CN107406503A

CN107406503A - Cd47抗体、方法和用途

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Publication number: CN107406503A
Application number: CN201580073804.7A
Authority: CN
Inventors: J.董; R.卡多索; H.M.周; C.皮伊施
Original assignee: Janssen Pharmaceutica NV
Current assignee: Janssen Pharmaceutica NV
Priority date: 2014-11-18
Filing date: 2015-11-17
Publication date: 2017-11-28
Anticipated expiration: 2035-11-17
Also published as: KR20170081699A; US20180250395A1; WO2016081423A1; IL252198A0; EP3221358A1; ZA201704117B; BR112017010303A2; CN107406503B; PH12017500915A1; JP6857603B2; CA2967379A1; MX2017006485A; EA201791093A1; JP2018502060A; SG11201704058TA; AU2015350190A1; EP3221358B1; US10864268B2; AU2015350190B2

Abstract

本公开整体涉及与CD47特异性结合的单克隆抗体，更具体地涉及不具有显著的血小板聚集活性且不具有显著的血细胞凝集活性的CD47抗体。本公开还提供了产生这些抗体的方法和将这些单克隆抗体用作治疗剂的方法。

Description

CD47抗体、方法和用途

序列表

本申请包含已经以ASCII格式电子提交的序列表，所述序列表据此全文以引用方式并入。所述ASCII副本创建于2015年11月5日，命名为PRD3361WOPCT_SL.TXT，大小为72,842字节。

技术领域

本文的主题整体涉及与CD47结合的抗体。所述抗-CD47抗体可用作血液障碍诸如白血病的治疗剂。

背景技术

分化簇蛋白47(CD47)也称为整合素相关蛋白(IAP)、卵巢癌抗原OA3和Rh-相关的抗原，是一种遍在表达的细胞表面五次跨膜(pentaspan transmembrane)Ig超家族成员。CD47与巨噬细胞上的SIRP-α(信号调节蛋白-α)相互作用，从而抑制吞噬作用。指派该途径的癌细胞逃避吞噬作用并由此促进癌细胞存活(Jaiswal,S.等人，Trends in Immunol 31:212-219,2010)。这是最新发现的肿瘤免疫避免机制；因此治疗学上靶向CD47已广泛应用于多种癌症。

CD47的表达与包括非霍奇金淋巴瘤(NHL)、急性淋巴细胞性白血病(ALL)、急性骨髓性白血病(AML)、卵巢癌、胶质瘤、胶质母细胞瘤等的许多不同恶性肿瘤的较差临床结果相关联。此外，CD47被确认为白血病和实体瘤两者的癌干细胞标记(Jaiswal等人，2009Cell,138(2):271-85；Chan等人，2009Proc Natl Acad Sci USA,106(33):14016-21；Chan等人，2010Curr Opin Urol,20(5):393-7；Majeti R等人，2011Oncogene,30(9):1009-19)。

阻断CD47的抗体已展示出对多种体内肿瘤模型的抗肿瘤活性。阻断CD47与SIRP-α的相互作用能够促进表达CD47的细胞被巨噬细胞吞噬(综述于Chao等人，2012Curr OpinImmunol,24(2):225-32)。此外，这些阻断CD47的抗体已显示与其它治疗性抗体(包括和)在肿瘤模型中协同作用。

然而，已报道CD47抗体引起血小板聚集和红细胞的血细胞凝集。血小板聚集和血细胞凝集是同型相互作用的示例，其中两个表达CD47的细胞在用二价CD47结合实体处理时发生聚集或凝集。例如，已报道CD47抗体MABL作为全长IgG或F(ab')₂导致红细胞的血细胞凝集并且仅当MABL变成scFv或二价scFv时该效应减轻。(参见例如Uno S,Kinoshita Y,Azuma Y等人，2007Oncol Rep,17(5):1189-94)。类似地，已报道CD47抗体B6H12诱导如下某些受试者的血小板直接聚集：具有Fc受体FcγRII的某些多态性(polymormisphms)(DorahyDJ,Thorne RF,Fecondo JV和Burns GF,1997Journal ofBiol.Chem.272:1323-1330).因此，血小板聚集和红细胞的血细胞凝集代表了用现有CD47抗体治疗学上靶向CD47的主要限制。

发明内容

本文描述了这样的抗体：与CD47特异性结合，阻止CD47与SIRP-α相互作用，并且不具有显著的血小板聚集活性。

在一些实施方案中，抗体通过与以下CD47(SEQ ID NO:21，不包括信号序列)氨基酸残基相互作用而与CD47特异性结合：Q1、L3、N27、E29、E97、L101、T102、R103和E104。在一些实施方案中，抗体与以下CD47(SEQ ID NO:21，不包括信号序列)氨基酸残基相互作用：Y37、K39、R45、D46、T49、A53、L54、N55、K56、S57、T58、V59、P60、T61、S64、A66和K67。在一些实施方案中，抗体与以下CD47(SEQ ID NO:21，不包括信号序列)氨基酸残基相互作用：E35、K39、Y37、D46、49、D51、A53、L54、K56、T58、V59、T99、L101和T102。在一些实施方案中，抗体与以下CD47(SEQ ID NO:21，不包括信号序列)氨基酸残基相互作用：E29、Q31、N32、T34、E35、V36、Y37、K39、N41、D46、D51、A53、E97、T99、E100、L101、T102、R103和E104。

某些所述实施方案的另一方面特征在于与人或猕猴CD47特异性结合的抗体，所述抗体包含选自SEQ ID NO:4-6的可变重链。抗体任选地包含选自SEQ ID NO:7和8的可变轻(VL)链区。在一些情况下，抗体包含选自SEQ ID NO:4-6的VH链区和选自SEQ ID NO:7和8的VL链区。在其它方面，抗体具有与包含SEQ ID NO:7的VL链区配对的包含SEQ ID NO:4或SEQID NO:5的VH链区。在另一方面，抗体具有与包含SEQ ID NO:8的VL链区配对的包含SEQ IDNO:6的VH链区。

在一些实施方案中，CD47抗体包含如SEQ ID NO:9或SEQ ID NO:10所示的VH互补决定区1(CDR1)序列、如SEQ ID NO:11或SEQ ID NO:12所示的VH CDR2序列、如SEQ ID NO:13或SEQ ID NO:14所示的VH CDR3序列、如SEQ ID NO:15或SEQ ID NO:16所示的VL CDR1序列、如SEQ ID NO:17或SEQ ID NO:18所示的VL CDR2序列以及如SEQ ID NO:19或SEQ IDNO:20所示的VL CDR3序列。例如，CD47抗体包含如SEQ ID NO:9所示的VH CDR1序列、如SEQID NO:11所示的VH CDR2序列、如SEQ ID NO:13所示的VH CDR3序列、如SEQ ID NO:15所示的VL CDR1序列、如SEQ ID NO:17所示的VL CDR2序列以及如SEQ ID NO:19所示的VL CDR3序列。在另一个示例中，CD47抗体包含如SEQ ID NO:10所示的VH CDR1序列、如SEQ ID NO:12所示的VH CDR2序列、如SEQ ID NO:14所示的VH CDR3序列、如SEQ ID NO:16所示的VLCDR1序列、如SEQ ID NO:18所示的VL CDR2序列以及如SEQ ID NO:20所示的VL CDR3序列。

在一些实施方案中，抗体与CD47在如下位置结合：其中VH链与CD47的接触比VL链更为广泛，其中抗体的VH链被定位在表达CD47的细胞的膜附近，并且其中抗体的VL链阻塞CD47上的SIRP-α结合位点。

在一些实施方案中，抗体不具有显著的血细胞凝集活性。在一些实施方案中，抗体的血小板聚集活性比不含抗体时观察到的小板聚集度大不超过10％。在一些实施方案中，抗体是嵌合抗体、人源化抗体、或完全人抗体。在一些实施方案中，抗体与人CD47或猕猴(cyno)CD47结合。在一些实施方案中，抗体促进巨噬细胞介导的对表达CD47的细胞的吞噬作用。在一些实施方案中，抗体或其抗原结合片段包含选自IgG1同种型和IgG2同种型的IgG同种型。

本文还描述了一种药物组合物，其包含本文所述的抗体和药学上可接受的载体。所述抗体可包含在试剂盒之内。还描述了编码所述抗体的多核苷酸以及适于表达所述多核苷酸的载体和细胞。

另一个实施方案包括通过将一种或多种本文所述抗体施用于有此需要的受试者来缓解癌症症状或其它赘生性病症的方法，其中抗体在施用之后不具有显著的血小板聚集活性。将抗体以足以缓解受试者的癌症症状或其它赘生性病症的量施用。在一些实施方案中，受试者是人。在一些实施方案中，抗体是嵌合抗体、人源化抗体、或完全人抗体。在一些实施方案中，抗体阻止CD47与SIRP-α相互作用，在一些实施方案中，抗体包含选自IgG1同种型和IgG2同种型的IgG同种型。在一些实施方案中，将化学治疗与所述抗体一同施用。

附图说明

图1A和图1B。通过噬菌体衍生的人IgG2 Fc-沉默mAb抑制SIRPα-Fc与Jurkat细胞的结合(图1A)。利用噬菌体衍生的人IgG2 Fc-沉默mAb与Jurkat细胞结合。(图1B)。示出与阳性对照抗-CD47 mAb B6H12.2和人IgG2 Fc-沉默(IgG2sigma)同种型对照相比的十种噬菌体衍生的mAb的SIRP-α阻断和CD47结合活性，如分别由MSD(A)和FACS(B)所测定。

图2A-2D。23种人IgG2 Fc-沉默mAb的子集对SIRP α-Fc与表达CD47的Jurkat细胞结合的剂量依赖性抑制。示出在基于细胞的SIRP α-阻断MSD测定中，与阳性对照抗-CD47mAb B6H12.2相比的17种杂交瘤细胞mAb和3种噬菌体mAb的剂量响应曲线。

图3A和图3B。响应于不同剂量的抗人CD47单克隆抗体IgG1/IgG2 Fc-沉默B6H12.2和可商购获得的BRIC126的人类红细胞的血细胞凝集(图3A)。采用23种抗-CD47mAb的血细胞凝集测定的代表性结果。示出响应于C47B91、C47B98、C47B116、C47B123和C47B131的血细胞凝集结果(图3B)。

图4。响应于不同剂量的抗人IgG1/IgG2 Fc-沉默C47B157、C47B161和C47B222的人类红细胞的血细胞凝集。已知诱导血细胞凝集的IgG2 Fc沉默C47B98(参见图3B)作为阳性对照包括在内。

图5A-5D。C47B116的HFA变体对SIRP α-Fc与表达CD47的Jurkat细胞结合的剂量依赖性抑制。示出在基于细胞的SIRP α-阻断MSD测定中，与亲本杂交瘤mAb C47B116相比的12种人类框架适应的变体的剂量响应曲线。

图6。C47B161(以出现的次序分别为SEQ ID NO 56、57和62)、C47B167(以出现的次序分别为SEQ ID NO 56、58和63)、C47B222(以出现的次序分别为SEQ ID NO 56、59和64)、C47B227(以出现的次序分别为SEQ ID NO 56、60和65)、以及B6H12.2(以出现的次序分别为SEQ ID NO 56、61和66)的表位和互补位区域。得自CD47 ECD-C15G突变体(SEQ ID NO 49)的表位残基和得自C47B161(SEQ ID NO:5和7)、C47B167(SEQ ID NO:50和51)、C47B222(SEQID NO:6和8)、C47B227(SEQ ID NO:41和46)以及B6H12.2(SEQ ID NO:52和53)中每一者的VH和VL的互补位残基以阴影表示，CDR区域加下划线并标记(Kabat定义)，并且SIRP-α结合残基在CD47序列上方用圆点标记。

图7A-7D。CD47与C47B161之间的表位位置和相互作用。C47B161与以黑色示出的表位箱2结合(图7A)。CD47与C47B161之间的2D相互作用图谱。CDR L1和L2接合与抗原进行接触，而CDR L3不与CD47相互作用。所有重链CDR的残基接触CD47。范德瓦尔斯相互作用以虚线示出，H键为带箭头实线(指示主链H键并指向主链原子)。CD47、VL和VH残基分别为灰框、白框和椭圆。使用的截断半径(distance cut-off)定义接触的残基(图7B)。CD47主要与Fab轻链(图7C)和重链(图7D)相互作用。长CDR-L1由残基H31、N33、Y35和Y37表示。H-键以虚线示出。CD47残基加下划线。

图8A-8D。CD47与C47B167之间的表位位置和相互作用。C47B167识别黑色的表位箱3区。抗体由于V59-T61表位区域的序列差异而良好结合至人CD47(SEQ ID NO:67)并较弱结合至猕猴CD47(SEQ ID NO:68)(图8A)。CD47与C47B167之间的2D相互作用图谱。范德瓦尔斯相互作用以虚线示出，H键为带箭头实线(指示主链H键并指向主链原子)。CD47、VL和VH残基分别为灰框、白框和椭圆。使用的截断半径定义接触的残基(图8B)。CD47主要与Fab轻链(图8C)和重链(图8D)相互作用。H-键以虚线示出。CD47残基加下划线。

图9A和9B。CD47与C47B161和C47B167两者结合。三元复合物通过两个复合物中等效CD47 Cα原子的重叠来实现(图9A)。在2种抗体之间不存在表位重叠(图9B)。来自C47B167复合物的CD47结构示出于图9B中。C47B167表位以黑色示出并且C47B161表位以白色表示。

图10A-10D。CD47与C47B222之间的表位位置和相互作用。表位总体位置：C47B161与以黑色示出的表位箱1区结合(图10A)。CD47和C47B222之间的2D相互作用图谱：在由LC和HC识别的CD47残基之间存在分离。范德瓦尔斯相互作用以虚线示出，H键为带箭头实线(指示主链H键并指向主链原子)。CD47、VL和VH残基分别为灰框、白框和椭圆(图10B)。使用的截断半径定义接触的残基。CD47主要与Fab轻链(图10C)和重链(图10D)相互作用。CDR-L3不与CD47结合。H-键以虚线示出。CD47残基加下划线。

图11A-11D。CD47与C47B227之间的表位位置和相互作用。表位总体位置：C47B227结合至以黑色示出的表位箱1区(图11A)。CD47和C47B227之间的2D相互作用图谱：由LC或HC识别的区域存在表位分离。范德瓦尔斯相互作用以虚线示出，H键为带箭头实线(指示主链H键并指向主链原子)。CD47、VL和VH残基分别为灰框、白框和椭圆。使用的截断半径定义接触的残基(图11B)。CD47主要与Fab轻链(图11C)和重链(图11D)相互作用。H-键以虚线示出。CD47残基加下划线。

图12A和12B。C47B222与C47B227之间的表位和互补位差异。轻链相互作用的差异：CDR-L1和CDR-L3中的N30G、N31S和Y93S突变导致CD47的FG环的重新定位和H键模式的改变(图12A)。重链相互作用的差异：C47B222的CDR-H3环的不同构象使H3环形成的H键数从C47B227中没有一个增大至C47B222(与CD47残基Y37、K39、D46和D51)的4个键。结构重叠通过两个复合物中等效CD47 Cα原子的重叠来实现。CD47残基加下划线(图12B)。

图13A-13D。CD47与B6H12.2之间的表位位置和相互作用。表位总体位置。B6H12.2与以黑色示出的表位箱1区结合(图13A)。CD47与B6H12.2之间的2D相互作用图谱：范德瓦尔斯相互作用以虚线示出，H键为带箭头实线(指示主链H键并指向主链原子)。CD47、VL和VH残基分别为灰框、白框和椭圆。使用的截断半径定义接触的残基(图13B)。CD47主要与Fab轻链(图13C)和重链(图13D)相互作用。H-键以虚线示出。CD47残基加下划线。

图14。响应于用不同浓度的抗-人CD47 IgG1/IgG2 Fc-沉默C47B157、C47B161、C47B222和B6H12.2处理90分钟的人PBMC衍生的巨噬细胞对Jurkat靶细胞的吞噬作用。

图15A和15B。响应于用不同浓度的抗-人CD47 IgG1/IgG2 Fc-沉默C47B157、C47B161、C47B222和B6H12.2处理24小时的Jurkat细胞(图15A)和HL60细胞(图15B)的细胞凋亡的诱导。

图16A和16B。响应于不同浓度的抗-人CD47 IgG1/IgG2 Fc-沉默C47B157、C47B161、C47B222、B6H12.2的针对Wil2-s靶细胞的补体依赖性细胞毒性的增强。利妥昔单抗作为阳性对照包括在内。

图17A-17D。响应于将富含血小板血浆与(图17A)PBS、200μg/ml IgG1/IgG2 Fc沉默B6H12.2和10μM ADP；(图17B)PBS、200μg/ml IgG1/IgG2 Fc-沉默C47B157和IgG1B6H12.2；(图17C)PBS、200μg/ml IgG1/IgG2sigma C47B161和IgG1 B6H12.2；以及(图17D)PBS、200μg/ml IgG1/IgG2sigma C47B222和IgG1 B6H12.2一同温育的人血小板的聚集。

图18A-18D。HL60/NSG小鼠模型中IgG1/IgG2 Fc-沉默C47B157、C47B161、C47B222和B6H12.2的体内活性。NSG小鼠经静脉注射植入1千万个HL60细胞，并且在肿瘤细胞植入后第6天开始抗体治疗。每个小组由五只小鼠组成。动物接受共六次剂量，每周两次(第23天最终剂量)。每周从小鼠采集外周血并在第14天开始经由FACS分析评估肿瘤细胞生长和治疗效果(第42天最终采集)。

图19A和19B。MV4-11/NSG小鼠模型中IgG1/IgG2 Fc-沉默C47B157、C47B161、C47B222和B6H12.2的体内活性。NSG小鼠经静脉注射植入五百万个MV4-11细胞，并且在肿瘤细胞植入后第6天开始抗体治疗。每个小组由五只小鼠组成。动物接受共六次剂量，每周两次(第23天最终剂量)。在第34天从小鼠采集外周血并经由FACS分析来评估对肿瘤细胞生长的治疗效果。

图20A-20D。Kasumi-3/NSG小鼠模型中IgG1/IgG2 Fc-沉默C47B157、C47B161、C47B222和B6H12.2的体内活性。NSG小鼠经静脉注射植入1千万个Kasumi-3细胞，并且在肿瘤细胞植入后第6天开始抗体治疗。每个治疗小组由五只小鼠组成。动物接受共十二次剂量，每周两次(第44天最终剂量)。每周从小鼠采集外周血并在第14天开始经由FACS分析评估肿瘤细胞生长和治疗效果。图示出起始于第34天的CD45％细胞的百分比。

图21A和21B。抗体中和的模式。CD47/Fab复合物的结构重叠到CD47/SIRPα复合物上，示出Fab与SIRP-α之间的碰撞区域。叠置通过两个复合物中等效CD47 Cα原子的重叠来实现(图21A)。各个表位与SIRP-α结合位点之间的重叠区域(图21B)。在图21B中使用来自C47B222复合物的CD47结构。

具体实施方式

本文所述抗体的一些特性包括：

·与人CD47和猕猴CD47特异性结合，

·阻断CD47与SIRP-α的相互作用，

·不具有显著的人血小板聚集活性，

·不具有显著的血细胞凝集活性，

·能够促进肿瘤细胞被巨噬细胞吞噬，

·在人类癌症的小鼠模型中显示有效的抗肿瘤活性。

因此，本文所述抗体在治疗多种癌症中占据重要地位。

许多现有的CD47抗体阻断SIRP-α。然而，在本文所述的主题之前，阻断SIRP-α的现有全长IgG CD47抗体导致如上所述的血小板聚集和/或血细胞凝集副作用，这是一个不期望的特性。其它现有的抗体诸如2D3不导致血细胞凝集，然而，这些抗体却也不阻断SIRP-α。因此，先前不存在已知的阻断SIRP-α而不导致血小板和红细胞凝集的全长IgG形式的CD47抗体。

在一些实施方案中，本文所述IgG CD47抗体并未表现出显著的血小板聚集和血细胞凝集，从而增大治疗学上靶向CD47的功效，并维持阻断CD47与SIRP-α相互作用的能力，这促进了对表达CD47的细胞的吞噬作用。具体地，本公开的全长IgG CD47抗体(例如C47B157、C47B161和C47B222)不具有显著的细胞凝集活性。例如，本文所述的CD47抗体不具有显著的血小板聚集和血细胞凝集活性。因此，综合而言，在现有CD47抗体之中，本文所述抗体(例如C47B157、C47B161和C47B222及其衍生物)在其阻断SIRP-α的能力方面很独特而无显著的血小板聚集和血细胞凝集活性。

一般方案

本领域的技术人员将会知道本文公开易受除特别描述的变型形式和修改形式之外的变型形式和修改形式影响。应当理解，本公开包括所有这些变型形式和修改形式。本公开还包括在本说明书中单独地或全体地提到或指出的所有步骤、特征、组合物和化合物，以及任何两个或更多个所述步骤或特征的任意和所有组合。

本公开并不限于本文所述特定实施方案所限定的范围，所述实施方案仅用于示例目的。功能性等同的产品、组合物和方法显然都在本公开的范围之内。

除非另外指明，否则使用分子生物学、微生物学、病毒学、重组DNA技术、溶液肽合成、固相肽合成、药物化学、医疗化学和免疫学的常规技术可以无需过多实验而产生或进行本文所述的物质组合物和方法。标准技术用于药物制备、配制和递送以及患者治疗。

定义

除非另有说明，否则所使用的与本公开相关的科学和技术术语应当具有本领域普通技术人员通常所理解的含义。

如根据本公开所用，除非另外指明，否则下列术语应理解为具有下列含义。

术语“和/或”，例如“X和/或Y”应当理解为意指“X和Y”或“X或Y”并且应当被用来提供对两种含义或任一含义的明确支持。

贯穿本说明书，除非另外特别说明或上下文另有要求，否则提及单个步骤、物质组合物、步骤的组或物质组合物的组应当涵盖一个和多个(即一个或更多个)那些步骤、物质组合物、步骤的组或物质组合物的组。因此，如本文所用，单数形式“一个”、“一种”、和“所述”包括复数方面，除非上下文清楚地表示其它含义。例如，提及“一个”包括单个以及两个或更多个；提及“一种”包括单种以及两种或更多种；提及“所述”包括单个以及两个或更多个等。

如本文所用，术语“CD47”、“整合素相关蛋白(IAP)”、“卵巢癌抗原OA3”和“Rh-相关的抗原”同义并且可互换使用。

术语“红血球”和“红细胞”同义并且本文互换使用。

如本文所用，“血小板聚集”是指活化的血小板彼此粘连，从而导致形成活化血小板的聚集体或凝集体。血小板聚集如实施例中所述的那样使用血小板凝集计测量，该血小板凝集计测量发生血小板聚集时光透射率的增加。如果加入本文所述抗体后6分钟的光透射率相对于加入抗体之前的光透射率增加至少25％，则存在“显著的血小板聚集活性”。

术语“凝集”是指细胞凝集，而术语“血细胞凝集”是指特定细胞亚型即红细胞的凝集。因此，血细胞凝集是凝集的一种类型。

在本文所述的血细胞凝集测定中，红细胞在给定孔中形成可为“纽扣”、“晕圈”或介于两者之间的中间体的形式。术语“显著的血细胞凝集活性”是指在加入本文所述的抗体时孔中存在任何晕圈形式。

如本文所用，术语“抗体”是指免疫球蛋白分子和免疫球蛋白(Ig)分子的免疫活性部分，即包含与抗原特异性结合(发生免疫反应)的抗原结合位点的分子。“特异性结合”或“发生免疫反应”或“针对”是指抗体与期望抗原的一个或多个抗原决定簇反应且不与其它多肽反应，或者以很低亲和力(K_d>10^-6)与其它多肽结合。抗体包括但不限于单克隆抗体、嵌合抗体、dAb(结构域抗体)、单链抗体、Fab、Fab-和F(ab')₂片段、F_v、scFvs和Fab表达库。

已知基本的抗体结构单元包括一个四聚体。每个四聚体由两对相同的多肽链组成，每对具有一条“轻”链(约25kDa)和一条“重”链(约50-70kDa)。每条链的氨基末端部分包括约100至110个或更多个氨基酸的可变区，主要负责抗原识别。每条链的羧基端部分限定了一个恒定区，主要负责效应子功能。一般来讲，从人类获得的抗体分子涉及IgG、IgM、IgA、IgE和IgD中的任意种类，这些由于分子中存在的重链的性质而彼此不同。某些种类还具有亚类，诸如IgG1、IgG₂、以及其它。此外，在人类中，轻链可为κ链或λ链。

如本文所用，术语“单克隆抗体”(mAb)或“单克隆抗体组合物”是指一群这样的抗体分子：其只含有由独特的轻链基因产物和独特的重链基因产物组成的抗体分子中的一种分子种类。具体地，单克隆抗体的互补决定区(CDR)在该群体的所有分子中是相同的。MAb含有能够与抗原的特定表位发生免疫反应的抗原结合位点。

一般来讲，从人类获得的抗体分子涉及IgG、IgM、IgA、IgE和IgD中的任意种类，这些由于分子中存在的重链的性质而彼此不同。某些种类还具有亚类，诸如IgG₁、IgG₂、以及其它。此外，在人类中，轻链可为κ链或λ链。

术语“抗原结合位点”或“结合部分”是指免疫球蛋白分子参与抗原结合的部分。抗原结合位点由重(“H”)链和轻(“L”)链的N-末端可变(“V”)区的氨基酸残基形成。重链和轻链的V区内的三段高度趋异的区段称为“高变区”，它们插入在更保守的侧翼区段“骨架区”或“FR”之间。因此，术语“FR”是指在免疫球蛋白高变区之间或与之相邻处天然存在的氨基酸序列。在抗体分子中，轻链的三个高变区和重链的三个高变区在三维空间上彼此相对排列以形成抗原结合表面。抗原结合表面与所结合的抗原的三维表面互补，并且重链和轻链各自的三个高变区被称为“互补决定区”或“CDR”。氨基酸在每个结构域的分配与下列文献中的定义一致：Kabat Sequences ofProeins of Immunological Interest(NationalInstitutes of Health,Bethesda,Md.(1987和1991))，或Chothia&Lesk,J.Mol.Biol.196:901-917(1987)，Chothia等人，Nature 342:878-883(1989)。

如本文所用，术语“表位”包括任何能够与免疫球蛋白或其片段、或T细胞受体特异性结合的蛋白决定簇。术语“表位”包括任何能够与免疫球蛋白或T细胞受体特异性结合的蛋白决定簇。表位决定簇通常由分子的化学活性表面基团，例如氨基酸或糖侧链组成，且通常具有特定的三维结构特征，以及比电荷特征。当解离常数≦1μM时，抗体被称作特异性结合抗原。

如本文所用，术语“特异性结合”是指在免疫球蛋白分子与免疫球蛋白特异的抗原之间发生的非共价相互作用类型。免疫学结合相互作用的强度或亲和力可以以相互作用的解离常数(K_d)表示，其中较小的K_d代表较大的亲和力。所选多肽的免疫结合特性可使用本领域熟知方法进行定量。一种此类方法需要测量抗原结合位点/抗原复合物形成和解离的速率，其中那些速率取决于复合物配偶体的浓度、相互作用的亲和力和在两个方向同等影响该速率的几何参数。因此，“结合速率常数”(k_on)和“解离速率常数”(k_off)两者可通过计算浓度和实际的缔合和解离速率测定。(参见Nature 361:186-87(1993))。k_off/k_on比率能够消除所有与亲和力无关的参数，并且等于解离常数K_d。(通常参见Davies等人(1990)Annual RevBiochem 59:439-473)。据说如由测定诸如放射性配体结合测定、表面等离子体共振(SPR)、流式细胞术结合测定、或本领域技术人员已知的类似测定所测，当平衡结合常数(K_d)≦1μM时，本公开的抗体与CD47特异性结合。

“分离的”抗体是从其天然环境的组分中鉴定和分离和/或回收的抗体。其天然环境的污染组分是将妨碍抗体的诊断或治疗用途的物质，并且可包括酶、激素、以及其它蛋白质或非蛋白质溶质。在优选的实施方案中，抗体将被纯化为：(1)按所述抗体重量计大于95％，并最优选按重量计多于99％，如由Lowry方法所测；(2)足以通过使用转杯式测序仪(spinning cup sequenator)获得N-末端或内部氨基酸序列的至少15个残基的程度；或者(3)通过还原或非还原条件下的SDS-PAGE使用考马斯蓝或优选银染色测出为均相。分离抗体包括重组细胞内的原位抗体，这是因为不存在抗体的天然环境中的至少一种组分。通常，然而，分离抗体将通过至少一个纯化步骤制备。

本文使用的术语“多肽”作为一个通用术语是指天然蛋白、片段、或多肽序列的类似物。因此，天然蛋白片段和类似物为多肽属的种类。

如本文所用，术语“天然存在的”在应用于对象时是指对象可以在自然界中被发现的事实。例如，存在于生物体(包括病毒)中，可从天然来源中分离，并且没有在实验室中经过人类或其它方式有意修饰的多肽或多核苷酸序列是天然存在的。

本文提及的术语“寡核苷酸”包括由天然存在的和非天然存在的寡核苷酸键连接在一起的天然存在的和经过修饰的核苷酸。寡核苷酸是多核苷酸的亚型，通常包含200个碱基或更短的长度。优选地，寡核苷酸为10至60个碱基的长度并最优选12、13、14、15、16、17、18、19、或20至40个碱基的长度。寡核苷酸通常为单链，例如如用于探针；但寡核苷酸也可为双链，如用于构建基因突变体。本文所述寡核苷酸为有义或反义寡核苷酸。

术语“序列同一性”指的是：在比较窗口中两个多核苷酸或氨基酸序列是相同的(即基于核苷酸对核苷酸或残基对残基是相同的)。术语“序列同一性百分比”通过如下方式计算：在比较窗口中比较两个最佳比对的序列，确定在两个序列中出现相同核酸碱基(例如A、T、C、G、U或I)或残基的位置的数目以得到匹配的位置的数目，将匹配的位置的数目除以比较窗口中位置的总数目(即窗口尺寸)，然后将结果乘以100以得到序列同一性百分比。如本文所述，术语“基本上相同”表示多核苷酸或氨基酸序列的一种特性，其中当与参考序列在至少18个核苷酸(6个氨基酸)位置的比较窗口上，经常是在至少24-48个核苷酸(8-16个氨基酸)位置的比较窗口上比较时，多核苷酸或氨基酸包含具有至少85％序列同一性，优选至少90至95％序列同一性，更通常至少99％序列同一性的序列，其中通过在比较窗上比较参考序列和可能包含缺失或添加的序列计算出序列同一性百分比，这些序列可包括的缺失或添加总计为参考序列的20％或更少。参考序列可以是较大序列的子集。

如本文所用，二十种常规氨基酸及其缩写遵循常规用法。参见Immunology—ASynthesis(第2版，E.S.Golub和D.R.Gren编辑，Sinauer Associates,Sunderland7Mass.(1991))。二十种常规氨基酸的立体异构体(例如，D-氨基酸)、非天然氨基酸(诸如α-、α-二取代氨基酸)、N-烷基氨基酸、乳酸及其它非常规氨基酸也可为适用于本公开多肽的组分。非常规氨基酸的示例包括：4-羟脯氨酸、γ-羧基谷氨酸盐、ε-N,N,N-三甲基赖氨酸、ε-N-乙酰赖氨酸、O-磷酸丝氨酸、N-乙酰丝氨酸、N-甲酰甲硫氨酸、3-甲基组氨酸、5-羟赖氨酰、σ-N-甲基精氨酸及其它类似的氨基酸和亚氨基酸(例如4-羟脯氨酸)。在本文所用的多肽表示方法中，左手方向为氨基末端方向，并且右手方向为羧基末端方向，与标准用法和惯例一致。

类似地，除非另外指明，否则单链多核苷酸序列的左手末端是5'端，双链多核苷酸序列的左手方向被称为5'方向。新生的RNA转录物的5’至3’的添加方向被称为转录方向；DNA链上与RNA序列相同，且在RNA转录物5’端5’的序列区被称为“上游序列”；DNA链上与RNA序列相同，且在RNA转录物3’端3’的序列区被称为“下游序列”。当应用于多肽时，术语“基本上相同”是指两个肽序列在诸如通过GAP或BESTFIT程序使用默认空位权重进行最佳比对时，共享至少80％序列同一性，优选至少90％序列同一性，更优选至少95％序列同一性，并最优选至少99％序列同一性。

优选地，不相同的残基位置区别在于保守氨基酸取代。

“保守”氨基酸取代是指具有类似侧链的残基的可互换性。例如，一组具有脂族侧链的氨基酸为甘氨酸、丙氨酸、缬氨酸、亮氨酸和异亮氨酸；一组具有脂族-羟基侧链的氨基酸为丝氨酸和苏氨酸；一组具有含酰胺侧链的氨基酸为天冬酰胺和谷氨酰胺；一组具有芳族侧链的氨基酸为苯丙氨酸、酪氨酸和色氨酸；一组具有碱性侧链的氨基酸为赖氨酸、精氨酸和组氨酸；并且一组具有含硫侧链的氨基酸为半胱氨酸和甲硫氨酸。优选的保守氨基酸取代组为：缬氨酸-亮氨酸-异亮氨酸、苯丙氨酸-酪氨酸、赖氨酸-精氨酸、丙氨酸-缬氨酸、谷氨酸-天冬氨酸、以及天冬酰胺-谷氨酰胺。

如本文所讨论的那样，预期抗体或免疫球蛋白分子的氨基酸序列的微小变化都涵盖在本公开之内，条件是氨基酸序列的变化保持至少75％、更优选至少80％、90％、95％并最优选99％。具体地，预期保守氨基酸置换。保守置换是在其侧链中相关的氨基酸家族内发生的那些。基因编码的氨基酸大致分以下类：(1)酸性氨基酸为天冬氨酸盐、谷氨酸盐；(2)碱性氨基酸为赖氨酸、精氨酸、组氨酸；(3)非极性氨基酸为丙氨酸、缬氨酸、亮氨酸、异亮氨酸、脯氨酸、苯丙氨酸、甲硫氨酸、色氨酸)；以及(4)无电荷的极性氨基酸为甘氨酸、天冬酰胺、谷氨酰胺、半胱氨酸、丝氨酸、苏氨酸、酪氨酸。亲水性氨基酸包括精氨酸、天冬酰胺、天冬氨酸盐、谷氨酰胺、谷氨酸盐、组氨酸、赖氨酸、丝氨酸和苏氨酸。疏水性氨基酸包括丙氨酸、半胱氨酸、异亮氨酸、亮氨酸、甲硫氨酸、苯丙氨酸、脯氨酸、色氨酸、酪氨酸和缬氨酸。其它家族的氨基酸包括(i)脂肪族-羟基家族的丝氨酸和苏氨酸；(ii)含酰胺家族的天冬酰胺和谷氨酰胺；(iii)脂肪族家族的丙氨酸、缬氨酸、亮氨酸和异亮氨酸；以及(iv)芳族家族的苯丙氨酸、色氨酸和酪氨酸。例如，可以合理地预测用异亮氨酸或缬氨酸单独的置换亮氨酸，用谷氨酸盐置换天冬氨酸盐，用丝氨酸置换苏氨酸，或用一个结构相关的氨基酸类似的置换一个氨基酸不对所得分子的结合或特性有重要影响，如果该置换不涉及框架位点内的氨基酸尤其如此。氨基酸改变是否产生功能性肽可以容易地通过测定多肽衍生物的比活性来确定。所述测定在本文进行了详细描述。抗体或免疫球蛋白分子的片段或类似物可由本领域普通技术人员容易地制备。片段或类似物的优选氨基末端和羧基末端存在于功能结构域的边界附近。可通过比较核苷酸和/或氨基酸序列数据与公共或专有序列数据库来鉴定结构和功能结构域。优选地，使用计算机化比较方法来鉴定序列基序或在其它已知结构和/或功能的蛋白中存在的预测的蛋白质构象结构域。鉴定折叠成已知三维结构的蛋白质序列的方法是已知的(Bowie等人Science 253:164(1991))。因此，上述示例展示，本领域技术人员可以识别可用于界定与本公开一致的结构和功能结构域的序列基序和结构构象。

优选的氨基酸取代是如下那些：(1)降低对蛋白水解作用的敏感性，(2)降低对氧化作用的敏感性，(3)改变用于形成蛋白复合物的结合亲和力，(4)改变结合亲和力，和(5)赋予或改进此类类似物的其它物理化学或功能特性。类似物可包括序列不同于天然存在的肽序列的各种突变蛋白。例如，可在天然存在的序列(优选在形成分子间接触的结构域之外的多肽部分中)中进行单个或多个氨基酸取代(优选保守氨基酸取代)。保守氨基酸取代不应当显著改变亲本序列的结构特性(例如，置换的氨基酸不应当趋于破坏亲本序列中存在的螺旋结构，或破坏表征亲本序列的其它类型二级结构)。人工识别的多肽的二级和三级结构的示例描述于Proteins,Structures and Molecular Principles(Creighton编辑，W.H.Freeman and Company,New York(1984))；Introduction to Protein Structure(C.Branden和J.Tooze编辑，Garland Publishing,New York,N.Y.(1991))；和Thornton等人Nature 354:105(1991)。

本文使用的术语“试剂”是指化合物、化合物的混合物、生物大分子、或由生物材料制成的提取物。

如本文所用，术语“标记”或“经标记的”是指掺入可检测标记，例如，通过掺入放射性标记的氨基酸，或者附着于可由标记的亲和素(例如，含有荧光标记或可由光学方法或量热法检测的酶活性的链霉亲和素)检测的生物素基部分的多肽。在某些情况下，标记物或标记也可为治疗性的。标记多肽和糖蛋白的各种方法是本领域已知的并且可以使用。用于多肽的标记物的示例包括但不限于以下项：放射性同位素或放射性核素(例如，³H、¹⁴C、¹⁵N、³⁵S、⁹⁰Y、⁹⁹Tc、¹¹¹In、¹²⁵I、¹³¹I)，荧光标记物(例如，FITC、罗丹明、镧系磷光体)，酶标记物(例如，辣根过氧化酶、β-半乳糖苷酶、荧光素酶、碱性磷酸酶)，化学发光标记，生物素酰基，被二级报告基因识别的预定多肽表位(例如，亮氨酸拉链对序列、二级抗体结合位点、金属结合结构域、表位标签)。在一些实施方案中，标记通过各种长度的间隔臂连接以减小可能的空间位阻。如本文所用，术语“药剂或药物”是指当适当施用于患者时能够诱导期望治疗效果的化合物或组合物。

本文所用术语“抗肿瘤药”是指具有抑制瘤在人体中发展或累进的功能特性的试剂，尤其是恶性(癌性)病变，诸如癌、肉瘤、淋巴瘤或白血病。抑制转移在很多情况下是抗肿瘤药的特性。

本文的其它化学术语根据本领域的常规用法来使用，如McGraw-Hill Dictionaryof Chemical Terms(Parker,S.编辑，McGraw-Hill,San Francisco(1985))所示例。

CD47抗体

本文所述的单克隆抗体能够结合CD47，抑制SIRP-α与CD47结合，减少CD47-SIRPα介导的信号传导，促进吞噬作用，并且抑制肿瘤生长和/或迁移。抑制例如用实施例中本文所述的细胞测定来测定。

本文所述的示例性抗体包括如下抗体：具有选自SEQ ID NO:4-6的可变重(VH)链并具有选自SEQ ID NO:7和8的可变轻(VL)链。具体地，示例性抗体包括表1中提供的那些。

表1

以下着重指出CD47抗体的VH链的互补决定区(CDR)。在一些实施方案中，VH CDR1的氨基酸序列为DYNMH(SEQ ID NO:9)或DYWIG(SEQ ID NO:10)。在一些实施方案中，VHCDR2的氨基酸序列为DIYPYNGGTGYNQKFKG(SEQ ID NO:11)或IIYPGDSDTRYSPSFQG(SEQ IDNO:12)。在一些实施方案中，VH CDR3的氨基酸序列为GGWHAMDS(SEQ ID NO:13)或VGRFASHQLDY(SEQ ID NO:14)。

在一些实施方案中，VL CDR1的氨基酸序列为RSRQSIVHTNRYTYLA(SEQ ID NO:15)或RASQSVNNRLA(SEQ ID NO:16)。在一些实施方案中，VL CDR2的氨基酸序列为KVSNRFS(SEQID NO:17)或WASTRAI(SEQ ID NO:18)。在一些实施方案中，VL CDR3的氨基酸序列为FQGSHVPYT(SEQ ID NO:19)或QQGASWPFT(SEQ ID NO:20)。

本公开中还包括与如本文所述CD47抗体相同的表位结合的抗体。例如，本专利申请中描述的抗体与包括以下提供的示例性人CD47(GenBank登录号Q08722.1(GI:1171879)，以引用方式并入本文)的一个或多个氨基酸残基的表位特异性结合。信号序列(氨基酸1-18)以画下划线表示。

SEQ ID NO:21

MWPLVAALLLGSACCGSAQLLFNKTKSVEFTFCNDTVVIPCFVTNMEAQNTTEVYVKWKFKGRDIYTFDGALNKSTVPTDFSSAKIEVSQLLKGDASLKMDKSDAVSHTGNYTCEVTELTREGETIIELKYRVVSWFSPNENILIVIFPIFAILLFWGQFGIKTLKYRSGGMDEKTIALLVAGLVITVIVIVGAILFVPGEYSLKNATGLGLIVTSTGILILLHYYVFSTAIGLTSFVIAILVIQVIAYILAVVGLSLCIAACIPMHGPLLISGLSILALAQLLGLVYMKFVASNQKTIQPPRKAVEEPLNAFKESKGMMNDE

在一些实施方案中，抗体与SEQ ID NO:21的Q1、L3、N27、E29、E97、L101、T102、R103和E104相互作用。在一些实施方案中，抗体与SEQ ID NO:21的Y37、K39、R45、D46、T49、A53、L54、N55、K56、S57、T58、V59、P60、T61、S64、A66和K67相互作用。在一些实施方案中，抗体与SEQ ID NO:21的E35、K39、Y37、D46、49、D51、A53、L54、K56、T58、V59、T99、L101和T102相互作用。在一些实施方案中，抗体与SEQ ID NO:21的E29、Q31、N32、T34、E35、V36、Y37、K39、N41、D46、D51、A53、E97、T99、E100、L101、T102、R103和E104相互作用。

本领域技术人员将认识到，可以通过查明前者是否阻止后者与CD47结合来确定抗体是否与本文所述抗体(例如，C47B157、C47B161和C47B222，或者具有选自SEQ ID NO:4-6的可变重链和选自SEQ ID NO:7和8的可变情况的抗体)中的一种具有相同的特异性而无需进行过多实验。如由本文所述抗体的结合减少所示出的那样，如果受试抗体与本公开抗体竞争，则两种抗体可能结合至相同或相近的表位。

一种用于确定抗体是否具有本文所述抗体的特异性的替代方法是将本文所述抗体与通常该抗体对其有反应的可溶CD47蛋白质一起预温育，然后加入测试的抗体以确定测试的抗体与CD47结合的能力是否受到抑制。如果测试的抗体受到抑制，则在所有可能中，其具有与本公开的抗体相同、或功能相同的表位特异性。

本公开的抗体

可评估本文所述抗体调节、阻断、抑制、减少、拮抗、中和或以其它方式妨碍CD47-和/或CD47/SIRP-α介导的信号传导的能力。例如，此类评估可包括在本文所述的一种或多种抗体存在下测量CD47-和/或CD47/SIRP-α介导的信号传导。这些测定可包括竞争结合测定法或者可测量生物示值读数，例如促进表达CD47的细胞被巨噬细胞吞噬的能力(如实施例7所述)。

可使用本领域内已知的各种方法产生针对CD47、或针对其衍生物、片段、类似物同系物或类似物的单克隆抗体。(参见，例如，Antibodies:A Laboratory Manual,Harlow E和Lane D,1988,Cold Spring Harbor Laboratory Press,Cold Spring Harbor,N.Y.，以引用方式并入本文)。完全人抗体是轻链和重链两者的整个序列(包括CDR)来源于人基因的抗体分子。此类抗体在本文被称为“人抗体”或“完全人抗体”。人单克隆抗体例如使用下文所提供实施例中描述的方法制备。人单克隆抗体还可通过使用trioma技术；人B细胞杂交瘤技术(参见Kozbor等人，1983Immunol Today 4:72)；以及EBV杂交瘤技术来制备以产生人单克隆抗体(参见Cole等人，1985In:MONOCLONAL ANTIBODIES AND CANCER THERAPY,AlanR.Liss,Inc.，第77-96页)。可利用人单克隆抗体并且其可通过使用人杂交瘤(参见Cote等人，1983.Proc Natl Acad Sci USA 80:2026-2030)或通过用在体外用巴尔病毒(EpsteinBarrVirus)转化人B细胞(参见Cole等人，1985In:MONOCLONAL ANTIBODIES AND CANCERTHERAPY,Alan R.Liss,Inc.，第77-96页)产生。

抗体通过公知的技术纯化，例如利用蛋白A或蛋白G进行亲和层析，其主要提供了免疫血清中的IgG级分。随后或另选地，可将免疫球蛋白所靶向的特异抗原或其表位固定于柱上，以通过免疫亲和色谱来纯化免疫特异性抗体。例如D.Wilkinson(The Scientist，由The Scientist,Inc.,Philadelphia Pa.出版，第14卷，第8期(2000年4月17日)，第25-28页)讨论了免疫球蛋白的纯化。

本公开的CD47抗体为单克隆抗体。调节、阻断、抑制、减少、拮抗、中和或以其它方式妨碍CD47-和/或CD47/SIRP-α介导的细胞信号传导的单克隆抗体例如通过用如膜结合的和/或可溶的CD47(例如，人CD47或其免疫原性片段、衍生物或变体)免疫动物来产生。另选地，用经包含编码CD47的核酸分子的载体转染的细胞免疫动物，由此使得CD47被表达并与转染细胞的表面相关联。另选地，通过筛选包含抗体或抗原结合结构域序列的库获得抗体以用于与CD47结合。该库如下制备：在噬菌体中作为与噬菌体外壳蛋白的蛋白质或肽融合体表达于装配的噬菌体颗粒表面上并且编码的DNA序列包含于噬菌体颗粒之内(即，“噬菌体展示库”)。然后筛选与CD47有反应性由骨髓瘤/B细胞融合体得到的杂交瘤。

使用例如杂交瘤方法来制备单克隆抗体，诸如Kohler和Milstein,Nature,256:495(1975)所述的那些。在杂交瘤方法中，通常用免疫剂免疫小鼠、仓鼠或其它合适的宿主动物，以引起淋巴细胞，所述淋巴细胞产生或能产生特异性结合免疫剂的抗体。另选地，可将淋巴细胞在体外免疫。

免疫剂将通常包括蛋白抗原、其片段、或其融合蛋白。通常，如果期望人源细胞，则使用外周血淋巴细胞，或者如果期望非人哺乳动物源，则使用脾细胞或淋巴结细胞。然后用适合的融合剂，例如聚乙二醇将淋巴细胞与永生化细胞系融合，以形成杂交瘤细胞(Goding，Monoclonal Antibodies:Principles andPractice,Academic Press,(1986)第59-103页)。永生化细胞系通常是转化的哺乳动物细胞，特别是啮齿动物、牛和人来源的骨髓瘤细胞。通常，采用大鼠或小鼠骨髓瘤细胞系。可在适当的培养基中培养杂交瘤细胞，该培养基优选含有一种或多种抑制未融合的永生化细胞生长或存活的物质。例如，如果亲本细胞缺乏次黄嘌呤鸟嘌呤磷酸核糖基转移酶(HGPRT或HPRT)，则杂交瘤的培养基通常包括次黄嘌呤、氨基喋呤和胸腺嘧啶(“HAT培养基”)，所述物质防止HGPRT-缺陷的细胞生长。

优选的永生化细胞系是有效融合，支持由所选的产生抗体的细胞稳定高水平地表达抗体，并且对培养基如HAT培养基敏感的那些。更优选的永生化细胞系是小鼠骨髓瘤细胞系，其可以例如从Salk Institute Cell Distribution Center,San Diego,Calif.和美国典型培养物保藏中心(American Type Culture Collection，Manassas，Va.)获得。也曾描述了人骨髓瘤和小鼠-人杂合骨髓瘤细胞系用于产生单克隆抗体。(参见Kozbor,J.Immunol.,133:3001(1984)；Brodeur等人，Monoclonal Antibody ProductionTechniques and Applications,Marcel Dekker,Inc.,NewYork,(1987)第51-63页))。

然后可测定培养杂交瘤细胞的培养基中针对抗原的单克隆抗体的存在。优选地，杂交瘤细胞所产生的单克隆抗体的结合特异性通过免疫沉淀或通过体外结合测定，如放射性免疫测定(RIA)或酶联免疫吸附测定(ELISA)来测定。此类技术和测定是本领域已知的。单克隆抗体的结合亲和力可例如通过Munson和Pollard,Anal.Biochem.,107:220(1980)的Scatchard分析来测定。此外，在单克隆抗体的治疗应用中，鉴定对靶抗原具有高度特异性和高结合亲和力的抗体是重要的。

在鉴定出期望的杂交瘤细胞之后，可用有限稀释步骤将所述克隆进行亚克隆并用标准方法使其生长。(参见Goding,Monoclonal Antibodies:Principles and Practice,Academic Press,(1986)第59-103页)。适用于该目的的培养基包括例如Dulbecco改良的Eagle培养基和RPMI-1640培养基。另选地，杂交瘤细胞可在体内如哺乳动物的腹水内生长。

可通过常规免疫球蛋白纯化方法从培养基或腹水液分离或纯化由亚克隆分泌的单克隆抗体，所述方法如例如，蛋白A-琼脂糖凝胶、羟基磷灰石层析、凝胶电泳、透析、或亲和层析。

单克隆抗体还可通过重组DNA方法制备，例如美国专利No.4,816,567中所述的那些。编码本文所述单克隆抗体的DNA可容易地使用常规方法来分离和测序(例如，通过使用能够与编码鼠抗体的重链和轻链的基因特异性结合的寡核苷酸探针)。本文所述杂交瘤细胞充当此类DNA的优选来源。一旦分离后，可以将DNA置入表达载体中，然后将其转染到宿主细胞例如不另外产生免疫球蛋白的中国仓鼠卵巢(CHO)细胞、人胚胎肾(HEK)293细胞、猿COS细胞、PER.NS0细胞、SP2/0、YB2/0、或骨髓瘤细胞中，从而在重组宿主细胞中获得合成的单克隆抗体。DNA也可通过例如用人重链和轻链恒定结构域的编码序列取代同源鼠序列(参见美国专利No.4,816,567；Morrison,Nature 368,812-13(1994))或者通过将免疫球蛋白编码序列与非免疫球蛋白多肽的全部或部分编码序列共价地连接进行修饰。此类非免疫球蛋白多肽能够取代本文所述抗体的恒定结构域，或者能够取代本文所述抗体的一个抗原结合位点的可变结构域以产生嵌合二价抗体。

人抗体和人源化抗体

本文所述抗体包括完全人抗体或人源化抗体。这些抗体适用于给人施用，而不会造成人对所施用的免疫球蛋白产生免疫应答。

CD47抗体例如通过噬菌体展示方法使用仅包含人序列的抗体来产生。此类方法在本领域中为人们所熟知，例如WO92/01047和美国专利No.6,521,404，它们均以引用方式并入本文。在该方法中，使用天然或重组CD47来源或其片段来筛选携带有随机的轻链和重链对的噬菌体的组合库。在另一种方法中，CD47抗体可通过这样的方法产生：至少一个方法步骤包括用人CD47蛋白质免疫转基因非人动物。在此类方法中，该异基因的非人动物的内源性重链和/或k轻链基因座中的一些已失效，并且不能发生产生编码响应于抗原的免疫球蛋白的基因所需的重排。此外，至少一个人重链基因座和至少一个人轻链基因座已被稳定转染到动物中。因此，响应于所施用的抗原，人基因座重排以提供编码对抗原具有免疫特异性的人可变区的基因。因此，在免疫时，转基因鼠产生分泌完全人免疫球蛋白的B细胞。

产生异基因的非人动物的各种技术在本领域中是熟知的。例如，参见美国专利No.6,075,181和No.6,150,584，所述专利全文以引用方式并入本文。随着1994年公布的第一种XenoMouse^TM菌株的生成，证实了该一般策略。参见Green等人Nature Genetics 7:13-21(1994)，其全文以引用方式并入本文。还可参见美国专利No.6,162,963；6,150,584；6,114,598；6,075,181；和5,939,598以及日本专利Nos.3 068 180 B2、3 068 506 B2和3 068507 B2以及欧洲专利No.,EP 0 463 151 B1和国际专利申请No.WO 94/02602、WO 96/34096、WO 98/24893、WO 00/76310和相关家族成员。

免疫原性降低的抗体的产生也使用适当的库经由人源化技术、嵌合化技术和展示技术来实现。应当理解，鼠抗体或来自于其它物种的抗体可使用本领域熟知的技术人源化或灵长类源化。参见例如Winter和Harris Immunol Today 14:43 46(1993)以及Wright等人Crit.Reviews in Immunol.12125-168(1992)。所关注的抗体可通过重组DNA技术进行工程化改造，以用相应的人序列取代CH1、CH2、CH3、铰链结构域和/或骨架结构域(参见WO92102190和美国专利No.5,530,101；5,585,089；5,693,761；5,693,792；5,714,350；和5,777,085)。将Ig cDNA用于构建嵌合免疫球蛋白基因也为本领域已知的(Liu等人P.N.A.S.84:3439(1987)和J.Immunol.139:3521(1987))。mRNA从产生抗体的杂交瘤或其它细胞中分离出并用于产生cDNA。所关注的cDNA可使用特异性引物通过聚合酶链反应来扩增(美国专利4,683,195和4,683,202)。另选地，构建并筛选库以分离所关注的序列。然后将编码抗体可变区的DNA序列与人恒定区序列融合。人恒定区基因的序列可见于Kabat等人(1991)Sequences of Proteins of immunological Interest,N.I.H.publicationno.91-3242。人C区基因可容易地从已知克隆中获得。同种型的选择将根据所期望的效应子功能，例如补体结合或抗体依赖性细胞毒性的活性来指导。优选的同种型为IgG1和IgG2。可使用任一种人轻链恒定区，即k或λ。然后通过常规方法表达嵌合人源化抗体。

抗体片段如Fv、F(ab')₂和Fab可通过裂解完整的蛋白质来制备，例如通过蛋白酶或者化学裂解。另选地，设计截短基因。例如，编码F(ab')₂片段的一部分的嵌合基因将包含编码H链的CH1结构域和铰链区的DNA序列，然后是翻译终止密码子以产生截短的分子。

H和LJ区的共有序列可用于设计用作引物的寡核苷酸，以便在J区内引入有用的限制性位点，用于随后将V区片段连接于人C区片段。C区cDNA可通过定点诱变修饰，以在人序列的类似位置放置一个限制性位点。

表达载体包括质粒、逆转录病毒、YAC、EBV衍生的附加体等等。便利的载体通常是这样一种载体，它编码功能完整的人CH或CL免疫球蛋白序列，并带有工程化的适当限制性位点以使得可以容易地插入和表达任何VH或VL序列。在此类载体中，剪接通常发生在被插入的J区中的剪接供体位点与人C区域前面的剪接受体位点之间，并且还发生在人CH外显子内存在的剪接区域处。聚腺苷酸化和转录终止发生在编码区下游的天然染色体位点处。所得的嵌合抗体可以连接于任何强启动子，包括逆转录病毒LTR，例如SV-40早期启动子(Okayama等人Mol.Cell.Bio.3:280(1983))、劳氏(Rous)肉瘤病毒LTR(Gorman等人P.N.A.S.79:6777(1982))和莫洛尼氏(moloney)鼠白血病病毒LTR(Grosschedl等人Cell41:885(1985))。另外，如将知道的那样，可使用天然Ig启动子等。

另外，可使用本领域中熟知的技术，通过展示型技术产生人抗体或来自其它物种的抗体，所述技术包括但不限于噬菌体展示、逆转录病毒展示、核糖体展示和其它技术，并且所得分子可经历另外成熟，诸如亲和力成熟，这些技术已为本领域所熟知。Wright等人Crit,Reviews in Immunol.12125-168(1992)，Hanes和Plückthun PNAS USA 94:4937-4942(1997)(核糖体展示)，Parmley和Smith Gene 73:305-318(1988)(噬菌体展示)，Scott,TIBS，第17卷：241-245(1992)，Cwirla等人PNAS USA 87:6378-6382(1990)，Russel等人Nucl.Acids Research 21:1081-1085(1993)，Hoganboom等人Immunol.)Reviews 130:43-68(1992)，Chiswell和McCafferty TIBTECH；10:80-8A(1992)，以及美国专利No.5,733,743。如果展示技术用于产生非人抗体，则此类抗体可以如上所述进行人源化。

使用这些技术，可以产生针对表达CD47的细胞、CD47的可溶形式、其表位或肽、以及针对其表达库的抗体(参见例如美国专利No.5,703,057)，该表达库可随后用来按上述方式评估期望的特性。

本文所述CD47抗体可以由包含编码上述单链抗体的DNA片段的载体表达。这些可包括载体、脂质体、裸露DNA、佐剂-辅助DNA、基因枪、导管等。载体包括如WO 93/64701所述的化学缀合物，其具有靶向部分(例如，细胞表面受体的配基)和核酸结合部分(例如多聚赖氨酸)、病毒载体(例如DNA或RNA病毒载体)、例如PCT/US95/02140(WO 95/22618)所述的融合蛋白，这种融合蛋白为包含靶部分(例如对靶细胞具有特异性的抗体)和核酸结合部分(例如鱼精蛋白)、质粒、噬菌体等的融合蛋白。载体可为染色体、非染色体或合成载体。

优选的载体包括病毒载体、融合蛋白和化学缀合物。逆转录病毒载体包括莫洛尼氏鼠类白血病病毒。DNA病毒载体是优选的。这些载体包括痘病毒如天花病毒或禽痘病毒载体，疱疹病毒载体如单纯疱疹病毒I(HSV)载体(参见Geller,A.I.等人，J.Neurochem,64:487(1995)；Lim,F.等人，载于DNA Cloning:Mammalian Systems,D.Glover编辑(OxfordUniv.Press,Oxford England)(1995)；Geller,A.I.等人，Proc Natl.Acad.Sci.:U.S.A.90:7603(1993)；Geller,A.I.等人，Proc Natl.Acad.Sci.USA 87:1149(1990)，腺病毒载体(参见LeGal LaSalle等人，Science,259:988(1993)；Davidson等人，Nat.Genet.3:219(1993)；Yang等人，J.Virol.69:2004(1995)和腺相关病毒载体(参见Kaplitt,M.G.等人，Nat.Genet.8:148(1994)。

痘病毒载体可将基因导入到细胞质内。禽痘病毒载体导致仅能短期内表达核酸。就将核酸导入到神经细胞内而言，优选腺病毒载体、腺相关病毒载体和单纯疱疹病毒(HSV)载体。腺病毒载体导致表达期限(约2个月)比腺相关病毒的表达期限短(约4个月)，后者又比HSV载体表达期限短。选择特定载体将依赖于靶细胞和所要治疗的病症。导入可利用标准技术进行，例如感染、转染、转导或转化。基因转移模式的示例包括例如裸露DNA、CaPO₄沉淀、DEAE葡聚糖、电穿孔、原生质体融合、微脂粒感染、细胞显微注射和病毒载体。

载体可用于基本上靶向任何期望的靶细胞。例如，可以用立体定位注射将载体(例如腺病毒，HSV)引导至期望的位置。另外，可利用微型泵输注系统如SynchroMedInfusion系统通过脑室内(icy)输注递送颗粒。还证明基于胀流的方法(称为对流)可有效地将大分子递送到脑部延伸区域，并且可用于将载体递送到靶细胞。(参见Bobo等人，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 91:2076-2080(1994)；Morrison等人，Am.J.Physiol.266:292-305(1994))。其它可利用的方法包括导管、静脉内、非肠道、腹膜内和皮下注射、以及口服或其它已知给药途径。

这些载体可用于表达大量的可以各种方式使用的抗体。例如，用于检测样品中CD47的存在。抗体还可用于试图结合并破坏CD47-和/或CD47/SIRP-α相互作用和CD47/SIRP-α介导的信号传导。

可采用产生对本文所述抗原蛋白具有特异性的单链抗体的技术(参见美国专利4,946,778)。此外，可采用构建Fab表达库的方法(参见Huse等人，1989Science 246:1275-1281)，以允许快速有效地鉴定对蛋白或其衍生物、片段、类似物或同系物具有期望特异性的单克隆Fab片段。含有蛋白抗原的特异基因型的抗体片段可以通过本领域已知的技术制备，包括但不限于：(i)用胃蛋白酶消化抗体分子得到F(ab')₂片段；(ii)通过还原F(ab')₂片段的二硫键得到Fab片段；(iii)用木瓜蛋白酶和还原剂处理抗体分子生成Fab片段，以及(iv)Fv片段。因此，设想所述实施方案的变型形式，其包括F_v、Fab、Fab'和F(ab')₂CD47片段、单链CD47抗体、单结构域抗体(例如纳米抗体或VHH)、双特异性CD47抗体、以及异源偶联CD47抗体。

Fc修饰

可以期望对本文所述抗体的有关效应子功能进行修饰，以提高例如抗体在治疗与异常CD47信号传导相关的疾病和障碍中的有效性。例如，因为CD47是遍在表达的，所以可将一个或多个突变引入到抗体的Fc区中，从而沉默效应子功能，由此减小杀死正常细胞的可能。

在一些实施方案中，本文所述的抗体是IgG同种型。在一些实施方案中，抗体的恒定区为人IgG1同种型，具有SEQ ID NO:1的氨基酸序列。

在一些实施方案中，抗体的恒定区为人IgG2同种型，具有SEQ ID NO:2的氨基酸序列。

在一些实施方案中，人IgG2恒定区在氨基酸Val234、Gly237、Pro238、His268、Val309、Ala329和Pro330(Kabat编号)处进行修饰以改变Fc受体相互作用(参见WO11/066501 A1)。例如，Val234Ala、Gly237Ala(G237A)、Pro238Ser(P238S)、His268Ala(H268A)、Val309Leu(V309L)、Ala329Ser(A329S)和Pro330Ser(P330S)。(EU索引，Kabat等人1991'Sequences of Proteins of Immunological Interest)。在一些实施方案中，经修饰的人IgG2的抗体恒定区具有SEQ ID NO:3的氨基酸序列。

针对CD47的抗体的使用

应当理解，根据所述实施方案的治疗剂将与合适的载体、赋形剂、以及其它被掺入制剂中以提供改善的转移、递送、耐受性等的试剂一同施用。大量适当的制剂可见于所有药物化学工作者已知的药典中：Remington's Pharmaceutical Sciences(第15版，MackPublishing Company,Easton,Pa.(1975))，特别是其中Blaug、Seymour的第87章。这些制剂包括例如粉末、糊剂、膏剂、凝胶剂、蜡、油、脂质、含脂质(阳离子或阴离子)载体(例如Lipofectin^TM)、DNA缀合物、无水吸浆、水包油和油包水乳液、乳液聚乙二醇(各种分子量的聚乙二醇)、半固态凝胶以及含有聚乙二醇的半固态混合物。任何前述混合物均可适用于根据本发明的治疗或疗法，条件是制剂中的活性成分不被制剂灭活并且制剂在生理学上是相容的并耐受给药途径。

在一个实施方案中，可将所述抗体用作治疗剂。此类试剂将通常用于治疗、缓解和/或预防受试者的与异常CD47表达、活性和/或信号传导相关的疾病或病理。可使用标准方法通过鉴定受试者，例如患有(或处于风险或发展)与异常CD47表达、活性和/或信号传导相关的疾病或障碍，例如癌症或其它赘生性障碍的人患者来实施治疗方案。将抗体制剂，优选对其靶抗原有高特异性和高亲和性的抗体制剂施用给受试者并且将通常因其与靶标结合而产生效应。施用的抗体可消除或抑制或妨碍靶标(例如CD47)的表达、活性和/或信号传导功能。施用的抗体可消除或抑制或妨碍靶标(例如CD47)与其所天然结合的内源性的配体(例如SIRP-α)结合。例如，抗体与靶标结合并调节、阻断、抑制、减少、拮抗、中和、或以其它方式妨碍CD47表达、活性和/或信号传导。在一些实施方案中，为治疗与异常CD47表达相关的疾病或障碍，可将具有重链和轻链CDR(具有如表2所述的氨基酸序列)的抗体施用给受试者。在一个实施方案中，与异常CD47表达相关的疾病或障碍可为癌症。

表2

作为非限制性示例，与异常CD47表达、活性和/或信号传导相关的疾病或障碍包括血液学癌症和/或实体瘤。血液学癌症包括例如白血病、淋巴瘤和骨髓瘤。作为非限制性示例，某些形式的白血病包括急性淋巴细胞性白血病(ALL)；急性髓性白血病(AML)；慢性淋巴细胞性白血病(CLL)；慢性髓细胞性白血病(CML)；骨髓增生性疾病/赘生物(MPDS)；和骨髓增生异常综合征。作为非限制性示例，某些形式的淋巴瘤包括霍奇金氏淋巴瘤、低度恶性和侵袭性非霍奇金氏淋巴瘤、伯基特淋巴瘤、以及滤泡性淋巴瘤(小细胞和大细胞)。作为非限制性示例，某些形式的骨髓瘤包括多发性骨髓瘤(MM)、巨细胞性骨髓瘤、重链骨髓瘤和轻链或Bence-Jones骨髓瘤。实体瘤包括例如乳腺肿瘤、卵巢肿瘤、肺肿瘤、胰腺肿瘤、前列腺肿瘤、黑色素瘤、结直肠肿瘤、肺肿瘤、头颈肿瘤、膀胱肿瘤、食管肿瘤、肝肿瘤和肾瘤。

与癌症及其它赘生性障碍相关的症状包括例如发炎、发烧、全身不适、发烧、疼痛、经常局部发炎、食欲不振、体重减轻、浮肿、头痛、疲乏、皮疹、贫血、肌无力、肌肉疲劳和腹部症状例如腹痛、痢疾或便秘。

本文所述抗体的治疗有效量通常涉及实现治疗目标所需的量。如上指出，这可为抗体及其靶抗原之间的结合相互作用，在某些情况下妨碍靶标的功能。需要施用的量此外取决于抗体对其特异性抗原的结合亲和力，并且还取决于所施用抗体从体内清除的速率。作为非限制性的示例，本文所述抗体或抗体片段的治疗有效剂量的常见范围可为约0.1mg/kg体重至约100mg/kg体重。在一个实施方案中，本文所述抗体的治疗有效剂量为约0.1mg/kg体重至约0.3mg/kg体重。在一个实施方案中，本文所述抗体的治疗有效剂量为约0.4mg/kg体重至约0.6mg/kg体重。在一个实施方案中，本文所述抗体的治疗有效剂量为约0.7mg/kg体重至约0.9mg/kg体重。在一个实施方案中，本文所述抗体的治疗有效剂量为约1.0mg/kg体重至约2.0mg/kg体重。在一个实施方案中，本文所述抗体的治疗有效剂量为约2.0mg/kg体重至约3.0mg/kg体重。在一个实施方案中，本文所述抗体的治疗有效剂量为约3.0mg/kg体重至约4.0mg/kg体重。在一个实施方案中，本文所述抗体的治疗有效剂量为约4.0mg/kg体重至约5.0mg/kg体重。在一个实施方案中，本文所述抗体的治疗有效剂量为约5.0mg/kg体重至约6.0mg/kg体重。在一个实施方案中，本文所述抗体的治疗有效剂量为约6.0mg/kg体重至约7.0mg/kg体重。在一个实施方案中，本文所述抗体的治疗有效剂量为约7.0mg/kg体重至约8.0mg/kg体重。在一个实施方案中，本文所述抗体的治疗有效剂量为约8.0mg/kg体重至约9.0mg/kg体重。在一个实施方案中，本文所述抗体的治疗有效剂量为约9.0mg/kg体重至约10.0mg/kg体重。在一个实施方案中，本文所述抗体的治疗有效剂量为约10.0mg/kg体重至约15.0mg/kg体重。在一个实施方案中，本文所述抗体的治疗有效剂量为约15.0mg/kg体重至约20.0mg/kg体重。一般的给药频率的范围可为例如从每日一次至每日两次到隔日一次到每周一次。

可结合任意已知的用于诊断或治疗特定炎性相关的障碍的方法确定治疗的有效性。炎性相关的障碍的一个或多个症状减轻指示抗体赋予了临床益处。

在另一个实施方案中，针对CD47的抗体可用于本领域中已知的与CD47定位和/或定量相关的方法(例如，用于测定适当生理样品中的CD47和/或CD47和SIRP-α两者的水平，用于诊断方法，用于蛋白成像等等)。在一个给定实施方案中，对CD47或其衍生物、片段、类似物或同系物具有特异性的、包含源于抗体的抗原结合结构域的抗体，被用作药物学活性化合物(下文称为“治疗剂”)。

在另一个实施方案中，可通过标准技术例如免疫亲和、色谱或免疫沉淀，使用对CD47具有特异性的抗体来分离CD47多肽。针对CD47蛋白质的抗体(或其片段)可用于检测生物样品中的蛋白质。在一些实施方案中，在生物样品中可检测CD47作为临床测试过程的一部分，例如，用于确定给定治疗方案的功效。将抗体偶联(即物理连接)到可检测物质可有利于检测。可检测物质的示例包括各种酶、辅基、荧光材料、发光材料、生物发光材料和放射性材料。合适的酶的示例包括辣根过氧化物酶、碱性磷酸酶、β-半乳糖苷酶或乙酰胆碱酯酶；合适的辅基复合物的示例包括链霉亲和素/生物素和亲和素/生物素；合适的荧光材料的示例包括伞形酮、荧光素、异硫氰酸荧光素、罗丹明、二氯三嗪氨荧光素、丹磺酰氯或藻红蛋白；发光材料的一个示例包括鲁米诺；生物发光材料的示例包括荧光素酶、荧光素和水母蛋白，并且合适放射性材料的示例包括¹²⁵I、¹³¹I、³⁵S或³H。

在另一个实施方案中，根据本公开的抗体可用作检测样品中CD47和/或CD47和SIRP-α蛋白质两者(或其蛋白质片段)存在的试剂。在一些实施方案中，抗体包含可检测标记。抗体为多克隆抗体，或更优选单克隆抗体。使用完整的抗体或其片段(例如Fab、scFv或F(ab')₂)。关于抗体的术语“标记”旨在包括通过将可检测物质偶联(即物理连接)到该抗体来直接标记该抗体，以及通过与直接标记的另一种试剂反应来间接标记该抗体。间接标记的示例包括使用荧光标记的第二抗体检测第一抗体，以及用生物素进行末端标记抗体，以便能够用荧光标记的链霉亲和素进行检测。术语“生物样品”旨在包括从受试者分离的组织、细胞和生物学流体，以及受试者体内存在的组织、细胞和流体。因此，使用的术语“生物样品”包括血液和血液中的级分或组分，包括血清、血浆、或淋巴液。换言之，所述实施方案的检测方法可用于在体外及体内检测生物样品中的分析物mRNA、蛋白质或基因组DNA。例如，分析物mRNA体外检测技术包括Norhtern杂交和原位杂交。分析物蛋白质体外检测技术包括酶联免疫吸附测定(ELISA)、Western印迹、免疫沉淀、以及免疫荧光。分析物基因组DNA体外检测技术包括Southern杂交。用于进行免疫测定的过程描述于例如“ELISA:TheoryandPractice:Methods in Molecular Biology”，第42卷，J.R.Crowther(编辑)HumanPress,Totowa,N.J.,1995；“Immunoassay”,E.Diamandis和T.Christopoulus,AcademicPress,Inc.,San Diego,Calif.,1996；以及“Practice and Theory of EnzymeImmunoassays”,P.Tijssen,Elsevier Science Publishers,Amsterdam,1985。此外，分析物蛋白质的体内检测技术包括向受试者体内导入标记的抗分析物蛋白抗体。例如，可以用放射性标记标记抗体，然后可以通过标准成像技术检测受试者体内该放射性标记物的存在和位置。

CD47抗体的治疗性施用和制剂

可将本文所述抗体和其衍生物、片段、类似物和同系物掺入适于施用的药物组合物中。制备此类组合物所涉及的原理和考虑事项以及选择组分的指南在本领域中是熟知的，例如参见Remington's Pharmaceutical Sciences:The Science And PracticeOfPharmacy第19版(Alfonso R.Gennaro等人编辑)Mack Pub.Co.,Easton,Pa.:1995；DrugAbsorption Enhancement:Concepts,Possibilities,Limitations,And Trends,HarwoodAcademic Publishers,Langhorne,Pa.,1994；以及Peptide And Protein Drug Delivery(Advances In Parenteral Sciences，第4卷),1991,M.Dekker,New York。

此类组合物通常包含抗体和药学上可接受的载体。当使用抗体片段时，与靶蛋白结合结构域特异性结合的最小抑制片段可为优选的。例如，基于抗体的可变区序列，可以设计保留结合靶蛋白质序列能力的肽分子。此类肽可化学合成和/或通过重组DNA技术产生。(参见例如Marasco等人，Proc.Natl.Acad.Sci.USA,90:7889-7893(1993))。

如本文所用，术语“药学上可接受的载体”旨在包括与药物给药相容的任何和所有溶剂、分散介质、包衣、抗细菌剂和抗真菌剂、等渗剂和吸收延缓剂等。合适载体描述于最新版的Remington's Pharmaceutical Sciences中，这是本领域的标准参考书目，其以引用方式并入本文。此类载体或稀释剂的优选示例包括但不限于水、盐水、林格氏溶液、葡萄糖溶液和5％的人血清白蛋白。也可以使用脂质体和非水性载体，例如固定化油。将此类介质和试剂用于药物活性物质是本领域熟知的。除去任何常规的介质或试剂与抗体不相容之外，设想其在组合物中的用途。

待用于体内施用的制剂必须为无菌的。这可容易地通过无菌滤膜过滤实现。

将所述实施方案的药物组合物配制成与其预期施用途径相容。给药途径的示例包括肠胃外，例如静脉内、皮内、皮下、经口(例如吸入)、经皮(即局部的)、经粘膜和直肠给药。用于肠胃外、皮内或皮下施用的溶液或悬浮液可包括以下组分：注射用无菌稀释剂例如水、盐溶液、固定油、聚乙二醇类、甘油、丙二醇或其它合成溶剂；抗细菌剂，例如苄醇或对羟基苯甲酸甲酯；抗氧化剂，例如抗坏血酸或亚硫酸氢钠；螯合剂，例如乙二胺四乙酸(EDTA)；缓冲剂，例如乙酸盐、柠檬酸盐或磷酸盐、以及调节渗透压的试剂，例如氯化钠或右旋糖。pH可用酸或碱进行调节，例如盐酸或氢氧化钠。可将肠胃外制剂包装在安瓿、一次性注射器或玻璃或塑料制多剂量小瓶内。

适于注射用途的药物组合物包括无菌水性溶液(在此是水溶性的)或分散体以及用于即时制备无菌注射液或分散体的无菌粉末。对于静脉内施用，合适的载体包括生理盐水、抑菌水、Cremophor EL^TM(BASF，Parsippany,N.J.)或磷酸盐缓冲盐水(PBS)。在所有情况下，组合物必须是无菌的并且应当为流动性达到易于注射的程度。其在制造和储存条件下必须是稳定的并且必须能防止微生物例如细菌和真菌的污染作用。载体可以是含有例如水、乙醇、多元醇(例如，甘油、丙二醇和液体聚乙二醇等)的溶剂或分散介质，及其适宜的混合物。例如通过利用涂层例如卵磷脂，在分散体情况下维持所需颗粒尺寸，以及利用表面活性剂，可以保持适宜的流动性。对微生物作用的防止可以通过各种抗细菌剂和抗真菌剂例如对羟基苯甲酸酯、氯代丁醇、苯酚、抗坏血酸、硫柳汞等来实现。在许多情况下，将优选在组合物中包含等渗剂，例如糖、多元醇(诸如甘露糖醇、山梨醇)、氯化钠。注射用组合物的延长吸收可通过在所述组合物中包含延缓吸收的试剂例如单硬脂酸铝和明胶来达到。

根据需要，可以通过将抗体以所需量掺入具有上文所列成分中的一种或组合(按需要)的合适溶剂中来制备无菌注射溶液，然后过滤消毒。一般来讲，通过将抗体掺入含有碱性分散介质和上文所列那些中的所需其它成分的无菌载体中来制备分散体。就用于制备无菌注射溶液的无菌粉末而言，制备方法是获得粉末的真空干燥和冷冻干燥，该粉末包含活性成分和任何另外的期望成分，它们来自前述的这些成分的无菌过滤溶液。

对于吸入给药，从包含合适推进剂如二氧化碳等气体的加压容器或分配器或者喷雾器以气溶胶喷雾形式递送化合物。

还可以通过经粘膜或透皮方式全身给药。对于经粘膜或透皮给药，在制剂中使用适于渗透屏障的渗透剂。此类渗透剂通常在本领域是通常所知的，并且包括如用于经粘膜给药的去污剂、胆盐和夫西地酸衍生物。经粘膜给药可以通过使用喷鼻剂或栓剂来实现。对于透皮给药，可将一种或多种所述抗体配制成如本领域通常所知的膏剂、软膏、凝胶、或霜膏。

还可将化合物以栓剂(例如，具有常规栓剂基质，如可可脂或其它甘油酯)或滞留性灌肠剂形式进行制备以用于经直肠递送。

在一个实施方案中，所述抗体可用防止其不被身体迅速消除的载体制备，例如缓释/控释制剂，包括植入体和微胶囊化递送体系。可使用可生物降解、可生物相容的聚合物，例如乙烯-乙酸乙烯酯、聚酐、聚乙醇酸、胶原、聚原酸酯和聚乳酸。用于制备此类制剂的方法对于本领域技术人员而言是显而易见的。

例如，这些活性成分可胶囊包封于例如通过凝聚技术或通过界面聚合法制备的微胶囊中，例如分别在胶体给药系统(例如，脂质体、白蛋白微球、微乳液、纳米颗粒和纳米胶囊剂)或大乳液中的羟甲基纤维素或明胶微胶囊和聚(甲基丙烯酸甲酯)微胶囊。

可制备缓释制剂。适宜的缓释制剂的示例包括含有抗体的固体疏水聚合物的半透性基质，该基质是成型制品形式例如膜或微胶囊。缓释基质的示例包括聚脂、水凝胶(例如，聚(2-羟乙基-甲基丙酸酯)、或聚(乙烯醇))、聚交酯(美国专利No.3,773,919)、L-谷氨酸和γ乙基-L-谷氨酸盐的共聚物、不可降解的乙烯-乙酸乙烯酯、可降解乳酸-乙醇酸共聚物例如LUPRON DEPOT^TM(由乳酸-乙醇酸共聚物和醋酸亮丙瑞林构成的注射用微球)、和聚-D-(-)-3-羟基丁酸。虽然聚合物例如乙烯-乙酸乙烯酯和乳酸-乙醇酸能够释放分子100天以上，但是一些水凝胶释放蛋白质的时间却较短。

脂质体混悬剂(包括用针对病毒抗原的单克隆抗体靶向受感染细胞的脂质体)也可以用作药学上可接受的载体。这些可根据本领域技术人员已知的方法制备，例如在美国专利No.4,522,811中有所描述。

尤其有利的是以剂量单位形式配制肠胃外组合物以易于施用和剂量的一致性。如本文所用，剂量单位形式是指用于待治疗的受试者，适合作为单位剂量的物理上可分离的单位；每个单位含有经计算与所需药物载体结合产生期望治疗效果的预定量的一种或多种所述抗体。所述实施方案的剂量单位形式的规格由以下指示并直接取决于：抗体的独特特征和待实现的具体治疗效果，和用于治疗个体的此类抗体的调配领域中固有的局限性。

所述药物组合物可与给药说明书一起放于容器、包装、或分配器中。

本文所述制剂还可根据要治疗的具体情况而包含多于一种所述抗体，优选具有互补活性但对彼此无负面影响的那些。另选地或除此之外，组合物可例如包含增强其功能的试剂，诸如细胞毒素试剂、细胞因子、化学治疗剂、或生长抑制剂。此类分子以对预期目的有效的量适当地联合存在。

在一个实施方案中，一种或多种所述抗体可在联合治疗中施用，即与其它试剂例如治疗剂(其可用于治疗病理学病症或障碍，例如各种形式的癌症、自身免疫性障碍和炎性疾病)联合。术语“联合”在本文中是指将试剂基本上同步地，同时地或顺次地给予。如果顺次给予，则在开始施用第二种化合物时，两种化合物中的第一种仍优选在治疗位点处以有效浓度被检测到。

例如，联合治疗可包含本文所述一种或多种抗体与一种或多种附加治疗剂(例如一种或多种细胞因子和生长因子抑制剂、免疫抑制剂、抗炎剂、代谢抑制剂、酶抑制剂、和/或细胞毒素或细胞生长抑制剂，如下更详述的)共同配制和/或共同施用。此类联合治疗可有利地利用较低剂量的施用的治疗剂，因而避免了与各种单一疗法相关的可能毒性或并发症。

与本文所述抗体联合使用的优选治疗剂是干扰炎症应答中不同阶段的那些试剂。在一个实施方案中，可将本文所述一种或多种抗体与一种或多种附加试剂例如其它细胞因子或生长因子拮抗剂(例如，可溶受体、肽抑制剂、小分子、配体融合物)；或结合其它靶标的抗体或抗原结合片段(例如，结合其它细胞因子或生长因子、其受体、或其它细胞表面分子的抗体)；以及抗炎性细胞因子或其激动剂共同配制和/或共同施用。

在其它实施方案中，本文所述抗体被用作针对自身免疫性障碍、炎性疾病等的疫苗佐剂。用于治疗这些类型障碍的佐剂的组合适于与各种各样的抗原联合使用，所述抗原来自于所靶向的自体抗原，即参与自身免疫的自身抗原，例如髓磷脂碱性蛋白；炎性自体抗原，例如淀粉状肽蛋白、或移植抗原，例如同种抗原。抗原可包括衍生自蛋白质的肽或多肽以及以下任一项的片段：糖、蛋白质、多核苷酸或寡核苷酸、自身抗原、淀粉样肽蛋白、移植抗原、过敏原或其它大分子组分。在一些例子中，多于一种抗原被包含在抗原性组合物中。

附加筛选方法

本公开提供用于鉴定调节剂的方法(在本文也称为“筛选测定”)，即调节或以其它方式妨碍CD47与SIRP-α结合的候选或受试化合物或试剂(例如，肽、模拟肽、小分子或其它药物)，或调节或以其它方式妨碍CD47和/或CD47-SIRP-α的信号传导功能的候选或受试化合物或试剂。本公开还提供了鉴定用于治疗与异常CD47和/或CD47-SIRPα表达、活性和/或信号传导相关的障碍的化合物的方法。筛选方法可包括本领域中已知或使用的那些或本文描述的那些。例如，可将CD47固定在微量滴定板上并在SIRP-α存在下与候选或受试化合物(例如CD47抗体)一起温育。随后，可使用第二抗体检测结合的SIRP-α，并且可在读板机上检测吸光度。

本公开还提供了鉴定能够促进肿瘤细胞被巨噬细胞吞噬的化合物的方法。这些方法可包括本领域中已知或使用的那些或本文描述的那些。例如，在候选化合物(例如CD47抗体)存在下，将巨噬细胞与标记的肿瘤细胞一起温育。在一段时间后，可观察巨噬细胞对肿瘤标记的内在化以鉴定吞噬作用。实施例中提供了关于这些方法的附加细节，例如SIRP-α阻断测定和吞噬作用测定。本发明还包括在本文所述筛选测定中鉴定的化合物。

在一个实施方案中，测定提供了筛选调节CD47信号传导功能的候选或受试化合物。受试化合物可使用本领域已知的组合库方法中的多种方法之任一种获得，包括：生物库法；空间可寻址的平行固相或液相库法；需要去褶合的合成库法；“单珠单化合物”库法；以及使用亲和层析选择的合成库法。生物库方法限于肽库，而其它四种方法适用于肽、非肽低聚体或小分子化合物库。(参见例如Lam,1997.Anticancer Drug Design 12:145)。

如本文所用，“小分子”意指分子量小于约5kD并最优选小于约4kD的组成。小分子可例如为核酸、肽、多肽、模拟肽、碳水化合物、脂质或其它有机或无机分子。化学和/或生物混合物库例如真菌提取物、细菌提取物或藻类提取物是本领域已知的，并且可通过本公开所述的任何测定法进行筛选。用于合成分子库的方法的示例可在本领域中找到，例如在：DeWitt等人，1993.Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.90:6909；Erb等人，1994.Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.91:11422；Zuckermann等人，1994.J.Med.Chem.37:2678；Cho等人，1993.Science 261:1303；Carrell等人，1994.Angew.Chem.Int.Ed.Engl.33:2059；Carell等人，1994.Angew.Chem.Int.Ed.Engl.33:2061；以及Gallop等人，1994.J.Med.Chem.37:1233。

化合物库可存在于溶液中(参见例如Houghten,1992.Biotechniques 13:412-421)、或小珠上(参见Lam,1991.Nature 354:82-84)、薄片上(参见Fodor,1993.Nature364:555-556)、细菌(参见美国专利No.5,223,409)、孢子(参见美国专利No.5,233,409)、质粒(参见Cull等人，1992.Proc.Natl.Acad.Sci.USA 89:1865-1869)或噬菌体上(参见Scott和Smith,1990.Science 249:386-390；Devlin,1990.Science 249:404-406；Cwirla等人，1990.Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.87:6378-6382；Felici,1991.J.Mol.Biol.222:301-310；以及美国专利No.5,233,409)。

在一个实施方案中，将候选化合物引入抗体-抗原复合物并确定候选化合物是否破坏抗体-抗原复合物，其中该复合物的破坏指示候选化合物调节CD47的信号传导功能和/或CD47与SIRP-α之间的相互作用。在另一个实施方案中，提供了本文所述的可溶CD47和/或CD47和SIRP-α蛋白质两者并且使其暴露于至少一种中和单克隆抗体。检测抗体-抗原复合物的形成，并且将一种或多种候选化合物引入复合物。如果抗体-抗原复合物在引入一种或多种候选化合物之后被破坏，则候选化合物可用于治疗与异常CD47和/或CD47-SIRP-α信号传导相关的障碍。

测定受试化合物妨碍或破坏抗体-抗原复合物的能力可通过例如以下方式实现：将受试化合物与放射性同位素或酶标记物偶联，由此使得受试化合物与抗原或其生物活性部分的结合可通过检测复合物中的标记化合物而确定。例如，受试化合物可用¹²⁵I、³⁵S、¹⁴C、或³H直接或间接标记，并且通过直接计数放射发射，或通过闪烁计数来检测放射性同位素。另选地，受试化合物可用例如辣根过氧化酶、碱性磷酸酶、或荧光素酶进行酶标记，并且酶标记通过测定适宜的底物向产物的转化来检测。

在一个实施方案中，测定包括使抗体-抗原复合物与受试化合物接触，并测定受试化合物与抗原的相互作用或以其它方式破坏现有抗体-抗原复合物的能力。在该实施方案中，测定受试化合物与抗原相互作用和/或破坏抗体-抗原复合物的能力包括：测定受试化合物相比于抗体优先结合抗原或其生物活性部分的能力。

在另一个实施方案中，测定包括使抗体-抗原复合物与受试化合物接触，并测定受试化合物调节抗体-抗原复合物的能力。测定受试化合物调节抗体-抗原复合物的能力可例如通过在受试化合物存在下测定抗原与抗体结合或相互作用的能力来实现。

本领域的普通技术人员应当认识到，在本文所公开的任何筛选方法中，抗体可为调节或以其它方式妨碍CD47活性和/或信号传导的中和抗体。

本文所公开的筛选方法可实施为基于细胞的测定或无细胞测定。所述实施方案的无细胞测定可以采用CD47及其片段的可溶形式或膜结合形式。就包括膜结合形式的CD47的无细胞测定而言，可以期望利用增溶剂以使得膜结合形式的蛋白质保持在溶液中。此类增溶剂的示例包括非离子洗涤剂，例如正辛基葡糖苷、正十二烷基葡糖苷、正十二烷基麦芽糖苷、辛酰基-N-甲基葡糖酰胺、癸酰基-N-甲基葡糖酰胺、X-100、X-114、异十三烷基聚(乙二醇醚)_n、N-十二烷基-N,N-二甲基-3-铵-1-丙磺酸盐、3-(3-胆酰胺丙基)二甲胺-1-丙磺酸盐(CHAPS)、或3-(3-胆酰胺丙基)二甲胺-2-羟基-1-丙磺酸盐(CHAPSO)。

在多于一个实施方案中，可期望固定化抗体或抗原，以促进从一种或全部两种以下引入的候选化合物的非复合形式中分离出复合形式，以及适应该测定的自动化。在存在和不存在候选化合物情况下，抗体-抗原复合物的观察可在适于容纳反应物的任何容器中实现。此类容器的示例包括微量滴定板、试管和微型离心管。在一个实施方案中，可提供融合蛋白，该融合蛋白添加有允许一种或全部两种蛋白质结合到基质的结构域。例如，GST-抗体融合蛋白或GST-抗原融合蛋白可被吸附到谷胱甘肽琼脂糖珠(Sigma Chemical,St.Louis,Mo.)或谷胱甘肽衍生的微量滴定板上，然后该融合蛋白与受试化合物混合，并且将混合物在有利于复合物形成的条件下(例如生理条件的盐和PH下)温育。在温育之后，洗涤小珠或微量滴定板孔以除去任何未结合的组分，在小珠情况下固定化的基质，直接或间接地测定复合物。另选地，可使复合物从基质上解离，并且可使用标准技术测定抗体-抗原复合物的形成水平。

在所述实施方案的筛选测定中也可使用将蛋白质固定到基质上的其它技术。例如，抗体(例如，C47B157、C47B161和C47B222，或具有选自SEQ ID NO:4-6的可变重链和选自SEQ ID NO:7和8的可变轻链的抗体)或抗原(例如CD47蛋白质)可利用生物素和链霉亲和素的缀合来固定。生物素化的抗体或抗原分子可用本领域熟知的技术(例如，生物素化试剂盒，Pierce Chemicals,Rockford,Ill.)由生物素-NHS(N-羟基琥珀酰亚胺)制备，并且固定于链霉亲和素包被的96孔板(Pierce Chemical)的孔中。另选地，可将与所关注的抗体或抗原反应但不妨碍所关注的抗体-抗原复合物形成的其它抗体衍生到板的孔内，并且通过抗体缀合将未结合的抗体或抗原捕获于孔中。除上文对GST-固定的复合物描述的那些之外，用于检测此类复合物的方法还包括使用与抗体或抗原反应的此类其它抗体对复合物进行免疫检测。

本公开还涉及由任何上述筛选测定鉴定的新型试剂和其在如本文描述治疗中的用途。

诊断和预防性制剂

本文所述抗体可用于诊断和预防性制剂。在一个实施方案中，可将一种或多种所述抗体施用给处于发展成一种或多种前述疾病(例如但不限于癌症或其它赘生性病症)风险的受试者。受试者或器官罹患一种或多种前述癌症或其它赘生性病症的倾向可使用基因型标记、血清学标记或生化标记来确定。

本文所述抗体还可用于检测患者样品中的CD47和/或SIRP-α并因此可用作诊断剂。例如，本文所述CD47抗体用于体外测定，例如ELISA，以检测患者样品中的CD47和/或SIRP-α水平。

在一个实施方案中，将本文所述抗体固定到固体载体(例如，微量滴定板的一个或多个孔)上。固定化抗体充当可在测试样品中存在的任何CD47和/或SIRP-α的捕集抗体。在将固定化抗体与患者样品接触之前，冲洗固体载体并用诸如牛乳蛋白或白蛋白的阻断剂处理以防止分析物的非特异性吸附。

随后，用怀疑包含抗原的测试样品，或用包含标准量抗原的溶液处理孔。从怀疑具有一定水平的循环抗原的受试者采得该样品例如血清样品，所述抗原被视为病理学的诊断特征。在洗去测试样品或标准物之后，用可检测性标记的第二抗体处理固体载体。标记的第二抗体充当检测抗体。测量可检测标记的水平，并且通过与从标准样品得到的标准曲线进行比较来确定测试样品中CD47和/或SIRPα的浓度。

应当理解，基于在体外诊断测定中使用所述抗体获得的结果，可以基于CD47和/或SIRP-α的表达水平来确定受试者的疾病阶段(例如，与缺血、自身免疫性病症或炎性障碍相关的临床指征)。对于给定的疾病，血液样品采自被诊断为处于疾病发展不同阶段，和/或处于疾病治疗处理不同点的受试者。使用可为进展或治疗的各个阶段提供统计上显著结果的样品群，指定可视为各个阶段特征的抗原浓度范围。

本说明书就包括的文献、文件、材料、装置、制品等所作的任何讨论，并不表示承认这些内容的任何或全部形成在本申请各项权利要求的优先权日之前已经存在的现有技术基础的一部分或者是本发明相关领域的公知常识。

实施例

实施例1：用杂交瘤技术产生CD47抗体

使用标准免疫方案，利用弗氏佐剂(Sigma)、InterFAD(小鼠干扰素-α，PBLInterferonSource)、或2-剂量佐剂(Creative Diagnostics)，用重组人CD47-Fc嵌合体(R&D系统)免疫Balb/c小鼠以引发抗-CD47抗体发展。为发展表达CD47抗体的杂交瘤，收获免疫小鼠的脾并分离出B细胞来与SP20-Bcl2骨髓瘤细胞融合。针对与CD47而非与Fc-标签结合的抗体，通过ELISA分析得自4种融合体(C47Y1、C47Y2、C47Y3和C47Y4)的杂交瘤克隆。通过基于meso scale discovery(MSD)的测定，进一步筛选显示出与CD47特异性结合的杂交瘤上清液以结合表达CD47的Jurkat细胞(TIB-152，ATCC)并阻断SIRP-α与Jurkat细胞的结合。

简而言之，洗涤Jurkat细胞并使其重悬于磷酸盐缓冲盐水中，然后通过在37℃下温育1.5小时以30,000个细胞/孔捕集到MSD 96-孔高结合板上。在轻轻搅拌下，将平板用15％胎牛血清(FBS)(或加热灭活的FBS)在室温下封闭30min。就细胞结合活性而言，将杂交瘤上清液与捕集在MSD高结合板上的细胞在4℃下一起温育1小时，并且用MSD磺基-标签标记的山羊抗小鼠抗体检测结合的抗体。

就SIRPα-阻断活性而言，将2μg/ml的重组SIRPα-Fc(R&D系统)与Jurkat细胞在杂交瘤上清液存在下温育1-1.5小时，并且用MSD磺基-标签标记的小鼠抗-SIRPα抗体(R&D系统)检测结合的SIRP-α。将平板在Sector 6000成像器上读数并记录电致化学发光(ECL)信号。将抑制百分比归一化为无抗体并且测定中不包括SIRP-α对照。选择示出SIRP-α结合的中和作用的杂交瘤命中以用于抗体V-区的分子克隆。简而言之，采用Invitrogen'sSuperScript III cells Direct cDNA系统通过逆转录酶反应分离来自目的杂交瘤命中的cDNA，然后在输注克隆到鼠IgG1/K恒定区上之前，用预混合的正向引物和反向引物通过PCR扩增V区。在HEK293细胞(Life Technologies)中重组表达之后，在Jurkat细胞结合和SIRP-α阻断测定中重新筛选包含mIgG1 mAb的瞬时转染上清液。选择确认SIRPα-阻断活性(>40％抑制，表3)的总共20个序列独特的mIgG1 mAb转化为嵌合人IgG2 Fc-沉默/人kmAb。

表3：展示SIRP-α阻断的抑制>40％的杂交瘤衍生的mIgG1 mAb的列表

实施例2：利用噬菌体展示技术产生CD47抗体

CD47试剂和方法：在添加C-末端6xHIS标签(SEQ ID NO:55)的情况下内部产生重组人CD47细胞外结构域(ECD)蛋白质(SEQ ID NO.22)以用于噬菌体淘选。人CD47的cDNA克隆购自Origene，并且通过PCR扩增ECD区并亚克隆到哺乳动物的表达载体中。在瞬时转染HEK 293F细胞之后，经由固定化金属亲和层析(IMAC)使用HisTrap柱(GE Healthcare)纯化分泌的His-标记的人CD47-ECD蛋白质。在26/60 Superdex 200柱(GE Healthcare)上色谱纯化而进行最终精制步骤之前，合并和浓缩峰级分以获得CD47-ECD蛋白质的单体形式和二聚体形式。用10-倍摩尔过量的硫代-NHS-LC-生物素(Pierce)生物素化CD47-ECD蛋白质以用于噬菌体淘选实验。

噬菌体展示：内部新创噬菌体库(In-house de novo)详述于(Shi等人(2010)J.Mol.Biol.397:385-396；国际专利公开WO09/085462)。这些库以三个人VH胚系基因(IGHV1-69、3-23、5-51)和四个人VL胚系基因(A27、B3、L6、O12)为基础构建，被设计成具有较高的CDR-H3多样性。根据标准方案，针对二聚体形式的生物素化的人CD47-ECD淘选在噬菌体外壳蛋白pIX上展示Fab变体的三个新创噬菌体库(DNP00004-169HC/LC mix、DNP00005-323HC/LC mix和DNP00006-551HC/LC mix)。所使用的淘选条件包括：采用生物素化的人CD47 ECD二聚体在室温下淘选1小时，第1轮抗原浓度为100nM并在捕集噬菌体中使用链霉亲和素小珠；第2轮抗原浓度为100nM并在捕集噬菌体中使用中和亲和素小珠；并且第3轮抗原浓度为10nM并在捕集噬菌体中使用链霉亲和素小珠。产生Fab蛋白并通过多克隆抗Fd(CH1)抗体捕集到ELISA平板上。生物素化的CD47 ECD以期望的nM浓度添加，并且结合的生物素化CD47通过HRP-缀合的链霉亲和素和读板机的化学发光读数来检测。另外针对Fab克隆的VH和VL同一性对Fab克隆进行测序。利用PCR采用框架特异性引物从表达目的Fab的大肠杆菌克隆来扩增所选Fab的VH，并且亚克隆到包含用于哺乳动物表达的信号肽和人IgG2效应子功能沉默(IgG2 Fc沉默)重链恒定区的哺乳动物表达载体中。类似地，扩增VL并亚克隆到包含k轻链恒定区的哺乳动物表达载体中。亚克隆使用表4汇总的所用引物通过输注克隆(Clontech)进行。输注克隆也被称为连接非依赖性克隆(LIC)，其中DNA片段基于序列同源性彼此连接而无需使用限制性内切核酸酶或DNA连接酶。

表4：用于将Fab命中转化为mAb表达构建体的引物

将新产生的VH和VL哺乳动物表达DNA构建体配对在一起以产生10种mAb，用于进一步表征。它们在HEK293F细胞中被瞬时转染，并且通过FACS表征所得的包含mAb的上清液与Jurkat细胞上的CD47结合和阻断SIRP-α与Jurkat细胞结合的能力(如前所述)。将可商购获得的抗CD47 B6H12.2亚克隆到人IgG2sigma恒定区中并在测定中用作阳性对照。图1示出十种噬菌体衍生的mAb的活性，其中四种展示出强SIRP-α阻断活性。其中三种C47B91(＝C47M91)、C47B96(＝C47M96)和C47B98(＝C47M98)确认为CD47特异性细胞结合子并因而被选择以供进一步表征。

实施例3：CD47抗体的生物活性

使用如下所述的多种体外测定法分析所产生的总共23种CD47抗体(20种得自杂交瘤方法并且3种得自噬菌体展示方法)结合CD47并阻断CD47的某些生物活性的能力。

CD47结合测定：人CD47和猕猴CD47 ECD蛋白质作为如实施例2所述的His-标记蛋白内部产生。通过Protein Interaction Array系统(ProteOn)测定人CD47和猕猴CD47 ECD蛋白质的动力学结合亲和力。简而言之，经由抗-IgG-Fc使mAbs捕集于传感器芯片上以达到200-350RU的表面密度。将CD47 ECD单体蛋白质从300nM降至3.7nM连续滴定并注射5min。对解离监测30min。将数据拟合成1:1结合模型。23种mAb的K_D值以及对人和猕猴CD47蛋白质的亲和力之间的比率列出于3中。除了C47B121、C47B120和C47B131，大部分mAb示出猕猴CD47交叉反应性(人CD47亲和力的5倍之内)。

分箱测定：该测定允许评估独立作为捕集和检测试剂两者的抗体的组以及组中其余抗体。彼此形成有效捕集/检测试剂的抗体理论上识别单体蛋白质上空间分开的表位，因此允许两个抗体同时与靶蛋白结合。跨越整个实验对象组表现出相似活性模式的克隆组假设与相似表位结合。从不同组中选择克隆因此应当提供识别不同表位的抗体。将CD47抗体直接固定到GLC传感器(BioRad)上。将竞争性样品与200nM的CD47-ECD一起预温育4小时，然后注射到芯片表面上4min以允许缔合。然后监测解离，进行4min。结果表明可能存在4个不同的表位组，组1和组2重叠并彼此竞争，而组3仅与组1重叠但不与组2重叠。

SIRP-α阻断活性：23种CD47抗体阻断SIRP-α的效能通过连续滴定抗体并将其与捕集于MSD高结合板上的Jurkat细胞一同温育1小时来测量，然后在移除后再温育重组SIRPα-Fc与Jurkat细胞1.5小时。采用MSD磺基-标签标记的小鼠抗-SIRPα抗体检测结合的SIRP-α。将ECL信号绘制成抗体浓度的函数，并且使用GraphPad Prism中的非线性回归模型拟合剂量响应曲线获得EC₅₀值所有抗体都展示出SIRP-α与表达CD47的细胞结合的剂量依赖性抑制。图2示出在测定中抗-CD47 mAb的子集的剂量响应曲线。

血细胞凝集测定：另外在血细胞凝集测定中评估23种mAb的活性。简而言之，将血液从健康供体志愿者采集到Vacutainer采血管(BD Biosciences)中，用柠檬酸钠缓冲。血液用PBS洗涤三次并在PBS中制备2％红细胞悬浮液。在室温下，将50μl连续稀释的mAb(2倍)与50μl的2％红细胞悬浮液在干净的96-孔圆底板中温育2小时，随后当RBC在孔中不呈现为紧密小球时对血细胞凝集进行评分。对于大部分所测mAb，由其制备2倍连续稀释液的起始浓度为200μg/ml。在抗体原液浓度较不浓缩(C47B118和C47B119)的情况下，所制备的抗体起始浓度为85μg/ml。大部分测试的mAb诱导血细胞凝集(代表性的结果示于图3和图4)，然而未发现血细胞凝集与这些mAb的任何其它特性相关联。

在这些测定中，23种mAb的特性汇总于表5中。其中，C47B116和C47B91被选择用于进一步优化，原因是它们并未诱导血细胞凝集，示出有效的SIRP-α阻断活性以及对人CD47和猕猴CD47两者良好的亲和力。

表5：23种抗-CD47 mAb的特征，包括对人和猕猴CD47的亲和力、阻断SIRP-α的能力、表位箱和血细胞凝集(Hg)活性。适当处指出了可在视觉上观察到血细胞凝集的最低浓度。注意：B6H12.2的K_D数代表在相同实验中5个读数的平均值。NA：在同一个实验中未测试。

实施例4：C47B116的人框架适应

C47B116 VH结构域的氨基酸序列(SEQ ID NO:30)的初始分析表明，最接近的小鼠胚系基因为IGHV1S29*02(对于HV)和IGHJ4*01(对于HJ)。C47B116 VL结构域的氨基酸序列(SEQ ID NO:54)的初始分析表明，最接近的小鼠胚系基因为IGKV117*01和IGKJ2*01。就C47B116的人框架适应(HFA)以降低人的免疫原性而言，将使用内部新创库基于序列同源性分析和对未来亲和力成熟的考虑，四个人VH(IGHV1-3、IGHV1-46、IGHV1-69和IGHV5-51)和3个人VL(IGKV2-28、IGKV3-1和IGKV4-1)变体链设计成用人框架置换C47B116 VL和VH序列中的小鼠框架，同时保持CDR完整。通过基因装配产生各个VH(SEQ ID NO:4、5、31和32)和VL(SEQ ID NO:7、33和34)链的构建体并克隆到载体中以进行人IgG2sigma表达。将VH和VL变体的组合共转染到HEK 293Expi表达系统中，并且通过蛋白-A层析从培养上层清液纯化所得的12种HFA变体。就如前所述的SIRPα–阻断、与人和猕猴CD47的结合亲和力以及血细胞凝集而言，对经纯化的C47B116 HFA变体进行再次表征。就血细胞凝集测定而言，对于大部分所测mAb，由其制备2倍连续稀释液的起始浓度为200μg/ml。在抗体原液浓度较不浓缩的情况下，连续稀释液的起始浓度制备为125μg/ml(C47B160)、170μg/ml487B156)和195μg/ml(C47B159)。所有变体都展示出有效SIRP-α阻断活性(图5)。C47B148、C47B151、C47B152、C47B156和C47B160诱导血细胞凝集，这表明框架可有助于该活性。研究的所选C47B116 HFA变体的动力学结合研究示出对人CD47和猕猴CD47的亲和力类似。一些HFA变体(C47B155、C47B157、C47B159和C47B161)保留与CD47良好的结合亲和力(亲本mAb C47B116的5倍之内)，而其它(C47B147、C47B149、C47B151和C47B153)却示出更显著的亲和力损失(相比于C47B116减小多于6倍)。结果汇总于表6中。选择C47B157和C47B161进行进一步表征，因为它们维持有效的SIRP-α阻断活性、与人和猕猴CD47两者良好的结合亲和力，但是没有展示出血细胞凝集活性或生物物理特性问题。

表6：12种C47B116 HFA变体的SIRPα–阻断、与人CD47和猕猴CD47的亲和力以及血细胞凝集活性的表征适当处指出了可在视觉上观察到血细胞凝集的最低浓度。

实施例5：C47B91的亲和力成熟

C47B91(SEQ ID NO:35)的重链来自于5-51胚系，并且轻链(SEQ ID NO:36)来自于L6胚系。针对C47B91的亲和力成熟，设计两个Fab库。一个Fab库是重链库(C47F8L1)，将来自de novo V5.0的多样性添加至C47B91的VH中的CDR1和CDR2(表7)；并且另一个Fab库是轻链库(C47F18L1)，基于C47B91的VL胚系(L6)添加来自de novo V5.0的VL多样性(表8)。在pIX噬菌体展示系统中构建Fab文库，如在美国专利No.6,472,147和国际申请No.WO09/085462中有所描述，对限制性酶位点稍作修饰以用于克隆目的。

表7：针对轻链库的亲和力成熟设计

表8：针对重链库的亲和力成熟设计

针对表达全长人CD47的CHO-S哺乳动物细胞来淘选噬菌体外壳蛋白pIX上展示的亲和力成熟Fab库。通过在10％FBS/DMEM中于4℃一起温育过夜而用1×10⁸个CHO-S亲本细胞预澄清噬菌体库。通过离心回收预澄清的库以移除CHO-S亲本细胞，并通过PEG/NaCl沉淀进行浓缩。约1×10⁷个CHO-S CD47表达细胞用于每轮淘选，淘选在4℃下进行约2小时。与噬菌体结合的细胞用含40％Ficoll/2％BSA的PBS洗涤一次，并用冰-冷PBS/0.2％FBS洗涤3次。第1和第2轮使用CHO-S CD47高表达克隆，而第3轮使用CHO-S CD47高表达克隆或低表达克隆，从而富集更紧密的结合子。还使用相同的库利用生物素化CD47人CD47 ECD单体进行淘选。淘选在25℃下进行一小时，并且第1轮抗原浓度为1nM，第2轮为0.1nM，并且第3轮为0.1nM或0.01nM。通过添加链霉亲和素珠找回结合子以形成珠/抗原/噬菌体复合物，将其在TBST中洗涤。另选地，过夜洗涤用于尝试以更慢的解离速率富集结合子。

Fab产生由淘选后富集的噬菌体质粒DNA诱导。如前所述通过ELISA将包含分泌的Fab的上清液直接用于测试重组人SIRP-α与Jurkat细胞上人CD47结合的抑制，以及用于检查其与人CD47 ECD单体和二聚体的结合。另外对Fab克隆进行测序以检查其VH和VL同一性。Fab命中基于独特的序列、与ECD蛋白质的结合活性、以及SIRP-α阻断活性而选择。

利用PCR，采用框架特异性引物从表达目的Fab的大肠杆菌克隆扩增来自所选Fab的V_H。将扩增的片段亚克隆到包含用于哺乳动物表达的信号肽和人IgG2Sigma重链恒定区的哺乳动物表达载体中。类似地，扩增V_L片段并亚克隆到包含k轻链恒定区的哺乳动物表达载体中。亚克隆采用以下引物通过输注克隆(Clontech)进行：HuG1_DNVH_F551、HuG1_DNVH_R、HuK_DNVL_FA27L6muSP和HuK_DNVL_R(表3所列的序列)。将新产生的V_H和V_L哺乳动物表达DNA构建体配对在一起以产生mAb，用于进一步表征。

总共32种C47B91亲和力成熟的mAb如下产生：通过将10种亲和力成熟的VH链(SEQID NO:6，和37-45)与亲本VL链、4种亲和力成熟的VL链(SEQ ID NO:8，和46-48)与亲本VH链配对或得自最佳的链杂交。使它们在HEK 293 Expi细胞中表达，经由蛋白-A层析纯化，并针对SIRPα-阻断活性，与人和猕猴CD47的结合亲和力以及血细胞凝集活性进行表征。进行生物化学测定以研究变体阻断SIRP-α与CD47结合的能力。此时，将His-标记的CD47-ECD二聚体蛋白质在添加至捕集于MSD标准板上的SIRPα-Fc之前先与mAb一起预温育，然后通过将绵羊多克隆抗-CD47抗体(R&D系统)与MSD磺基-标签标记的抗绵羊抗体(Meso ScaleDiscovery)混合来检测结合的CD47的量。将抗体的SIRP-α阻断活性归一化为相对于无Ab(最大结合)和无CD47(背景)的信号的抑制百分比。这些10μg/ml的mAb的抑制活性示于表9中，并且32种mAb之中的25种展示出比10μg/ml的亲本C47B91更大的SIRP-α结合抑制。如前所述，通过ProteOn测量对人和猕猴CD47的结合亲和力。大部分变体示出相比于亲本C47B91mAb改善的亲和力，并且C47B222、C47B223、C27B226和C47B227示出最大的、相比于C47B91的亲和力更紧密5-7倍。重要地，这些变体中的一些的解离速率显著改善。一些变体并未诱导血细胞凝集，这表明CDR序列的变异也可有助于血细胞凝集活性。SIRPα–阻断、与人和猕猴CD47的结合亲和力以及血细胞凝集的数据汇总于表8中。

表9：32种C47B91 AM变体的SIRPα–阻断、与人CD47和猕猴CD47的亲和力以及血细胞凝集活性的表征适当处指出了可在视觉上观察到血细胞凝集的最低浓度。对于C47B214、 C47B218、C47B241、C47B242、C47B243和C47B244，测试两种供体，并且一种供体展示出响应于这些mAb的血细胞凝集。

实施例6：通过X射线晶体学的表位和互补位鉴定

抗体C47B161、C47B167、C47B222、C47B227和B6H12.2的详细表位和互补位通过使其对应的Fab与CD47 ECD-C15G突变体[(SEQ ID NO:49)，下文简称为CD47]共结晶来测定并且通过X射线晶体学进行结构测定。C47B167来源于表位箱3的C47B131的人框架适应，使用如实施例4中对C47B116所述的类似方法。其阻断SIRP-α结合(EC₅₀＝0.79μg/ml)、以中等亲和力与人CD47结合(kD＝5.2nM)并且不诱导血细胞凝集。

在HEK293细胞中表达His-标记的C47B161、C47B167、C47B222、C47B227 Fab，并使用亲和色谱和体积排阻色谱进行纯化。将His-标记的CD47去糖基化并通过亲和色谱进一步纯化。通过将Fab与过量的CD47以1.2:1.0至1.5:1.0的摩尔比混合来制备复合物CD47:Fab。使复合物在4℃下温育过夜，用尺寸排阻色谱法将其与未复合的种类分开，并且在20mMHEPES pH 7.4、100mM NaCl、5％甘油中浓缩至7.5-20mg/mL。然后，在20℃下利用坐滴法用浓缩的复合物建立结晶试验，并且通过改变蛋白质与贮存器的比率来最优化结晶。每种Fab-CD47复合物的最优化结晶条件列于表10中。

表10：CD47/Fab复合物的结晶条件

对于X射线数据收集，将一个晶体在含有补充有20％甘油的结晶溶液的冷冻保护剂溶液中浸泡数秒，并且在氮流中以100K速冻。衍射数据在Dectris Pilatus 6M PixelArray检测器和Argonne National Laboratory的先进光子源(Advanced Photon Source，APS)的射束线17-ID处经过240°晶体旋转收集，使用每0.25°图像2分钟暴露，并且用程序HKL2000处理。表11和12中给出了X射线数据统计。

表11：CD47/Fab复合物的晶体数据、X射线数据和精化统计

*括号中为高分辨率层的值。

表12：游离Fab的晶体数据、X射线数据和精化统计

*括号中为高分辨率层的值。

整体结构

CD47分子的结构模型包括从第1位到至少第114位的残基(对应于IgV结构域)，和第5、16、32、55和93位处的聚糖，不同的是C47B161 Fab复合物中的CD47无可见聚糖。CD47C-末端6xHis(SEQ ID NO:55)是无序的。Fab结构模型的轻链包含从第1位到至少第211位的残基，重链包含从第1位到至少第217位的残基。Fab C-末端6xHis标记(SEQ ID NO:55)和链间的双硫键是无序的。就C47B222/C47B227重链而言，第135-140位残基也是无序的。抗体/抗原结合位点由所有5种复合物中的电子密度明确限定，这使得结合残基能够可靠的定位。将Fab在所有图中依序地编号，并且CD47编号起始于成熟蛋白质的N-末端。

Fab复合物中的CD47分子在自身之间以及与结合到SIRP-α(Hatherley,2008)的CD47重叠，RMSD为这指示各种复合物中CD47的高度结构类似性并且不存在由Fab或受体结合诱导的较大构象变化。

表位、互补位和抗体/抗原相互作用

C47B161、C47B167和C47B222/C47B227/B6H12.2与3种不同的表位箱结合，如由抗体竞争性分箱测定所显示的那样。C47B222和C47B227与相同的总体位置结合，而C47B167更靠近于细胞膜结合，并且C47B161和B6H12.2与CD47的更尖端区结合。与更靠近膜的表位结合可导致对Fab的附加约束，这可能传送给抗体中的第二Fab臂并使该臂与另一个CD47分子结合更具挑战性。我们推测对第二Fab臂的约束是由于表位位置可从CD47/抗体/CD47交联转化为较少的细胞聚集。就C47B222 Fab而言，HC与CD47的接触比LC更为广泛，并且其为更靠近膜的链。

表位和互补位序列示于图6中。下文详细讨论了CD47与各个Fab之间发生的相互作用的细节。

CD47/C47B161复合物

C47B161识别由CD47N-末端(Q1和L3)、BC(N27和E29)和FG(残基101-103)环区和F(残基E97)和G(E104)β-链中的残基构成的构象表位，如图7所示。M259与表位箱2区结合并覆盖CD47上的约的面积。

互补位由除CDR-L3外的五个CDR中的残基构成。LC主要定位于CD47 β-折叠上，而HC覆盖抗原的尖端环区。相比于待评估的其它抗-CD47 Fab，C47B161具有在第30位插入有六个残基的长CDR-L1。靠近CDR-L1环顶端的Y35和Y37残基通过H键合CD47的β-折叠增强抗体对其抗原的亲和力(图7C)。L1环顶端的其它残基(H31和N33残基)并不参与与CD47直接接触，但是其在使Y35特别是Y37定向中发挥重要作用以与CD47有效相互作用。在VH侧面，所有CDR都参与了与抗原，特别是与环化为焦谷氨酸盐的N-末端Q1残基以及27-29和102-103环片段相互作用(图7B和7D)。

CD47/C47B167复合物

C47B167识别由C(Y37和K39)、C’(R45、D46和T49)和C”(N55-T58)β-链和C‘C”(A53、L54)以及C”E(V59-T61、S64、A66、K67)环区的残基构成的构象表位，如图8所示。C47B167与表位箱3区结合并覆盖CD47上的约的面积。

C47B167互补位由所有六个CDR的残基形成。C和C’β-链(Y37、K39、R45、D46和T49)仅与LC CDR相互作用，而环区64-67仅接触长CDR-H3(插入9个残基)。

C47B167降低了与食蟹猕猴CD47的交叉反应性，这是由于表位区V59-T61的序列趋异(参见图8A中的序列比对片段)。对于猕猴CD47而言T61A人的变化破坏了猕猴的残基61与LC残基D49和R52之间的H键(图8C)。另外，猕猴CD47中第62位潜在的N-键合的糖基化位点(且不在人中)可产生抗体与V59-T61区结合的空间位阻。V59A变化应当具有微小影响(图8D)。

表位箱2和3之间不存在常见残基。C47B161(箱2)和C47B167(箱3)可同时与CD47结合而无任何碰撞区，如图9所示。该结果还使用抗体竞争性分箱测定展示(参见实施例3)。C47B167识别的CD47β-折叠的区域比C47B161更大，并且与细胞膜结合更靠近许多。

CD47/C47B222和CD47/C47B227复合物

C47B222识别由C(Y37和K39)、C’(D46、T49、D51)、C”(K56、T58)和F(T99)β-链和BC(E35)、C’C”(A53和L54)、C”E(V59)和FG(L101、T102)环区的残基构成的构象表位，如图10所示。C47B222的表位位于箱1区并覆盖约的CD47面积。C47B222与C47B161、C47B167、C47B227和B6H12.2竞争性结合CD47。与其它表位重叠的C47B222表位的区域示于图6中。

C47B222互补位由除CDR-L3外的所有CDR中的残基构成。利用H键和范德瓦尔斯接触的组合，通过重链使得大多数C47B222与CD47相互作用(图10)。由HC和LC互补位识别的表位区之间存在明显分离。重链相互作用排他性地与C’C”环和所有β-链表位区域(除F链之外)相互作用。轻链也排他性地与BC和FG环和F链结合，占据用于极有效地阻断SIRP-α与CD47结合的CD47上更顶点的位置。C’C”环中亮氨酸54处于结合位点的中心位置并且接触所有三个重链CDR(图10B)。C”链氢键CDR-H2以及C和C’β-链接触CDR-H3。

C47B227构象表位也位于箱1中。表位覆盖约的CD47面积，由β-折叠的所有链(链C：Y37；链C’：T49和D51；链C”：N55、K56和T58；链F：T99；链G：E104)和BC的片段(E35)、C’C”(残基范围53-55)以及FG(L101,T102)环区的残基构成，如图11所示。

C47B227互补位由所有CDR的残基构成。类似于C47B222，C47B227的重链排他性地与C,C’和C”β-链以及大部分C’C”环区相互作用——除处于C’C”环中并与CDR-L3范德瓦尔斯接触的A53之外。M263的轻链与F和G链以及BC和FG环结合。C47B222和C47B227以类似的取向与CD47结合，并且共享多个表位和互补位残基(图6)。

C47B222与C47B227具有97％的序列同一性，在靠近或处于CDR处的区域中有6个氨基酸变化(从C47B222到C47B227的变化为：HC：T30D，以及LC:N30G、N31S、H49Y、I56T和S93Y参见图6)。然而，C47B222和C47B227以相同的总体取向与CD47结合，并且大致识别具有类似亲和力(约1nM)的相同表位区域。该种耐受不同轻链的表位是C47B222/C47B227识别CD47的直接结果，这很大程度上基于HC接触和由HC和LC互补位识别的表位区域之间的分离(表位分离)。此外，C47B222与C47B227之间有效的残基变化数目仅为三个(N30G、N31S和S93Y)，因为重链T30D以及轻链H49Y和I56T变化过于远离(大于)结合位点而无法对CD47识别发挥作用。在C47B222中用Asn置换G30仅诱导CD47FG环略微不同的位置调节，以避免L101与N30之间的空间碰撞，如图11A所示。M263中N31S和S93Y变化而与T102主链和E35产生新的H键，加强C47B227 LC与CD47的相互作用，并且反平衡C47B227的CDR-H3相比于C47B222产生的更少H键，所述C47B222采用不同的构象且使H独特地键合CD47残基Y37、K39、D46和D51(图10-12)。

CD47/B6H12.2复合物

使B6H12.2与表位箱1区结合并且将其用作对照抗体。B6H12.2识别由C(V36、Y37、K39和K41)、C’(D46、D51)、F(E97、T99)和G(E104)β-链和BC(E29、Q31、N32、T34和E35)、C’C”(A53)以及FG(E100-R103)环区的残基构成的构象表位，如图10所示。不同于也簇生于箱1中的C47B222和C47B227，B6H12.2并不识别C”β-链或C”D环区的任何残基。然而，B6H12.2具有比C47B161、C47B167、C47B222和C47B227更大的表位面积(约相比于C47B161的C47B 167的C47B222的以及C47B227的)。

B6H12.2互补位由所有CDR中的残基构成(图13)。抗体和抗原识别似乎主要由H键驱动。轻链使6H与CD47侧链键合且3H与主链原子键合。另一方面，重链参与13H与CD47键合，其大部分涉及主链原子。B6H12.2具有深度进入结合位点的短CDR-H3，稳定FG环并给予CDR-H2在BC环顶部上伸展的空间。重链排他性地接触BC(主要为CDR-H2)、C’C”(CDR-H3)和大部分FG(CDR-H2和H3)环区，而LC排他性地接触C’链和邻近的C链的C-末端区域。然而，对于B6H12.2的表位分离比C47B222和C47B227更少。存在在与HC和LC两者相互作用的F链和FG环中的多个表位残基。

表位汇总

不同于C47B161，B6H12.2并不识别CD47的N-末端区域。不同于C47B167、C47B222和C47B227，B6H12.2并不识别CD47的C”β-链或C”D环区的任何残基(参见图6)。具体地，与B6H12.2所鉴定的表位不一致的各个Fab的表位残基为：

C47B161：N-末端(Q1和L3)和BC环(N27)区域中的残基。

C47B167：β-链C’(R45和T49)、C’C”环(L54)、β-链C”(K56、S57和T58)以及C”D环(V59、P60、T61、S64和K67)区域中的残基。

C47B222：β-链C’(T49)、C’C”环(L54)、β-链C”(K56和T58)以及C”D环(V59)区域中的残基。

C47B227：C’C”环(L54)和β-链C”(K56和T58)区域中的残基。

实施例7：CD47抗体的表征

将具有期望特性的几种人CD47 IgG2sigma抗体转化为IgG1 Fc形式以用于进一步生物测定评估。其IgG1变体被确认与人CD47结合，并阻断SIRP-α结合。在体外进一步评估不诱导血细胞凝集的IgG1/IgG2sigma Fc变体(C47B222、C47B157和C47B161)的吞噬作用、细胞凋亡、互补序列介导的细胞毒性(CDC)以及血小板聚集活性的增强。此外，在体内测试这三种mAb的抗肿瘤活性。

吞噬作用：

进行体外吞噬作用测定以评估C47B157、C47B161和C47B222是否增强人巨噬细胞对表达CD47的靶细胞的吞噬。简而言之，使用Stemcell EasySep人单核细胞富集试剂盒通过负消耗法从leukopak纯化的PBMC分离CD14阳性单核细胞而无需CD16耗竭。将经纯化的单核细胞以0.1×10⁶个细胞/cm²铺板到补充有10％FBS(Invitrogen)和25ng/ml M-CSF(R&DSystems)的X-VIVO-10培养基(Lonza)中，并且分化为巨噬细胞七天。在分化的最终24小时期间，将IFN-γ(R&D Systems)以50ng/ml添加。随后，通过Accutase(Sigma)处理从组织培养皿中分离贴壁巨噬细胞，并在各种浓度的抗-CD47mAb的存在下，将巨噬细胞(1×10⁵)与表达GFP的Jurkat细胞(1×10⁵)以1:1比率铺板到96-孔U底板中。将细胞在37℃下温育90分钟。在温育完成时，将细胞用PBS洗涤一次并用Accutase分离细胞(20分钟温育)。沉淀细胞，洗涤并将巨噬细胞用APC缀合的抗人CD11b抗体(eBiosciences)染色30分钟后，用染色缓冲液(BD Biosciences)洗涤两次。在MacsQuant流式细胞仪上获得细胞。用FloJo软件分析数据。吞噬百分比由下式确定：[((GFP^pos,Cd11bpos^pos细胞)/(GFP^pos,CD11b^pos+GFP^pos细胞))×100％].

这些实验展示出，IgG1 B157、B161、B222和B6H12.2示出强劲的吞噬增强能力，而IgG2sigma B157、B161、B222和B6H12.2(图14)最小地增强吞噬。

细胞凋亡：

几种抗-CD47 mAb(例如，AD-22、1F7和MABL-1)已被描述在连接CD47时介导可溶形式的靶细胞凋亡。为测试C47B15、C47B161和C47B222是否在连接CD47时介导细胞凋亡，在存在或不存在抗体的情况下(0.05、0.5和5μg/ml)，将Jurkat细胞或HL60细胞(1×10⁶个细胞/ml，100μl)在补充有10％FBS的RPMI1640中于37℃下温育24小时。用FITC Annexin-V细胞凋亡检测试剂盒(BD Pharmingen)检测细胞凋亡。细胞凋亡表达为早期细胞凋亡(膜联蛋白-V阳性/PI阴性)和晚期细胞凋亡(膜联蛋白-V阳性/PI阴性)的总和。

这些实验显示，对照mAb B6H12.2在Jurkat和HL60细胞中作为IgG2sigma而非作为IgG1诱导强劲的细胞凋亡(参见图15)。类似地，C47B157和C47B161在Jurkat细胞中作为IgG2sigma而非作为IgG1诱导较低水平的细胞凋亡。IgG1/IgG2sigma C47B157和C47B161对HL60细胞没有促凋亡效应。将Jurkat和HL60细胞用IgG1或IgG2sigma C47B222处理24小时并未导致细胞凋亡诱导。

互补序列介导的细胞毒性：

测试C47B157、C47B161和C47B222的互补序列介导的细胞毒性(CDC)。CDC测定采用Wil2-S靶细胞进行。将50,000个Wil2-S细胞铺板到白色不透明96-孔板的补充有10％热灭活的FBS和0.1mM NEAA的25μl RPMI-1640(所用试剂均得自Invitrogen)中。在加入25μl的补充有或不补充抗体的培养基时，将细胞在37℃下温育30分钟。随后，添加50μl的人血清(Bioreclamation，保留互补序列)并将细胞在37℃下温育2小时。为评估最大裂解，将20μl的2％Triton-X-100添加到对照孔中并将细胞在37℃下温育2小时。在温育完成之后，将100μl的CellTiter-Glo试剂(Promega；缓冲液和底物的预混物)添加到各个孔中，将内容物温和地混合以诱导细胞裂解并在2104EnVision Multilabel阅读器(Perkin Elmer)上记录发光值。特异性裂解通过以下公式计算：[特异性裂解＝((实验释放-自发释放)/(最大释放-自发释放))*100]。

如图16所示，IgG1/IgG2sigma C47B157、C47B161和C47B222并未作为IgG1或IgG2sigma增强CDC。相比之下，类似于阳性对照利妥昔单抗，工具mAb B6H12.2IgG1介导强劲的CDC，但是在效应子功能沉默IgG2sigma主链中并未增强CDC。

血小板聚集：

基于观察到可商购获得的抗-CD47 mAb B6H12(mIgG1)诱导血小板聚集(FujimotoTT,Katsutani S,Shimomura T,Fujimura K.(2003)J Biol Chem 278:26655-26665)，建立测定以测定C47B157、C47B161和C47B222的血小板聚集活性。简而言之，将血液从健康供体志愿者采集到Vacutainer采血管(BD Biosciences)中，用柠檬酸钠缓冲。根据制造商规程，利用PDQ血小板功能离心机(Biodata Corporation)制备富含血小板的血浆(PRP)和血小板稀少的血浆(PPP)。如制造商所建议，用PAP-8E血小板凝集计(Biodata Corporation)测量血小板聚集。具体地，将25μl的ADP(阳性对照；Biodata Corporation)或抗体添加到225μl的PRP中，以达到10μM ADP或100、140、150或200μg/ml的测试抗体最终浓度(根据所测抗体的可用性)。通过在连续搅拌下于37℃测量光通过250μl样品的透射率来测定聚集。PPP的透射率设定为100％。将聚集共记录6分钟。

为评估本文所述mAb的血小板聚集活性，评估独立供体的八个测定：1.)进行将IgG1/IgG2sigma B6H12.2的活性与阳性对照10μM ADP和阴性对照PBS比较的五个实验；以及2.)进行将IgG1/IgG2sigma C47B157、C47B161和C47B222的活性与IgG1 B6H12.2和阴性PBS对照比较的三个实验。血小板聚集测定展示，当以范围为100至200μg/ml的浓度测试时，三个独立供体的C47B157、C47B161和C47B222在IgG1或IgG2sigma主链情况下并未诱导血小板聚集(参见图17b-d，其描述在200μg/ml下运行的实验结果)。对IgG1/IgG2sigmaC47B157、C47B161和C47B222所观察的最大聚集的范围为0至7％，类似于对PBS对照所观察的(八个独立供体；最大聚集范围为2-11％)。相比之下，以100和200μg/ml测试的B6H12.2作为IgG1诱导聚集，范围为40至93％(八个供体)，类似于阳性对照10μM ADP(五个供体；聚集范围为55至120％)，但是不作为IgG2sigma诱导，范围为1至6％(五个独立供体)。

CD47抗体的Fc变体的体内抗肿瘤功效：

在三个人肿瘤细胞模型中测试C47B157、C47B161和C47B222的体内抗肿瘤活性。简而言之，对于前两个模型，将10×10⁶个HL-60或5×10⁶个MV4-11细胞经静脉注射植入NSG小鼠中。对于这两个模型，在肿瘤细胞植入后第6天开始抗体治疗，动物每周经腹膜内注射以0.2和10mg/kg给药两次。总共施用六次剂量(在第23天施用最终剂量)，并且每个剂量组由五只小鼠组成。对于HL-60/NSG小鼠模型，每周从小鼠采集外周血并在第14天开始经由FACS分析评估肿瘤细胞生长和治疗效果(在第42天最终采集)。对于MV4-11/NSG模型，在第34天从小鼠采集外周血并经由FACS分析来评估对外周血中肿瘤细胞生长的治疗效果。在第三体内模型中，将10×10⁶个Kasumi-3细胞经静脉注射植入NSG小鼠中，并且在肿瘤细胞植入后第6天开始治疗。动物每周经腹膜内注射以0.2和10mg/kg给药两次，总共给予12次剂量。最终剂量在第44天施用，并且每个剂量组由五只小鼠组成。每周从小鼠采集外周血并在第14天开始经由FACS分析评估外周血中肿瘤细胞的生长。

在所有三个测试模型中，C47B157、C47B161、C47B222和B6H12.2都展示出抗肿瘤活性。当在HL60模型中测试时(参见图18)，各个mAb的功效均依赖于所测剂量和各个mAb的Fc效应子功能。所有mAb的效应子功能组分IgG1和效应子功能沉默IgG2 sigma形式都展示出剂量依赖性活性。IgG1在10mg/kg下强劲地抑制肿瘤细胞生长并在0.2mg/kg下延缓肿瘤细胞生长。IgG2sigma在10mg/kg下延缓肿瘤细胞生长，而在0.2mg/kg下抗肿瘤效应却较不明显。类似于HL60模型，当在MV4-11模型内测试时(图19)，mAb作为IgG1以0.2和10mg/kg有效地抑制肿瘤细胞生长。当在IgG2 sigma主链情况下测试mAb时，肿瘤细胞生长抑制较小。虽然效应子功能在HL60和MV4-11模型中提供功效增强，但是当在IgG1或IgG2sigma主链中以0.2和10mg/kg两者测试时，IgG1和IgG2sigma C47B157、C47B161、C47B222和B6H12.2展示出强劲的抗肿瘤活性(图20)。

实施例8：提出抗体中和的模式

如前面的实施例所提及，抗体产生如下结果：很可能通过阻断靶细胞中的CD47与SIRP-α受体结合，可促进巨噬细胞中的细胞吞噬作用，并因此破坏原本靶细胞将发送给巨噬细胞的“别吃我”的信号。图21中CD47/Fab结构与CD47/SIRP-α结构的重叠示出，所有Fv结构域与SIRP-αD1结构域之间的碰撞区，使得抗体和SIRP-α两者不可能同时与CD47结合。

序列表简述

Claims

1.一种分离抗体，所述分离抗体包括以下特性：

a.所述抗体与CD47特异性结合；

b.所述抗体阻止CD47与信号调节蛋白-α(SIRP-α)相互作用；

c.所述抗体不具有显著的血小板聚集活性。

2.根据权利要求1所述的抗体，其中所述抗体通过与以下CD47(SEQ ID NO:21，不包括信号序列)氨基酸残基相互作用而与CD47特异性结合：

a.Q1、L3、N27、E29、E97、L101、T102、R103和E104；

b.Y37、K39、R45、D46、T49、A53、L54、N55、K56、S57、T58、V59、P60、T61、S64、A66和K67；

c.E35、K39、Y37、D46、49、D51、A53、L54、K56、T58、V59、T99、L101和T102；或

d.E29、Q31、N32、T34、E35、V36、Y37、K39、N41、D46、D51、A53、E97、T99、E100、L101、T102、R103和E104。

3.一种分离抗体，所述分离抗体与人或猕猴CD47特异性结合，并且包含选自SEQ IDNO:4-6的可变重(VH)链区。

4.根据权利要求3所述的抗体，其中所述抗体或其抗原结合片段包含选自SEQ ID NO:7和8的可变轻(VL)链区。

5.根据权利要求3所述的抗体，其中所述抗体或其抗原结合片段包含选自SEQ ID NO:4-6的VH区和选自SEQ ID NO:7和8的VL区。

6.根据权利要求5所述的抗体，其中所述VH链区包含与包含SEQ ID NO:7的VL链区配对的SEQ ID NO:4或SEQ ID NO:5。

7.根据权利要求5所述的抗体，其中所述VH链区包含与包含SEQ ID NO:8的VL链区配对的SEQ ID NO:6。

8.根据权利要求3所述的抗体，其中所述抗体或其抗原结合片段包含如SEQ ID NO:9或SEQ ID NO:10所示的VH互补决定区1(CDR1)序列、如SEQ ID NO:11或SEQ ID NO:12所示的VH CDR2序列、如SEQ ID NO:13或SEQ ID NO:14所示的VH CDR3序列、如SEQ ID NO:15或SEQID NO:16所示的VL CDR1序列、如SEQ ID NO:17或SEQ ID NO:18所示的VL CDR2序列以及如SEQ ID NO:19或SEQ ID NO:20所示的VL CDR3序列。

9.根据权利要求8所述的抗体，其中所述抗体或其抗原结合片段包含如SEQ ID NO:9所示的VH CDR1序列、如SEQ ID NO:11所示的VH CDR2序列、如SEQ ID NO:13所示的VH CDR3序列、如SEQ ID NO:15所示的VL CDR1序列、如SEQ ID NO:17所示的VL CDR2序列以及如SEQID NO:19所示的VL CDR3序列。

10.根据权利要求8所述的抗体，其中所述抗体或其抗原结合片段包含如SEQ ID NO:10所示的VH CDR1序列、如SEQ ID NO:12所示的VH CDR2序列、如SEQ ID NO:14所示的VH CDR3序列、如SEQ ID NO:16所示的VL CDR1、如SEQ ID NO:18所示的VL CDR2序列以及如SEQ IDNO:20所示的VL CDR3序列。

11.根据前述权利要求中任一项所述的抗体，其中所述抗体的VH链与CD47的接触比所述抗体的VL链更为广泛。

12.根据权利要求2-10中任一项所述的抗体，其中所述抗体的VH链所结合的表位被定位在表达CD47的细胞的膜附近，并且其中所述抗体的VL链阻塞CD47上的SIRP-α结合位点。

13.根据前述权利要求中任一项所述的抗体，其中所述抗体不具有显著的血细胞凝集活性。

14.根据前述权利要求中任一项所述的抗体，其中所述抗体的血小板聚集活性比不含所述抗体时观察到的血小板聚集度大不超过10％。

15.根据前述权利要求中任一项所述的抗体，其中所述抗体是嵌合抗体、人源化抗体、或完全人抗体。

16.根据前述权利要求中任一项所述的抗体，其中所述CD47是人CD47或猕猴CD47。

17.根据前述权利要求中任一项所述的抗体，其中所述抗体或其抗原结合片段促进巨噬细胞介导的对表达CD47的细胞的吞噬作用。

18.根据前述权利要求中任一项所述的抗体，其中所述抗体或其抗原结合片段包含选自IgG1同种型和IgG2同种型的IgG同种型。

19.一种药物组合物，所述药物组合物包含根据权利要求1至17中任一项所述的抗体和药学上可接受的载体。

20.一种缓解癌症症状或其它赘生性病症的方法，所述方法包括将根据权利要求1至17中任一项所述的抗体以足以缓解受试者的所述癌症症状或其它赘生性病症的量施用于有此需要的所述受试者。

21.根据权利要求20所述的方法，其中所述受试者是人。

22.根据权利要求20或21所述的方法，其中所述抗体是嵌合抗体、人源化抗体、或完全人抗体。

23.根据权利要求20至22中任一项所述的方法，其中所述抗体或其抗原结合片段阻止CD47与SIRP-α相互作用。

24.根据权利要求20至23中任一项所述的方法，其中所述抗体包含选自IgG1同种型和IgG2同种型的IgG同种型。

25.根据权利要求20至24中任一项所述的方法，所述方法还包括施用化学治疗。