CN110577597A - 一种阻断CD47和SIRPα相互作用的抗体 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及靶向CD47的特异性抗体其制造方法和应用。

Description

一种阻断CD47和SIRPα相互作用的抗体
技术领域
本公开涉及靶向CD47的特异性抗体其制造方法和应用。
背景技术
CD47(UniProt Q08722)是一种跨膜糖蛋白，由N端IgV样胞外区、五次穿膜区以及短的胞内区组成。由于最早是从卵巢癌组织中克隆得到，CD47曾经一度被认为是一种肿瘤抗原，其表达水平也与肿瘤的进展相关。后来发现CD47也表达于多数正常细胞表面，但在肿瘤细胞通常高表达。
CD47通过与配体的相互作用发挥生物学功能。抑制性受体信号调节蛋白SIRPα(CD172a，UniProt P78324)是CD47最重要的配体之一，CD47和SIRPα的相互作用，被 认为是先天免疫系统中，巨噬细胞识别自我和非自我的重要机制。Oldenborg等人发现缺乏 CD47的小鼠红细胞迅速由脾巨噬细胞从血液中清除，而正常红细胞上的CD47通过与SIRPα 的结合抑制了这种吞噬。Han等人证实抗CD47单克隆抗体或CD47融合蛋白可以阻断巨噬 细胞的融合。
肿瘤细胞也利用同样的机制逃避巨噬细胞杀伤，肿瘤细胞通常在细胞膜表面表达高水平 的CD47分子，从而被机体识别为“自我”。Jaiswal等在人白血病细胞系高表达小鼠CD47分 子，发现在荷瘤小鼠体内，人白血病细胞可以有效逃避小鼠巨噬细胞的吞噬。Majeti等在急 性髓细胞白血病小鼠模型中，利用阻断CD47和SIRPα相互作用的CD47单克隆抗体，发现 在治疗组中小鼠的骨髓及外周血中的白血病细胞明显减少，长期生存率大幅度提高。Chao 等发现CD47单抗与利妥昔单抗联用具有显著的协同作用。Weiskopf等利用高亲和力的人 SIRPα，发现能有效地拮抗癌细胞上的CD47，同样显示出与肿瘤特异性单克隆抗体的协同 作用。
CD47抗体可用于治疗多种CD47阳性的血液瘤和实体瘤，包括非霍奇金淋巴瘤(NHL)、 急性淋巴细胞性白血病(ALL)、急性骨髓性白血病(AML)、慢性淋巴细胞性白血病(CLL)、 慢性骨髓性白血病(CML)、多发性骨髓瘤(MM)、乳腺癌、卵巢癌、前列腺癌、头颈癌、膀胱癌、黑素瘤、结直肠癌、胰腺癌、肺癌、食道癌、肝癌、肾癌、平滑肌癌、平滑肌肉瘤、 胶质瘤、成胶质细胞瘤等。
动脉粥样硬化的发生可能与CD47的上调有关，凋亡细胞通过上调CD47表达，抵御巨 噬细胞的清除。Kojima等发现CD47阻断抗体在多种小鼠模型中，可以使患病血管组织的清除正常化，并改善动脉粥样硬化。
鉴于CD47在各类相关疾病中作用和功能，本领域仍然需要开发适于治疗患者的改善的 抗CD47特异性抗体。本专利中提供的抗体一方面能特异性结合人CD47的胞外区，另外一 方面，抗-CD47抗体能阻碍CD47与SIRPα之间的结合，促进巨噬细胞的吞噬作用，抗体不会造成红细胞凝集反应，在人源化转基因小鼠体内没有明显的毒性作用。
发明内容
在一方面，本公开涉及特异性结合CD47的抗体或其功能片段。
根据前一方面的抗体或其功能片段，其包含选自氨基酸序列SEQ ID NO：2-4、12-14、 22-24、32-34、42-44、52-54、62-64、72-74、82-84、92-94、102-104、107-109、112-114、117-119、122-124、132-134、137-139、142-144、147-149、152-154或其任何变体的重链CDR，和/或选自氨基酸序列SEQ ID NO：7-9、17-19、27-29、37-39、47-49、57-59、67-69、77-79、87-89、97-99、157-159、162-164、167-169、172-174、177-179或任何变体的轻链CDR。
根据前一方面的抗体或其功能片段，其包含选自氨基酸序列SEQ ID NO：2、12、22、32、 42、52、62、72、82、92、102、107、112、117、122、127、132、137、142、147、152或 其任何变体的重链CDR1，选自氨基酸序列SEQ ID NO：3、13、23、33、43、53、63、73、 83、93、103、108、113、118、123、128、133、138、143、148、153或其任何变体的重链 CDR2，选自氨基酸序列SEQID NO：4、14、24、34、44、54、64、74、84、94、104、114、 119、124、129、134、139、144、149、154或其任何变体的重链CDR3；和/或选自氨基酸 序列SEQ ID NO：7、17、27、37、47、57、67、77、87、97、157、162、167、172、177或 其任何变体的轻链CDR1，选自氨基酸序列SEQ ID NO：8、18、28、38、48、58、68、78、 88、98、158、163、168、173、178或其任何变体的轻链CDR2，选自氨基酸序列SEQ ID NO：9、 19、29、39、49、59、69、79、89、99、159、164、169、174、179或其任何变体的轻链 CDR3。
根据前述任一方面的抗体或其功能片段，其包含选自氨基酸序列SEQ ID NO：1、11、21、 31、41、51、61、71、81、91、101、106、111、116、121、126、131、136、141、146、151 或其任何变体的重链可变区，和/或选自氨基酸序列SEQ ID NO：6、16、26、36、46、56、 66、76、86、96、156、161、166、171、176或其任何变体的轻链可变区。
在一方面，本公开涉及一种抗体或其功能片段，其包含选自氨基酸序列SEQ IDNO：101 或其任何变体的重链可变区，和/或选自氨基酸序列SEQ ID NO：156或其任何变体的轻链可 变区。
在一方面，本公开涉及一种抗体或其功能片段，其包含选自氨基酸序列SEQ IDNO：106 或其任何变体的重链可变区，和/或选自氨基酸序列SEQ ID NO：156或其任何变体的轻链可 变区。
在一方面，本公开涉及一种抗体或其功能片段，其包含选自氨基酸序列SEQ IDNO：111 或其任何变体的重链可变区，和/或选自氨基酸序列SEQ ID NO：156或其任何变体的轻链可 变区。
在一方面，本公开涉及一种抗体或其功能片段，其包含选自氨基酸序列SEQ IDNO：116 或其任何变体的重链可变区，和/或选自氨基酸序列SEQ ID NO：156或其任何变体的轻链可 变区。
在一方面，本公开涉及一种抗体或其功能片段，其包含选自氨基酸序列SEQ IDNO：121 或其任何变体的重链可变区，和/或选自氨基酸序列SEQ ID NO：156或其任何变体的轻链可 变区。
在一方面，本公开涉及一种抗体或其功能片段，其包含选自氨基酸序列SEQ IDNO：126 或其任何变体的重链可变区，和/或选自氨基酸序列SEQ ID NO：156或其任何变体的轻链可 变区。
在一方面，本公开涉及一种抗体或其功能片段，其包含选自氨基酸序列SEQ IDNO：131 或其任何变体的重链可变区，和/或选自氨基酸序列SEQ ID NO：156或其任何变体的轻链可 变区。
在一方面，本公开涉及一种抗体或其功能片段，其包含选自氨基酸序列SEQ IDNO：136 或其任何变体的重链可变区，和/或选自氨基酸序列SEQ ID NO：156或其任何变体的轻链可 变区。
在一方面，本公开涉及一种抗体或其功能片段，其包含选自氨基酸序列SEQ IDNO：141 或其任何变体的重链可变区，和/或选自氨基酸序列SEQ ID NO：156或其任何变体的轻链可 变区。
在一方面，本公开涉及一种抗体或其功能片段，其包含选自氨基酸序列SEQ IDNO：146 或其任何变体的重链可变区，和/或选自氨基酸序列SEQ ID NO：156或其任何变体的轻链可 变区。
在一方面，本公开涉及一种抗体或其功能片段，其包含选自氨基酸序列SEQ IDNO：151 或其任何变体的重链可变区，和/或选自氨基酸序列SEQ ID NO：156或其任何变体的轻链可 变区。
在一方面，本公开涉及一种抗体或其功能片段，其包含选自氨基酸序列SEQ IDNO：101 或其任何变体的重链可变区，和/或选自氨基酸序列SEQ ID NO：161或其任何变体的轻链可 变区。
在一方面，本公开涉及一种抗体或其功能片段，其包含选自氨基酸序列SEQ IDNO：106 或其任何变体的重链可变区，和/或选自氨基酸序列SEQ ID NO：161或其任何变体的轻链可 变区。
在g方面，本公开涉及一种抗体或其功能片段,其包含选自氨基酸序列SEQ ID NO：111 或其任何变体的重链可变区，和/或选自氨基酸序列SEQ ID NO：161或其任何变体的轻链可 变区。
在一方面，本公开涉及一种抗体或其功能片段，其包含选自氨基酸序列SEQ IDNO：116 或其任何变体的重链可变区，和/或选自氨基酸序列SEQ ID NO：161或其任何变体的轻链可 变区。
在一方面，本公开涉及一种抗体或其功能片段，其包含选自氨基酸序列SEQ IDNO：121 或其任何变体的重链可变区，和/或选自氨基酸序列SEQ ID NO：161或其任何变体的轻链可 变区。
在一方面，本公开涉及一种抗体或其功能片段，其包含选自氨基酸序列SEQ IDNO：126 或其任何变体的重链可变区，和/或选自氨基酸序列SEQ ID NO：161或其任何变体的轻链可 变区。
在一方面，本公开涉及一种抗体或其功能片段，其包含选自氨基酸序列SEQ IDNO：131 或其任何变体的重链可变区，和/或选自氨基酸序列SEQ ID NO：161或其任何变体的轻链可 变区。
在一方面，本公开涉及一种抗体或其功能片段，其包含选自氨基酸序列SEQ IDNO：136 或其任何变体的重链可变区，和/或选自氨基酸序列SEQ ID NO：161或其任何变体的轻链可 变区。
在一方面，本公开涉及一种抗体或其功能片段，其包含选自氨基酸序列SEQ IDNO：141 或其任何变体的重链可变区，和/或选自氨基酸序列SEQ ID NO：161或其任何变体的轻链可 变区。
在一方面，本公开涉及一种抗体或其功能片段，其包含选自氨基酸序列SEQ IDNO：146 或其任何变体的重链可变区，和/或选自氨基酸序列SEQ ID NO：161或其任何变体的轻链可 变区。
在一方面，本公开涉及一种抗体或其功能片段，其包含选自氨基酸序列SEQ IDNO：151 或其任何变体的重链可变区，和/或选自氨基酸序列SEQ ID NO：161或其任何变体的轻链可 变区。
根据前述任一方面的抗体或其功能片段，其中所述抗体是抗体片段。
根据前述任一方面的抗体或其功能片段，其中所述抗体或其功能片段阻断CD47与SIRPα相互作用。
根据前述任一方面的抗体或其功能片段，其中所述抗体或其功能片段是人源化的。
抗体或其功能片段，其与前述任一方面的抗体或其功能片段具有至少大于60％、65％、 70％、75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％或更高的序列同一性。
编码如前述任一方面的抗体或其功能片段的核酸分子，或与其具有至少大于60％、65％、 70％、75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％或更高的序列同一性的核酸 分子。
含有如前述任一方面的核酸的载体。
含有如前述任一方面的载体的细胞。
包含如前述任一方面的抗体或其功能片段或其编码核酸和可药用载体的药物组合物。
治疗癌症的方法，其包括下述步骤：向所述哺乳动物施用治疗有效量的前述任一方面的 抗体或其功能片段或核酸分子或载体或细胞或药物组合物。
治疗哺乳动物中与CD47异常产生有关的疾病的方法，其包括下述步骤：向所述哺乳动 物施用治疗有效量的前述任一方面的抗体或其功能片段或核酸分子或载体或细胞或药物组 合物。
前述任一方面的抗体或其功能片段或核酸分子或载体或细胞或药物组合物在制备用于 治疗哺乳动物中与CD47异常产生有关的疾病的药物中的用途。
前述任一方面的抗体或其功能片段或核酸分子或载体或细胞或药物组合物在制备用于 治疗哺乳动物中癌症的药物中的用途。
附图说明
图1.重组人的CD47分子N端胞外结构区蛋白，由于糖基化，在还原SDS-PAGE上大小显示在35KDa左右；人SIRPα-Fc融合蛋白还原后大小在80KDa左右。
图2.非还原SDS-PAGE显示，生物素化SIRPα-Fc融合蛋白与streptavidin结合后，整 体向上迁移，生物素化效率为100％。
图3.人CD47-CHO稳转细胞株与未转染的CHO空白细胞。
图4.上图分别为用重组人CD47抗原(左)和CD47阳性细胞(右)验证筛选得到的 阳性杂交瘤克隆。
图5.CD47-SIRPα阻断实验，杂交瘤阳性克隆1H1、2E4、7A11、7G5、7H5、9C4、9G11、10B8、12G8、14G6、15A7和15G6结合到CD47阳性细胞表面后，均能有效阻止SIRPα与 CD47的结合。
图6-1.利用ELISA方法检测在抗原水平上CD47嵌合抗体与hCD47的结合；图6-2.利用ELISA方法检测在抗原水平上CD47嵌合抗体对CD47-SIRPα的阻断检测；图6-3.利用 FACS方法检测在细胞水平上CD47嵌合抗体与细胞表面CD47受体的结合；图6-4.利用 FACS方法检测在细胞水平上CD47嵌合抗体对CD47-SIRPα的阻断检测。
图7.显示CD47抗体识别食蟹猴淋巴细胞。
图8.抗-CD47嵌合抗体具有浓度依赖性的抗体介导的细胞吞噬作用。
图9.上图为不同浓度抗-CD47单克隆抗体作用下红细胞的凝集情况，杂交瘤阳性克隆 7G5、7A11、9G11和14G6的亚克隆株可引起红细胞发生凝集；下图为抗-CD47单克隆抗体 显微镜下红细胞凝集情况，杂交瘤阳性克隆2E4、10B8、12G8、15A7、15G6均不引发红细胞凝集。
图10.人源化抗体在细胞上的亲和力以及对CD47-SIRPα结合的阻断作用。
图11.图11A分别为包被biotin抗原检测h15G6VH-v1/VK-v1、VH-v5/VK-v1 VH-v7/VK-v1、VH-v7/VK-v2亲和力(avidity)；图11B分别为包被biotin抗体检测 h15G6VH-v1/VK-v1、VH-v5/VK-v1、VH-v7/VK-v1、VH-v7/VK-v2亲和力(affinity)。
图12-1.ELISA结果显示抗原水平上人源化后的CD47抗体与hCD47有结合；图12-2.ELISA结果显示抗原水平上人源化后的CD47抗体具有阻断CD47-SIRPα的生物学活性；图12-3.FACS结果显示细胞水平上人源化后的CD47抗体与细胞表达的CD47有结合；图12-4.FACS结果显示细胞水平上人源化后的CD47抗体具有阻断CD47-SIRPα的生物学活性。
图13.结果显示人源化的h15G6抗体具有ADCP生物学活性。
图14.结果显示h15G6抗体与利妥昔联用显著增加巨噬细胞吞噬作用。
图15.抗体Fc功能检测，人源化h15G6-IgG1抗体具有较强的ADCC作用，h15G6-IgG4的ADCC作用缺失。
图16.抗体Fc功能检测，人源化h15G6-IgG1抗体具有较强的CDC作用，h15G6-IgG4的CDC作用缺失。
图17.人源化小鼠两次受试CD47抗体后体重变化情况。
图18.人源化小鼠两次受试CD47抗体后外周血红细胞变化情况。
具体实施方式
1.定义
在本发明中，除非另有说明，否则本文中使用的科学和技术名词具有本领域技术人员所 通常理解的含义。并且，本文中所用的蛋白质和核酸化学、分子生物学、细胞和组织培养、 微生物学、免疫学相关术语和实验室操作步骤均为相应领域内广泛使用的术语和常规步骤。 同时，为了更好地理解本发明，下面提供相关术语的定义和解释。
在一个方面，本文提供的是特异性结合CD47(例如，人CD47)的抗体(例如，单克隆抗 体)及其抗原结合片段。在具体的方面，这样的抗CD47抗体阻断CD47与SIRPα的结合， 促进吞噬作用，具有降低的Fc效应物功能或没有Fc效应物功能(例如，结合FcγR、ADCC 或CDC)，和/或具有很少的或没有凝集(例如，血细胞凝集)活性。
在具体的方面，本文提供的是特异性结合人CD47的单克隆抗CD47抗体，其中所述抗 CD47抗体是亲本抗体的变体。在特定的方面，本文提供的在CF系统中表达的抗CD47抗体是非糖基化的。在具体的方面，本文提供的是特异性结合CD47(例如，人CD47)的抗体。 在特定的方面，本文提供的是包含一个或更多个氨基酸残基中的修饰的抗CD47抗体(例如，重链可变区的框架区中5-13个氨基酸取代)，与没有所述修饰的亲本抗体相比，其保持与抗原的亲和力。在某些方面，在体内或在体外、或在体内与在体外两者，这样的抗CD47抗体 抑制SIRPα与CD47的相互作用，是非糖基化的，促进吞噬作用，具有抗肿瘤活性(例如， 不促进凝集，例如，血细胞凝集)，和/或具有低的或没有Fc效应物功能(例如，结合FcγR、 ADCC或CDC)。
在某些实施方式中，本文描述的抗体或抗原结合片段可以包含不是天然存在于动物或哺 乳动物(例如，人类)体内的抗体种系全集之内的序列。
如本文使用的和除非另作说明，术语“约”或“大约”是指在给定值或范围的加或减10％之 内。在需要整数的情况下，该术语是指在给定值或范围的加或减10％之内、向上或向下舍 入到最接近的整数。
如本文使用的，术语“CD47”或“整联蛋白相关蛋白”或“IAP”或“卵巢癌抗原”或“OA3”或 “Rh相关抗原”或“MER6”可互换地使用，是指一种属于免疫球蛋白超家族的多跨的跨膜受体。
术语红血细胞和红血球是同义的，在本文中可互换地使用。
术语凝集是指细胞的簇集，而术语血细胞凝集是指细胞的特定子集，即红血细胞的簇集。 因而，血细胞凝集是凝集的一种。
就抗体链多肽序列而言，短语“基本相同”可理解为表现出与参照多肽序列至少60％、 65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％或更多的序列同一性 的抗体链。就核酸序列而言，该术语可理解为表现出与参照核酸序列至少大于60％、65％、 70％、75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％或更高的序列同一性的核苷 酸序列。
术语“同一性”或“同源性”可指候选序列中与相应序列残基相同的核苷酸碱基或氨基酸 残基的百分数，所述候选序列为与相应序列进行比较，经比对序列和引入空位(若有必要)以 实现整段序列的最大同一性百分数且不把任何保守性取代视为序列同一性部分后。无论N 端或C端延伸或插入均不应理解为降低同一性或同源性。用于比对的方法和计算机程序均 易获得，并为本领域所熟知。可使用序列分析软件测量序列同一性。
抗体或抗原的“功能片段、变异体、衍生物或类似物”等以及它们的多种形式等短语和术 语是指具有与全长目的抗体或抗原在性质上相同的生物活性的化合物或分子。例如，抗CD47 抗体的功能片段或类似物是可结合CD47分子的片段或类似物，或是可防止或基本上降低配 体或激动或拮抗性抗体结合CD47的能力的片段或类似物。
“取代型”变异体是天然序列中至少一个氨基酸残基被除去并被不同的氨基酸插入其相 同位置的变异体。所述取代可为单个的，其中该分子中仅有一个氨基酸被取代；或可为多个 的，其中该相同分子有两个或更多的氨基酸被取代。多个取代可位于连续的位点。同样，一 个氨基酸可被多个残基取代，其中这样的变异体包括取代和插入二者。“插入型”变异体是一 个或多个氨基酸被插入到紧邻一段天然序列某个特定位置处的氨基酸的变异体。紧邻氨基酸 意指与该氨基酸的α-羧基或α-氨基官能团连接。“缺失型”变异体是天然氨基酸序列中一个 或多个氨基酸被除去的变异体。通常情况下，缺失型变异体在其分子的特定区域内有一个或 两个氨基酸被缺失。
如本文所用，术语“抗体”被用于最宽泛的含义，具体涵盖单克隆抗体(包括全长单克隆 抗体)、多克隆抗体、多特异性抗体(例如双特异性抗体)、携带一个或多个CDR或源自CDR 序列的抗体片段或合成多肽，只要这些多肽表现出所需的生物活性。抗体(Abs)和免疫球蛋 白(Igs)是具有相同结构特征的糖蛋白。“抗体”也可指免疫球蛋白和免疫球蛋白片段，无论天 然的或者部分或全部合成(例如重组)产生的，包括其至少包含免疫球蛋白分子的部分可变区 的保留全长免疫球蛋白的结合特异性能力的任何片段。因此，抗体包括具有与免疫球蛋白抗 原结合结构域(抗体结合位点)同源或基本上同源的结合结构域的任何蛋白。抗体包括抗体片 段，例如抗肿瘤干细胞抗体片段。如本文所用，因此术语抗体包括合成抗体、重组产生的抗 体、多特异性抗体(例如双特异性抗体)、人抗体、非人抗体、人源化抗体、嵌合抗体、胞内 抗体以及抗体片段，例如但不限于Fab片段、Fab′片段、F(ab’)2片段、Fv片段、二硫键连 接的Fv(dsFv)、Fd片段、Fd’片段、单链Fv(scFv)、单链Fab(scFab)、双抗体、抗独特型(抗 Id)抗体、或者上述任何抗体的抗原结合片段。本文所提供的抗体包括任何免疫球蛋白类型(例 如，IgG、IgM、IgD、IgE、IgA和IgY)、任何类别(例如IgG1、IgG2、IgG3、IgG4、IgA1 和IgA2)或亚类(例如，IgG2a和IgG2b)的成员。
本发明所述抗体可为任何种类(例如IgG、IgE、IgM、IgD、IgA等)、或亚类(例如IgG1、 IgG2、IgG2a、IgG3、IgG4、IgA1、IgA2等)的抗体(“类型”和“种类”、以及“亚型”和“亚类”在本 文中可互换使用)。天然或野生型(即得自未人工操纵的群体成员)抗体和免疫球蛋白通常为约 150,000道尔顿的异四聚体糖蛋白，其由两个相同的轻链(L)和两个相同的重链(H)组成。每 条重链的一端具有可变结构域(VH)，随后是多个恒定结构域。每条轻链的一端具有可变结构 域(VL)，另一端具有恒定结构域。所谓“未人工操纵”意指未经旨在使其含有或表达外来抗原 结合分子的处理。野生型可指一个群体中发现的最普遍的等位基因或种类或指得自未操纵动 物的抗体，相比较于等位基因或多态型，或得自以某种形式的操纵例如诱变、使用重组方法 等改变该抗原结合分子的氨基酸的变异体或衍生物。
正如本文所使用，“抗CD47抗体”意指可特异结合本文所定义的CD47的抗体或源自这 些抗体的多肽(衍生物)，其包括但不限于抑制或实质降低CD47与其受体的结合或抑制CD47 活性的分子。
就抗体的可变结构域而言，术语“可变”系指抗体之间有广泛序列差异的相关分子的某些 部分，且被用于针对其特异靶的特定抗体的特异识别和结合。但是，可变性在抗体的整个可 变结构域内不是均匀分布的。可变性集中在被称为互补决定区域(CDRs；即CDR1、CDR2 和CDR3)或超变区的三个区段，它们均位于轻链和重链的可变结构域内。可变结构域内保 守程度更高的部分被称为构架(FR)区或构架序列。天然重链和轻链的每个可变结构域均包括 四个FR区，其主要采用β-折叠构型，它们籍三个CDRs连接起来，CDRs形成环，所述环 连接β-折叠结构并在某些情形下形成部分的β-折叠结构。每条链的CDRs通常被FR区在邻 近连接起来，并且借助于来自其它链的CDR，有助于抗体靶结合位点(表位或决定簇)的形成 (参看Kabat等人Sequences of Proteins of Immunological Interest，NationalInstitute of Health， Bethesda，MD(1987))。正如本文所使用，免疫球蛋白氨基酸残基的编号是依据Kabat等人 的免疫球蛋白氨基酸残基编号系统而进行的，除非另有说明。一个CDR可具有特异结合关 联表位的能力。
本发明所用的术语“绞链”或“绞链区”系指包含抗体的第一和第二恒定结构域之间的氨 基酸的柔性多肽。
如本文所用，抗体的“抗体片段”或“抗原结合片段”指全长抗体的任何部分，其少于全长， 但是至少包含结合抗原的所述抗体的部分可变区(例如一个或多个CDR和/或一个或多个抗 体结合位点)，并且因此保留结合特异性以及所述全长抗体的至少部分特异性结合能力。因 此，抗原结合片段指包含与衍生抗体片段的抗体结合相同抗原的抗原结合部分的抗体片段。 抗体片段包括通过酶促处理全长抗体所产生的抗体衍生物，以及合成产生的衍生物，例如重 组产生的衍生物。抗体包括抗体片段。抗体片段的实例包括但不限于Fab、Fab′、F(ab’)2、 单链Fv(scFv)、Fv、dsFv、双抗体、Fd和Fd’片段以及其他片段，包括修饰的片段(参见， 例如，Methods in Molecular Biology，Vol 207：Recombinant Antibodiesfor Cancer Therapy Methods and Protocols(2003)；Chapter 1；p 3-25，Kipriyanov)。所述片段可以包括连接在一起 的多条链，例如通过二硫键和/或通过肽接头。抗体片段一般包含至少或约50个氨基酸，并 且典型至少或约200个氨基酸。抗原结合片段包括任何抗体片段，其在被插入抗体框架(例 如通过置换相应区域)时获得免疫特异性地结合(即表现出至少或至少约107-108M-1的Ka)抗 原的抗体。“功能片段”或“抗CD47抗体的类似物”是可防止或实质降低所述受体结合配体或 启动信号转导的能力的片段或类似物。正如本文所使用，功能片段一般与“抗体片段″含义相 同，且就抗体而论，可指能防止或实质降低所述受体结合配体或启动信号转导的能力的片段， 例如Fv、Fab、F(ab′)2等等。“Fv”片段由一条重链的可变结构域和一条轻链的可变结构域籍非 共价结合方式而形成的二聚体(VH-VL二聚体)组成。在该构型中，每个可变结构域的三个 CDRs相互作用，以确定VH-VL二聚体表面上的靶结合位点，与完整抗体的情况一样。所述 六个CDRs共同赋予完整抗体的靶结合特异性。但是，即使是单个可变结构域(或仅包括3 个靶特异的CDRs的Fv的一半)，仍可具有识别和结合靶的能力。
“单链Fv”、“sFv”或“scab”抗体片段包括抗体的VH和VL结构域，其中这些结构域位于单 条多肽链上。一般而言，所述Fv多肽还包括一段位于VH和VL区域之间的多肽连接体，其通常为柔性分子，可使sFv形成适合于靶结合的所需结构。
术语“双抗体(diabody)”系指具有两个抗原结合位点的抗体片段，这些片段可包括与同一 多肽链的轻链可变结构域(VL)相连的重链可变结构域(VH)。通过使用过短的连接体使得同一 条链上的两个可变结构域无法配对，所述双抗体结构域被迫与另一条链的结合结构域配对， 生成两个抗原结合位点。
Fab片段含有轻链的可变结构域和恒定结构域以及重链的可变和第一个恒定结构域(CH1)。 Fab′片段与Fab片段的不同之处在于前者在CH1结构域的羧基端加入数个残基，以包括一个或 多个来自抗体铰链区的半胱氨酸。通过裂解位于F(ab′)2胃蛋白酶消化产物的铰链半胱氨酸处 的二硫键，可生成Fab′片段。对抗体另外进行酶处理和化学处理可生成其它目的功能片段。
术语“线性Fab”系指Miller等所述之四价抗体(Miller等人(2003)，JImmunol.170： 4854-4861)。“线性Fab”是由一连串相同的CH1-VH结构域组成的，在每一个CH1-VH位置 与相同的轻链配对。研发了这些分子是为了增加抗体的效价并透过亲合力效应来增强其功能 性亲和力，但是，它们是单特异性的。
如本文所用，“单克隆抗体”指相同抗体的群体，表示单克隆抗体群体中的每个单独的抗 体分子与其他抗体分子相同。这种特性与抗体的多克隆群体的特性相反，所述抗体的多克隆 群体包含具有多种不同序列的抗体。单克隆抗体可以通过许多公知的方法来制备(Smith et al.(2004)J.Clin.Pathol.57，912-917；和Nelson et al.，J Clin Pathol(2000)，53，111-117)。例如，单 克隆抗体可以通过永生化B细胞来制备，例如通过与骨髓瘤细胞融合以产生杂交瘤细胞系 或者通过用诸如EBV的病毒感染B细胞。重组技术还可以用来在体外通过用携带编码抗体 的核苷酸的人工序列的质粒转化宿主细胞来从宿主细胞的克隆群体制备抗体。
如本文中所用，术语“杂交瘤”或“杂交瘤细胞”指由融合产抗体的淋巴细胞和不产抗体的 癌细胞而产生的细胞或细胞系(通常为骨髓瘤或淋巴瘤细胞)。如本领域普通技术人员所知的， 杂交瘤可增殖并持续供应产生特定单克隆抗体。用于产生杂交瘤的方法为本领域已知的(见 例如，Harlow&Lane，1988)。当提及术语“杂交瘤”或“杂交瘤细胞”时，其还包括杂交瘤的亚 克隆和后代细胞。
如本文所用，“常规抗体”指包含两条重链(其可以标示为H和H’)和两条轻链(其可以标 示为L和L’)和两个抗原结合位点的抗体，其中每条重链可以是全长免疫球蛋白重链或保留 抗原结合能力的其任何功能区(例如重链包括但不限于VH链、VH-CH1链和 VH-CH1-CH2-CH3链)，并且每条轻链可以是全长轻链或任何功能区(例如轻链包括但不限于 VL链和VL-CL链)。每条重链(H和H’)与一条轻链(分别为L和L’)配对。
如本文所用，全长抗体是具有两条全长重链(例如VH-CH1-CH2-CH3或 VH-CH1-CH2-CH3-CH4)和两条全长轻链(VL-CL)和铰链区的抗体，例如通过抗体分泌B细 胞天然产生的抗体以及合成产生的具有相同结构域的抗体。
如本文所用，dsFv指具有稳定VH-VL对的工程化分子间二硫键的Fv。
如本文所用，Fab片段是用木瓜蛋白酶消化全长免疫球蛋白所获得的抗体片段，或者例 如通过重组方法合成产生的具有相同结构的片段。Fab片段包含轻链(包含VL和CL)和另一 条链，所述另一条链包含重链的可变结构域(VH)和重链的一个恒定区结构域(CH1)。
如本文所用，F(ab’)2片段是在pH 4.0-4.5下用胃蛋白酶消化免疫球蛋白所导致的抗体 片段，或者例如通过重组方法合成产生的具有相同结构的片段。F(ab’)2片段基本上包含两 个Fab片段，其中每个重链部分包含额外的几个氨基酸，包括形成连接两个片段的二硫键的 半胱氨酸。
如本文所用，Fab’片段是包含F(ab’)2片段的一半(一条重链和一条轻链)的片段。
如本文所用，scFv片段指包含通过多肽接头以任何顺序共价连接的可变轻链(VL)和可 变重链(VH)的抗体片段。接头长度使得两个可变结构域基本不干扰地桥接。示例性接头是 分散有一些Glu或Lys残基以增加溶解性的(Gly-Ser)n残基。
术语“嵌合抗体”是指这样的抗体，其中可变区序列源自一个物种，恒定区序列源自另一 物种，如其中可变区序列源自小鼠抗体及恒定区序列源自人抗体的抗体。
“人源化”抗体是指非人(例如小鼠)抗体形式，其是嵌合的免疫球蛋白、免疫球蛋白链或 者其片段(如Fv、Fab、Fab′、F(ab′)2或者抗体的其它抗原结合亚序列)，含有源自非人免疫 球蛋白的最小序列。优选地，人源化抗体是人免疫球蛋白(接受者抗体)，其中接受者抗体的 互补决定区(CDR)的残基由来自具有希望的特异性、亲和性和能力的非人物种(供体抗体)如 小鼠、大鼠或者兔的CDR残基置换。
此外，在人源化中，还可能对VH和/或VL的CDR1、CDR2和/或CDR3区内的氨基酸 残基进行突变，由此改善抗体的一或多种结合特性(例如亲和性)。可进行例如PCR介导的 突变引入突变，其对抗体结合或其它功能特性的影响可利用本文所述的体外或体内测试评估。 通常，引入保守性突变。此类突变可为氨基酸取代、添加或缺失。另外，CDR内的突变通常不超过一个或两个。因此，本发明所述人源化抗体还涵盖CDR内包含1或2两个氨基酸 突变的抗体。
如本文所用，术语“表位”指抗体的互补位结合的抗原上的任何抗原决定簇。表位决定簇 通常包含分子的化学活性表面分型，例如氨基酸或糖侧链，并且通常具有特定的三维结构特 征以及特定的电荷特征。
如本文所用，可变结构域或可变区是抗体重链或轻链的特定Ig结构域，其包含在不同 抗体之间变化的氨基酸序列。每条轻链和每条重链分别具有一个可变区结构域VL和VH。 可变结构域提供抗原特异性，并且因此负责抗原识别。每个可变区包含CDR和框架区(FR)， CDR是抗原结合位点结构域的部分。
如本文所用，“抗原结合结构域”和“抗原结合位点(antigen-binding site)”同义地用来指识 别并与同种(cognate)抗原物理相互作用的抗体内的结构域。天然的常规全长抗体分子具有两 个常规抗原结合位点，每个包含重链可变区部分和轻链可变区部分。常规抗原结合位点包含 连接可变区结构域内反向平行的β链的环。抗原结合位点可以包含可变区结构域的其他部分。 每个常规抗原结合位点包含3个来自重链的高变区和3个来自轻链的高变区。高变区也称为 互补决定区(CDR)。
如本文所用，“高变区”、“HV”、“互补决定区”和“CDR”和“抗体CDR”可交换地用来指一起形成抗体的抗原结合位点的每个可变区内的多个部分中的一个。每个可变区结构域包含 3个CDR，命名为CDR1、CDR2和CDR3。例如，轻链可变区结构域包含3个CDR，命名 为VLCDR1、VL CDR2和VL CDR3；重链可变区结构域包含3个CDR，命名为VH CDR1、 VH CDR2和VHCDR3。可变区中的3个CDR沿线性氨基酸序列是不连续的，但是在折叠 的多肽中接近。CDR位于连接可变结构域的β折叠的平行链的环内。如本文所述，本领域 技术人员知道并且可以基于Kabat或Chothia编号鉴定CDR(参见例如，Kabat，E.A.et al.(1991)Sequences ofProteins of Immunological Interest，Fifth Edition，U.S.Department of Health andHuman Services，NIH Publication No.91-3242，和Chothia，C.et al.(1987)J.Mol.Biol.196：901-917)。
如本文所用，框架区(FR)是位于β折叠内的抗体可变区结构域内的结构域；在氨基酸序 列方面，FR区比高变区相对更保守。
如本文所用，“恒定区”结构域是抗体重链或轻链中的结构域，其包含比可变区结构域的 氨基酸序列相对更保守的氨基酸序列。在常规全长抗体分子中，每条轻链具有单个轻链恒定 区(CL)结构域，而每条重链包含一个或多个重链恒定区(CH)结构域，包括CH1、CH2、CH3 和CH4。全长IgA、IgD和IgG同种型包含CH1、CH2、CH3和铰链区，而IgE和IgM包 含CH1、CH2、CH3和CH4。CH1和CL结构域延伸抗体分子的Fab臂，因此有助于与抗 原相互作用以及转动抗体臂。抗体恒定区可以服务于效应子功能，例如但不限于清除该抗体 特异性结合的抗原、病原体和毒素，例如通过与各种细胞、生物分子和组织相互作用。
如本文所用，抗体的功能区是包含该抗体的至少VH、VL、CH(例如CH1、CH2或CH3)、CL或铰链区结构域或者至少其功能区的抗体部分。
如本文所用，VH结构域的功能区是保留完整VH结构域的至少部分结合特异性(例如通 过保留完整VH结构域的一个或多个CDR)的完整VH结构域的至少一部分，从而所述VH结构域的功能区单独地或者与另一抗体结构域(例如VL结构域)或其区域组合地结合抗原。示例性VH结构域的功能区是包含VH结构域的CDR1、CDR2和/或CDR3的区域。
如本文所用，VL结构域的功能区是保留完整VL结构域的至少部分结合特异性(例如通 过保留完整VL结构域的一个或多个CDR)的完整VL结构域的至少一部分，从而所述VL结构域的功能区单独地或者与另一抗体结构域(例如VH结构域)或其区域组合地结合抗原。示例性VL结构域的功能区是包含VL结构域的CDR1、CDR2和/或CDR3的区域。
如本文所用，关于抗体或其抗原结合片段的“特异性结合”或“免疫特异性地结合”在本文 中可交换使用，并且指抗体或抗原结合片段通过抗体和抗原的抗体结合位点之间的非共价相 互作用与同种抗原形成一个或多个非共价键的能力。所述抗原可以是分离的抗原或存在于肿 瘤细胞。通常，免疫特异性地结合(或特异性结合)抗原的抗体是以约或1×107M-1或1x108M-1 或更大的亲和常数Ka(或者1x10-7M或1×10-8M或更低的解离常数(Kd))结合所述抗原。亲和 常数可以通过抗体反应的标准动力学方法来测定，例如，免疫测定、表面等离子共振 (SPR)(Rich and Myszka(2000)Curr.Opin.Biotechnol 11：54；Englebienne(1998)Analyst.123：1599)、 等温滴定量热法(ITC)或本领域已知的其他动力学相互作用测定(参见，例如， Paul，ed.，Fundamental Immunology，2nd ed.，RavenPress，New York，pages 332-336(1989)；还参见 描述用于计算抗体的结合亲和力的示例性SPR和ITC方法的美国专利第7,229,619号)。用 于实时检测和监测结合速率的仪器和方法是已知的，并且可商购(参见，BiaCore 2000，Biacore AB，Upsala，Sweden and GEHealthcare Life Sciences； Malmqvist(2000)Biochem.Soc.Trans.27：335)。
如本文所用，关于抗体的术语“竞争”是指第一抗体或其抗原结合片段以与第二抗体或其 抗原结合片段足够相似的方式结合一个表位，由此第一抗体与其关联表位的结合结果在存在 第二抗体的条件下与不存在第二抗体的条件下相比可检测地降低。或者，在第二抗体与其表 位的结合在存在第一抗体条件下也可检测地降低的情况中，可以但不必需是这种情况。也就 是说，第一抗体可以抑制第二抗体与其表位的结合，而不用第二抗体抑制第一抗体与其各自 表位的结合。然而，在每个抗体均可检测地抑制另一抗体与其关联表位或配体的结合的情况 中，无论是相同、更高或更低程度，所述抗体被称为彼此“交叉竞争”结合其各自的表位。竞 争及交叉竞争抗体均涵盖在本发明中。无论这种竞争或交叉竞争发生的机制如何(例如位阻、 构象改变或者结合共同表位或其片段)，本领域技术人员基于本发明提供的教导将意识到这 种竞争和/或交叉竞争抗体涵盖在本发明中且可用于本发明揭示的方法中。
如本文所用，“多肽”指共价连接的两个或更多个氨基酸。术语“多肽”和“蛋白质”在本文 中可交换使用。
“分离的蛋白质”、“分离的多肽”或“分离的抗体”指所述蛋白质、多肽或抗体(1)不与在其 天然状态下伴随其天然相关成分关联，(2)不含来自相同物种的其它蛋白质，(3)由来自不同 物种的细胞表达，或(4)不在天然中发生。因此，经化学合成的多肽或在不同于多肽的天然 来源细胞的细胞系统中合成的多肽将会与其天然相关成分″分离″。还可通过分离以使蛋白质 实质上不含天然相关成分，即使用本领域众所周知的蛋白质纯化技术。
在肽或蛋白中，合适的保守氨基酸取代是本领域技术人员已知的，并且一般可以进行而 不改变所得分子的生物活性。通常，本领域技术人员认识到多肽的非必需区中的单个氨基酸 取代基本上不改变生物活性(参见，例如，Watson et al.，Molecular Biologyof the Gene，4th Edition，1987，The Benjamin/Cummings Pub.co.，p.224)。
如本文所用，术语“多核苷酸”和“核酸分子”指包含至少两个连接的核苷酸或核苷酸衍生 物的寡聚体或聚合物，包括通常通过磷酸二酯键连接在一起的脱氧核糖核酸(DNA)和核糖核 酸(RNA)。
如本文所用，分离的核酸分子是从存在于核酸分子的天然来源中的其他核酸分子分离的 核酸分子。诸如cDNA分子的“分离的”核酸分子可以在通过重组技术制备时基本上不含其他 细胞物质或培养基，或者在化学合成时基本上不含化学前体或其他化学成分。本文所提供的 示例性分离的核酸分子包括编码所提供的抗体或抗原结合片段的分离的核酸分子。
序列“相同性”或“同一性”具有本领域公认的含义，并且可以利用公开的技术计算两个核 酸或多肽分子或区域之间序列相同性的百分比。可以沿着多核苷酸或多肽的全长或者沿着该 分子的区域测量序列相同性。(参见，例如：Computational MolecularBiology，Lesk，A.M.，ed.，Oxford University Press，New York，1988；Biocomputing：Informatics and Genome Projects，Smith，D.W.，ed.，Academic Press，New York，1993；Computer Analysis of Sequence Data，Part I，Griffin，A.M.，and Griffin，H.G.，eds.，Humana Press，New Jersey，1994； Sequence Analysis in Molecular Biology，vonHeinje，G.，Academic Press，1987；and Sequence Analysis Primer，Gribskov，M.andDevereux，J.，eds.，M Stockton Press，New York，1991)。虽然存在 许多测量两个多核苷酸或多肽之间的相同性的方法，但是术语“相同性”是技术人员公知的 (Carrillo，H.&Lipman，D.，SIAM J Applied Math 48：1073(1988))。
如本文所用，关于核酸序列、区域、元件或结构域的“可操作地连接”表示核酸区域互相 功能相关。例如，启动子可以可操作地连接至编码多肽的核酸，从而所述启动子调控或介导 所述核酸的转录。
如本文所用，“表达”指通过多核苷酸的转录和翻译产生多肽的过程。多肽的表达水平可 以利用本领域已知的任何方法来评价，包括例如测定从宿主细胞产生的多肽的量的方法。这 类方法可以包括但不限于通过ELISA定量细胞裂解物中的多肽，凝胶电泳之后考马斯蓝染 色，Lowry蛋白测定以及Bradford蛋白测定。
如本文所用，“宿主细胞”是用于接受、保持、复制和扩增载体的细胞。宿主细胞还可以 用来表达载体所编码的多肽。当宿主细胞分裂时，载体中所含的核酸复制，从而扩增核酸。 宿主细胞可以是真核细胞或原核细胞。合适的宿主细胞包括但不限于CHO细胞、各种COS 细胞、HeLa细胞、HEK细胞例如HEK 293细胞。
“密码子优化”是指通过用在宿主细胞的基因中更频繁地或者最频繁地使用的密码子代 替天然序列的至少一个密码子(例如约或多于约1、2、3、4、5、10、15、20、25、50个或更多个密码子同时维持该天然氨基酸序列而修饰核酸序列以便增强在感兴趣宿主细胞中的 表达的方法。不同的物种对于特定氨基酸的某些密码子展示出特定的偏好。密码子偏好性(在 生物之间的密码子使用的差异)经常与信使RNA(mRNA)的翻译效率相关，而该翻译效率则 被认为依赖于被翻译的密码子的性质和特定的转运RNA(tRNA)分子的可用性。细胞内选定 的tRNA的优势一般反映了最频繁用于肽合成的密码子。因此，可以将基因定制为基于密码 子优化在给定生物中的最佳基因表达。密码子利用率表可以容易地获得，例如在www.kazusa.orjp/codon/上可获得的密码子使用数据库(“Codon Usage Database”)中，并且这些 表可以通过不同的方式调整适用。参见，Nakamura Y.等，“Codon usage tabulatedfrom the international DNA sequence databases：status for theyear2000.Nucl.Acids Res.，28：292(2000)。
如本文所用，“载体”是可复制的核酸，当载体转化入适当的宿主细胞时，可以从该载体 表达一种或多种异源蛋白。关于载体包括那些通常通过限制酶切消化和连接可以将编码多肽 或其片段的核酸引入其中的载体。关于载体还包括那些包含编码多肽的核酸的载体。载体用 来将编码多肽的核酸引入宿主细胞，用于扩增核酸或者用于表达/展示核酸所编码的多肽。 载体通常保持游离，但是可以设计为使基因或其部分整合入基因组的染色体。还考虑人工染 色体的载体，例如酵母人工载体和哺乳动物人工染色体。这类媒介物的选择和用途是本领域 技术人员公知的。
如本文所用，载体还包括“病毒载体”或“病毒的载体”。病毒的载体是工程化的病毒，其 可操作地连接至外源基因以将外源基因转移(作为媒介物或穿梭(shuttle))入细胞。
如本文所用，“表达载体”包括能够表达DNA的载体，所述DNA与诸如启动子区的能够影响这类DNA片段表达的调控序列可操作地连接。这类额外的片段可以包括启动子和终止子序列，并且任选地可以包括一个或多个复制起点、一个或多个选择标记、增强子、多腺苷酸化信号等。表达载体一般来源于质粒或病毒DNA，或者可以包含这两者的元件。因此，表达载体指重组DNA或RNA构建体，例如质粒、噬菌体、重组病毒或其他载体，当引入 适当的宿主细胞时，导致克隆DNA的表达。适当的表达载体是本领域技术人员公知的，并 且包括在真核细胞和/或原核细胞中可复制的表达载体以及保持游离的表达载体或者整合入 宿主细胞基因组的表达载体。
如本文所用，“治疗”患有疾病或疾病状况的个体表示所述个体的症状部分或全部缓解， 或者在治疗后保持不变。因此，治疗包括预防、治疗和/或治愈。预防指防止潜在疾病和/或 防止症状恶化或疾病发展。治疗还包括所提供的任何抗体或其抗原结合片段以及本文所提供 的组合物的任何药学用途。
如本文所用，“疗效”表示由个体的治疗所导致的效果，其改变、通常改良或改善疾病或 疾病状况的症状，或者治愈疾病或疾病状况。
如本文所用，“治疗有效量”或“治疗有效剂量”指施用于对象之后至少足以产生疗效的物 质、化合物、材料或包含化合物的组合物的量。因此，其为防止、治愈、改善、阻滞或部分 阻滞疾病或病症的症状所必需的量。
如本文所用，“预防有效量”或“预防有效剂量”指在施用于对象时会具有预期的预防效果 的物质、化合物、材料或包含化合物的组合物的量，例如，防止或延迟疾病或症状的发生或 复发，减少疾病或症状发生或复发的可能性。完全预防有效剂量不必通过施用一个剂量发生， 并且可以仅在施用一系列剂量之后发生。因此，预防有效量可以在一次或多次施用中施用。
如本文中所使用的，术语“患者”是指哺乳动物，例如人。
在一方面，本公开涉及一种抗体或其功能片段，其包含选自氨基酸序列SEQ IDNO：2-4、 12-14、22-24、32-34、42-44、52-54、62-64、72-74、82-84、92-94、102-104、107-109、112-114、 117-119、122-124、132-134、137-139、142-144、147-149、152-154或其任何变体的重链CDR， 和/或选自氨基酸序列SEQ ID NO：7-9、17-19、27-29、37-39、47-49、57-59、67-69、77-79、 87-89、97-99、157-159、162-164、167-169、172-174、177-179或任何变体的轻链CDR。
在一方面，本公开涉及一种抗体或其功能片段，其包含选自氨基酸序列SEQ IDNO：2、 12、22、32、42、52、62、72、82、92、102、107、112、117、122、127、132、137、142、 147、152或其任何变体的重链CDR1，选自氨基酸序列SEQ ID NO：3、13、23、33、43、53、 63、73、83、93、103、108、113、118、123、128、133、138、143、148、153或其任何变 体的重链CDR2，选自氨基酸序列SEQ ID NO：4、14、24、34、44、54、64、74、84、94、 104、114、119、124、129、134、139、144、149、154或其任何变体的重链CDR3；和/或 选自氨基酸序列SEQ ID NO：7、17、27、37、47、57、67、77、87、97、157、162、167、 172、177或其任何变体的轻链CDR1，选自氨基酸序列SEQ IDNO：8、18、28、38、48、58、 68、78、88、98、158、163、168、173、178或其任何变体的轻链CDR2，选自氨基酸序列 SEQ ID NO：9、19、29、39、49、59、69、79、89、99、159、164、169、174、179或其任何变体的轻链CDR3。
在一方面，本公开涉及一种抗体或其功能片段，其包含选自氨基酸序列SEQ IDNO：1、 11、21、31、41、51、61、71、81、91、101、106、111、116、121、126、131、136、141、 146、151或其任何变体的重链可变区，和/或选自氨基酸序列SEQ ID NO：6、16、26、36、 46、56、66、76、86、96、156、161、166、171、176或其任何变体的轻链可变区。
在一方面，本公开涉及一种抗体或其功能片段，其包含选自氨基酸序列SEQ IDNO：2 的重链CDR1，选自氨基酸序列SEQ ID NO：3的重链CDR2，选自氨基酸序列SEQ ID NO：4的重链CDR3；和/或选自氨基酸序列SEQ ID NO：7的轻链CDR1，选自氨基酸序列SEQ ID NO：8的轻链CDR2，选自氨基酸序列SEQ ID NO：9的轻链CDR3。
在一方面，本公开涉及一种抗体或其功能片段，其包含选自氨基酸序列SEQ IDNO：12 的重链CDR1，选自氨基酸序列SEQ ID NO：13的重链CDR2，选自氨基酸序列SEQ IDNO：14 的重链CDR3；和/或选自氨基酸序列SEQ ID NO：17的轻链CDR1，选自氨基酸序列SEQID NO：18的轻链CDR2，选自氨基酸序列SEQ ID NO：19的轻链CDR3。
在一方面，本公开涉及一种抗体或其功能片段，其包含选自氨基酸序列SEQ IDNO：22 的重链CDR1，选自氨基酸序列SEQ ID NO：23的重链CDR2，选自氨基酸序列SEQ IDNO：24 的重链CDR3；和/或选自氨基酸序列SEQ ID NO：27的轻链CDR1，选自氨基酸序列SEQID NO：28的轻链CDR2，选自氨基酸序列SEQ ID NO：29的轻链CDR3。
在一方面，本公开涉及一种抗体或其功能片段，其包含选自氨基酸序列SEQ IDNO：32 的重链CDR1，选自氨基酸序列SEQ ID NO：33的重链CDR2，选自氨基酸序列SEQ IDNO：34 的重链CDR3；和/或选自氨基酸序列SEQ ID NO：37的轻链CDR1，选自氨基酸序列SEQID NO：38的轻链CDR2，选自氨基酸序列SEQ ID NO：39的轻链CDR3。
在一方面，本公开涉及一种抗体或其功能片段，其包含选自氨基酸序列SEQ IDNO：42 的重链CDR1，选自氨基酸序列SEQ ID NO：43的重链CDR2，选自氨基酸序列SEQ IDNO：44 的重链CDR3；和/或选自氨基酸序列SEQ ID NO：47的轻链CDR1，选自氨基酸序列SEQID NO：48的轻链CDR2，选自氨基酸序列SEQ ID NO：49的轻链CDR3。
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在一方面，本公开涉及一种抗体或其功能片段，其包含选自氨基酸序列SEQ IDNO：62 的重链CDR1，选自氨基酸序列SEQ ID NO：63的重链CDR2，选自氨基酸序列SEQ IDNO：64 的重链CDR3；和/或选自氨基酸序列SEQ ID NO：67的轻链CDR1，选自氨基酸序列SEQID NO：68的轻链CDR2，选自氨基酸序列SEQ ID NO：69的轻链CDR3。
在一方面，本公开涉及一种抗体或其功能片段，其包含选自氨基酸序列SEQ IDNO：72 的重链CDR1，选自氨基酸序列SEQ ID NO：3的重链CDR73，选自氨基酸序列SEQ IDNO：74 的重链CDR3；和/或选自氨基酸序列SEQ ID NO：77的轻链CDR1，选自氨基酸序列SEQID NO：78的轻链CDR2，选自氨基酸序列SEQ ID NO：79的轻链CDR3。
在一方面，本公开涉及一种抗体或其功能片段，其包含选自氨基酸序列SEQ IDNO：82 的重链CDR1，选自氨基酸序列SEQ ID NO：83的重链CDR2，选自氨基酸序列SEQ IDNO：84 的重链CDR3；和/或选自氨基酸序列SEQ ID NO：87的轻链CDR1，选自氨基酸序列SEQID NO：88的轻链CDR2，选自氨基酸序列SEQ ID NO：89的轻链CDR3。
在一方面，本公开涉及一种抗体或其功能片段，其包含选自氨基酸序列SEQ IDNO：92 的重链CDR1，选自氨基酸序列SEQ ID NO：93的重链CDR2，选自氨基酸序列SEQ IDNO：94 的重链CDR3和/或选自氨基酸序列SEQ ID NO：97的轻链CDR1，选自氨基酸序列SEQID NO：98的轻链CDR2，选自氨基酸序列SEQ ID NO：99的轻链CDR3。
在一方面，本公开涉及一种抗体或其功能片段，其包含选自氨基酸序列SEQ IDNO：102 的重链CDR1，选自氨基酸序列SEQ ID NO：103的重链CDR2，选自氨基酸序列SEQ IDNO：104的重链CDR3；和/或选自氨基酸序列SEQ ID NO：157的轻链CDR1，选自氨基酸序 列SEQ ID NO：158的轻链CDR2，选自氨基酸序列SEQ ID NO：159的轻链CDR3。
在一方面，本公开涉及一种抗体或其功能片段，其包含选自氨基酸序列SEQ IDNO：1 或其任何变体的重链可变区，和/或选自氨基酸序列SEQ ID NO：6或其任何变体的轻链可变 区。
在一方面，本公开涉及一种抗体或其功能片段，其包含选自氨基酸序列SEQ IDNO：11 或其任何变体的重链可变区，和/或选自氨基酸序列SEQ ID NO：16或其任何变体的轻链可 变区。
在一方面，本公开涉及一种抗体或其功能片段，其包含选自氨基酸序列SEQ IDNO：21 或其任何变体的重链可变区，和/或选自氨基酸序列SEQ ID NO：26或其任何变体的轻链可 变区。
在一方面，本公开涉及一种抗体或其功能片段，其包含选自氨基酸序列SEQ IDNO：31 或其任何变体的重链可变区，和/或选自氨基酸序列SEQ ID NO：36或其任何变体的轻链可 变区。
在一方面，本公开涉及一种抗体或其功能片段，其包含选自氨基酸序列SEQ IDNO：41 或其任何变体的重链可变区，和/或选自氨基酸序列SEQ ID NO：46或其任何变体的轻链可 变区。
在一方面，本公开涉及一种抗体或其功能片段，其包含选自氨基酸序列SEQ IDNO：51 或其任何变体的重链可变区，和/或选自氨基酸序列SEQ ID NO：56或其任何变体的轻链可 变区。
在一方面，本公开涉及一种抗体或其功能片段，其包含选自氨基酸序列SEQ IDNO：61 或其任何变体的重链可变区，利/或选自氨基酸序列SEQ ID NO：66或其任何变体的轻链可 变区。
在一方面，本公开涉及一种抗体或其功能片段，其包含选自氨基酸序列SEQ IDNO：71 或其任何变体的重链可变区，和/或选自氨基酸序列SEQ ID NO：76或其任何变体的轻链可 变区。
在一方面，本公开涉及一种抗体或其功能片段，其包含选自氨基酸序列SEQ IDNO：81 或其任何变体的重链可变区，和/或选自氨基酸序列SEQ ID NO：86或其任何变体的轻链可 变区。
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在一方面，本公开涉及一种抗体或其功能片段，其包含选自氨基酸序列SEQ IDNO：116 或其任何变体的重链可变区，和/或选自氨基酸序列SEQ ID NO：156或其任何变体的轻链可 变区。
在一方面，本公开涉及一种抗体或其功能片段，其包含选自氨基酸序列SEQ IDNO：121 或其任何变体的重链可变区，和/或选自氨基酸序列SEQ ID NO：156或其任何变体的轻链可 变区。
在一方面，本公开涉及一种抗体或其功能片段，其包含选自氨基酸序列SEQ IDNO：126 或其任何变体的重链可变区，和/或选自氨基酸序列SEQ ID NO：156或其任何变体的轻链可 变区。
在一方面，本公开涉及一种抗体或其功能片段，其包含选自氨基酸序列SEQ IDNO：131 或其任何变体的重链可变区，和/或选自氨基酸序列SEQ ID NO：156或其任何变体的轻链可 变区。
在一方面，本公开涉及一种抗体或其功能片段，其包含选自氨基酸序列SEQ IDNO：136 或其任何变体的重链可变区，和/或选自氨基酸序列SEQ ID NO：156或其任何变体的轻链可 变区。
在一方面，本公开涉及一种抗体或其功能片段，其包含选自氨基酸序列SEQ IDNO：141 或其任何变体的重链可变区，和/或选自氨基酸序列SEQ ID NO：156或其任何变体的轻链可 变区。
在一方面，本公开涉及一种抗体或其功能片段，其包含选自氨基酸序列SEQ IDNO：146 或其任何变体的重链可变区，和/或选自氨基酸序列SEQ ID NO：156或其任何变体的轻链可 变区。
在一方面，本公开涉及一种抗体或其功能片段，其包含选自氨基酸序列SEQ IDNO：151 或其任何变体的重链可变区，和/或选自氨基酸序列SEQ ID NO：156或其任何变体的轻链可 变区。
在一方面，本公开涉及一种抗体或其功能片段，其包含选自氨基酸序列SEQ IDNO：101 或其任何变体的重链可变区，和/或选自氨基酸序列SEQ ID NO：161或其任何变体的轻链可 变区。
在一方面，本公开涉及一种抗体或其功能片段，其包含选自氨基酸序列SEQ IDNO：106 或其任何变体的重链可变区，和/或选自氨基酸序列SEQ ID NO：161或其任何变体的轻链可 变区。
在一方面，本公开涉及一种抗体或其功能片段，其包含选自氨基酸序列SEQ IDNO：111 或其任何变体的重链可变区，和/或选自氨基酸序列SEQ ID NO：161或其任何变体的轻链可 变区。
在一方面，本公开涉及一种抗体或其功能片段，其包含选自氨基酸序列SEQ IDNO：116 或其任何变体的重链可变区，和/或选自氨基酸序列SEQ ID NO：161或其任何变体的轻链可 变区。
在一方面，本公开涉及一种抗体或其功能片段，其包含选自氨基酸序列SEQ IDNO：121 或其任何变体的重链可变区，和/或选自氨基酸序列SEQ ID NO：161或其任何变体的轻链可 变区。
在一方面，本公开涉及一种抗体或其功能片段，其包含选自氨基酸序列SEQ IDNO：126 或其任何变体的重链可变区，和/或选自氨基酸序列SEQ ID NO：161或其任何变体的轻链可 变区。
在方面，本公开涉及一种抗体或其功能片段，其包含选自氨基酸序列SEQ ID NO：131 或其任何变体的重链可变区，和/或选自氨基酸序列SEQ ID NO：161或其任何变体的轻链可 变区。
在一方面，本公开涉及一种抗体或其功能片段，其包含选自氨基酸序列SEQ IDNO：136 或其任何变体的重链可变区，和/或选自氨基酸序列SEQ ID NO：161或其任何变体的轻链可 变区。
在一方面，本公开涉及一种抗体或其功能片段，其包含选自氨基酸序列SEQ IDNO：141 或其任何变体的重链可变区，和/或选自氨基酸序列SEQ ID NO：161或其任何变体的轻链可 变区。
在一方面，本公开涉及一种抗体或其功能片段，其包含选自氨基酸序列SEQ IDNO：146 或其任何变体的重链可变区，和/或选自氨基酸序列SEQ ID NO：161或其任何变体的轻链可 变区。
在一方面，本公开涉及一种抗体或其功能片段，其包含选自氨基酸序列SEQ IDNO：151 或其任何变体的重链可变区，和/或选自氨基酸序列SEQ ID NO：161或其任何变体的轻链可 变区。
在一方面，本公开涉及一种抗体或其功能片段，其包含选自氨基酸序列SEQ IDNO：101 或其任何变体的重链可变区，和/或选自氨基酸序列SEQ ID NO：166或其任何变体的轻链可 变区。
在一方面，本公开涉及一种抗体或其功能片段，其包含选自氨基酸序列SEQ IDNO：106 或其任何变体的重链可变区，和/或选自氨基酸序列SEQ ID NO：166或其任何变体的轻链可 变区。
在一方面，本公开涉及一种抗体或其功能片段，其包含选自氨基酸序列SEQ IDNO：111 或其任何变体的重链可变区，和/或选自氨基酸序列SEQ ID NO：166或其任何变体的轻链可 变区。
在一方面，本公开涉及一种抗体或其功能片段，其包含选自氨基酸序列SEQ IDNO：116 或其任何变体的重链可变区，和/或选自氨基酸序列SEQ ID NO：166或其任何变体的轻链可 变区。
在方面，本公开涉及一种抗体或其功能片段，其包含选自氨基酸序列SEQ ID NO：121 或其任何变体的重链可变区，和/或选自氨基酸序列SEQ ID NO：166或其任何变体的轻链可 变区。
在一方面，本公开涉及一种抗体或其功能片段，其包含选自氨基酸序列SEQ IDNO：126 或其任何变体的重链可变区，和/或选自氨基酸序列SEQ ID NO：166或其任何变体的轻链可 变区。
在一方面，本公开涉及一种抗体或其功能片段，其包含选自氨基酸序列SEQ IDNO：131 或其任何变体的重链可变区，和/或选自氨基酸序列SEQ ID NO：166或其任何变体的轻链可 变区。
在一方面，本公开涉及一种抗体或其功能片段，其包含选自氨基酸序列SEQ IDNO：136 或其任何变体的重链可变区，和/或选自氨基酸序列SEQ ID NO：166或其任何变体的轻链可 变区。
在一方面，本公开涉及一种抗体或其功能片段，其包含选自氨基酸序列SEQ IDNO：141 或其任何变体的重链可变区，和/或选自氨基酸序列SEQ ID NO：166或其任何变体的轻链可 变区。
在一方面，本公开涉及一种抗体或其功能片段，其包含选自氨基酸序列SEQ IDNO：146 或其任何变体的重链可变区，和/或选自氨基酸序列SEQ ID NO：166或其任何变体的轻链可 变区。
在一方面，本公开涉及一种抗体或其功能片段，其包含选自氨基酸序列SEQ IDNO：151 或其任何变体的重链可变区，和/或选自氨基酸序列SEQ ID NO：166或其任何变体的轻链可 变区。
在一方面，本公开涉及一种抗体或其功能片段，其包含选自氨基酸序列SEQ IDNO：101 或其任何变体的重链可变区，和/或选自氨基酸序列SEQ ID NO：171或其任何变体的轻链可 变区。
在一方面，本公开涉及一种抗体或其功能片段，其包含选自氨基酸序列SEQ IDNO：106 或其任何变体的重链可变区，和/或选自氨基酸序列SEQ ID NO：171或其任何变体的轻链可 变区。
在一方面，本公开涉及一种抗体或其功能片段，其包含选自氨基酸序列SEQ IDNO：111 或其任何变体的重链可变区，和/或选自氨基酸序列SEQ ID NO：171或其任何变体的轻链可 变区。
在一方面，本公开涉及一种抗体或其功能片段，其包含选自氨基酸序列SEQ IDNO：116 或其任何变体的重链可变区，和/或选自氨基酸序列SEQ ID NO：171或其任何变体的轻链可 变区。
在一方面，本公开涉及一种抗体或其功能片段，其包含选自氨基酸序列SEQ IDNO：121 或其任何变体的重链可变区，和/或选自氨基酸序列SEQ ID NO：171或其任何变体的轻链可 变区。
在一方面，本公开涉及一种抗体或其功能片段，其包含选自氨基酸序列SEQ IDNO：126 或其任何变体的重链可变区，和/或选自氨基酸序列SEQ ID NO：171或其任何变体的轻链可 变区。
在一方面，本公开涉及一种抗体或其功能片段，其包含选自氨基酸序列SEQ IDNO：131 或其任何变体的重链可变区，和/或选自氨基酸序列SEQ ID NO：171或其任何变体的轻链可 变区。
在一方面，本公开涉及一种抗体或其功能片段，其包含选自氨基酸序列SEQ IDNO：136 或其任何变体的重链可变区，和/或选自氨基酸序列SEQ ID NO：171或其任何变体的轻链可 变区。
在一方面，本公开涉及一种抗体或其功能片段，其包含选自氨基酸序列SEQ IDNO：141 或其任何变体的重链可变区，和/或选自氨基酸序列SEQ ID NO：171或其任何变体的轻链可 变区。
在一方面，本公开涉及一种抗体或其功能片段，其包含选自氨基酸序列SEQ IDNO：146 或其任何变体的重链可变区，和/或选自氨基酸序列SEQ ID NO：171或其任何变体的轻链可 变区。
在一方面，本公开涉及一种抗体或其功能片段，其包含选自氨基酸序列SEQ IDNO：151 或其任何变体的重链可变区，和/或选自氨基酸序列SEQ ID NO：171或其任何变体的轻链可 变区。
在一方面，本公开涉及一种抗体或其功能片段，其包含选自氨基酸序列SEQ IDNO：101 或其任何变体的重链可变区，和/或选自氨基酸序列SEQ ID NO：176或其任何变体的轻链可 变区。
在一方面，本公开涉及一种抗体或其功能片段，其包含选自氨基酸序列SEQ IDNO：106 或其任何变体的重链可变区，和/或选自氨基酸序列SEQ ID NO：176或其任何变体的轻链可 变区。
在一方面，本公开涉及一种抗体或其功能片段，其包含选自氨基酸序列SEQ IDNO：111 或其任何变体的重链可变区，和/或选自氨基酸序列SEQ ID NO：176或其任何变体的轻链可 变区。
在一方面，本公开涉及一种抗体或其功能片段，其包含选自氨基酸序列SEQ IDNO：116 或其任何变体的重链可变区，和/或选自氨基酸序列SEQ ID NO：176或其任何变体的轻链可 变区。
在一方面，本公开涉及一种抗体或其功能片段，其包含选自氨基酸序列SEQ IDNO：121 或其任何变体的重链可变区，和/或选自氨基酸序列SEQ ID NO：176或其任何变体的轻链可 变区。
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在一方面，本公开涉及一种抗体或其功能片段，其包含选自氨基酸序列SEQ IDNO：131 或其任何变体的重链可变区，和/或选自氨基酸序列SEQ ID NO：176或其任何变体的轻链可 变区。
在一方面，本公开涉及一种抗体或其功能片段，其包含选自氨基酸序列SEQ IDNO：136 或其任何变体的重链可变区，和/或选自氨基酸序列SEQ ID NO：176或其任何变体的轻链可 变区。
在一方面，本公开涉及一种抗体或其功能片段，其包含选自氨基酸序列SEQ IDNO：141 或其任何变体的重链可变区，和/或选自氨基酸序列SEQ ID NO：176或其任何变体的轻链可 变区。
在一方面，本公开涉及一种抗体或其功能片段，其包含选自氨基酸序列SEQ IDNO：146 或其任何变体的重链可变区，和/或选自氨基酸序列SEQ ID NO：176或其任何变体的轻链可 变区。
在一方面，本公开涉及一种抗体或其功能片段，具包含选自氨基酸序列SEQ IDNO：151 或其任何变体的重链可变区，和/或选自氨基酸序列SEQ ID NO：176或其任何变体的轻链可 变区。
在一方面，本公开涉及编码本文所披露抗体或其功能片段或变体变体的分离的核酸序列， 含有编码本发明的抗体或其功能片段的CD47结合部分的核苷酸序列的载体构建体，含有这 种载体的宿主细胞，以及生产多肽的重组技术。
在一方面，编码本文所披露抗体或具功能片段或变体变体的分离的核酸序列选自核酸序 列SEQ ID NO：5、10、15、20、25、30、35、40、45、50、55、60、65、70、75、80、85、 90、95、100、105、110、115、120、125、130、135、140、145、150、155、160、165、170、 175、180。
在一方面，本公开还包括试剂盒，例如所述试剂盒包括本公开的抗体、其片段、同源物、 其衍生物等，例如带标记或具有细胞毒性的辍合物，以及抗体使用说明书、杀死特定类型细 胞的辍合物等等。该说明书可包括在体外、体内或离体使用抗体、辍合物等的指导。抗体可 以是液体形式或固体，通常是冻干的。该试剂盒可包含其它适宜的试剂，如缓冲液、重构溶 液以及为了预定用途的其它必要成分。考虑了以预定量包装好的试剂组合与用于其用途的说 明书，所述用途例如用于治疗用途或用于进行诊断测定。当抗体是带标记的时，例如用酶标 记的，那么该试剂盒可包括底物和酶所需的辅因子(例如提供可检测生色团或荧光团的底物 前体)。此外，其它添加剂，如稳定剂、缓冲液(例如封闭缓冲液或裂解缓冲液)等也可包括在 内。多种试剂的相对量可以改变而提供试剂溶液的浓缩物，这就提供了用户灵活性、节省空 间、节省试剂等。这些试剂也可以干粉形式提供，通常是冻干形式，包括赋形剂，它在溶解 时可提供具有适当浓度的试剂溶液。
本发明之抗体可用于治疗哺乳动物。在一个实施方案中，例如，出于获得临床前数据的 目的，将目的抗体或等效物施用给非人哺乳动物。示例性的待治疗非人哺乳动物，包括非人 灵长类动物、狗、猫、啮齿类动物以及其它哺乳动物，其中进行了临床前研究。这种哺乳动 物可为需用抗体治疗的疾病的建立的动物模型，或可用于研究目的抗体的毒性。在每个这样 的实施方案中，可在哺乳动物中进行剂量递增研究。
抗体，无论有无第二个组分(如与之缀合的治疗剂部分)，无论是单独或与细胞毒性因子 组合施用，均可作为治疗剂使用。本发明涉及以抗体为基础的疗法，其中保留给动物、哺乳 动物或人施用本发明之抗体，以治疗CD47介导的疾病、障碍或状况。
本发明所使用的术语″治疗″是指治疗性治疗和预防性或预防措施。它指的是预防、治愈、 逆转、减弱、改善、最小化、抑制或停止疾病状态、疾病进程、疾病致病因素(如细菌或病 毒)或其它异常状况的有害效应。
因此，本发明还包含多价抗体，包括双特异抗CD47抗体，其具有与之相连的诊断或治 疗功能的效应分子、原子或其它物质。例如，抗体可具有放射性诊断标签或放射性细胞毒性 原子或金属或细胞毒性物质如蓖麻毒蛋白链，与之相连用于癌症的体内诊断或治疗。
此外，本发明的抗体还可用于免疫测定、纯化方法以及其它用到免疫球蛋白或其片段的 方法。此类用途在本领域为人所熟知。
相应地，本发明还提供包含本发明的抗CD47的抗体或其片段的组合物，所述抗体方便 地和可药用的载体、稀释剂或赋形剂组合，这是本领域的常规做法。
本发明所使用的术语″药物组合物″系指多种制备物的制剂。含有治疗有效量的多价抗体 的制剂为无菌液体溶液、液体悬浮剂或冻干形式，任选地包含稳定剂或赋形剂。
本发明所使用的术语″障碍″系指任何能够得益于本发明抗体治疗的状况。这包括慢性和 急性障碍或疾病，包括那些倾向于使哺乳动物，尤其是人染上所述障碍的病理状况。本文中 非限制性的有待治疗的障碍之实例包括癌症、炎症、自身免疫疾病、感染、心血管疾病、呼 吸疾病、神经疾病以及代谢性疾病。
本发明所使用的术语“癌症”系指或描述了哺乳动物尤其是人的生理状况，其典型特点是 细胞无调控地生长。癌症的实例包括但不限于癌(carcinoma)、淋巴瘤、母细胞瘤、肉瘤和白 血病。
本发明的抗体可以作为单独施用的组合物使用，或可与其它活性剂联合使用。
编码如前述任一方面的抗体或其功能片段的核酸。
含有如前述任一方面的核酸的载体。
含有如前述任一方面的载体的细胞。
包含如前述任一方面的抗体或其功能片段或其编码核酸和可药用载体的药物组合物。
治疗癌症的方法，其包括下述步骤：向所述哺乳动物施用治疗有效量的前述任一方面的 抗体或其功能片段或其编码核酸。
治疗哺乳动物中与CD47异常产生有关的疾病之方法，其包括下述步骤：向所述哺乳动 物施用治疗有效量的前述任一方面的抗体或其功能片段或其编码核酸。
应当理解，根据所述实施方案的治疗剂将与合适的载体、赋形剂、以及其它被掺入制剂 中以提供改善的转移、递送、耐受性等的试剂一同施用。大量适当的制剂可见于所有药物化 学工作者已知的药典中：Remington′s Pharmaceutical Sciences(第15版，MackPublishing Company，Easton，Pa.(1975))，特别是其中Blaug、Seymour的第87章。这些制剂包括例如粉 末、糊剂、膏剂、凝胶剂、蜡、油、脂质、含脂质(阳离子或阴离子)载体(例如LipofectinTM)、 DNA缀合物、无水吸浆、水包油和油包水乳液、乳液聚乙二醇(各种分子量的聚乙二醇)、 半固态凝胶以及含有聚乙二醇的半固态混合物。任何前述混合物均可适用于根据本发明的治 疗或疗法，条件是制剂中的活性成分不被制剂灭活并且制剂在生理学上是相容的并耐受给药 途径。
在一个实施方案中，可将所述抗体用作治疗剂。此类试剂将通常用于治疗、缓解和/或 预防受试者的与异常CD47表达、活性和/或信号传导相关的疾病或病理。可使用标准方法 通过鉴定受试者，例如患有(或处于风险或发展)与异常CD47表达、活性和/或信号传导相关 的疾病或障碍，例如癌症或其它赘生性障碍的人患者来实施治疗方案。将抗体制剂，优选对 其靶抗原有高特异性和高亲和性的抗体制剂施用给受试者并且将通常因其与靶标结合而产 生效应。施用的抗体可消除或抑制或妨碍靶标(例如CD47)的表达、活性和/或信号传导功能。 施用的抗体可消除或抑制或妨碍靶标(例如CD47)与其所天然结合的内源性的配体(例如 SIRPα)结合。例如，抗体与靶标结合并调节、阻断、抑制、减少、拮抗、中和、或以其它方 式妨碍CD47表达、活性和/或信号传导。在一些实施方案中，为治疗与异常CD47表达相 关的疾病或障碍，可将具有重链和轻链CDR(具有如表2所述的氨基酸序列)的抗体施用给受 试者。在一个实施方案中，与异常CD47表达相关的疾病或障碍可为癌症。
作为非限制性示例，与异常CD47表达、活性和/或信号传导相关的疾病或障碍包括血 液学癌症和/或实体瘤。血液学癌症包括例如白血病、淋巴瘤和骨髓瘤。作为非限制性示例， 某些形式的白血病包括急性淋巴细胞性白血病(ALL)；急性髓性白血病(AML)；慢性淋巴细 胞性白血病(CLL)；慢性髓细胞性白血病(CML)；骨髓增生性疾病/赘生物(MPDS)；和骨髓 增生异常综合征。作为非限制性示例，某些形式的淋巴瘤包括霍奇金氏淋巴瘤、低度恶性和 侵袭性非霍奇金氏淋巴瘤、伯基特淋巴瘤、以及滤泡性淋巴瘤(小细胞和大细胞)。作为非限 制性示例，某些形式的骨髓瘤包括多发性骨髓瘤(MM)、巨细胞性骨髓瘤、重链骨髓瘤和轻 链或Bence-Jones骨髓瘤。实体瘤包括例如乳腺肿瘤、卵巢肿瘤、肺肿瘤、胰腺肿瘤、前列 腺肿瘤、黑色素瘤、结直肠肿瘤、肺肿瘤、头颈肿瘤、膀胱肿瘤、食管肿瘤、肝肿瘤和肾瘤。
与癌症及其它赘生性障碍相关的症状包括例如发炎、发烧、全身不适、发烧、疼痛、经 常局部发炎、食欲不振、体重减轻、浮肿、头痛、疲乏、皮疹、贫血、肌无力、肌肉疲劳和 腹部症状例如腹痛、痢疾或便秘。
本文所述抗体的治疗有效量通常涉及实现治疗目标所需的量。如上指出，这可为抗体及 其靶抗原之间的结合相互作用，在某些情况下妨碍靶标的功能。需要施用的量此外取决于抗 体对其特异性抗原的结合亲和力，并且还取决于所施用抗体从体内清除的速率。作为非限制 性的示例，本文所述抗体或抗体片段的治疗有效剂量的常见范围可为约0.1mg/kg体重至约 100mg/kg体重。在一个实施方案中，本文所述抗体的治疗有效剂量为约0.1mg/kg体重至约 0.3mg/kg体重。在一个实施方案中，本文所述抗体的治疗有效剂量为约0.4mg/kg体重至约 0.6mg/kg体重。在一个实施方案中，本文所述抗体的治疗有效剂量为约0.7mg/kg体重至约 0.9mg/kg体重。在一个实施方案中，本文所述抗体的治疗有效剂量为约1.0mg/kg体重至约 2.0mg/kg体重。在一个实施方案中，本文所述抗体的治疗有效剂量为约2.0mg/kg体重至约 3.0mg/kg体重。在一个实施方案中，本文所述抗体的治疗有效剂量为约3.0mg/kg体重至约 4.0mg/kg体重。在一个实施方案中，本文所述抗体的治疗有效剂量为约4.0mg/kg体重至约 5.0mg/kg体重。在一个实施方案中，本文所述抗体的治疗有效剂量为约5.0mg/kg体重至约 6.0mg/kg体重。在一个实施方案中，本文所述抗体的治疗有效剂量为约6.0mg/kg体重至约 7.0mg/kg体重。在一个实施方案中，本文所述抗体的治疗有效剂量为约7.0mg/kg体重至约 8.0mg/kg体重。在一个实施方案中，本文所述抗体的治疗有效剂量为约8.0mg/kg体重至约 9.0mg/kg体重。在一个实施方案中，本文所述抗体的治疗有效剂量为约9.0mg/kg体重至约 10.0mg/kg体重。在一个实施方案中，本文所述抗体的治疗有效剂量为约10.0mg/kg体重至 约15.0mg/kg体重。在一个实施方案中，本文所述抗体的治疗有效剂量为约15.0mg/kg体重 至约20.0mg/kg体重。一般的给药频率的范围可为例如从每日一次至每日两次到隔日一次到 每周一次。
可结合任意已知的用于诊断或治疗特定炎性相关的障碍的方法确定治疗的有效性。炎性 相关的障碍的一个或多个症状减轻指示抗体赋予了临床益处。
在另一个实施方案中，针对CD47的抗体可用于本领域中已知的与CD47定位和/或定 量相关的方法(例如，用于测定适当生理样品中的CD47和/或CD47和SIRPα两者的水平，用于诊断方法，用于蛋白成像等等)。在一个给定实施方案中，对CD47或其衍生物、片段、 类似物或同系物具有特异性的、包含源于抗体的抗原结合结构域的抗体，被用作药物学活性化合物(下文称为“治疗剂”)。
在另一个实施方案中，可通过标准技术例如免疫亲和、色谱或免疫沉淀，使用对CD47 具有特异性的抗体来分离CD47多肽。针对CD47蛋白质的抗体(或其片段)可用于检测生物 样品中的蛋白质。在一些实施方案中，在生物样品中可检测CD47作为临床测试过程的一部 分，例如，用于确定给定治疗方案的功效。将抗体偶联(即物理连接)到可检测物质可有利于 检测。可检测物质的示例包括各种酶、辅基、荧光材料、发光材料、生物发光材料和放射性 材料。合适的酶的示例包括辣根过氧化物酶、碱性磷酸酶、β-半乳糖苷酶或乙酰胆碱酯酶； 合适的辅基复合物的示例包括链霉亲和素/生物素和亲和素/生物素；合适的荧光材料的示例 包括伞形酮、荧光素、异硫氰酸荧光素、罗丹明、二氯三嗪氨荧光素、丹磺酰氯或藻红蛋白； 发光材料的一个示例包括鲁米诺；生物发光材料的示例包括荧光素酶、荧光素和水母蛋白， 并且合适放射性材料的示例包括125I、131I、35S或3H。
在另一个实施方案中，根据本公开的抗体可用作检测样品中CD47和/或CD47和SIRPα 蛋白质两者(或其蛋白质片段)存在的试剂。在一些实施方案中，抗体包含可检测标记。抗体 为多克隆抗体，或更优选单克隆抗体。使用完整的抗体或其片段(例如Fab、scFv或F(ab′)2)。 关于抗体的术语“标记”旨在包括通过将可检测物质偶联(即物理连接)到该抗体来直接标记 该抗体，以及通过与直接标记的另一种试剂反应来间接标记该抗体。间接标记的示例包括使 用荧光标记的第二抗体检测第一抗体，以及用生物素进行末端标记抗体，以便能够用荧光标 记的链霉亲和素进行检测。术语“生物样品”旨在包括从受试者分离的组织、细胞和生物学流 体，以及受试者体内存在的组织、细胞和流体。因此，使用的术语“生物样品”包括血液和血 液中的级分或组分，包括血清、血浆、或淋巴液。换言之，所述实施方案的检测方法可用于 在体外及体内检测生物样品中的分析物mRNA、蛋白质或基因组DNA。例如，分析物mRNA 体外检测技术包括Norhtern杂交和原位杂交。分析物蛋白质体外检测技术包括酶联免疫吸 附测定(ELISA)、Western印迹、免疫沉淀、以及免疫荧光。分析物基因组DNA体外检测技 术包括Southern杂交。用于进行免疫测定的过程描述于例如“ELISA：Theory andPractice：Methods in Molecular Biology”，第42卷，J.R.Crowther(编辑)Human Press，Totowa，N.J.，1995；“Immunoassay”，E.Diamandis和T.Christopoulus，Academic Press，Inc.，San Diego，Calif.，1996；以及“Practice and Theory of EnzymeImmunoassays”，P.Tijssen，ElsevierSciencePublishers，Amsterdam，1985。此外，分析物蛋白质的 体内检测技术包括向受试者体内导入标记的抗分析物蛋白抗体。例如，可以用放射性标记标 记抗体，然后可以通过标准成像技术检测受试者体内该放射性标记物的存在和位置。
可将本文所述抗体和其衍生物、片段、类似物和同系物掺入适于施用的药物组合物中。 制备此类组合物所涉及的原理和考虑事项以及选择组分的指南在本领域中是熟知的，例如参 见Remington′s Pharmaceutical Sciences：The Science And PracticeOfPharmacy第19版(AIfonso R.Gennaro等人编辑)Mack Pub.Co.，Easton，Pa.：1995；DrugAbsorption Enhancement：Concepts，Possibilities，Limitations，And Trends，HarwoodAcademic Publishers，Langhome，Pa.，1994；以及Peptide And Protein Drug Delivery(Advances In Parenteral Sciences，第4卷)，1991，M.Dekker，New York。
此类组合物通常包含抗体和药学上可接受的载体。当使用抗体片段时，与靶蛋白结合结 构域特异性结合的最小抑制片段可为优选的。例如，基于抗体的可变区序列，可以设计保留 结合靶蛋白质序列能力的肽分子。此类肽可化学合成和/或通过重组DNA技术产生(参见例 如Marasco等人，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，90：7889-7893(1993))。
如本文所用，术语“药学上可接受的载体”旨在包括与药物给药相容的任何和所有溶剂、 分散介质、包衣、抗细菌剂和抗真菌剂、等渗剂和吸收延缓剂等。合适载体描述于最新版的 Remington′s Pharmaceutical Sciences中，这是本领域的标准参考书目，其以引用方式并入本 文。此类载体或稀释剂的优选示例包括但不限于水、盐水、林格氏溶液、葡萄糖溶液和5％ 的人血清白蛋白。也可以使用脂质体和非水性载体，例如固定化油。将此类介质和试剂用于 药物活性物质是本领域熟知的。除去任何常规的介质或试剂与抗体不相容之外，设想其在组 合物中的用途。
待用于体内施用的制剂必须为无菌的。这可容易地通过无菌滤膜过滤实现。
将所述实施方案的药物组合物配制成与其预期施用途径相容。给药途径的示例包括肠胃 外，例如静脉内、皮内、皮下、经口(例如吸入)、经皮(即局部的)、经粘膜和直肠给药。用 于肠胃外、皮内或皮下施用的溶液或悬浮液可包括以下组分：注射用无菌稀释剂例如水、盐 溶液、固定油、聚乙二醇类、甘油、丙二醇或其它合成溶剂；抗细菌剂，例如苄醇或对羟基 苯甲酸甲酯；抗氧化剂，例如抗坏血酸或亚硫酸氢钠；螯合剂，例如乙二胺四乙酸(EDTA)； 缓冲剂，例如乙酸盐、柠檬酸盐或磷酸盐、以及调节渗透压的试剂，例如氯化钠或右旋糖。 pH可用酸或碱进行调节，例如盐酸或氢氧化钠。可将肠胃外制剂包装在安瓿、一次性注射 器或玻璃或塑料制多剂量小瓶内。
适于注射用途的药物组合物包括无菌水性溶液(在此是水溶性的)或分散体以及用于即 时制备无菌注射液或分散体的无菌粉末。对于静脉内施用，合适的载体包括生理盐水、抑菌 水、Cremophor ELTM(BASF，Parsippany，N.J.)或磷酸盐缓冲盐水(PBS)。在所有情况下，组合 物必须是无菌的并且应当为流动性达到易于注射的程度。其在制造和储存条件下必须是稳定 的并且必须能防止微生物例如细菌和真菌的污染作用。载体可以是含有例如水、乙醇、多元 醇(例如，甘油、丙二醇和液体聚乙二醇等)的溶剂或分散介质，及其适宜的混合物。例如通 过利用涂层例如卵磷脂，在分散体情况下维持所需颗粒尺寸，以及利用表面活性剂，可以保 持适宜的流动性。对微生物作用的防止可以通过各种抗细菌剂和抗真菌剂例如对羟基苯甲酸 酯、氯代丁醇、苯酚、抗坏血酸、硫柳汞等来实现。在许多情况下，将优选在组合物中包含 等渗剂，例如糖、多元醇(诸如甘露糖醇、山梨醇)、氯化钠。注射用组合物的延长吸收可通 过在所述组合物中包含延缓吸收的试剂例如单硬脂酸铝和明胶来达到。
根据需要，可以通过将抗体以所需量掺入具有上文所列成分中的一种或组合(按需要)的 合适溶剂中来制备无菌注射溶液，然后过滤消毒。一般来讲，通过将抗体掺入含有碱性分散 介质和上文所列那些中的所需其它成分的无菌载体中来制备分散体。就用于制备无菌注射溶 液的无菌粉末而言，制备方法是获得粉末的真空干燥和冷冻干燥，该粉末包含活性成分和任 何另外的期望成分，它们来自前述的这些成分的无菌过滤溶液。
对于吸入给药，从包含合适推进剂如二氧化碳等气体的加压容器或分配器或者喷雾器以 气溶胶喷雾形式递送化合物。
还可以通过经粘膜或透皮方式全身给药。对于经粘膜或透皮给药，在制剂中使用适于渗 透屏障的渗透剂。此类渗透剂通常在本领域是通常所知的，并且包括如用于经粘膜给药的去 污剂、胆盐和夫西地酸衍生物。经粘膜给药可以通过使用喷鼻剂或栓剂来实现。对于透皮给 药，可将一种或多种所述抗体配制成如本领域通常所知的膏剂、软膏、凝胶、或霜膏。
还可将化合物以栓剂(例如，具有常规栓剂基质，如可可脂或其它甘油酯)或滞留性灌肠 剂形式进行制备以用于经直肠递送。
在一个实施方案中，所述抗体可用防止其不被身体迅速消除的载体制备，例如缓释/控 释制剂，包括植入体和微胶囊化递送体系。可使用可生物降解、可生物相容的聚合物，例如 乙烯-乙酸乙烯酯、聚酐、聚乙醇酸、胶原、聚原酸酯和聚乳酸。用于制备此类制剂的方法 对于本领域技术人员而言是显而易见的。
例如，这些活性成分可胶囊包封于例如通过凝聚技术或通过界面聚合法制备的微胶囊中， 例如分别在胶体给药系统(例如，脂质体、白蛋白微球、微乳液、纳米颗粒和纳米胶囊剂)或 大乳液中的羟甲基纤维素或明胶微胶囊和聚(甲基丙烯酸甲酯)微胶囊。
可制备缓释制剂。适宜的缓释制剂的示例包括含有抗体的固体疏水聚合物的半透性基质， 该基质是成型制品形式例如膜或微胶囊。缓释基质的示例包括聚脂、水凝胶(例如，聚(2-羟 乙基-甲基丙酸酯)、或聚(乙烯醇))、聚交酯(美国专利No.3,773,919)、L-谷氨酸和γ乙基-L- 谷氨酸盐的共聚物、不可降解的乙烯-乙酸乙烯酯、可降解乳酸-乙醇酸共聚物例如LUPRON DEPOTTM(由乳酸-乙醇酸共聚物和醋酸亮丙瑞林构成的注射用微球)、和聚-D-(-)-3-羟基丁酸。 虽然聚合物例如乙烯-乙酸乙烯酯和乳酸-乙醇酸能够释放分子100天以上，但是一些水凝胶 释放蛋白质的时间却较短。
脂质体混悬剂(包括用针对病毒抗原的单克隆抗体靶向受感染细胞的脂质体)也可以用 作药学上可接受的载体。这些可根据本领域技术人员已知的方法制备，例如在美国专利 No.4,522,811中有所描述。
尤其有利的是以剂量单位形式配制肠胃外组合物以易于施用和剂量的一致性。如本文所 用，剂量单位形式是指用于待治疗的受试者，适合作为单位剂量的物理上可分离的单位；每 个单位含有经计算与所需药物载体结合产生期望治疗效果的预定量的一种或多种所述抗体。 所述实施方案的剂量单位形式的规格由以下指示并直接取决于：抗体的独特特征和待实现的 具体治疗效果，和用于治疗个体的此类抗体的调配领域中固有的局限性。
所述药物组合物可与给药说明书一起放于容器、包装、或分配器中。
本文所述制剂还可根据要治疗的具体情况而包含多于一种所述抗体，优选具有互补活性 但对彼此无负面影响的那些。另选地或除此之外，组合物可例如包含增强其功能的试剂，诸 如细胞毒素试剂、细胞因子、化学治疗剂、或生长抑制剂。此类分子以对预期目的有效的量 适当地联合存在。
在一个实施方案中，一种或多种所述抗体可在联合治疗中施用，即与其它试剂例如治疗 剂(其可用于治疗病理学病症或障碍，例如各种形式的癌症、自身免疫性障碍和炎性疾病)联 合。术语“联合”在本文中是指将试剂基本上同步地，同时地或顺次地给予。如果顺次给予， 则在开始施用第二种化合物时，两种化合物中的第一种仍优选在治疗位点处以有效浓度被检 测到。
例如，联合治疗可包含本文所述一种或多种抗体与一种或多种附加治疗剂(例如一种或 多种细胞因子和生长因子抑制剂、免疫抑制剂、抗炎剂、代谢抑制剂、酶抑制剂、和/或细 胞毒素或细胞生长抑制剂，如下更详述的)共同配制和/或共同施用。此类联合治疗可有利地 利用较低剂量的施用的治疗剂，因而避免了与各种单一疗法相关的可能毒性或并发症。
与本文所述抗体联合使用的优选治疗剂是干扰炎症应答中不同阶段的那些试剂。在一个 实施方案中，可将本文所述一种或多种抗体与一种或多种附加试剂例如其它细胞因子或生长 因子拮抗剂(例如，可溶受体、肽抑制剂、小分子、配体融合物)；或结合其它靶标的抗体或 抗原结合片段(例如，结合其它细胞因子或生长因子、其受体、或其它细胞表面分子的抗体)； 以及抗炎性细胞因子或其激动剂共同配制和/或共同施用。
在其它实施方案中，本文所述抗体被用作针对自身免疫性障碍、炎性疾病等的疫苗佐剂。 用于治疗这些类型障碍的佐剂的组合适于与各种各样的抗原联合使用，所述抗原来自于所靶 向的自体抗原，即参与自身免疫的自身抗原，例如髓磷脂碱性蛋白；炎性自体抗原，例如淀 粉状肽蛋白、或移植抗原，例如同种抗原。抗原可包括衍生自蛋白质的肽或多肽以及以下任 一项的片段：糖、蛋白质、多核苷酸或寡核苷酸、自身抗原、淀粉样肽蛋白、移植抗原、过 敏原或其它大分子组分。在一些例子中，多于一种抗原被包含在抗原性组合物中。
为了达到清楚和简洁描述的目的，本文中作为相同的或分开的一些实施方案的一部分来 描述特征，然而，将要理解的是，本发明的范围可包括具有所描述的所有或一些特征的组合 的一些实施方案。
实施例
1.CD47及SIRPα融合蛋白在真核细胞的表达
以人CD47的cDNA质粒(Sino Biological，货号：HG12283-G)为模板，PCR扩增人CD47分子N端胞外区片段(19-135)，其中Cys33突变为Gly，PCR引物如下：
上游引物 5’CTGAGAGGTGCCAGATGTCAGCTACTATTTAATAAAACAAAATCTGTAGAATTCACGTTTGGTAATGACACTGTCGT 3’
下游引物 5’TCCGCCTCCGCCGCTAGCTGAAACAACACGATA 3’
扩增产物克隆到自主构建的真核表达质粒系统(含C端His6 tag，便于纯化)。转染HEK293.6E细胞5-7天后，收集培养基上清液，Ni亲和柱纯化得到重组人CD47分子N端 胞外区蛋白(hCD47)。
以人SIRPα cDNA质粒(Sino Biological，货号：HG11612-M)为模板，将其克隆到自主构建的带有小鼠IgG2aFc片段的真核表达质粒系统，以此质粒转染HEK293.6E细胞5-7 天后，收集培养基上清液，Protein A亲和柱纯化得到重组人SIRPα-Fc融合蛋白。取1mg SIRPα-Fc融合蛋白，用PBS调节浓度至1mg/ml；称取1mg EZ-LinkSulfo-NHS-LC-LC-Biotin(Thermofisher，货号：21338)试剂，用150uL ddH2O将其快速溶解；取13.2uL溶解后的Sulfo-NHS-LC-LC-Biotin试剂加入蛋白液中，上下颠倒混匀；将其放置在冰上孵育2小时；反应结束后将蛋白转移至10000道尔顿(Da)超滤管中，浓缩换液至PBS；测OD280后， 用r-streptavidin(普欣生物，货号：1005-01)检测蛋白生物素化效率，然后将蛋白分装保存。结果分别见图1和图2。
2.人CD47基因稳转细胞株构建
构建含有人CD47全长序列的慢病毒载体，按照慢病毒包装试剂盒说明书(Lenti-Pac HIV Expression Packaging Kit，GeneCopoeia，货号HPK-LvTR-20)，用构建好的慢病毒和包装质粒 共转染HEK293T细胞，进行慢病毒包装。转染48小时后收集培养基，以500*g离心10分 钟去除细胞碎片，获得含慢病毒的培养上清，以0.45um的PES过滤膜过滤后，分装至1.5mlEP 管(每管200ul)中，取10ul用于感染1x106CHO细胞，其余贮存于-80℃。感染后，在培 养基中加入10ug/ml puromycin进行筛选，阳性克隆有限稀释后得到稳定表达人全长CD47 分子的细胞株hCD47-CHO-1B10。结果见图3。
3.杂交瘤制备
将人CD47重组蛋白或hCD47-CHO-1B10细胞，作为抗原与等量免疫佐剂(福氏佐剂)混合，取每组6只6-8周雌性Balb/c小鼠进行免疫。在初次免疫两周后，进行加强免疫。三 次免疫后，眼眶取血检测血清效价。融合前，以1x106个hCD47-CHO稳转细胞进行尾静脉 注射冲击免疫。三天后，断颈处死小鼠，取小鼠脾和部分外周淋巴结，在DMEM培养基中 研磨后离心；倾倒上清后，轻轻将脾细胞团打散，加入5mL红细胞裂解液，裂解50s后， 加入40mL DMEM离心，得到不含红细胞的脾细胞悬浮液。取适量的淋巴结和脾细胞的混 悬液和SP2/0混合后，采用BTX电融合仪进行细胞融合。将融合细胞接种于96孔板中， 在含有HAT的DMEM完全培养基中置于5％CO2，37℃条件下培养。一周左右开始观察 杂交瘤细胞的生长情况，待其长至60％以上时取出上清供抗体检测。
4.杂交瘤上清的筛选
用0.05M pH9.0碳酸氢盐缓冲液配制1ug/ml hCD47抗原(hCD47R-ECD chis)，按照100ul每孔的体积加入96孔酶标板中(Costar，货号9018)，4℃中孵育过夜，次日PBS洗 涤3次，用200ul 2％脱脂奶粉/PBS室温封闭2小时，PBS洗涤3次，加入50ul杂交瘤上 清，室温孵育1小时后，用PBST和PBS重复洗涤3次，加入二抗(抗-mouse IgG-Fc-HRP， JacksonImmunoResearch货号：115-035-071)孵育1小时，重复洗涤3次后加入50ul显色 液(TMB溶液，Sigma货号T2885)，37℃放置5分钟后加入50ul 2M浓硫酸溶液终止反 应，立即放于酶标仪中读取OD450的值。
将ELISA检测到的结合CD47抗体的阳性克隆上清，进一步验证与CD47阳性细胞的结合。取CCRF-CEM细胞(CRM-CCL-119TM)按5×104/孔加入96孔板中，每孔再 加入50ul杂交瘤上清，4℃孵育60分钟，离心吸弃上清，用0.5％BSA/PBS洗涤，再加入 50ul二抗溶液(抗-mouse IgG-Fc-AF647，Jackson ImmunoResearch货号：115-606-071)，4℃ 孵育45分钟，之后用0.5％BSA/PBS洗去多余的二抗，最后用60ul含有1ug/ml荧光染料(碘 化丙啶，PI，Sigma，货号：P4170)的PBS溶液重悬细胞，上流式细胞仪检测。结果见图4。
5.CD47-SIRPα阻断实验
将CCRF-CEM细胞按5×104/孔加入96孔板中，每孔加入50ul杂交瘤上清，4℃孵育30 分钟，加入50ul 1ug/ml生物素化的SIRPα-Fc融合蛋白，4℃孵育30min，用0.5％BSA/PBS洗涤，再加入50ul二抗溶液(SA-PE，Jackson ImmunoResearch货号：016-110-084)，最后 用60ul含有1ug/ml荧光染料(碘化丙啶，PI，Sigma，货号：P4170)的PBS溶液重悬细胞， 上流式细胞仪器检测。结果见图5杂交瘤阳性克隆1H1、2E4、7A11、7G5、7H5、9C4、9G11、 10B8、12G8、14G6、15A7和15G6结合到CD47阳性细胞表面后，均能有效阻止SIRPα与 CD47的结合。
6.克隆候选抗体基因
根据前期筛选的结果，我们提取杂交瘤细胞的RNA，反转录为cDNA。以cDNA模板，进行PCR扩增，经测序后，得到候选阳性克隆重链和轻链可变区序列为：
克隆2E4-C7：
重链
核酸序列
轻链
核酸序列
克隆7A11-C2
重链
核酸序列
轻链
核酸序列
克隆7G5-D10
重链
核酸序列
轻链
核酸序列
克隆7H5-B12
重链
核酸序列
轻链
核酸序列
克隆9G11-D2
重链
核酸序列
轻链
核酸序列
克隆10B8-B8
重链
核酸序列
轻链
核酸序列
克隆12G8-A9
重链
核酸序列
轻链
核酸序列
克隆14G6-C1
重链
核酸序列
轻链
核酸序列
克隆15G6-E8
重链
核酸序列
轻链
核酸序列
克隆15A7-A10
重链
核酸序列
轻链
核酸序列
7.嵌合抗体的构建和表达
扩增重链和轻链可变区序列片段，经Gibson Assembly插入到相应的表达完整的抗体 重链和轻链的质粒载体上，其中重链可变区克隆到含有人重链恒定区的载体上，从而可以在 哺乳动物细胞中表达完整的IgG1重链。类似地，将轻链可变区克隆到含有人轻链恒定区的 载体，以在哺乳动物细胞中表达完整的IgGkappa轻链。测序正确后的质粒在哺乳动物细胞 HEK293.6E中瞬转表达CD47候选抗体，5-7天后收集细胞上清，过滤后纯化。采用Protein A层析纯化IgG，用50mM Tris-HCl pH8.0，250mM NaCl洗涤，用0.1M Glycine-HClpH3.0 将结合的IgG洗脱下来。利用浓缩管(Millipore)将蛋白超滤浓缩换液至PBS，测定IgG 的浓度。
嵌合体抗体对CD47的结合及阻断
将重组表达的嵌合抗体，利用ELISA和FACS分别在抗原和细胞水平上，进行了人CD47 分子的结合以及CD47-SIRPα阻断实验。
用重组CD47抗原检测嵌合抗体对CD47的结合
用0.05M pH9.0碳酸氢盐缓冲液配制1ug/ml hCD47抗原，按照100ul每孔的体积加入 96孔酶标板中，4℃中孵育过夜，次日PBS洗涤3次，用200ul 2％脱脂奶粉/PBS室温封闭2小时，PBS洗涤3次，加入50ul等比稀释的抗体，室温孵育1小时后用PBST和PBS重复 洗涤3次，加入二抗抗-mouse IgG-Fc-HRP孵育1小时，重复洗涤3次后加入50ul显色液 (TMB溶液，Sigma，货号T2885)，37℃放置5分钟后立即加入50ul 2M浓硫酸溶液终止反 应，立即放于酶标仪中读取0D450的值(图6-1)；
用重组CD47抗原检测嵌合抗体对CD47-SIRPα结合的抑制作用
1ug/ml重组蛋白hCD47包被过夜，次日PBS洗涤3次，用200ul 2％脱脂奶粉/PRS室温封闭2小时，PBS洗涤3次，先加入50ul等比稀释的不同浓度的CD47嵌合抗体，再加入 50ul生物素化的SIRPα-Fc融合蛋白，分别在室温孵育1小时后用PBST和PBS重复洗涤3 次，加入二抗(SA-HRP，Jackson ImmunoResearch货号：016-030-084)孵育1小时，重复 洗涤3次后加入50ul显色液，37℃放置5分钟后立即加入50ul 2M浓硫酸溶液终止反应， 立即放于酶标仪中读取0D450的值(图6-2)。
在细胞水平上检测嵌合抗体结合CD47的生物学活性
选取表达hCD47的肿瘤细胞CCRF-CEM，按照5×104个细胞每孔铺板于96孔U型板中， 加入50ul等比稀释不同浓度的CD47嵌合抗体，4℃孵育60分钟，之后用0.5％BSA/PBS洗去多余的一抗，再加入50ul二抗溶液抗-mouse IgGFc-AF647，4℃孵育45分钟，之后用0.5％BSA/PBS洗去多余的二抗，最后用60ul含有1ug/ml荧光染料PI的PBS溶液重悬细胞，立 即上流式细胞仪器检测(图6-3)；
在细胞水平上检测嵌合抗体对CD47-SIRPα结合的抑制作用
将CCRF-CEM按照5×104个细胞每孔铺板于96孔U型板中，加入50ul等比稀释不同浓 度CD47抗体，4℃孵育30分钟，之后加入50ul 1ug/ml生物素化的SIRPα-Fc融合蛋白溶液，4℃孵育30分钟，之后用0.5％BSA/PBS洗去多余的一抗，再加入50ul二抗SA-PE溶液， 最后用60ul含有1ug/ml荧光染料PI的PBS溶液重悬细胞，立即上流式细胞仪器检测(图 6-4)。实验结果表明，构建得到的人鼠嵌合体抗体在抗原和细胞上都能结合CD47，同时具 有竞争性抑制CD47-SIRPα受体和配体结合的生物学活性。
8.抗-CD47单抗识别食蟹猴淋巴细胞
采集4ml新鲜猴血取到50ml离心管中，加入10ml红细胞裂解液，室温静置10分 钟，1200rpm离心10分钟，加入20ml PBS清洗两次，第二次清洗前细胞计数，按照2x105/ 管细胞数准备细胞染色，1200rpm离心10分钟，用100ug/ml鼠IgG进行封闭5-10分钟， 加入不同浓度抗体，冰上孵育60分钟，洗2次将多余一抗洗去，加入二抗(抗-human IgGFc-AF647，Jackson ImmunoResearch货号：109-606-170)，冰上孵育45分钟，洗2次 将多余二抗洗去，最后用1ug/ml PI/PBS重悬细胞，用流式细胞仪检测。结果见图7。
9.抗-CD47抗体介导的细胞吞噬作用
用Ficoll(GE healtheare，货号：17-1440-03)从新鲜人血液中分离出PBMC细胞，将1胞，将人洗涤过的PBMC细胞弃去上清液，用MACS Buffer重悬细胞(1x107细胞/80uL)，加入CD14 MicroBeads human-lyophilized(10-7细胞/20uL)(MACS，货号：130097052)， 经分选磁力架先洗脱非单核细胞，最后用MACS Buffer将单核细胞洗脱下来，用RPMI1640 培养基(含40ng/ml CSF-1)培养诱导成巨噬细胞。
采用被1uM CFSE标记的CCRF-CEM细胞作为CD47阳性靶细胞，按照1×105/孔接种50ul 至96孔板中，再加入50ul 4倍终浓度的抗体，最后加入100ul密度为2.5×105/ml用CSF1 诱导7天成熟的巨噬细胞，巨噬细胞∶CCRF-CEM＝1∶4，37℃培养箱孵育4小时，最后上流 式细胞分析仪检测收集细胞。结果见图8。
10.红细胞凝集试验
将待测抗体用PBS溶液做倍比稀释，其实浓度均为10ug/ml，随后在96孔板中加入50ul 不同稀释度的抗体，再加入50ul密度为1x108/ml新鲜红细胞，室温静置数分种后，部分反 应孔出现肉眼可见的凝集颗粒。未出现明显凝集现象的反应孔在静置2小时后，用显微镜确 认是否有红细胞凝集。结果见图9。
11.抗体的人源化
鼠源单克隆抗体15G6的人源化参照经典的CDR移植策略进行，即把鼠抗15G6的轻、重 链可变区CDR序列，移植到同源性较高的人胚系序列IGKV4-1*01和IGHV1-3*01中，框架区 4选择与鼠抗同源性最高的IGKJ1*01和IGHJ4*01；随后同时利用计算机进行同源建模，设 计回复突变位点。
将轻、重链衍生物分别进行基因合成(苏州泓迅生物科技公司、苏州金唯智生物科技公 司)，克隆到含有抗体kappa链恒定区或人IgG1恒定区的载体，质粒进行配对后转染HEK293.6E细胞，表达5-7天，收取上清进行ProteinA柱纯化。
人源化抗体重链/轻链可变区序列如下：
VH-v1
核酸序列
VH-v2：
核酸序列
VH-v3：
核酸序列
VH-v4：
核酸序列
VH-v5：
核酸序列
VH-v6：
核酸序列
VH-v7：
核酸序列
VH-v8：
核酸序列
VH-v9：
核酸序列
VH-v10：
核酸序列
VH-v11：
核酸序列
Vk-v1：
核酸序列
Vk-v2：
核酸序列
Vk-v3：
核酸序列
Vk-v4：
核酸序列
Vk-v5：
核酸序列
12.人源化抗体h15G6对CD47的结合和对CD47-SIRPα阻断作用
将所有的重链和轻链构建到真核表达载体上，将所有的重链和轻链进行相互配对，瞬转 表达得到的抗体用于亲和力检测、受体配体阻断实验，结果显示人源化后抗体与CD47的亲 和力和对受体配体的阻断能力并未发生显著变化。进一步进行红细胞凝集试验，结果见图 10，显示未出现凝血现象。
13.人源化抗体h15G6的亲和力测定
利用Fortbio、ELISA和FACS测定了抗-CD47单克隆抗体与人CD47分子的亲和力。
Fortbio测定亲和力
Protein A探针分别包被5ug/ml待测抗体，梯度稀释的重组蛋白hCD47，浓度设置5ug/ml、2.5ug/ml、1.25ug/ml、0.625ug/ml、0ug/ml 5个点，然后再Fortbio仪器上进行 上样检测。结果见图11。
进一步利用ELISA和FACS方法在抗原水平和细胞水平上，检测人源化抗体能够与人 CD47分子结合，同时具有能够抑制受体配体CD47-SIRPα能相互结合的活性。结果见图12。
14.人源化h15G6-IgG4抗体介导的细胞吞噬(ADCP)
用Ficoll(GE healtheare，货号：17-1440-03)从新鲜人血液中分离出PBMC细胞，将1胞，将人洗涤过的PBMC细胞弃去上清液，用MACS Buffer重悬细胞(10-7个细胞/80uL)，加入CD14 MicroBeads human-lyophilized(10-7个细胞/20uL)(MACS，货号：130097052)，经分选磁力架先洗脱非单核细胞，最后用MACS Buffer将单核细胞洗脱下来，用RPMI1640培养基(含40ng/ml CSF-1)培养诱导成巨噬细胞。
将人源化h15G6可变区插入表达完整的人IgG4抗体重链的质粒载体，从而在哺乳动物 细胞中表达得到h15G6-IgG4。测序正确后的质粒在哺乳动物细胞HEK293.6E中瞬转表达CD47 候选抗体，5-7天后收集细胞上清，过滤后纯化。采用Protein A层析纯化IgG，用50mM Tris-HCl pH8.0，250mM NaCl洗涤，用0.1M Glycine-HCl，pH3.0将结合的IgG洗脱下来。 利用浓缩管(Millipore)将蛋白超滤浓缩换液至PBS溶液，测定IgG的浓度。
采用被1uM CFSE标记的CCRF-CEM细胞作为CD47阳性靶细胞，按照1×105/孔接种50ul 至96孔板中，再加入50ul稀释4倍终浓度的h15G6人源化抗体(IgG4)，最后加入100ul密度为2.5×105/ml用CSF-1诱导7天成熟的巨噬细胞，巨噬细胞∶CCRF-CEM＝1∶4，37℃ 培养箱孵育4小时，最后上流式细胞分析仪检测收集细胞。结果见图13。
15.人源化抗体h15G6和利妥昔单抗的协同效应
采用被1uM CFSE标记的Daudi细胞作为CD47+靶细胞，按照1×105/孔接种50ul至96 孔板中，再加入50ul稀释4倍终浓度的人源化h15G6-IgG4抗体，最后加入100ul密度为2.5×105/ml用CSF-1诱导7天成熟的巨噬细胞，巨噬细胞∶Daudi＝1∶4，37℃培养箱孵育 4小时，最后上流式细胞分析仪检测收集细胞。结果见图14。
16.人源化h15G6抗体Fc功能试验
抗体依赖性的细胞介导的细胞毒性作用(ADCC)
取适量的效应细胞(NK-92MI-CD16)，用含2.5％FBS的RPMI1640培养基将细胞重悬至密度为4×106/ml，同样地，将靶细胞(CCRF-CEM)重悬至密度为4×105/ml。将抗体 起始浓度设置为40ug/ml，之后10倍等比稀释。取50ul(2×105/孔)效应细胞至96孔 U型板中，加入25ul不同稀释比例的抗体，37℃，5％CO2培养箱孵育30分钟。孵育完成 后加入25ul(1×104/孔)靶细胞，1000rpm离心1分钟，放于37℃，5％CO2培养箱孵育 4h。在检测前30分钟，向靶细胞最大孔加入2ul裂解液(10×)，放回继续培养。30分 钟后，1000rpm离心3分钟，取50ul细胞上清至黑色酶标板，加入等量LDH检测底物 (CytoTox-ONE HomogeneousMembrane Integrity Assay，Promega货号：G7892)，轻 轻振荡混匀，10分钟后用25ul终止液终止，震荡10s，选择Fluorescence波长excitation： 560nm，emission：590nm检测化学发光。结果见图15。
补体介导的细胞毒性作用(CDC)
将靶细胞(CCRF-CEM)重悬至密度为2×106/ml。将抗体起始浓度设置为30ug/ml，用RPMI1640培养基按照1∶3对抗体进行等比稀释。用RPMI1640培养基配制30％的补体。 取50ul(1×105/孔)细胞悬液至96孔板中，之后加入50ul不同稀释浓度的抗体，再加 入50ul稀释成30％的补体，放于37℃，5％CO2培养箱孵育2小时。用RPMI培养基(含 0.1％BSA)配制含40％CCK8的检测溶液，细胞-抗体-补体孵育2小时后，每孔加入50ul CCK8 溶液进行染色，震荡10秒，放于37℃，5％CO2培养箱孵育4小时。孵育完成后震板10 秒，酶标仪450nm检测波长，630nm为参比波长读取OD值。结果见图16。
17.抗-CD47单抗在CD47人源化小鼠的毒性试验
选取CD47人源化小鼠C57BL/6-Cd47tml(hCD47)/Bcgen(百奥赛图，货号B-CM-021)，采取 腹腔注射抗体(10mg/kg体重)的方式进行2轮给药，每组3只受试小鼠。第一次给药后第2、6、9、13天对受试小鼠进行血液采集，进行血常规检测，第7天进行第二次给药，第9、 13、18天对受试小鼠进行血常规检测。结果见图17。
受试小鼠体重结果显示，在第一次给药后第3天开始小鼠体重降低，至第6天小鼠体重 恢复，次日进行第二次给药，第二次给药后第3天小鼠体重未出现明显变化，之后11天中 小鼠体重持续稳定在正常范围内。阳性对照组control2在第一次注射CD47抗体后三组小鼠 均在第3天出现死亡，其余小鼠正常。
血常规及血生化分析结果如图18所示，表明，抗-CD47单克隆抗体第一次给药后，与 空白对照组相比受试组小鼠外周血红细胞数出现下降，第二次给药后红细胞数目基本稳定， 一周内数目基本恢复正常。

Claims (10)

1.抗体或其功能片段，其包含选自氨基酸序列SEQ ID NO：2-4、12-14、22-24、32-34、42-44、52-54、62-64、72-74、82-84、92-94、102-104、107-109、112-114、117-119、122-124、132-134、137-139、142-144、147-149、152-154或其任何变体的重链CDR，和/或选自氨基酸序列SEQ ID NO：7-9、17-19、27-29、37-39、47-49、57-59、67-69、77-79、87-89、97-99、157-159、162-164、167-169、172-174、177-179或任何变体的轻链CDR。
2.根据权利要求1的抗体或其功能片段，其包含选自氨基酸序列SEQ ID NO：2、12、22、32、42、52、62、72、82、92、102、107、112、117、122、127、132、137、142、147、152或其任何变体的重链CDR1，选自氨基酸序列SEQ ID NO：3、13、23、33、43、53、63、73、83、93、103、108、113、118、123、128、133、138、143、148、153或其任何变体的重链CDR2，选自氨基酸序列SEQ IDNO：4、14、24、34、44、54、64、74、84、94、104、114、119、124、129、134、139、144、149、154或其任何变体的重链CDR3；和/或选自氨基酸序列SEQ ID NO：7、17、27、37、47、57、67、77、87、97、157、162、167、172、177或其任何变体的轻链CDR1，选自氨基酸序列SEQ ID NO：8、18、28、38、48、58、68、78、88、98、158、163、168、173、178或其任何变体的轻链CDR2，选自氨基酸序列SEQID NO：9、19、29、39、49、59、69、79、89、99、159、164、169、174、179或其任何变体的轻链CDR3。
3.根据权利要求1或2的抗体或其功能片段，其包含选自氨基酸序列SEQ ID NO：1、11、21、31、41、51、61、71、81、91、101、106、111、116、121、126、131、136、141、146、151或其任何变体的重链可变区，和/或选自氨基酸序列SEQ ID NO：6、16、26、36、46、56、66、76、86、96、156、161、166、171、176或其任何变体的轻链可变区。
4.根据权利要求1或2的抗体或其功能片段，其包含选自氨基酸序列SEQ ID NO：82的重链CDR1，选自氨基酸序列SEQ ID NO：83的重链CDR2，选自氨基酸序列SEQ ID NO：84的重链CDR3；和/或选自氨基酸序列SEQ ID NO：87的轻链CDR1，选自氨基酸序列SEQ ID NO：88的轻链CDR2，选自氨基酸序列SEQ ID NO：89的轻链CDR3。
5.根据权利要求1或2的抗体或其功能片段，其包含选自氨基酸序列SEQ ID NO：102的重链CDR1，选自氨基酸序列SEQ ID NO：103的重链CDR2，选自氨基酸序列SEQ ID NO：104的重链CDR3；和/或选自氨基酸序列SEQ ID NO：157的轻链CDR1，选自氨基酸序列SEQ ID NO：158的轻链CDR2，选自氨基酸序列SEQ ID NO：159的轻链CDR3。
6.根据权利要求4的抗体或其功能片段，其包含选自氨基酸序列SEQ ID NO：81或其任何变体的重链可变区，和/或选自氨基酸序列SEQ ID NO：86或其任何变体的轻链可变区。
7.根据权利要求5的抗体或其功能片段，其包含选自氨基酸序列SEQ ID NO：101或其任何变体的重链可变区，和/或选自氨基酸序列SEQ ID NO：156或其任何变体的轻链可变区。
8.根据前述权利要求任一项的抗体或其功能片段，其中所述抗体或其功能片段阻断CD47和SIRPα相互作用，优选地，所述抗体或其功能片段还不具有显著的血细胞凝集活性，任选地，所述抗体或其功能片段是人源化的，任选地，其中所述抗体或其功能片段是IgG1型或IgG4型。
9.编码如前述权利要求任一项的抗体或其功能片段的核酸分子，和/或含有如前述任一方面的核酸的载体，和/或含有如前述任一方面的载体的细胞，和/或包含如权利要求任一项的抗体或其功能片段或其编码核酸和可药用载体的药物组合物。
10.前述权利要求任一项的抗体或其功能片段或核酸分子或载体或细胞或药物组合物在制备用于治疗癌症或治疗动脉粥样硬化的药物中的用途。
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