抗单链IV型胶原多肽抗体和包含其的用于诊断、预防或治疗肿瘤的药物或药剂
技术领域
本发明涉及单克隆抗体,其结合作为单链形式的IV型胶原基因产物分泌的单链IV型胶原多肽,并且抑制表达单链IV型胶原多肽的肿瘤组织的生长。本发明也涉及包含该单克隆抗体的用于肿瘤的药物和诊断、预防或治疗的药物。
背景技术
活组织由为生命单位的细胞和存在于细胞周围或之间的细胞外基质组成。细胞外基质是大的蛋白复合体,其主要由糖修饰的蛋白比如胶原、层粘连蛋白、弹性蛋白和蛋白聚糖组成。胶原占生物蛋白的约30%并且主要见于结缔组织中。而且,胶原组成上皮组织和结缔组织之间的边界处或内皮组织和结缔组织之间边界处的基膜。已知细胞外基质的功能是参与控制细胞生长和/或分化。细胞外基质和细胞之间的相互作用已经显示对于正常组织的发育、修复、再生等是重要的。
也已经显示,细胞外基质和细胞之间的该相互作用对于肿瘤形成期间肿瘤细胞生长和血管发生起到重要的作用。通过细胞外基质的反复降解和重塑,肿瘤细胞重建细胞外微环境。结果,促进肿瘤细胞的生长或新生血管的形成以使得肿瘤组织生长。而且,已知由于这种重塑的细胞外基质的降解,发生肿瘤细胞的侵袭和/或转移。
已知胶原包括基因型不同的20或更多种类型。例如,I型胶原主要存在于由成纤维细胞、间质细胞等组成的结缔组织,而IV型胶原主要存在于基膜中。
除了成纤维细胞或间质细胞之外,IV型胶原还从多种细胞比如上皮细胞和内皮细胞分泌。这样分泌的IV型胶原分子被认为彼此缔结以构建具有网结构的基膜骨架。正常组织的基膜在上皮组织和间质组织之间的边界处、内皮组织和间质组织之间的边界处等存在,并且调节组织形态学和功能。
胶原分子具有松弛的右手三螺旋结构,其由三条多肽链一起组成,每条链具有左手螺旋构象。IV型胶原包括6种基因型。已知衍生自这6种基因的α1至α6多肽链,并且考虑其不同组合以形成3种或更多种类型的分子种类。最广泛可见的基膜由IV型胶原分子的聚集体组成,每条聚集体具有通过分子间二硫键交联的2条α1多肽链和1条α2多肽链。相对照,由α3至α6多肽链组成的IV型胶原分子仅仅可见于有限数量组织的基膜中。
如上述,IV型胶原指三聚体分子——其具有由通过分子间二硫键交联的3条α多肽链形成的三螺旋结构,或这些三聚体分子的聚集体。一般而言,已知IV型胶原被细胞外分泌为三聚体分子以在细胞外形成聚集体。但是,本发明人已经发现培养的人细胞分泌IV型胶原以及其单多肽链(下文,也称为“单链IV型胶原多肽”),其即没有分子间二硫键也不采取螺旋结构(见NPL1)。具体而言,在不含维生素C的培养基中培养的细胞产生的单链IV型胶原多肽的量比IV型胶原的量大得多(见NPL2)。而且,已知IV型胶原通过降解蛋白的酶(明胶酶、基质金属蛋白酶-2等)经历降解。因为缺乏螺旋结构,单链IV型胶原多肽比具有三螺旋结构的IV型胶原更容易由降解酶降解。所以,已经假定全长单链IV型胶原多肽难以在体内检测。然而,本发明人已经在人胎盘中发现单链IV型胶原多肽(见NPL3)。
本发明人已经进一步揭示从细胞分泌的单链IV型胶原多肽经历不同于IV型胶原的翻译后修饰。已知IV型胶原中的脯氨酸羟基化和赖氨酸羟基化参与三螺旋结构的形成和/或稳定,而与IV型胶原相比,单链IV型胶原多肽中的脯氨酸羟基化和赖氨酸羟基化程度更低。另外,单链IV型胶原多肽与二孢蘑菇(Agaricusbisporus)凝集素(ABA)——识别糖链Galβ1-3GalNAc的凝集素——反应,而IV型胶原不与ABA凝集素反应。
如上述,单链IV型胶原多肽的化学结构不同于由于其变性而产生的IV型胶原或多肽的化学结构。因此推定单链IV型胶原多肽的生物功能不同于IV型胶原的生物功能。
实体瘤为了其生长需要新生血管。由于该原因,抑制血管发生是抑制肿瘤生长的方法之一。IV型胶原具有胶原的和非胶原的区域。据报道,包含在C-端非胶原的区域的多肽Arresten抑制腔形成并且抑制血管发生,导致肿瘤生长的抑制(见NPL4)。
已经报道,JK199(见PTL1)和包含在血清中IV型胶原的测试试剂盒中的抗体(见NPL5、NPL6和PTL2)作为抗IV型胶原的单克隆抗体。
另外,已经报道作用于“隐藏胶原位点(crypticcollagensite)”的抗体(见PTL3)作为抗变性的IV型胶原的单克隆抗体。但是,其既没有公开也没有暗示这些抗体识别细胞外分泌和稳定存在的单链IV型胶原多肽。
同时,已经报道JK132(见NPL1和NPL7)识别单链IV型胶原多肽,作为识别单链IV型胶原多肽的抗体。不幸地,这些报道尚未揭示单链IV型胶原多肽的生物学作用或其与癌症的关系。因此,既没有公开也没有暗示包括抗单链IV型胶原多肽的抗体的药物可用作肿瘤的诊断和治疗的药物。
参考文献列表
专利文献
PTL1:日本专利申请特许公开(JP-A)号63-78067
PTL2:JP-A号2-1553
PTL3:JP-A号2009-240324
非专利文献
NPL1:Takahashi,S.等,ConnectiveTissue(1999)vol.31;pp.161-168
NPL2:Yoshikawa,K.等,J.Biochem.(2001)vol.129;pp.929-936
NPL3:Kajimura,D.等,BiochemicalandBiophisicalResearchCommunication(2004)vol.314;pp.11-16
NPL4:ThomasM.Mundel等,MicrovascularResearch(2007)vol.74;pp.85-89
NPL5:InstructionmanualofthetypeIVcollagenassaykit“PanassayIV-CLatex”;DaiichiPureChemicalsCo.,Ltd.(2006修改的版本)
NPL6:Obata,K.等,ClinialChimicaActa181,pp.293-304,1989
NPL7:Iwata,N.等,JournalofBiochemistry(1995)vol.117(6);pp.1298-1304
发明内容
技术问题
本发明的目的是解决上述常规问题并且提供肿瘤组织选择性极好的单克隆抗体、包含该单克隆抗体的药物,和包含该单克隆抗体的可用于肿瘤治疗或诊断用于肿瘤的诊断、预防或治疗的药物。
问题的解决方案
本发明人已经进行了细致的研究通过下述发现获得该目的并且从而完成本发明:单链IV型胶原多肽在人癌细胞系、患癌症动物的癌症组织和人临床肿瘤中高度表达;和特异性结合单链IV型胶原多肽的单克隆抗体抑制患癌症动物的癌组织的生长。
本发明基于本发明人获得的发现,并且解决问题的手段如下。
<1>单克隆抗体,
其中单克隆抗体特异性结合单链IV型胶原多肽,和
其中单克隆抗体由抗NK-抗原单克隆抗体#141的杂交瘤系产生(获取号:FERMBP-11300)。
<2>根据<1>的单克隆抗体,
其中单克隆抗体包含:H链,其包含选自由SEQIDNOs:5至7表示的氨基酸序列的至少一条氨基酸序列;和L链,其包含选自由SEQIDNOs:8至10表示的氨基酸序列的至少一条氨基酸序列。
<3>根据<1>的单克隆抗体,
其中单克隆抗体包含:H链,其包含选自由SEQIDNOs:11至13表示的氨基酸序列的至少一条氨基酸序列;和L链,其包含选自由SEQIDNOs:14至16表示的氨基酸序列的至少一条氨基酸序列。
<4>根据<1>至<3>任一项的单克隆抗体,
其中单克隆抗体识别包含由GIGIPGLRG(SEQIDNO:41)表示的氨基酸序列的表位。
<5>单克隆抗体,包含:
根据<1>的单克隆抗体的至少一个互补决定区(CDR)。
<6>单克隆抗体,包含:
H链,其包含选自由SEQIDNOs:5至7表示的氨基酸序列的至少一条氨基酸序列;和
L链,其包含选自由SEQIDNOs:8至10表示的氨基酸序列的至少一条氨基酸序列,
H和L链包含在根据<2>的单克隆抗体中。
<7>单克隆抗体,包含:
H链,其包含选自由SEQIDNOs:11至13表示的氨基酸序列的至少一条氨基酸序列;和
L链,其包含选自由SEQIDNOs:14至16表示的氨基酸序列的至少一条氨基酸序列,
H和L链包含在根据<3>的单克隆抗体中。
<8>单克隆抗体,
其中单克隆抗体识别包含由GIGIPGLRG(SEQIDNO:41)表示的氨基酸序列的表位,
该表位被根据<4>的单克隆抗体识别。
<9>根据<5>至<8>任一项的单克隆抗体,
其中单克隆抗体是人源化的。
<10>单克隆抗体,包含:
根据<1>的单克隆抗体的至少一个互补决定区(CDR),和
人抗体,
其中至少一个互补决定区(CDR)被移植至人抗体。
<11>单克隆抗体,包含:
H链,其包含选自由SEQIDNOs:5至7表示的氨基酸序列的至少一条氨基酸序列;和
L链,其包含选自由SEQIDNOs:8至10表示的氨基酸序列的至少一条氨基酸序列。
<12>单克隆抗体,包含:
H链,其包含选自由SEQIDNOs:11至13表示的氨基酸序列的至少一条氨基酸序列;和
L链,其包含选自由SEQIDNOs:14至16表示的氨基酸序列的至少一条氨基酸序列。
<13>单克隆抗体,
其中单克隆抗体识别包含由GIGIPGLRG(SEQIDNO:41)表示的氨基酸序列的表位。
<14>根据<11>至<13>任一项的单克隆抗体,
其中单克隆抗体是人源化的。
<15>杂交瘤系,
其中杂交瘤系是抗NK-抗原单克隆抗体#141(获取号:FERMBP-11300)。
<16>药物,包含:
根据<1>至<14>任一项的单克隆抗体。
<17>用于肿瘤的诊断、预防或治疗的药物,包含:
根据<1>至<14>任一项的单克隆抗体。
<18>根据<17>的用于肿瘤的诊断、预防或治疗的药物,
其中肿瘤是包含表达单链IV型胶原多肽的癌细胞的肿瘤。
<19>根据<1>、<2>、<4>至<6>、<8>至<11>、<13>和<14>任一项的单克隆抗体的部分结构,
其中该部分结构包含单克隆抗体的至少一个互补决定区(CDR),和
其中至少一个CDR包含:选自由SEQIDNOs:5至7表示的氨基酸序列的至少一条氨基酸序列;和选自由SEQIDNOs:8至10表示的氨基酸序列的至少一条氨基酸序列。
<20>根据<1>、<3>至<5>、<7>至<10>和<12>至<14>任一项的单克隆抗体的部分结构,
其中该部分结构包含单克隆抗体的至少一个互补决定区(CDR),和
其中至少一个CDR包含:选自由SEQIDNOs:11至13表示的氨基酸序列的至少一条氨基酸序列;和选自由SEQIDNOs:14至16表示的氨基酸序列的至少一条氨基酸序列。
本发明的有利效果
本发明可解决上述常规问题并且获得该目的。具体而言,本发明可提供肿瘤组织选择性极好的单克隆抗体,包含该单克隆抗体的药物,和包含该单克隆抗体可用于肿瘤的治疗或诊断的用于肿瘤的诊断、预防或治疗的药物。
附图说明
图1是显示肿瘤细胞系(人肝癌细胞系HLF或人肾癌细胞系UO31)中表达单链IV型胶原多肽的一个例子的图。JK132和Ab6586(由Abcamplc.制造)都是蛋白质印迹中识别单链IV型胶原多肽的抗体。术语“三链COL4”表示在三条链之间保持其分子间二硫键的SDS-变性的IV型胶原。术语“单链COL4”表示单链IV型胶原多肽。还原处理的标记“-”表示电泳样品的缓冲液不含2-巯基乙醇。还原处理的标记“+”表示电泳样品的缓冲液包括2-巯基乙醇。
图2是显示患癌症(人肺癌Lu65A)的裸大鼠的癌组织中表达单链IV型胶原多肽的一个例子的图。术语“三链COL4”表示在三条链之间保持其分子间二硫键的SDS-变性的IV型胶原。术语“单链COL4”表示单链IV型胶原多肽。还原处理的标记“-”表示电泳样品的缓冲液不含2-巯基乙醇。还原处理的标记“+”表示电泳样品的缓冲液包括2-巯基乙醇。
图3是显示比较从肺癌患者获得的人临床肺癌组织和人临床正常肺组织之间的单链IV型胶原多肽表达水平的结果的图。术语“三链COL4”表示在三条链之间保持其分子间二硫键的SDS-变性的IV型胶原。术语“单链COL4”表示单链IV型胶原多肽。
图4是显示人肝癌细胞系HLF产生的单链IV型胶原多肽的纯化产物的一个例子的图。术语“MW”表示分子量标记。
图5是作为一个例子显示抗-单链IV型胶原多肽抗体(NK46141)特异性识别单链IV型胶原多肽的图。术语“Sup.”表示人肝癌细胞HLF的培养物上清液。术语“CNT”表示用作阴性对照而不包含用于免疫沉淀反应的一抗的PBS。术语“IgG2b”表示小鼠IgG2b同种型对照。
图6是作为一个例子显示在具有皮下移植的人肺癌Lu65A的裸小鼠模型中,抗-单链IV型胶原多肽抗体(NK46141)抑制肿瘤生长的图。空白三角形表示对照组。空白圆表示接收本发明抗-单链IV型胶原多肽抗体(NK46141)的给药组。
图7A是显示使用全长(FL)野生型IV型胶原α1基因(COL4A1)和变体COL4A1表达载体表达的野生型重组蛋白(FL)和变体重组蛋白(Δ29-488、Δ29-989和Δ29-1,066)的示意性说明图。
图7B是显示缩小抗-单链IV型胶原多肽抗体(NK46141)识别的表位的蛋白质印迹结果的图。术语“Mock”表示阴性对照。JK132表示基因表达确认的对照。
图8A是显示使用变体COL4A1表达载体表达的变体重组蛋白(990-1,066myc、990-1,019myc和1,020-1,066myc)的示意性说明图。术语“myc”表示抗-myc抗体识别的用于基因表达确认的增加的标记。
图8B是显示缩小抗-单链IV型胶原多肽抗体(NK46141)识别的表位的蛋白质印迹结果的图。术语“Mock”表示阴性对照。抗-myc抗体表示基因表达确认的对照。
图9A是显示使用全长野生型COL4A1和变体COL4A1表达载体表达的野生型重组蛋白(FL)和变体重组蛋白(Δ1,020-1,066、Δ1,020-1,049和Δ1,050-1,066)的示意性说明图。
图9B是显示缩小NK46141识别的表位的蛋白质印迹结果的图。术语“Mock”表示阴性对照。JK132表示基因表达确认的对照。
图10是显示缩小NK46141识别的表位的点渍法结果的图。#1:由SEQIDNO:37表示的肽序列。#2:由SEQIDNO:38表示的肽序列。#3:由SEQIDNO:39表示的肽序列。#4:由SEQIDNO:40表示的肽序列。#5:由SEQIDNO:41表示的肽序列。#6:由SEQIDNO:42表示的肽序列。
具体实施方式
(单克隆抗体)
本发明的单克隆抗体(下文,也称为“抗-单链IV型胶原多肽抗体”,“NK46141”等)包括下列第一至第三实施方式。
根据第一实施方式的单克隆抗体是特异性结合单链IV型胶原多肽的抗体,该抗体由抗NK-抗原单克隆抗体#141的杂交瘤系产生(获取号:FERMBP-11300)。抗NK-抗原单克隆抗体#141的杂交瘤系由高级工业科学与技术国家研究所的国际专利生物保管(InternationalPatentOrganismDepositary,NationalInstituteofAdvancedIndustrialScienceandTechnology)进行国际保藏(接收日期:2010年10月5日)。
根据第二实施方式的单克隆抗体是如此单克隆抗体,其包含H链,其包含选自由SEQIDNOs:5至7表示的氨基酸序列的至少一条氨基酸序列,和L链,其包含选自由SEQIDNOs:8至10表示的氨基酸序列的至少一条氨基酸序列;或如此单克隆抗体,其包含H链,其包含选自由SEQIDNOs:11至13表示的氨基酸序列的至少一条氨基酸序列,和L链,其包含选自由SEQIDNOs:14至16表示的氨基酸序列的至少一条氨基酸序列。
根据第三实施方式的单克隆抗体是识别包含由GIGIPGLRG(SEQIDNO:41)表示的氨基酸序列的表位的单克隆抗体。
第一至第三实施方式的所有单克隆抗体特异性结合单链IV型胶原多肽。根据第一至第三实施方式的单克隆抗体可彼此相同或不同,只要这些单克隆抗体具有上述其各自特征。
在本发明中,“单链IV型胶原多肽”指从细胞中以单链形式的IV型胶原基因产物分泌的蛋白质。典型地,“IV型胶原”指具有由通过分子间二硫键交联的三个IV型胶原基因产物组成的三螺旋结构的蛋白质。相对照,“单链IV型胶原多肽”没有这种分子间二硫键。
单链IV型胶原多肽(分子量:约180kDa)的化学结构不同于通过IV型胶原的还原获得的单体(分子量:约500kDa)或由于其变性得到的多肽的化学结构。单链IV型胶原多肽比IV型胶原具有更低比例的羟基化脯氨酸残基或羟基化赖氨酸残基。不像IV型胶原,单链IV型胶原多肽具有被二孢蘑菇凝集素(ABA)识别的的糖链Galβ1-3GalNAc。单链IV型胶原多肽也甚至包括其遗传多态形式、基因变体、剪接变体和翻译后修饰变体。
产生单链IV型胶原多肽的细胞可以是天然存在的细胞或可以是包含编码单链IV型胶原多肽的基因的重组细胞。不以任何方式限制细胞,只要这些细胞产生单链IV型胶原多肽。重组细胞可通过本领域已知的方法获得。
在本发明中,“特异性结合单链IV型胶原多肽的抗体”(抗-单链IV型胶原多肽抗体)不被其来源、类型、形状等限制,只要该抗体特异性识别单链IV型胶原多肽而不识别IV型胶原。抗体不限于单克隆抗体。甚至多克隆抗体也包括在本发明的范围内。
多克隆抗体可通过本领域已知的方法从用单链IV型胶原多肽致敏的动物的血清免疫球蛋白部分获得。就此而言,被致敏的动物不被其物种所限制,只要该动物产生多克隆抗体。
<第一实施方式>
根据第一实施方式的抗-单链IV型胶原多肽抗体可以是由抗NK-抗原单克隆抗体#141的杂交瘤系(获取号:FERMBP-11300)产生的抗-单链IV型胶原多肽抗体本身。另外,例如,包含抗-单链IV型胶原多肽抗体部分结构的嵌合抗体、人源化抗体、人抗体或小鼠抗体也包括在本发明的范围内。在这些抗体中,人源化抗体或人抗体是尤其优选的。
不具体限制部分结构,只要该部分结构是特异性识别单链IV型胶原多肽的抗-单链IV型胶原多肽抗体的一部分。可根据目的适当选择部分结构。其例子包括包含结合抗原(单链IV型胶原多肽)的Fab、F(ab’)2、可变区(V区)、互补决定区(CDR)和单链抗体(scFv)的部分结构。
“嵌合抗体”意思是包含源自两种或更多种不同抗体的区域的抗体。在一种实施方式中,嵌合抗体包含源自抗-单链IV型胶原多肽抗体的V区的区域。在另一种实施方式中,嵌合抗体包含源自多个抗-单链IV型胶原多肽抗体的V区。
“人抗体”指具有源自人免疫球蛋白序列的V区的抗体。制备人抗体的技术也是本领域已知的,并且已经建立了基于基因工程方法的制备方法。
“人源化抗体”指通过移植非人哺乳动物例如小鼠的抗体的一个或多个CDR到人抗体的CDR而制备的抗体。其一般基因重组方法也是已知的(见EP专利申请公开号EP125023和国际公开号WO96/02576)。
具体而言,已知的方法包括:设计编码与人抗体框架区(FR)连接的小鼠抗体CDR的DNA序列;通过PCR使用制备具有与CDR和FR二者的末端区域都重叠的部分的数种寡核苷酸引物合成DNA序列;和使用合成的DNA序列产生人源化抗体(见国际公开号WO98/13388中描述的方法)。
经CDR连接的人抗体FR选自允许形成对抗原具有高亲和力的抗体的抗原-结合位点的那些。如果必要,抗体可变区中的FR的氨基酸可被取代,从而可形成对抗原具有高亲和力的抗体的抗原-结合位点。
CDR意思是在重链和轻链多肽的可变区中都出现的非连续抗原-结合位点。这些具体的区域在本领域是已知的并且已经被下列所描述:Kabat等(J.Biol.Chem.,252:6609-6616(1977)),Kabat等(UnitedStatesDepartmentofHealthandHumanServices(HHS),“Sequencesofproteinsofimmunologicalinterest”(1991)),Chothia等(J.Mol.Biol.,196:901-917(1987)),和MacCallum等(J.Mol.Biol.,262:732-745(1996))。
而且,这些区域也可从一些数据库中获得,比如IMGT/LIGM-DB数据库[Giudicelli等,2006,NucleicAcidsResearch34(数据库专刊):D781-D784;和Lefranc等,1995,LIGM-DB/IMGT:AnIntegratedDatabaseofIgandTcR,PartoftheImmunogeneticsDatabase.AnnualoftheNewYorkAcademyofScience764(1),47-47doi;10.1111/j.1749-6632.1995.tb55805.x(http://www.imgt.org/IMGTlect/)中描述],IMGTRepertoire数据库(http://www.imgt.org/IMGTrepertoire/),IMGT/GENE-DB数据库[Giudicelli等,2005,NucleicAcidsRes.,2005Jan1;33(数据库专刊):D256-61(http://www.imgt.org/IMGT_GENE-DB/GENElect)中描述],和Kabat数据库(http://www.kabatdatabase.com)。抗-单链IV型胶原多肽抗体中包含的CDR可通过与这些数据库中登记的CDR序列信息比较进行分离。
根据第一实施方式的抗-单链IV型胶原多肽抗体优选地包含H链,其包含选自由SEQIDNOs:5至7和11至13表示的氨基酸序列的至少一个CDR,和L链,其包含选自由SEQIDNOs:8至10和14至16表示的氨基酸序列的至少一个CDR,更优选地如下H链和L链的组合,所述H链包含选自由SEQIDNOs:5至7表示的氨基酸序列的至少一个CDR,和所述L链包含选自由SEQIDNOs:8至10表示的氨基酸序列的至少一个CDR,或如下H链和L链的组合,所述H链包含选自由SEQIDNOs:11至13表示的氨基酸序列的至少一个CDR,和所述L链包含选自由SEQIDNOs:14至16表示的氨基酸序列的至少一个CDR。
至少任意的根据第一实施方式的抗-单链IV型胶原多肽抗体中由SEQIDNOs:5至16表示的CDR氨基酸序列可以是通过缺失、取代、插入或增加一个或数个氨基酸从其衍生的氨基酸序列。
而且,根据第一实施方式的抗-单链IV型胶原多肽抗体优选地是识别包含由GIGIPGLRG(SEQIDNO:41)表示的氨基酸序列的表位的抗体。在该表位中,由SEQIDNO:41表示的氨基酸序列可以是通过缺失、取代、插入或增加一个或数个氨基酸从其衍生的氨基酸序列。
除了根据第一实施方式的抗-单链IV型胶原多肽抗体本身,例如,抗-单链IV型胶原多肽抗体的部分结构也包括在本发明的范围内。
不具体限制部分结构,只要该部分结构是特异性识别单链IV型胶原多肽的抗-单链IV型胶原多肽抗体的一部分。可根据目的适当选择部分结构。其例子包括包含结合抗原(单链IV型胶原多肽)的Fab、F(ab’)2、V区、互补决定区(CDR)和单链抗体(scFv)的部分结构。
<第二实施方式>
不具体限制根据第二实施方式的抗-单链IV型胶原多肽抗体,只要其是如此包含H链和L链的单克隆抗体,所述H链包含选自由SEQIDNOs:5至7表示的氨基酸序列的至少一条氨基酸序列,所述L链包含选自由SEQIDNOs:8至10表示的氨基酸序列的至少一条氨基酸序列;或如此包含H链和L链的单克隆抗体,所述H链包含选自由SEQIDNOs:11至13表示的氨基酸序列的至少一条氨基酸序列,所述L链包含选自由SEQIDNOs:14至16表示的氨基酸序列的至少一条氨基酸序列。可根据目的适当地选择根据第二实施方式的抗-单链IV型胶原多肽抗体。
根据第二实施方式的抗-单链IV型胶原多肽抗体也包括,例如,包含在本发明范围内的H链和L链的嵌合抗体、人源化抗体、人抗体和小鼠抗体。在这些抗体中,人源化抗体或人抗体是尤其优选的。
根据第二实施方式的抗-单链IV型胶原多肽抗体中由SEQIDNOs:5至16表示的至少任何氨基酸序列可以是通过缺失、取代、插入或增加一个或数个氨基酸从其衍生的氨基酸序列。
除了根据第二实施方式的抗-单链IV型胶原多肽抗体本身,例如,抗-单链IV型胶原多肽抗体的部分结构也包括在本发明的范围内。
不具体限制部分结构,只要部分结构是特异性识别单链IV型胶原多肽的抗-单链IV型胶原多肽抗体的一部分。可根据目的适当地选择部分结构。其例子包括包含结合抗原(单链IV型胶原多肽)的Fab、F(ab’)2、V区、CDR和单链抗体(scFv)的部分结构。
<第三实施方式>
不具体限制根据第三实施方式的抗-单链IV型胶原多肽抗体,只要其识别包含由GIGIPGLRG(SEQIDNO:41)表示的氨基酸序列的表位。可根据目的适当地选择根据第三实施方式的抗-单链IV型胶原多肽抗体。
根据第三实施方式的抗-单链IV型胶原多肽抗体也包括,例如,在本发明范围内的识别由SEQIDNO:41表示的氨基酸序列的嵌合抗体、人源化抗体、人抗体和小鼠抗体。在这些抗体中,人源化抗体或人抗体是尤其优选的。
在表位中,由SEQIDNO:41表示的氨基酸序列可以是通过缺失、取代、插入或增加一个或数个氨基酸从其衍生的氨基酸序列。
除了根据第三实施方式的抗-单链IV型胶原多肽抗体本身,例如,抗-单链IV型胶原多肽抗体的部分结构也包括在本发明的范围内。
不具体限制部分结构,只要该部分结构是特异性识别单链IV型胶原多肽的抗-单链IV型胶原多肽抗体的一部分。可根据目的适当地选择部分结构。其例子包括包含结合抗原(单链IV型胶原多肽)的部分结构的Fab、F(ab’)2、V区、CDR和单链抗体(scFv)。
在本发明中,“表位”指蛋白质(抗原)中结合抗体的具体位点。该具体的位点既包括线性的表位又包括非线性的表位。
本领域已知的分子生物学、细胞工程或生物化学方法可用作鉴定表位的方法。
下文,作为一个例子显示用于鉴定表位的方法。
从产生单链IV型胶原多肽的人细胞系制备总RNA,并且使用总RNA克隆全长IV型胶原α1基因(COL4A1,NCBI基因ID:1282)以制备COL4A1表达载体(野生型)。接下来,也用克隆的COL4A1cDNA作为模板制备各种变体COL4A1表达载体(变体)。如此制备的野生型或每个变体COL4A1表达载体被引入至适当的培养细胞系(例如,人细胞系)以瞬时过表达野生型或变体单链IV型胶原多肽。如此造成瞬时表达野生型或变体单链IV型胶原多肽的培养细胞的上清液或提取物可与作为一抗的抗-单链IV型胶原多肽抗体一起用于蛋白质印迹,以鉴定抗-单链IV型胶原多肽抗体识别的单链IV型胶原多肽中的表位。
除了该方法,具有IV型胶原多肽部分序列的肽被化学合成,并且抗-单链IV型胶原多肽抗体识别的单链IV型胶原多肽中的表位可通过点渍法、ELISA等使用该肽进行鉴定。
可选地,抗-单链IV型胶原多肽抗体识别的单链IV型胶原多肽中的表位可通过这两种类型方法的组合鉴定。
<<制备抗-单链IV型胶原多肽抗体的方法>>
不具体限制制备第一至第三实施方式的抗-单链IV型胶原多肽抗体的方法,并且可根据目的适当地选自本领域已知的方法。其例子包括免疫法、噬菌体展示法和核糖体展示法。在这些方法中,免疫法是优选的。
接下来,将作为一个例子显示通过免疫法制备抗-单链IV型胶原多肽抗体。
不具体限制在免疫法中使用的抗原并且可根据目的适当地选择。其例子包括化学合成的抗原、重组抗原和从生物样品中纯化的抗原。这些抗原可单独使用或其两个或更多个结合使用。在这些抗原中,具有单链IV型胶原多肽的全长氨基酸序列的蛋白质优选地用作抗原。在抗-单链IV型胶原多肽抗体的制备中,由于抗原的低分子量,可能未预期有效的免疫诱导的作用。在这种情况下,优选地使用与载体蛋白缀合的抗原。
不具体限制载体蛋白并且可根据目的适当地选择。其例子包括匙孔光血蓝蛋白(keyholelighthemocyanin,KLM)、牛血清白蛋白(BSA)和卵白蛋白(OVA)。这些载体蛋白可单独使用或其两个或更多个结合使用。
不具体限制缀合载体蛋白与抗原的方法,并且可根据目的适当地选择。其例子包括碳二亚胺法、戊二醛法、重氮缩合法和马来酰亚胺基苯甲酸基-琥珀酰亚胺(MBS)法。
可选地,抗原可表达为单链IV型胶原多肽(或其部分)与GST、β半乳糖苷酶、麦芽糖结合蛋白、组氨酸标签等的融合蛋白,并且用作抗原。这种融合蛋白可方便地通过广泛使用的方法纯化。
通过免疫法制备抗-单链IV型胶原多肽抗体的方法的具体例子包括涉及下述的方法:用抗原致敏期望的动物;如果必要,通过致敏重复免疫;在其抗体效价充分升高之后从动物收集血液;和通过离心处理等获得血清。在其抗体效价充分升高之后,从免疫的动物中提取产生抗体的细胞。
接下来,获得的产生抗体的细胞与骨髓瘤细胞系融合以获得杂交瘤。随后,这些杂交瘤制备成单克隆。接着,挑选产生对单链IV型胶原多肽具有高亲和力的抗体的克隆。纯化所挑选的克隆的培养液以获得感兴趣的抗体。
可选地,杂交瘤可生长至期望的数量或更多,接着腹膜内移植至动物(例如,小鼠),并且在腹水中生长,其可接着被纯化以获得感兴趣的抗体。
培养液的纯化或腹水的纯化可优选地通过使用G蛋白、A蛋白等的亲和层析进行。可选地,这种亲和层析可用固定在固定相上的抗原进行。另外,也可使用比如离子交换层析、凝胶过滤层析、硫酸铵分级分离和离心的方法。这些方法可单独使用或任何组合使用。
特异性识别单链IV型胶原多肽的抗体的例子包括本发明的抗-单链IV型胶原多肽抗体以及本领域已知的抗体,比如JK132(见NPL1和NPL7)。抗-单链IV型胶原多肽抗体比本领域已知的抗体更有优势,因为抗-单链IV型胶原多肽抗体具有针对抗原(单链IV型胶原多肽)的高亲和力。
(杂交瘤系)
本发明的杂交瘤系指定为抗NK-抗原单克隆抗体#141系并且国际上以获取号:FERMBP-11300(接收日期:2010年10月5日)由高级工业科学与技术国家研究所的国际专利生物保管进行保藏(TsukubaCentral6,1-1-1Higashi,Tsukuba,Ibaraki,305-8566,Japan)。
杂交瘤系可产生抗-单链IV型胶原多肽抗体。
(药物)
本发明的药物包含至少本发明的抗-单链IV型胶原多肽抗体和/或其部分结构,并且如果必要,进一步包括另外的成分。在本发明中,部分结构优选地包含单链IV型胶原多肽的CDR或表位识别位点,即,抗-单链IV型胶原多肽抗体的抗原-结合位点。
本发明的药物优选地用作用于本发明下述的肿瘤的诊断、预防或治疗的药物(例如,抗癌剂)。
药物也包括包含抗-单链IV型胶原多肽抗体和/或其部分结构的药物组合物。除了抗-单链IV型胶原多肽抗体之外,药物组合物还进一步包括药用载体。
不具体限制药用载体,只要该载体是任何适合施用至人或非人哺乳动物的生理学可接受的溶剂、分散介质、包衣试剂、抗菌剂、抗真菌剂、张度剂、延迟吸收剂等。
药用载体的具体的例子包括单独或组合使用的水、盐水、磷酸盐缓冲盐水、葡萄糖、丙三醇和乙醇。在许多情况下,组合物优选地包含用作张度剂的物质,例如,糖类、多元醇(例如,甘露醇或山梨糖醇)或氯化钠。药用载体可进一步包含痕量的辅助物质比如湿润剂或乳化剂、防腐剂或缓冲剂。这些物质对于增强抗-单链IV型胶原多肽抗体或抗-单链IV型胶原多肽抗体的部分结构的存储稳定性和有效性是有优势的。
<剂型>
不具体限制药物的剂型。药物为例如,液体、半固体和固体剂型的任意一种。其具体的例子包括溶液(例如,注射液和不溶溶液)、分散体、悬浮液、片剂、丸剂、粉末、脂质体和栓剂。
根据施用途径或指示适当选择剂型。可注射剂型是优选的。优选的可注射剂型组合物的例子包括注射液或不溶溶液剂型,并且具体包括适合肌肉注射,优选地皮下注射的那些。
另外,药物可为任何的溶液、微乳液、分散体和脂质体形式,和适合施用的其他形式,而没有限制,只要药物是无菌的并且在生产和储存条件下是稳定的。抗-单链IV型胶原多肽抗体和/或其部分结构并入必要量的适当溶剂中——如果必要与上面列举的成分的一种或组合一起。随后,混合物可通过过滤灭菌以制备可注射的无菌溶液。
一般而言,抗-单链IV型胶原多肽抗体和/或其部分结构并入包含基本分散体介质和上面列举的必要的另外成分(一种或多种)的无菌介质以制备分散体。在用于制备可注射无菌溶液的无菌粉末情况中,优选的制备方法包括通过真空干燥和冷冻干燥从通过过滤已经灭菌的溶液获得活性成分与任意期望的另外成分的粉末。例如,可通过使用包衣试剂比如卵磷脂保持分散体必要的颗粒尺寸,同时可通过使用表面活性剂保持溶液适当的流动性。延迟吸收剂比如单硬脂酸酯和明胶可包含在组合物中,并且从而实现可注射组合物的持续吸收。
<施用>
药物的施用途径优选地为肠胃外途径,其包括静脉内、皮下、腹膜内和肌内途径。皮下施用是优选的。除了注射,可使用植入和透皮贴剂,或可使用保护抗-单链IV型胶原多肽抗体和/或其部分结构免于快速释放的载体制备活性化合物,比如包括微胶囊递送系统的控释制品(见SustainedandControlledReleaseDrugDeliverySystems,J.R.Robinsoned.,MarcelDekker,Inc.,NewYork,1978)。可使用生物可降解的或生物相容的聚合物,比如乙烯乙酸乙烯酯、聚乙二醇(PEG)、聚酸酐、聚乙醇酸、胶原、多正酯或聚乳酸。
可选地,药物可口服施用。在这种情况下,优选地,抗-单链IV型胶原多肽抗体和/或其部分结构包衣有防止化合物失活的材料,或抗-单链IV型胶原多肽抗体和/或其部分结构和防止失活的材料同时施用。
例如,药物可封装在硬的或软的明胶胶囊中和/或压缩以制备片剂。可选地,药物可与惰性稀释剂或可吸收的和可食用的载体一起口服施用。另外,药物可直接并入试验对象的膳食中。就治疗的口服施用而言,抗-单链IV型胶原多肽抗体和/或其部分结构可与赋形剂混合,并且接着用在用于摄取的剂型中,比如片剂、舌下片剂、含片、胶囊、酏剂、悬浮液、糖浆剂或扁囊剂。
不具体限制药物中抗-单链IV型胶原多肽抗体和/或其部分结构的含量,并且根据治疗或预防目的适当调整。
根据,例如,个体的疾病状态、年龄、性别和体重适当调整其实际剂量。在本发明中,用于预防的施用指预防手术后复发或在疾病初始阶段抑制恶化的施用。
不具体限制施用的单个剂量,并且可根据目的适当地选择。单个剂量通常为0.1mg/kg至250mg/kg,更优选地0.5mg/kg至50mg/kg,尤其优选地约5mg/kg。根据治疗的症状可调整每次施用的剂量。可选地,考虑患者的症状、一般状况等可运用落在该范围外的剂量。
药物的施用安排可为任何的单个剂量施用和连续施用。而且,可设定施用给定时间段之后的休药期,并且接着,可恢复施用。
药物可与一种或多种另外的药物组合使用。考虑症状或副作用,适当选择与其组合的药物。在本发明中,这种组合使用也包括本发明的药物与另外的药物同时或几乎同时施用,以及施用本发明的药物连同另外药物的制剂。
根据症状适当选择可与本发明的药物组合的药物。其例子包括:具有抗肿瘤活性的药物,例如,含铂药物比如顺铂、卡铂和奥沙利铂;烷化剂,比如环磷酰胺和美法仑;代谢拮抗物,比如吉西他滨、TS-1,5-氟尿嘧啶和甲氨蝶呤;抗肿瘤抗生素,比如博来霉素、道诺霉素和阿霉素;生物碱,比如伊立替康、紫杉醇、依托泊苷和长春新碱;抗癌剂,比如激素;分子靶向药物,比如厄洛替尼、吉非替尼和索拉非尼;和抗体药物,比如曲妥珠单抗和贝伐单抗。
用作用于预防的药物或药物组合物的剂型、施用途径、剂量和施用安排与用于治疗的相同。
本发明的药物也包括用于治疗的试剂盒。用于治疗的试剂盒包含本发明的药物或药物组合物和与其组合使用的一种或多种另外的药物。
不具体限制本发明诊断、预防或治疗的标靶。本发明的诊断、预防或治疗可应用于每种实体癌症,比如肺癌、胃癌、肝癌、结肠癌、肾癌、胰腺癌、胆囊癌和卵巢癌,并且应用于造血器官肿瘤。本发明可诊断、预防或治疗确认具有表达的单链IV型胶原多肽的患者。为了进行本发明的诊断、预防或治疗,可使用单独的本发明的抗-单链IV型胶原多肽抗体和/或其部分结构、本发明的药物和本发明的药物组合物的任意一种。在使用本发明的药物或药物组合物作为用于预防的药物或药物组合物的情况下,药物或药物组合物有效地用作在实体癌手术之后意图预防转移并且预防复发的转移预防药剂。
(肿瘤的诊断或预防药物或抗癌剂)
本发明的肿瘤诊断或预防药剂、或抗癌症剂包含至少抗-单链IV型胶原多肽抗体。肿瘤的诊断药物可以以诊断试剂盒的形式提供。试剂盒也包括在本发明中。
肿瘤诊断试剂盒至少包含抗-单链IV型胶原多肽抗体,并且如果必要,可另外包含标记材料或固相试剂,抗-单链IV型胶原多肽抗体或其标记的产品固定在其上。
抗-单链IV型胶原多肽抗体的标记产品意思是用酶、放射性同位素、荧光化合物或化学发光化合物标记的抗-单链IV型胶原多肽抗体。在酶标记产品情况下,除了上述组分,试剂盒可进一步包含其他用于检测的试剂,例如,酶底物(发光底物等)、酶底物溶解溶液、酶反应终止液或样品稀释剂。
可使用抗-单链IV型胶原多肽抗体如下进行肿瘤检测:通过抗原-抗体反应,使样品(比如从受试对象收集的生物样品,例如,血液)与抗-单链IV型胶原多肽抗体或其结构结合;和基于结合的抗体的量测量样品中感兴趣的抗原(单链IV型胶原多肽)的量。
可根据本领域已知的免疫实验检测抗原的量。例如,可使用免疫沉淀、免疫凝集、标记的免疫测定、免疫比浊、蛋白质印迹和流式细胞术。
在标记的免疫测定中,抗-单链IV型胶原多肽抗体的信号通过使用标记的抗体直接检测的标记的量指示,或可通过使用具有已知浓度或已知抗体效价的抗体标准溶液的相对值指示。具体而言,使用仪表测定标准溶液和样品,并且样品中抗-单链IV型胶原多肽抗体的信号可由相对于标准溶液值的值指示。标记的免疫测定的例子包括ELISA、EIA、RIA、荧光免疫测定(FIA)和发光免疫测定。这些方法中,就方便性和高灵敏度而言,ELISA是优选的。
基于使用抗-单链IV型胶原多肽抗体的肿瘤检测,可用通过检测方法获得的检测结果作为指标评估或诊断肿瘤的状态。例如,假设检测结果超过预定参考值的样品是肿瘤-阳性的,而检测结果等于或低于预定参考值的样品是肿瘤-阴性的,阳性的样品可确定为具有已经被任何肿瘤影响的可能性并且评估其肿瘤的状态。
肿瘤的状态意思是发育肿瘤的存在或不存在或其进展程度。其例子包括发育肿瘤的存在或不存在、其进展程度、其恶性程度、转移的存在或不存在和复发的存在或不存在。为了评估,可选择肿瘤的这些状态之一,或可选择其两个或更多个的合适的组合。
为了评估肿瘤的存在或不存在,基于检测结果,用预定的参考值作为阈值确认发育肿瘤的存在或不存在。肿瘤的恶性程度用作表示癌症已经进展的程度的指标。可通过基于检测结果的阶段分类评估或可通过分类成早期癌症和晚期癌症评估恶性程度。例如,用检测结果作为指标,可评估肿瘤为早期癌症或晚期癌症。用检测结果作为指标,基于赘生物是否出现在远离原发肿瘤的位置的位点处,评估肿瘤的转移。基于在间歇或缓解之后获得的检测结果是否再次超过预定的参考值,评估肿瘤的复发。
实施例
下文,将参考实施例更具体地描述本发明。但是,为了示意性目的提供这些实施例,并且这些实施例绝不限制本发明。除非另外说明,根据制造商提供的说明手册使用实施例中描述的商业上可获得的试剂。
(实施例1)
人肝癌细胞系HLF(从RIKENCELLBANK获得)和人肾癌细胞系UO31(由NationalCancerInstitute制造)分别在37℃和5%CO2条件下使用补充有按体积计10%胎牛血清(由TissueCultureBiologicalsInc.制造)的RPMI1640培养基(由MediatechInc.制造)进行培养。当细胞汇合时,用不含血清的RPMI1640培养基替换该培养基,随后培养48小时。接着,回收培养物上清液。向该培养物上清液以1/4(体积比)的量添加4×电泳样品的缓冲液[8(质量/体积)%十二烷基硫酸钠(SDS)、40(体积)%丙三醇、20(体积)%2-巯基乙醇、0.008(质量/体积)%溴酚蓝、0.25MTris-HCl,pH6.8(在下面的实施例中,使用的电泳样品的缓冲液具有与该组合物相同的组成)],并且混合物在90℃下加热5分钟以制备样品[还原处理(+)]。同样,进行上面相同的操作以制备样品,除了4×电泳样品的缓冲液不含2-巯基乙醇[还原处理(-)]。
这些样品使用XVPANTERAMP系统(由D.R.C.Co.,Ltd.制造)进行4.5(质量/体积)%SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳并且转移至聚偏氟乙烯(PVDF)膜。为每个样品制备两个这样的PVDF膜,每个用5(质量/体积)%的脱脂乳封闭,并且接着与JK132(抗-人IV型胶原α1多肽小鼠单克隆抗体,由YasutadaImamura教授,AnimalCellTechnologyLaboratory,DepartmentofAppliedChemistry,FacultyofEngineering,KogakuinUniversity提供;在下面的描述中,其对该抗体适用)或Ab6586(抗-IV型胶原兔多克隆抗体,由Abcamplc.制造;在下面的描述中,其对该抗体适用)的抗体溶液一起在室温下温育1小时。用TBS-Tween20(20mMTris-HCl(pH7.4),150mMNaCl,0.1(体积)%Tween20)冲洗三次10分钟之后,膜与作为二抗的HRP标记的抗-小鼠IgG抗体(由GEHealthcareJapanCorp.制造)的抗体溶液一起在室温下温育1小时。用TBS-Tween20冲洗三次10分钟之后,膜与ECLplus(由GEHealthcareJapanCorp.制造)反应以发射化学发光,其接着暴露于X-射线胶片。
结果显示在图1中。抗体Ab6586和JK132检测基本上相同的具有流动性不同的一条条带或两条条带的条带图案。从未还原的样品[还原处理(-)],检测到两种蛋白:(1)SDS-处理的IV型胶原(图1中由“三链COL4”表示),其具有小的流动性并且保持其分子间二硫键,和(2)约180-kD单链IV型胶原多肽(图1中由“单链COL4”表示),其具有大的流动性并且初始缺少分子间二硫键。从还原的样品[还原处理(+)],仅仅检测出具有与缺乏分子间二硫键的单链IV型胶原多肽(2)相同流动性的条带。还原样品[还原处理(+)]的条带包括:源自切割保持其分子间二硫键的SDS-处理的IV型胶原(1)中分子间二硫键的单链;和缺乏分子间二硫键的单链IV型胶原多肽(2)。因此,这些癌细胞系显示表达没有分子间二硫键的单链IV型胶原多肽。
(实施例2)
将裸大鼠(F344/N-rnu/rnu,7周龄,由CLEAJapan,Inc.制造)中皮下移植的人肺癌Lu65A(获得自JCRB:JapaneseCollectionofResearchBioresources)肿瘤块切割成约3平方毫米的块,并且使用套管针皮下移植至裸大鼠的背部。当肿瘤体积达到约200mm3或更大时,收集癌症组织。通过添加4倍于湿重的量的组织提取缓冲液(pH7.4,0.1MNaCl/PBS,5mMEDTA,蛋白酶抑制剂混合物(由F.Hoffmann-LaRocheLtd.制造),1mMPMSF)使组织均质化。接着,匀浆以12,000rpm离心5分钟,并且回收离心上清液。向该上清液以1/4的量(体积比)添加4×电泳样品的缓冲液,并且混合物在90℃下加热5分钟以制备样品[还原处理(+)]。而且,进行上面相同的操作以制备样品,除了4×电泳样品的缓冲液不含2-巯基乙醇[还原处理(-)]。
这些样品使用XVPANTERAMPSystem(由D.R.C.Co.,Ltd.制造)进行4.5(质量/体积)%SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳并且转移至PVDF膜。为每个样品制备两个这样的PVDF膜,每个用5(质量/体积)%的脱脂乳封闭,并且接着与JK132或Ab6586的抗体溶液在室温下温育1小时。用TBS-Tween20冲洗三次10分钟之后,膜与作为二抗的HRP-标记的抗-小鼠IgG抗体或抗-兔IgG抗体(由GEHealthcareJapanCorp.制造)一起在室温下温育1小时。用TBS-Tween20冲洗三次10分钟之后,膜与ECL反应以发射化学发光,其接着暴露于X-射线胶片。
结果显示在图2中。抗体JK132和Ab6586从未还原的样品[还原处理(-)]中检测到没有分子间二硫键的单链IV型胶原多肽(图2中由“单链COL4”表示)的条带。因此,人肺癌Lu65A的肿瘤组织显示表达单链IV型胶原多肽。因为JK132抗体与人单链IV型胶原α1多肽反应,但是不与小鼠单链IV型胶原多肽反应,所以人肺癌Lu65A的肿瘤组织(裸大鼠中皮下移植的人肿瘤组织)显示表达衍生自Lu65A细胞的人单链IV型胶原多肽。
(实施例3)
以与实施例1中相同的方式确认每个人癌细胞系中单链IV型胶原多肽的表达,除了实施例1的人肝癌细胞系HLF和人肾癌细胞系UO31改变为人癌细胞系[Lu65A(获得自JCRB:JapaneseCollectionofResearchBioresources)、NCI-H460(由NationalCellInstitute制造)、NCI-H226(由NationalCellInstitute制造)、MDA-MB-157(获得自ATCC:AmericanTypeCultureCollection)、A498(获得自ATCC)、Panc-1(获得自CellResourceCenterforBiomedicalResearch,InstituteofDevelopment,AgingandCancer,TohokuUniversity)、OVCAR3(获得自CellResourceCenterforBiomedicalResearch,InstituteofDevelopment,AgingandCancer,TohokuUniversity)和HT1080(由DainipponSumitomoPharmaCo.,Ltd.制造)]。
同样,以与实施例2中相同的方式确认裸大鼠中皮下移植的人肿瘤组织中单链IV型胶原多肽的表达,除了实施例2的人肺癌Lu65A改变为HLF(获得自RIKENCELLBANK)。
另外,获得自肺癌患者的人临床肺癌组织(由Asterandplc.制造,样品IDs:110443A1、112523A1、107811A1、111540B1、112294A1和111541A1)或人临床正常肺组织(由Asterandplc.制造,样品IDs:98859B2、112279B1和112301B1)通过添加4倍于湿重的量的组织提取缓冲液(pH7.4,0.1MNaCl/PBS,5mMEDTA,蛋白酶抑制剂混合物(由F.Hoffmann-LaRocheLtd.制造),1mMPMSF)被分别均质化。接着,匀浆以12,000rpm离心5分钟,并且回收离心上清液。向该上清液添加与上相同的4×电泳样品的缓冲液,除了以1/4(体积比)的量添加2-巯基乙醇,并且混合物在90℃下加热5分钟以制备样品[还原处理(-)]。
对于获得自肺癌患者的人临床肺癌组织和人临床正常肺组织中单链IV型胶原多肽的表达,使用抗-β-肌动蛋白抗体(由Sigma-AldrichCorp.制造),以便检查作为内标的β-肌动蛋白的量。
注意,由专家病理学上诊断作为人临床组织的癌症组织和正常肺组织。
以与实施例1相同的方式确认表达单链IV型胶原多肽的人癌细胞系(体外)和以与实施例2相同的方式确认表达单链IV型胶原多肽的人肿瘤组织(体内;裸大鼠中皮下移植的)的结果与实施例1和2的结果一起显示在表1中。同样地,人临床肺癌组织和人临床正常肺组织的结果显示在图3中。
如表1中所显示,在裸大鼠中皮下移植的这10种类型的人癌细胞系和2种类型的人肿瘤组织中确认了单链IV型胶原多肽的表达。如图3中所显示,在所有的人临床肺癌组织的6个病例中,确认了高的单链IV型胶原多肽表达。相对照,单链IV型胶原多肽的表达仅仅略微在获得自肺癌患者的人临床正常肺组织中观察到。
表1
上述结果表明单链IV型胶原多肽在裸大鼠中皮下移植的人癌细胞系和人肿瘤组织中表达,其在表1中显示。同样地,图3的结果表明单链IV型胶原多肽在肿瘤组织中特异性高度表达。
(实施例4)
<单链IV型胶原α1多肽的制备>
-细胞和细胞培养-
人肝癌细胞系HLF(RIKENCELLBANK)在37℃和5%CO2条件下使用补充有按体积计10%胎牛血清(由TissueCultureBiologicalsInc.制造)的RPMI1640培养基(由MediatechInc.制造)进行培养,并且然后保持。
-单链IV型胶原α1多肽的制备-
参考Takahashi,S.等的方法(Takahashi,S.等,“ConnectiveTissue”(1999)vol.31;pp.161-168)从在不含血清的RPMI1640培养基(由MediatechInc.制造)中培养7天的人肝癌HLF细胞培养基中免疫亲和纯化单链IV型胶原α1多肽。
简言之,首先,将4.2mg的JK132抗体固定在HiTrapNHS活化的HP柱(由GEHealthcareJapanCorp.制造)上,以制备JK132亲和柱。用0.2M甘氨酸-HCl(pH2.5)冲洗JK132亲和柱。
将450ml的培养物上清液施加至1ml的JK132亲和柱。在用磷酸盐缓冲盐水冲洗之后,用0.2M甘氨酸-HCl(pH2.5)收集的馏分通过SDS-PAGE和蛋白质印迹分析。透析获得的洗脱组分,接着冷冻干燥,并且在-80℃下保存。纯化的单链IV型胶原α1多肽的4.5(质量/体积)%的聚丙烯酰胺凝胶电泳和随后的银染色(由DaiichiPureChemicalsCo.,Ltd.制造)的结果显示在图4中。从Bio-RadLaboratories,Inc.可获得的PrecisionPlusProteinStandardDualColor(双色标准品)用作分子量标记(MW)。
(实施例5)
<单克隆抗体(NK46141)的筛选>
-免疫-
每只雌性Balb/c小鼠(JapanSLC,Inc.)通过使用实施例4中制备的单链IV型胶原α1多肽(抗原)腹膜内注射进行免疫。对于初始免疫,每只小鼠施用弗氏完全佐剂(由DifcoLaboratories,Inc.制造)中100μg或20μg的单链IV型胶原α1多肽。对于随后的接种,每只小鼠施用RIBI佐剂(由CorixaCorp.制造)中20μg至50μg的单链IV型胶原α1多肽。以2周至3周的间隔进行免疫。最后免疫之后7天,通过用包含25μg的单链IV型胶原α1多肽的磷酸盐缓冲盐水(PBS)的强化来提高动物的抗体效价。
-杂交瘤的制备-
强化之后3天,从具有高抗体效价的免疫动物根据常规方法制备脾细胞。使用聚乙二醇4000(由Sigma-AldrichCorp.制造),将脾细胞与P3.X63-Ag8.653小鼠骨髓瘤细胞(获得自ATCC,#CRL-1580)融合。根据本领域已知的Kohler和Milstein的技术,使用微量滴定板(Nunc;由ThermoFisherScientificInc.制造)在HAT培养基[所述HAT培养基通过使按质量计10%的FBS(HyClone;由ThermoFisherScientificInc.制造)、500μMD(+)-葡萄糖(由WakoPureChemicalIndustries,Ltd.制造)、按质量计2%的青霉素-链霉素(由InvitrogenCorp.制造)、100μM次黄嘌呤钠(由InvitrogenCorp.制造)、0.1μM氨基蝶呤(由InvitrogenCorp.制造)和16μM胸苷(由InvitrogenCorp.制造)悬浮在RPMI1640(由InvitrogenCorp.制造)中制备;在下面的实施例中,HAT培养基在该组合物中具有相同的组成]中选择杂交瘤细胞。
-抗体效价测量-
对于杂交瘤选择,在血清中使用下面显示的ELISA测量免疫动物的抗体效价。首先,微量滴定板(Nunc;由ThermoFisherScientificInc.制造)用单链IV型胶原α1多肽(抗原)包被。随后,血清的连续稀释物添加至用1(质量/体积)%BSA/TBS(20mMTris-HCl,150mMNaCl,pH7.5)-0.05(体积)%Tween20封闭的孔,并且然后温育。使用抗小鼠免疫球蛋白的过氧化物酶缀合的抗体检测与单链IV型胶原α1多肽(抗原)结合的抗体。
-通过ELISA筛选杂交瘤-
在室温下,将单链IV型胶原α1多肽(抗原)(浓度:在50mM碳酸盐缓冲液中1μg/ml)固定在96孔微量滴定板(Nunc;由ThermoFisherScientificInc.制造)上2小时。随后,用TBS/0.05(体积)%Tween20冲洗板。在室温下使用1(质量/体积)%BSA/TBS-0.05(体积)%Tween20封闭板表面上游离的吸附部分30分钟。用TBS/0.05(体积)%Tween20再次冲洗板。将杂交瘤培养物上清液添加至每个孔并且在室温下反应1小时。接着,用TBS/0.05(体积)%Tween20冲洗板。随后,向其添加稀释在1(质量/体积)%BSA/TBS-0.05(体积)%Tween20中的50μL/孔的过氧化物缀合酶抗-小鼠IgG抗体(BETHYLLaboratories,Inc.,#E90-131)。在室温下温育1小时之后,用TBS/0.05(体积)%Tween20冲洗板,并且将100μL/孔的底物溶液(柠檬酸盐缓冲液(pH5),0.05(质量/体积)%邻苯二胺,按体积计0.03%的H2O2)添加至孔。20分钟至30分钟之后,添加2N硫酸使反应终止,并且使用分光光度计在490nm下测量吸光度。
将这样获得的杂交瘤系以抗NK-抗原单克隆抗体#141(下文,也称为“#141系”)由高级工业科学与技术国家研究所的国际专利生物保管国际上保藏(接收日期:2010年10月5日)。
-单克隆抗体的纯化-
将产生抗体的杂交瘤#141系在37℃和5%CO2条件下使用HAT培养基培养以制备培养物上清液。同样地,将产生抗体的杂交瘤#141系腹膜内施用至小鼠,并且7天至10天后收集其腹水,并且将其通过过滤器过滤以除去不溶物质。
根据常规方法,将产生抗体的杂交瘤培养物上清液或小鼠腹水施加至填充G蛋白-Sepharose4B(GEHealthcareJapanCorp.)的柱,以在其上吸附抗体成分。接着,去除非特异性吸附的物质,并且接着回收在酸性条件下释放的单克隆抗体,并且将其用作纯化的抗体。获得的纯化的抗体用100倍(体积比)量的PBS缓冲液透析进行缓冲液置换。本发明人指定该单克隆抗体为“NK46141”。
-单克隆抗体NK46141的分型-
使用夹心ELISA对NK46141分型。抗-小鼠IgG山羊多克隆抗体(由DakoJapanInc.制造)(抗体被固定,用50mM碳酸盐缓冲液稀释1,000倍)以50μl/孔的浓度分散至96孔微量滴定板(Nunc;由ThermoFisherScientificInc.制造)的6个孔,并且在室温下固定2小时。随后,用TBS/0.05(体积)%Tween20冲洗孔。在室温下,使用1(质量/体积)%BSA/TBS-0.05(体积)%Tween20封闭表面上游离的吸附部分30分钟。用TBS/0.05(体积)%Tween20再次冲洗板。
向其添加50μl/孔的产生NK46141的杂交瘤的培养物上清液,并且在室温下反应1小时。接着,用TBS/0.05(体积)%Tween20冲洗孔。用1(质量/体积)%BSA/TBS-0.05(体积)%Tween20稀释1,000倍的每种50μL的6种类型的检测抗体(HRP标记的抗-小鼠IgG1山羊抗体、HRP标记的抗-小鼠IgG2a山羊抗体、HRP标记的抗-小鼠IgG2b山羊抗体、HRP标记的抗-小鼠IgG3山羊抗体、HRP标记的抗-小鼠IgA山羊抗体和HRP标记的抗-小鼠IgGM山羊抗体;所有的都由BETHYLLaboratories,Inc.制造)添加至每个孔(一种类型一个孔)。在室温下温育1小时之后,用TBS/0.05(体积)%Tween20冲洗板,并且100μ/孔的底物溶液(柠檬酸盐缓冲液(pH5.0)、0.05(质量/体积)%邻苯二胺、按体积计0.03%的H2O2)添加至孔。20分钟至30分钟之后,通过添加2N硫酸终止反应,并且使用分光光度计测定490nm处的吸光度。
结果,NK46141的同种型确认为IgG2b。
-免疫沉淀分析-
对于免疫沉淀分析,将0.5μg纯化的单克隆抗体(NK46141)在4℃下与以实施例1中相同的方式培养的500μl表达单链IV型胶原α1多肽的人肝癌细胞系HLF的培养物上清液一起旋转温育30分钟。进行上面相同的操作,除了使用阳性对照JK132代替NK46141。进行上面相同的操作,除了使用同种型对照小鼠IgG2b(FunctionalGrade,由Medical&BiologicalLaboratoriesCo.,Ltd.(MBL),M077-3M2制造)代替NK46141。同样地,进行上面相同的操作,除了使用阴性对照PBS而不包含用于免疫沉淀的一抗。
接下来,向其添加10μl的免疫磁珠M-280绵羊抗-小鼠IgG二抗(免疫磁珠(Dynabead)缀合的山羊抗-小鼠IgG,由VERITASCorp.制造,#DB11201),并且在4℃下旋转温育1小时。同样地,免疫磁珠M-280绵羊抗-小鼠IgG二抗作为阴性对照添加至人肝癌细胞系HLF的培养物上清液,并且以与上述相同的方式温育。
使反应混合物在磁体上静置2分钟,并且抛弃上清液。用500μl的冲洗缓冲液(包含0.05(体积)%Tween20和2mMEDTA的PBS)冲洗免疫磁珠三次。向免疫磁珠添加50μl的不含2-巯基乙醇的1×电泳样品的缓冲液,并且在90℃下加热混合物5分钟,以制备样品。使该样品进行SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳,并且转移至PVDF膜。接着,PVDF膜与Ab6586一起温育,并且以与实施例1中相同的方式进行分析。
结果显示在图5中。在图5中,术语“Sup.”表示免疫沉淀之前人肝癌细胞系HLF的培养物上清液,从其中用Ab6586检测到数条条带。如该图中所显示的,通过该样品与NK46141或JK132的免疫沉淀,仅仅选择性回收单链IV型胶原多肽。该免疫沉淀方法表明NK46141特异性识别单链IV型胶原多肽而不识别IV型胶原。
这样,获得特异性识别单链IV型胶原α1多肽的单克隆抗体NK46141。
(实施例6)
<单克隆抗体NK46141的结合亲和力>
参考Djavadi-OhanianceL.等的方法[Djavadi-OhanianceL.,等,(1996)InAntibodyEngineering(Eds.:McCaffertyJ,等),第4章,77-97页,IRLPress,Oxford.],通过ELISA测定纯化的单克隆抗体NK46141的解离常数。
简言之,预先制备具有单链IV型胶原α1多肽(抗原)固定在其上的免疫板(Immunoplate)(Nunc;由ThermoFisherScientificInc.制造)。同时,具有恒定浓度(0.10μg/ml)的JK132和NK46141每个与不同浓度的抗原一起温育足够的时间,直到达到平衡。将该温育溶液添加至ELISA孔,以测定游离抗体的量。因为抗原-抗体反应遵守质量作用定律,所以测量的值应用于下面公式1。测定下面公式2中的X和Y,并且画图以从斜率(1/Kd)测定解离常数。
(公式1)
x/[总抗体浓度]×1/[游离抗原]=(1-x/[总抗体浓度])×1/Kd
其中X=x/[总抗体浓度]和Y=x/([总抗体浓度]×[游离抗原]
(公式2)
Y=(1-X)×1/Kd
结果显示在表2中。
表2
|
JK132 |
NK46141 |
解离常数(M) |
15.3×10-8 |
3.4×10-8 |
JK132和NK46141的解离常数分别为15.3×10-8M和3.4×10-8M,其表明NK46141对单链IV型胶原α1多肽的亲和力比JK132更高。
(实施例7)
<单克隆抗体NK46141识别的表位位点的分析>
通过夹心ELISA评估与抗原(单链IV型胶原α1多肽)的反应性。在室温下,将实施例5中纯化的单克隆抗体NK46141(抗体被固定,浓度:50mM碳酸盐缓冲液中5μg/ml)固定在96孔微量滴定板(Nunc;由ThermoFisherScientificInc.制造)上2小时。随后,用TBS/0.05(体积)%Tween20冲洗板。在室温下使用1(质量/体积)%BSA/TBS-0.05(体积)%Tween20封闭板表面上游离的吸附部分30分钟。用TBS/0.05(体积)%Tween20再次冲洗板。单链IV型胶原α1多肽(1(质量/体积)%BSA/TBS-0.05(体积)%Tween20中1μg/ml)作为抗原添加至孔并且在室温下反应1小时。接着,用TBS/0.05(体积)%Tween20冲洗板。随后,向其添加制备为HRP标记的抗体的50μL/孔的单克隆抗体用于使用过氧化物酶标记的Kit-SH(由WakoPureChemicalIndustries,Ltd.制造)进行检测。在室温下温育1小时之后,用TBS/0.05(体积)%Tween20冲洗板,并且100μL/孔的底物溶液(柠檬酸盐缓冲液(pH5),0.05(质量/体积)%邻苯二胺,按体积计0.03%的H2O2)添加至孔。20分钟至30分钟之后,添加2N硫酸使反应终止,和使用分光光度计测定490nm处的吸光度。结果显示在表3中。
表3
作为该测试的结果,对HRP标记的JK132抗体和HRP标记的单克隆抗体NK46141,用JK132作为固定抗体获得的吸光度值分别为0.273和3.354。相对照,对HRP标记的JK132抗体和HRP标记的NK46141抗体,用NK46141作为固定抗体获得的吸光度值分别为3.284和0.209,这表明NK46141和JK132对于结合单链IV型胶原α1肽不彼此竞争。这显示NK46141识别的表位位于与JK132识别的表位不同的位点处,这表明NK46141和JK132识别不同的表位。
因此,表明单克隆抗体NK46141和JK132之间它们的结合亲和力和识别的表位位点不同的这些分析结果显示NK46141和JK132是具有不同活性的抗体。
(实施例8)
<对裸小鼠中移植的人肺癌细胞系的抗肿瘤作用>
人肺癌细胞系Lu65A(获得自JCRB)在37℃和5%CO2条件下使用补充按体积计10%胎牛血清(由TissueCultureBiologicalsInc.制造)的RPMI1640培养基(由MediatechInc.制造)中培养,并且然后保持。使用注射器将2×106个细胞/0.2ml浓度的Lu65A细胞悬浮液皮下移植至每只裸小鼠(Balb/cAJcl-nu/nu,9周龄,由CLEAJapan,Inc.制造)的背部。
在肿瘤移植的前一天和移植后3天、7天、10天和14天总共5次施用单克隆抗体NK46141至尾静脉。NK46141用盐水(由OtsukPharmaceuticalCo.,Ltd.制造)稀释备用。对照组中使用盐水。
在Lu65A移植后7天、10天、14天、17天和21天测量肿瘤体积。通过测量肿瘤的长轴(Lmm)和短轴(Wmm),根据公式(L×W2)/2计算肿瘤体积。
结果显示在图6中。施用NK46141(30mg/kg)的具有皮下移植的人肺癌细胞Lu65A的小鼠模型组的肿瘤体积显著(p值<0.05,t检验)小于未接受NK46141的对照组的肿瘤体积,这表明NK46141抑制肿瘤组织的生长。
(实施例9)
<NK46141的CDR序列的确定>
使用RNeasy(由QiagenN.V.制造)从杂交瘤#141系获得总RNA。根据获得的总RNA,通过5’-RACEPCR扩增并且克隆编码NK46141的H链和L链可变区的cDNA。通过DNA测序和N-端氨基酸序列分析,确定NK46141H链或L链可变区的基因序列(SEQIDNOs:1和2)和氨基酸序列(SEQIDNOs:3和4)。
通过比较NK46141的氨基酸序列与已知抗体的CDR氨基酸序列,确定NK46141CDR。具体而言,从IMGTRepertoire数据库(http://www.imgt.org/IMGTrepertoire/)、IMGT数据库(IMGT/LIGM-DB数据库(http://www.imgt.org/IMGTlect/)和Kabat数据库(http://www.kabatdatabase.com)搜索与NK46141具有高同源性的已知抗体的基因。从关于获得的抗体基因的CDR氨基酸序列信息确定NK46141的CDR。
作为基于这两种类型的IMGT数据库分析的结果,H链确定为具有CDR1序列GFTFTDYY(SEQIDNO:5)、CDR2序列ISEGGSYT(SEQIDNO:6)和CDR3序列ASPYYGDGGFAY(SEQIDNO:7),而L链确定为具有CDR1序列QSIVHSDGNTY(SEQIDNO:8)、CDR2序列KVS(SEQIDNO:9)和CDR3序列FQGSHVPPT(SEQIDNO:10)。
作为基于Kabat数据库分析的结果,H链确定为具有CDR1序列DYYMY(SEQIDNO:11)、CDR2序列TISEGGSYTYYPDSVKG(SEQIDNO:12)和CDR3序列PYYGDGGFAY(SEQIDNO:13),而L链确定为具有CDR1序列RSSQSIVHSDGNTYLE(SEQIDNO:14)、CDR2序列KVSNRFS(SEQIDNO:15)和CDR3序列FQGSHVPPT(SEQIDNO:16)。
(实施例10)
<NK46141识别的表位序列的鉴定>
为了缩小NK46141识别的表位位点,通过下面示出的方法制备多种变体单链IV型胶原肽。
-野生型IV型胶原α1基因的克隆-
使用RNeasy(由QiagenN.V.制造)从产生单链IV型胶原肽的人肝癌细胞HLF细胞系获得总RNA。从获得的总RNA,使用逆转录酶(SuperscriptIII,由InvitrogenCorp.制造)制备HLF细胞源的cDNA。使用HLF细胞源的cDNA作为模板和由SEQIDNOs:17和18表示的引物序列通过PCR扩增野生型IV型胶原α1基因(COL4A1,NCBI基因ID:1282),随后克隆。通过DNA测序,确认克隆的野生型COL4A1没有变异。
-制备野生型COL4A1表达载体-
将野生型COL4A1亚克隆入pENTR1A(由InvitrogenCorp.制造)。使用LRClonase(由InvitrogenCorp.制造)制备野生型COL4A1表达载体。
-制备变体COL4A1表达载体1-
为了获得在单链IV型胶原α1多肽的残基29至488处缺乏氨基酸的变体COL4A1重组蛋白,通过下述方法制备变体COL4A1表达载体1:
为了缺失对应单链IV型胶原肽中残基29至488的氨基酸缺失位点的碱基,通过PCR使用野生型COL4A1表达载体作为模板和由SEQIDNOs:19和20表示的引物序列扩增cDNA。随后,以与制备野生型COL4A1表达载体相同的方式,制备变体COL4A1表达载体1,除了在制备野生型COL4A1表达载体中的野生型COL4A1改变为该PCR产物。
-制备变体COL4A1表达载体2-
以与制备变体COL4A1表达载体1相同的方式制备变体COL4A1表达载体2,除了将在制备变体COL4A1表达载体1中由SEQIDNOs:19和20表示的引物序列改变为由SEQIDNOs:21和22表示的引物序列。
变体COL4A1表达载体2是包含基因插入片段的表达载体,该基因插入片段具有对应单链IV型胶原肽中从残基29至989的氨基酸缺失位点的碱基缺失。
-制备变体COL4A1表达载体3-
以与制备变体COL4A1表达载体1相同的方式制备变体COL4A1表达载体3,除了将在制备变体COL4A1表达载体1中由SEQIDNOs:19和20表示的引物序列改变为由SEQIDNOs:23和24表示的引物序列。
变体COL4A1表达载体3是包含基因插入片段的表达载体,该基因插入片段具有对应单链IV型胶原肽中从残基29至1,066的氨基酸缺失位点的碱基缺失。
因为制备的野生型COL4A1表达载体和变体COL4A1表达载体1至3每个包含COL4A1源的信号序列,所以哺乳动物细胞瞬时过表达的野生型或变体单链IV型胶原肽被分泌入培养物上清液。
因此,将制备的野生型COL4A1表达载体和变体COL4A1表达载体1至3每种引入人胚肾细胞源的293FT细胞(由InvitrogenCorp.制造)以瞬时表达野生型或变体单链IV型胶原肽。下文,具有使用野生型COL4A1表达载体表达的单链IV型胶原肽的全长氨基酸序列的野生型重组蛋白也称为“FL”;使用变体COL4A1表达载体1表达的变体重组蛋白也称为“Δ29-488”;使用变体COL4A1表达载体2表达的变体重组蛋白也称为“Δ29-989”;和使用变体COL4A1表达载体3表达的变体重组蛋白也称为“Δ29-1,066”。
制备的野生型COL4A1表达载体和变体COL4A1表达载体1至3以及从其表达的FL、Δ29-488、Δ29-989和Δ29-1,066总结在下面的表4和图7A中。
图7A是显示野生型单链IV型胶原肽(FL)和这三种类型变体单链IV型胶原肽(Δ29-488、Δ29-989和Δ29-1,066)的示意性说明图。
表4
回收包含如此分泌的野生型单链IV型胶原肽或三种类型的变体单链IV型胶原肽每一种的培养物上清液,并且用NK46141作为探针进行蛋白质印迹,以缩小NK46141的表位。就此而言,以与上述相同的方式,仅仅将不含COL4A1基因的载体引入人胚肾细胞源的293FT细胞,并且将所得培养物上清液用作阴性对照(Mock)。另外,将识别与NK46141不同的表位的抗-单链IV型胶原肽抗体JK132用作基因表达确认的对照。结果显示在图7B中。
结果,对于Δ29-1,066未检测到条带,这表明NK46141识别的表位位于单链IV型胶原肽的氨基酸序列中的残基990至1,066处。注意,已知JK132识别的IV型胶原α1多肽的表位位于氨基酸序列中残基1,165至1,179处。
为了进一步缩小NK46141识别的表位,制备下列变体COL4A1表达载体4至6。
-制备变体COL4A1表达载体4-
以与制备变体COL4A1表达载体1相同的方式制备变体COL4A1表达载体4,除了将在制备变体COL4A1表达载体1中作为模板的野生型COL4A1表达载体改变为变体COL4A1表达载体2和将由SEQIDNOs:19和20表示的引物序列改变为由SEQIDNOs:25和26表示的引物序列。随后,根据常规方法,将编码加标签于C末端的myc表位的序列添加至变体COL4A1表达载体4。
变体COL4A1表达载体4是包含基因插入片段的表达载体,该基因插入片段具有对应单链IV型胶原肽中从残基29至989和从残基1,067至1,669的氨基酸缺失位点的碱基缺失。
-制备变体COL4A1表达载体5-
以与制备变体COL4A1表达载体4中相同的方式制备变体COL4A1表达载体5,除了将在制备变体COL4A1表达载体4中由SEQIDNOs:25和26表示的引物序列改变为由SEQIDNOs:27和28表示的引物序列。随后,根据常规方法,将编码加标签于C末端的myc表位的序列添加至变体COL4A1表达载体5。
变体COL4A1表达载体5是包含基因插入片段的表达载体,该基因插入片段具有对应单链IV型胶原肽中从残基29至989和从残基1,020至1,669的氨基酸缺失位点的碱基缺失。
-制备变体COL4A1表达载体6-
以与制备变体COL4A1表达载体4中相同的方式制备变体COL4A1表达载体6,除了将在制备变体COL4A1表达载体4中作为模板的变体COL4A1表达载体2改变为变体COL4A1表达载体4和将由SEQIDNOs:25和26表示的引物序列改变为由SEQIDNOs:29和30表示的引物序列。随后,根据常规方法,将编码加标签于C末端的myc表位的序列添加至变体COL4A1表达载体6。
变体COL4A1表达载体6是包含基因插入片段的表达载体,该基因插入片段具有对应单链IV型胶原肽中从残基29至1,019和从残基1,067至1,669的氨基酸缺失位点的碱基缺失。
将制备的变体COL4A1表达载体4至6分别引入人胚肾细胞源的293FT细胞(由InvitrogenCorp.制造)以将野生型或变体单链IV型胶原肽瞬时表达入培养物上清液。下文,使用变体COL4A1表达载体4表达的变体重组蛋白也称为“990-1,066myc”;使用变体COL4A1表达载体5表达的变体重组蛋白也称为“990-1,019myc”;和使用变体COL4A1表达载体6表达的变体重组蛋白也称为“1,020-1,066myc”。
制备的变体COL4A1表达载体4至6以及从其表达的990-1,066myc、990-1,019myc和1,020-1,066myc总结在下面表5和图9中。
图9是显示这三种类型的变体单链IV型胶原肽(990-1,066myc、990-1,019myc和1,020-1,066myc)的示意性说明图。
表5
回收包含如此分泌的三种类型的变体单链IV型胶原肽每种的培养物上清液,并且用NK46141作为探针进行蛋白质印迹以缩小NK46141的表位。就此而言,仅仅将不含COL4A1基因的载体以上述相同的方式引入人胚肾细胞源的293FT细胞,和将所得培养物上清液用作阴性对照(Mock)。另外,将抗-myc抗体(由Sigma-AldrichCorp.制造)用作阳性对照用于确认单链IV型胶原肽的表达。结果显示在图8B中。
结果,对于990-1,019myc未检测到条带,这表明NK46141识别的表位位于单链IV型胶原肽的氨基酸序列中的残基990至1,019处。
为了进一步缩小NK46141识别的表位,制备下列变体COL4A1表达载体7至9。
-制备变体COL4A1表达载体7-
以与制备变体COL4A1表达载体1相同的方式制备变体COL4A1表达载体7,除了将在制备变体COL4A1表达载体1中由SEQIDNOs:19和20表示的引物序列改变为由SEQIDNOs:31和32表示的引物序列。
变体COL4A1表达载体7是包含基因插入片段的表达载体,该基因插入片段具有对应单链IV型胶原肽中从残基1,020至1,066的氨基酸缺失位点的碱基缺失。
-制备变体COL4A1表达载体8-
以与制备变体COL4A1表达载体1相同的方式制备变体COL4A1表达载体8,除了将在制备变体COL4A1表达载体1中由SEQIDNOs:19和20表示的引物序列改变为由SEQIDNOs:33和34表示的引物序列。
变体COL4A1表达载体8是包含基因插入片段的表达载体,该基因插入片段具有对应单链IV型胶原肽中从残基1,020至1,049的氨基酸缺失位点的碱基缺失。
-制备变体COL4A1表达载体9-
以与制备变体COL4A1表达载体1相同的方式制备变体COL4A1表达载体9,除了将在制备变体COL4A1表达载体1中由SEQIDNOs:19和20表示的引物序列变为由SEQIDNOs:35和36表示的引物序列。
变体COL4A1表达载体9是包含基因插入片段的表达载体,该基因插入片段具有对应单链IV型胶原肽中从残基1,050至1,066的氨基酸缺失位点的碱基缺失。
将制备的变体COL4A1表达载体7至9分别引入人胚肾细胞源的293FT细胞(由InvitrogenCorp.制造)以将野生型或变体单链IV型胶原肽瞬时表达入培养物上清液。下文,使用变体COL4A1表达载体7表达的变体重组蛋白也称为“Δ1,020-1,066”;使用变体COL4A1表达载体8表达的变体重组蛋白也称为“Δ1,020-1,049”;和使用变体COL4A1表达载体9表达的变体重组蛋白也称为“Δ1,050-1,066”。
制备的变体COL4A1表达载体7至9以及从其表达的Δ1,020-1,066、Δ1,020-1,049和Δ1,050-1,066连同野生型COL4A1表达载体一起总结在下面表6和图9A中。
图9A是显示这三种类型的变体单链IV型胶原肽(Δ1,020-1,066、Δ1,020-1,049和Δ1,050-1,066)的示意性说明图。
表6
回收包含这样分泌的三种类型的变体单链IV型胶原肽每一种的培养物上清液,并且用NK46141作为探针进行蛋白质印迹以缩小NK46141的表位。就此而言,仅仅将不含COL4A1基因的载体以上述相同的方式引入人胚肾细胞源的293FT细胞,并且将所得培养物上清液用作阴性对照(Mock)。另外,将识别与NK46141不同的表位的抗-单链IV型胶原肽抗体JK132用作基因表达确认的对照。结果显示在图9B中。
结果,对于Δ1,020-1,066或Δ1,050-1,066未检测到条带,这表明NK46141识别的表位位于单链IV型胶原肽的氨基酸序列中的残基1,050至1,066处。
实施例10中制备野生型COL4A1表达载体和变体COL4A1表达载体1至9使用的引物序列总结如下。
正向引物
反向引物
为了进一步确定NK46141识别的表位,化学合成如下显示的由SEQIDNOs:37至42表示的肽序列,并且将其用于点渍法中,NK46141作为探针。图10中,#1表示由SEQIDNO:37表示的肽序列;#2表示由SEQIDNO:38表示的肽序列;#3表示由SEQIDNO:39表示的肽序列;#4表示由SEQIDNO:40表示的肽序列;#5表示由SEQIDNO:41表示的肽序列;和#6表示由SEQIDNO:42表示的肽序列。
结果,NK46141识别的表位显示为由氨基酸序列“GIGIPGLRG”(SEQIDNO:41)表示的肽,其位于IV型胶原α1多肽的氨基酸序列中的残基1,056至1,064处(图10的#5)。
序列
已经参考实施例描述了本发明。但是,提供这些实施例仅仅用于例证性的目的。本领域技术人员应当理解本文可作出各种改变或修改,并且这些改变或修改落在本发明的范围内。
获取号
FERMBP-11300
工业适用性
如上述,本发明靶向肿瘤组织中特异性表达的单链IV型胶原多肽的抗体可用作药物或诊断药物——其不作用于正常组织、正常器官或正常细胞,或用作肿瘤治疗或诊断的试剂盒。