KR20210114920A - 인간 및 원숭이 cd38 항원에 특이적으로 결합하는 단일클론항체 및 이의 제조방법과 용도 - Google Patents
인간 및 원숭이 cd38 항원에 특이적으로 결합하는 단일클론항체 및 이의 제조방법과 용도 Download PDFInfo
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Abstract
본 발명은 항체의 경쇄 가변영역의 항원 상보성 결정부위 CDR1, CDR2 및 CDR3이 각각 서열번호 3, 서열번호 4 및 서열번호 5로 표시되는 아미노산 서열; 항체의 중쇄 가변영역의 항원 상보성 결정부위 CDR1, CDR2 및 CDR3이 각각 서열번호 8, 서열번호 9 및 서열번호 10으로 표시되는 아미노산 서열을 포함하는 인간 및 원숭이 CD38 항원에 특이적으로 결합하는 단일클론항체 또는 이의 유도체를 개시하였다. 상기 항체 또는 이의 유도체는 약학 조성물의 성분으로 또는 적합한 약학 제제로 제조될 수 있으며, 인간 골수종, 인간 림프종 등과 같이 CD38을 발현하는 양성 종양의 치료를 위해 단독으로 또는 화학 요법 등과 같은 다른 치료 수단과 함께 사용된다.
Description
본 발명은 생명공학-단일클론항체 분야에 속한다. 본 발명은 인간 및 원숭이 CD38 항원에 특이적으로 결합하는 단일클론항체 및 이의 코딩서열 및 이의 제조방법과 용도에 관한 것이다.
CD38(T10이라고도 함, OKT10 단일클론항체에 의해 인식되는 항원)은 분자량이 약 45kDa인 Ⅱ형 단일막관통 당단백질이다. 인간 및 마우스 CD38 유전자를 코딩하는 cDNA는 1990년대 초반에 이미 클로닝 및 보고되었으며(Jackson DG and Bell JI. J. Immunol. 1990, 144:2811-2815; Harada et al. J Immunol. 1993, 151:3111-8); 사이노몰구스 원숭이(cynomolgus macaque) CD38 유전자를 코딩하는 cDNA도 2004년에 클로닝 및 보고되었다(Ferrero E et al, BMC Immunol. 2004, 5:21). 인간 CD38 단백질의 전장은 300개의 아미노산을 가지고, 그 중 N-말단 영역의 21개 아미노산은 세포 내에, 22개의 아미노산은 세포막에 위치하며, 세포막 외부에 위치한 C-말단 영역은 257개의 아미노산을 갖는다. 사이노몰구스 원숭이 CD38 단백질의 전장은 301개의 아미노산을 가지며, 인간 CD38 단백질의 아미노산 서열과의 상동성은 92%이며, 반면에 마우스 CD38 단백질의 전장은 304개의 아미노산을 가지며, 인간 CD38 단백질의 아미노산 서열과의 상동성은 약 70%이다.
CD38의 생물학적 기능에 관련된 최초의 보고서는 States DJ 등이 1992년에 발표한 저술(States DJ, Walseth TF and Lee HC. Trends Biochem. Sci. 1992, 17: 495)에서 유래하였다. 상기 연구보고서에서, States DJ 등은 CD38분자와 군소(Aplysia)에서 유래된 ADP 리보실 사이클레이스(Aplysia ADP-ribosyl cyclase)가 구조적 상동성을 갖고 있음을 처음으로 발견하였고, CD38이 NAD+를 촉매하여 cADPR을 생성시킬 수 있는 ADP 리보실 사이클레이스 활성을 가질 것이라고 추측하였으며, cADPR은 세포 내에서 두번째 메신저 역할을 하여, 칼슘 이온(Ca2+)의 동원 및 수송에 참여하므로, CD38을 ADP-ribosyl cyclase/cyclic ADP-ribose hydrolase 1 (ADPR1)이라고도 한다. 다른 후속 연구에서도 이러한 추측이 확인되었으며 CD38 단백질 분자가 탈수소효소 활성을 더 가지고 있으며, cADPR로부터 ADPR의 생성을 더 촉진할 수 있음을 발견하였다(Howard M et al. Science. 1993; 262:105; Summerhill RJ, Jackson DG, Galione A. FEBS Lett. 1993, 335:231-3; Prasad GS et al, Nature Structural Biology 1996, 3:957-964). 따라서, CD38은 이기능성(bifunctional) 효소의 활성을 가지며, 상기 이기능성 효소의 활성 부위는 모두 세포막 외 구조 영역에 위치한다. CD38분자 구조 및 효소활성과 기능 관련 연구는 리뷰문헌을 참조할 수 있다(Mehta K, Shahid U and Malavasi F: Human CD38, a cell-surface protein with multiple function. FASEB J. 1996, 10; 1408-1417; George Shubinsky, Michael Schlesinger: The CD38 lymphocyte differentiation marker: new insight into its ectoenzymatic activity and its role as a signal transducer. Immunity 1997, 7:315-324).
CD38(T10) 항원은 1980년에 Feinnerz E 및 그의 동료에 의해 최초로 보고 및 발견되었다. 그들은 인간 유래 정상 흉선세포와 T-림프종 세포주 MOLT-4에서 당시 T10으로 불리는 코드명이 OKT10인 단일클론 항체에 의해 특이적으로 결합될 수 있는 항원이 발현됨을 관찰하였다(Feinnerz E et al. PNAS 1980, 77:1588-1592). 그 이후 다른 연구에서 CD38(T10)항원이 T-림프구뿐만 아니라, B-림프구, 대식세포, 수지상세포, 혈소판, 골수형질세포와 같은 인체의 다른 세포에서도 널리 발현되며, 그 외에, 중추신경계의 신경세포 및 신경교세포, 말초신경세포, 췌장의 섬세포, 뼈조직의 파골세포, 골격근세포, 심근세포 및 기관지 상피세포와 같은 다른 조직 세포에서도 상이한 수준의 CD38(T10) 항원이 발현됨을 증명하였다(리뷰문헌 참조: Mehta K, Shahid U and Malavasi F: Human CD38, a cell-surface protein with multiple function. FASEB J 10, 1408-1417).
그러나, 다른 조직세포에 비해, CD38 항원의 발현 수준이 다발성 골수종(multiple myeloma, MM) 및 B-림프종에서 상대적으로 가장 높았기때문에, 1990년대 초부터 CD38 항원은 다발성 골수종 및 B-림프종을 치료하는 이상적인 표적으로 간주되었으며, CD38 항원을 표적화한 단일클론항체를 치료제로 사용하는 동물의 생체 내(in vivo) 및 시험관 내(in vitro) 시험에서 다발성 골수종 및 B림프종을 치료하는 많은 연구 및 보고가 있었다.
예를 들어 Stevenson FK 등은 1991년에 OKT10 단일클론 항체의 유전공학 조작 후에 얻은 인간-마우스 키메라 항체가 시험관 내에서 항체의존 세포독성(antibody-dependent cellular cytotoxicity, ADCC)을 통해 CD38 양성 림프종 세포를 살상할 수 있다고 보고하였다(Stevenson FK et al, Blood. 1991, 7:1071-1079).
Goldmacher VS 등은 1994년에 리신(ricin)을 마우스 항-인간 CD38 단일클론항체 HB7에 이식하여, 면역독성(immunotoxin)을 갖는 항체-약물 복합체(antibody-drug-conjugated, ADC)를 얻었으며, 상기 항체-약물 복합체는 시험관 내에서 CD38 양성 종양세포의 활성을 더 강력하게 살상한다고 보고하였다(Goldmacher VS et al. Blood. 1994, 84:3017-25).
Ellis JH 등은 1995년에 또 다른 마우스 유래 항-CD38 단일클론항체 AT13/5의 유전공학 조작 후의 인간화 항체가 선구 마우스 유래 항체보다 더 강한 ADCC 활성을 가지고 있다고 보고하였다(Ellis JH et al, J Immunol. 1995, 155:925-37).
그러나, 이러한 초기 연구결과는 유용한 임상응용 프로그램으로 전환되거나 임상연구로 진입하지 못하였다.
다발성 골수종은 골수에서 분비되는 형질세포의 잠재적 축적과 낮은 증식 및 연장된 세포 성장주기로 인해 고칼슘혈증, 신장기능손상, 인접한 골수조직 파괴 및 빈혈 등 증상으로 이어질 수 있는 것을 특징으로 하는 악성 형질세포 질환이다. 2015년 이전에, 국내 외 임상연구에서 다발성 골수종을 치료하는 주요 방법에는 빈크리스틴(Vincristine), 시클로포스파미드(Cyclophosphamide), 멜파란(Melphalan), 아드리아마이신(Adriamycin)과 같은 화학요법 약물, 면역조절제(Immunomodulators, IMiDs), 프로테아좀 억제제(Proteasome Inhibitors, PIs), 비스포스포네이트(Bisphosphonates) 및 프리드니손(Prednisone), 덱사메타손(Dexamethasone)과 같은 호르몬 및 자가 줄기세포 이식 등이 포함되었다.
그 중, 대표적인 면역조절제 약물로는 미국 셀진제약사(Celgene)에서 개발하여 시판된 Thalomid(일반명칭 Thalidomide, 1998년 07월 미국 FDA 승인을 받아 시판됨), 레날리도마이드 Revlimid(일반명칭 lenalidomide, 2005년 12월 미국 FDA 승인을 받아 시판됨) 및 포말리도마이드 Pomalyst(일반명칭 Pomalidomide, 2013년 02월 미국 FDA 승인을 받아 시판됨)가 있다.
대표적인 프로테아좀 억제제 약물로는 일본 다케다제약사(Takeda/Millennium)에서 개발한 Velcade벨케이드(일반명칭 Bortezomib 보르테조밉, 2003년 05월 미국 FDA 승인을 받아 시판됨), 미국 Onyx사에서 개발한 Kyprolis 카필조밉(일반명칭 Carfilzomib, 2012년 07월 미국 FDA승인을 받아 시파된)이 있다. 비스포스포네이트의 대표적인 약물로는 노바티스사(Novartis)에서 개발한 Aredia(일반명칭 Pamidronate, 1991년 10월 미국 FDA 승인을 받아 시판됨) 및 Zometa(일반명칭 Zoledronic acid, 2001년 08월 미국 FDA 승인을 받아 시판됨)가 있다.
그러나 이러한 약물의 병용 후 완전반응률(Complete Response Rate, CRR)은 일반적으로 5%에 불과하였으며, 환자의 중앙생존기간(Median Survival Time, MST)은 일반적으로 첫 진단 후 36 내지 48개월이었다. 따라서, 다발성 골수종 치료 분야에 있어서 보다 효과적인 신규한 약물이나 치료방법의 개발이 시급하다.
다발성 골수종의 치료 분야에서 2015년 11월 미국 FDA는 Bortezomib보르테조밉 및 Lenalidomide를 포함하여 적어도 세번의 치료를 받았거나 또는 보르테조밉 및 레날리도마이드에 모두 내성이 있는 다발성 골수종 환자의 치료에 세계 최초로 항-CD38단일클론항체 약물인 Daratumumab(다라투무맙)의 사용을 승인함으로써, 단일클론항체를 이용한 표적 치료의 혁신적인 새로운 시대에 접어들었다.
Daratumumab의 상품명은 Darzalex이며, 미국 존슨앤존슨 Johnson & Johnson의 자회사인 Janssen Biotech 및 덴마크 Genmab사에서 공동으로 개발하였다. Daratumumab은 인간 CD38 항원에 특이적으로 결합하는 완전 인간 유래 IgG1/kappa를 인식하는 단일클론항체이며, 이는 최초로 Genmab사에서 개발한 코드명이 005인 항-인간 CD38 단일클론항체에서 유래하였다(de Weers et al. J Immunol 2001;186:1840-8; 국제 PCT 특허출원문서: PCT/DK2006/000166, 미국출원번호: US7829673B2). 전기 비임상 연구결과에 따르면 Daratumumab/005 단일클론항체는 보체의존성세포독성(complement-dependent cytotoxicity, CDC), 항체의존세포매개세포독성(antibody-dependent cell-mediated cytotoxicity, ADCC), 항체의존세포매개식균작용(antibody-dependent cell-mediated phagocytosis, ADCP), 및 종양세포의 아포토시스(apoptotosis)의 직접 유도 등 다양한 기전으로 골수종과 같은 CD38 항원 발현 양성 종양을 빠르게 살상한다. 그 외에, Daratumumab/005 단일클론항체는 또한 CD38 매개 효소활성(ADP-ribosyl cyclase)을 억제하여 효과를 나타낼 수 있다.
2011년 미국 존슨앤존슨 Johnson & Johnson과 Genmab사는 임상 협력을 통해 Daratumumab을 개발하기로 협의하였다. 2013년 Daratumumab은 골수종 치료를 위한 임상시험에서 우수한 단일제제 활성을 보여 미국 FDA로부터 신속심사지정(Fast Track Designation) 및 혁신신약지정(Breakthrough Therapy Designation)약물로 인정받았다. 2015년 11월 미국 FDA는 각각 GEN501(Lokhorst HM et al, N Engl J Med. 2015, 373:1207-19) 및 SIRIUS(Lonial S et al, Lancet. 2016, 387:1551-60)라는 두 프로젝트의 I/II기 임상시험 결과를 바탕으로, Daratumumab 약물의 시판을 신속하게 승인하였으며, bortezomib 보르테조밉 및 lenalidomide 레날리도마이드를 포함하여 적어도 세 번의 치료를 받았거나 동시에 bortezomib 보르테조밉 및 lenalidomide 레날리도마이드 치료 후 내성을 가진 다발성 골수종 환자의 4차 치료에 사용되었다. GEN501 및 SIRIUS의 임상시험에서, 결과적으로 주사 제제량이 16mg/kg체중인 Daratumumab 단일클론항체 치료군에서, 환자의 객관적 반응률(Objective response rate, ORR) 및 중앙 무진행 생존율(Progression-free survival, PFS)이 모두 현저하게 개선되었음을 보여주었다.
Johnson & Johnson 존슨앤존슨/Genmab사는 Daratumumab의 시판 승인을 받은 후, 코드명이 POLLUX 및 CASTOR인 두 프로젝트의 3상 임상연구를 수행하였으며, 그 중 POLLUX 연구는 골수종 환자의 3차 치료에서 lenalidomide 레날리도마이드 및 Dexamethasone 덱사메타손을 병용한 Daratumumab의 임상효능을 평가하는 것이며; lenalidomide 레날리도마이드 및 Dexamethasone 덱사메타손을 병용한 Daratumumab 286건(치료군), lenalidomide 레날리도마이드 및 Dexamethasone 덱사메타손 병용 치료군 283건(대조군)을 포함하여 총 568명의 골수종 환자가 연구에 투입되었다. 연구결과에 따르면, Daratumumab 을 병용한 치료군에서 12개월 무진행 생존(PFS) 환자의 비율은 83.2%이었고, 객관적 반응률(ORR)은 92.9%이었으며, 대조군(PFS비율은 60.1%이었고, ORR은 76.4%임)에 비해 유의하게 높았다(Dimopoulos et al. POLLUX Investigators, N Engl J Med. 2016, 375:1319-31).
CASTOR 연구는 골수종 환자의 3차 치료에서 Daratumumab과 Bortezomib 보르테조밉/벨케이드 및 Dexamethasone덱사메타손의 임상효능을 평가하는 것이며, Bortezomib 보르테조밉 및 Dexamethasone 덱사메타손을 병용한 Daratumumab의 약물치료군 251건(치료군)과 Bortezomib 보르테조밉 및 Dexamethasone 덱사메타손을 병용한 약물 대조군 247건을 포함하여 총 498건의 골수종 환자가 상기 연구에 투입되었다. 연구결과에 따르면 Daratumumab을 병용한 치료군에서 12개월 무진행생존 PFS 환자의 비율은 60.7%이었고, 객관적 반응률(ORR)은 82.9%이었으며, 대조군(PFS 비율은 26.9%이었고, ORR은 63.2%임)에 비해 유의하게 높았다(Palumbo A et al, CASTOR Investigators. N Engl J Med. 2016, 375:754-66).
상기 POLLUX 및 CASTOR 두 프로젝트의 3상 임상연구를 기반으로, 미국 FDA는 2016년 11월에 골수종 3차 치료를 위한 lenalidomide 레날리도마이드 및 Dexamethasone 덱사메타손과 Daratumumab의 병용 또는 Daratumumab과 Bortezomib 보르테조밉 및 Dexamethasone 덱사메타손의 병용을 승인하였다.
코드명 EQUULEUS(MMY1001)의 임상 연구결과를 기반으로, 미국 FDA는 2017년 06월에 골수종 2차 치료를 위한 Pomalidomide 포말리도마이드 및 Dexamethasone 덱사메타손과 Daratumumab의 병용을 승인하였다. 골수종 환자를 치료하는 EQUULEUS(MMY1001)의 임상연구에서 Pomalidomide 포말리도마이드 및 Dexamethasone 덱사메타손과 Daratumumab를 병용한 골수종 환자의 치료에서 객관적 반응률(ORR)은 60%이었고, 중앙 무진행생존기 PFS는 8.8개월이었으며, 중앙 생존기간은 합계 17.5개월로 나타났다(Ajai Chari, et al, EQUULEUS; MMY1001 Investigators: Blood. 2017, 130: 974-981).
코드명이 ALCYONE인 임상연구 결과를 기반으로, 미국 FDA는 2018년 05월에 고용량 화학요법 및 자가줄기세포이식(ASCT)을 받지 않은 새로 진단된 골수종 환자의 1차 치료를 위한 Bortezomib 보르테조밉, Melphalan 멜파란 및 Prednisone 프리드니손과 Daratumumab의 병용을 승인하였다. ALCYONE 연구는 골수종 환자 706명을 대상으로 하여, Daratumumab 병용군에서 18개월 무진행생존기(PFS) 환자의 비율은 71.6%이었으며, 객관적 반응률(ORR)은 90.9%이었으며, 모두 대조군(PFS비율은 50.2%이었고, ORR은 73.9%임(Mateos M-V et al, ALCYONE Investigators. N Engl J Med. 2018, 378:518-528)보다 유의하게 높은 결과를 나타내었다.
따라서, Daratumumab은 2015년 11월 미국 FDA의 첫 승인을 받아 시판된 이래, 3년만에 기존의 골수종 단일제제의 4차 치료제에서 1차 치료제로 단계적으로 승격되었으며, 빠르게 시장에서 베스트셀러 블록버스터 약품이 되었다. Daratumumab은 현재 세계에서 시판 승인을 받은 유일한 항-CD38 단일클론항체 약물이며, 현재 이미 임상 시험에 들어간 다른 항-CD38 단일클론항체 약물은 사노피(Sanofi)/Immungen사에서 공동 개발한 인간-마우스 키메라 단일클론항체 SAR650984(Isatuximab) 및 독일제약회사 MorphoSys가 phage-display 항체 라이브러리에서 선별한 인간 유래 단일클론 항-MOR202 단일클론항체뿐이며, 이러한 항체 약물에 대해 현재 개발된 주요 임상 적응증도 모두 골수종이다.
중국에서, 현재 골수종 치료에 사용되는 주요 약물은 수입된 Bortezomib 보르테조밉/벨케이드, lenalidomide 레날리도마이드 등이 있다. Bortezomib(보르테조밉/벨케이드)등 약물의 특허가 만료됨에 따라, 이미 수십개의 국내 기업에서 복제약을 개발하였으며, 그중 치루제약(Qilu pharmaceutical), 정대천칭제약(Chia tai Tianqing pharmaceutical) 및 쟈앙수 하오썬 제약(Jiangsu Hausen Pharmaceuticals)에서 최근 연구 개발한 Bortezomib 보르테조밉 복제약은 골수종 치료를 위해 최근 이미 중국식약청(CFDA)의 승인을 받았다. CD38을 표적으로 하는 단일클론항체 약물은 상기 존슨앤존슨사의 Daratumumab, 사노피사의 SAR650984(Isatuximab)단일클론항체 등 중국 국내에서 이미 임상시험 신청을 완료했거나 막 임상시험에 들어간 개별 수입품뿐이며, 중국 국내 기업이 독자적으로 개발한 CD38 단일클론항체 신약이 임상시험을 신청하거나 또는 임상시험 단계에 진입한 것은 없었다.
국내 외 골수종 환자가 많고 골수종 치료용 약물, 특히 항체 약물의 심각한 부족을 감안할 때 골수종 치료를 위한 새로운 약물, 특히 CD38 항원을 표적으로 하는 단일클론항체 약물의 연구개발은 매우 의미있고 필요하다.
Daratumumab은 해외 시판이래 임상 의사, 환자 및 시장에서 널리 호평을 받았지만 여전히 많은 결함과 부족한 점이 있으며 이의 단점 및 부족한 점은 적어도 하기 몇가지가 있다:
1)환자에게 Daratumumab 약물을 정맥주사한 경우, 임상적으로 높은 비율의 주입 이상 반응이 발생하였으며, 또한 투여시간이 비교적 길었다. 예를 들어 1차 정맥주사는 8시간이 걸리며, 후속 주사도 5 내지 6시간이 걸리고, 8주간의 첫번째 치료코스에서 환자는 일주일에 한 번 치료를 받아야 하였으며;
2)일부 골수종 환자는 임상적으로 Daratumumab 치료에 반응효과가 없었으며; 다른 일부 환자는 Daratumumab 치료를 받은 후에도 질환이 계속하여 진행되거나 또는 약물에 내성 현상이 생겼으며; 지금으로서는 아직 환자가 Daratumumab 치료에 내성이 생기거나 실패한 원인 및 기전이 명확하지 않으며;
3)Daratumumab은 원숭이 CD38 항원을 인식하지 못하였으며, 이는 단일제제 또는 다른 약물과의 병용으로 원숭이 등 기타 비인간 영장류에서 전임상 효능, 약리학 및 독성 연구 및 개발 적용을 제한하였다.
마우스 CD38과 인간 CD38 단백질 아미노산 서열의 상동성이 약 70%인 점을 감안할 때, 이론적으로 전통적인 항원단백질 면역화 마우스 및 하이브리도마 기술을 사용하여, 완전히 새롭거나 CD38 항원의 상이한 에피토프(epitope)에 대한 단일클론항체를 제조하거나 개발할 수 있음을 추측한다. 이러한 완전히 새롭거나 CD38 항원의 특이적 에피토프(epitope)를 인식하는 단일클론항체에서, 현재 시판중인 Daratumumab 또는 현재 임상연구 중인 기타 CD38 단일클론항체보다 더 강력한 생물학적 활성을 가지거나 더 안전한 약물을 개발할 것을 기대한다. 이러한 새로운 단일클론항체는 단일 약물로 사용되거나, 또는 현재 시판중인 다른 약물 예를 들어 Bortezomib 보르테조밉, Lenalidomide 레날리도마이드 등과 같은 기타 약물과 병용하거나 순차적으로 투여하여, 골수종 및 임프종과 같이 CD38 고 발현 종양 등 질환을 치료하는데 사용될 것이다.
본 발명에서 해결하고자 하는 첫번째 기술적 과제는 항원결합부위/결합 에피토프(epitope)가 기존의 다라투무맙(Daratumumab)과 상이한, 인간 및 원숭이 CD38 항원과 결합하는 완전히 새로운, 또한 체내 외에서 CD38 항원 고발현 종양 등을 살상시키는 생물학적 활성을 갖는 단일클론항체 또는 항체 Fab 단편, 단일사슬 항체 등과 같은 이의 유도체를 제공하는 것이다.
본 발명에서 해결하고자 하는 두번째 기술적 과제는 상기 항체를 코딩하는 DNA 분자 또는 유전자를 제공하는 것이다.
본 발명에서 해결하고자 하는 세번째 기술적 과제는 상기 항체를 포함하는 약물 또는 약학 조성물을 제공하는 것이다.
본 발명에서 해결하고자 하는 네번째 기술적 과제는 CD38 항원을 고 발현하는 양성 종양을 치료하기 위한 상기 항체를 포함하는 약물 또는 약학 조성물의 용도를 제공하는 것이다.
본 발명에서 해결하고자 하는 다섯번째 기술적 과제는 상기 항체의 제조방법을 제공하는 것이다.
상기 기술적 과제를 해결하기 위해, 본 발명은 하기 실시형태를 채택한다.
본 발명의 첫번째 측면에 있어서, 제1가변영역 및 제2가변영역을 포함하고, 상기 제1가변영역은 항체의 경쇄 가변영역이고, 이의 항원 상보성 결정부위 CDR1, CDR2 및 CDR3은 각각 서열번호 3, 서열번호 4 및 서열번호 5로 표시되는 아미노산 서열이고; 상기 제2가변영역은 항체의 중쇄 가변영역이며, 이의 항원 상보성 결정부위 CDR1, CDR2 및 CDR3은 각각 서열번호 8, 서열번호 9 및 서열번호 10으로 표시되는 아미노산 서열인 항원결합부위/결합 에피토프(epitope)가 기존의 Daratumumab과 상이한, 신규한 항-CD38 단일클론항체 또는 이의 유도체를 제공한다.
상기 항체는 인간-마우스 키메라, 반키메라/반인간 또는 인간 유래 단일클론항체 등을 포함하며, 상기 유도체는 항체 Fab 단편, 단일사슬 Fab-단편, Fv-단편, 단일사슬항체, 이중특이성 항체(bi-specific), 항체-약물 복합체(antibody-drug-conjugated, ADC), 키메라 항원 수용체 T세포(chimeric antigen receptor T-Cell, CAR-T) 등을 포함한다.
본 발명의 바람직한 실시형태로서, 상기 제1가변영역은 서열번호 2로 표시되는 아미노산 서열인 항체의 경쇄 가변영역이고; 상기 제2가변영역은 서열번호 7로 표시되는 아미노산 서열인 항체의 중쇄 가변영역이다.
본 발명의 바람직한 실시형태로서, 상기 제1가변영역은 항체의 경쇄 가변영역이고, 서열번호 11로 표시되는 아미노산 서열이며; 상기 제2가변영역은 항체의 중쇄 가변영역이고, 서열번호 12로 표시되는 아미노산 서열 또는 서열번호 7로 표시되는 아미노산 서열이다.
본 발명의 바람직한 실시형태로서, 이는 상기 항체의 경쇄 가변영역 및 인간 항체의 경쇄 불변영역을 포함하며, 상기 항체의 중쇄 가변영역 및 인간 항체의 중쇄 불변영역의 힌지 영역, CH1 영역, CH2 영역 및 CH3 영역을 더 포함한다.
본 발명의 바람직한 실시형태로서, 상기 인간 항체의 경쇄 불변영역은 인간 항체 kappa 사슬 또는 항체 lamda 사슬로부터 유래되고, 상기 인간 항체의 중쇄 불변영역은 인간 IgG1, IgG2, IgG3 또는 IgG4 등 서브 타입에서 유래되며, 여기서, 바람직하게는 IgG1이다.
본 발명의 두번째 측면에 있어서, 항체의 경쇄 가변영역은 서열번호 1 또는 서열번호 13으로 표시되는 뉴클레오티드 서열이며, 항체의 중쇄 가변영역은 서열번호 6 또는 서열번호 14의 뉴클레오티드 서열인 상기 항체 또는 이의 유도체를 코딩하는 DNA 분자 또는 유전자를 제공한다.
본 발명의 세번째 측면에 있어서, 상기 항체 또는 유도체를 코딩하는 DNA 분자/유전자 뉴클레오티드 서열 및 상기 서열에 작동 가능하게 연결된 발현 조절 서열을 포함하는 발현벡터를 제공한다.
본 발명의 네번째 측면에 있어서, 상기 발현벡터로 형질전환되어 형성된 재조합 숙주 세포를 제공한다. 상기 재조합 숙주세포 또는 이의 자손세포는 상기 항체 또는 이의 유도체를 발현한다. 상기 항체는 인간 유래 단일클론항체를 포함하고, 유도체는 항체 Fab 단편, 단일사슬 항체, 이중특이성 항체(bi-specific)등을 포함한다.
본 발명의 다섯번째 측면에 있어서, 약학적으로 유효량의 상기 항체 또는 이의 유도체, 및 약학적으로 허용 가능한 담체를 포함하는 약물 또는 약학 조성물을 제공한다.
본 발명의 여섯번째 측면에 있어서, 종양 치료용 약물을 제조하기 위한, 특히 CD38 발현 양성 종양 치료용 약물을 제조하기 위한, 상기 항체의 약물 또는 약학 조성물의 용도를 제공한다. 상기 CD38 발현 양성 종양은 바람직하게는 인간골수종, 림프종(B-림프구성 종양) 등이다. 본 발명의 구체적인 실시형태에 있어서, 본 발명에서는 상기 항체가 생체 내에서 CD38 고 발현의 인간 B-림프종 Raji의 성장을 억제하기 위한 항체의 용도를 설명한다.
본 발명의 다른 바람직한 실시형태로서, 본 발명의 항 CD38 항체로 CD38 발현 양성 종양을 치료할 경우, 항체의 ADCC 또는 CDC를 유지하거나 증가시켜, 종양조직 및 세포에 대한 더 강력한 살상 효과에 도달하기 위해, 야생형 또는 유전자 변형된 인간 IgG1, IgM 서브 타입 항체의 불변영역을 사용하는 것을 더 많이 고려할 수 있다. 야생형 또는 유전자 변형된 인간 IgG1, IgM 서브 타입 항체의 불변영역은 당업자에게 공지된 유전공학 기술을 사용하여 클로닝하여 얻거나, 또는 시험관 내 합성으로 제조될 수 있다.
본 발명에서 항 CD38 항체 또는 이의 유도체는, 표적화된 담체로서 기타 항종양약물 또는 독소와 함께 이식 또는 랩핑되어, 항체-약물 복합체(antibody-drug-conjugated, ADC)를 형성하여, 함께 종양 조직을 표적화하여, 더 우수한 종양세포 살상 효과를 얻을 수 있다. 항체 및 약물 또는 독소와 함께 이식 또는 랩핑하는 방법은 당업자에게 공지된 통상적인 기술을 사용할 수 있다.
본 발명의 다른 바람직한 실시형태로서, 본 발명의 항 CD38 항체 또는 이의 유도체는 CD38 발현 양성 종양의 치료를 위한 항종양 혈관신생약물 또는 면역관문억제포인트(inhibitory immune checkpoint molecules)를 표적으로 하는 약물과 순차적으로 또는 병용하여 사용될 수 있다.
그 중에서 본 발명의 항 CD38 항체 또는 이의 유도체와 순차적으로 또는 병용하여 사용되는 항종양 혈관신생 약물은 바람직하게 VEGF 또는 VEGF 수용체(VEGF-R)를 표적화하는 거대분자 생물학적 약물 또는 소분자 화학적 약물일 수 있다. 그 중에서 VEGF/ 또는 VEGF-R을 표적화하는 거대분자 생물학적 약물은 바람직하게는 항-VEGF 단일클론 약물인 베바시주맙(Bevacizumab, 상품명 Avastin), 항-VEGF 단일클론 Fab 단편인 라니비주맙(Ranibizumab, 상품명Lucentis); 항-VEGFR2 단일클론항체인 라무시루맙(Ramucirumab, 상품명Gyramza) 및 코드명이 hPV19인 항-VEGF 단일클론항체(STAINWEI사에서 현재 연구 중인 약물, 중국특허문헌: 특허 등록번호: 201210540692X, 특허명칭: 혈관내피세포성장인자 및 이의 수용체에 대한 결합을 길항 및 억제하기 위한 단일클론항체와 이의 코딩 서열 및 용도; 및 특허 등록번호가 US9580498B2인 미국특허문헌); 또는 VEGF 수용체-Fc 융합단백질 약물인 애플리버셉트(Albercept, 상품명:Eylea), 캉바이시푸(conbercept) 등을 포함한다. VEGF 수용체를 표적화하는 소분자 화학적 약물은 바람직하게는 수니티닙(Sunitinib), 소라페닙(sorafenib), 아파티닙(apatinib), 파조파닙(Pazopanib)등을 포함한다.
반면에 본 발명에 있어서, 항 CD38 항체 또는 이의 유도체와 순차적으로 또는 병용하여 사용되는 면역관문억제포인트 약물은 바람직하게는 항-CTLA4 (Cytotoxic T-lymphocyte Antigen-4) Ipilimumab 이필리무맙 단일클론항체(상품명 Yervoy); 항 PD-1(programmed death protein -1) 단일클론항체 Nivolumab(상품명 Opdivo), Pembrolizumab(상품명 Keytruda) 및 STAINWEI사에서 연구 중인 항-PD-1단일클론항체 hAB21 (PCT 특허출원문서: PCT/CN2017/089282, 인간 PD-1 항원 및 이의 리간드에 대한 결합을 길항 및 억제하기 위한 단일클론항체 및 이의 제조방법과 용도)등을 포함하며; 항 PD-L1 단일클론 약물은 Atezolizumab (상품명 Tecentriq), Avelumab(상품명 Bavencio), Durvalumab (상품명 Imfinzi) 등을 포함한다.
본 발명의 다른 바람직한 실시형태로서, 본 발명의 항 CD38 항체는 또한 먼저 키메라항원 수용체 T세포(chimeric antigen receptor T-Cell, CAR-T)로 제조되고, 시험관 내에서 종양 환자의 말초혈액으로부터 분리된 T-림프구와 같은 면역세포에 도입되고, 다시 시험관 내에서 배양 및 증폭시킨 후, CD38 항원 인식을 갖는 이들 림프구를 다시 인체 내에 주입하여, 체내에서 CD38 항원을 고 발현하는 종양을 표적화 함으로써, 종양 치료 효과를 달성할 수 있게 된다. 본 발명의 항 CD38 항체를 키메라항원 수용체 T세포(CAR-T)로 제조함에 있어서 당업자에게 공지된 통상적인 기술을 사용할 수 있다.
본 발명의 일곱번째 측면에서, 상기 항체 또는 유도체의 제조 방법을 제공하며, 상기 방법은 하기 단계를 포함한다:
a)
상기 DNA 서열 및 상기 서열에 작동가능하게 연결된 발현 조절 서열을 포함하는 발현벡터를 제공하는 단계;
b)
단계a)의 발현벡터로 숙주세포를 형질전환하는 단계;
c)
상기 항체의 발현에 적합한 조건에서 단계b)에서 수득된 숙주세포를 배양하는 단계, 및
d)
상기 숙주세포 배양액으로부터 상기 항체를 분리 및 정제하여 수득하는 단계.
본 명세서에 사용된 용어 "단일클론항체 (mAb)"는 순수한 세포주로부터 수득된 면역글로불린을 지칭하고, 동일한 구조 및 화학적 특성을 가지며, 단일 항원결정기에 특이적이다. 단일클론항체는 통상적인 다클론항체의 제제(일반적으로 상이한 결정기에 대해 상이한 항체를 가짐)와 다르며, 각각의 단일클론항체는 항원 상의 단일 결정기를 타겟한 것이다. 이들의 특이성 외에, 단일클론항체의 장점은 이들이 하이브리도마 또는 재조합 조작된 세포배양에 의해 수득되어 다른 면역글로불린이 혼합되지 않을 것이라는 점이다. 수식어 "단일클론항체"는 항체의 특성을 나타내며 균질한 항체군으로부터 얻어지며, 이는 항체를 생산하기 위해 특별한 방법을 요구하는 것으로 해석되어서는 안된다.
본 명세서에 사용된 용어 "인간화 단일클론항체"는 마우스 단일클론항체의 아미노산 서열에서 상보성 결정부위(complementarity-determining regions, CDR)를 보존한 외에, 기타 서열(가변영역의 프레임 워크영역 서열을 포함)의 전부 또는 대부분을 성인 면역글로불린의 아미노산 서열로 대체하여, 유전공학을 통해 마우스의 단일클론항체의 면역원성을 최대한 감소시키는 것이다.
본원에 사용된 용어 "항체" 및 "면역글로불린"은 동일한 구조적 특징을 갖는 약 150000 달톤의 이종사량체 당단백질이며, 이는 2개의 동일한 경쇄(L) 및 2개의 동일한 중쇄(H)로 구성된다. 각각의 경쇄는 공유 이황화 결합을 통해 중쇄에 연결되고, 상이한 면역글로불린 동종형의 중쇄 사이의 이황화 결합의 수는 상이하다. 각각의 중쇄 및 경쇄는 또한 규칙적으로 이격된 사슬 내 이황화 결합을 갖는다. 각 중쇄는 한쪽 끝에 가변영역(VH)이 있다. 그 뒤에 복수의 불변 영역이 있다. 각각의 경쇄는 한쪽 끝에 가변영역(VL)이 있고, 다른 한쪽 끝에 불변영역을 가지며; 경쇄의 불변영역은 중쇄의 제1불변영역과 대향하고, 경쇄의 가변영역은 중쇄의 가변영역과 대향한다. 특수 아미노산 잔기는 경쇄 및 중쇄의 가변영역 사이에서 계면을 형성한다.
본 명세서에 사용된 용어 "가변"은 항체의 가변영역의 특정 부분이 서열상에서 상이함을 나타내며, 이들의 특정 항원에 대한 다양한 특정 항체의 결합 및 특이성을 형성한다. 그러나, 가변성은 항체의 가변영역에 걸쳐 고르게 분포되지는 않는다. 이는 경쇄 및 중쇄 가변영역에서 상보성 결정부위(CDR) 또는 초가변영역을 이루는 3개의 단편에 집중된다. 가변영역의 보다 보수적인 부분을 프레임워크 영역(Framework regions, FR)이라고 한다. 항체의 중쇄 및 경쇄의 가변영역은 각각 4개의 FR 영역을 포함하며, 이들은 대략 β-시트 구성이고, 연결루프를 형성하는 3개의 CDR에 의해 연결되며, 일부 경우에는 부분 β-시트 구조를 형성할 수 있다. 각 사슬의 CDR은 FR 영역을 통해 밀접하게 기대어 있고 다른 사슬의 CDR과 함께 항체의 항원 결합부위를 형성한다(Kabat 등, NIH Publ. No. 91-3242, 권 1, 647-669페이지(1991)를 참조). 항체 불변영역은 항원에 대한 항체의 결합에 직접 관여하는 것이 아니며, 항체의존세포독성(Antibody-dependent cellular cytotoxicity, ADCC) 또는 보체의존세포독성(Complemnt-dependent cytotoxicity, CDC)에 관여하는 것과 같은 상이한 작용효과를 나타낸다.
본 발명의 항체는 일반적으로 하기 방법으로 제조할 수 있다:
먼저, 적절한 발현 조절 서열을 포함하는 발현벡터에 본 발명의 항체를 코딩하는 유전자를 삽입한다.
본 명세서에 사용된 용어 "발현 조절 서열"은 일반적으로 유전자 발현의 조절에 관여하는 서열을 지칭한다. 발현 조절 서열은 표적 유전자에 작동 가능하게 연결된 프로모터 및 종결인자를 포함한다. 본 발명의 항체를 코딩하는 유전자(DNA) 서열은 본 발명에 개시된 단백질 서열의 인공합성 또는 PCR에 의한 증폭과 같은 당업자에게 공지된 통상적인 수단에 의해 수득될 수 있다. 그 후, 당업계에 공지된 다양한 방법을 이용하여 합성 또는 PCR로 증폭시켜 얻은 DNA 단편을 적합한 발현벡터에 삽입할 수 있다. 본 발명에 사용되는 발현벡터는 Invitrogen사의 pCDNA3.1 발현벡터와 같이 당업자에게 공지된 시판되는 발현벡터 일 수 있다.
발현벡터를 수용하여 형질전환에 사용되는 적합한 숙주세포는 일반적으로 원핵세포 및 진핵세포를 포함한다. 일반적으로 사용되는 원핵생물 숙주세포의 예는 대장균, 고초균 등을 포함한다. 일반적으로 사용되는 진핵생물 숙주세포는 효모세포, 곤충세포, 포유동물세포 등을 포함한다. 본 발명에서, 바람직한 숙주세포는 포유동물세포, 특히 차이니즈 햄스터 난소(CHO) 세포이다.
발현벡터로 형질전환된 숙주세포를 적합한 조건 하에서 (예를 들어, 세포배양 플라스크 또는 생물반응기에서 배양물을 부착 또는 현탁시키기 위해 무혈청 배지를 사용함) 배양한 후, 배양 상청액을 수거한 다음, 단백질-A 친화성 크로마토그래피, 이온교환 크로마토그래피 및 필터멸균 등을 포함하는 당업자에게 공지된 통상적인 분리단계 또는 수단으로 정제하여 본 발명의 항체를 얻는다.
정제하여 얻은 본 발명의 항체는 멸균된 생리식염수와 같은 적합한 용매에 용해될 수 있으며, 용해도는 0.01 내지 100mg/ml 사이로 제조될 수 있으며, 이상적인 최종 용해도는 1 내지 40 mg/ml 사이로 제조될 수 있다.
인간 CD38 항원에 특이적으로 결합하는 마우스 단일클론항체 및 이를 분비하는 하이브리도마 세포주를 얻기 위해, 본 발명은 포유동물에 의해 발현되는 재조합 인간 CD38 세포막 외 단백질을 면역항원으로 선택하고, 소량으로 마우스에 반복적으로 여러번 피하 면역함으로써 항-CD38 단백질을 분비하는 다클론항체를 얻으며; 이어서 고역가 항체를 포함하는 마우스를 선별하여 비장세포를 수집하고, 시험관 내에서 마우스 골수종 세포를 융합시킨 후, 약물 스크리닝 및 서브 클로닝 등 단계를 거쳐 항-인간 CD38 단백질 항체를 안정적으로 분비하는 다중 하이브리도마 단일클론세포를 구축하였다. 그 중에서 코드명이 m29인 마우스 하이브리도마 세포주를 ELISA, 유세포 분석 등과 같은 다양한 측정 방법으로 확인하여 이들이 분비한 단일클론항체가 인간 CD38 단백질 및 CD38 발현 양성 유래 및 다양한 인간 종양 세포주에 고친화력으로 특이적으로 결합할 수 있을 뿐만 아니라 또한, m29의 마우스 하이브리도마 세포주에 의해 분비되는 항체는 시험관 내에서 CDC를 통해 CD38 항원 발현 양성 종양세포를 살상할 수 있음을 확인하였다.
본 발명은 유전자 공학 등 수단에 의해 마우스 항체의 중쇄 가변영역 및 경쇄 가변영역을 코딩하는 유전자 단편을 얻었고; 이 기초상에서 상기 항체에 대해 유전공학 조작을 하여, 인간-마우스 키메라 항체 또는 인간화 항체의 발현 벡터를 얻었다. 상기 발현 벡터를 차이니즈 햄스터 난소(CHO)세포로 형질 감염시켜 인간-마우스 키메라 항체를 안정적이고 효율적으로 분비하는 재조합 조작된 세포를 수득하였으며, 상기 재조합 공학 세포 배양액으로부터 생물학적 활성이 있는 인간-마우스 키메라항체 ch29 단백질 또는 인간화 항체 HH29 단백질을 분리 정제하여 수득하였다.
경쟁적 ELISA, 유세포분석을 포함한 다양한 방법을 이용한 시험관 내 동정 및 분석은 마우스 단일클론항체 m29 및 인간-마우스 키메라항체 ch29 및 CD38 항원의 결합부위(epitope)가 Daratumumab과 상이함을 보여주었다. 시험관 내 직접적 ELISA 및 유세포분석 등 결과는 또한 마우스 단일클론항체 m29 및 이의 인간-마우스 키메라 항체 ch29가 원숭이 CD38 재조합 단백질 및 원숭이 CD38 재조합 유전자를 발현하는 CHO 세포주와 고친화력으로 특이적으로 결합할 수 있는 반면에 Daratumumab 단일클론은 인간 CD38 항원에만 결합하고 원숭이 CD38 항원에 대한 유의미한 결합이 없음을 보여주었다.
마우스 유래 m29 단일클론항체와 인간 마우스 키메라 m29 단일클론항체(ch29)의 항 종양 효능을 면역 결핍 마우스(node mice)에서 시험 한 결과, 마우스 유래 단일클론항체 m29와 인간 마우스 키메라 항체 ch29를 생체 내 투여 후 종양의 성장에 유의한 억제 효과가 있었으며 또한 치료 효과는 현재 시판되는 양성 대조 약물 Rituximab(상품명 Rituxan, 인간-마우스 키메라 인간 CD20 단일클론항체)또는 Daratumumab에 못지 않음을 알 수 있었다.
도 1은 본 발명의 실시예 1에서 인간 CD38 및 마우스 CD38 단백질의 아미노산 서열 비교 분석의 모식도이다.
도 2A 본 발명의 실시예 1에서 ELISA방법으로 스크리닝하여 얻은 항CD38 항체를 분비하는 각 하이브리도마 세포주의 코드명 및 OD값 측정 모식도이다.
도 2B는 본 발명의 실시예 2에서 CDC의 방법으로 ELISA 스크리닝하여 얻은 항 CD38 항체를 분비하는 하이브리도마 세포주 상청액으로 시험관 내에서 Daudi 표적 세포를 살상시키는 활성결과 모식도이며, 여기서 사용한 표적세포는 Daudi이고, RFU는 Relative Fluorescence Unit(상대 형광 단위)의 약어이다.
도 3A는 본 발명의 실시예 3에서 CDC 방법을 이용하여 마우스 하이브리도마 세포주 m29의 상청액을 추가로 측정하여 분석한 CDC 활성 결과 모식도이며, 여기서 사용한 표적세포는 Daudi이고, 양성 대조샘플은 Daratumumab이며, 음성 대조샘플은 마우스 SP2/0 골수종세포 세포주이다.
도 3B는 본 발명의 실시예3에서 양성 대조샘플 Daratumumab의 CDC 측정결과 모식도이고;
도 3C는 본 발명의 실시예 3에서 마우스 하이브리도마 세포주 m29의 상청액 샘플의 CDC측정 결과 모식도이다.
도 4는 본 발명의 실시예 4에서 유세포분석기로 CD38 항원 발현 양성 인간 종양 세포주에 대한 마우스 하이브리도마 세포주 m29 상청액 샘플의 결합을 측정하여 분석한 대표적 결과도이며, 음성 대조샘플은 비 관련 마우스 단일클론항체 mAB21(마우스 항-인간-PD-1 단일클론항체)이고; 여기서:
도 4A는 인간B-림프종 세포주 Daudi의 유세포분석기 측정 결과도이며;
도 4B는 인간 골수종 세포주 RPMI-8226의 유세포분석기 측정 결과도이고;
도 4C는 인간 T-림프종 세포주 MOLT-4세포의 유세포분석기 측정 결과도이다.
도 5는 본 발명의 실시예 5에서 유세포분석기로 형질주입된 인간 CD38유전자를 발현하는 CHO 세포(CHO-hCD38)에 대한 마우스 유래 단일클론항체 m29 샘플 및 양성 대조샘플 Daratumumab의 결합을 측정하여 분석한 대표적 결과도이며; 음성 대조샘플은 비 관련 마우스 유래 단일클론항체 mAB21(마우스 항-인간PD-1 단일클론항체)또는 인간화 hAB21단일클론항체이고; 여기서:
도 5A는 마우스 유래 단일클론항체 m29 샘플의 유세포 분석기 측정 결과도이며;
도 5B는 양성 대조샘플 Daratumumab의 유세포분석기 측정 결과도이다.
도 6은 본 발명의 실시예 6에서 경쟁적 ELISA로 CD38에 경쟁적으로 결합하기 위한 정제된 마우스 유래 단일클론항체 m29 샘플 및 Daratumumab을 분석한 모식도이며; 비 관련 인간화 단일클론 샘플 hPV19(항 VEGF 단일클론항체)는 음성 대조샘플이고; 여기서:
도 6A는 Biotin이 표지된 Daratumumab 샘플에 대한 마우스 유래 단일클론항체 m29 및 Daratumumab이 CD38에 경쟁적으로 결합한 결과도이며;
도 6B는 Biotin이 표지된 m29 단일클론항체에 대한 마우스 유래 단일클론항체 m29 및 Daratumumab이 CD38에 경쟁적으로 결합한 결과도이다.
도 7은 본 발명의 실시예 7에서 마우스 유래 단일클론항체 m29의 가변영역 아미노산 서열 및 Daratumumab 가변영역 아미노산 서열의 비교분석도이며, 여기서:
도 7A는 경쇄 가변영역 아미노산 서열의 비교 분석도이고; m29 단일클론항체가 Daratumumbab과 다른 아미노산은 모두 기호 “X”로 표시되며, 박스가 표기된 아미노산 서열 영역은 경쇄 가변영역의 CDR1, CDR2 및 CDR3이고;
도 7B는 중쇄 가변영역 아미노산 서열의 비교 분석도이고; m29 단일클론항체가 Daratumumab 단일클론항체와 다른 아미노산은 모두 기호 “X”로 표시되며, 박스가 표기된 아미노산 서열 영역은 중쇄 가변영역의 CDR1, CDR2 및 CDR3이다.
도 8은 본 발명의 실시예 9에서 유세포분석기로 인간 유래 종양 세포주에 대한 마우스 유래 단일클론항체 m29 샘플, 인간-마우스 키메라 항체 ch29G 및 양성 대조샘플 Daratumumab 또는 Rituximab (Rituxan, 인간-마우스 키메라 항 인간-CD20 단일클론항체)의 결합을 측정하여 분석한 대표적 결과도이며; 여기서:
도 8A는 인간 B-림프종 세포주 Raji의 유세포분석기 측정 결과도이고;
도 8B는 인간 골수종 세포주 RPMI-8226의 유세포분석기 측정 결과도이며;
도 8C는 인간 T-림프종 세포주 MOLT-4의 유세포분석기 측정 결과도이고;
도 8D는 인간 T-림프종세포주 Jurkat의 유세포분석기 측정 결과도이다.
도 9는 본 발명의 실시예 10에서 시험관 내 CDC 방법으로 마우스 유래 단일클론항체 m29 샘플, 인간-마우스 키메라 항체 ch29G 샘플 및 대조 샘플 Daratumumab의 활성을 측정하여 분석한 결과도이고, 여기서 사용한 표적세포는 인간 B-림프종 세포주 Daudi이며, 보체는 토끼 혈청에서 유래되며, 음성 대조샘플은 비 관련 인간화 hPV19 단일클론항체(항-VEGF 단일클론항체)이다.
도 10은 본 발명의 실시예 11에서 유세포분석기로 각각의 안정적인 형질주입으로 야생형 인간 CD38을 발현하는 CHO 세포(CHO-human CD38/wild type), 또는 안정적인 형질주입으로 S274F 점 돌연변이 CD38을 발현하는 CHO 세포(CHO-human CD38/S274F mutation)에 대한 마우스 유래 단일클론항체 m29 샘플, 인간-마우스 키메라항체 ch29G 샘플 및 대조 샘플 Daratumumab의 결합 결과도이며, 음성 대조샘플은 비 관련 인간화 hAB21단일클론항체(항-인간-PD-1 단일클론항체)이다. 여기서, 도10A는 야생형(wild-type)인간 CD38을 발현하는 CHO 세포의 측정 결과도이고; 도10B는 점 돌연변이 인간 CD38을 발현하는 CHO 세포(CHO/hCD38-S274F)의 측정 결과도이다.
도 11A는 본 발명의 실시예 12에서 인간 CD38, 침팬지 CD38 및 사이노몰구스 원숭이 CD38 단백질의 아미노산서열 비교분석 결과도이다.
도 11B는 본 발명의 실시예 12에서 안정적으로 형질주입된 사이노몰구스 원숭이 CD38 유전자를 발현하는 CHO 세포(CHO-cynomolgus CD38)에 대한 단일클론항체 m29 샘플, 인간-마우스 키메라 항체 ch29G 샘플 및 대조 샘플 Daratumumab의 결합을 유세포분석기로 측정한 결과도이고, 여기서 음성 대조샘플은 비 관련 인간화 hAB21 단일클론항체(항-인간-PD-1 단일클론항체)이다.
도 12는 본 발명의 실시예 13에서 ELISA로 각각의 재조합 인간 CD38 단백질(도 12A) 및 재조합 사이노몰구스 원숭이 CD38 단백질(도 12B)에 대한 인간-마우스 키메라 항체 ch29G 샘플 및 Daratumumab 단일클론항체의 결합을 비교하여 측정한 결과도이며, 여기서 음성 대조샘플은 Rituximab(Rituxan, 인간-마우스 키메라 항-인간 CD20 단일클론항체)이다.
도 13은 본 발명의 실시예 14에서 CDC 방법으로 인간-마우스 키메라 항체 ch29G 샘플, Daratumumab 및 양성 대조샘플 Rituximab(인간-마우스 키메라 항-인간 CD20 단일클론항체)의 활성을 측정하여 분석한 결과도이며, 보체는 인간혈청에서 유래하고, 음성 대조샘플은 비 관련 인간화 hPV19 단일클론항체(항-VEGF 단일클론항체)이며, 여기서:
도 13A는 인간 B-림프종 세포주 Daudi를 표적 세포로 한 CDC 측정 결과도이고;
도 13B는 인간 B-림프종 세포주 Raji를 표적 세포로 한 CDC측정 결과도이며;
도 13C는 인간 T-림프종 세포주 MOLT-4를 표적 세포로 한 CDC측정 결과도이고;
도 13D는 인간 T-림프종 세포주 Jurkat를 표적 세포로 한 CDC측정 결과도이다.
도 14는 본 발명의 실시예 17에서 누드 마우스에 피하이식된 인간 B-림프종 Raji 종양 모델에서 마우스 유래 m29 단일클론항체의 생체 내 항종양 효능을 시험한 결과도이다. 여기서, 도 14A는 종양 이식 전 10일 동안의 평균 성장부피에 대한 모식도이고; 도 14B는 종양 이식 후기의 평균 성장 부피의 모식도이다.
도 15는 본 발명의 실시예 18에서 누드 마우스에 피하이식된 인간 B-림프종 Raji 종양 모델에서 인간-마우스 키메라 항체 ch29 샘플의 생체 내 항종양 효능을 시험한 결과도이다.
도 2A 본 발명의 실시예 1에서 ELISA방법으로 스크리닝하여 얻은 항CD38 항체를 분비하는 각 하이브리도마 세포주의 코드명 및 OD값 측정 모식도이다.
도 2B는 본 발명의 실시예 2에서 CDC의 방법으로 ELISA 스크리닝하여 얻은 항 CD38 항체를 분비하는 하이브리도마 세포주 상청액으로 시험관 내에서 Daudi 표적 세포를 살상시키는 활성결과 모식도이며, 여기서 사용한 표적세포는 Daudi이고, RFU는 Relative Fluorescence Unit(상대 형광 단위)의 약어이다.
도 3A는 본 발명의 실시예 3에서 CDC 방법을 이용하여 마우스 하이브리도마 세포주 m29의 상청액을 추가로 측정하여 분석한 CDC 활성 결과 모식도이며, 여기서 사용한 표적세포는 Daudi이고, 양성 대조샘플은 Daratumumab이며, 음성 대조샘플은 마우스 SP2/0 골수종세포 세포주이다.
도 3B는 본 발명의 실시예3에서 양성 대조샘플 Daratumumab의 CDC 측정결과 모식도이고;
도 3C는 본 발명의 실시예 3에서 마우스 하이브리도마 세포주 m29의 상청액 샘플의 CDC측정 결과 모식도이다.
도 4는 본 발명의 실시예 4에서 유세포분석기로 CD38 항원 발현 양성 인간 종양 세포주에 대한 마우스 하이브리도마 세포주 m29 상청액 샘플의 결합을 측정하여 분석한 대표적 결과도이며, 음성 대조샘플은 비 관련 마우스 단일클론항체 mAB21(마우스 항-인간-PD-1 단일클론항체)이고; 여기서:
도 4A는 인간B-림프종 세포주 Daudi의 유세포분석기 측정 결과도이며;
도 4B는 인간 골수종 세포주 RPMI-8226의 유세포분석기 측정 결과도이고;
도 4C는 인간 T-림프종 세포주 MOLT-4세포의 유세포분석기 측정 결과도이다.
도 5는 본 발명의 실시예 5에서 유세포분석기로 형질주입된 인간 CD38유전자를 발현하는 CHO 세포(CHO-hCD38)에 대한 마우스 유래 단일클론항체 m29 샘플 및 양성 대조샘플 Daratumumab의 결합을 측정하여 분석한 대표적 결과도이며; 음성 대조샘플은 비 관련 마우스 유래 단일클론항체 mAB21(마우스 항-인간PD-1 단일클론항체)또는 인간화 hAB21단일클론항체이고; 여기서:
도 5A는 마우스 유래 단일클론항체 m29 샘플의 유세포 분석기 측정 결과도이며;
도 5B는 양성 대조샘플 Daratumumab의 유세포분석기 측정 결과도이다.
도 6은 본 발명의 실시예 6에서 경쟁적 ELISA로 CD38에 경쟁적으로 결합하기 위한 정제된 마우스 유래 단일클론항체 m29 샘플 및 Daratumumab을 분석한 모식도이며; 비 관련 인간화 단일클론 샘플 hPV19(항 VEGF 단일클론항체)는 음성 대조샘플이고; 여기서:
도 6A는 Biotin이 표지된 Daratumumab 샘플에 대한 마우스 유래 단일클론항체 m29 및 Daratumumab이 CD38에 경쟁적으로 결합한 결과도이며;
도 6B는 Biotin이 표지된 m29 단일클론항체에 대한 마우스 유래 단일클론항체 m29 및 Daratumumab이 CD38에 경쟁적으로 결합한 결과도이다.
도 7은 본 발명의 실시예 7에서 마우스 유래 단일클론항체 m29의 가변영역 아미노산 서열 및 Daratumumab 가변영역 아미노산 서열의 비교분석도이며, 여기서:
도 7A는 경쇄 가변영역 아미노산 서열의 비교 분석도이고; m29 단일클론항체가 Daratumumbab과 다른 아미노산은 모두 기호 “X”로 표시되며, 박스가 표기된 아미노산 서열 영역은 경쇄 가변영역의 CDR1, CDR2 및 CDR3이고;
도 7B는 중쇄 가변영역 아미노산 서열의 비교 분석도이고; m29 단일클론항체가 Daratumumab 단일클론항체와 다른 아미노산은 모두 기호 “X”로 표시되며, 박스가 표기된 아미노산 서열 영역은 중쇄 가변영역의 CDR1, CDR2 및 CDR3이다.
도 8은 본 발명의 실시예 9에서 유세포분석기로 인간 유래 종양 세포주에 대한 마우스 유래 단일클론항체 m29 샘플, 인간-마우스 키메라 항체 ch29G 및 양성 대조샘플 Daratumumab 또는 Rituximab (Rituxan, 인간-마우스 키메라 항 인간-CD20 단일클론항체)의 결합을 측정하여 분석한 대표적 결과도이며; 여기서:
도 8A는 인간 B-림프종 세포주 Raji의 유세포분석기 측정 결과도이고;
도 8B는 인간 골수종 세포주 RPMI-8226의 유세포분석기 측정 결과도이며;
도 8C는 인간 T-림프종 세포주 MOLT-4의 유세포분석기 측정 결과도이고;
도 8D는 인간 T-림프종세포주 Jurkat의 유세포분석기 측정 결과도이다.
도 9는 본 발명의 실시예 10에서 시험관 내 CDC 방법으로 마우스 유래 단일클론항체 m29 샘플, 인간-마우스 키메라 항체 ch29G 샘플 및 대조 샘플 Daratumumab의 활성을 측정하여 분석한 결과도이고, 여기서 사용한 표적세포는 인간 B-림프종 세포주 Daudi이며, 보체는 토끼 혈청에서 유래되며, 음성 대조샘플은 비 관련 인간화 hPV19 단일클론항체(항-VEGF 단일클론항체)이다.
도 10은 본 발명의 실시예 11에서 유세포분석기로 각각의 안정적인 형질주입으로 야생형 인간 CD38을 발현하는 CHO 세포(CHO-human CD38/wild type), 또는 안정적인 형질주입으로 S274F 점 돌연변이 CD38을 발현하는 CHO 세포(CHO-human CD38/S274F mutation)에 대한 마우스 유래 단일클론항체 m29 샘플, 인간-마우스 키메라항체 ch29G 샘플 및 대조 샘플 Daratumumab의 결합 결과도이며, 음성 대조샘플은 비 관련 인간화 hAB21단일클론항체(항-인간-PD-1 단일클론항체)이다. 여기서, 도10A는 야생형(wild-type)인간 CD38을 발현하는 CHO 세포의 측정 결과도이고; 도10B는 점 돌연변이 인간 CD38을 발현하는 CHO 세포(CHO/hCD38-S274F)의 측정 결과도이다.
도 11A는 본 발명의 실시예 12에서 인간 CD38, 침팬지 CD38 및 사이노몰구스 원숭이 CD38 단백질의 아미노산서열 비교분석 결과도이다.
도 11B는 본 발명의 실시예 12에서 안정적으로 형질주입된 사이노몰구스 원숭이 CD38 유전자를 발현하는 CHO 세포(CHO-cynomolgus CD38)에 대한 단일클론항체 m29 샘플, 인간-마우스 키메라 항체 ch29G 샘플 및 대조 샘플 Daratumumab의 결합을 유세포분석기로 측정한 결과도이고, 여기서 음성 대조샘플은 비 관련 인간화 hAB21 단일클론항체(항-인간-PD-1 단일클론항체)이다.
도 12는 본 발명의 실시예 13에서 ELISA로 각각의 재조합 인간 CD38 단백질(도 12A) 및 재조합 사이노몰구스 원숭이 CD38 단백질(도 12B)에 대한 인간-마우스 키메라 항체 ch29G 샘플 및 Daratumumab 단일클론항체의 결합을 비교하여 측정한 결과도이며, 여기서 음성 대조샘플은 Rituximab(Rituxan, 인간-마우스 키메라 항-인간 CD20 단일클론항체)이다.
도 13은 본 발명의 실시예 14에서 CDC 방법으로 인간-마우스 키메라 항체 ch29G 샘플, Daratumumab 및 양성 대조샘플 Rituximab(인간-마우스 키메라 항-인간 CD20 단일클론항체)의 활성을 측정하여 분석한 결과도이며, 보체는 인간혈청에서 유래하고, 음성 대조샘플은 비 관련 인간화 hPV19 단일클론항체(항-VEGF 단일클론항체)이며, 여기서:
도 13A는 인간 B-림프종 세포주 Daudi를 표적 세포로 한 CDC 측정 결과도이고;
도 13B는 인간 B-림프종 세포주 Raji를 표적 세포로 한 CDC측정 결과도이며;
도 13C는 인간 T-림프종 세포주 MOLT-4를 표적 세포로 한 CDC측정 결과도이고;
도 13D는 인간 T-림프종 세포주 Jurkat를 표적 세포로 한 CDC측정 결과도이다.
도 14는 본 발명의 실시예 17에서 누드 마우스에 피하이식된 인간 B-림프종 Raji 종양 모델에서 마우스 유래 m29 단일클론항체의 생체 내 항종양 효능을 시험한 결과도이다. 여기서, 도 14A는 종양 이식 전 10일 동안의 평균 성장부피에 대한 모식도이고; 도 14B는 종양 이식 후기의 평균 성장 부피의 모식도이다.
도 15는 본 발명의 실시예 18에서 누드 마우스에 피하이식된 인간 B-림프종 Raji 종양 모델에서 인간-마우스 키메라 항체 ch29 샘플의 생체 내 항종양 효능을 시험한 결과도이다.
본 발명은 하기 실시예와 결합하여 더 한층 설명될 것이고, 이들 실시예는 단지 설명의 역할을 하기 위한 것으로, 본 발명을 제한하려는 것이 아니다.
본 발명에 사용된 종양 세포주 및 DNA 프라이머(primer)는 각각 표 1 및 표 2를 참조하였다:
실시예 1: 항-CD38 항체를 분비하는 마우스 하이브리도마 세포주의 구축 및 선별 동정
1.1 인간 CD38 단백질의 아미노산 서열 및 마우스 CD38 단백질의 아미노산 서열의 비교 분석
인간 CD38 단백질의 아미노산 서열과 마우스 CD38 단백질의 아미노산 서열의 비교분석은 도 1(그 중에서 박스 내 이탤릭체로 표기된 아미노산 서열은 세포막 관통영역이다)과 같다. 도 1에 도시된 바와 같이, 인간 CD38 및 마우스 CD38 단백질의 아미노산 서열의 전체 상동성은 59%에 불과하며, 따라서, 전통적인 항원 단백질 면역화 마우스 및 하이브리도마 제조기술을 사용하면, 다양한 상이한 결합 영역 또는 아미노산 결합 부위에 대한 마우스 항-인간 CD38 단일클론항체를 제조할 수 있을 것으로 추측된다. 이러한 항-인간 CD38 단일클론항체, 또는 이들의 항원 결합부위/결합 에피토프(epitope)가 Daratumumab과 같은 기존 CD38 단일클론항체와 다르기때문에, 생체 내 및 시험관 내에서 생물학적 활성 및 치료 효과가 이러한 단일클론항체와 상이하거나 더 우수할 것으로 예상된다. 이러한 새로운 부위를 인식하는 신형의 CD38 단일클론항체는 약물 성분으로 사용될 수 있으며, 한편으로는 현재 시판 중인 골수종 치료제인 Bortezomib 보르테조밉, lenalidomide 레날리도마이드와 병용 또는 순차적으로 사용하여 골수종 치료효과를 향상시키는 효과에 도달하며; 다른 한 편으로, 이러한 단일클론항체 약물은 B-림프종, T-림프종 등 CD38 발현 양성인 다른 종양 치료용으로도 개발 될 것으로 예상된다.
따라서, 본 발명은 이러한 신형의 CD38 단일클론항체에 대한 연구 개발 및 제조를 수행하였으며, 구체적인 제조 단계는 다음과 같다:
1.2 항-CD38 항체를 분비하는 마우스 하이브리도마 세포주의 구축 및 선별 동정
단계 1. 재조합 인간 CD38 단백질(면역 항원)의 유래 및 동물 면역
본 발명의 실시예에 있어서, 면역화에 사용되는 항원은 포유동물에 의해 발현되는 재조합 인간 CD38 세포막외 단백질(Human CD38 Protein-His Tag, 베이징 시노바이오사(Sino Biological Inc.) 제품, Catalog: 10818-H08H)이다. 상기 재조합 인간 CD38 단백질을 프로인트 완전 보강제(Freund's complete adjuvant)(미국 Sigma사 제품)와 혼합한 후, Balb/c마우스의 피하 여러 곳에 주사(100μl/마리, 매 회 10 μg CD38 단백질)하였다. 1차 면역 3주 후 CD38 단백질을 불완전 보강제와 혼합하여, 10μg/마리의 용량으로 피하 여러 곳에 면역한 후; 2주에 2 내지 3회 동일한 방법으로 면역을 강화시키고, 세번째 면역 강화 1주일 후 마우스의 꼬리 정맥 혈액에서 혈청을 채취하고, 재조합 인간 CD38 단백질로 코팅된 96-웰 플레이트를 사용하여 효소결합면역 흡착시험(ELISA) 방법으로 마우스 혈청 중 항 CD38 항체의 역가를 측정하였다.
상기 ELISA 측정 단계는 다음과 같다: 재조합 인간 CD38 단백질(2μg/ml, pH 9.6, 0.1 M NaHCO3 용액)로 96-웰 마이크로플레이트를 코팅하고, 37℃에서 2시간 동안 코팅한 후, 다시 2% 소혈청알부민(BSA)을 넣고 4℃에서 밤새 블로킹하였다. 다음 날, 코팅된 플레이트를 PBS-0.1% Tween20 용액으로 세척한 후, 배의 비율로 희석된 면역화된 마우스 혈청 샘플(면역되지 않은 마우스 혈청을 음성 대조군으로 함)을 첨가하여 37℃에서 2시간 동안 인큐베이션하고; PBS-0.1% Tween20 용액으로 세척한 후, 서양고추냉이 과산화효소(horseradish peroxidase) HRP-표식된 염소 항-마우스 IgG(미국 Sigma사 제품)를 첨가하여, 37℃에서 1시간 동안 인큐베이션하였고; 다시 PBS-0.1% Tween20 용액으로 충분히 세척한 후, O-페닐렌다이아민(OPD)-0.1% H2O2 기질액을 넣어 10 내지 15분 동안 발색시킨 다음 다시 0.1M HCl을 첨가하여 반응을 종결시켰다. 그 다음 다기능 마이크로 플레이트리더기 (PerkinElmer Victor X3)로 492nm에서의 OD값을 읽었다. 비교적 높은 항체 역가를 가진 마우스의 비장세포를 다음 단계의 세포융합에 사용하였다.
단계 2. 세포융합
마지막 면역화(면역력을 4회 강화) 3 내지 4일 후, 마우스 비장세포 현탁액을 무균적으로 제조하고, 50% PEG-1000(미국 Sigma사 제품)의 작용 하에 마우스 SP2/0 골수종 세포(중국과학원 상하이 생명과학원 세포기탁센터에서 구입)를 5:1 또는 10:1의 비율로 융합시켰다. 융합은 통상적인 방법(Kohler G. and Milstein C: Nature 1975, 256:495-497)에 따라, 1ml의 PEG 용량을 60초 내에 천천히 첨가하였다. 90초 동안 반응시킨 후, 무혈청 RPMI-1640 배지로 반응을 종결하고, 1000rpm으로 10 min동안 원심분리하여, 상청액을 제거하고, 다시 원심분리에 의해 침전된 세포를 10% HAT(H는 히포크산틴, A는 아미놉테린, T는 티미딘, 미국 Sigma사 제품)가 포함된 RPMI 1640-10% FCS 배지로 세포농도를 1x106/ml이 되게끔 조절하여, 96-웰 평바닥 세포배양 플레이트(웰 당 200μl)에 첨가하고, 37℃, 5% CO2 인큐베이터(미국 Thermo사 제품)에서 2 내지 3주동안 배양하였다.
단계 3. 항 CD38 항체를 분비하는 양성 마우스 하이브리도마 세포의 효소결합 면역흡착시험(ELISA)에 의한 스크리닝
상기 선별시험으로 마우스 혈청에서 항 CD38 항체의 역가를 검출하는데 사용된 동일한 효소결합면역 흡착시험(ELISA)을 사용하여 마우스 하이브리도마 세포의 상청액에 항-CD38 항체가 포함되어 있는지 여부를 측정하였다.
상기 ELISA 측정 단계는 다음과 같다: 재조합 인간 CD38 단백질(2μg/ml, pH 9.6, 0.1M NaHCO3 용액)로 96-웰 마이크로플레이트를 코팅하고, 37℃에서 2시간 동안 코팅한 후, 다시 2% 소혈청알부민(BSA)을 넣고 4℃에서 밤새 블로킹하였다. 다음 날, 코팅된 플레이트를 PBS-0.1% Tween20 용액으로 세척한 후, 하이브리도마 세포 상청액 샘플(융합되지 않은 SP2/0 골수종 세포 배양액 상청액을 음성대조로 하고, CD38 항원으로 면역한 후 마우스 혈청 샘플(1: 200으로 희석)을 양성대조로 함)을 첨가하여 37℃에서 2시간 동안 인큐베이션하고; PBS-0.1% Tween20 용액으로 세척한 후, 서양고추냉이 과산화효소(horseradish peroxidase) HRP-표식된 염소 항-마우스 IgG(미국 Sigma사 제품)를 첨가하여, 37℃에서 1시간 동안 인큐베이션하였고; 다시 PBS-0.1% Tween20 용액으로 충분히 세척한 후, O-페닐렌다이아민(OPD)-0.1% H2O2 기질액을 넣어 10 내지 15분 동안 발색시킨 다음 다시 0.1M HCl을 첨가하여 반응을 종결시켰다. 그 다음 다기능 마이크로 플레이트리더기(PerkinElmer Victor X3)로 492nm 에서 OD값을 읽었다.
합계 600개 이상의 마우스 하이브리도마 세포클론을 스크리닝하고, 항-CD38항체를 분비하는 10개 이상의 양성 하이브리도마 클론(양성클론에 대한 판단기준: OD 값이 음성 대조군 샘플의 OD 값보다 5배 이상 높음)을 얻었다.
도 2A는 ELISA 스크리닝을 통해 얻은 CD38에 결합하는 항원을 분비하는 각 양성 하이브리도마 세포주의 코드명 및 OD 값이다. 이들 양성 하이브리도마 세포를 확대 배양한 후 -70 ℃에서 동결보존하였다.
실시예 2: 보체의존세포독성(complement-dependent cytotoxicity, CDC) 방법에 의한 항-CD38 항체를 분비하는 양성 하이브리도마 세포주의 상청액의 시험관 내 스크리닝 및 검출 분석
본 실시예에 있어서, 항-CD38 항체 양성 하이브리도마 세포주의 상청액의 보체의존세포독성 (complement-dependent cytotoxicity, CDC)의 시험관 내 스크리닝 및 검출 방법은 다음과 같이 요약된다:
2.1 실험재료
세포배양배지: RPMI-1640 Hyclone
태아소혈청: 미국 GIBCO사 제품
표적세포: 인간 B-림프종 세포주 Daudi(인간 CD38+, CD20+ B-lymphoma cell line 또는 기타 종양세포주, 중국과학원 전형배양물기탁위원회 세포은행에서 구매)
보체 유래: 인간 혈청/아기토끼혈청/토끼보체(건강함)(자제력 있음)
테스트 샘플: 항-CD38 단일클론항체 양성 하이브리도마 세포주 상청액(자체 제작)
양성 대조샘플: Daratumumab(항-CD38 인간화 단일클론항체), 또는 Rituximab(항-CD20 인간-마우스 키메라 단일클론항체)
음성 대조샘플: hPV19 단일클론항체(항 VEGF 인간화 단일클론항체)
세포생존력 테스트 키트: CellTiter-Glo® Luminescent Cell Viability Assay Kit (Promega 제품)
96-웰 세포배양 플레이트: Corning-3610
2.2 실험 단계
1)10μl의 희석된 테스트 샘플(항체 샘플의 초기 최고농도는 20 내지 200 μg/ml이고, 5-배 또는 3-배로 계단식 희석하며; 하이브리도마 상청액에서 직접 10μl를 취하여 로딩)를 96-웰 플레이트의 대응되는 웰에 첨가하고;
2)대수성장기의 표적세포(Daudi 세포 또는 기타 CD38 항원 발현 양성 표적세포)를 수집하고, CDC 희석용액(1% FBS RPMI1640 배지)으로 한번 세척하고, 계수하며, 세포 생존율은 90%이상이어야 하고, 재현탁된 세포의 농도를 2.5×105개/ml이 되게끔 조정하고;
3)표적 세포를 96-웰 플레이트(Corning-3610)에, 80μl/웰, 웰 당 약 2×10^4개 세포가 되게끔 넣고, 37℃, 5% CO2 인큐베이터에 방치하여 30분 동안 인큐베이션 하였으며;
4)희석된 아기토끼혈청 또는 인간혈청(두가지 모두 CDC 희석용액 1:10 또는 1:20으로 희석)을 10μl/웰 되게끔 추가하고, 37℃, 5% CO2 인큐베이터에 방치하여 1 내지 2시간 동안 인큐베이션하였으며;
5)세포생존력 테스트 시약을 첨가하기 전, 세포배양 플레이트 및 세포 생존력 테스트 키트(CellTiter-Glo®Luminescent Cell Viability kit) 및 96-웰 플레이트를 차광하여 30분 동안 방치하여 실온으로 평형이 되게끔 하며, 다시 웰당 100uL의 준비된 시약을 실온에서 빛을 차단하여 10 내지 15분 동안 발색시킨 후, 다기능 마이크로플레이트(PerkinElmer Victor X3)를 사용하여 형광강도 RFU(Relative Fluorescence Unit, 또는 Relative Luminescent Unit, RLU상대 형광 단위)를 측정하였다.
2.3 CDC 활성결과 계산
CDC 활성은 형광강도 RFU 직접 값으로 표시하거나 또는 하기 공식에 따라 CDC 세포사멸률을 계산할 수 있다:
세포 사멸률(%)=100×(1-(RFU 샘플 웰)/((RFU 세포+혈청웰));
세포 생존력은 하기 공식에 의해 계산된다:
세포 생존력(%)=100 × ((RFU 샘플 웰 )/(RFU 세포+혈청웰))
2.4 CDC 활성측정 결과
도 2B는 상기 CDC의 방법으로 항-CD38 항체를 분비하는 하이브리도마 세포주 상청액으로 시험관 내에서 Daudi 표적 세포를 사멸시키는 활성을 측정하여 분석한 결과(RFU 직접 값)이며, 여기서 코드명이 m29인 하이브리도마 세포 상청액은 유의한 CDC 활성(다른 샘플에 비해, RFU 값이 95%이상 감소)을 보인 반면에, 기타 하이브리도마 세포배양 상청액 샘플(RFU 값은 유의하게 감소하지 않음)은 모두 유의한 CDC 활성이 없었다.
실시예 3: 마우스 유래 m29 단일클론항체의 서브 타입의 동정 및 이의 보체의존세포독성 (CDC)의 재검증
시판되는 마우스 단일클론항체 IgG 서브클래스 테스트 카드(베이징 바이오드래곤 면역기술유한회사(Beijing Biodragon immunotechnologies Co.,Ltd) 제품, 카달로그번호 BF06038)로 마우스 유래 m29 단일클론항체를 확인한 결과, IgG2b형 항체로 나타내었다. 이어서, 실시예 2와 동일한 방법으로 다시 m29 하이브리도마 상청액 샘플의 CDC에 의한 Daudi 표적 세포를 시험관 내에서 사멸시키는 활성을 확인한 결과를 도 3에 나타내었다.
여기서 도 3A는 m29 하이브리도마 세포주 상청액 샘플을 희석하지 않고 직접 CDC 테스트 플레이트에 첨가한 RFU 판독결과이며; 결과는 m29 하이브리도마 세포주 상청액이 유의한 CDC 활성을 나타냄을 다시 보여주었다(음성 대조샘플에 비해, RFU 값이 95%이상 감소).
도 3B는 상이한 용해도를 갖는 양성 대조샘플 Daratumumab의 시험관 내에서 Daudi 표적세포를 사멸시키는 CDC 활성 시험 결과이고, 결과는 유의한 용량-반응 곡선을 보여주었다.
도 3C는 상이한 용해도를 갖는 m29 단일클론항체 상청액의 시험관 내에서 Daudi 표적 세포를 사멸시키는 CDC 활성 시험 결과를 보여주며, 결과 또한 유의한 용량-반응 곡선을 보여주었다.
실시예 4: 유세포분석기에 의한 인간 CD38 항원 발현 종양 세포주에 대한 마우스 유래 단일클론항체 m29의 결합의 측정 및 분석
본 실시예에 있어서, m29 하이브리도마 세포주 상청액 샘플, 또는 비 관련 마우스 유래 단일클론항체 mAB21(마우스-항 인간 PD-1 단일클론항체) 샘플은 1차 항체이고, FITC 형광이 표식된 염소-항 마우스 IgG는 2차 항체이며, 유세포분석기를 사용하여 CD38 항원 발현 양성 인간 종양 세포주에 대한 샘플의 결합을 측정하여 분석하였다.
이를 위해, 이미 알려진 CD38 항원 발현 양성인 인간 종양세포주(B-림프종 세포주 Daudi, 골수종 세포주 RPMI-8226 및 T-림프종 세포주 MOLT-4, 모두 중국과학원 상하이 생명과학원 세포기탁센터에서 구입)을 각각 m29 하이브리도마 세포주 상청액 샘플, 또는 비 관련 단일클론항체 마우스 유래 mAB21(마우스-항 인간 PD-1 단일클론항체)샘플과 함께 4℃에서 1시간 동안 인큐베이션하고, PBS-0.1% FCS 용액으로 세척한 후, FITC-표식된 염소-항 마우스 IgG(1: 200 희석, Sigma 사 제품)를 첨가하여 4℃에서 1시간 동안 인큐베이션하였으며, PBS-0.1% FCS 용액으로 다시 세척한 후, 샘플을 Accuri C6 Plus Flow Cytometer 유세포분석기(미국 Becton Dickinson사, Mountain view, CA)에 로딩하여 측정하였다.
도 4는 유세포분석기로 측정한 대표적 결과이다. 도 4에 도시된 바와 같이: 비 관련 단일클론항체 mAB21(마우스-항 인간 PD-1 단일클론항체)샘플에 비해, m29 하이브리도마 세포주 상청액 샘플은 유의하게 CD38 항원 발현 양성인 B-림프종 세포주 Daudi(도 4A), 골수종 세포주 RPMI-8226(도 4B) 및 T-림프종 세포주 MOLT-4(도 4C)에 특이적으로 결합할 수 있다.
실시예 5: 유세포분석기에 의한 안정적으로 형질주입된 인간 CD38 유전자를 발현하는 CHO 세포(CHO-hCD38)에 대한 m29 하이브리도마 세포주 상청액 샘플 및 Daratumumab의 결합의 측정 및 분석
5.1
안정적으로 인간 CD38 유전자를 발현하는 CHO 세포주(CHO-hCD38)의 구축
Genebank 데이터 베이스에 의해 공개된 인간 CD38 유전자 서열(Gene ID: 952)에 따라, 소주 진웨이지생물학기술유한회사(Suzhou Jinweizhi Biological Technology Co., Ltd.)에 의뢰하여 CD38을 코딩하는 cDNA 단편을 합성하였으며, 이를 세포발현벡터 pQY-DHFR(자체 구축)에 클로닝하여, 대장균으로 형질전환한 후, 제한효소 분해 검증 방법으로 양성 재조합 발현 플라스미드 pQY-DHFR-hCD38을 확인하였다. 이어서 재조합 플라스미드 pQY-DHFR-hCD38과 Fugen-6 리보솜(Roche사 제품)을 혼합하여 CHO-dhfr-세포에 공동 형질주입한 후, 태아소혈청을 포함하는 IMDM 배지를 이용하여 인간 CD38 유전자를 안정적으로 발현하는 CHO 세포주(CHO-hCD38)를 스크리닝하였다.
5.2 유세포분석기에 의한 인간 CD38 유전자를 안정적으로 발현하는 CHO 세포(CHO-hCD38)에 대한 마우스 유래 m29 하이브리도마 상청액 샘플 및 Daratumumab의 결합의 측정 및 분석
본 실시예에 있어서, 마우스 유래 m29 하이브리도마 상청액 또는 양성 샘플Daratumumab을 1차 항체로 하고, 각각 FITC형광이 표식된 염소-항 마우스 IgG 또는 FITC가 표식된 염소-항 인간 IgG를 2차 항체로 하며, 유세포분석기를 사용하여 인간 CD38 유전자를 안정적으로 발현하는 CHO 세포(CHO-hCD38)에 대한 샘플의 결합을 측정 및 분석하였다.
이를 위해, CHO-hCD38 세포를 각각 마우스 유래 m29 하이브리도마 상청액 샘플, 양성 단일클론항체 샘플 Daratumumab, 또는 비 관련 마우스 유래 단일클론항체 mAB21(마우스-항 인간 PD-1 단일클론항체) 또는 이의 인간화 hAB21 단일클론항체 샘플과 함께 4℃에서 1시간 동안 인큐베이션하고, PBS-0.1% FCS 용액으로 세척한 후, 각각 FITC-표식된 염소-항 마우스 IgG(1:200 희석, Sigma사 제품)를 첨가하고, Daratumumab 샘플에는 FITC-표식된 염소-항 인간 IgG-Fc, 1:200 희석, Sigma 사 제품)를 첨가하며; 4℃에서 1시간 동안 인큐베이션하고, PBS-0.1% FCS용액으로 다시 세척한 후, 샘플을 Accuri C6 Plus Flow Cytometer 유세포분석기(미국 Becton Dickinson사, Mountain view, CA)에 로딩하여 측정하였다.
도 5는 상기 유세포분석기로 CHO-hCD38을 측정한 대표적 결과이다. 도 5에 도시된 바와 같이, 음성 대조샘플 mAB21 또는 hAB21에 비해, 마우스 유래 m29 하이브리도마 상청액 샘플(도 5A) 및 Daratumumab 샘플(도 5B)은 모두 유의하게 CHO-hCD38 세포에 결합할 수 있고, 그 중에서 CHO-hCD38 세포에 대한 m29 단일클론항체 샘플의 결합력은 Daratumumab 단일클론 항체에 못지 않았다.
실시예 6 마우스 유래 m29 단일클론항체의 분리 정제 및 시험관 내 경쟁적 ELISA 방법에 의한 CD38에 대한 m29 단일클론 항체 및 Daratumumab의 경쟁적 결합의 측정
6.1 마우스 유래 m29 단일클론항체의 분리 정제
m29 하이브리도마 세포를 증폭시키고, 무혈청배지(KD-Hybri, Zhuhai Kairui사 제품)에 적응시켜 배양하였다. 일정량의 무혈청배지의 상청액을 수집하고, 원심분리 및 0.45μm 필터 맴브레인으로 여과한 후, Protein-G 친화성 크로마토 그래피 컬럼(Protein G-Sepharose Fast Flow, 미국 제너럴 일렉트릭 GE사 제품)에 로딩하고, 1xPBS로 세척한 후, 완충액(0.05M 아세트산나트륨, pH=3.2)으로 용출하여 m29 항체를 얻은 다음, 초미세 여과튜브(Millipore UFC903096, 30kD)를 사용하여 원심분리하여 완충액을 glycine-Tris(pH=6.0)로 교체한 후, 정량 표지 시험 후, 정제된 m29 항체를 4℃에 보관하였다.
6.2 시험관 내 경쟁적 ELISA방법에 의한 CD38에 대한 마우스 유래 m29 단일클론항체 및 Daratumumab의 경쟁적 결합 측정
상기 경쟁적 ELISA 방법의 기본원리 및 과정은 우선 서로 다른 농도의 m29 단일클론항체 샘플 또는 Daratumumab을 정해진 농도의 비오틴이 표식된 m29 단일클론항체(biotin-m29) 또는 비오틴이 표식된 Daratumumab(biotin- Daratumumab)과 혼합한 후, 다시 혼합물을 사전에 CD38-His 재조합 단백질로 코팅해 놓은 96-웰 플레이트에 옮겨, 인큐베이션 및 용출시킨 후, 효소가 표식된 Avidin(고추냉이 과산화효소가 표식된 Avidin)을 첨가하여 다시 인큐베이션 및 용출시킨 후, 기질을 넣어 OD값을 나타내고 측정하였다.
그 중, 실시예에 있어서, 상기 경쟁적 ELISA방법으로 측정하는 구체적인 단계는 다음과 같다:
1)재조합 CD38 세포막 외 단백질(베이징 시노바이오사(Sino Biological Inc.) 제품)로 96-웰 플레이트(코팅농도: 2μg/ml, 50μl/웰)를 코팅하고, 4℃에서 밤새 방치하였고;
2)PBS 용액으로 세척 및 5% 밀크(PBS-0.1% tween20 용액에 희석)로 실온에서 블로킹한 후, 각각 상이한 농도의 항-CD38 단일클론항체(m29, Daratumumab) 또는 비 관련 항체(항-VEGF 단일클론항체 hPV19) 및 정해진 농도의 비오틴이 표식된 Daratumumab(biotin-Daratumumab, 1:1000 희석) 또는 m29 단일클론항체 (biotin-m29, 1:1000 희석)를 첨가하고, 37℃에서 1.5h 인큐베이션하였으며;
3)PBS-T로 용출시킨 후, 고추냉이 과산화효소가 표식된 Avidin(1:5000 희석)을 첨가하고, 37℃에서 1h 배양하였으며;
4)PBS-T로 용출시킨 후, 발색용액 (O-페닐렌다이아민)-3% 과산화수소를 첨가하여, 실온에서 10min동안 발색시켰으며;
5)1M HCl를 가하여 반응을 종결시키고, 효소결합면역분석기로 492nm의 파장에서 각 웰의 흡광도를 측정하였다.
도 6은 경쟁적 ELISA방법의 대표적 결과 모식도이며; 여기서,
도 6A는 CD38 단백질에 대한 m29 단일클론항체 및 Daratumumab과 비오틴이 표식된 Daratumumab(biotin-Daratumumab)간의 시험관 내 경쟁적 결합 결과이며; 도면에 도시된 바와 같이: 상이한 농도의 m29 단일클론항체 또는 Daratumumab과 정해진 농도의 biotin-Daratumumab 샘플에 있어서, 각 웰의 발색반응의 OD값 및 첨가한 표식된 단일클론항체 샘플의 양은 반비례되며: 즉 첨가한 m29 단일클론항체 또는 Daratumumab 단일클론항체의 양이 많을수록, 이의 발색 OD값이 더 낮으며; 이 결과는 Daratumumab과 마찬가지로, m29 단일클론항체도 시험관 내에서 biotin-Daratumumab 샘플과 길항 경쟁적으로 CD38에 결합할 수 있으며; 또한 CD38에 대한 경쟁적 결합에서 m29 단일클론항체도 Daratumumab과 거의 동일한 효과에 도달하였다.
도 6B는 CD38 단백질에 대한 m29 단일클론항체 및 Daratumumab과 비오틴이 표식된 m29 단일클론항체(biotin-m29 단일클론항체)간의 시험관 내 경쟁적 결합 결과이며; 도면에 도시된 바와 같이, 상이한 농도의 m29 단일클론항체 및 정해진 농도의 biotin-m29 샘플에 있어서, 각 웰의 발색반응의 OD값 및 첨가한 표식되지 않은 m29 단일클론항체의 샘플양이 반비례되며: 즉 첨가된 m29 단일클론항체의 양이 많을수록, 이의 발색 OD값이 더 낮으며; 반면에 Daratumumab 또는 비 관련 단일클론항체 샘플 hPV19의 첨가양은 각 웰의 OD값에 거의 영향을 미치지 않는다. 이 결과는 Daratumumab이 시험관 내에서 CD38에 결합하기 위해 m29 단일클론항체와 경쟁하지 않음을 나타낸다.
상기 경쟁적 ELISA 결과에 대한 포괄적인 분석으로부터 인간 CD38 단백질에 대한 m29 단일클론항체의 결합부위(epitope)가 Daratumumab과 상이하며, m29 단일클론항체는 인간 CD38 단백질에 대한 Daratumumab의 결합을 경쟁에 의해 차단할 수 있는 반면에, Daratumuma는 인간 CD38 단백질에 대한 m29 단일클론항체의 결합을 경쟁에 의해 차단할 수 없음을 알 수 있다.
실시예 7: 마우스 유래 m29 단일클론항체의 가변영역을 코딩하는 유전자의 클로닝
여기서, 우선 마우스 하이브리도마 m29 세포에서 총 RNA를 추출하고, 다시 상기 RNA를 주형으로 하여, 변성 프라이머(degenerate primers)를 사용하여, Reverse transcription-polymerase chain reaction (RT-PCR) 방법으로 (Wang Y 등: Degenerated primer design to amplify the heavy chain variable region from immunoglobulin cDNA. BMC Bioinformatics. 2006; 7 Suppl (4): S9) 각각 클로닝 및 증폭에 의해 m29 항체의 중쇄 가변영역 및 경쇄 가변영역의 cDNA 유전자 단편을 수득하였다.
그 중 상기 cDNA 유전자를 클로닝하는 단계는 다음과 같다:
단계 1, 키트(강소 하이문 비요타임회사(Jiangsuhaimen Beyotime Biotechnology제품 )를 사용하여 마우스 m29 하이브리도마 세포로부터 총 RNA를 추출하였으며;
단계 2, 역전사 PCR(RT-PCR) 방법으로 eppendorf 튜브에서 cDNA 주형을 얻었다.
여기서, m29 항체의 경쇄 가변영역 역전사 PCR 프라이머 mKaRT에 사용된 서열은: TGT CGT TCA CTG CCA TCA AT이고;
m29 항체의 중쇄 가변영역 역전사 PCR 프라이머 mGaRT에 사용된 서열은: GCA AGG CTT ACA ACC ACA ATC이며;
RT-PCR 반응 시스템은 하기와 같다:
42℃ 온도에서 1시간 동안 반응시킨 후, 온도를 75℃까지 승온시켜, 15분 동안 불활성화 시킨 후 cDNA를 수득하여 -20℃에서, 사용할 때까지 저장하였다.
단계 3, m29 항체의 경쇄 가변영역 및 중쇄 가변영역을 코딩하는 유전자의 PCR 클로닝 및 증폭
변성 프라이머(degenerate primers) PCR 방법으로 상기 m29 항체의 경쇄 가변영역 유전자를 증폭시키는데 사용되는 한 쌍의 프라이머는 하기와 같다:
포워드 프라이머 mIgLF1: GACATTGTGATGWCM CA ;
리버스 프라이머 mIgLCR440: CTGAGGCACCTCCAGATGTT.
여기서, W=A 또는 T, M= A 또는 C.
반면에 변성 프라이머(degenerate primers) PCR 방법으로 m29 항체의 중쇄 가변영역 유전자를 클로닝 및 증폭시키는데 사용되는 한 쌍의 프라이머는 하기와 같다:
포워드 프라이머 mIgHset1: CARCTGCARCARYCTG;
여기서, R= A 또는 G, Y=C 또는 T.
리버스 프라이머 mIgHCR135: GTGCTGGAGGGGACAGTCACT.
PCR 증폭에 의해 수득된 DNA 생성물을 1.5% agarose 겔에서 전기영동으로 분석하였다. 전기영동이 완료된 후, 분리된 DNA 밴드를 절단하여 각각 서열 분석하여 항체의 경쇄 및 중쇄 가변영역 DNA의 뉴클레오티드 서열을 수득하였다. 측정된 상기 항체의 경쇄 가변영역 DNA의 뉴클레오티드 서열은 서열번호 1을 참조하고, 상기 DNA 뉴클리오티드의 서열로부터 추측된 항체의 경쇄의 가변영역 아미노산 서열은 서열번호 2를 참조한다. 상기 경쇄의 항원 상보성 결정부위(complementarity-determining regions, CDR)의 CDR1, CDR2 및 CDR3의 아미노산 서열은 각각 서열번호 3, 서열번호 4 및 서열번호 5를 참조한다.
측정된 상기 항체의 중쇄의 가변영역 DNA의 뉴클리오티드 서열은 서열번호 6을 참조하고, 상기 DNA의 뉴클리오티드의 서열로부터 추측된 항체의 중쇄의 가변영역 아미노산 서열은 서열번호 7을 참조한다. 상기 중쇄 항원 상보성 결정부위의 CDR1, CDR2 및 CDR3의 아미노산 서열은 각각 서열번호 8, 서열번호 9 및 서열번호 10을 참조한다.
도 7A는 m29 항체를 코딩하는 경쇄 가변영역 및 Daratumumab 경쇄 가변영역의 아미노산 서열의 비교 분석결과이다: 여기서, m29 단일클론항체의 경쇄 가변영역의 아미노산 서열에서 Daratumumab과 다른 부분은 모두 “X”기호로 표시하였으며, 박스가 표식된 아미노산 서열은 각 단일클론항체의 경쇄 가변영역의 CDR1, CDR2 및 CDR3이며; 비교분석 결과, m29 단일클론항체의 경쇄 가변영역 및 이의 CDR 서열은 Daratumumab과 유의하게 다른 것으로 나타났다.
도 7B는 m29 항체를 코딩하는 중쇄 가변영역 및 Daratumumab 중쇄 가변영역의 아미노산 서열의 비교 분석결과이다. 여기서, m29 단일클론항체의 중쇄 가변영역 아미노산 서열에서 Daratumumab과 다른 부분은 모두 “X” 기호로 표시하였으며, 박스가 표식된 아미노산 서열은 각 단일클론항체의 중쇄 가변영역의 CDR1, CDR2 및 CDR3이며; 비교분석 결과 m29 단일클론항체의 경쇄 가변영역 및 이의 CDR 서열은 Daratumumab과 유의하게 다른 것으로 나타났다.
실시예 8: 마우스 유래 m29 항체의 인간-마우스 키메라 항체(ch29G)의 구축
실시예 7에서 클로닝 및 증폭하여 수득한 m29 항체의 경쇄의 가변영역 유전자 및 중쇄의 가변영역 유전자를 각각 인간-kappa 경쇄 불변영역(C-domain) 및 인간 IgG1-중쇄 불변영역의 유전자 단편에 융합시켜, 인간-마우스 키메라 경쇄 유전자(ch29L) 및 인간-마우스 키메라 중쇄 유전자(ch29H)를 얻었다. 이어서 경쇄 키메라 유전자 및 중쇄 키메라 유전자를 각각 pQY-DHFR-Hex 발현 플라스미드에 클로닝하고, 대장균에 주입하여 증폭시켰으며, 인간-마우스 키메라 항체 유전자를 많이 포함하는 발현 플라스미드를 분리하여 수득하였다.
인간-마우스 키메라항체 유전자를 포함하는 발현 플라스미는 다시 X-tremeGENE HP DNA Transfection Reagent 리보솜(Roche사 제품)과 혼합한 후 CHO-dhfr- 세포에 형질 주입하였다. 세포에 형질주입한 2 내지 3일 후, 배양 상청액을 취하여, 인간 CD38-his 단백질이 코팅된 96-웰 플레이트를 사용하여, HRP효소로 표식된 염소-항 인간 IgG(Goat-anti-human-IgG, 상하이 서당생물회사 Shanghai Xitang Biological Company에서 구매)를 2차 항체로 하여, ELISA 방법으로 상청액 중의 인간 CD38-his 단백질에 대한 키메라 항체(ch29G)의 결합을 측정하였다.
하기 표 3은 상기 ELISA의 대표적 측정 결과이다:
표 3의 결과는 인간-마우스 키메라 항체 ch29 유전자를 발현하는 플라스미드가 형질 주입된 CHO 세포 배양 상청액은 인간 CD38 단백질에 특이적으로 결합할 수 있음을 나타내었다.
이어서, 상기 형질 주입된 세포를 배양플라스크에서 계대배양하고, 안정된 발현균주를 선별하기 위해 조건 배지를 추가하였다. 2 내지 3주간 배양 후, 잘 자란 세포 클론을 선별하여 96-웰 플레이트에 옮기고, 2 내지 3일 후에 상청액을 취하여 ELISA 방법으로 상청액의 단백질 발현 양을 검출하였으며, 마지막으로 비교적 높은 ch29 항체 단백질을 발현하는 CHO 세포주를 선별하였다. 상기 세포주를 무혈청배지(CHOM-B01, 상하이 백안의료투자유한회사)로 적응시키고, 적응이 완료된 후, 배양을 증폭시키고 상청액을 수집하였다. 상청액을 원심분리하고 0.45μm 필터막으로 여과한 후, Protein-A 친화성 크로마토그래피 컬럼(proteinA-Sepharose Fast Flow, 미국 제너럴일렉트릭 GE사 제품)에 로딩하여, 분리정제하고, 글리신-트리스(glycine-Tris, pH=7.0)로 치환하여, 순도가 99%이상인 인간-마우스 키메라 항체(ch29G, 또는 약어 ch29)를 얻었다.
실시예 9: 유세포분석기에 의한 CD38 항원을 발현하는 인간종양세포에 대한 마우스 유래 단일클론항체 m29, 인간-마우스 키메라항체 ch29G 및 Daratumumab의 결합의 측정 및 비교
본 실시예에 있어서, 정제된 마우스 유래 m29 단일클론항체, 인간-마우스 키메라항체 ch29G 및 Daratumumab 또는 비 관련 hAB21 단일클론항체(인간화 항 인간 PD-1 단일클론항체) 샘플을 1차 항체로 하고, FITC 형광이 표식된 염소-항 마우스 IgG 또는 염소-항 인간 IgG를 2차 항체로 하며, 실시예 4에서와 같은 유세포분석 방법으로 CD38 항원 발현 양성 종양세포주에 대한 샘플의 결합을 측정하였다.
이를 위해, CD38 항원의 양성 발현이 알려진 인간 종양세포주(인간 Burkitt B-림프종 세포주 Raji, 인간 골수종 세포주 RPMI-8226, 인간 T-림프종 세포주 MOLT-4 및 인간 T-림프종 세포주 Jurkat 세포는 모두 중국과학원 상하이 생명과학원 세포기탁센터에서 구입)를 각각 마우스 유래 m29 단일클론항체, 인간-마우스 키메라항체 ch29G 및 Daratumumab 또는 비 관련 hAB21 단일클론항체 샘플과 함께 4℃에서 1시간 동안 인큐베이션하고, PBS-0.1% FCS액으로 세척한 후, 각각 FITC-표식된 염소-항 마우스 IgG(1:200 희석, Sigma사 제품) 또는 FITC-표식된 염소-항 인간 IgG(1:200 희석, Sigma사 제품)로 4℃에서 1시간 동안 인큐베이션하며, 다시 PBS-0.1% FCS액으로 세척한 후, 샘플을 Accuri C6 Plus Flow Cytometer 유세포분석기(미국 Becton Dickinson사, Mountain view, CA)에 로딩하여 측정하였다.
도 8은 유세포분석기로 측정한 대표적 결과이며; 여기서:
도 8A는 인간 Burkitt B-림프종 세포주 Raji의 측정 결과이고: 비 관련 단일클론항체 hAB21에 비해, 마우스 m29 단일클론항체, 인간-마우스 키메라 항체 ch29G 및 Daratumumab은 모두 유의하게 인간 Burkitt B-림프종 세포주에 결합하며; 여기서, Raji 세포에 대한 마우스 유래 m29 단일클론항체 및 이의 인간-마우스 키메라항체 ch29G 결합의 양성 비율 및 시그널 강도는 Daratumumab 샘플과 거의 동일하다.
도 8B는 인간 골수종 세포주 RPMI-8226의 측정 결과이다: 비 관련 단일클론항체 hAB21에 비해, 마우스 m29 단일클론항체, 인간-마우스 키메라 항체 ch29G 및 Daratumumab은 모두 유의하게 인간 Burkitt B-림프종 세포주에 결합하며; 여기서, RPMI-8226 세포에 대한 마우스 유래 m29 단일클론항체와 이의 인간-마우스 키메라 항체 ch29G 결합의 양성비율 및 시그널 강도도 Daratumumab 샘플과 거의 동일하다.
도 8C는 인간 T-림프종 세포주 MOLT-4의 측정 결과이다: 여기서, MOLT-4세포에 대한 마우스 유래 m29 단일클론항체 및 이의 인간-마우스 키메라항체 ch29G 결합의 양성비율 및 시그널 강도는 Daratumumab보다 약간 낮다.
도 8D는 인간 T-림프종 세포주 Jurkat의 측정 결과이다: 여기서, Jurkat 세포에 대한 마우스 유래 m29 단일클론항체 및 이의 인간-마우스 키메라항체 ch29G 결합의 양성비율 및 시그널 강도는 Daratumumab보다 낮다.
실시예 10: 시험관 내에서 마우스 유래 단일클론항체 m29, 인간-마우스 키메라 단일클론항체 ch29G 및 Daratumumab의 CDC 활성의 비교 분석
실시예 2에서와 동일한 CDC 측정 방법을 이용하여 시험관 내에서 마우스 유래 m29 단일클론항체, 인간-마우스 키메라 단일클론항체 ch29G 및 Daratumumab의 CDC 활성을 비교분석하였다. 본 실시예에 있어서, 사용된 표적세포는 고전적인 Daudi 세포이며, 사용된 보체는 10%의 토끼혈청(자체 제작)이다.
도 9는 상기 CDC의 측정 결과이다. 결과는 마우스 유래 m29 단일클론항체 및 이의 인간-마우스 키메라 단일클론항체 ch29G가 모두 Daratumumab보다 더 강한 CDC 활성을 나타냄을 보여주었다. 마우스 유래 m29 단일클론항체 및 이의 인간-마우스 키메라 단일클론항체 ch29G의 CDC 활성의 최고값은 95% 이상에 달하며, EC50 값은 약 30ng/ml이고; 반면에 Daratumumab의 CDC 활성의 최고 값은 약 55%에 불과하며, EC50 값은 100 ng/ml이다.
실시예 11: 유세포분석기에 의한 점 돌연변이 CD38에 대한 마우스 유래 단일클론항체 m29, 인간-마우스 키메라항체 ch29G 및 Daratumumab의 결합의 측정
11.1 인간 CD38 유전자의 점 돌연변이를 안정적으로 발현시키는 CHO 세포주(CHO/hCD38-S274F)의 구축
인간 CD38의 C-말단의 274번 세린(serine, S)을 페닐알라닌(F)으로 변이시키기 위해, 실시예 5.1에서 합성한 인간 CD38 cDNA를 주형으로 하고, 프라이머를 설계하여, PCR 증폭을 수행하였다:
포워드 프라이머 huCD38F- HindIII-2:
TTGTAAGCTTGCCGCCACCATGGCTAACTGCGAGTTCTCC;
리버스 프라이머 huCD38-S274F-R1:
CTTATCGGGCCTATAGATATTTTTGCAGAAGAACTGGATGTTCCGCTTGCTGATGATGC
수득된 DNA 생성물을 1.5% agarose겔에서 전기영동하여 표적 DNA 밴드를 분리하고, 회수한 DNA 단편을 주형으로 하고, 하기 프라이머를 이용하여 두번째 PCR을 수행하여, 완전한 hCD38-S274F 유전자를 얻었다:
포워드 프라이머 huCD38F-HindIII-2:
TTGTAAGCTTGCCGCCACCATGGCTAACTGCGAGTTCTCC;
리버스 프라이머 huCD38-S274F-R2- XhoI:
TGGTCTCGAGTCAGATCTCGGAGGTGCAGCTGGAGTCTTCGGGGTTCTTCACGCACTGTAAAAACTTATCGGGCCTATAGATATT
hCD38-S274F 유전자 단편을 세포 발현벡터 pQY-DHFR(자체구축)에 클로닝하고, 대장균에 주입하여, 제한 효소 분해 검증방법으로 양성 재조합 발현 플라스미드 pQY-DHFR-hCD38-S274F를 식별하였다.
이어서 재조합 플라스미드 pQY-DHFR-hCD38S274F를 Fugen-6리보솜(Roche)과 혼합 후 CHO-dhfr-세포에 공동 형질주입하고, 태아소혈청을 포함한 IMDM 배양배지를 이용하여 인간 CD38 유전자를 안정적으로 발현하는 점 돌연변이된 CHO 세포 세포주(CHO/hCD38-S274F)를 선별하였다.
11.2 유세포분석기에 의한 야생형(wild-type) 또는 점 돌연변이 인간 CD38을 발현하는 CHO 세포(CHO/hCD38-S274F)에 대한 마우스 유래 단일클론항체 m29, 인간-마우스 키메라 단일클론항체 ch29G 및 Daratumumab의 결합을 측정
본 실시예에 있어서, 유세포분석기로 야생형(wild-type) 또는 점 돌연변이 인간 CD38을 발현하는 CHO 세포에 대한 마우스 유래 단일클론항체 m29, 인간-마우스 키메라 단일클론항체 ch29G 및 Daratumumab의 결합을 측정 및 분석하였다.
여기서, 측정의 주요 단계는 다음과 같다: 이를 위해, 각각의 야생형(wild-type) 또는 점 돌연변이 인간 CD38을 안정적으로 발현하는 CHO 세포와 마우스 유래 단일클론항체 m29, 인간-마우스 키메라 단일클론항체 ch29G 또는 Daratumumab 샘플을 4℃에서 1시간 동안 인큐베이션하고, PBS-0.1% FCS 용액으로 세척한 후, FITC 형광이 표식된 염소-항 마우스 IgG 또는 FITC 형광이 표식된 염소-항 인간 IgG를 4℃에서 1시간 동안 인큐베이션하며, 다시 PBS-0.1% FCS 용액으로 세척한 후, 샘플을 유세포분석기(Accuri C6 Plus Flow Cytometer, 미국 BD사)에 로딩하여 측정하였다.
도 10은 상기 유세포분석기로 측정한 대표적 결과 모식도이며, 여기서,
도 10A는 야생형(wild-type)인간 CD38을 발현하는 CHO 세포에 대한 측정결과이며, 결과는 인간-마우스 키메라 단일클론항체 ch29가 마우스 유래 단일클론항체 m29와 마찬가지로, 야생형(wild-type)인간 CD38을 발현하는 CHO 세포에 대한 결합을 유지하고, 양자의 결합강도는 Daratumumab과의 결합강도와 비슷함을 보여주었다
도 10B는 점 돌연변이 인간 CD38을 발현하는 CHO 세포(CHO/hCD38-S274F)에 대한 측정 결과이며, 결과는 인간-마우스 키메라 단일클론항체 ch29G도 마우스 유래 단일클론항체 m29와 마찬가지로, 상기 점 돌연변이 인간 CD38을 발현하는 CHO 세포(CHO/hCD38-wild-typ)에 대한 결합을 유지하고, 반면에 상기 점 돌연변이 CD38을 발현하는 CHO 세포에 대한 Daratumumab의 결합은 유의하지 않음을 보여주었다.
실시예 12: 사이노몰구스 원숭이 CD38을 안정적으로 발현하는 CHO 세포주(CHO/mkCD38)의 구축 및 유세포분석기에 의한 상기 세포주에 대한 마우스 유래 단일클론항체 m29, 인간-마우스 키메라 항체(ch29G) 및 Daratumumab의 결합의 측정
12.1 사이노몰구스 원숭이 CD38(CHO/mkCD38)을 안정적으로 발현하는 세포주의 구축
인간 CD38 단백질의 아미노산 서열 및 사이노몰구스 원숭이(Macaca fascicularis, Cynomolgus monkey)CD38 및 침팬지(Chimpanzee, Pan troglodytes) CD38 단백질의 아미노산 서열의 비교 분석은 도 11A에서 볼 수 있고; 도 11A에 도시된 바와 같이: 침팬지 CD38(ChiCD38) 단백질의 아미노산 서열은 인간 CD38 단백질(huCD38)의 아미노산 서열과 거의 일치하며, 반면에 사이노몰구스 원숭이 CD38(mkCD38) 단백질의 아미노산 서열과 인간 CD38 단백질의 아미노산 서열의 전체적인 상동성은 91%이고, 양자는 16개 아미노산 서열이 상이하다.
Genebank 데이터베이스에 의해 공개된 사이노몰구스 원숭이 CD38 유전자 서열(Gene ID: 102126394)에 따라, 소주 진웨이지생물학기술유한회사(Suzhou Jinweizhi Biological Technology Co., Ltd.)에 의뢰하여 사이노몰구스 원숭이(cynomolgus) CD38의 cDNA단편을 합성하였으며, 이를 세포 발현벡터 pQY-DHFR(자체 구축)에 클로닝하여, 대장균으로 형질전환한 후, 제한효소 분해 검증방법으로 양성 재조합 플라스미드 pQY-DHFR-mkCD38을 확인하였다.
이어서, 재조합 플라스미드 pQY-DHFR-mkCD38 및 Fugen-6 리보솜(Roche)을 혼합하여 CHO-dhfr 세포에 공동 형질주입한 다음, 태아소혈청을 포함한 IMDM 배지를 이용하여 사이노몰구스 원숭이 CD38 단백질을 안정적으로 발현하는 CHO 세포주(CHO-cynomolgus CD38)를 스크리닝하였다.
12.2 유세포분석기에 의한 사이노몰구스 원숭이 CD38(CHO-cynomolgus CD38)을 안정적으로 발현하는 세포주에 대한 마우스 유래 단일클론항체 m29, 인간-마우스 키메라항체(ch29G) 및 Daratumumab의 결합의 측정 및 분석
실시예 11의 11.2섹션에 기재된 방법을 이용하여 유세포분석기로 마우스 유래 단일클론항체 m29, 인간-마우스 키메라항체(ch29G) 및 Daratumumab와 사이노몰구스 원숭이 CD38 단백질을 안정적으로 발현하는 CHO 세포주 (CHO-cynomolgus CD38)를 유세포분석기로 측정하여 분석하였다.
도 11B는 상기 유세포분석기로 측정한 대표적 결과 모식도이며, 결과는 인간-마우스 키메라 단일클론항체 ch29G가 마우스 유래 단일클론항체 m29와 마찬가지로 사이노몰구스 원숭이 CD38을 발현하는 CHO 세포주에 대한 고친화력 결합을 유지하고, 반면에 사이노몰구스 원숭이 CD38을 발현하는 CHO 세포주에 대한 Daratumumab의 결합 활성의 강도는 90%이상 감소함을 보여주었다.
실시예 13: ELISA에 의한 인간 CD38단백질 또는 사이노몰구스 원숭이 CD38 단백질에 대한 인간-마우스 키메라항체 ch29G 및 Daratumumab의 결합의 측정
본 실시예에 있어서, 직접적 ELISA방법으로 재조합 인간 CD38 단백질 또는 재조합 사이노몰구스 원숭이 CD38 단백질에 대한 인간-마우스 키메라항체 ch29 및 Daratumumab의 결합을 측정하였다. 이를 위해, 각각의 재조합 인간 CD38-his 단백질 또는 재조합 사이노몰구스 원숭이(cynomolgus) CD38-his 단백질(모두 베이징 시노바이오사(Sino Biological Inc.) 제품)으로 96-웰 플레이트(1ug/ml, 50ul/웰, 4℃에 밤새 방치)를 코팅하고, 5% 밀크로 블로킹한 후, 인간-마우스 키메라항체 ch29 샘플, Daratumumab 및 음성 대조항체 Rituximab (항-인간 CD20 단일클론항체)를 희석액(0.5% 밀크가 포함된 PBST)으로 1ug/ml이 되게끔 희석하고, CD38 단백질이 코팅된 96-웰 플레이트에 로딩하고, 2배로 계단식 희석으로 12개 웰을 희석하고, 실온에서 1시간 동안 인큐베이션하였으며, PBS-0.1% Tween20 용액으로 충분히 세척한 후, HRP 효소가 표식된 Goat-anti-human-IgG를 첨가하여 2차 항체(1:1000 희석, 상하이 서당생물회사(Shanghai Xitang Biological Company)에서 구입)로 하며 실온에서 1시간 동안 인큐베이션하고, 다시 PBS-0.1% Tween20 용액으로 충분히 세척한 후, O-페닐렌다이아민(OPD)-0.1% H2O2 기질용액을 첨가하여 10 내지 15min동안 발색시킨 후 0.1M HCl을 첨가하여 반응을 종결시켰다. 그 이후에 다기능 마이크로 플레이트 리더기(PerkinElmer Victor X3)에서 492nm의 OD값을 읽었다.
도 12는 상기 ELISA의 측정 결과이다. 도면에 도시된 바와 같이: 인간-마우스 키메라항체 ch29G 및 Daratumumab은 모두 고친화력으로 인간 CD38 단백질에 결합할 수 있다(도 12A). 인간-마우스 키메라항체 ch29G는 또한 사이노몰구스 원숭이 CD38 단백질에 고친화력으로 결합할 수 있는 반면에; Daratumumab은 사이노몰구스 원숭이 CD38 단백질에 유의한 결합을 보이지 않았다(도 12B).
실시예 14: 인간-마우스 키메라 단일클론항체 ch29G 및 Daratumumab의 활성의 시험관 내 보체의존세포독성 (complement-dependent cytotoxicity, CDC)의 검출 및 비교분석
14.1 실험재료 및 방법
본 실시예에 있어서, 본 실시예 2와 같이 다양한 표적세포(Daudi, Raji, MOLT-4 및 Jurket 등을 포함)에 대한 인간-마우스 키메라 단일클론항체 ch29G의 CDC 활성을 시험관 내 보체의존세포독성 (complement-dependent cytotoxicity, CDC) 방법으로 검출하였으며, 결과를 Daratumumab의 CDC 활성 결과와 비교하였다. 여기서 사용한 보체는 건강한 인간 혈청(10%, 자체 제작)에서 유래하였고, CDC 양성대조 샘플은 Rituximab(항 CD20 인간-마우스 키메라 단일클론항체)이며, 음성대조 샘플은 hPV19 단일클론항체(항 VEGF 인간화 단일클론항체)이다.
도 13은 상기 CDC의 측정 결과이며, 여기서:
도 13A는 Daudi를 표적세포로 하는 CDC 측정 결과이며, 결과는 인간-마우스 키메라 항체 ch29G가 양성대조 샘플 Rituximab과 비슷한 CDC 활성을 구비하며, 또한 양자의 CDC 활성은 모두 Daratumumab보다 높음을 나타내었다.
도 13B는 Raji를 표적세포로 하는 CDC 측정 결과이며, 결과는 인간-마우스 키메라항체 ch29G도 양성대조샘플 Rituximab과 비슷한 CDC 활성을 구비하며, Daratumumab의 CDC 활성은 인간-마우스 키메라항체 ch29G의 활성과 비슷함을 나타내었다.
도 13C은 MOLT-4를 표적세포로 하는 CDC 측정 결과이며, 결과는 인간-마우스 키메라항체 ch29G, Daratumumab 및 Rituximab 모두 유의한 CDC 활성이 없음을 나타내었다.
도 13D는 Jurket을 표적 세포로 하는 CDC 측정 결과이며, 결과는 인간-마우스 키메라항체 ch29G, Daratumumab 및 Rituximab 또한 유의한 CDC 활성이 없음을 나타내었다.
실시예 15: 마우스 유래 m29 항체의 인간화 유전공학 조작
ELISA 방법, CDC 등 측정에 의해 인간-마우스 키메라항체 ch29G가 인간 CD38 단백질에 대한 고 친화력 결합 유지 및 CDC 활성을 초보적으로 입증한 것을 기반으로, PCR과 같은 일련의 유전공학 클로닝 방법을 이용하여 상기 키메라 항체의 경쇄에 있는 항원 상보성 결정부위(CDR) 유전자 단편을 해당 인간 kappa-경쇄 가변영역 골격(framework regions, FR)에 이식하여, 인간화 항체의 경쇄를 얻었으며, 다시 상기 경쇄를 키메라 중쇄와 결합시켜, 경쇄 인간화 HH29G 항체를 얻었다.
15.1 마우스 유래 m29 항체의 경쇄의 인간화 유전공학 조작
아미노산 서열 분석을 통해, 인간 면역 글로불린 Kappa 경쇄의 첫번째 V영역의 생식세포 유전자를 발현하는 생성물(IgKV2D-29, NCBI Gene ID: 28882)이 마우스 유래 m29 항체의 경쇄 가변영역과 가장 높은 상동성을 갖는 것으로 확인되었다. 따라서, m29 항체의 경쇄 프레임 워크 영역(FR)을 인간 IgKV2D-29의 상동성 서열로 대체한 다음, 대체된 가변영역 유전자를 인간 면역글로불린 IgG-Kappa 경쇄의 불변영역 코딩 서열과 스플라이싱하고, 최종적으로 인간화된 경쇄 코딩 유전자(h29-L)를 성공적으로 획득하였다. 그 중에서 인간화 m29 항체의 경쇄 가변영역의 아미노산 서열은 서열번호 11로 표시되고, 이의 뉴클레오티드 서열은 서열번호 13으로 표시된다.
15.2 마우스 유래 m29 항체의 중쇄의 인간화 유전공학 조작
아미노산 서열 분석을 통해, 인간 면역 글로불린 Kappa 중쇄의 첫번째 V영역의 생식세포 유전자를 발현하는 생성물(IGHV1-69, NCBI Gene ID:28461)이 m29 중쇄 가변영역과 가장 높은 상동성을 갖는 것으로 확인되었다. 따라서, m29 중쇄 프레임 워크 영역(FR)을 인간 IGHV1-69의 상동성 서열로 대체한 다음, 대체된 가변영역 유전자를 인간 면역글로불린 IgG- 중쇄 불변영역 코딩 서열과 스클라이싱하고, 최종적으로 인간화된 경쇄 코딩 유전자(h29-h)를 성공적으로 수득하였다. 그 중에서 인간화 m29 항체의 중쇄 가변영역 아미노산 서열은 서열번호 12로 표시되고, 이의 뉴클레오티드 서열은 서열번호 14로 표시된다.
실시예 16: 인간화 또는 반인간화 HH29 단일클론항체(HH29)를 안정적이고 효율적으로 분비하고 발현하는 CHO 세포주의 구축 및 항체 단백질의 분리 정제
인간-마우스 키메라 중쇄 유전자(ch29H), 인간화 경쇄 유전자(HH29L)를 단계적으로 pQY-Dhfr-Hex 발현벡터에 클로닝하고, 대장균으로 형질전환한 후 증폭 및 분리하여 인간화 또는 반인간화 HH29 단일클론항체(HH29) 단일클론항체 발현 플라스미드를 얻었다. 이어서, 경쇄 인간화 항체 HH29를 발현하는 재조합 플라스미드를 CHO 세포에 일시적 형질주입을 수행하였다. 형질 주입 24시간 후, 웰 안의 세포배양 상청액을 흡인하고, CD38-his 단백질을 코팅 항원으로 하고, HRP 효소가 표식된 Goat-anti-human-IgG를 검출 2차 항체(상하이 서당생물회사(Shanghai Xitang Biological Company)에서 구입)로 하며, OPD를 발색기질로 하고, 직접적 ELISA방법으로 인간 CD38 단백질 항원에 대한 형질주입된 세포 상청액 중의 항체의 결합 활성을 측정하였다.
하기 표 4는 상기 ELISA의 대표적 측정 결과이다.
표 4의 결과에 나타난 바와 같이, 인간-마우스 키메라형 ch29G 단일클론항체와 마찬가지로, 반인간화 HH29 단일클론항체(경쇄 인간화)는 인간 CD38 단백질에 대한 결합활성을 유지하였다.
상기 형질주입된 세포는 클로닝으로 스크리닝하고 무혈청배지로 현탁 배양 적응시킨 후, 반인간화 단일클론항체(경쇄 인간화) HH29 를 안정적이고 효율적으로 분비하고 발현하는 CHO 세포 공정주를 성공적으로 획득하였다.
이어서, 그 중에서 세포공정주를 선별하여 다시 무혈청배지에서 증폭 및 배양한 후, 배양상청액을 수집하고, 상청액을 원심분리하고 0.45μm 필터막으로 여과한 후, Protein A 친화성 크로마토그래피 컬럼(proteinA-Sepharose Fast Flow, 미국 제너럴일렉트릭GE사), 이온교환크로마토그래피 컬럼, 바이러스 제거/비활성화, 및 필터멸균(0.22μm 여과막 여과)을 포함한 다양한 분리 정제 수단에 로딩한 후, 최종적으로 높은 순도(단백질 순도가 99% 이상에 달함)의 HH29 항체를 얻었다. 정제된 HH29 단일클론항체를 글리신-Tris 완충액(pH=7.0)에 용해시키고(1 내지 10mg/ml), 저온(약 4℃)에서 보존하였다.
실시예 17: 마우스 생체 내에서 마우스 유래 m29 단일클론항체의 항종양효능 시험
본 실시예에 있어서, 누드 마우스에 피하이식된 인간 B-림프종 Raji 종양 모델에서 마우스 유래 m29 단일클론항체의 생체 내 항종양 효능을 시험하였으며, 인간-마우스 키메라-항-CD20 단일클론항체 Rituximab을 양성대조 약물로 사용하였다. 상기 실험은 우선 인간 B-림프종 세포주 Raji를 누드 마우스에 피하이식하였고; 실험동물에서 종양이 형성된 후, 다시 그룹을 나누어 약물을 투여하고 종양의 성장을 관찰 및 기록하였다.
이를 위해, 1x107개의 인간 유래 B-림프종 세포주 Raji세포(중국 과학원 전형배양물기탁위원회 세포은행)를 누드마우스(남경대학동물센터에서 구입)에 접종하였으며, 접종하고자 하는 종양 부피가 대두정도(약 100mm3, 종양세포 접종 후 약 6 내지 7일)일 때 동물을 무작위로 하기 3개 군으로 나누었다:
A군: 생리식염수 음성대조군(n=2, 동등한 부피의 생리식염수)
B군: 양성대조약물 Rituximab 단일클론항체 치료군(n=4, 투여용량은 10mg/kg체중)
C군: m29 단일클론항체약물 치료군(n=4, 투여용량은 10mg/kg 체중)
동물을 그룹화 한 당일부터(즉 종양 접종 후 6 내지 7일), 주 2회(3 내지 4일 간격으로), 연속 6회(총 3주 동안 투여) 복강 내 주사(i.p.)로 투여하였다. 이 기간 동안 동물의 일반적인 임상 증상을 매일 관찰하고, 종양의 장경(mm)과 단경(mm) 및 동물의 체중을 3 내지 4일 간격으로 측정하였다. 종양부피의 계산공식은 부피(mm3)=장경(mm)×단경(mm)×단경(mm)×0.5이다. 만약 측정 중에 종양의 부피가 3000mm3를 초과하면 시험동물에 대해 안락사를 수행하였다(euthanized).
시험결과:
도 14는 각 시험군 동물의 종양의 평균 성장량 추세이고, 그 중에서,
도 14A는 종양 이식 전 10일 동안의 평균 성장부피에 대한 모식도이고, 결과는 각 군 간에 유의한 차이가 없음을 나타내었고;
도 14B는 종양 이식 후기의 평균 성장 부피에 대한 모식도이고, 결과는 생리식염수 음성대조군에 비해, m29 단일클론항체 약물 치료군 및 양성 대조약물 Rituximab 단일클론항체 치료군의 종양이 유의하게 줄어들었거나 완전히 사라짐을 나타내었다.
실시예 18: 마우스 생체 내에서 인간-마우스 키메라 ch29G 항체의 항종양효능 시험
본 실시예에 있어서, 실시예 17에서와 동일한 누드 마우스 피하이식된 인간 B-림프종 Raji 종양 모델을 사용하여 인간-마우스 키메라 ch29G 단일클론항체의 항종양 효능을 시험하였으며, Daratumumab 단일클론항체를 양성 대조약물로 사용하였다. 상기 실험에서 우선 인간 B-림프종 세포 Raji를 누드 마우스에 피하이식하였고; 실험동물에서 종양이 형성된 후, 다시 그룹을 나누어 약물을 투여하고 종양의 성장을 관찰 및 기록하였다.
이를 위해, 1×107개의 인간 유래 B-림프종 Raji 세포(중국 과학원 전형배양물위원회 세포은행)를 누드 마우스(남경대학동물센터에서 구입)에 접종하였으며, 접종하고자 하는 종양 부피가 대두정도(약 100mm3, 종양세포 접종 후 약 6 내지 7일)일 때 동물을 무작위로 하기 3개 군으로 나누었다:
A군: 생리식염수의 음성 대조군(n=10, 동등한 부피의 생리식염수)
B군: 양성 대조약물 Daratumumab군(n=10, 투여용량은 5 mg/kg체중)
C군: ch29G 단일클론항체 약물 치료군(n=10, 투여용량은 2.5 mg/kg체중)
동물을 그룹화한 당일부터(즉 종양 접종 후 6 내지 7일), 주 2회(3 내지 4일 간격으로), 연속 6회(총 3주동안 투여) 복강 내 주사(i.p.)로 투여하였다. 이 기간 동안 동물의 일반적인 임상 증상을 매일 관찰하고, 종양의 장경(mm)과 단경(mm) 및 동물의 체중을 3 내지 4일 간격으로 측정하였다. 종양부피의 계산공식은 부피(mm3)=장경(mm)×단경(mm)×단경(mm)×0.5이다. 만약 측정 중에 종양의 부피가 3000mm3를 초과하면 시험동물에 대해 안락사를 수행하였다(euthanized).
실험결과:
도 15는 각 시험군 동물의 종양의 평균 성장량 추세이고, 결과는 생리식염수 음성대조군에 비해, ch29G 단일클론항체 약물 치료군 및 양성 대조약물 Daratumumab 치료군의 치료 성장이 유의하게 억제되며, 여기서, 2.5 mg/kg체중의 투여량인 ch29G 단일클론항체의 치료효과가 투여량이 5mg/kg체중인 Daratumumab의 치료효과와 유사함을 보여주었다.
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tccggcgtgc ccgatcgttt ttccggttct ggctccggca ccgacttcac tttaaaaatt 240
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ttgtaagctt gccgccacca tggctaactg cgagttctcc 40
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carctgcarc aryct 15
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gtgctggagg ggacagtcac t 21
Claims (14)
- 제1가변영역 및 제2가변영역을 포함하고,
상기 제1가변영역은 항체의 경쇄 가변영역이며, 이의 항원 상보성 결정부위 CDR1, CDR2 및 CDR3은 각각 서열번호 3, 서열번호 4 및 서열번호 5로 표시되는 아미노산 서열이고; 상기 제2가변영역은 항체의 중쇄 가변영역이며, 이의 항원 상보성 결정부위 CDR1, CDR2 및 CDR3은 각각 서열번호 8, 서열번호 9 및 서열번호 10으로 표시되는 아미노산 서열을 포함하는 것을 특징으로 하는 인간 및 원숭이 CD38 항원에 특이적으로 결합하는 단일클론항체 또는 이의 유도체. - 제1항에 있어서,
상기 제1가변영역은 서열번호 2로 표시되는 아미노산 서열인 항체의 경쇄 가변영역이고; 상기 제2가변영역은 서열번호 7로 표시되는 아미노산 서열인 항체의 중쇄 가변영역인 것을 특징으로 하는 항체 또는 이의 유도체. - 제1항에 있어서,
상기 제1가변영역은 서열번호 11로 표시되는 아미노산 서열인 항체의 경쇄 가변영역이고, 상기 제2가변영역은 서열번호 12로 표시되는 아미노산 서열 또는 서열번호 7로 표시되는 아미노산 서열인 항체의 중쇄 가변영역인 것을 특징으로 하는 항체 또는 이의 유도체. - 제1, 2 또는 3항에 있어서,
상기 항체의 경쇄 가변영역 및 인간 항체의 경쇄 불변영역을 포함하고, 상기 항체의 중쇄 가변영역 및 인간 항체의 중쇄 불변영역의 힌지 영역, CH1 영역, CH2 영역 및 CH3 영역을 더 포함하는 것을 특징으로 하는 항체 또는 이의 유도체. - 제4항에 있어서,
상기 인간 항체의 경쇄 불변영역은 인간 항체 kappa 사슬 또는 항체 lamda 사슬로부터 유래되고, 상기 인간 항체의 중쇄 불변영역은 인간 IgG1, IgG2, IgG3 또는 IgG4 서브 타입으로부터 유래되는 것을 특징으로 하는 항체 또는 이의 유도체. - 항체의 경쇄 가변영역은 서열번호 1 또는 서열번호 13으로 표시되는 뉴클레오티드 서열이고, 항체의 중쇄 가변영역은 서열번호 6 또는 서열번호 14로 표시되는 뉴클레오티드 서열인 것을 특징으로 하는 제3항의 상기 항체 또는 이의 유도체를 코딩하는 DNA 분자 또는 유전자.
- 제6항의 DNA 분자서열 및 상기 서열을 작동 가능하게 연결된 발현 조절 서열을 포함하는 것을 특징으로 하는 발현벡터.
- 제7항의 상기 발현벡터로 형질전환하여 형성된 것을 특징으로 하는 재조합 숙주세포.
- 제1항 또는 제5항의 항체 또는 이의 유도체를 발현하는 제8항의 상기 재조합 숙주세포 또는 이의 자손세포.
- 약학적으로 유효량의 제1항 또는 제5항의 항체 또는 이의 유도체, 및 약제학적으로 허용가능한 담체를 포함하는 것을 특징으로 하는 약물 또는 약학 조성물.
- 제10항에 있어서,
종양 치료 약물을 제조하기 위한 상기 약물 또는 약학 조성물의 용도. - 제11항에 있어서,
상기 종양은 CD38 발현 양성 종양인 것을 특징으로 하는 용도. - 제12항에 있어서,
상기 CD38 발현 양성 종양은 인간 골수종 또는 인간 림프종인 것을 특징으로 하는 용도. - 제1항 또는 제5항의 항체 또는 이의 유도체를 제조하는 방법으로,
a) 제1항 또는 제6항의 DNA 분자서열 및 상기 서열에 작동 가능하게 연결된 발현 조절 서열을 포함하는 발현벡터를 제공하는 단계;
b) 단계a)의 발현벡터로 숙주세포를 형질전환하는 단계;
c) 상기 항체의 발현에 적합한 조건에서 단계b)에서 수득된 숙주세포를 배양하는 단계; 및
d) 친화성 크로마토그래피를 이용하여 상기 숙주세포 배양액으로부터 상기 항체를 분리 및 정제하여 수득하는 단계;
를 포함하는 방법.
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