CN105452297B - mAb 2抗-Met抗体 - Google Patents

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Abstract

本文公开了特异性结合包含于c‑Met的α‑链中的表位的抗体、其变型、组合物和用途。

Description

mAb 2抗-Met抗体
相关申请的交叉引用
本申请要求2013年8月23日提交的新加坡专利申请号201306428-2和2013年4月30日提交的新加坡专利申请号201303329-5的优先权的权益，这两个新加坡专利申请的内容出于所有目的在此以引用方式整体并入。
技术领域
本发明属于免疫学领域并且涉及特异性结合c-Met的抗体、其片段和其用途。
背景技术
c-Met是由通过二硫键连接到跨膜β-链的胞外α-链构成的190kD酪氨酸激酶受体。c-Met是作为170kD单一多肽合成的，其被蛋白水解切割而形成α-链和β-链。成熟的α-链是45kD并且构成了sema结构域的一部分。sema结构域是信号素(semaphorin)和神经丛素(plexin)共有的保守结构域。该结构域呈对于同型二聚化重要的七叶β-螺旋桨(seven-bladed beta-propeller)结构。在c-Met中，α-链和β-链均形成对于受体二聚化和配体结合必要且充分的sema结构域。
肝细胞生长因子(HGF)是唯一已知的c-Met配体。在HGF结合时，c-Met受体在细胞表面上二聚化，这导致激酶结构域中的酪氨酸残基的自身磷酸化。自身磷酸化被认为诱导c-Met的构象变化，暴露了c-Met的羧基末端尾中的对接位点(docking site)。这导致c-Met对接位点中的酪氨酸残基的转磷酸化。对接位点可用于募集接头分子和信号传导分子，导致各种信号传导途径(包括AKT/PI3K、RAS/MAPK和STAT途径)的激活。
c-Met信号传导途径的异常c-Met激活与各种人癌症中的过度增殖、肿瘤细胞侵袭、肿瘤血管生成和不良预后相关联。另外，c-Met信号传导通过抑制凋亡并诱导对癌症疗法的抗性、由此阻碍肿瘤治疗的作用来保护肿瘤细胞。c-Met作为癌症预后标志物和其参与癌症转移和药物抗性使c-Met成为非常有吸引力的药物靶标。
各种机制已被用于抑制c-Met激活。小分子激酶抑制剂如PHA-665752、AM7和SU11274在抑制c-Met激活方面是极为成功的。然而，由于小分子抑制剂的脱靶效应(off-target effect)所致的毒性组织是主要担忧。另外，SU11274被报道针对特定的c-Met突变是无效的。
U1snRNA/核酶的使用也被报道下调c-Met/HGF的表达水平。然而，该方法由于药物递送问题而对于癌症治疗是不可行的。为了有效，U1snRNA/核酶必须被有效地递送到待表达的每个肿瘤细胞中。
已对使用HGF片段和c-Met片段(分别如NK4和诱饵(decoy)-Met)来竞争Met-HGF相互作用进行检查。这些竞争性抑制剂显示了体内异常移植模型中对c-Met激活的有效抑制；然而，它们的临床效用仍有待确定。
许多抗体如赫赛汀(Herceptin)(临床上被称为曲妥珠单抗(Trastuzamab))已在临床上获得成功。赫赛汀是用于乳腺癌治疗的靶向酪氨酸受体激酶HER2的嵌合抗体。
随着治疗性抗体的成功，已尝试开发针对Met-HGF轴的治疗性抗体。开发了旨在封阻Met-HGF相互作用的靶向HGF的中和抗体。只有当使用两种或三种不同的抗-HGF抗体的组合时，c-Met与HGF的结合才被封阻。已开发出靶向HGF的β-链的五种完全人抗-HGF抗体。这些抗体在封阻U-87MG胶质母细胞瘤细胞中的Met-HGF相互作用方面是成功的。
开发靶向c-Met的治疗性二价抗体已经是具有挑战性的。先前已开发出针对c-Met的胞外结构域的两种单克隆抗体(DO-24和DN-30)。有趣的是，两种单克隆抗体充当激动剂而非拮抗剂并且在体内激活c-Met信号传导。为了避免二价单克隆抗体对c-Met的激活，对DN-30Fab片段进行工程化。DN-30Fab保持了其对c-Met的高结合亲和力，但丧失了其对c-Met的激动剂活性。DN-30Fab通过引起c-Met胞外结结构域脱落和受体下调而有效地抑制c-Met信号传导。
单臂5D5抗体(MetMab或临床上被称为奥纳珠单抗(Onartuzumab))是靶向c-Met的单价嵌合抗体。与DN-30类似，当被转化为单价Fab时，二价5D5抗体变成拮抗剂。与Fab DN-30不同，MetMab通过与HGF竞争c-Met结合而充当拮抗剂并且引起c-Met内化和下调。
因此，需要提供克服或至少改善一个或多个上述缺点的结合c-Met的新拮抗性抗体。
发明内容
下面描述了针对人c-Met的α-链的抗体。开发针对抗人c-Met的α-链而产生的一组二价抗-Met鼠科动物单克隆抗体。通过蛋白质印迹法(Western blotting)、免疫沉淀、流式细胞术、表位定位和对c-Met的激动剂/拮抗剂活性来表征这些抗体。令人惊讶地，这些抗体都不是c-Met激动剂。两种抗体mAb 2和mAb 13通过流式细胞术显示与天然c-Met的最强结合，但在检测蛋白质印迹上的变性c-Met方面效果差。mAb 2在降低细胞增殖方面是最有效的。通过流式细胞对mAb 2的进一步分析显示其与活细胞上的c-Met的结合是温度敏感性的。mAb 2表位的详细定位揭示部分mAb 2表位被包埋在c-Met内。
因此，在第一方面，提供特异性结合包含在c-Met的α-链中的表位的抗体。
在第二方面，提供编码如本文所述的抗体的核酸，其中所述抗体的重链包含如SEQID NO:1中所示的序列或由如SEQ ID NO:1中所示的序列组成。
在第三方面，提供包含如本文所述的抗体或由如本文所述的抗体组成的药物组合物。
在第四方面，提供治疗和/或预防癌症的方法，其包括施用治疗有效量的如本文所述的抗体。
在第五方面，提供诊断癌症的方法，其包括通过施用用于检测c-Met的如本文所述的抗体来检测c-Met的异常表达。
在第六方面，提供本文所公开的抗体在制造用于治疗和/或预防癌症的药剂中的用途。
在第七方面，提供本文所公开的抗体用于检测具有异常c-Met表达的细胞的用途。
在第八方面，提供本文所公开的抗体作为癌症预后标志物的用途。
附图说明
附图说明了所公开的实施方案并且用于解释所公开的实施方案的原理。然而，应当理解，附图被设计为只用于说明的目的，而不是作为本发明范围的定义。
图1是图解说明抗-α-链c-Met单克隆抗体表位定位的定位的草图。A)抗体结合区域的图解。利用肽扫描(一种基于ELISA的测定)来确定21种单克隆上清液的结合区域。合成跨越整个c-Metα-链的连续重叠肽并且将其涂覆于96孔中。为了确定α-链上的抗体结合区域，向每条肽中添加单克隆细胞上清液。抗体结合导致比色反应，通过450nM下的吸光度读数对其进行分析。将所述抗体的表位分类成各个区域。共有同一结合区域的抗体被指示。图并非按比例绘制。B和C)c-Met的晶体结构的抗体结合区域的定位。结合HGFβ-链的c-Met胞外结构域(氨基酸残基25–567)的晶体结构。从蛋白质数据库(PDB)以保藏号1SHY获得晶体结构。以绿色突出显示c-Met并且以蓝色突出显示HGF。从两个不同的角度(B)和(C)显示蛋白质复合物以允许相对于配体-受体相互作用位点观察不同抗体结合区域。(D)是图解说明单克隆抗体筛选的概况的示意图。筛选768个细胞系在杂交瘤融合后的抗-α-链抗体产生。在初级筛选中发现57个细胞系表达抗-α-链c-Met抗体。将这些细胞系扩增并且在次级筛选中再次测试其抗-α-链抗体产生。观察到39个细胞系稳定地表达抗-α-链抗体。21个细胞系被选择用于单细胞克隆。然后在蛋白质印迹上对这些抗体的结合区域、同种型亚类和功能性进行表征。基于这些测定，选择11个克隆用于腹水产生。从腹水纯化单克隆抗体并且进行进一步表征。
图2呈现了使用纯化的抗-α-链c-Met单克隆抗体的蛋白质印迹的摄影图像。选择11个杂交瘤克隆(mAb2、mAb4、mAb8和mAb11-18)用于腹水产生。从腹水纯化单克隆抗体并且再次测试其对全细胞溶解产物中的全长c-Met的反应性。从未转染的NIH3T3细胞(UT)、用全长人c-Met(Met)转染的NIH3T3细胞、U-87MG细胞系和T47D细胞系获得50μg全细胞溶解产物。U-87MG细胞和T47D细胞分别表达高水平的c-Met和不可检测水平的c-Met。单克隆抗体以1μg/mL的浓度使用。10ng纯化的α-链被用作阳性对照。AF276抗体被用作对照。蓝色箭头指示c-Met前体(170kD)。红色箭头指示纯化的α-链。分子量以千道尔顿被标注在旁边。
图3描绘了蛋白质印迹的图像，其显示抗-α-链c-Met单克隆抗体使内源性c-Met免疫沉淀。从腹水产生单克隆抗体并且使用蛋白质A珠粒将其纯化。测试纯化抗体使来自SNU-5细胞溶解产物的内源性c-Met免疫沉淀的能力。1μg/mL抗体被用于免疫沉淀。商业抗-Met抗体SC-10和AF276以及小鼠IgG被用作对照。通过蛋白质印迹法使用A)SC-10抗体和AF276抗体以及B)从该筛选产生的缀合HRP的单克隆抗体来分析免疫沉淀的SNU-5细胞溶解产物。mAb 8、mAb 12和18先前被显示识别不同表位并且在蛋白质印迹上运行良好。分子量以千道尔顿被标注在旁边。
图4显示来自用抗-α-链c-Met单克隆抗体处理的SNU-5细胞的流式细胞术分析的代表性信号。将纯化的单克隆抗体(1μg/mL)与活的SNU-5细胞一起培育。在细胞通过流式细胞器之前，使用缀合FITC的二级抗体检测结合的抗体。FITC强度的变化指示单克隆抗体与SNU-5细胞的结合。
图5呈现了HaCaT细胞的图像，其证实纯化的抗-α-链c-Met单克隆抗体对细胞离散(cell scatter)的作用。在处理前将HaCaT细胞血清饥饿24hr。固定前与单克隆抗体(1μg/mL)和HGF培育24hr。然后用结晶紫将细胞染色用于可视化。抗-HGF抗体(抗-HGF)、商业上获得的小鼠免疫球蛋白G(IgG)和c-Met小分子抑制剂SU11274被用作对照。UT：未处理的。
图6是显示纯化的抗-α-链c-Met单克隆抗体对SNU-5细胞活力和半胱天冬酶激活的作用的一对条形图。在含血清的培养基存在下向SNU-5细胞中添加10μg/mL单克隆抗体。在测试(A)细胞活力和(B)半胱天冬酶激活前将细胞培育72hr。SU11274(5μM)被用作对照。
图7是证实mAb 2和mAb 13对细胞生长的作用的一系列测定。在含血清的培养基存在下将10μg/mL单克隆抗体与SNU-5细胞一起培育。A)是显示SNU-5细胞的细胞生长的条形图。单克隆抗体处理后72hr，收获细胞并且使用自动化的ADAM细胞计数器(Digital Bio)进行计数。第0天：被接种用于测定的细胞的数量。B和C)在与单克隆抗体一起培育6天前用5μMCellTracker Green BODIPY染料将SNU-5细胞染色。隔天向细胞中添加含有10μg/mL单克隆抗体的新鲜培养基。收获细胞并且通过流式细胞术分析CellTracker Green BODIPY荧光保留。B)用相应的单克隆抗体处理的荧光细胞的直方图示。C)通过流式细胞术记录单克隆抗体处理的细胞的CellTracker Green BODIPY荧光强度。一式两份进行实验。获得平均几何平均荧光并且将其标绘出来。
图8呈现了显示mAb 2和mAb 13在SNU-5细胞中的胞内免疫荧光染色的摄影图像。在所示温度下将活的SNU-5细胞与10μg/mL单克隆抗体一起培育1小时。收获细胞并且将其旋涂到显微镜载玻片上。将细胞在4％PFA(多聚甲醛)/PBS(磷酸盐缓冲盐水)中固定并且进行渗透化处理。使用抗小鼠的缀合的二级抗体检测mAb 2和mAb 13。使用分别将F-肌动蛋白和细胞核染色的鬼笔环肽和DAPI作为复染剂。
图9是代表在不同温度下抗-α-链c-Met单克隆抗体与活的SNU-5细胞的结合的流式细胞术分析的一系列直方图。在4℃或37℃下用相应的单克隆抗体将活的SNU-5细胞处理1hr。收获细胞。通过缀合的抗小鼠二级抗体确定抗-α-链c-Met单克隆抗体结合并且通过流式细胞术分析细胞。
图10是来自与HGF复合的c-Met的计算机模拟的代表性瞬态图对，其显示了对mAb2表位关键的残基的鉴别。mAb 2表位的丙氨酸扫描鉴别出对mAb 2-Met相互作用重要的若干非连续残基。c-Met晶体结构(PDB保藏号为1SHY)上的关键残基的定位将所述残基分组为两个簇，即位于c-Met表面上的残基(以粉红色表示)和包埋在c-Met中的残基(以青色表示)。以绿色突出显示c-Met并且以蓝色突出显示HGF。再次，从两个不同的角度(A)和(B)显示了蛋白质复合物。
图11A)和B)显示用于确定c-Metα-链上的mAb 2表位区域的肽扫描(基于ELISA的测定)。合成跨越整个人c-Metα-链的连续重叠肽并且将其涂覆于96孔中。为了确定mAb 2在α-链上的结合区域，向每条肽中添加mAb 2。mAb 2结合导致比色反应，通过450nM下的吸光度读数对其进行分析。A)mAb 2以类似的亲和力结合肽O28和肽O29。陈述了肽O1、肽O27、肽O28和肽O29的序列和结合亲和力。B)mAb 2肽扫描分析图片。mAb 2结合肽O28和肽O29，这导致比色反应。
图11C)显示呈现蛋白质印迹的图像，其显示使用mAb 2对人c-Met的分析。从小鼠腹水纯化mAb 2并且测试其对全细胞溶解产物中的全长c-Met的反应性。从未转染的NIH3T3小鼠细胞(UT)、用全长人c-Met(Met)转染的NIH3T3小鼠细胞、U-87MG人胶质母细胞瘤细胞和T47D人乳腺癌细胞获得50μg全细胞溶解产物。mAb 2以1μg/mL的浓度使用。10ng纯化的α-链被用作阳性对照。蓝色箭头指示c-Met前体(170kD)。红色箭头指示纯化的α-链。分子量以千道尔顿被标注在旁边。
图11D)是显示通过抗-Met抗体对SNU-5人胃细胞的流式细胞术分析的直方图。SNU-5细胞表达高水平的c-Met。将1μg/mL抗-Met抗体与活的SNU-5细胞一起培育。在使细胞通过流式细胞器之前，使用缀合FITC的二级抗体检测结合的抗-Met抗体。仅二级抗体被用作对照。FITC强度的右移指示单克隆抗体与SNU-5细胞的结合。mAb 2和mAb 13强烈地结合活的SNU-5。
图11E)是显示mAb 2和mAb 13对细胞生长的作用的条形图。在含血清的培养基存在下将10μg/mLmAb与SNU-5细胞一起培育。mAb处理后72hr，收获细胞并且使用自动化的ADAM细胞计数器(Digital Bio)进行计数。第0天：被接种用于测定的细胞的数量。
图12是代表用于鉴别mAb 2主要表位的实验的计算机模拟的表、点图和瞬态图。A)丙氨酸扫描分析用于确定参与mAb 2表位的主要残基。肽1-31是肽O28和肽O29的衍生物，其中每个氨基酸残基依序被丙氨酸置换。肽序列列于表1中。使用相同的基于ELISA的测定作为肽扫描，在1mM DTT存在下向所述肽中添加0.05μg/mL纯化的mAb 2。通过450nM下的吸光度读数来确定mAb 2结合。以绿色突出显示的mAb 2结合的缺乏将指示被置换的残基参与了mAb 2-Met相互作用。肽O1、肽O27以及无肽被用作对照。B)抗针对肽的纯化的mAb 2的滴定。用增加浓度的纯化的mAb 2滴定丧失mAb 2结合的丙氨酸置换的肽。这些肽以增加的mAb 2结合的顺序被列出。C)c-Met晶体结构(PBD 1SHY)上的mAb 2主要表位(‘IEE’和‘CPDC’)的定位。以绿色突出显示c-Met，以蓝色突出显示HGF，以橙色突出显示‘IEE’残基(残基166-168)并且以粉红色突出显示‘CPDC’残基(残基172–175)。从两个不同的角度(i)和(ii)显示蛋白质复合物以允许与配体-受体相互作用位点有关的mAb 2主要表位的可视化。氨基酸残基数量基于c-Met蛋白质结构PBD 1SHY。
图13是mAb 2重链的核苷酸和蛋白质序列。使用可在IMGT(国际免疫遗传学信息系统)网页上获得的IMGT/V-QUEST软件进行比对、核苷酸翻译和CDR预测。
图14呈现了mAb 2轻链的核苷酸和蛋白质序列。使用可在IMGT(国际免疫遗传学信息系统)网页上获得的IMGT/V-QUEST软件进行比对、核苷酸翻译和CDR预测。
图15是显示通过噬菌体展示对mAb 2scFv结合的分析的条形图。克隆mAb 2重链和轻链并且将其在噬菌体表面上表达。通过ELISA确定mAb 2scFv对肽O28(SEQ ID NO:16)和O29(SEQ ID NO:17)的结合特异性。肽O27以及无肽被用作对照。制得mAb 2scFv的两种构建体：VH后接VL即(VH-VL)以及VL后接即VH(VL-VH)。
具体实施方式
在描述本发明抗体、其片段和用途之前，应当理解本发明并不限于所述的具体的肽、方法、用途和实验条件，因为此类肽、方法、用途和条件可以改变。还应当理解，本文所用的术语仅用于描述具体的实施方案的目的，而不意在进行限制，因为本发明的范围将仅受所附权利要求限制。
除非另有定义，否则本文所用的所有技术和科学术语都与本发明所属领域技术人员通常所理解的含义相同。类似或等同于本文所述的方法和材料的任何方法和材料均可用于本发明的实践或测试，因为应当理解，修改和改变涵盖于本公开的精神和范围内。
在本发明中，已设计出特异性结合c-Met的α-链中的表位的抗体肽。蛋白质印迹法、免疫沉淀、流式细胞术、表位定位、对c-Met的激动剂/拮抗剂活性和晶体结构被用于表征针对人c-Met的α-链产生的一组二价抗-Met鼠科动物单克隆抗体。本发明人发现，本文所述的抗体是与先前所述的靶向c-Met的治疗性二价抗体相反的c-Met拮抗剂。本发明的抗体还被显示在降低细胞增殖方面有效。
如本文所用的术语“c-Met”或“c-Met蛋白质”意指由通过二硫键连接到跨膜β-链(SEQ ID NO:59)的胞外α-链(SEQ ID NO:58)构成的190kD酪氨酸激酶受体(SEQ ID NO:1)。c-Met是作为170kD单一多肽合成的，其被蛋白水解切割而形成α-链和β-链。成熟的α-链是45kD并且构成了sema结构域的一部分。sema结构域是信号素和神经丛素共有的保守结构域。该结构域呈对于同型二聚化重要的七叶β-螺旋桨结构。在c-Met中，α-链和β-链均形成对于受体二聚化和配体结合必要且足够的sema结构域。140kD成熟的β-链由胞外结构域、跨膜结构域和胞质结构域组成。β-链的胞外部分构成了sema结构域的剩余部分。c-Metβ-链的胞质部分含有后接激酶结构域和羧基末端尾的近膜区域。羧基末端尾对于c-Met下游信号传导至关重要，因为它含有用于信号传导的对接位点和结合c-Met的衔接蛋白质。
如本文所定义的术语“胞外区”指示跨膜蛋白质暴露于细胞外部的蛋白质区。c-Met的α-链完全在胞外，也就是说，c-Met的α-链不具有跨膜结构域。
c-Met是结合HGF(肝细胞生长因子)且因此起始细胞内的信号转导途径的受体。c-Met蛋白质还可包括变体。c-Met蛋白质还可包括片段，如不具有全部或部分跨膜结构域的胞外结构域和/或胞内结构域，以及胞外结构域的片段。c-Met的克隆、表征和制备先前已被描述。人c-Met的氨基酸序列示于SEQ ID NO:1中。可用于本发明方法中的人c-Met的可溶形式包括胞外结构域或缺少信号肽的成熟形式或保持结合HGF的能力的胞外结构域的片段。术语“c-Met”还包括c-Met氨基酸序列的翻译后修饰。翻译后修饰包括但不限于N-连接的糖基化和O-连接的糖基化。
本发明提供特异性结合包含在c-Met的α-链中的表位的抗体。抗体的示例包括特异性结合包含在c-Met的α-链中的表位的肽和/或多肽(任选地包括翻译后修饰)。抗体的示例包括特异性结合包含在c-Met的α-链中的表位的抗体和其片段，如本文中所不同地定义的。本发明的示例包括特异性结合人c-Met并且抑制HGF结合和激活c-Met的抗体。
术语"抗体"(Ab)以最广泛的含义被使用并且明确地涵盖单克隆抗体(包括全长单克隆抗体)、多克隆抗体、单特异性抗体、多特异性抗体(例如，双特异性抗体)和抗体片段，(只要它们仍然展现期望的生物活性)。在本发明的上下文中，“抗体”是指免疫球蛋白分子、免疫球蛋白分子的片段或这两种中任一种的衍生物，其在典型的生理条件下具有特异性结合抗原的能力，且半衰期为相当长的时段，如至少约30分钟、至少约45分钟、至少约1小时、至少约2小时、至少约4小时、至少约8小时、至少约12小时、约24小时或更长、约48小时或更长、约3天、4天、5天、6天、7天或更长等、或任何其它相关的功能限定时段(如足以诱导、促进、增强和/或调节与抗体结合抗原相关的生理反应的时间和/或所述抗体足以募集效应子活性的时间)。免疫球蛋白分子的重链和轻链的可变区含有与抗原相互作用的结合结构域。抗体(Ab)的恒定区可介导免疫球蛋白与宿主组织或宿主因子的结合，所述宿主组织或宿主因子包括免疫系统的各种细胞(如效应细胞)和补体系统的组分，如Clq，即补体激活的经典途径中的第一组分。c-Met抗体还可以是双特异性抗体、双链抗体(diabody)或类似分子。实际上，由本发明提供的双特异性抗体、双链抗体等除了结合c-Met的一部分，还可以结合任何合适的靶标。如上文所示，在本文中，除非上下文另有说明或明显矛盾，否则术语抗体包括为抗原结合片段(即，保持特异性结合抗原的能力)的抗体片段。已显示，抗体的抗原结合功能可由全长抗体的片段执行。术语"抗体"内所涵盖的抗原结合片段的示例包括(i)Fab'或Fab片段，即由VL、VH、CL和CH 1结构域组成的单价片段、或单价抗体；(ii)F(ab')2片段，即包含由铰链区的二硫桥键连接的两个Fab片段的二价片段；(iii)Fd片段，其基本上由VH和CH1结构域组成；(iv)Fv片段，其基本上由抗体的单臂的VL和VH结构域组成；(v)dAb片段，其基本上由VH结构域组成并且也被称为结构域抗体；(vi)骆驼抗体(camelid)或纳米抗体以及(vii)分离的互补决定区(CDR)。此外，虽然Fv片段的两个结构域VL和VH由单独的基因编码，但它们可使用重组方法、通过使它们能够被制成单蛋白质链的合成接头而被接合，其中VL和VH区配对而形成单价分子(被称为单链抗体或单链Fv(scFv))。除非上下文另有说明或明确指示，否则术语抗体内涵盖此类单链抗体。虽然在抗体的含义内通常包括此类片段，但它们共同地且各自独立地是本发明的独特特征，展现了不同的生物性质和效用。本发明上下文中的这些和其它有用的抗体片段以及此类片段的双特异性形式在本文中进一步被论述。还应当理解，除非另有指明，否则术语抗体还包括通过任何已知技术如酶促切割、肽合成和重组技术提供的多克隆抗体、单克隆抗体(mAb)、抗体样多肽(如嵌合抗体和人源化抗体)以及保持特异性结合抗原的能力的抗体片段(抗原结合片段)。如此生成的抗体可具有任何同种型。
在本发明的上下文中，术语"单价抗体"意指抗体分子能够结合单抗原分子，且因此不能进行抗原交联。
术语"单克隆抗体"是指具有同源的(基本上相同的)抗体群的抗体组合物。该术语在物种方面不受限制，例如，人、鼠科动物、小鼠或犬科动物或抗体来源，它也不受制备它的方式限制。例如，该术语包括通过除杂交瘤以外的方法产生的单克隆抗体，而不管该产生的单克隆抗体如何细分，例如，杂交的单克隆抗体、改变的单克隆抗体、嵌合的单克隆抗体或人源化单克隆抗体。此外，该术语包括在单克隆抗体产生期间天然发生的变体。该术语包括整个免疫球蛋白。如本文所用的术语"人源化抗体"是指工程化抗体(即嵌合抗体)，其通常包含非人(例如，鼠科动物)抗体的可变区或至少其互补决定区(CDR)以及源自人抗体的剩余的免疫球蛋白部分。用于产生嵌合抗体和进一步工程化的单克隆抗体的程序包括本领域内所述的那些。此类人源化抗体可通过已知技术制备，并且在向人施用所述抗体时可提供降低免疫原性的优点。
因此，如本文所用的术语“c-Met抗体”或“抗-c-Met抗体”是指能够相比于与其它蛋白质的结合以更高的亲和力结合c-Met蛋白质的如上文所定义的抗体。“c-Met抗体”是如上文和下文所定义的针对c-Met蛋白质或其片段产生的抗体。
如本文所定义的术语“表位”是指抗原上可被抗体结合的位点，该位点的分子排布决定了特定的组合抗体。它还被称为抗原决定簇。表位通常由分子如氨基酸或糖侧链的表面基团组成且通常具有特定的三维结构特性以及特定的电荷特性。构象表位和非构象表位的区别在于与前者而不是后者的结合在变性溶剂存在下损失。该表位可包含直接参与结合的氨基酸残基(还被称为该表位的免疫显性组分)和不直接参与结合的其它氨基酸残基，如被特异性抗原结合肽有效地遮盖的氨基酸残基(换句话说，所述氨基酸残基在特异性抗原结合肽的覆盖区域(footprint)内)。
本发明的抗体特异性结合包含在c-Met的α-链内的表位。如本文所用的表达"特异性结合"是指抗体(包括本发明的抗体)与蛋白质(例如，靶受体)之间的结合反应，其决定了所述蛋白质在异源蛋白质群和其它化学物质中的存在。更具体地说，如本文所用的短语“特异性结合”意指相对于其它蛋白质，所述抗体优先结合c-Met。在一些实施方案中，“特异性结合”意指c-Met抗体对c-Met的亲和力高于对其它蛋白质的亲和力。例如，平衡解离常数是<10-7到10-11M、或<10-8到<10-10M、或<10-9到<10-10M。因此，在指定的免疫测定条件下，结合特定蛋白质的抗体不以显著量结合存在于样品中的其它蛋白质。在此类条件下与蛋白质的特异性结合可能需要针对其对该特定蛋白质的特异性被选择的抗体。各种免疫测定形式可用于选择与特定蛋白质选择性地结合的抗体。例如，固相ELISA免疫测定常规地被用于选择与蛋白质选择性地免疫反应的抗体。
术语"免疫球蛋白"是指一类结构上相关的糖蛋白，其由两对多肽链即一对低分子量轻(L)链和一对重(H)链组成，这四条链全部通过二硫键互连。免疫球蛋白的结构已被充分表征。简单地说，每条重链通常包含重链可变区(在本文中缩写为VH或VH)和重链恒定区。重链恒定区通常包含3个结构域，即CH1、CH2和CH3。每条轻链通常包含轻链可变区(在本文中缩写为VL或VL)和轻链恒定区。轻链恒定区通常包含一个结构域CL。VH区和VL区可进一步细分为还被称为互补决定区(CDR)的超变区(或可在结构上限定的环的序列和/或形式上超变的超变区)，它散布于更为保守的被称为框架区(FR)的区域。每个VH和VL通常由从氨基末端到羧基末端以如下顺序排布的三个CDR和四个FR构成：FR1、CDR1、FR2、CDR2、FR3、CDR3、FR4。除非上下文另有说明或矛盾，否则CDR序列在本文中根据IMGT(国际免疫遗传学信息系统(The international immunogenetics information system))规则被标识。
然而，抗体序列中的氨基酸残基的编号还可通过Kabat等，Sequences ofProteins of Immunological Interest，第5版，Public Health Service,NationalInstitutes of Health,Bethesda,MD.(1991)中所述的方法进行(短语如"Kabat中的可变结构域残基编号"、"Kabat位置"或"根据Kabat"在本文中是指该编号系统)。具体地说，对于在恒定区中的氨基酸的编号来说，可使用根据Kabat等(见上文)的EU指数编号系统。给定抗体的残基的Kabat编号可通过在同源区比对所述抗体的的序列与"标准"Kabat编号序列来确定。
如本文所用的"同种型"是指由重链恒定区基因编码的免疫球蛋白类别(例如IgGl、IgG2、IgG3、IgG4、Ig D、IgA、Ig E或Ig M)。天然存在的完整抗体或免疫球蛋白的结构包含四条多肽：两条全长轻链和两条全长重链，其中每条轻链通过二硫键连接到重链。每条重链具有两个区域，即恒定区和可变区。重链恒定区存在五种同种型，即伽马(γ)、谬(μ)、阿尔法(α)、德尔塔(δ)或厄普西隆(ε)，其可通过亚型进一步分类为伽马1(γ1)、伽马2(γ2)、伽马3(γ3)、伽马4(γ4)、阿尔法1(α1)或阿尔法2(α2)。类似地，每条轻链具有两个区域，即恒定区和可变区。轻链恒定区是卡帕(κ)型或拉姆达(λ)型。各抗体之间的可变区在序列上不同并且以用于给定抗体与其特定抗原的结合和特异性被使用中。
应当理解，当提到本文所述的c-Met抗体的各种示例时，它还涵盖其c-Met抗体片段。c-Met抗体片段包含保持与c-Met特异性结合的能力的本文所述的任何抗体片段或结构域。
在其中抗体被用于治疗性应用的实施方案中，c-Met抗体的一个特性是它可以抑制HGF的结合和c-Met的一种或多种生物活性或由c-Met介导的一种或多种生物活性。此类抗体被认为是中和抗体，因为它们能够抑制HGF结合c-Met并抑制HGF引起c-Met信号传导和/或生物活性。在这种情况下，抗体特异性结合c-Met并且将HGF与c-Met的结合抑制10％到100％的任何值，如至少约20％、21％、22％、23％、24％、25％、26％、27％、28％、29％、30％、31％、32％、33％、34％、35％、36％、37％、38％、39％、40％、41％、42％、43％、44％、45％、46％、47％、48％、49％、50％、51％、52％、53％、54％、55％、56％、57％、58％、59％、60％、61％、62％、63％、64％、65％、66％、67％、68％、69％、70％、71％、72％、73％、74％、75％、76％、77％、78％、79％、80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或更高(例如通过在如本文所述的体外竞争性结合测定中测量结合)。例如，可通过利用本领域内已知的任何合适的测定进行测试来测试c-Met抗体的中和能力。仅出于说明目的，用于测试c-Met信号传导和/或生物活性的抑制的c-Met的额外生物活性(例如，测定读出)的示例包括在细胞离散测定中对细胞离散的体外和/或体内测量。
作为一般结构，本发明的抗体包含(a)骨架和(b)一个或多个CDR。如本文所用的“互补决定区”或“CDR”是指构成用于抗原结合的主要表面接触点的结合蛋白质区。本发明的实施方案包括嵌入抗体的骨架结构中的一个或多个CDR。抗体的骨架结构可以是抗体的框架或其片段或变体，或在性质上可以是完全合成的。下文进一步描述了本发明的抗原结合蛋白质的各种骨架结构的示例。
本发明的抗体包含骨架区和一个或多个CDR。本发明的抗原结合蛋白质可具有1到6个CDR(如天然存在的抗体通常如此)，例如，一个重链CDR1(“H-CDR1”)、和/或一个重链CDR2(“H-CDR2”)、和/或一个重链CDR3(“H-CDR3”)、和/或一个轻链CDR1(“L-CDR1”)、和/或一个轻链CDR2(“L-CDR2”)、和/或一个轻链CDR3(“L-CDR3”)。
在本说明书通篇中关于生物材料(如肽、多肽、核酸、宿主细胞等)使用的术语“天然存在”是指在自然界中发现的材料。在天然存在的抗体中，H-CDR1通常包含约五(5)到约七(7)个氨基酸，H-CDR2通常包含约十六(16)到约十九(19)个氨基酸，并且H-CDR3通常包含约三(3)到约二十五(25)个氨基酸。L-CDR1通常包含约十(10)到约十七(17)个氨基酸，L-CDR2通常包含约七(7)个氨基酸，并且L-CDR3通常包含约七(7)到约十(10)个氨基酸。本发明的各种抗体的特定CDR提供于表1和序列表中。
表1：mAb 2CDR序列
如本文所用的术语"拮抗(antagonize或antagonizing)"是指封阻、阻碍、阻止、降低、抑制、减小或以某种方式干扰相关目标蛋白质如靶受体的生物活性。术语"拮抗剂(antagonist或antagonistic)"是指拮抗目标蛋白质的生物活性的化合物。
当在c-Met抗体的背景下使用时，如本文所用的"内化"包括抗体借以例如通过胞吞作用从细胞表面和/或从周围介质内化到c-Met表达细胞中的任何机制。抗体的内化可使用测量内化的抗体的量的直接测定或测量内化的抗体-毒素缀合物的作用的间接测定来评估。
本发明还提供包含各示例的抗体的VL区、VH区或一个或多个CDR的功能变体的抗体。用于c-Met抗体的背景下的VL、VH或CDR的功能变体仍然允许抗体保持至少相当大比例(至少约50％、60％、70％、80％、90％、95％或更高)的亲本抗体的亲和力(affinity)/亲合力(avidity)和/或特异性/选择性，并且在一些情况下，此类c-Met抗体可相比于亲本抗体以更大亲和力、选择性和/或特异性被缔合。
此类功能变体通常保持与亲本抗体的相当大的序列同一性。两个序列之间的同一性百分比是在考虑了为了所述两个序列的最佳比对而需要引入的缺口数目和每个缺口的长度的情况下，所述序列共有的相同位置的数目的函数(即，同源性％＝相同位置的数目/位置的总数x 100)。两个核苷酸或氨基酸序列之间的同一性百分比可例如使用本领域内已知的算法来确定。另外，两个氨基酸序列之间的同一性百分比可使用本领域技术人员已知的算法来确定。
示例性变体包括相应的共有序列中与亲本在一个或多个"变体"氨基酸位置处不同的那些，所述"变体"氨基酸位置被表示为"*"。
或者或另外，表位变体的序列与共有表位序列的不同之处可主要在于保守置换；例如所述变体中的至少10个、如至少9个、8个、7个、6个、5个、4个、3个、2个或1个置换是保守氨基酸残基置换。
在本发明的上下文中，保守置换可通过下表中反映的氨基酸类别内的置换来限定：
保守置换的氨基酸残基类别
酸性残基 Asp(D)和Glu(E)
碱性残基 Lys(K)、Arg(R)和His(H)
不带电荷的亲水残基 Ser(S)、Thr(T)Asn(N)和Gln(Q)
不带电荷的脂族残基 Gly(G)、Ala(A)、Val(V)、Leu(L)和Ile(I)
不带电荷的非极性残基 Cys(C)、Met(M)和Pro(P)
芳香族残基 Phe(F)、Tyr(Y)和Trp(W)
当在本文中使用时，术语"激动"、"激动剂"和"激动物"是指或描述能够直接或间接地、大幅度地诱导、促进或增强细胞因子生物活性或细胞因子受体激活的分子。
在一个实施方案中，如本文所公开的抗体可特异性结合包含序列IEE或CPD、或IEE或CPDC、或IEE和CPD、或IEE和CPDC或由序列IEE或CPD、或IEE或CPDC、或IEE和CPD、或IEE和CPDC组成的表位。在又一变化形式中，所述表位包含氨基酸序列******IEE***CPD(SEQ IDNO:12)或*IEE***CPDC****(SEQ ID NO:13)或由氨基酸序列******IEE***CPD(SEQ ID NO:12)或*IEE***CPDC****(SEQ ID NO:13)组成。如上文所示，“*”表示任何氨基酸。
在又一变化形式中，包含在被本发明抗体特异性结合的c-Met的α-链中的表位包含如上文所定义的序列******IEE***CPD或由如上文所定义的序列******IEE***CPD组成，所述序列是C***P*IEEP**CPD(SEQ ID NO:14)。在又一变化形式中，序列C***P*IEEP**CPD是CIFSPQIEEPSQCPD(SEQ ID NO:16)。
在另一实施方案中，包含*IEE***CPDC****或由*IEE***CPDC****组成的所述表位的氨基酸序列是*IEEP**CPDC****(SEQ ID NO:15)。在又一变化形式中，所述表位的氨基酸序列是QIEEPSQCPDCVVSA(SEQ ID NO:17)。
在一些变化形式中，得到所述表位的c-Met蛋白质在物种方面可包括但不限于人、鼠科动物、马科动物、牛科动物、猫科动物、绵羊科动物或犬科动物或抗体源，它也不受制备它的方式限制。在一些变化形式中，c-Met蛋白质是人c-Met蛋白质。在一些变化形式中，人c-Met的α-链例如使用杆状病毒表达载体被原核表达。例如，杆状病毒表达系统可用于表达预先克隆于优化的表达载体中的人c-Met的α-链。所述表达载体可被优化用于在昆虫细胞中表达和纯化人c-Met的α-链。蛋白质或多肽的克隆、表达和纯化已在本领域内被充分证明和已知。仅出于说明目的，下文的实施例2中给出了示例。
如本文所公开的抗体在物种方面不受限制，例如，人、鼠科动物、马科动物、牛科动物、猫科动物或犬科动物或抗体来源，它也不受制备它的方式限制。例如，所述抗体包括但不限于单克隆抗体、多克隆抗体、单特异性抗体、多特异性抗体(例如，双特异性抗体)和抗体片段，只要它们仍然展现期望的生物活性。在又一实施方案中，如本文所公开的c-Met抗体是单克隆抗体或多克隆抗体。在一些变化形式中，如本文所公开的抗体是鼠科动物抗体。在其它变化形式中，c-Met抗体是鼠科动物单克隆抗体。
在一些实施方案中，所述抗体可包括但不限于人源化抗体、嵌合抗体、重组抗体、单链抗体、双链抗体、三链抗体(triabody)、四链抗体(tetrabody)、Fab片段、F(ab’)2片段、IgD抗体、IgE抗体、IgM抗体、IgG1抗体、IgG2抗体、IgG3抗体和IgG4抗体。在一些实施方案中，抗体是嵌合抗体。
在某些实施方案中，CDR相对于H-CDR1(即，重链的CDR1等)、H-CDR2、H-CDR3、L-CDR1(即，轻链的CDR1等)、L-CDR2和L-CDR3以及其片段、衍生物、突变蛋白质和变体包含不超过1个、2个、3个、4个、5个或6个氨基酸添加、缺失或置换。
本发明的示例包括包含重链可变区的抗体，所述重链可变区包含重链CDR1(GFTFTDHYMS；SEQ ID NO:2)、重链CDR2(FIRNKAKGYTTE；SEQ ID NO:3)或重链CDR3(ARDGVGIAY；SEQ ID NO:4)中的至少一个或至少两个或全部。
本发明的示例包括包含轻链可变区的抗体，所述轻链可变区包含轻链CDR1(RSSQSLENINGNTYLN；SEQ ID NO:5)、轻链CDR2(RVSNRVS；SEQ ID NO:6)或轻链CDR3(LQVTHVPWT；SEQ ID NO:7)中的至少一个或至少两个或全部。
本发明的示例包括如本文所述的抗体，其中所述抗体包含以下中的至少一个、至少两个、至少三个、至少四个、至少五个或全部的氨基酸序列：抗体mAb 2的重链CDR1(SEQID NO:2)、重链CDR2(SEQ ID NO:3)、重链CDR3(SEQ ID NO:4)和轻链CDR1(SEQ ID NO:5)、轻链CDR2(SEQ ID NO:6)、轻链CDR3(SEQ ID NO:7)。
在其它实施方案中，抗体的重链可变结构域和轻链可变结构域被定义为与参考重链可变结构域和/或轻链可变结构域具有一定的同一性百分比。例如，所述抗体包含A)与SEQ ID NO:8的重链氨基酸序列至少80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％同一性的重链可变结构域氨基酸；和B)与选自由SEQ ID NO:9组成的组的轻链氨基酸序列至少80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％同一性的轻链可变结构域氨基酸。
本发明的示例包括包含具有不超过1个、2个、3个、4个、5个或6个氨基酸添加、缺失或置换的SEQ ID NO:8的重链可变区和/或SEQ ID NO:9的轻链可变区的抗体。在再一实施方案中，所述抗体具有SEQ ID NO:8的重链或与SEQ ID NO:8至少95％、或96％、或97％、或98％相同的序列。在又一实施方案中，所述抗体具有SEQ ID NO:9的轻链或与SEQ ID NO:9至少95％、或96％、或97％、或98％相同的序列。
本发明的变化形式包括包含SEQ ID NO:9的轻链可变区的抗体。本发明的示例包括包含具有不超过1个、2个、3个、4个、5个或6个氨基酸添加、缺失或置换的SEQ ID NO:9的轻链可变区的抗体。在一个实施方案中，如本文所公开的抗体包含SEQ ID NO:8的轻链可变区或通过与参考轻链可变结构域具有一定的同一性百分比所定义的序列。例如，所述抗体包含为SEQ ID NO:8或与SEQ ID NO:8的重链氨基酸序列至少80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％相同的轻链可变结构域氨基酸。在再一实施方案中，所述抗体具有SEQ ID NO:8的重链或与SEQ ID NO:8至少95％、或96％、或97％、或98％相同的序列。
在一些实施方案中，所述抗体包含选自由以下组成的组的氨基酸序列：
A.a.与Ab2L的轻链可变结构域序列(SEQ ID NO:9)至少80％相同的轻链可变结构域序列；
b.与Ab2H的重链可变结构域序列(SEQ ID NO:8)至少80％相同的重链可变结构域序列；或
c.(a)的轻链可变结构域和(b)的重链可变结构域；和
B.与以下序列的每个CDR不同不超过总共3个氨基酸添加、置换和/或缺失的轻链CDR1、轻链CDR2、轻链CDR3和重链CDR1、重链CDR2、重链CDR3：
a.抗体Ab2的轻链CDR1(SEQ ID NO:5)、轻链CDR2(SEQ ID NO:6)、轻链CDR3(SEQID NO:7)和重链CDR1(SEQ ID NO:2)、重链CDR2(SEQ ID NO:3)、重链CDR3(SEQ ID NO:4)；其中所述抗体特异性结合包含于c-Met的α-链中的表位。
在另一实施方案中，如上文所定义的抗体可包含具有Ab2L/Ab2H的轻链可变结构域和重链可变结构域的氨基酸序列(SEQ ID NO:9/SEQ ID NO:8)；其中所述抗体特异性结合包含于c-Met的α-链中的表位。
在再一实施方案中，如上文所述的抗体包含具有Ab2的轻链CDR1(SEQ ID NO:5)、轻链CDR2(SEQ ID NO:6)、轻链CDR3(SEQ ID NO:7)和重链CDR1(SEQ ID NO:2)、重链CDR2(SEQ ID NO:3)、重链CDR3(SEQ ID NO:4)的氨基酸序列；其中所述抗体特异性结合包含于c-Met的α-链中的表位。
在一些实施方案中，本发明的抗体可与药剂偶合。如本文所公开的抗体或其片段可与所述药剂缀合、融合或偶合。所述抗体的缀合可通过本领域技术人员已知的方法来实现。缀合可包括接头和/或间隔物。例如，曲妥珠单抗(Trastuzumab)-DM1(T-DM1；曲妥珠单抗埃姆坦西尼(trastuzumab emtansine))由利用不可还原的硫醚接头N-琥珀酰亚胺基-4-(N-马来酰亚氨基甲基)-环己烷-1-羧酸酯(SMCC，在缀合后被命名为MCC)连接的人源化抗体曲妥珠单抗和DM1(类美登素(maytansinoid)衍生物)构成。类美登素是天然产物，它们是有效的抗有丝分裂剂，与长春花生物碱一样，阻止微管装配。
将所述接头与抗体交联以将药物适当地递送到预定的细胞区室。通过药物或化学交联试剂与所述抗体上的溶剂可及的反应性氨基酸如赖氨酸和半胱氨酸的反应来构建抗体-药物缀合物。在一些示例中，接头可以是可切割的，如肽、腙或二硫化物接头，或不可切割的，如硫醚。例如，叠氮化物-炔烃“点击”生物缀合化学可用于连接接头与抗体。在一些示例中，可将聚乙二醇(PEG)或PEG样衍生物添加到接头以改善其溶解性。接头固有地具有比它们的抗体对应物更短的半衰期，且因此通常需要被修饰。
可切割的接头可在细胞溶质中由于还原性更高的环境(例如基于二硫化物的接头)而被切割，在溶酶体的胞内区室内由于相比于系统性血液循环更低的pH(例如连接到通过链间二硫键还原生成的抗体硫醇基的腙接头)而被切割，或通过溶酶体蛋白酶的酶促水解(例如在肽接头的情况下)而被切割。
在一个实施方案中，偶合到本发明抗体的药剂是细胞毒性剂。细胞毒性剂可以是可切割的或不可切割的。在又一实施方案中，如本文所公开的抗体或其片段偶合到药剂，所述药剂包括但不限于mertansine(Meytansinoid DM1；N2’-去乙酰基-N2’-(3-巯基-1-氧代丙基)-美登素)、美登素衍生物4(DM4)、埃姆坦西尼(通过-4-3-巯基-2,5-二氧代-1-吡咯烷基甲基)-环己烷羧酸接头连接到抗体的mertansine)、单甲基奥里斯他汀(auristatin)E(MMAE)、单甲基奥里斯他汀F(MMAF)、篦麻毒素、白喉毒素、多柔比星(doxorubicin)、铜绿假单胞菌(Pseudomonas aeruginosa)外毒素、来自加利车霉素(calicheamicin)类别的抗肿瘤剂和吡咯并苯并二氮杂卓。
在另一实施方案中，提供编码如本文所公开的抗体的核酸，其中重链包含如SEQID NO:10中所示的序列。在又一实施方案中，提供编码包含至少一重链互补决定区(CDR)氨基酸序列的重链可变区的核酸，所述氨基酸序列包括但不限于SEQ ID NO:2、SEQ ID NO:3和SEQ ID NO:4。
在另一实施方案中，提供编码如本文所公开的抗体的核酸，其中轻链包含如SEQID NO:11中所示的序列。在又一实施方案中，提供编码包含至少一轻链互补决定区(CDR)氨基酸序列的轻链可变区的核酸，所述氨基酸序列包括但不限于SEQ ID NO:5、SEQ ID NO:6和SEQ ID NO:7。所述核酸可具有SEQ ID NO:10或SEQ ID NO:11的核苷酸序列。
如本文所用的术语"核酸"是指以单链或双链形式存在的脱氧核糖核苷酸或核糖核苷酸的聚合物。除非另有提到，否则多核苷酸包括RNA和DNA(基因组DNA和cDNA)序列以及天然多核苷酸的类似物。
所述核酸还包括编码特异性结合c-Met蛋白质的α-链的抗体的重链可变区和轻链可变区的氨基酸序列的核苷酸序列和与其互补的核苷酸序列。互补序列包括完全互补的序列和基本上互补的序列，其可在本领域已知的严格条件下与编码特异性结合c-Met蛋白质的胞外区的抗体的重链可变区和轻链可变区的氨基酸序列的核苷酸序列杂交。实现适度严格的条件的一种方式涉及使用含有5xSSC、0.5％SDS、1.0mM EDTA(pH 8.0)的预洗涤溶液、约50％甲酰胺、6xSSC的杂交缓冲液和约55℃的杂交温度(或其它类似的杂交溶液，如含有约50％甲酰胺的杂交溶液，其中杂交温度为约42℃)以及约60℃、在0.5xSSC、0.1％SDS中的洗涤条件。通常，高度严格的条件被定义为如上文的杂交条件，但在大约68℃、0.2xSSC、0.1％SDS下进行洗涤。SSPE(1xSSPE是0.15M NaCl、10mM NaH2PO4和1.25mM EDTA，pH 7.4)可取代杂交和洗涤缓冲液中的SSC(1xSSC是0.15M NaCl和15mM柠檬酸钠)；在杂交完成后进行15分钟洗涤。应当理解，洗涤温度和洗涤盐浓度可根据需要通过应用管控杂交反应和双链体稳定性的基本原理进行调节以实现期望的严格程度，如本领域技术人员已知的。
另外，编码重链可变区和轻链可变区的氨基酸序列的核苷酸序列可被突变。突变包括核苷酸的添加、缺失或置换和氨基酸的非保守或保守置换。编码特异性结合c-Met蛋白质的α-链的抗体的重链可变区和轻链可变区的氨基酸序列的多核苷酸被理解为包括与上述核苷酸序列基本上相同的核苷酸序列。在使用本领域已知的算法进行最大序列比对后，这些基本上相同的核苷酸序列可与原始核苷酸序列具有至少80％同源性、至少90％同源性或至少95％同源性。
根据本发明的一个实施方案，提供重组载体。在一个实施方案中，重组载体包含编码包含至少一种重链互补决定区(CDR)氨基酸序列的抗体重链可变区的多核苷酸，所述重链互补决定区(CDR)氨基酸序列包括但不限于SEQ ID NO:2、SEQ ID NO:3和SEQ ID NO:4；或包含编码包含至少一种轻链互补决定区(CDR)氨基酸序列的抗体轻链可变区的多核苷酸，所述轻链互补决定区氨基酸序列包括但不限于SEQ ID NO:5、SEQ ID NO:6和SEQ IDNO:7。
在一个实施方案中，重组载体包含编码具有SEQ ID NO:8的氨基酸序列的重链可变区的核酸或编码具有SEQ ID NO:9的氨基酸序列的轻链可变区的核酸。在一些实施方案中，重组载体包括编码具有SEQ ID NO:8的氨基酸序列的重链可变区的核酸和编码具有SEQID NO:9的氨基酸序列的轻链可变区的核酸。
在重组载体的一些实施方案中，编码重链可变区的核酸可具有SEQ ID NO:10的核苷酸序列，并且编码轻链可变区的核酸可具有SEQ ID NO:11的核苷酸序列。
本文所用的术语"载体"是指在宿主细胞中运输和表达靶基因的工具，通常为核酸。例如，所述载体可包括质粒载体、粘粒载体或病毒载体，如噬菌体载体、腺病毒载体、逆转录病毒载体和腺相关病毒载体。重组载体可通过操作本领域内已知的质粒、噬菌体或病毒来制备。
在重组载体中，编码重链可变区和轻链可变区的氨基酸序列的核酸可以可操作地连接到启动子。术语"可操作地连接"是指调控转录的核苷酸序列(例如，启动子序列)与其它核苷酸序列之间的官能连接。因此，调控转录的核苷酸序列可调控其它核苷酸序列的转录和/或翻译。
所述重组载体可被构建用于克隆或表达。例如，重组表达载体可以是本领域内已知的用于在植物、动物或微生物中表达外来蛋白质的载体。所述重组载体可使用本领域内已知的各种方法构建。
所述重组载体可被构建用于原核宿主细胞或真核宿主细胞中。当原核细胞被用作宿主细胞时，表达载体通常包括能够起始转录的强启动子、用于起始翻译的核糖体结合位点和转录/翻译终止序列。当真核细胞被用作宿主细胞时，载体可含有复制起点。用于真核宿主细胞的表达载体中的启动子可源自哺乳动物细胞基因组或哺乳动物病毒。用于真核宿主细胞的表达载体中的转录终止序列通常是聚腺苷酸化序列。
能够表达抗体的重链可变区和轻链可变区的载体系统可涉及重链可变区和轻链可变区从单载体的同时表达或重链可变区和轻链可变区从单独载体的独立表达。在后一系统中，两种载体可通过共转化或靶向转化被引入到宿主细胞中。
根据本发明的一个实施方案中，提供了一种宿主细胞，其包含编码具有SEQ IDNO:8的氨基酸序列的重链可变区的多核苷酸和编码具有SEQ ID NO:9的氨基酸序列的轻链可变区的多核苷酸。
可利用包含编码具有SEQ ID NO:8的氨基酸序列的重链可变区的多核苷酸和编码具有SEQ ID NO:9的氨基酸序列的轻链可变区的多核苷酸的重组载体转化所述宿主细胞。
能够稳定地且连续地克隆或表达所述重组载体的宿主细胞可以是本领域内已知的任何宿主细胞。可使用本领域内已知的方法将所述核酸或包含其的重组载体转移到宿主细胞中。
根据一个实施方案，提供了一种药物组合物，其包含特异性结合如本文所述的c-Met蛋白质的α-链的抗体或其片段。所述药物组合物可进一步包含一种或多种药学上可接受的赋形剂或媒介物或载剂。在其它实施方案中，所述组合物进一步包含抗肿瘤剂、免疫刺激剂、免疫调节剂、皮质类固醇或其组合。在一个实施方案中，抗肿瘤剂是细胞毒性剂、作用于肿瘤新血管系统的药剂或其组合。在另一实施方案中，免疫调节剂是细胞因子、趋化因子、佐剂或其组合。在再一实施方案中，免疫刺激剂是白介素-2、α-干扰素,γ-干扰素、肿瘤坏死因子-α、免疫刺激性寡核苷酸或其组合。在又一实施方案中，皮质类固醇是泼尼松(prednisone)和多西紫杉醇(docetaxel)。
在一个实施方案中，本发明的抗体可用于治疗/预防癌症的方法中。所述方法包括施用药学上有效量的如上文和这里所述的抗体、其片段、核酸或药物组合物。在一些实施方案中，本发明的方法可包括施用药学上有效量的抗体与一种或多种其它的治疗化合物，其中施用是同时的、依序的或分开的。
在又一实施方案中，待通过本发明的抗体治疗或预防的癌症包括但不限于乳腺癌、肺癌(包括但不限于小细胞肺癌和非小细胞肺癌)、肝癌(包括但不限于肝细胞瘤和肝细胞性腺瘤)、胃癌、鳞状细胞癌、肺腺癌、肺鳞状细胞癌、腹膜癌、皮肤癌、皮肤或眼球中的黑素瘤、直肠癌、食道癌、小肠瘤、内分泌腺癌、甲状旁腺癌、肾上腺癌、软组织肉瘤、尿道癌、慢性或急性白血病、癌症、淋巴细胞淋巴瘤、胃肠癌、胰腺癌、胶质母细胞瘤、宫颈癌、卵巢癌、膀胱癌、结肠癌、大肠癌、子宫内膜癌或子宫癌、唾液腺瘤、肾癌、前列腺癌、外阴癌、甲状腺癌或各种类型的头颈癌。
在又一实施方案中，提供用于治疗或预防癌症的方法，其包括施用有效量的如本文所公开的抗体，其中癌症包括但不限于乳腺癌、肺癌、肝癌、胃癌、脑癌、血癌、结肠癌、胰腺癌和前列腺癌。在又一实施方案中，提供如本文所公开的抗体，其用以制造用于治疗和/或预防癌症的药剂。在一些实施方案中，待治疗或预防的癌症可以是任何形式的癌症。可在本发明中使用任何形式的肿瘤或癌症，包括例如良性肿瘤和转移性恶性肿瘤。癌症的示例包括但不限于脑癌(如胶质母细胞瘤和神经母细胞瘤)、血癌(如淋巴瘤和白血病)、结肠癌、胰腺癌、前列腺癌、胃癌、肺癌、乳腺癌、膀胱癌、黑素瘤、头颈癌、食道癌和宫颈癌。肿瘤的其它示例包括但不限于血液学恶性肿瘤和实体瘤。实体瘤包括例如起因于结缔组织支持组织的肉瘤、起因于身体的腺细胞和上皮细胞的癌瘤或淋巴瘤、淋巴组织如淋巴节、脾和胸腺的癌症。
在一个实施方案中，提供诊断癌症的方法，其包括通过施用用于检测c-Met的如本文所公开的抗体来检测c-Met的异常表达。如本文所用的术语“异常表达”涉及与在健康组织或未患有包括癌症在内的疾病或未处于患有包括癌症在内的疾病的风险的健康个体中发现的c-Met蛋白质、c-MetcDNA和/或RNA的表达显著不同的c-Met蛋白质、c-Met cDNA和/或RNA的表达。在又一实施方案中，提供如本文所公开的抗体用于检测具有异常c-Met表达的细胞的用途。在再一实施方案中，提供如本文所公开的抗体作为癌症预后标志物的用途。
在一些实施方案中，如上文和这里所述的药物组合物可进一步包含治疗化合物(或药剂或分子或组合物)。如本文所定义的“治疗”化合物是能够实现以下目的的化合物(或药剂或分子或组合物)：预防性地作用而防止发生虚弱状态和/或不健康状态；和/或向受试者提供足够量的复合物或其药物组合物或药剂以减轻或消除疾病状态和/或疾病状态的症状以及虚弱状态和/或不健康状态。在一个示例中，治疗化合物包括但不限于促进凋亡的化合物、化学治疗化合物或能够减轻消除患者的癌症的化合物。促进凋亡的化合物的示例包括但不限于细胞周期蛋白依赖性激酶(CDK)抑制剂、受体酪氨酸激酶(RTK)抑制剂、BCL(B-细胞淋巴瘤)家族BH3(Bcl-2同源结构域3)-模拟抑制剂和共济失调性毛细血管扩张症突变(ATM)抑制剂。
如本文所用的术语"治疗"意指提供药学上有效量的本发明肽或其相应的药物组合物或药剂，足以预防性地作用而防止发生虚弱状态和/或不健康状态；和/或向受试者提供足够量的复合物或其药物组合物或药剂以减轻或消除疾病状态和/或疾病状态的症状以及虚弱状态和/或不健康状态。
在一些实施方案中，提供如本文所述的抗体用于蛋白质纯化、或用于中和、破坏、调节、拮抗或用于抑制蛋白质-蛋白质相互作用(例如c-Met-HGF相互作用，由此影响c-Met-HGF轴)的用途。
具体的说明性实施方案
抗-α-链c-Met抗体的产生和初始表征
将人c-Met的α-链原核表达并纯化。纯化的α-链被使BALB/c小鼠免疫。为了获得产生抗-α-链c-Met抗体的杂交瘤细胞，将经免疫的小鼠的脾细胞与SP2/0-Ag14细胞融合。对杂交瘤细胞进行单细胞克隆并且主要通过蛋白质印迹法和细胞染色筛选来自单克隆杂交瘤克隆的细胞上清液的抗-α-链c-Met反应性。在一级抗体和二级抗体筛选(图1D)后，针对同种型表征和表位定位选择21个抗体的组。通过将市售分型条浸入单克隆杂交瘤上清液中进行抗体分型。所有21个单克隆抗体共有相同的IgG同种型(而不是相同的亚类)和κ轻链(表2)。
鉴别c-Met被抗体结合的区域在确定抗体是否能够封阻c-Met与其配体HGF的结合方面是重要的。使用基于ELISA的测定(肽扫描)，将合成的肽添加到经抗生蛋白链菌素涂覆的板中并且对抗体与其各自表位的结合进行比色确定。所述肽是跨越整个c-Metα-链的连续重叠肽。从21个所测试的单克隆细胞上清液中鉴别出总共10个来自α-链的不同抗体结合区，表明不存在一个高度免疫原性的主要区域。
表1：抗-α-链c-Met单克隆抗体的表位定位和分型。
c-Metα-链上的抗体结合区的简化图示于图1A中。抗体结合区也被定位到PDB保藏号为1SHY的c-Met的晶体结构上(图1B和图1C)。初始抗体表征结果概述于表2中。
纯化的抗-α-链c-Met单克隆抗体的进一步表征
从21个单克隆抗体的组中选择11种抗体用于腹水产生和纯化。通过蛋白质印迹法、免疫沉淀、流式细胞术和通过细胞离散的激动剂/拮抗剂活性来进一步表征纯化的抗体。
使用蛋白质A珠粒从小鼠腹水中纯化抗-α-链c-Met单克隆抗体。在SDS-PAGE凝胶上分离纯化的抗体并且用考马斯蓝(Coomassie blue)染料染色(数据未显示)。除了对应于抗体的重链(约51kD)和轻链(约25kD)的预计的两个带之外，在考马斯染色的凝胶中没其观察到它蛋白质带，表明从小鼠腹水对单克隆抗体的纯化是成功的。
为了确保单克隆抗体在腹水产生和纯化后保持其抗-α-链活性，通过蛋白质印迹法来表征纯化的单克隆抗体(图2)。使用1μg/mL纯化的单克隆抗体来检测纯化的c-Metα-链、在转染NIH3T3细胞后表达的c-Met和U-87MG细胞中的内源性c-Met。除了mAb 13和mAb15之外，所有单克隆抗体均成功地检测到纯化的c-Metα-链、转染的c-Met和内源性人c-Met。mAb 13和15对c-Met具有低特异性。相比于mAb 13和mAb 15，mAb 2和mAb 14被观察到对c-Met具有更高的亲和力。相比于mAb 2、mAb 13、mAb 14和mAb 15，mAb 4、mAb 8、mAb 16、mAb 17和mAb 18具有对c-Met更高的亲和力和更少的非特异性带。尽管识别了不同的表位(图1A)，但多数抗-α-链c-Met单克隆抗体与mAb 11和mAb 12共有相同的带识别图谱。这表明mAb 11和mAb 12的带型是完全特异性的。因此，mAb 11和mAb 12是在蛋白质印迹上使用的最好的单克隆抗体，因为它们以良好的亲和力和特异性检测c-Met。辣根过氧化物酶(HRP)与mAb 12缀合(mAb 12-HRP)并且被用作该研究中的工具用于检测前体c-Metα-链和成熟c-Metα-链。
为了进一步表征单克隆抗体对c-Metα-链的反应性，使用所述抗体使来自SNU-5细胞溶解产物的内源性c-Met免疫沉淀。SNU-5是表达高水平的c-Met的人胃细胞系。通过蛋白质印迹法(图3)使用商业SC-10抗体和AF276抗体来分析免疫沉淀的细胞溶解产物。虽然SC-10抗体和AF276抗体是针对c-Met的不同区域产生的，但SC-10和AF276两者共有类似的蛋白质印迹带谱。我们的单克隆抗体中的多数成功地使170kD前体c-Met(连接一起的α-链和β-链)免疫沉淀。有趣的是，还在蛋白质印迹上观察到对应于成熟c-Metβ-链的145kD蛋白质带，表明c-Metβ-链与其α-链一起被拉下(pulled down)。为了确保使成熟α-链免疫沉淀，使用mAb 12-HRP(从该筛选产生)分析蛋白质印迹上的相同的免疫沉淀的SNU-5细胞溶解产物。也在该筛选中产生的mAb 8和mAb 18与HRP缀合并且也被用于检测c-Metα-链。mAb 8、mAb 12和mAb18识别c-Met上的不同表位(图1A)，但所有HRP-缀合抗体均成功地强烈地检测到成熟c-Metα-链和前体c-Met。
使用流式细胞术来确定我们的单克隆抗体是否可以结合活细胞上的天然c-Met。将SNU-5细胞与1μg/mL单克隆抗体培育。使用与FITC染料缀合的抗小鼠二级抗体检测抗-α-链c-Met单克隆抗体与SNU-5细胞的细胞表面上表达的天然c-Met的结合。在该测定中使用T47D(表达低水平的c-Met的人乳腺癌细胞系)来确定所述抗体是否非特异性地结合细胞表面。经纯化的单克隆抗体处理的T47D细胞的流式细胞术结果与阴性对照(仅二级抗体)不可区分，表明单克隆抗体并不非特异性地结合细胞表面(数据未显示)。利用SNU-5细胞获得的流式细胞术结果显示所述抗体属于对天然c-Met具有不同荧光强度的三个不同组：强荧光强度、中等荧光强度和弱荧光强度(图4)。mAb 2和mAb 13在该测定中显示最强的荧光强度。mAb 8、mAb 11、mAb 12和mAb 17显示中等荧光强度，而mAb 4、mAb 14、mAb 15、mAb 16和mAb18显示弱荧光强度(如通过小的峰位移所证实)。
细胞离散是c-Met激活的生物标志之一。靶向c-Met的激动剂二价单克隆抗体将激活c-Met并使细胞变得移动和分散。这里，我们检查了纯化的抗-α-链c-Met单克隆抗体对细胞离散的作用。以低密度接种HaCaT细胞并且使其生长直到集落形成。细胞血清饥饿24hr然后与1μg/mL单克隆抗体培育24hr。然后将细胞固定并用结晶紫染色。作为对照，用10ng/mLHGF诱导HaCaT细胞的细胞离散(图5)。非特异性IgG(小鼠IgG)的存在不影响离散。抗-HGF抗体和SU11274被用作对照。SU11274是c-Met的小分子抑制剂。经抗-HGF和SU11274处理的细胞集落保持圆形。在仅用单克隆抗体处理的细胞中没有观察到细胞离散(图5)。这表明单克隆抗体不是针对c-Met激活的细胞离散的激动剂。
mAb 2和mAb 13降低SNU-5细胞中的细胞生长
mAb 2和mAb 13在流式细胞术中显示与天然c-Met的最强结合。为了确定这些抗体对肿瘤细胞是否具有任何生理作用，将10μg/mL mAb添加到SNU-5细胞中。在72hr抗体处理后，记录mAb 2和mAb 13对SNU-5细胞活力和半胱天冬酶激活的作用(图7A)。在流式细胞术中分别表现中等亲和力和弱亲和力的mAb 11和mAb 18被用作对照。SU11274显示细胞活力的显著降低和高半胱天冬酶激活。这表明SU11274机制模式是通过激活半胱天冬酶，这进而导致SNU-5肿瘤细胞的凋亡。相比之下，用mAb 2或mAb 13处理的细胞具有降低的细胞活力以及还有降低的半胱天冬酶激活。为了确定抗-α-链单克隆抗体对细胞生长的作用，在抗体处理后72小时进行细胞计数，mAb 2显示最强的细胞生长降低，其次是mAb 13。mAb 18具有略微降低的细胞生长，而mAb 11没有作用(图7A)。
为了进一步证实抗-α-链单克隆抗体对细胞生长的作用，在抗体处理之前预先用CellTracker green BODIPY染料将SNU-5细胞染色。CellTracker BODIPY染料是自由进入细胞的膜透性染料。一旦在细胞中，所述染料就被转化为将细胞标记为绿色的膜不透性产物。所述染料被传送到到分裂的子细胞上，但不可转移到相邻细胞。分裂细胞将未能保留绿色染料，因为它被稀释到后代细胞中。用10μg/mL单克隆抗体将细胞处理6天并且通过流式细胞术分析细胞中的染料保留。如所预计的，未处理的细胞、经mAb11和mAb 18处理的细胞中的荧光强度的水平下降到类似于未染色的细胞的水平(图7B和图7C)。mAb 2和mAb 13保留了绿色荧光的显著水平，表明细胞生长降低。
mAb 2和mAb 13在SNU-5细胞中的内化
为了确定在抗体结合时mAb 2和mAb 13是否内化到细胞中，将SNU-5细胞与10μg/mL抗-α-链单克隆抗体培育。将经单克隆抗体处理的细胞固定并透化。通过抗小鼠的缀合的二级抗体检测结合的和内化的抗体。通过共焦显微镜检查观察抗体定位。在4℃下，观察到mAb 2和mAb 13两者的染色定位于具有扩散的胞质染色的细胞膜上(图8)。细胞表面上的抗体定位在37℃下变得较不突出，而在胞质中观察到增加的染色。胞质染色被观察到在细胞中累积，表明mAb 2和mAb 13在结合c-Met时被内化并且在细胞内累积。
mAb 2的温度敏感性
为了确定温度是否影响抗-α-链单克隆抗体与天然c-Met的结合亲和力，将mAb 2、mAb 13、mAb 11和mAb 18与活的SNU-5细胞在4℃或37℃下孵育。使用与染料缀合的抗小鼠二级抗体检测单克隆抗体与在活的SNU-5细胞的细胞表面上表达的天然c-Met的结合并且通过流式细胞术加以分析。在不同的温度下比较与荧光强度相关的抗体结合。有趣的是，每种抗体均在不同温度之间表现峰位移(图9)，表明在4℃下抗体结合的降低。在所测试的4种抗体中，mAb 2显示最显著的峰位移。抗体结合的降低似乎可能归因于活的SNU-5细胞上表达的天然c-Met上的抗体表位的不可利用性。c-Met在正常的生理温度下是动力蛋白质并且在低温下变得僵硬，从而使某些表位被隐匿。
mAb 2表位的详细定位
先前的肽扫描分析被设计成将抗体表位缩小在最多15个氨基酸残基内，这些残基并非全部可能参与抗体-Met相互作用。为了进一步理解在低温下抗体结合的降低，对mAb 2的表位更详细地定位。mAb 2的肽扫描分析证实mAb 2以相等的亲和力结合肽O28和肽O29。这表明mAb 2的表位被两种肽共有。为了鉴别对于mAb 2相互作用至关重要的残基，合成肽O28和肽O29的变化形式，其中每个氨基酸残基被丙氨酸残基置换。利用先前所用的相同的基于ELISA的测定，将纯化的mAb 2添加到每种经丙氨酸置换的肽中。抗体与肽的相互作用的丧失将证实被置换的氨基酸残基在mAb 2-Met相互作用中的重要性。
mAb 2表位的全面定位揭示对于mAb 2–Met相互作用至关重要的残基不是连续残基。这与mAb 2的被观察到的特性一致，即mAb 2对天然c-Met具有高亲和力且对变性的c-Met没有亲和力。只有当蛋白质呈其三级构象时，不连续残基才会并列且会合而形成用于蛋白质-蛋白质相互作用的位点。关键残基到c-Met的晶体结构(PBD保藏号为1SHY)上的定位揭示了所述残基属于两个簇(图10)。一个簇(以粉红色表示)暴露于c-Met的表面上，而第二个簇(以蓝绿色表示)被包埋在c-Met内。
c-Met是参与各种各样的生物活性如细胞增殖、细胞运动性、血管生成和形态发生的酪氨酸激酶受体。c-Met的异常表达与肿瘤侵袭和癌症进展相关。还已知c-Met的表达引起对HER2、EGFR和B-RAF治疗的药物抗性。因此，c-Met是用于癌症疗法的有吸引力的靶标。
本发明人已开发出针对人c-Met的α-链的一组鼠科动物单克隆抗体。本发明人通过蛋白质印迹法、免疫沉淀、流式细胞术、表位定位和对c-Met的激动剂/拮抗剂活性对所述抗体进行了表征。α-链被用作免疫原，因为它是在其它c-Met片段(全长β-链、胞外β-链、c-Met的胞外结构域)中被最好表达的且最有免疫原性的。与商业抗体(SC-10和AF276)的比较已揭示本发明抗体在免疫印迹法中的优良性能。mAb 11和mAb 12是用于蛋白质印迹法的最好抗体，因为它们对c-Met表现出了良好的亲和力和特异性。另外，如本文所公开的抗体能够在免疫沉淀和ELISA中起作用。相比于现用商业抗体具有更高亲和力和特异性且以各种生物化学技术被表征的抗体将是用于c-Met进一步研究的有价值的工具。最后，商业c-Met抗体作为癌症预后标志物的可靠性已受到质疑。在被检查以定量c-Met蛋白质水平的5种商业c-Met抗体中，一些抗体具有批次变异，而其它具有不可再现的结果。这强调了需要开发和表征可靠的c-Met抗体。
尽管使用原核表达的变性蛋白质作为免疫原，但仍然可能获得识别天然c-Met蛋白质的抗体。通过蛋白质印迹法显示对c-Met的差亲和力和差特异性的mAb 13，与mAb 2一起产生了通过流式细胞术确定的最高荧光染色。明显地，mAb 2和mAb 13表位处于c-Met天然构象中。在SNU-5细胞中，mAb 2和mAb 13不激活半胱天冬酶激活且不引起如通过膜联蛋白V染色的缺乏所表明的细胞死亡。使用衰老标志物和自吞噬标志物(分别为p16和LC-3)对经抗体处理的细胞的蛋白质印迹分析对于此类事件为阴性(数据未显示)。通过mAb 2或mAb13与c-Met的结合，这些抗体诱发的唯一功能作用是SNU-5细胞生长的降低。然而，在DNA合成期间合并BrdU在经抗体处理的细胞与未经处理的细胞之间未显示显著差异。最后，本发明的抗体在细胞离散中对c-Met是非激动性的。
考虑到抗体工程的进展，有若干种方式可将抗体工程化用于癌症疗法和诊断。mAb2和mAb 13以高亲和力和特异性结合活的SNU-5细胞上的内源性c-Met。免疫荧光染色证实最有可能通过胞吞作用介导的mAb 2和mAb13被内化到肿瘤细胞中。组合分子成像技术和纳米技术，可将c-Met抗体工程化成用于体内肿瘤成像的强大工具。这将提供关于肿瘤生理学的有价值的信息，这将有助于改善癌症诊断、预后和疗法。c-Met抗体还可被工程化以将毒性有效载荷携带到肿瘤细胞中并杀死肿瘤细胞。
本发明人已证明用10μg/mL抗-α-链c-Met单克隆抗体处理SNU-5细胞。如本领域内众所周知的，使用更高浓度的抗体进行处理也似乎是可能的。在更高浓度下测试如本文所公开的抗体可提供对于我们的抗体的作用模式的更好认识。
使用单克隆抗-Met抗体对c-Met-诱导的生物活性的部分抑制在本领域内已被描述。抗-Met抗体DN-30抑制其它的经c-Met-诱导的生物活性，但不抑制细胞运动性。从与DN-30相同的免疫产生的另一单克隆抗体(DO-24)是能够诱发完全c-Met活性的完全激动剂。已证实，需要超过三种单克隆抗体来完全抑制c-Met结合。通过HGF对c-Met激活的分子机制仍不清楚。该相互作用比先前所考虑到的更为复杂，并且从这些抗体研究，很明显存在负责诱发各种c-Met活性的关键相互作用位点。另外，mAb 2隐性表位的揭示表明c-Met是动力蛋白质并且这进一步说明我们对于c-Met生理学的理解的缺乏。mAb 2将可能类似于识别仅在肿瘤细胞上表达的隐性表位的EGFR 806抗体。
本文所说明性地描述的本发明可在不存在本文未明确公开的任何一种或多种要素、一种或多种限制的情况下被合适地实施。因此，例如，术语"包含"、"包括"、"含有"等应当被宽泛地解读并且没有限制。另外，本文所采用的术语和表达是以描述而非限制的术语被使用，并且使用这些术语和表达并不意在排除所显示和描述的特征或其部分的任何等同物，而应认识到可在所要求保护的本发明范围内作出各种修改。因此，应当理解，虽然已经通过优选实施方案和任选特征具体地公开了本发明，但本领域技术人员可采用本文所公开的优选实施方案和任选特征中所体现的本发明的修改和变更，并且认为此类修改和变更在本发明范围内。
本文已对本发明进行了宽泛的和一般性的描述。落入该一般公开的每个较窄的类和亚组也构成本发明的一部分。这包括带有将任何主题从一般性中去除的附带条件或负面限制来一般性地描述本发明，而不管被除去的内容是否在本文中明确述及。
其它实施方案在以下权利要求书和非限制性实施例内。
材料和方法
细胞系和试剂
所有细胞均被维持在37℃的5％CO2加湿的培育器中。在具有高葡萄糖与丙酮酸钠的达尔伯克改良必需培养基(Dulbecco’s Modified Essential Medium)(DMEM)中培养的HaCaT细胞、U-87MG细胞和鼠科动物NIH3T3细胞是分别来自Birgit Lane(Institute ofMedical Biology(IMB),Singapore)、Nick Leslie(Division of Cell Signalling andImmunology,University of Dundee)和Axel Ullrich(Institute of Medical Biology(IMB),Singapore)实验室的慷慨礼物。SNU-5细胞购自Korean Cell Line Bank。在RPMI1640培养基中培养T47D细胞和SNU-5细胞。DMEM和RPMI得自Invitrogen(U.S.A)。所有组织培养基均补充有从HyClone Laboratories/Thermo Scientific(U.S.A)获得的10％热灭活的胎牛血清。
重组人HGF(编号294-HG)和抗-人HGF(编号MAB294)购自R&D Systems(U.S.A)。SU11274(c-Met小分子抑制剂)购自Calbiochem/Merck(Germany，编号448101)。根据制造商的方案将CellTracker Green BODIPY染料(Invitrogen编号C2102)再悬浮于DMSO中。
细胞收获和细胞溶解
在刮掉细胞之前用冷PBS冲洗细胞培养板/细胞培养皿。通过离心收集细胞。在干冰上快速冷冻细胞沉淀物之前去除PBS。使用含有完整的蛋白酶抑制剂(Roche,UnitedKingdom，编号11697498001)的NP40溶解缓冲液(1％NP40,150mM NaCl,50mM Tris-HCL pH8.0)在冰上溶解冷冻的细胞沉淀物。将细胞溶解产物以10,000xg离心并且回收上清液用于分析。使用BCA试剂盒(Pierce/Thermo Scientific)，根据制造商的方案进行蛋白质定量。
c-Metα-链的克隆、原核表达和纯化
首先使用TOPO TA克隆试剂盒(Invitrogen)将c-Metα-链从含有全长人c-MetcDNA(Invitrogen编号IOH36570)的入门载体(entry vector)克隆到pCR2.1载体(Invitrogen)中。使用c-Metα-链引物(αF:5’-GGAATTCCATATGGAGTGTAAAGAGGCACTAGC-3’；SEQ ID NO:24)和αR:5’-GCGGATCCCTATCTCTTTTTTCTCTTTTCTGTGAG-3’；SEQ ID NO:25)进行c-Metα-链的扩增。使用Qiagen(United Kingdom)试剂盒，根据制造商的方案进行所有质粒提取、凝胶提取和PCR产物纯化方案。
对于原核表达来说，将c-Metα-链从pCR2.1载体亚克隆到pET19b载体(Novagen/Merck)中并且转化到BL21pLysS细胞(Invitrogen)中。使经转化的细胞生长直到达到OD6000.4-0.6。通过将IPTG(异丙基-β-D-硫代-半乳糖苷)添加到1mM的最终浓度来诱导蛋白质表达。使培养物生长3hr。通过离心回收细胞并且将其再悬浮于溶解缓冲液(0.3M KCL,50mM KH2PO4,pH 8.0)中。将细胞溶解产物以33,000xg离心。将所得细胞沉淀物再悬浮于含有6M尿素的溶解缓冲液中并且在轻轻搅拌下培育过夜。将得到的悬浮液离心并且将所得上清液用于蛋白质纯化。
使用自动化Profinia蛋白质纯化系统(Bio-Rad)在1mL IMAC(固定化金属亲和色谱)Bio-Scale Mini Cartridge(Bio-Rad,U.S.A)上对原核表达的c-Metα-链进行亲和纯化。将c-Metα-链洗脱并且用于使小鼠免疫以产生抗体。
小鼠免疫和杂交瘤融合
由来自Moravian Biotechnology(Czech Republic)的Borek Vojtesek博士进行抗体产生。简单地说，用从细菌表达的纯化的人c-Metα-链使小鼠免疫。每次注射含有40μg纯化的c-Metα-链。取小鼠尾部流出血(bleed)以测试针对c-Metα-链的免疫反应。将产生针对c-Metα-链的最高免疫反应的两只小鼠处死用于杂交瘤细胞融合。将来自小鼠的脾细胞与SP2/0-Ag14细胞融合，SP2/0-Ag14细胞是小鼠永生骨髓瘤细胞。使杂交瘤细胞在含有次黄嘌呤、氨基蝶呤和胸苷的选择培养基中生长。仅已成功地在脾细胞与永生细胞之间融合的杂交瘤细胞将在选择培养基中存活并生长。
抗体筛选.
与Moravian Biotechnology合作进行抗体筛选。单克隆抗体筛选的概述示于图1bis中。在细胞融合后10天筛选杂交瘤细胞的抗-α-链抗体产生。
分型
使用市售的IsoQuickTM条(Sigma-Aldrich)来表征小鼠单克隆抗体同种型。将分型条在杂交瘤细胞上清液中培育5min。红色测试线将在条上显色。红色测试线的位置取决于抗体的同种型，因此通过参考制造商的分型表来确定抗体的同种型。
肽扫描和丙氨酸扫描
由Mimotopes(Australia)合成通过SGSG接头序列在N-末端处连接到生物素的肽。用于肽扫描的肽：合成跨越c-Met的整个α-链的肽。合成总共55条具有连续重叠序列的肽。每条肽与先前的肽重叠10个氨基酸残基。
用于丙氨酸扫描的肽
肽扫描结果显示mAb 2结合肽O28和肽O29。合成了肽O28和肽O29的变化形式，其中每个氨基酸残基依序被丙氨酸残基置换。在室温下用3％BSA/PBS封阻经抗生蛋白链菌素涂覆的板(Pierce/Thermo Scientific，编号15520)。将所述肽溶解于DMSO中并且根据制造商的建议进行储存。在室温下用每条肽(5μg/mL)涂覆经抗生蛋白链菌素涂覆的板过夜。将孔洗涤后将杂交瘤上清液或纯化的单克隆抗体添加到每个孔中。添加缀合HRP的抗小鼠抗体以检测结合的单克隆抗体。根据制造商说明书新制备ELISA底物(Bio-Rad编号172-1067)溶液并且将其添加到各孔中。通过眼监测色彩变化并且通过添加100mM硫酸来终止反应。在微板读数器(SPECTRAmax PLUS384,Molecular Device,U.S.A)中在450nM下读取吸光度。从Protein Data Base(PDB)获得保藏号为1SHY的c-Met胞外结构域的晶体结构。通过PyMol(DeLano Scientific LLC,U.S.A)软件分析表位的计算机成像。
蛋白质印迹法和所用抗体
针对人c-Met的C-末端胞质区内的肽而产生商购的SC-10抗体(Santa Cruz,U.S.A)并且预计其会识别蛋白质印迹上的c-Met前体(170kD)和成熟c-Metβ-链(145kD)。AF276抗体(R&D systems)是针对c-Met的胞外结构域而产生的山羊抗体。预计AF276抗体会识别蛋白质印迹上的c-Met前体、成熟c-Metβ-链和成熟c-Metα-链。SC-10抗体和AF276抗体两者均以1:10000稀释度被用于蛋白质印迹法。1μg/mL抗-α-链c-Met单克隆抗体被用于蛋白质印迹法。
在对使用MOPs缓冲液(Invitrogen)的4-12％Bis-Tris梯度凝胶(Invitrogen)上进行分析之前，将蛋白质样品与4X LDS样品缓冲液(Invitrogen)和10X样品还原剂(Invitrogen)混合。SeeBlue Plus2蛋白质梯(Invitrogen)被用作分子量梯。使用Bio-Rad湿式转移系统以100V的恒定电流将蛋白质转移到硝酸纤维素膜(0.45μm孔径，Whatman,United Kingdom)上，持续2hr。转移缓冲液含有25mM Tris、192mM和20％甲醇。封阻缓冲液由5％Marvel奶的PBST(PBS中的1％吐温(Tween)20)组成。在与抗体培育之前，在封阻缓冲液中封阻所述膜上的非特异性位点。将所述膜洗涤三次并且在封阻缓冲液中以1:10000稀释度添加二级抗体。从Jacksons Laboratory/Stratech Scientific有限公司(UnitedKingdom)获得与辣根过氧化物酶(HRP)缀合的二级抗体。增强的化学发光(ECL)(Amersham/G.E.Healthcare,United Kingdom)被用于检测蛋白质印迹。
免疫沉淀
通过在如上文所述的NP40溶解缓冲液中溶解细胞来获得细胞溶解产物。将1μg纯化的抗体与细胞溶解产物(200μg–500μg总蛋白质，大约500μL)培育过夜。将洗涤的蛋白质G珠粒(Sigma-Aldrich,U.S.A)添加到所述细胞溶解产物中。通过以18,000x g离心来收集珠粒并且用NP40溶解缓冲液将其洗涤若干次。通过添加2X LDS样品缓冲液来洗脱结合的蛋白质并且在100℃下加热样品。通过以10,000xg离心从洗脱物中去除珠粒。通过SDS-PAGE凝胶分析洗脱物。
流式细胞术
在Flow Cytometry Core Facility(College of Medicine,Dentistry andNursing,University of Dundee,United Kingdom)的帮助下进行流式细胞术。
在1％BSA/PBS中封阻之前，在冷PBS中将SNU-5细胞(1x 106个细胞)洗涤一次。在与抗-α-链c-Met单克隆抗体培育之前，将细胞洗涤两次。使用1μg/mL抗-α-链单克隆抗体。将细胞与缀合FITC的山羊抗小鼠IgG二级抗体(Invitrogen)培育并且最终再悬浮于1％BSA/PBS中。使用Becton Dickinson(U.S.A)FACScan进行流式细胞术。Cell Quest(BectonDickinson)和FlowJo(Tree Star公司，U.S.A)软件被用于数据分析。
温度敏感性
在4℃或37℃下将10μg/mL抗-α-链单克隆抗体与活的SNU-5细胞培育1hr。收获细胞并且在冷PBS中将其洗涤一次。通过缀合的抗小鼠二级抗体(Invitrogen编号A11029)来确定抗体与活细胞的结合。将细胞再悬浮于1％BSA/PBS中并且通过流式细胞术加以分析。
细胞离散测定
将100-200个HaCaT细胞接种于24孔板中并且使其生长直到形成小集落(大约7天)。将细胞血清饥饿24hr。将细胞与纯化的单克隆抗体(1μg/mL)培育24hr然后冷PBS中冲洗两次并且在冰冷的甲醇中固定。然后将细胞在1％结晶紫(Sigma-Aldrich)溶液中染色。使用Zeiss Axiovert 25倒置显微镜观察细胞染色并且使用Canon EOS 1000 D照相机拍照。
细胞活力和半胱天冬酶激活
分别使用发光细胞活力测定和测定(Promega,U.S.A)来确定细胞活力和半胱天冬酶激活。将SNU-5细胞(1x 105个细胞)接种于每个96孔中并且在分析前处理72hr。根据制造商的方案进行细胞活力和半胱天冬酶激活。使用EnVision板读数器(PerkinElmer,U.S.A)读取发光。
使用细胞计数器和CellTracker Green BODIPY染料确定细胞增殖
细胞计数
接种细胞并且用抗-α-链c-Met单克隆抗体将其处理72hr。收获细胞并且使用自动化ADAM细胞计数器(Digital Bio,Korea)计数。
CellTracker Green BODIPY染料
用5μM CellTracker BODIPY染料将SNU-5细胞染色30min。接种染色的细胞并且用抗-α-链c-Met单克隆抗体将其处理6天。收获细胞并且通过流式细胞术来分析活细胞中的染料保留。
免疫荧光
在4℃或37℃下将10μg/mL抗-α-链单克隆抗体与活的SNU-5细胞培育1hr。用PBS将经抗体处理的细胞洗涤一次并且使用Thermo Shandon Cytospin 3 Cytofuge(ThermoScientific)以800rpm持续5min使其沉积到经聚赖氨酸涂覆的载玻片(ThermoScientific，编号5991056)上，并且立即在4％多聚甲醛中固定。然后将细胞在含有0.4％Triton X-100和5％BSA的PBS中封阻并透化。使用抗小鼠的缀合的二级抗体检测结合的抗-α-链c-Met抗体。将鬼笔环肽(phallodin)与二级抗体一起添加。将细胞洗涤后，用4',6'-二脒基-2-苯基吲哚(DAPI)染色并且用含有2.5％DABCO(1,4-二氮杂二环-[2.2.2]辛烷)(Sigma-Aldrich)作为抗漂白剂的液压悬置(hydromount)(NationalDiagnostics,U.S.A)固定。使用Nikon Eclipse E600显微镜观察免疫荧光。
mAb 2表位的全面定位
使用肽扫描分析来确定c-Metα-链被mAb 2结合的区域。在体外(Mimotopes)合成跨越整个α-链的连续重叠肽。由15个氨基酸残基组成的每条肽与每条相邻肽重叠10个氨基酸。利用生物素在N-末端通过SGSG接头序列标记这些肽。将肽添加到96孔板中的单个的经抗生蛋白链菌素涂覆的孔中并且通过充分洗涤去除未结合的肽。为了确定mAb 2在α-链上的结合区域，向每个含肽的孔中添加mAb 2。通过比色测定来检测抗体的结合并且通过450nM下的吸光度计数加以分析。
mAb 2以类似亲和力结合肽O28(CIFSPQIEEPSQCPD)和肽O29(QIEEPSQCPDCVVSA)(图11A)。这表明mAb 2的表位被两种肽共有。为了鉴别肽O28和肽O29内对于mAb 2-Met相互作用至关重要的残基，进行丙氨酸扫描。合成了肽O28和肽O29的变化形式，其中每个氨基酸残基依序被丙氨酸残基置换(表3)。肽P1到P16(具有SEQ ID NO:26到39)和P17到P31(具有SEQ ID NO:40到56)分别衍生自原始的肽O28和肽O29。使用相同的上述基于ELISA的测定，将合成的肽添加到经抗生蛋白链菌素涂覆的孔中并且将纯化的mAb 2添加到每个含肽的孔中。通过450nM下的吸光度读数来确定mAb 2结合。抗体与肽的结合的丧失证实被置换的氨基酸残基在mAb 2-Met相互作用中的重要性。肽O27、肽O1以及无肽被用作阴性对照。有趣的是，虽然肽O28的前10个氨基酸与肽O27重叠，但mAb 2不结合肽O27。
表3：用于mAb 2丙氨酸扫描的肽
在1mM DTT存在下，丙氨酸扫描分析揭示mAb 2未能结合肽P1、肽P7、肽P8、肽P9、肽P10、肽P14、肽P15、肽P17、肽P19、肽P20和肽P25(图12A)。因此，这些肽中的被置换的氨基酸残基参与了mAb 2表位。有趣的是，形成蛋白质结构中的扭结的脯氨酸被观察到是mAb 2表位中的重要残基。这支持肽P14、肽P25和肽P10中由于脯氨酸被丙氨酸置换而丧失mAb 2结合。为了确定在mAb 2结合中起较关键作用的残基，用所述肽滴定mAb2(图12B)。所述肽以与mAb 2的渐增的结合亲和力列于表4中。mAb 2最少地结合肽P1、肽P8和肽P14，表明被置换的残基(分别为‘C’、‘E’和‘P’)对于mAb 2结合是最关键的(图12B和表4)。对未能结合mAb 2的肽的进一步分析显示残基166到168‘IEE’和172到175‘CPDC’形成mAb 2的主要表位。这些残基不是连续残基。脯氨酸残基和残基在mAb 2主要表位中不连续的重要性表明c-Met的天然结构对于mAb 2结合是重要的。这与mAb 2的被观察到的特性一致，即mAb 2对天然c-Met具有高亲和力和特异性且对变性的c-Met没有亲和力(图11C和图11D)。
mAb 2主要表位‘IEE’和‘CPDC’在c-Met的晶体结构(PBD 1SHY)上的的定位揭示‘IEE’(以橙色表示)暴露于c-Met的表面上，而‘CPDC’(以粉红色表示)被包埋于c-Met内(图12C)。mAb 2如何能够结合‘CPDC’尚不清楚，但推测该区域在癌细胞中可能更加突出。mAb 2结合的计算机模拟研究将进一步阐明mAb 2的这一隐性表位。
表4：经丙氨酸置换的肽以mAb 2结合的渐增顺序被列出。
mAb 2scFv的噬菌体表达
将mAb 2重链(VH)和轻链(VL)的可变区克隆到用于抗体单链可变片段(scFv)表达的噬菌体表达载体pIT2中。制备两种mAb 2scFv构建体：VH-VL scFv和VL-VH scFv。mAb 2重链和轻链的核苷酸和蛋白质序列分别列于图13和图14中。
在噬菌体表面上表达mAb 2scFv。为了确定噬菌体表达的scFv是否保持了mAb 2结合特异性，分析表达mAb 2scFv的噬菌体与肽O28和肽O29的结合。使用如前文所述的相同的基于ELISA的测定，，使用缀合HRP的抗噬菌体抗体确定表达mAb 2scFv的噬菌体与肽O28和肽O29的结合。在450nM下分析吸光度。作为阴性对照，使用肽O27并且不使用肽对照。两种mAb 2scFv构建体均结合肽O28和肽O29，表明mAb 2的VH和VL被成功地克隆(图15)。有趣的是，虽然全长鼠科动物mAb 2未显示对肽O28和肽O29的结合偏好，但相比于与肽O28的结合，噬菌体表达的mAb 2scFv的两种构建体均更强烈地结合肽O29。这可能归因于抗体结构/框架的差异。scFv是单价的并且缺乏还含有柔性铰链区的抗体恒定区。这可能影响抗体的柔性、结合亲合力(avidity)和结合亲和力(affinity)。

Claims (25)

1.一种抗体，其特异性结合包含在c-Met的α-链中的表位，
其中所述抗体的重链包含：
由SEQ ID NO:2的序列组成的CDR1；
由SEQ ID NO:3的序列组成的CDR2；和
由SEQ ID NO:4的序列组成的CDR3；以及
其中所述抗体的轻链包含：
由SEQ ID NO:5的序列组成的CDR1；
由SEQ ID NO:6的序列组成的CDR2；和
由SEQ ID NO:7的序列组成的CDR3。
2.根据权利要求1所述的抗体，其中所述抗体具有包含SEQ ID NO:8的序列的重链。
3.根据权利要求1所述的抗体，其中所述抗体具有包含与SEQ ID NO:8的序列至少95％相同的序列的重链。
4.根据权利要求1所述的抗体，其中所述抗体具有包含与SEQ ID NO:8的序列至少96％相同的序列的重链。
5.根据权利要求1所述的抗体，其中所述抗体具有包含与SEQ ID NO:8的序列至少97％相同的序列的重链。
6.根据权利要求1所述的抗体，其中所述抗体包含具有与SEQ ID NO:8的序列至少98％相同的序列的重链。
7.根据权利要求1所述的抗体，其中所述抗体具有包含SEQ ID NO:9的序列的轻链。
8.根据权利要求1所述的抗体，其中所述抗体包含具有与SEQ ID NO:9的序列至少95％相同的序列的轻链。
9.根据权利要求1所述的抗体，其中所述抗体包含具有与SEQ ID NO:9的序列至少96％相同的序列的轻链。
10.根据权利要求1所述的抗体，其中所述抗体包含具有与SEQ ID NO:9的序列至少97％相同的序列的轻链。
11.根据权利要求1所述的抗体，其中所述抗体包含具有与SEQ ID NO:9的序列至少98％相同的序列的轻链。
12.根据权利要求1所述的抗体，其中所述抗体与药剂偶合。
13.根据权利要求12所述的抗体，其中所述药剂是细胞毒性剂。
14.根据权利要求13所述的抗体，其中所述细胞毒性剂选自由mertansine、埃姆坦西尼、单甲基奥里斯他汀E、篦麻毒素、白喉毒素、多柔比星、铜绿假单胞菌(Pseudomonasaeruginosa)外毒素和吡咯并苯并二氮杂卓组成的组。
15.根据权利要求1所述的抗体，其中c-Met是人c-Met。
16.根据权利要求1所述的抗体，其中所述抗体是单克隆抗体或多克隆抗体。
17.根据权利要求1所述的抗体，其中所述抗体是鼠科动物抗体。
18.根据权利要求17所述的抗体，其中所述抗体是鼠科动物单克隆抗体。
19.根据权利要求18所述的抗体，其中所述鼠科动物抗体是人源化的。
20.根据权利要求1所述的抗体，其中所述抗体是嵌合抗体。
21.一种核酸，其编码根据权利要求1-20中任一项所述的抗体。
22.一种药物组合物，其包含根据权利要求1-20中任一项所述的抗体。
23.根据权利要求22所述的药物组合物，其进一步包含一种或多种药学上可接受的赋形剂或媒介物或载剂。
24.根据权利要求1-20中任一项所述的抗体在制造用于治疗和/或预防癌症的药剂中的用途。
25.根据权利要求24所述的用途，其中所述癌症选自由乳腺癌、肺癌、肝癌、胃癌、脑癌、血癌、结肠癌、胰腺癌和前列腺癌组成的组。
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Families Citing this family (6)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN106188293A (zh) * 2015-04-17 2016-12-07 江苏恒瑞医药股份有限公司 抗c-Met抗体和抗c-Met抗体-细胞毒性药物偶联物及其医药用途
TW201813671A (zh) * 2016-10-14 2018-04-16 蘇州盛迪亞生物醫藥有限公司 抗ｃ－Ｍｅｔ抗體－細胞毒性藥物偶聯物的醫藥用途
TWI782930B (zh) 2016-11-16 2022-11-11 美商再生元醫藥公司 抗ｍｅｔ抗體，結合ｍｅｔ之雙特異性抗原結合分子及其使用方法
TW201825515A (zh) * 2017-01-04 2018-07-16 美商伊繆諾金公司 Ｍｅｔ抗體以及其免疫結合物及用途
CN114340684A (zh) 2019-09-16 2022-04-12 瑞泽恩制药公司 用于免疫pet成像的放射性标记的met结合蛋白
CN111647084B (zh) * 2020-06-13 2020-12-01 广东赛尔生物科技有限公司 抗c-MET抗体及其在治疗癌症中的应用

Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN102216333A (zh) * 2008-11-21 2011-10-12 伊莱利利公司 c-Met抗体
WO2011150454A1 (en) * 2010-06-01 2011-12-08 Monash University ANTIBODIES DIRECTED TO THE UNPROCESSED RECEPTOR TYROSINE KINASE c-MET
WO2013051878A2 (en) * 2011-10-05 2013-04-11 Samsung Electronics Co., Ltd. Antibody specifically binding to epitope in sema domain of c-met

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* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
HN2004000285A (es) 2003-08-04 2006-04-27 Pfizer Prod Inc ANTICUERPOS DIRIGIDOS A c-MET
AR074439A1 (es) 2008-12-02 2011-01-19 Pf Medicament Anticuerpo anti-cmet (receptor c-met)
CN103764678A (zh) * 2010-11-03 2014-04-30 阿尔金-X公司 c-Met抗体组合
KR20130037153A (ko) * 2011-10-05 2013-04-15 삼성전자주식회사 항 ｃ-Ｍｅｔ 항체 및 그의 용도

Patent Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN102216333A (zh) * 2008-11-21 2011-10-12 伊莱利利公司 c-Met抗体
WO2011150454A1 (en) * 2010-06-01 2011-12-08 Monash University ANTIBODIES DIRECTED TO THE UNPROCESSED RECEPTOR TYROSINE KINASE c-MET
WO2013051878A2 (en) * 2011-10-05 2013-04-11 Samsung Electronics Co., Ltd. Antibody specifically binding to epitope in sema domain of c-met

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