CN103865878B - 拮抗抑制血管内皮细胞生长因子与其受体结合的单克隆抗体及分泌它的杂交瘤细胞系与用途 - Google Patents

Abstract

本发明属于生物技术-单克隆抗体领域。本发明公开了一种可拮抗抑制血管内皮细胞生长因子（VEGF）与其受体（VEGF-R）结合的单克隆抗体及分泌它的杂交瘤细胞系，该杂交瘤细胞系的保藏编号为CGMCC？No.5889。本发明还公开了该单克隆抗体的制备方法及其用途,包括其在检测VEGF蛋白的应用以及在制备治疗与血管增生有关疾病的药物制剂中的应用。

Description

拮抗抑制血管内皮细胞生长因子与其受体结合的单克隆抗体及分泌它的杂交瘤细胞系与用途

技术领域

本发明属于生物技术-单克隆抗体领域。本发明涉及一种可拮抗抑制血管内皮细胞生长因子（VEGF）与其受体（VEGF-R）结合的单克隆抗体及其用途。

背景技术

血管新生或增生(angiogenesis)在生物学上是指体内的已存在的血管(如毛细血管和微小动、静脉)通过出芽或分裂的方式而产生新的血管的过程。血管新生在维持机体的许多正常的生理过程如组织胚胎发育、外伤伤口的癒合与修复等是有益的和必需的。但过度的血管新生或增生也与许多病理变化（如肿瘤的增生扩散、炎症等）息息相关。体内的血管能够不断地增生与增长的关键是其内衬的血管内皮细胞具有不断分裂增生及定向迁移置入已有的血管管壁的能力。血管内皮细胞生长因子(vascularendothelialgrowthfactor,VEGF)则是已知的最重要及最强烈的促血管内皮细胞分裂增生及血管增长的因子。VEGF在血管增生中的重要性已在VEGF基因剔除小鼠的研究中被充分证实：因为只要当VEGF基因中的一份被敲除后，小鼠胚胎在仅发育至11至12天时就会因血管增生受阻及异常而死亡(CarmelietP等Nature1996,380:435;FerraraN等Nature1996，380:439)。

VEGF在多种恶性肿瘤组织中（如胃癌、肝癌、结、直肠癌、卵巢癌、乳腺癌、多发性骨髓瘤等）呈过度表达，且其表达水平高低与肿瘤生长与转移复发程度呈高度正相关(DvorakHF等：JExpMed1991;174:1275-8；BrownLF等CancerRes1993;53:4727-35；WeidnerN,SempleJP,WelchWR及FolkmanJ:NEnglJMed1991；324:1-8.4-5)。近年来国内外一系列动物试验及临床实践已证明：如通过基因调控或给予药物来阻断体内VEGF及其受体（VEGFR）介导的促血管增生，则可导致肿瘤组织因缺血而坏死，从而达到抑制肿瘤生长和转移及延长患者生存期的良好疗效。因此,以VEGF及其受体为靶点的抗肿瘤血管增生药物已成为当今国内外药物研发竞争热点。

在以VEGF及其受体为靶点的抗肿瘤血管增生药物的开发上，目前主要有两大模式：

模式一是研制拮抗VEGF受体（VEGF-R）中位于细胞膜内的酪氨酸蛋白激酶活性的抑制剂，这类拮抗抑制剂一般都属于小分子化学类药，其中的代表性药物为2006年由美国Pfizer(辉瑞)开发上市的Sutent(舒尼替尼);及由德国Bayer(拜耳)与美国OnyxPharmaceuticals开发上市的Nexavar。

模式二是研制可直接阻断VEGF与其受体（VEGF-R）中位于细胞膜外区域结合的抗体或抗体-Fc融合蛋白，这类拮抗抑制剂一般都属于大分子蛋白类生物制剂，其中的代表性药物为由Roche/Genentech公司研发生产并于2004年获美国FDA批准上市的抗VEGF单克隆抗体药物Bevacizumab（贝伐单抗）,商品名Avastin（阿瓦斯丁)。Bevacizumab是目前为止全球市场上唯一的一个以VEGF为靶点的人源化单克隆抗体药物。Avastin通过与体内VEGF的高度特异结合,从而阻止VEGF与其受体的结合，进而达到抗血管增生与抗肿瘤的疗效（PrestaLG等CancerRes，1997，57:4593;HurwitzH等NEnglJMed，2004;350:2335）。目前已获美国FDA批准用于与化疗药合并治疗结肠癌、肺癌、脑瘤、肾癌等多种实体瘤。

Avastin其前身可追溯到代号为A4.6.1的小鼠单克隆抗体。该小鼠单克隆抗体的来源及分泌它的杂交瘤细胞系与用途在专利号为US6,582,959的美国专利（发明人：Kim，KyungJin，专利授权日期：June24,2003，专利名称：Antibodiestovascularendothelialcellgrowthfactor）；及专利号为US7,227,004的美国专利（发明人：Kim，KyungJin专利授权日期：June5,2007，专利名称：Antibodiestovascularendothelialcellgrowthfactor）中都有所描述。该鼠源抗体及其人源化抗体rhuMab-VEGF（即Bevacizumab）的序列及其制备方法已在专利号为US6,054,297的美国专利（发明人：Carter;PaulJ.及Presta;LeonardG，专利申请日期：May9，1995，专利授权日期：April25,2000，专利名称：Humanizedantibodiesandmethodsformakingthem）公开并在CancerRes杂志上发表（PrestaLG等CancerRes，1997，57:4593）。

但该抗体还存在如下不足：

1）与大多数的单克隆抗体一样，小鼠单克隆抗体A4.6.1及其人源化抗体Bevacizumab也仅只是能结合VEGF抗原表位中的部分位点，无法结合或涵盖VEGF抗原表位中众多的其他位点。

2）先前在动物实验中及近年来的临床研究中发现仅单独给予小鼠单克隆抗体A4.6.1或Bevacizumab抗体，无法达到完全中和抑制体内VEGF及其介导的促血管新生。

因此，研制具有新的可拮抗抑制人VEGF蛋白与其受体（VEGF-R）结合的单克隆抗体或药物制剂显得很有意义与必要。

为获得可拮抗抑制人VEGF蛋白与其受体（VEGF-R）结合的单克隆抗体及分泌它的杂交瘤细胞系，本发明选取由酵母表达的重组人VEGF165蛋白为免疫抗原，通过反复多次小剂量的小鼠皮下免疫，获得分泌高效价的抗VEGF多克隆抗体；再从中挑取小鼠，取其脾脏细胞，通过体外与小鼠骨髓瘤细胞融合、再经药物筛选及亚克隆等步骤而建立了多株稳定分泌抗人VEGF抗体的杂交瘤单克隆细胞。其中一代号为PV19-5小鼠杂交瘤细胞株（以下又简称PV19），经ELISA、免疫印迹，免疫组化等多种方法鉴定，证实其所分泌的单克隆抗体能够特异识别并高亲合力结合人VEGF（包括VEGF121、165及VEGF189等）。体外测试表明该鼠源单克隆抗体可高效抑制VEGF与其受体（VEGF-R）的结合。在人类移植肿瘤裸鼠模型上的测试结果还表明该鼠源单克隆抗体能有效抑制包括如乳腺癌、横纹肌肉瘤等多种肿瘤在体内的生长。

发明内容

本发明要解决的技术问题之一是提供拮抗抑制血管内皮细胞生长因子（VEGF）与其受体（VEGF-R）结合的小鼠单克隆抗体。

本发明要解决的技术问题之二是提供分泌生产该单克隆抗体的小鼠杂交瘤细胞系；该杂交瘤细胞系代号为PV19-5（以下又简称PV19），已于2012年03月12日保藏在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心（保藏编号为CGMCCNo5889.保藏地点：中国，北京）。

本发明要解决的技术问题之三是提供本发明的单克隆抗体的制备方法。

本发明要解决的技术问题之四是提供本发明的小鼠单克隆抗体在VEGF相关的研究和临床检测诊断与治疗等领域的应用。

本发明选取重组人VEGF蛋白为免疫原，通过反复多次小剂量的小鼠皮下免疫，获得分泌高效价的抗VEGF多克隆抗体；再从中挑取小鼠，取其脾脏细胞，通过体外与小鼠骨髓瘤细胞融合、再经药物筛选及亚克隆等步骤而建立了多株稳定分泌抗人VEGF抗体的杂交瘤单克隆细胞。其中一代号为PV19-5杂交瘤细胞株，经ELISA、免疫印迹、免疫组化等多种方法鉴定，证实其所分泌的单克隆抗体能够特异识别并结合人VEGF（包括VEGF121、VEGF165及VEGF189等）。体外研究还证明该单克隆抗体可竞争抑制VEGF与其受体（即VEGF-R）的结合，体内在人类移植肿瘤裸鼠模型上的测试结果还表明该鼠源单克隆抗体能有效抑制包括如乳腺癌、横纹肌肉瘤等多种肿瘤在体内的生长。

在本发明的一方面，提供一种可分泌单克隆抗体的杂交瘤细胞系，该杂交瘤细胞系代号为PV19-5，已于2012年03月12日保藏在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心（简称为CGMCC），保藏编号为CGMCCNo.5889，保藏地点：中国，北京。

在本发明的另一方面，提供一种可拮抗抑制人VEGF蛋白与其受体（即VEGF-R）结合的单克隆抗体，由上述保藏编号为CGMCCNo.5889的杂交瘤细胞系分泌产生。

本文所采用的术语“单克隆抗体（单抗）”指从一纯系细胞得到的免疫球蛋白，具有相同的结构和化学特性，对单一抗原决定簇有特异性。单克隆抗体与常规多克隆抗体制剂（通常是具有针对不同决定簇的不同抗体）不同，各单克隆抗体是针对抗原上的单个决定簇。除了它们的特异性外，单克隆抗体的好处还在于它们是通过杂交瘤或重组工程细胞培养获得，不会混杂有其它免疫球蛋白。修饰语“单克隆”表示了抗体的特性，是从均一的抗体群中获得的，这不应被解释成需要用任何特殊方法来生产抗体。

本文所采用的术语“杂交瘤细胞系”（英文名称：hybridomacellline），指从杂交瘤细胞中筛选培养出的细胞系。

在本发明的另一方面，提供上述单克隆抗体蛋白的制备方法，包括如下步骤：

步骤1、制备重组人VEGF蛋白为免疫原，具体为：PCR扩增得到编码人VEGF的基因片断，将其克隆到酵母表达载体中，获得表达质粒，转化酵母菌，筛选出高效表达工程菌株，工程菌株经发酵、诱导表达、分离纯化后，获得纯度达95％以上的VEGF蛋白；

步骤2、动物免疫：通过反复多次小剂量的小鼠皮下免疫，获得分泌高效价的抗人VEGF多克隆抗体；

步骤3、从中挑取小鼠，取其脾脏细胞，通过体外与小鼠骨髓瘤细胞融合；

步骤4、酶联免疫吸附试验筛选抗体分泌阳性的杂交瘤细胞；

步骤5、阳性杂交瘤细胞经亚克隆鉴定得到多株稳定分泌抗人VEGF抗体的杂交瘤单克隆细胞；经再次亚克隆鉴定，筛选得到一株如权利要求1所述的杂交瘤细胞；

步骤6、将该杂交瘤细胞扩增培养，收集培养液，采用亲合层析法分离纯化抗人VEGF单克隆抗体。

步骤2所述小鼠皮下免疫的方法为：将所述纯化的重组VEGF蛋白与弗氏完全佐剂混合，于皮下多点注射小鼠。

步骤6所述的亲合层析法具体为：将含单克隆抗体的杂交瘤细胞扩增后，接种于无血清的1640培养基中，37℃培养5天，随后上清过滤液后上样至含ProteinG-SepharoseFastFlow亲合层析；亲合层析柱经以PBS洗脱去除杂蛋白后,再以pH为2.7的甘氨酸液洗脱被吸附的抗体蛋白；洗脱液以1mol/LTris(pH9.0)调节pH至7.0，再对10倍的体积的1xPBS透析12～16后，透析后的样品再经0.45μm滤膜过滤后即获得纯化的抗人VEGF单克隆抗体。

在本发明的另一方面，提供一种上述单克隆抗体在检测VEGF蛋白中的应用。本发明进一步确认了上述单克隆抗体用于检测体液或病变组织中的VEGF蛋白的表达。例如用该单克隆抗体作为试剂用以体外定量检测各种体液如血液、血浆、血清、尿、淋巴液或脑脊液中的VEGF的水平，或检测各种生物材料如细胞培养上清液、组织细胞裂解物中的VEGF的水平；或该单克隆抗体作为试剂用于免疫组化（IHC）等方法来定性或定量检测各种病变器官组织的VEGF蛋白的表达，或各种疾病下如肿瘤（肿瘤增生早期及扩散期等）、炎症（如关节炎、系统性红斑狼苍等）患者外周血液中VEGF的水平表达，以作为临床诊断或辅助诊断的一个标志。

在本发明的另一方面，提供一种上述单克隆抗体在制备治疗与血管增生有关疾病的药物制剂中的应用。所述与血管增生有关疾病包括横纹肌移植瘤、乳腺肿瘤等。

本发明的抗VEGF单克隆抗体及其分泌它的杂交瘤细胞系的用途至少包括但不限于以下范畴：

（1）该抗体作为试剂用于免疫组化方法检测各种病变器官组织的VEGF蛋白的表达。

（2）该抗体作为试剂用以体外定量测定各种体液（如血液、血浆、血清、尿、淋巴液）或各种生物材料（如细胞培养上清液、组织细胞裂解物）中的VEGF的水平。

（3）利用该抗体制备免疫亲和层析柱，来分离纯化VEGF蛋白。

（4）标记的（生物素或荧光如FITC等标记）抗VEGF的单克隆抗体为探针显影剂，用于免疫荧光实验或其他显影方法来定位或定量检测各种疾病如肿瘤或炎症患者的组织器官中的VEGF表达水平，以辅助临床诊断。

（5）该抗体还可作为VEGF的拮抗剂，用于药理学研究。

（6）从分泌该抗体的小鼠杂交瘤细胞系中分离纯化mRNA，再以RT-PCR等方法从中克隆和扩增出编码小鼠PV19抗体的轻链和重链可变区的基因。扩增获得的抗体轻链和重链可变区基因可用于制备单链抗体、Fab片断、人-鼠嵌合抗体或者人源化抗体等各种基因工程抗体。

（7）该抗体或其衍生体（如单链抗体、Fab片断、人-鼠嵌合抗体、人源化抗体、放射药物标记抗体、细胞毒性药物标记抗体、纳米材料-抗体复合体等）作为单独成分，或与其他治疗药物或治疗手段合并使用，用于制备与VEGF高表达有关的病变（如肿瘤，炎症等）的治疗药物。

附图说明

下面结合附图和具体实施方式对本发明作进一步详细的说明：

图1为本发明实施例1中以重组人VEGF165蛋白包板，以ELISA法检测PV19杂交瘤细胞的培养上清液与重组人VEGF蛋白结合的实验结果示意图。其中，M23为已知分泌抗人VEGF单抗的杂交瘤细胞上清液，为阳性对照。P16为非相关杂交瘤细胞培养上清液，为阴性对照；SP2/0代表未融合的骨髓瘤细胞培养上清液。

图2为本发明实施例2中以SDS-PAGE分析鉴定从PV19杂交瘤细胞的培养上清液中经亲合层析纯化获得的PV19单克隆抗体蛋白的实验结果示意图。图2中，泳道1为DTT还原的PV19抗体蛋白；泳道2为未还原的PV19抗体蛋白；Marker为蛋白质分子量标志。

图3为本发明实施例3中以免疫印迹法(Westernblot)分析鉴定小鼠PV19单克隆抗体与还原及未还原的重组人VEGF165蛋白的结合特性。其中泳道1为未还原的VEGF165蛋白;泳道2为DTT还原的VEGF165蛋白。

图4为本发明实施例4中用竞争性ELISA法检测单克隆抗体-生物素标记的重组人VEGF165蛋白混合物与固定在96-孔板上的VEGFR1受体蛋白结合的实验结果示意图。其中mPV19&Biotin-VEGF组代表不同溶度的小鼠PV19单克隆抗体与固定量的生物素标记的重组人VEGF165蛋白混合；W10&Biotin-VEGF组代表不同溶度的非相关单克隆抗体（代号为W10）与固定量的生物素标记的重组人VEGF165蛋白的混合。

图5A为本发明实施例5中PV19单克隆抗体在裸鼠体内抑制人A673横纹肌瘤生长的实验结果示意图。

图5B为本发明实施例5中PV19单克隆抗体在裸鼠体内抑制人A673横纹肌瘤生长实验终末时与阴性对照组相比，各治疗组平均肿瘤瘤重下降率（瘤重抑制率%）的条形图。

图5C为本发明实施例5中PV19单克隆抗体在裸鼠体内抑制人A673横纹肌瘤生长实验终末时测定的各治疗组动物重量均值条形图。

图6为本发明实施例6中PV19单克隆抗体在裸鼠体内抑制人MD-MBA-321乳腺肿瘤生长的实验结果示意图。

图7为本发明实施例7中以PV19单克隆抗体为第一抗体，以免疫组化方法检测人肿瘤组织切片的结果示意图，其中图7A为人结肠癌组织切片；图7B为人乳腺癌组织切片。

代号为PV19-5的小鼠杂交瘤细胞株(来源于小鼠Musmusculus)已于2012年03月12日保藏在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心（保藏编号为CGMCCNo.5889；保藏地点：中国北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所）。

具体实施方式

下面的实施例可以使本领域技术人员更全面地理解本发明，但不以任何方式限制本发明。实施例1:稳定分泌抗VEGF单克隆抗体的杂交瘤细胞系的建立与筛选鉴定

步骤1.重组人VEGF165蛋白（免疫抗原）的制备

重组人VEGF165蛋白（免疫抗原）的制备（采用申请号为2007100473522，发明名称为“重组人血管内皮细胞生长因子的分离纯化、体外化学标记及其应用”的中国发明专利申请所记载的方法制备）：

利用PCR技术从人肺组织细胞cDNA文库中扩增得到编码人VEGF165完整开放读码框架序列（open-readingframe,ORF）的基因片断，经序列测定鉴定正确，用限制性内切酶处理后，将其克隆到酵母表达载体pPic9K(Invitrogen公司)载体中。获得表达质粒pPic9K-VEGF165，转化毕赤酵母菌，筛选出高效表达工程菌株。工程菌经发酵、诱导表达，分离纯化后，获得纯度95％以上的VEGF165蛋白。

步骤2、动物免疫

将上述纯化的重组人VEGF165蛋白与弗氏完全佐剂混合，于皮下多点注射Balb/c小鼠（100μl/只，共10μgVEGF165蛋白）。首次免疫2-3周后，小鼠再给予皮下多点注射VEGF165蛋白与不完全佐剂混合加强免疫。加强免疫2-3次后，取少量小鼠血清，用包被VEGF165蛋白的96-孔酶标板以ELISA法检测小鼠血清中抗VEGF蛋白抗体的效价，取效价高者小鼠的脾细胞用于下一步的细胞融合。

步骤3、细胞融合

在VEGF165蛋白末次免疫后3天，无菌制备小鼠脾细胞悬液，与小鼠骨髓瘤细胞SP2/0（购自中国科学院上海生命科学院细胞保藏中心），以5：1的比例在50%PEG-1000（Sigma公司产品）作用下融合。融合按常规法（KohlerG.andMilsteinC:Nature1975;256:495-497）,PEG用量1ml，1分钟内缓慢加完。反应90秒后，以无血清的RPMI-1640培养基终止反应，1000rpm离心10min,去除上清液，再将离心沉淀下的细胞以含10%HAT(H为次黄嘌呤、A氨基碟呤、T胸腺嘧啶核苷，为Sigma公司产品)的RPMI1640-10%FCS培养基将细胞浓度调节至1×10⁶/ml，加入96孔平底细胞培养板（每孔200μl），于37℃，5%CO₂培养箱中培养2-3周。

步骤4、酶联免疫吸附试验（ELISA）筛选抗体分泌阳性的杂交瘤细胞

以重组人VEGF165蛋白（2μg/ml，pH9.6，0.1MNaHCO₃液）包被酶标板，37℃包被2小时或4℃过夜；2%牛血清白蛋白（BSA）封闭，4℃过夜。经PBS-0.1%Tween20液洗涤后加入待检杂交瘤细胞培养上清（以未融合的SP2/0小鼠骨髓瘤细胞培养上清为阴性对照）37℃孵育2小时；经PBS-0.1%Tween20液洗涤后，加入辣根过氧化物酶（HRP）标记的羊抗小鼠Ig（Sigma公司产品），37℃孵育1小时；再经PBS-0.1%Tween20液充分洗涤后，加入邻苯二胺（OPD）-0.1%H₂O₂底物液显色10-15min,以0.1MHCl终止反应。在MK3Multiskan酶标仪(ThermoScientific公司产品)中读取492nm处OD值。测得的OD492值比阴性对照高5-10倍的杂交瘤细胞再克隆化，并进行扩增冻存。

步骤5、阳性杂交瘤细胞的克隆化-有限稀释法

将上述初筛得到的阳性细胞以RPMI-1640-10%FCS培养基稀释至每孔1-10个细胞，铺于96-孔细胞培养板，于37℃，5%CO2培养箱中培养2-3周。待克隆长成，取上清液以ELISA再次检测鉴定抗VEGF抗体的分泌。经检测鉴定，获得多个抗体分泌阳性细胞株。其中，经再次亚克隆鉴定，获得了一株代号为PV19-5(以下简称PV19)的稳定分泌抗VEGF单克隆抗体的杂交瘤细胞株。图1为以ELISA法检测鉴定PV19杂交瘤细胞上清液与重组VEGF165蛋白结合，结果证明该杂交瘤细胞上清液含高效价抗VEGF165蛋白的抗体。该抗体经鉴定为IgG类。该杂交瘤细胞株再经大量扩增，长期传代培养并冻存，于2012年03月12日保藏在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心（保藏编号为CGMCCNo5889）。

实施例2.抗VEGF单克隆抗体的体外制备及纯化

本实施例中，抗VEGF单克隆抗体（PV19）的分离纯化采用亲合层析法。其纯化步骤为：将PV19杂交瘤细胞扩增后，接种于200ml无血清的1640培养基中，37℃培养5天，随后上清过滤液后上样至含ProteinG-SepharoseFastFlow（购自通用电气公司）亲合层析；亲合层析柱经以PBS洗脱去除杂蛋白后,再以低pH(2.7)甘氨酸(0.1M)液洗脱被吸附的抗体蛋白。洗脱液以1mol/LTris(pH9.0)调节pH至7.0，再对10倍的体积的1xPBS透析12～16后（期间换液2-3次），透析后的样品再经0.45μm滤膜过滤后即获得纯化的PV19单克隆抗体。

将纯化的PV19抗体按常规方法在DTT还原及未还原条件下进行SDSPAGE电泳（分离胶为10%，浓缩胶5%）鉴定分析。图2为该电泳分析结果图谱，其中泳道1为DTT-还原的PV19抗体，泳道2为未还原的PV19抗体。如图2所示：与未还原的PV19抗体样品相比后，DTT-还原的PV19抗体分离为2条主带，其中处于上面的条带为PV19抗体重链，处于下面的条带为PV19抗体轻链。

实施例3.免疫印迹法(Westernblot)分析鉴定PV19单克隆抗体与人VEGF蛋白及其他相关蛋白的结合

图3为免疫印迹法(Westernblot)分析鉴定PV19单克隆抗体与人VEGF165蛋白特异结合的实验结果图谱。实验中的VEGF蛋白来源于大肠杆菌表达的重组人VEGF165蛋白（美国R&DSystem公司产品）。该VEGF165蛋白先溶于PBS-1%BSA液中(50μg/ml）,每道上样10μl进行15%SDS-PAGA电泳，按常规方法将凝胶蛋白带转移到PVDF纤维膜上（Millipore公司产品），用5%脱脂奶粉在4℃封闭过夜，加入由实施例2制备获得的PV19单抗，室温反应2小时，用TBS-T（pH7.5，0.05mol/lTris-Hcl,0.15mol/lNaCl,0.05%Tween-20）洗涤3次，随后加入辣根过氧化物酶-（HRP）标记的羊抗小鼠IgG或羊抗兔IgG（Sigma公司产品），室温反应1h，用TBS-T洗涤三次。最后加DAB-0.1%H2O2底物液显色10-15min。结果如图3所示，PV19抗体可与未还原的（泳道1）及还原的重组VEGF165蛋白（泳道2）特异结合；而与泳道中的BSA等其他蛋白无交叉反应。

该免疫印迹实验结果证明PV19细胞株产生的单克隆抗体也能与还原及未还原的大肠杆菌表达的重组人VEGF165蛋白特异结合。

在本实施例中，还以免疫印迹法、免疫组织化学（IHC）、ELISA、dot-blot等方法还检测分析了PV19单克隆抗体与不同类型的VEGF蛋白及相关蛋白的结合反应。检测结果小结如表1。

表1免疫分析检测PV19抗体与VEGF及其他相关蛋白的结合

+：表示结合反应阳性，-：表示结合反应阴性。+/-：表示结合反应阴性至微弱阳性

检测结果表明PV19单克隆抗体能与人VEGF（包括VEGF121、165、189）及猴VEGF蛋白结合；但不与小鼠及大鼠的VEGF结合，也不与人VEGF-B、VEGF-C、VEGF-D、IL-17等蛋白结合。与人胎盘生长因子（PLGF）结合呈阴性至微弱阳性。

实施例4竞争性ELISA法检测PV19单克隆抗体体外阻断VEGF与其受体结合的活性

鼠源PV19单克隆抗体的生物活性测定方法之一是竞争性ELISA法检测鉴定鼠源PV19单克隆抗体体外阻断VEGF与其受体的结合。该竞争性ELISA法的基本原理与过程是先将生物素标记的人VEGF165蛋白与不同溶度的单克隆抗体混合，之后再将混合物转入预先包被有重组VEGF受体（如VEGFR1）蛋白的96-孔板，经孵育及洗脱后，加入酶标记的Avidin（如辣根过氧化物酶标记的Avidin）。再经孵育及洗脱后，加入底物显示并测定OD值。

检测具体步骤如下：

1）用重组人VEGFR1蛋白（美国R&D公司产品）包被96-孔酶标板（2μg/ml,50μl/孔)，4℃过夜；

2）经PBS液漂洗及2%BSA(稀释在PBS-0.1%tween20液中)室温封闭后,分别加入固定溶度的生物素标记的VEGF165单克隆抗体（Bio-VEGF，1：1000）与不同溶度的PV19抗体，或非相关的抗体（W10），37℃孵育2h；

3）经PBS-T洗脱后，加入辣根过氧化物酶标记的Avidin（1：5000），37℃孵育1h；

4）经PBS-T洗脱后，加入显色液(邻苯二胺)-3%双氧水，室温10min至显色；

5）加入HCL终止反应，以酶标仪测定492nm波长处各孔的吸光值。

图4为竞争性ELISA结果的代表性示意图。如图4所示:在PV19抗体（mPV19&Bio-VEGF）组中，其OD值与抗体蛋白量成反比关系：即加入的PV19抗体的量越高，其OD值越低。而非相关的抗体（W10&Bio-VEGF）组，各孔OD值不受加入的抗体蛋白量影响。此结果表明PV19抗体体外可特异阻断VEGF与其受体（VEGF-R1）的结合。

实施例5.PV19单克隆抗体在裸鼠体内抑制人横纹肌移植瘤的生长

步骤1：人A673横纹肌移植瘤模型的建立

收集体外培养的A673横纹肌瘤细胞（购自中国科学院上海生命科学院细胞保藏中心），共收集细胞数量约10⁶/ml×8ml，1000rpm离心4分钟后，用8ml生理盐水重悬，EP管分装，每管0.2ml，注射前混匀。将混匀的A673瘤细胞接种于的8周龄Balb/c雄性裸鼠（裸鼠购自上海斯莱克实验动物有限责任公司，以下各实施例同）右侧皮下。每只裸鼠接种5x10⁶细胞,共接种35-40只）。待接种后10-14天，接种处见明显的肿块时，开始随机分组治疗。

步骤2：PV19抗体治疗人A673横纹肌移植瘤

将上述接种了A673瘤的裸鼠分成四组（每组6-8只），通过腹腔注射分别给予

1）PV19抗体高剂量治疗组（PV19-1，200μg/次）；

2）PV19抗体低剂量治疗组PV19，50μg/次）；

3）对照IgG组(200μg/次)及

4）Avastin抗体阳性对照组（200μg/次）。

各组首次给药时间为在接种肿瘤细胞后的第13天，此后每3天给药一次，共计10次，至第43天。期间测量每只小鼠中肿瘤大小.

结果如图5A所示：与对照IgG组(controlIgG)相比，PV19抗体高剂量治疗组（PV19-1）及PV19抗体治疗低剂量组（PV19-2）肿瘤生长都得到明显的抑制（P<0.05）；且两组抑制肿瘤的疗效都不亚于Avastin抗体阳性对照组（Bev.）。

在末次给药后的第4天，剥离肿瘤，称重及计算各治疗组肿瘤的瘤重下降率（%）。瘤重下降率的计算公式如下：（对照IgG组平均瘤重-治疗组平均瘤重）/对照IgG组平均瘤重x100%.

各治疗组肿瘤下降率（%）如图5B所示：PV19抗体高剂量治疗组（PV19-1）及PV19抗体治疗低剂量组（PV19-2）肿瘤瘤重分别下降了76%和88%,与Avastin抗体阳性对照组（Bev.）的瘤重下值相近（Avastin阳性对照组下降了76%）。图5C则显示各治疗组间动物的体重无明显差别。

该测试结果证明PV19抗体能有效抑制人A673肿瘤在裸鼠体内的生长。

实施例6.PV19单克隆抗体在裸鼠体内抑制移植人乳腺肿瘤的生长

步骤1：人MDA-MB-231乳腺肿瘤移植模型的建立

收集体外培养的MDA-MB-231人乳腺肿瘤细胞（购自中国科学院上海生命科学院细胞保藏中心），离心后，用PBS重悬，EP管分装，每管0.2ml，注射前混匀。将混匀的MDAMB-231乳腺肿瘤细胞接种于的8周龄Balb/c雄性裸鼠右侧皮下（每只裸鼠接种5x10⁶细胞,共接种20只）。待接种后10-14天，接种处见明显的肿块时，开始随机分组治疗。

步骤2：PV19抗体治疗MDA-MB-231移植乳腺肿瘤

将上述接种人乳腺肿瘤细胞的裸鼠分成两组（每组6-8只），通过腹腔注射分别给予PV19抗体（PV19抗体治疗组：100μg/次）；或PBS（PBS阴性对照组）。各组首次给药时间为在接种肿瘤细胞后的第13天，此后每3天给药一次，至第46天共计给药10次。期间测量记录各小鼠肿瘤大小。测试期间各组肿瘤体积增长曲线结果如图6所示：与PBS阴性对照组相比，PV19抗体治疗组肿瘤生长得到明显抑制（P<0.05）。此结果证明PV19抗体能有效抑制人MDA-MB-231乳腺肿瘤在裸鼠体内的生长。

实施例7.PV19单克隆抗体用于免疫组化检测组织切片中人VEGF蛋白

本发明的PV19单克隆抗体还可作为试剂成分，用于定性或定量检测样品中VEGF蛋白。其中本实施例中以PV19单克隆抗体为第一抗体，以辣根过氧化物酶（HRP）标记的-兔抗小鼠Ig（RabbitAnti-MouseIg）多克隆抗体为第二抗体，采用免疫组化方法检测了人肿瘤病理组织切片中VEGF蛋白的表达。

其中该免疫组化检测步骤如下：

1)取人肿瘤病理组织切片（人乳腺癌组织及结肠癌组织切片，购自陕西超英生物技术有限公司）在60℃中烤片30分钟，常规脱蜡水化；

2)抗原修复：高压修复抗原2分钟，冷却至室温，PBS洗5分钟×2次；

3)滴加PeroxidaseBlockingSolution室温30分钟；

4）滴加1抗：检测第一抗体为PV19单克隆抗体或阴性对照抗体（均为1：100稀释）4℃冰箱过夜；

5)0.1%Tween－PBS洗5分钟×3次；

6)滴加辣根过氧化物酶（HRP）标记的兔抗小鼠（RabbitAnti-MouseIg，Sigma公司）多克隆抗体，室温30分钟；

7)0.1%Tween－PBS洗5分钟×3次；

8)DAB显色，蒸馏水洗终止显色；

9)苏木素复染、水洗、分化后充分水洗返蓝；

10)常规脱水透明，中性树胶封片；

图7为免疫组化检测结果。其中图7A为人结肠癌组织切片；图7B为人乳腺癌组织切片。组织切片检测结果表明PV19单克隆抗体可检测人肿瘤组织中的VEGF抗原。

Claims (4)

1.一种拮抗抑制血管内皮细胞生长因子与其受体结合的单克隆抗体，由保藏编号为CGMCCNo.5889的杂交瘤细胞系分泌产生。

2.权利要求1所述的抗体在检测VEGF蛋白的非诊断应用。

3.权利要求1所述的抗体在制备治疗与血管增生有关疾病的药物制剂中的应用。

4.如权利要求3所述的应用，其特征在于，所述与血管增生有关疾病为横纹肌移植瘤、乳腺肿瘤。