，脫醯胺或異構化可以使分子變得不穩定和異質化。為了減少序列不穩定性，可以通過突變去除PTM基序。查找VH或VL序列的PTM基序，例如異構化基序（例如DG）。然後將“熱點”殘基（例如，DG基序中的D或G）突變為胚系序列中的對應殘基或具有類似生物物理特性的其他殘基。然後，通過成熟的分子生物學技術重組產生由PTM去除後的序列變體組成的抗體。
獲得了以下表14的抗CD73抗體：
表14：
抗體編號 PTM去除 輕鏈 重鏈 VL VH
PR000846 去除 119 98 94 73
PR001408 去除 120 103 95 78
PR003836 去除 121 106 96 81
實施例9 CD73/PD-L1雙特異性抗體的製備
本實施例利用抗CD73的IgG抗體PR000846、PR001408、PR003836的抗原結合結構域Fab，與抗PD-L1的HCAb抗體PR002082以及親和力成熟變體PR005263、PR005872、PR005875、PR005878、PR006246、PR006248的抗原結合結構域VH，來構建CD73 × PD-L1的雙特異性抗體分子。
抗CD73的H2L2抗體的序列編號見表15，抗PD-L1的HCAb抗體的序列編號見表16。
表15：抗CD73的H2L2抗體的序列編號（SEQ ID NO:）
抗體編號 輕鏈 重鏈 VL VH
PR000846 119 98 94 73
PR001408 120 103 95 78
PR003836 121 106 96 81
表16：抗PD-L1的HCAb抗體的序列編號（SEQ ID NO:）
抗體編號 重鏈 VH
PR005263 107 82
PR005872 111 86
PR005875 112 87
PR005878 113 88
PR006246 115 90
PR006248 117 92
PR002082 105 80
圖14列出了本發明所包含的雙特異性結合蛋白的分子結構，每一個結構會在下文進一步描述。在本實施例以及本發明申請的其他部分，當提及分子結構所含多肽鏈數目的時候，通常是指“不同的多肽鏈”的數目；例如常規IgG抗體有兩條不同的多肽鏈，即重鏈和輕鏈，儘管IgG抗體分子本身是含有兩條相同的重鏈和兩條相同的輕鏈的四肽鏈蛋白分子，但是描述其結構特徵時特指其兩條不同的多肽鏈。結合價數是指該分子結構中的抗原結合位點的數目，例如常規IgG抗體能同時結合兩個相同的抗原分子，其結合價數為二。
表17列出了本發明申請的結構設計中可能用到的連接肽序列。 表17：連接肽序列表
連接肽名稱 連接肽長度 連接肽序列 序列編號 SEQ ID NO:
GS_4 4 GSGS 136
GS_5 5 GGGGS 137
GS_6 6 GGSGGS 138
GS_7 7 GGGGSGS 139
GS_15 15 GGGGSGGGGSGGGGS 140
GS_20 20 GGGGSGGGGSGGGGSGGGGS 141
GS_25 25 GGGGSGGGGSGGGGSGGGGSGGGGS 142
人IgG1鉸鏈 15 EPKSCDKTHTCPPCP 143
人IgG1鉸鏈 (C220S) 15 EPKS S DKTHTCPPCP 144
H1_15 15 EPKSSDKTHTPPPPP 145
G5-LH 15 GGGGGDKTHTCPPCP 146
H1_15-RT 17 EPKSSDKTHTPPPPPRT 147
L-GS_15-RT 18 LGGGGSGGGGSGGGGSRT 148
L-H1_15-RT 18 LEPKSSDKTHTPPPPPRT 149
KL-H1_15-RT 19 KLEPKSSDKTHTPPPPPRT 150
KL-H1_15-AS 19 KLEPKSSDKTHTPPPPPAS 151
RT-GS_5-KL 9 RTGGGGSKL 152
RT-GS_15-KL 19 RTGGGGSGGGGSGGGGSKL 153
RT-GS_25-KL 29 RTGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSKL 154
EPKSSD 6 EPKSSD 155
AS-GS_15 17 ASGGGGSGGGGSGGGGS 156
GS_2 2 GS 157
9.1 構建IgG_HC-VH 四價對稱結構的雙特異性抗體
利用抗CD73的H2L2抗體和抗PD-L1的HCAb抗體構建IgG-VH 四價對稱結構的雙特異性抗體。 IgG_HC-VH四價對稱結構（如圖14之A所示）的結合蛋白包含兩條多肽鏈：多肽鏈1，也稱短鏈，從胺基末端到羧基末端，其包含VL_A-CL；多肽鏈2，也稱長鏈，從胺基末端到羧基末端，其包含VH_A-CH1-h-CH2-CH3-L-VH_B。h是IgG抗體的鉸鏈區或衍生序列。在一個實施方案中，多肽鏈2的CH3與VH_B直接融合聯結，即L的長度為0。在另一個實施方案中，多肽鏈2的CH3經由連接肽L聯結到VH_B；L可以是表17中所列的序列。
9.2 構建VH-IgG_HC 四價對稱結構的雙特異性抗體
利用抗CD73的H2L2抗體和抗PD-L1的HCAb抗體構建IgG-VH 四價對稱結構的雙特異性抗體。 VH-IgG_HC四價對稱結構（如圖14之B所示）的結合蛋白包含兩條多肽鏈：多肽鏈1，也稱短鏈，從胺基末端到羧基末端，其包含VL_A-CL；多肽鏈2，也稱長鏈，從胺基末端到羧基末端，其包含VH_B -L-VH_A-CH1-h-CH2-CH3。h是IgG抗體的鉸鏈區或衍生序列。多肽鏈2的VH_A經由連接肽L聯結到VH_B，連接肽L可以是表17中所列序列。在一個實施方案中，多肽鏈2的VH_A與VH_B直接融合聯結，即L的長度為0。
9.3 構建 Fab(CL)-VH-Fc 結構的雙特異性抗體分子
利用抗CD73的H2L2抗體和抗PD-L1的HCAb抗體構建IgG-VH 四價對稱結構的雙特異性抗體。 Fab(CL)-VH-Fc對稱結構（如圖14之C所示）的結合蛋白包含兩條多肽鏈，多肽鏈1，也稱短鏈，從胺基末端到羧基末端，其包含VH_A-CH1；多肽鏈2，也稱長鏈，從胺基末端到羧基末端，其包含VL_A-CL-L1-VH_B-L2-CH2-CH3。多肽鏈2的連接肽L1和L2可以是表17中所列序列。在一個實施方案中，多肽鏈2的CL與VH_B直接融合聯結，即L1的長度為0。
CD73 × PD-L1雙特異性抗體為IgG1，具有Fc突變L234A和L235A或者L234A和L235A和G237A（根據EU索引編號）。
本發明製備得到的CD73 × PD-L1雙特異性抗體總結在表18；所得雙抗分子的多肽鏈的胺基酸序列的序列編號見表19。所得雙抗分子的抗原結合結構域的CDR的序列編號見表20。製備的CD73 × PD-L1雙抗抗體分子樣品理化性質分析總結於表21。
表18：利用抗CD73的IgG抗體和抗PD-L1的重鏈抗體設計的CD73 × PD-L1雙抗分子
結構編號 雙抗分子 CD73 抗體 (IgG) PD-L1 抗體 (VH_B) VH_B 相對 IgG 位置 連接肽 Fc 類型（突變）
2 PR006268 PR000846 PR005263 VH-IgG GS_15 IgG1_LALA
2 PR006269 PR000846 PR005872 VH-IgG GS_15 IgG1_LALA
2 PR006270 PR000846 PR005875 VH-IgG GS_15 IgG1_LALA
2 PR006271 PR000846 PR005878 VH-IgG GS_15 IgG1_LALA
1 PR006663 PR000846 PR006246 IgG-VH GS_6 IgG1_AAA
3 PR006667 PR000846 PR006246 Cross Fab-HCAb 無 IgG1_AAA
1 PR006664 PR000846 PR006248 IgG-VH GS_6 IgG1_AAA
3 PR006668 PR000846 PR006248 Cross Fab-HCAb 無 IgG1_AAA
2 PR003569 PR000846 PR002082 VH-IgG GS_15 IgG1_LALA
2 PR003739 PR001408 PR002082 VH-IgG GS_15 IgG1_LALA
2 PR004295 PR003836 PR002082 VH-IgG GS_15 IgG1_LALA
表19：本發明的CD73 × PD-L1雙抗分子的序列編號
結構編號 抗體編號 多肽鏈 1 多肽鏈 2
2 PR006268 125 119
2 PR006269 126 119
2 PR006270 127 119
2 PR006271 128 119
1 PR006663 129 119
3 PR006667 132 131
1 PR006664 130 119
3 PR006668 133 131
2 PR003569 122 119
2 PR003739 123 120
2 PR004295 124 121
表20：CD73 × PD-L1雙抗分子的抗原結合結構域的CDR的序列編號
結構編號 抗體編號 抗原結合域 LCDR1 LCDR2 LCDR3 HCDR1 HCDR2 HCDR3
2 PR006268 CD73 51 57 65 8 22 35
PD-L1 無  無  無  10 27 36
2 PR006269 CD73 51 57 65 8 22 35
PD-L1 無  無  無  10 27 39
2 PR006270 CD73 51 57 65 8 22 35
PD-L1 無  無  無  10 27 40
2 PR006271 CD73 51 57 65 8 22 35
PD-L1 無  無  無  10 27 41
1 PR006663 CD73 51 57 65 8 22 35
PD-L1 無  無  無  14 27 39
3 PR006667 CD73 51 57 65 8 22 35
PD-L1 無  無  無  14 27 39
1 PR006664 CD73 51 57 65 8 22 35
PD-L1 無  無  無  14 27 41
3 PR006668 CD73 51 57 65 8 22 35
PD-L1 無  無  無  14 27 41
2 PR003569 CD73 51 57 65 8 22 35
PD-L1 無  無  無  10 23 36
2 PR003739 CD73 52 58 66 12 25 37
PD-L1 無  無  無  10 23 36
2 PR004295 CD73 53 59 67 10 26 38
PD-L1 無  無  無  10 23 36
表21：CD73 × PD-L1雙抗分子蛋白的表達和物理化學性質
結構編號 雙抗分子 表達體系和體積 第一步純化後產量 (mg/L) SEC-HPLC 純度 (%) 內毒素水平 (EU/mg)
2 PR006268 100ml 34.2 98.76% ＜1
2 PR006269 100ml 32.2 98.59% ＜1
2 PR006270 100ml 24.6 99.29% ＜1
2 PR006271 100ml 38.2 98.70% ＜1
1 PR006663 40ml 43 98.41% ＜0.1
3 PR006667 40ml 47.5 97.61% ＜0.1
1 PR006664 40ml 43.75 97.93% ＜0.1
3 PR006668 40ml 68 96.14% ＜0.1
2 PR003569 1L 66 99.4% ＜0.2
2 PR003739 1L 40 99.42% ＜0.2
2 PR004295 40ml 69 94.7% ＜0.6
實施例10. CD73 × PD-L1雙特異性抗體與過表達人PD-L1或人CD73的細胞的結合（FACS）
為了研究CD73 × PD-L1雙特異性抗體與結合人CD73和PD-L1的活性，採用過表達人CD73或PD-L1的CHO-K1細胞株（CHO-K1-hCD73，CHO-K1-hPD-L1）進行細胞水平的結合實驗。簡言之，消化CHO-K1-hCD73和CHO-K1-hPD-L1細胞，並用F-12K完全培養基重懸，將細胞密度調整為1×10 6細胞/mL。以100 µL細胞/孔接種於96孔V底板（Corning, #3894），隨後加入100 µL/孔，於500 g 4℃離心5分鐘，棄上清。稀釋抗體至最高終濃度50 nM，3倍稀釋，共8個濃度。取100 µL稀釋後的抗體加入到細胞中，將細胞放置於4℃，避光培養1小時。之後，加入100 µL/孔預冷PBS漂洗細胞兩次，於500 g 4℃離心5分鐘，棄上清。再加入100 µL/孔螢光二抗（山羊抗人IgG (H+L)第二抗體，Alexa Fluor® 488 conjugate, Invitrogen, #A11013, 1:1000），4℃，避光培養30分鐘。用200 µL/孔預冷PBS洗滌細胞兩次，於500 g 4℃離心5分鐘，棄上清。最後，200 µL/孔預冷PBS重懸細胞，使用BD FACS CANTOII讀取螢光發光訊號值。
圖15結果顯示，本發明的抗CD73抗體PR000846和PR001408能夠特異性結合過表達人CD73的CHO-K1 細胞（圖15之A）；本發明的CD73×PD-L1雙特異性抗體（PR003569和PR003739）能夠結合過表達人CD73的CHO-K1 細胞（圖15之A）；本發明的抗CD73抗體PR003836能夠特異性結合過表達人CD73的CHO-K1 細胞（圖15之B）；本發明的CD73×PD-L1雙特異性抗體PR004295能夠結合過表達人CD73的CHO-K1 細胞（圖15之B）；
本發明的抗CD73抗體PR000846能夠特異性結合過表達人CD73的CHO-K1細胞（圖15之C、圖15之D）；本發明的CD73×PD-L1雙特異性抗體（PR006268、PR006269、PR006270、PR006271、PR006661、PR006662、PR006663、PR006664、PR006667、PR006668）能夠結合過表達人CD73的CHO-K1 細胞（圖15之C、圖15之D）；本發明的抗PD-L1抗體PR002082能夠結合過表達人PD-L1的CHO-K1 細胞（圖15之E）；本發明的CD73×PD-L1雙特異性抗體PR003569、PR003739和PR004295能夠結合過表達人PD-L1的CHO-K1 細胞（圖15之E、圖15之F）。
本發明的抗CD73抗體，抗PD-L1抗體以及CD73×PD-L1雙特異性抗體的EC50值在0.3418nM-2.929 nM的範圍內。圖15之C中起始濃度為50nM，3倍梯度稀釋，共八個濃度；圖15之D中起始濃度為100nM，3倍梯度稀釋，共八個濃度。
實施例11. CD73 × PD-L1雙特異性抗體抑制CD73的酶活性
利用孔雀綠法測定抗體抑制可溶性重組CD73的酶活性，首先在384孔板（Corning, #3799）中加入12.5 µL 1 nM重組CD73蛋白和12.5 µL 1 nM的抗體（實驗緩衝液為25 mM Tris pH 7.5，5 mM MgCl 2，0.005% 吐溫-20），室溫培養1小時。加入25 µL AMP（最高濃度200 µM，用實驗緩衝液2倍稀釋至8個濃度），室溫培養15分鐘。檢測每個孔中無機磷酸鹽的濃度，無機磷酸鹽濃度的測定按照供應商的說明書操作。測定結束後用Molecular Devices（SPECTRAMax plus384）讀板機記錄620 nm光吸收值。實驗結果用GraphPad Prism 8.0分析作圖。
圖16結果顯示，本發明的CD73xPD-L1雙特異性抗體PR003569、PR003739、PR006268、PR006269、PR006270、PR006271、PR006663、PR006664、PR006667、PR006668能夠非競爭性的抑制CD73蛋白酶活性，和親本單株抗體PR000846活性相當。
實施例12. 利用報導基因細胞系檢測CD73 × PD-L1雙特異性抗體對PD-1訊號通路的抑制作用
將表達PD-L1和OS8（CD3單鏈抗體跨膜蛋白）的HEK293T（eBioscience）細胞鋪到96孔板上，細胞量為1.25×10 4/孔，100 µL /孔。在37℃ 5% CO 2環境下培養過夜。加入50 µL /孔的待測抗原結合蛋白稀釋液，起始濃度為100 nM，5倍濃度稀釋，hlgG1為對照組。加入5×10 4/孔的可持續表達PD-1和NFAT-螢光素酶報導基因的Jurkat報告細胞（UPharm）50 µL /孔。在37℃ 5% CO 2環境下培養6小時。加入ONE-GloT螢光素酶試劑（Promega, #E6110），室溫培養5分鐘，酶標儀檢測發光值。
圖17結果顯示，利用報導基因細胞系檢測本發明的CD73×PD-L1雙特異性抗體PR003569，PR003739以及PR004295對PD-1訊號通路具有抑制作用。
實施例13. CD73 × PD-L1雙特異性抗體在混合淋巴細胞反應（MLR）試驗中啟動T細胞
購買AllCells PBMC細胞，分離CD14+單核細胞，加入重組人源白介素4（IL-4）（R&D, #204-GMP）和人源GM-CSF（R&D, #215-GM/CF）誘導6天後，獲得未成熟的人樹突狀細胞（iDC細胞）。繼續加入1 μg/mL的脂多糖（Lipopolysaccharide, LPS; Sigma, #L2630），誘導24小時，獲得成熟的樹突狀細胞（mDC細胞）。採用Pan-T細胞分離試劑盒（Miltenyibiotec , #130-096-535）從第二供體PBMC細胞中分離得到T淋巴細胞。將1×10 5/孔的T淋巴細胞和1×10 4/孔的mDC細胞按10: 1比例接種至96孔板，加入稀釋的抗原結合蛋白和及陰陽性對照抗體。在37℃ 5% CO 2培養箱培養5天。收集第三天和第五天的上清液，採用ELISA試劑盒，分別檢測IL-2（ThermoFisher, #88-7025-88）和IFN-γ（ThermoFisher, #88-7316-88）的分泌量。
圖18結果顯示，MLR法體外檢測本發明的CD73xPD-L1雙特異性抗體PR003569，PR003739和PR004295對T細胞具有啟動作用。與人同種型IgG相比，單獨的抗PD-L1單抗PR002082相比，以及與單獨的抗CD73單抗PR000846，PR001408和PR003836相比，以及與抗PD-L1單抗PR002082與抗CD73的單抗PR000846的組合相比，以及與抗PD-L1單抗PR002082與抗CD73的單抗PR003836的組合相比，CD73xPD-L1雙特異性抗體PR003569，PR003739和PR004295在10nM的濃度下對於啟動T細胞分泌IL-2更顯著有效。而且基於CD73xPD-L1雙特異性抗體PR003569，PR003739和PR004295與抗PD-L1單抗PR002082與抗CD73的單抗PR000846的組合相比，以及與抗PD-L1單抗PR002082與抗CD73的單抗PR003836的組合相比更顯著的效果，可以認為CD73xPD-L1雙特異性抗體PR003569，PR003739和PR004295具有協同效果。
類似地，與人同種型IgG相比，與單獨的抗PD-L1單抗PR002082相比，以及與單獨的抗CD73單抗PR000846，PR001408和PR003836相比，以及與抗PD-L1單抗PR002082與抗CD73的單抗PR000846的組合相比，以及與抗PD-L1單抗PR002082與抗CD73的單抗PR003836的組合相比，CD73xPD-L1雙特異性抗體PR003569，PR003739和PR004295在10nM的濃度下對於啟動T細胞分泌IFN-γ顯著更有效。而且基於CD73xPD-L1雙特異性抗體PR003569，PR003739和PR004295與抗PD-L1單抗PR002082與抗CD73的單抗PR000846的組合相比，以及與抗PD-L1單抗PR002082與抗CD73的單抗PR003836的組合相比更顯著的效果，可以認為CD73xPD-L1雙特異性抗體PR003569，PR003739和PR004295具有協同效果。
無
圖1顯示本發明的抗原結合蛋白結合過表達人PD-L1的CHO-K1細胞的結果。其中，A、B顯示本發明的PD-L1抗原結合蛋白結合過表達人PD-L1的CHO-K1細胞的結果；C顯示本發明所述PR000960轉譯後修飾（PTM）變體結合過表達人PD-L1的CHO-K1細胞的結果；D、E、F顯示本發明所述PR002082親和力成熟變體結合過表達人PD-L1的CHO-K1細胞的結果。
圖2顯示本發明的抗原結合蛋白結合過表達食蟹猴PD-L1的CHO-K1細胞的結果。其中，A顯示本發明的PD-L1抗原結合蛋白結合過表達食蟹猴PD-L1的CHO-K1細胞的結果；B顯示本發明所述PR000960轉譯後修飾（PTM）變體結合過表達食蟹猴PD-L1的CHO-K1細胞的結果；C顯示本發明所述PR002082親和力成熟變體結合過表達猴PD-L1的CHO-K1細胞的結果。
圖3顯示本發明的抗原結合蛋白對PD-1訊號通路的抑制作用。其中，A顯示本發明的PD-L1抗原結合蛋白對PD-1訊號通路的抑制作用；B顯示本發明所述PR000960轉譯後修飾（PTM）變體對PD-1訊號通路的抑制作用；C、D顯示本發明所述PR002082親和力成熟變體對PD-1訊號通路的抑制作用。
圖4顯示在供體對#1的MLR實驗中本發明的抗原結合蛋白對T淋巴細胞分泌細胞因子的作用。其中，A顯示本發明的PD-L1抗原結合蛋白增強啟動T淋巴細胞分泌細胞因子IL-2的結果；B顯示本發明所述PD-L1抗原結合蛋白增強啟動T淋巴細胞分泌細胞因子IFN-γ的結果。
圖5顯示在供體對#2的MLR實驗中本發明的抗原結合蛋白對T淋巴細胞分泌細胞因子的作用。其中，A顯示本發明的PD-L1抗原結合蛋白增強啟動T淋巴細胞分泌細胞因子IL-2的結果；B顯示本發明的PD-L1抗原結合蛋白增強啟動T淋巴細胞分泌細胞因子IFN-γ的結果。
圖6顯示在供體對#3的MLR實驗中本發明的抗原結合蛋白對T淋巴細胞分泌細胞因子的作用。其中，A顯示本發明的PR000960轉譯後修飾（PTM）變體增強啟動T淋巴細胞分泌細胞因子IL-2的結果；B顯示本發明的PR000960轉譯後修飾（PTM）變體增強啟動T淋巴細胞分泌細胞因子IFN-γ的結果。
圖7顯示在供體對#4的MLR實驗中本發明的抗原結合蛋白對T淋巴細胞分泌細胞因子的作用。其中，A顯示本發明的PR002082親和力成熟變體增強啟動T淋巴細胞分泌細胞因子IL-2的結果；B顯示本發明的PR002082親和力成熟變體增強啟動T淋巴細胞分泌細胞因子IFN-γ的結果。
圖8顯示在供體對#5的MLR實驗中本發明的抗原結合蛋白對T淋巴細胞分泌細胞因子的作用。其中，A顯示本發明的PR002082親和力成熟變體增強啟動T淋巴細胞分泌細胞因子IL-2的結果；B顯示本發明的PR002082親和力成熟變體增強啟動T淋巴細胞分泌細胞因子IFN-γ的結果。
圖9顯示在供體對#6的MLR實驗中本發明的抗原結合蛋白對T淋巴細胞分泌細胞因子的作用。其中，A顯示本發明的PR002082親和力成熟變體增強啟動T淋巴細胞分泌細胞因子IL-2的結果；B顯示本發明的PR002082親和力成熟變體增強啟動T淋巴細胞分泌細胞因子IFN-γ的結果。
圖10顯示在供體對#7的MLR實驗中本發明的抗原結合蛋白對T淋巴細胞分泌細胞因子的作用。其中，A顯示本發明的PR002082親和力成熟變體增強啟動T淋巴細胞分泌細胞因子IL-2的結果；B顯示本發明的PR002082親和力成熟變體增強啟動T淋巴細胞分泌細胞因子IFN-γ的結果。
圖11顯示在供體對#8的MLR實驗中本發明的抗原結合蛋白對T淋巴細胞分泌細胞因子的作用。其中，A顯示本發明的PR002082親和力成熟變體增強啟動T淋巴細胞分泌細胞因子IL-2的結果；B顯示本發明的PR002082親和力成熟變體增強啟動T淋巴細胞分泌細胞因子IFN-γ的結果。
圖12顯示在供體對#9的MLR實驗中本發明的抗原結合蛋白對T淋巴細胞分泌細胞因子的作用。其中，A顯示本發明的PR002082親和力成熟變體增強啟動T淋巴細胞分泌細胞因子IL-2的結果；B顯示本發明的PR002082親和力成熟變體增強啟動T淋巴細胞分泌細胞因子IFN-γ的結果。
圖13顯示本發明的抗原結合蛋白在NCG小鼠重建人PBMC免疫系統的A375腫瘤模型中的抑制腫瘤作用。其中，A顯示體內抗瘤效果；B顯示在實驗過程中各組動物體重改變的結果。
圖14顯示本發明的雙特異性分子的結構示意圖。
圖15顯示抗體與穩定表達人CD73和人PD-L1 的CHO-K1 細胞的結合。
圖16顯示抗體抑制CD73酶活性的實驗結果。
圖17顯示利用報導基因細胞系檢測抗體對PD-1/PD-L1訊號通路的抑制作用。
圖18顯示MLR法體外檢測融合蛋白對T細胞的啟動作用。
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Claims (69)

  1. 一種特異性結合PD-L1和/或其片段的分離的抗原結合蛋白，其包含抗體重鏈可變區VH，所述VH包含以下的互補決定區或其突變體： SEQ ID NO：9的胺基酸序列所示的HCDR1； SEQ ID NO：23的胺基酸序列所示的HCDR2；和/或 SEQ ID NO：36的胺基酸序列所示的HCDR3。
  2. 如請求項1所述之分離的抗原結合蛋白，其中，所述突變體為在所述VH的HCDR1、HCDR2、HCDR3的胺基酸序列上分別具有1、2、3或4個胺基酸的插入、缺失或取代， 較佳地，所述HCDR1的胺基酸序列為GFX 1FSX 2Y， 所述HCDR2的胺基酸序列為X 3YX 4GX 5X 6， 所述HCDR3的胺基酸序列為NRAX 7FGVX 8PDX 9SDI， 其中，X 1、X 2、X 3、X 4、X 5、X 6、X 7、X 8或X 9為選自N、T、D、S、W、R、K、E、I、A、V和L中的任一種； 更佳地，X 1為T、D或N， X 2為N或S， X 3為W或R， X 4為D或T， X 5為T或S， X 6為K、R或E， X 7為I或L， X 8為V或I，和/或 X 9為A或D。
  3. 如請求項1或2所述之分離的抗原結合蛋白，其中，所述HCDR1的突變體具有SEQ ID NO：10、SEQ ID NO：11、SEQ ID NO：13和SEQ ID NO：14中任一項所示的胺基酸序列。
  4. 如請求項1或2所述之分離的抗原結合蛋白，其中，所述HCDR2的突變體具有SEQ ID NO：24或SEQ ID NO：27所示的胺基酸序列。
  5. 如請求項1或2所述之分離的抗原結合蛋白，其中，所述HCDR3的突變體具有SEQ ID NO：39、SEQ ID NO：40和SEQ ID NO：41中任一項所示的胺基酸序列。
  6. 如請求項1所述之分離的抗原結合蛋白，其中，所述VH包含以下的互補決定區或其突變體： SEQ ID NO：9-11和SEQ ID NO：13-14中任一項的胺基酸序列所示的HCDR1； SEQ ID NO：23-24和SEQ ID NO：27中任一項的胺基酸序列所示的HCDR2；和/或 SEQ ID NO：36和SEQ ID NO：39-41中任一項的胺基酸序列所示的HCDR3。
  7. 如請求項1或2所述之分離的抗原結合蛋白，其中，所述VH包含以下互補決定區： 分別如SEQ ID NO：9，SEQ ID NO：23和SEQ ID NO：36所示的HCDR1，HCDR2和HCDR3；或 分別如SEQ ID NO：10，SEQ ID NO：23和SEQ ID NO：36所示的HCDR1，HCDR2和HCDR3；或 分別如SEQ ID NO：11，SEQ ID NO：24和SEQ ID NO：36所示的HCDR1，HCDR2和HCDR3；或 分別如SEQ ID NO：11，SEQ ID NO：23和SEQ ID NO：36所示的HCDR1，HCDR2和HCDR3；或 分別如SEQ ID NO：13，SEQ ID NO：23和SEQ ID NO：36所示的HCDR1，HCDR2和HCDR3；或 分別如SEQ ID NO：10，SEQ ID NO：23和SEQ ID NO：39所示的HCDR1，HCDR2和HCDR3；或 分別如SEQ ID NO：10，SEQ ID NO：23和SEQ ID NO：40所示的HCDR1，HCDR2和HCDR3；或 分別如SEQ ID NO：10，SEQ ID NO：23和SEQ ID NO：41所示的HCDR1，HCDR2和HCDR3；或 分別如SEQ ID NO：10，SEQ ID NO：27和SEQ ID NO：36所示的HCDR1，HCDR2和HCDR3；或 分別如SEQ ID NO：10，SEQ ID NO：27和SEQ ID NO：39所示的HCDR1，HCDR2和HCDR3；或 分別如SEQ ID NO：10，SEQ ID NO：27和SEQ ID NO：40所示的HCDR1，HCDR2和HCDR3；或 分別如SEQ ID NO：10，SEQ ID NO：27和SEQ ID NO：41所示的HCDR1，HCDR2和HCDR3；或 分別如SEQ ID NO：14，SEQ ID NO：27和SEQ ID NO：36所示的HCDR1，HCDR2和HCDR3；或 分別如SEQ ID NO：14，SEQ ID NO：27和SEQ ID NO：39所示的HCDR1，HCDR2和HCDR3；或 分別如SEQ ID NO：14，SEQ ID NO：27和SEQ ID NO：40所示的HCDR1，HCDR2和HCDR3；或 分別如SEQ ID NO：14，SEQ ID NO：27和SEQ ID NO：41所示的HCDR1，HCDR2和HCDR3。
  8. 如請求項1或2所述之分離的抗原結合蛋白，其中，所述VH還包含重鏈可變區框架區VH FWR，所述VH FWR包含VH FWR1，VH FWR2，VH FWR3和VH FWR4，所述VH FWR1具有SEQ ID NO：3-5中任一項所示的胺基酸序列，所述VH FWR2具有SEQ ID NO：17或SEQ ID NO：20所示的胺基酸序列，所述VH FWR3具有SEQ ID NO：30或SEQ ID NO：31所示的胺基酸序列，以及所述VH FWR4具有SEQ ID NO：43所示的胺基酸序列。
  9. 如請求項1或2所述之分離的抗原結合蛋白，其中，所述VH包含SEQ ID NO：74-77，SEQ ID NO：79-80和SEQ ID NO：82-92中任一項所示的胺基酸序列或與其具有至少80%、85%、88%、90%、92%、95%、97%、98%、99%或100%一致性的胺基酸序列。
  10. 如請求項1或2所述之分離的抗原結合蛋白，其還包含Fc區，或者與免疫球蛋白的Fc區等同的區域，較佳地，所述Fc區為人Fc，更佳地，所述人Fc為人IgG1 Fc。
  11. 如請求項10所述之分離的抗原結合蛋白，其中，所述Fc包含L234A、L235A和P329G突變，或L234A和L235A突變，或者包含S298A，E333A和K334A中的一個、兩個或三個突變，更佳地包含S298A，E333A和K334A突變。
  12. 如請求項1或2所述之分離的抗原結合蛋白，其包含胺基酸序列與SEQ ID NO：99、100、101、102、104、105、107、108、109、110、111、112、113、114、115、116或117具有至少80%、85%、88%、90%、92%、95%、97%、98%、99%或100%一致性的重鏈。
  13. 如請求項1或2所述之分離的抗原結合蛋白，其是HCAb形式或奈米抗體形式的抗原結合片段。
  14. 一種分離的核酸，其編碼如請求項1至13中任一項所述之分離的抗原結合蛋白。
  15. 一種表達載體，其包含如請求項14所述之分離的核酸。
  16. 一種宿主細胞，其包含如請求項14所述之分離的核酸，或如請求項15所述之表達載體。
  17. 一種抗體藥物偶聯物，其包含：如請求項1至13中任一項所述之分離的抗原結合蛋白；和與所述抗原結合蛋白共價連接的藥物。
  18. 如請求項17所述之抗體藥物偶聯物，其中，所述藥物選自化學治療劑、放射治療劑、免疫抑制劑和細胞毒性藥物。
  19. 一種嵌合抗原受體，其包括胞外抗原結合結構域、跨膜結構域和胞內訊號傳導結構域，其中所述胞外抗原結合結構域包含如請求項1至13中任一項所述之分離的抗原結合蛋白。
  20. 一種修飾的免疫細胞，其包含如請求項19所述之嵌合抗原受體。
  21. 一種多特異性抗體，其包含兩個或兩個以上的抗原結合結構域，其中一個抗原結合結構域包含如請求項1至13中任一項所述之分離的抗原結合蛋白。
  22. 一種藥物組合物，其包含：如請求項1至13中任一項所述之分離的抗原結合蛋白，如請求項17或18所述之抗體藥物偶聯物，如請求項19所述之嵌合抗原受體，如請求項20所述之修飾的免疫細胞或如請求項21所述之多特異性抗體；以及藥學上可接受的載體。
  23. 如請求項22所述之藥物組合物，其還包含選自化學治療劑、放射治療劑、免疫抑制劑和細胞毒性藥物的治療劑。
  24. 一種如請求項1至13中任一項所述之分離的抗原結合蛋白、如請求項14所述之分離的核酸、如請求項17或18所述之抗體藥物偶聯物、如請求項19所述之嵌合抗原受體、如請求項20所述之修飾的免疫細胞或如請求項21所述之多特異性抗體、如請求項22或23所述之藥物組合物在製備用於預防、治療和/或診斷免疫性疾病、急性和慢性炎性疾病、以及腫瘤疾病的藥物中的應用。
  25. 如請求項24所述之應用，其中，所述腫瘤為乳腺癌、腎細胞癌、黑色素瘤、結腸癌、B細胞淋巴瘤、黑色素瘤、頭頸癌、膀胱癌、胃癌、卵巢癌、惡性肉瘤、尿路上皮癌、肝癌、食道癌、胃食道交界癌、鼻咽癌、小細胞肺癌、子宮頸癌、子宮內膜癌、胰腺癌、前列腺癌、膠質瘤、非小細胞肺癌、急性粒細胞白血病、霍奇金淋巴瘤、皮膚鱗狀細胞癌、局部晚期和轉移性惡性腫瘤中的一種或多種； 所述炎性疾病為特應性皮炎或潰瘍性結腸炎中的一種或多種； 所述免疫性疾病為移植物抗宿主病、類風濕性關節炎、系統性紅斑狼瘡或哮喘中的一種或多種。
  26. 一種用於檢測樣品中的PD-L1的方法，所述方法包括用如請求項1至13中任一項所述之分離的抗原結合蛋白檢測樣品中的PD-L1的步驟，所述樣品為全血、紅血細胞濃縮物、血小板濃縮物、白細胞濃縮物、組織、骨髓吸出物、血漿、血清、腦脊液、糞便、尿液、培養的細胞、唾液、口腔分泌物和/或鼻腔分泌物；較佳地，所述方法為非診斷目的的。
  27. 一種特異性結合蛋白，其包含至少兩個結構域，並且能夠結合PD-L1或其片段，和/或CD73或其片段。
  28. 如請求項27所述之特異性結合蛋白，其包含第一結構域和第二結構域，所述第一結構域結合CD73或其片段，並且所述第二結構域結合PD-L1或其片段，所述第一結構域與所述第二結構域連接形成雙特異性結合蛋白。
  29. 如請求項28所述之特異性結合蛋白，其中，所述第一結構域為CD73抗體或其抗原結合片段，所述第二結構域為PD-L1抗體或其抗原結合片段，所述第一結構域和/或所述第二結構域選自IgG、Fab、Fab’、F(ab’) 2、Fv、scFv、VH、或者HCAb的形式，較佳地，所述Fab、Fab’、F(ab’) 2、Fv、scFv、VH的數量為一個或多個。
  30. 如請求項28所述之特異性結合蛋白，其中，所述第一結構域為IgG的形式，較佳地，所述IgG的重鏈恆定區為人重鏈恆定區，更佳為人IgG1、人IgG2、人IgG3或人IgG4重鏈恆定區。
  31. 如請求項30所述之特異性結合蛋白，其中，IgG包含L234A、L235A和P329G中的一個、兩個或三個突變，更佳地包含L234A和L235A的突變；或者包含S298A，E333A和K334A中的一個、兩個或三個突變，更佳地包含S298A，E333A和K334A突變； 較佳地，IgG的Fc為人IgG1的Fc。
  32. 如請求項28所述之特異性結合蛋白，其中，所述第一結構域為Fab的形式，更佳地，所述第一結構域包括2個Fab。
  33. 如請求項28所述之特異性結合蛋白，其中，所述第二結構域為VH， 較佳地，所述VH為人VH，更佳地，所述第二結構域具有兩個VH。
  34. 如請求項28所述之特異性結合蛋白，其中，所述第二結構域為HCAb形式，較佳地，所述HCAb的恆定區包含L234A、L235A和P329G突變，或L234A和L235A突變，或者包含S298A，E333A和K334A中的一個、兩個或三個突變，更佳地包含S298A，E333A和K334A突變。
  35. 如請求項28所述之特異性結合蛋白，其中，所述第一結構域與所述第二結構域直接連接或經連接肽L連接形成雙特異性結合蛋白，所述第二結構域連接在所述第一結構域的C末端或N末端。
  36. 如請求項35所述之特異性結合蛋白，其中，所述雙特異性結合蛋白包含短鏈和長鏈，所述短鏈具有N’-VL 1-CL 1-C’所示的結構；所述長鏈具有N’-VH 1-CH 1-h-CH 2-CH 3-L-VH 2-C’所示的結構； 或者，所述短鏈具有N’-VL 1-CL 1-C’所示的結構；所述長鏈具有N’-VH 2-L-VH 1-CH 1-h-CH 2-CH 3-C’所示的結構； 或者，所述短鏈具有N’-VH 1-CH 1-C’所示的結構；所述長鏈具有N’-VL 1-CL 1-L-VH 2-CH 2-CH 3-C’所示的結構， 其中，所述VL 1和VH 1分別為第一結構域的VL和VH，所述VH 2為第二結構域的VH，所述h為鉸鏈區，所述L為連接肽，所述CL 1是第一結構域的CL。
  37. 如請求項35或36所述之特異性結合蛋白，其中，所述L為長度為0-30個胺基酸長度的肽，較佳地，其胺基酸序列包括SEQ ID NO：136-157任一所示。
  38. 如請求項35或36所述之特異性結合蛋白，其中，所述長鏈的CH 3經由連接肽L連接到VH 2；L為0-30個胺基酸的多肽，較佳地，L包括SEQ ID NO. 136-157中任一項所示的胺基酸序列；或者長鏈的CH3與VH 2直接連接。
  39. 如請求項35或36所述之特異性結合蛋白，其中，所述長鏈的VH 1經由連接肽L連接到VH 2；L為長度為0-30個胺基酸長度的肽，較佳地，L包括SEQ ID NO. 136-157中任一項所示的胺基酸序列；或者所述長鏈的VH 1與VH 2直接連接。
  40. 如請求項35或36所述之特異性結合蛋白，其中，所述長鏈的VH 2經由連接肽L連接到CL 1；L是如SEQ ID NO. 136-157中任一項所示的胺基酸序列；或者所述長鏈的VH 2與CL 1直接連接。
  41. 如請求項28所述之特異性結合蛋白，其中，所述第一結構域包含輕鏈可變區VL和重鏈可變區VH，所述VL包含選自如下的互補決定區： SEQ ID NO：51，SEQ ID NO：52和SEQ ID NO：53中任一項的胺基酸序列所示的LCDR1； SEQ ID NO：57，SEQ ID NO：58和SEQ ID NO：59中任一項的胺基酸序列所示的LCDR2；和/或 SEQ ID NO：65，SEQ ID NO：66和SEQ ID NO：67中任一項的胺基酸序列所示的LCDR3； 所述VH包含選自如下的互補決定區： SEQ ID NO：8，SEQ ID NO：12和SEQ ID NO：10中任一項的胺基酸序列所示的HCDR1； SEQ ID NO：22，SEQ ID NO：25和SEQ ID NO：26中任一項的胺基酸序列所示的HCDR2；和/或 SEQ ID NO：35，SEQ ID NO：37和SEQ ID NO：38中任一項的胺基酸序列所示的HCDR3。
  42. 如請求項28所述之特異性結合蛋白，其中，所述第一結構域包含輕鏈可變區VL和重鏈可變區VH，所述VL和VH包含選自如下的互補決定區： 分別如SEQ ID NO：51，SEQ ID NO：57和SEQ ID NO：65所示的LCDR1，LCDR2和LCDR3；和，分別如SEQ ID NO：8，SEQ ID NO：22和SEQ ID NO：35所示的HCDR1，HCDR2和HCDR3； 分別如SEQ ID NO：52，SEQ ID NO：58和SEQ ID NO：66所示的LCDR1，LCDR2和LCDR3；和，分別如SEQ ID NO：12，SEQ ID NO：25和SEQ ID NO：37所示的HCDR1，HCDR2和HCDR3； 分別如SEQ ID NO：53，SEQ ID NO：59和SEQ ID NO：67所示的LCDR1，LCDR2和LCDR3；和，分別如SEQ ID NO：10，SEQ ID NO：26和SEQ ID NO：38所示的HCDR1，HCDR2和HCDR3。
  43. 如請求項28所述之特異性結合蛋白，其中，所述第一結構域包含VL和VH，所述VL的胺基酸序列與SEQ ID NO：94，SEQ ID NO：95或SEQ ID NO：96具有至少80%、85%、88%、90%、92%、95%、97%、98%、99%或100%一致性； 所述VH的胺基酸序列與SEQ ID NO：73，SEQ ID NO：78或SEQ ID NO：81具有至少80%、85%、88%、90%、92%、95%、97%、98%、99%或100%一致性。
  44. 如請求項28所述之特異性結合蛋白，其中，所述第一結構域包含VL和VH，所述VL和VH的胺基酸序列分別如SEQ ID NO: 94和SEQ ID NO: 73所示；或分別如SEQ ID NO: 95和SEQ ID NO: 78所示；或分別如SEQ ID NO: 96和SEQ ID NO: 81所示。
  45. 如請求項28所述之特異性結合蛋白，其中，所述第一結構域包含胺基酸序列與SEQ ID NO: 119，SEQ ID NO: 120或SEQ ID NO: 121具有至少80%、85%、88%、90%、92%、95%、97%、98%、99%或100%一致性的輕鏈；以及胺基酸序列與SEQ ID NO: 98，SEQ ID NO: 103或SEQ ID NO: 106具有至少80%、85%、88%、90%、92%、95%、97%、98%、99%或100%一致性的重鏈。
  46. 如請求項28所述之特異性結合蛋白，其中，所述第一結構域包含： SEQ ID NO: 119所示的輕鏈和SEQ ID NO: 98所示的重鏈；或 SEQ ID NO: 120所示的輕鏈和SEQ ID NO: 103所示的重鏈；或 SEQ ID NO: 121所示的輕鏈和SEQ ID NO: 106所示的重鏈。
  47. 如請求項28所述之特異性結合蛋白，其中，所述第二結構域為如請求項1至13中任一項所述之分離的抗原結合蛋白。
  48. 如請求項28所述之特異性結合蛋白，其中，所述特異性結合蛋白的長鏈包含與SEQ ID NO：122、123、124、125、126、127、128、129、130、132或133具有至少80%、85%、88%、90%、92%、95%、97%、98%、99%或100%一致性的胺基酸序列；以及所述特異性結合蛋白的短鏈包含與SEQ ID NO：119、120、121或131具有至少80%、85%、88%、90%、92%、95%、97%、98%、99%或100%一致性的胺基酸序列。
  49. 如請求項28所述之特異性結合蛋白，其中，所述特異性結合蛋白具有： SEQ ID NO：122所示的長鏈以及SEQ ID NO：119所示的短鏈；或 SEQ ID NO：123所示的長鏈以及SEQ ID NO：120所示的短鏈；或 SEQ ID NO：124所示的長鏈以及SEQ ID NO：121所示的短鏈；或 SEQ ID NO：125所示的長鏈以及SEQ ID NO：119所示的短鏈；或 SEQ ID NO：126所示的長鏈以及SEQ ID NO：119所示的短鏈；或 SEQ ID NO：127所示的長鏈以及SEQ ID NO：119所示的短鏈；或 SEQ ID NO：128所示的長鏈以及SEQ ID NO：119所示的短鏈；或 SEQ ID NO：129所示的長鏈以及SEQ ID NO：119所示的短鏈；或 SEQ ID NO：132所示的長鏈以及SEQ ID NO：131所示的短鏈；或 SEQ ID NO：130所示的長鏈以及SEQ ID NO：119所示的短鏈；或 SEQ ID NO：133所示的長鏈以及SEQ ID NO：131所示的短鏈。
  50. 如請求項28所述之特異性結合蛋白，其中，所述雙特異性結合蛋白為包含兩條第一多肽鏈以及兩條第二多肽鏈形成二價結構或四價對稱結構。
  51. 一種分離的核酸，其編碼如請求項28至50中任一項所述之特異性結合蛋白或其片段。
  52. 一種表達載體，其包含如請求項51所述之分離的核酸。
  53. 一種宿主細胞，其包含如請求項51所述之分離的核酸，或如請求項52所述之表達載體。
  54. 一種抗體藥物偶聯物，其包含：如請求項28至50中任一項所述之分離的抗原結合蛋白；和與所述抗原結合蛋白共價連接的藥物。
  55. 如請求項54所述之抗體藥物偶聯物，其中，所述藥物選自化學治療劑、放射治療劑、免疫抑制劑和細胞毒性藥物。
  56. 一種藥物組合物，其包含：如請求項28至50中任一項所述之特異性結合蛋白，或如請求項54或55所述之抗體藥物偶聯物；以及藥學上可接受的載體。
  57. 如請求項56所述之藥物組合物，其還包含選自化學治療劑、放射治療劑、免疫抑制劑和細胞毒性藥物的治療劑。
  58. 一種如請求項28至50中任一項所述之特異性結合蛋白、如請求項51所述之分離的核酸、如請求項54或55所述之抗體藥物偶聯物或如請求項56或57所述之藥物組合物在製備用於預防、治療和/或診斷免疫性疾病、急性和慢性炎性疾病、以及腫瘤疾病的藥物中的應用。
  59. 如請求項58所述之應用，其中，所述腫瘤為乳腺癌、腎細胞癌、黑色素瘤、結腸癌、B細胞淋巴瘤、黑色素瘤、頭頸癌、膀胱癌、胃癌、卵巢癌、惡性肉瘤、尿路上皮癌、肝癌、食道癌、胃食道交界癌、鼻咽癌、小細胞肺癌、子宮頸癌、子宮內膜癌、胰腺癌、前列腺癌、膠質瘤、非小細胞肺癌、急性粒細胞白血病、霍奇金淋巴瘤、皮膚鱗狀細胞癌、局部晚期和轉移性惡性腫瘤中的一種或多種； 所述炎性疾病為特應性皮炎或潰瘍性結腸炎中的一種或多種； 所述免疫性疾病為移植物抗宿主病、類風濕性關節炎、系統性紅斑狼瘡或哮喘中的一種或多種。
  60. 一種用於檢測樣品中的PD-L1和CD73的方法，所述方法包括用如請求項28至50中任一項所述之特異性結合蛋白檢測樣品中的PD-L1和CD73的步驟，所述樣品為全血、紅血細胞濃縮物、血小板濃縮物、白細胞濃縮物、組織、骨髓吸出物、血漿、血清、腦脊液、糞便、尿液、培養的細胞、唾液、口腔分泌物和/或鼻腔分泌物。
  61. 一種套裝藥盒，其包括一個或多個藥盒，所述藥盒包含如請求項1至13中任一項所述之抗原結合蛋白，如請求項17或18所述之抗體藥物偶聯物，或如請求項22或23所述之藥物組合物，
  62. 如請求項61所述之套裝藥盒，其中，所述套裝藥盒包括第一藥盒和第二藥盒，其中，所述第一藥盒包括如請求項1至13中任一項所述之抗原結合蛋白，如請求項17或18所述之抗體藥物偶聯物，或如請求項22或23所述之藥物組合物；其中，所述第二藥盒包含選自化學治療劑、放射治療劑、免疫抑制劑和細胞毒性藥物的治療劑。
  63. 一種套裝藥盒，其包括一個或多個藥盒，所述藥盒包含如請求項28至50中任一項所述之特異性結合蛋白，如請求項54或55所述之抗體藥物偶聯物，或如請求項56或57所述之藥物組合物。
  64. 如請求項63所述之套裝藥盒，其中，所述套裝藥盒包括第一藥盒和第二藥盒，其中，所述第一藥盒包括如請求項28至50中任一項所述之抗原結合蛋白，如請求項54或55所述之抗體藥物偶聯物，或如請求項56或57所述之藥物組合物；其中，所述第二藥盒包含選自化學治療劑、放射治療劑、免疫抑制劑和細胞毒性藥物的治療劑。
  65. 一種給藥裝置，其包含如請求項1至13中任一項所述之抗原結合蛋白，如請求項17或18所述之抗體藥物偶聯物，或如請求項22或23所述之藥物組合物， 較佳地，所述給藥裝置是預填充注射器。
  66. 一種給藥裝置，其包含如請求項28至50中任一項所述之特異性結合蛋白，如請求項54或55所述之抗體藥物偶聯物，或如請求項56或57所述之藥物組合物， 較佳地，所述給藥裝置是預填充注射器。
  67. 一種預防、治療和/或診斷腫瘤疾病、急性和慢性炎性疾病和/或免疫性疾病的方法，其包括向受試者施用治療有效量的如請求項1至13中任一項所述之抗原結合蛋白，如請求項17或18所述之抗體藥物偶聯物，或如請求項22或23所述之藥物組合物。
  68. 一種預防、治療和/或診斷腫瘤疾病、急性和慢性炎性疾病和/或免疫性疾病的方法，其包括向受試者施用治療有效量的如請求項28至50中任一項所述之抗原結合蛋白，如請求項54或55所述之抗體藥物偶聯物，或如請求項56或57所述之藥物組合物。
  69. 如請求項67或68所述之方法，其中，所述腫瘤為乳腺癌、腎細胞癌、黑色素瘤、結腸癌、B細胞淋巴瘤、黑色素瘤、頭頸癌、膀胱癌、胃癌、卵巢癌、惡性肉瘤、尿路上皮癌、肝癌、食道癌、胃食道交界癌、鼻咽癌、小細胞肺癌、子宮頸癌、子宮內膜癌、胰腺癌、前列腺癌、膠質瘤、非小細胞肺癌、急性粒細胞白血病、霍奇金淋巴瘤、皮膚鱗狀細胞癌、局部晚期和轉移性惡性腫瘤中的一種或多種； 所述炎性疾病為特應性皮炎或潰瘍性結腸炎中的一種或多種； 所述免疫性疾病為移植物抗宿主病、類風濕性關節炎、系統性紅斑狼瘡或哮喘中的一種或多種。
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