JP2022509156A - 抗ｃｄ４０抗体、その抗原結合フラグメント、およびその医学的使用 - Google Patents

Abstract

本発明は、抗ＣＤ４０抗体、抗原結合フラグメント、およびその医薬としての使用に関する。抗ＣＤ４０抗体およびその抗原結合フラグメントの重鎖定常領域は、変異を含む。変異によって、抗ＣＤ４０抗体はＦｃγＲＩＩＩへの結合活性を失い、抗ＣＤ４０抗体とＦｃγＲＩＩＢの結合は向上され、したがって、抗体依存性細胞傷害性（ＡＤＣＣ）が失される一方で、ＦｃγＲＩＩＢ仲介抗体架橋が改善される。重鎖定常領域の変異は、ＣＤ４０の活性化を向上し、樹状細胞の抗原提示を向上する。抗ＣＤ４０抗体およびその抗原結合フラグメントは、抗癌剤としてＣＤ４０仲介疾患または症状を処置するために使用しうる。

Description

本願は、２０１８年１１月３０日出願の中国特許出願「抗ＣＤ４０抗体、その抗原結合フラグメント、およびその医学的使用」（出願番号CN201811448228.1）の優先権を主張する。

本開示は、重鎖定常領域に変異を含む抗ＣＤ４０抗体もしくはその抗原結合フラグメント、キメラ抗体、または抗ＣＤ４０抗体のＣＤＲを含むヒト化抗体、および抗ヒトＣＤ４０抗体もしくはその抗原結合フラグメントを含む医薬組成物、ならびにその抗癌剤としての使用に関する。

癌は、長らく人間社会における健康上の大きな問題となっている。手術、化学療法および放射線療法といった従来の治療法は、播種性の固形腫瘍の処置においてあまり効果がない。腫瘍処置の分野において腫瘍の免疫療法が注目されており、Ｔ細胞による腫瘍免疫療法が中心的位置を占めている。腫瘍免疫療法ではキラーＴ細胞をフルに活用し、腫瘍患者においてキラーＴ細胞を腫瘍の死滅のため動員する。腫瘍免疫療法は、腫瘍処置の最も有効で最も安全な方法の１つでありうる。腫瘍免疫療法は現在、播種性の転移腫瘍を包含するいくつかの異なる種類の癌の処置のために特に有望視されている。

人体におけるＴ細胞活性化には、二重のシグナル伝達経路の系が関与する：抗原提示細胞（ＡＰＣ）を介してＴ細胞にＭＨＣ抗原ペプチドが提示されることで、第１のシグナルが供される；第２のシグナルを供するのに、一連の共刺激分子が必要で、それによってＴ細胞は正常な免疫反応をもたらす。この二重のシグナル伝達経路の系は、インビボの免疫系のバランスにおいて重要な役割を果たす。これは、自己抗原および非自己抗原に対する生体の異なる免疫反応を厳密に調節する。共刺激分子により供される第２のシグナルの不存在下において、Ｔ細胞は不応答となり得るか、または特定の免疫反応の持続をもたらし得、その結果として寛容をもたらしうる。したがって、第２のシグナル伝達経路は、生体の免疫反応の全プロセスの調節において非常に重要な役割を果たしている。

ＣＤ４０は、細胞表面に発現される糖タンパク質の１つである。これは分子量約４８ｋＤａのＩ型膜内糖タンパク質である。ＣＤ４０は腫瘍壊死因子受容体（ＴＮＦＲ）スーパーファミリーに属し、免疫系において重要な役割を果たす。ＣＤ４０は、Ｂ細胞、樹状細胞、単球およびマクロファージといった、さまざまな免疫細胞において発現される。ＣＤ４０を介するシグナル伝達が起こると、特定の抗原提示細胞が活性化される。ＣＤ４０の天然のリガンドはＣＤ１５４またはＣＤ４０Ｌと称され、主に成熟Ｔリンパ球において発現されることが知られている。ＣＤ４０Ｌ仲介シグナル伝達は、免疫細胞の活性化、増殖、ならびにサイトカインおよびケモカインの産生を包含する、いくつかの細胞生物学的イベントを引き起こす。ＣＤ４０シグナル伝達は、Ｔ細胞依存性免疫反応のために、特に腫瘍環境に関して、非常に重要である。ＣＤ４０刺激された樹状細胞は、腫瘍細胞を死滅させる可能性を有する腫瘍特異的エフェクターＴ細胞を活性化することができる。

ＣＤ４０発現は、Ｂリンパ球を包含する多くの正常細胞および腫瘍細胞において見られる。例えば、メラノーマはＣＤ４０を発現する腫瘍であり、固形腫瘍の３０％～７０％も、ＣＤ４０発現を示す。ＣＤ４０の活性化は、腫瘍特異的Ｔ細胞反応の免疫活性化、ＣＤ４０陽性腫瘍のアポトーシスに対する直接作用、および刺激により仲介されるＡＤＣＣ液性反応を包含する抗腫瘍反応を効果的に引き起こしうることが現在わかっている（Tong et al., Cancer Gene Therapy, 2003, 10: 1-13）。腫瘍の死滅が腫瘍特異的細胞傷害性Ｔリンパ球の存在と強く関連することが観察されている。一方で、ＣＤ４０抗体の全身的投与は、ショック症候群およびサイトカイン放出症候群といった副作用を伴うことに注意すべきである（van Mierlo et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 2002, 99: 5561-5566）。

腫瘍細胞を死滅させるという目的を達成できるよう、腫瘍に応答する患者自身の免疫系を高めるために免疫活性化を特異的に刺激する、前記のようなＣＤ４０に対するモノクローナル抗体を、多くの国際的製薬会社が現在開発中である。関連する特許には例えば、PCT/CN2018/089252、CN1198647、CN1369015、CN1582165、CN100430419、CN101014386、CN101237882、CN101289510、CN101490086、CN103842382、CN104918957、WO2002028904、WO2011123489、WO2012149356、WO2013034904、WO201509853、WO2016196314、WO2017040932、WO2017004006等がある。これまでに、Pfizer（関連生成物がRocheにライセンスされている）、Alligatorおよび他のいくつかの会社の抗ＣＤ４０抗体が、前臨床動物モデルにおいて優れた腫瘍死滅効果を示すことが観察されており、第Ｉ相臨床試験に付されている。

抗体定常領域の変異については、WO2006019447、WO2014145806、US8734791、US9657106、US8084582、WO2008150494、WO2004099249が、抗体重鎖のＳ２６７Ｅ、Ｌ３２８ＦおよびＮ３２５Ｓ変異を開示している。該変異は、抗体のＦｃγＲＩＩＩへの結合能を欠失させるが、ＦｃγＲＩＩＢへの結合能は向上させる。したがって、抗体依存性細胞傷害性（ＡＤＣＣ）が欠失される一方、ＦｃγＲＩＩＢ仲介架橋が向上され、それにより、ＣＤ４０活性化が向上され、樹状細胞による抗原提示が向上される。

本開示の課題は、抗体依存性細胞傷害性（ＡＤＣＣ）を欠くがＦｃγＲＩＩＢ仲介架橋を向上し、それによりインビボ腫瘍増殖を抑制することのできる、高親和性、高選択性および高生物学的活性の抗ＣＤ４０抗体を提供することである。本開示の抗体は、ＣＤ４０により仲介される、およびＣＤ４０経路により仲介される癌の処置のために、医薬として使用する、または組成物中に使用することができる。

本開示は、
配列番号６、配列番号７、配列番号８、配列番号１４、配列番号１５、配列番号１６、配列番号４２、配列番号４３、配列番号４４、配列番号５０、配列番号５１、配列番号５２、配列番号５８、配列番号５９および配列番号６０からなる群から選択される配列として示される少なくとも１つのＬＣＤＲを含む抗体軽鎖可変領域；および／または
配列番号３、配列番号４、配列番号５、配列番号１１、配列番号１２、配列番号１３、配列番号３９、配列番号４０、配列番号４１、配列番号４７、配列番号４８、配列番号４９、配列番号５５、配列番号５６および配列番号５７からなる群から選択される配列として示される少なくとも１つのＨＣＤＲを含む抗体重鎖可変領域；
を含む、ＣＤ４０抗体またはその抗原結合フラグメントを提供する。

いくつかの態様において、前記抗ＣＤ４０抗体またはその抗原結合フラグメントは、配列番号６、配列番号１４、配列番号４２、配列番号５０または配列番号５８に示されるＬＣＤＲ１を含む軽鎖可変領域を含む。

いくつかの態様において、前記抗ＣＤ４０抗体またはその抗原結合フラグメントは、配列番号７、配列番号１５、配列番号４３、配列番号５１または配列番号５９に示されるＬＣＤＲ２を含む抗体軽鎖可変領域を含む。

いくつかの態様において、前記抗ＣＤ４０抗体またはその抗原結合フラグメントは、配列番号８、配列番号１６、配列番号４４、配列番号５２または配列番号６０に示されるＬＣＤＲ３を含む抗体軽鎖可変領域を含む。

いくつかの態様において、前記抗ＣＤ４０抗体またはその抗原結合フラグメントは、配列番号３、配列番号１１、配列番号３９、配列番号４７または配列番号５５に示されるＨＣＤＲ１を含む抗体重鎖可変領域を含む。

いくつかの態様において、前記抗ＣＤ４０抗体またはその抗原結合フラグメントは、配列番号４、配列番号１２、配列番号４０、配列番号４８または配列番号５６に示されるＨＣＤＲ２を含む抗体重鎖可変領域を含む。

いくつかの態様において、前記抗ＣＤ４０抗体またはその抗原結合フラグメントは、配列番号５、配列番号１３、配列番号４１、配列番号４９または配列番号５７に示されるＨＣＤＲ３を含む抗体重鎖可変領域を含む。

いくつかの態様において、前記抗ＣＤ４０抗体またはその抗原結合フラグメントは、配列番号６、配列番号７および配列番号８にそれぞれ示されるＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２およびＬＣＤＲ３を含む抗体軽鎖可変領域を含む。

いくつかの態様において、前記抗ＣＤ４０抗体またはその抗原結合フラグメントは、配列番号１４、配列番号１５および配列番号１６にそれぞれ示されるＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２およびＬＣＤＲ３を含む抗体軽鎖可変領域を含む。

いくつかの態様において、前記抗ＣＤ４０抗体またはその抗原結合フラグメントは、配列番号４２、配列番号４３および配列番号４４にそれぞれ示されるＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２およびＬＣＤＲ３を含む抗体軽鎖可変領域を含む。

いくつかの態様において、前記抗ＣＤ４０抗体またはその抗原結合フラグメントは、配列番号５０、配列番号５１および配列番号５２にそれぞれ示されるＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２およびＬＣＤＲ３を含む抗体軽鎖可変領域を含む。

いくつかの態様において、前記抗ＣＤ４０抗体またはその抗原結合フラグメントは、配列番号５８、配列番号５９および配列番号６０にそれぞれ示されるＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２およびＬＣＤＲ３を含む抗体軽鎖可変領域を含む。

いくつかの態様において、前記抗ＣＤ４０抗体またはその抗原結合フラグメントは、配列番号３、配列番号４および配列番号５にそれぞれ示されるＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２およびＨＣＤＲ３を含む抗体重鎖可変領域を含む。

いくつかの態様において、前記抗ＣＤ４０抗体またはその抗原結合フラグメントは、配列番号１１、配列番号１２および配列番号１３にそれぞれ示されるＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２およびＨＣＤＲ３を含む抗体重鎖可変領域を含む。

いくつかの態様において、前記抗ＣＤ４０抗体またはその抗原結合フラグメントは、配列番号３９、配列番号４０および配列番号４１にそれぞれ示されるＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２およびＨＣＤＲ３を含む抗体重鎖可変領域を含む。

いくつかの態様において、前記抗ＣＤ４０抗体またはその抗原結合フラグメントは、配列番号４７、配列番号４８および配列番号４９にそれぞれ示されるＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２およびＨＣＤＲ３を含む抗体重鎖可変領域を含む。

いくつかの態様において、前記抗ＣＤ４０抗体またはその抗原結合フラグメントは、配列番号５５、配列番号５６および配列番号５７にそれぞれ示されるＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２およびＨＣＤＲ３を含む抗体重鎖可変領域を含む。

いくつかの態様において、抗ＣＤ４０抗体またはその抗原結合フラグメントは、
配列番号６、配列番号７および配列番号８にそれぞれ示されるＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２およびＬＣＤＲ３；または
配列番号１４、配列番号１５および配列番号１６にそれぞれ示されるＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２およびＬＣＤＲ３；または
配列番号４２、配列番号４３および配列番号４４にそれぞれ示されるＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２およびＬＣＤＲ３；または
配列番号５０、配列番号５１および配列番号５２にそれぞれ示されるＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２およびＬＣＤＲ３；または
配列番号５８、配列番号５９および配列番号６０にそれぞれ示されるＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２およびＬＣＤＲ３
を含む抗体軽鎖可変領域；および
配列番号３、配列番号４および配列番号５にそれぞれ示されるＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２およびＨＣＤＲ３；または
配列番号１１、配列番号１２および配列番号１３にそれぞれ示されるＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２およびＨＣＤＲ３；または
配列番号３９、配列番号４０および配列番号４１にそれぞれ示されるＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２およびＨＣＤＲ３；または
配列番号４７、配列番号４８および配列番号４９にそれぞれ示されるＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２およびＨＣＤＲ３；または
配列番号５５、配列番号５６および配列番号５７にそれぞれ示されるＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２およびＨＣＤＲ３
を含む抗体重鎖可変領域を含む。

いくつかの特定の態様において、抗ＣＤ４０抗体またはその抗原結合フラグメントは、以下のものから選択される任意の１つでありうる：
（１）抗体軽鎖可変領域が、配列番号６、配列番号７および配列番号８にそれぞれ示されるＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２およびＬＣＤＲ３を含み；抗体重鎖可変領域が、配列番号３、配列番号４および配列番号５にそれぞれ示されるＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２およびＨＣＤＲ３を含むもの；
（２）抗体軽鎖可変領域が、配列番号１４、配列番号１５および配列番号１６にそれぞれ示されるＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２およびＬＣＤＲ３を含み；抗体重鎖可変領域が、配列番号１１、配列番号１２および配列番号１３にそれぞれ示されるＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２およびＨＣＤＲ３を含むもの；
（３）抗体軽鎖可変領域が、配列番号４２、配列番号４３および配列番号４４にそれぞれ示されるＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２およびＬＣＤＲ３を含み；抗体重鎖可変領域が、配列番号３９、配列番号４０および配列番号４１にそれぞれ示されるＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２およびＨＣＤＲ３を含むもの；
（４）抗体軽鎖可変領域が、配列番号５０、配列番号５１および配列番号５２にそれぞれ示されるＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２およびＬＣＤＲ３を含み；抗体重鎖可変領域が、配列番号４７、配列番号４８および配列番号４９にそれぞれ示されるＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２およびＨＣＤＲ３を含むもの；および
（５）抗体軽鎖可変領域が、配列番号５８、配列番号５９および配列番号６０にそれぞれ示されるＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２およびＬＣＤＲ３を含み；抗体重鎖可変領域が、配列番号５５、配列番号５６および配列番号５７にそれぞれ示されるＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２およびＨＣＤＲ３を含むもの。

いくつかの特定の態様において、抗体の軽鎖可変領域の配列は配列番号２または配列番号１０からなる群から選択され、重鎖可変領域の配列は配列番号１または配列番号９から選択される。

前記の抗ＣＤ４０抗体またはその抗原結合フラグメントは、マウス抗体またはキメラ抗体でありうる。

いくつかの特定の態様において、マウス抗体またはキメラ抗体の重鎖可変領域のアミノ酸配列は配列番号１に示され、軽鎖可変領域のアミノ酸配列は配列番号２に示される。

いくつかの特定の態様において、マウス抗体またはキメラ抗体の重鎖可変領域のアミノ酸配列は配列番号９に示され、軽鎖可変領域のアミノ酸配列は配列番号１０に示される。

他のいくつかの特定の態様において、抗体または抗原フラグメントの軽鎖可変領域ＬＣＶＲは配列番号３８に示されるとおりであり、重鎖可変領域ＨＣＶＲは配列番号３７に示されるとおりである。

他のいくつかの特定の態様において、抗体または抗原フラグメントの軽鎖可変領域ＬＣＶＲは配列番号４６に示されるとおりであり、重鎖可変領域ＨＣＶＲは配列番号４５に示されるとおりである。

他のいくつかの特定の態様において、抗体または抗原フラグメントの軽鎖可変領域ＬＣＶＲは配列番号５４に示されるとおりであり、重鎖可変領域ＨＣＶＲは配列番号５３に示されるとおりである。

いくつかの特定の態様において、抗ＣＤ４０抗体またはその抗原結合フラグメントは、マウス抗体、キメラ抗体、ヒト化抗体、ヒト抗体、またはそのフラグメントである。

いくつかの特定の態様において、抗ＣＤ４０抗体またはその抗原結合フラグメントがマウス抗体またはそのフラグメントである場合、抗体軽鎖可変領域は、マウスκ、λ鎖の軽鎖ＦＲ領域もしくは軽鎖定常領域またはそのバリアントをさらに含み；および／または抗体重鎖可変領域はマウスＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、ＩｇＧ４の重鎖ＦＲ領域もしくは重鎖定常領域またはそのバリアントをさらに含む。

いくつかの特定の態様において、抗ＣＤ４０抗体またはその抗原結合フラグメントがキメラ抗体またはそのフラグメントである場合、ヒトκ、λ鎖の軽鎖定常領域またはそのバリアントを含み、および／またはヒトＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３もしくはＩｇＧ４の重鎖定常領域またはそのバリアントを含む。いくつかの特定の態様において、軽鎖可変領域配列は配列番号２または配列番号１０に示されるとおりであり、および／または重鎖可変領域配列は配列番号１または配列番号９に示されるとおりである。

いくつかの特定の態様において、抗ＣＤ４０抗体またはその抗原結合フラグメントがヒト化抗体またはそのフラグメントである場合、抗体軽鎖配列は配列番号１８もしくは配列番号２０のものまたはそのバリアントであり；特に、バリアントは軽鎖において０～１０個のアミノ酸変異を含み、とりわけ２および３位にアミノ酸変異を含む。２および３位の変異後のアミノ酸はそれぞれ独立にＩ、ＶまたはＬから選択される。抗体重鎖配列は配列番号１７もしくは配列番号１９のものまたはそのバリアントであり、バリアントは重鎖において０～１０個のアミノ酸変異を含み、とりわけ６および８位にアミノ酸変異を有する。変異後のアミノ酸はそれぞれ独立にＩ、ＡまたはＬから選択される。

前記抗ＣＤ４０ヒト化抗体またはその抗原結合フラグメントのいくつかの特定の態様において、ヒト化抗体の重鎖可変領域は、ヒトＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、ＩｇＧ４の重鎖定常領域もしくはＦＲ領域またはそのバリアントをさらに含み、とりわけヒトＩｇＧ１、ＩｇＧ２またはＩｇＧ４の重鎖定常領域またはＦＲ領域を含み、とりわけヒトＩｇＧ１またはＩｇＧ２の重鎖定常領域またはＦＲ領域を含み；および／またはヒトκ、λ鎖の軽鎖ＦＲ領域またはそのバリアントを含む。

前記抗ＣＤ４０ヒト化抗体またはその抗原結合フラグメントのいくつかの特定の態様において、ヒト化抗体の軽鎖可変領域の軽鎖ＦＲ領域配列は、例えば配列番号２２に示されるヒト生殖細胞系列軽鎖ＩＧｋＶ１－３３に由来するか、または配列番号２４に示されるヒト生殖細胞系列軽鎖ＩＧｋＶ２－２８に由来する。

前記抗ＣＤ４０ヒト化抗体またはその抗原結合フラグメントのいくつかの特定の態様において、ヒト化抗体の軽鎖可変領域バリアントは特に、軽鎖可変領域において０～１０個のアミノ酸変異を有し、とりわけ２および３位にアミノ酸変異を有し、とりわけ変異後のアミノ酸はＩ、VまたはＬである。

いくつかの特定の態様において、前記抗ＣＤ４０ヒト化抗体またはそのフラグメントは、ヒトκ、λ鎖の軽鎖定常領域またはそのバリアントをさらに含む。

前記抗ＣＤ４０ヒト化抗体またはそのフラグメントのいくつかの特定の態様において、ヒト化抗体の重鎖可変領域の重鎖ＦＲ領域配列は、例えば配列番号２１に示されるヒト生殖細胞系列重鎖ＩＧＨＶ１－６９に由来し、および／または配列番号２２に示されるヒト生殖細胞系列重鎖ＩＧｋＶ１－３３に由来し；配列番号２３に示されるヒト生殖細胞系列重鎖ＩＧＨＶ１－２に由来し、および／または配列番号２４に示されるヒト生殖細胞系列重鎖ＩＧｋＶ２－２８に由来する。

抗ＣＤ４０ヒト化抗体またはそのフラグメントのいくつかの特定の態様において、重鎖可変領域は、配列番号２５～３０のいずれかに示される配列またはそのバリアントから選択され、軽鎖可変領域は、配列番号３１～３６のいずれかに示される配列またはそのバリアントから選択される。

抗ＣＤ４０ヒト化抗体またはそのフラグメントのいくつかの特定の態様において、重鎖可変領域は、配列番号２６に示されるものまたはそのバリアントであり、軽鎖可変領域は、配列番号３３に示されるものまたはそのバリアントである。

いくつかの特定の態様において、重鎖可変領域は配列番号３０に示されるものまたはそのバリアントであり、軽鎖可変領域は配列番号３４に示されるものまたはそのバリアントである。

いくつかの特定の態様において、ヒト化抗ＣＤ４０抗体の重鎖は配列番号１７に示されるとおりであり、軽鎖は配列番号１８に示されるとおりである。

いくつかの特定の態様において、重鎖は配列番号１９に示されるとおりであり、軽鎖は配列番号２０に示されるとおりである。

抗ＣＤ４０ヒト化抗体またはそのフラグメントのいくつかの特定の態様において、ヒト化抗体重鎖配列は配列番号６１、６２、６３、６４もしくは６７に示される配列またはそのバリアントであり、および／または軽鎖可変領域は配列番号１８、２０に示される配列またはそのバリアントである。

いくつかの特定の態様において、抗ＣＤ４０ヒト化抗体またはそのフラグメントの重鎖配列は配列番号６１もしくは６２に示される配列またはそのバリアントであり、軽鎖配列は配列番号１８に示される配列またはそのバリアントであり；重鎖配列は配列番号６３、６４もしくは６７に示される配列またはそのバリアントであり、軽鎖配列は配列番号２０に示される配列またはそのバリアントである。

バリアントは、重鎖可変領域において０～１０個のアミノ酸変異を有し、とりわけ６および８位にアミノ酸変異を有し、とりわけ変異後のアミノ酸はＩ、ＡまたはＬである。

ここで、配列番号６１に示される配列は、配列番号１７に対応して２６６位においてグルタミン酸（Ｅ）に変異したアミノ酸残基（例えばＳ２６６Ｅ）を含み；
配列番号６２に示される配列は、配列番号１７に対応して２６６位においてグルタミン酸（Ｅ）に変異したアミノ酸残基（例えばＳ２６６Ｅ）、配列番号１７に対応して３２４位においてセリン（Ｓ）に変異したアミノ酸残基（例えばＮ３２４Ｓ）、配列番号１７に対応して３２７位においてフェニルアラニン（Ｆ）に変異したアミノ酸残基（例えばＬ３２７Ｆ）を含み；
配列番号６３に示される配列は、配列番号１９に対応して２６２位においてグルタミン酸（Ｅ）に変異したアミノ酸残基（例えばＳ２６２Ｅ）を含み；
配列番号６４に示される配列は、配列番号１９に対応して２６２位においてグルタミン酸（Ｅ）に変異したアミノ酸残基（例えばＳ２６２Ｅ）、配列番号１９に対応して３２３位においてフェニルアラニン（Ｆ）に変異したアミノ酸残基（例えばＬ３２３Ｆ）を含み；
配列番号６７に示される配列は、配列番号１９に対応して２６２位においてグルタミン酸（Ｅ）に変異したアミノ酸残基（例えばＳ２６２Ｅ）、配列番号１９に対応して３２０位においてセリン（Ｓ）に変異したアミノ酸残基（例えばＮ３２０Ｓ）、配列番号１９に対応して３２３位においてフェニルアラニン（Ｆ）に変異したアミノ酸残基（例えばＬ３２３Ｆ）を含む。それらのなかで、アミノ酸位置の番号付けは、天然の順序にしたがう。いくつかの態様において、前記抗ＣＤ４０抗体またはその抗原結合フラグメントの重鎖アミノ酸配列の最後の位置のアミノ酸（例えばリジン）は、アラニン（Ａ）に変異する。

いくつかの特定の態様において、配列番号６１、６２、６３、６４または６７に示される重鎖配列の最後の位置のアミノ酸は、Ａに変異する。

いくつかの特定の態様において、配列番号６９に示される重鎖、および配列番号６６に示される軽鎖を含む抗体が提供される。

いくつかの特定の態様において、配列番号６８に示される重鎖、および配列番号６６に示される軽鎖を含む抗体が提供される。

前記抗ＣＤ４０抗体またはその抗原結合フラグメントのいくつかの特定の態様において、抗原結合フラグメントはＦａｂ、Ｆｖ、ｓＦｖ、Ｆ（ａｂ’）_２、リニア（linear）抗体、一本鎖抗体、ナノボディ、ドメイン抗体または多重特異性抗体である。

本開示はさらに、前記抗ＣＤ４０抗体またはその抗原結合フラグメントの重鎖可変領域および軽鎖可変領域を含む一本鎖抗体を提供する。

本開示はさらに、前記抗ＣＤ４０抗体またはその抗原結合フラグメントの重鎖可変領域および軽鎖可変領域を含む多重特異性抗体を提供する。

本開示はさらに、前記抗ＣＤ４０抗体もしくはその抗原結合フラグメント、多重特異性抗体または一本鎖抗体をコードする核酸分子（ＤＮＡまたはＲＮＡ）を提供する。

本開示はさらに、前記核酸分子を含む発現ベクターを提供する。

本開示はさらに、前記発現ベクターを含む、またはそれが導入された宿主細胞を提供する。いくつかの特定の態様において、宿主細胞は細菌、酵母または哺乳動物細胞、とりわけ大腸菌、ピキア・パストリス（Pichia pastoris）、チャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞、またはヒト胎児腎（ＨＥＫ）２９３細胞である。

本開示はさらに、前記の抗ＣＤ４０抗体軽鎖可変領域および／または重鎖可変領域を含む、抗体－薬物コンジュゲートを提供する。抗体－薬物コンジュゲートは当分野においてよく知られており、抗体、リンカーおよび薬物を連結することによって形成される。知られているリンカーには、切断可能なリンカーおよび非切断可能なリンカーがある。例えば、リンカーにはＳＭＣＣ、ＳＰＤＰ等があるが、それに限定されない。薬物も当分野においてよく知られており、その例には、ＤＭ１、ＤＭ４、ＭＭＡＥ、ＭＭＡＦ等がある。

本願はさらに、抗ＣＤ４０抗体もしくはその抗原結合フラグメント、多重特異性抗体または一本鎖抗体、および薬学的に許容しうる賦形剤、希釈剤または担体を含む医薬組成物を提供する。

いくつかの態様において、医薬組成物の単位用量は、抗ＣＤ４０抗体またはその抗原結合フラグメントを０．０１％～９９％（重量）含んでよく、医薬組成物の単位用量中のＣＤ４０抗体またはその抗原結合フラグメントの量は０．１ｍｇ～２０００ｍｇであり、いくつかの態様においては１ｍｇ～１０００ｍｇである。

本開示はさらに、ＣＤ４０が仲介する、またはＣＤ４０Ｌが仲介する疾患または状態の処置用の医薬の製造における、前記の抗ＣＤ４０抗体もしくはその抗原結合フラグメント、多重特異性抗体、一本鎖抗体、またはそれを含む医薬組成物の使用を提供し、ここで、疾患は特に癌であり、癌は特にリンパ腫、乳癌、卵巣癌、前立腺癌、膵臓癌、腎臓癌、肺癌、肝臓癌、胃癌、結腸直腸癌、膀胱癌、横紋筋肉腫、食道癌、子宮頸癌、多発性骨髄腫、白血病、胆嚢癌、膠芽腫および黒色腫からなる群から選択される。

本開示はさらに、ＣＤ４０またはＣＤ４０Ｌが仲介する疾患または状態を治療または予防する方法を提供し、該方法は、前記の抗ＣＤ４０抗体もしくはその抗原結合フラグメント、多重特異性抗体、一本鎖抗体、またはそれを含む医薬組成物の予防有効量または治療有効量を対象と接触させることを含み、ここで、疾患または状態は特に癌であり、癌は特にリンパ腫、乳癌、卵巣癌、前立腺癌、膵臓癌、腎臓癌、肺癌、肝臓癌、胃癌、結腸直腸癌、膀胱癌、横紋筋肉腫、食道癌、子宮頸癌、多発性骨髄腫、白血病、胆嚢癌、膠芽腫および黒色腫からなる群から選択される。

本開示はさらに、自己免疫疾患に罹っている患者の症状を改善するための医薬の製造における、前記の抗ＣＤ４０抗体もしくはその抗原結合フラグメント、多重特異性抗体、一本鎖抗体、またはそれを含む医薬組成物の使用を提供する。

本開示はさらに、炎症性疾患に罹っている患者の症状を改善するための医薬の製造における、前記の抗ＣＤ４０抗体もしくはその抗原結合フラグメント、多重特異性抗体、一本鎖抗体、またはそれを含む医薬組成物の使用を提供する。

図１は、ＣＤ８０活性化分子に基づく、マウス抗ヒトＣＤ４０抗体のＤＣ細胞活性化効果を示す。 図２は、ＣＤ８６活性化分子に基づく、マウス抗ヒトＣＤ４０抗体のＤＣ細胞活性化効果を示す。 図３は、Ｒａｊｉ移植リンパ腫とヒトＰＢＭＣおよびＤＣ細胞の同時移植後の、Ｒａｊｉ移植リンパ腫の腫瘍増殖曲線を示す。 図４は、Ｒａｊｉ移植リンパ腫とヒトＰＢＭＣおよびＤＣ細胞の同時移植後の、ＮＯＧマウスの体重変化曲線を示す。 図５は、ＭＣ３８結腸癌のマウスモデルへの単回用量の抗ＣＤ４０抗体の腹腔内注射後の腫瘍増殖曲線を示す。 図６は、重鎖定常領域に変異を有する抗ＣＤ４０抗体のＤＣ細胞活性化効果を示す。 図７Ａおよび図７Ｂは、重鎖定常領域に変異を有する抗ＣＤ４０抗体がＤＣ細胞を活性化し、サイトカイン産生を促進することを示す。

発明の詳細な説明
１．用語
本開示のより容易な理解のために、いくつかの技術用語および科学用語を、以下、特に定義する。本書において用いられる他の技術用語および科学用語はいずれも、本書のどこかで明示されなければ、本発明が属する分野の通常の技術を有する者が通常理解する意味を有する。

本書において用いられるアミノ酸の３文字コードおよび１文字コードは、J. Biol. Chem, 243, (1968) p3558に記載されるものである。

本書において用いられる用語「抗体」は、２つの同じ重鎖および２つの同じ軽鎖の間のジスルフィド結合によって連結された４ペプチド鎖構造である免疫グロブリンをさす。異なる免疫グロブリン重鎖定常領域は異なるアミノ酸組成および配列順序を示し、それによって異なる種類の抗原性を示す。したがって、免疫グロブリンは５つのカテゴリー、いわゆる免疫グロブリンアイソタイプ、すなわちＩｇＭ、ＩｇＤ、ＩｇＧ、ＩｇＡおよびＩｇＥに分類することができ、それらの重鎖はそれぞれ、μ鎖、δ鎖、γ鎖、α鎖およびε鎖である。そのヒンジ領域のアミノ酸組成ならびに重鎖ジスルフィド結合の数および位置にしたがって、同じ種類のＩｇを異なるサブカテゴリーに分類することができ、例えば、ＩｇＧをＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３およびＩｇＧ４に分類することができる。軽鎖は、定常領域の違いによりκまたはλ鎖に分類することができる。５種のなかの各Ｉｇがκまたはλ鎖を有する。

本開示において、本書に記載される抗体軽鎖は、軽鎖定常領域をさらに含み、これは、ヒトまたはマウスのκ、λ鎖またはそのバリアントを含む。

本開示において、本書に記載される抗体重鎖は、重鎖定常領域をさらに含み、これは、ヒトまたはマウスのＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、ＩｇＧ４またはそのバリアントを含む。

抗体重鎖および軽鎖のＮ末端側において、約１１０アミノ酸の配列が非常に多様であり、可変領域（Ｖ領域）と称される。残りのＣ末端側のアミノ酸配列は比較的一定で、定常領域（Ｃ領域）と称される。可変領域は、３つの超可変領域（ＨＶＲ）、および比較的保存された４つのフレームワーク領域（ＦＲ）を含む。３つの超可変領域は、抗体の特異性を決定し、相補性決定領域（ＣＤＲ）とも称される。それぞれの軽鎖可変領域（ＶＬ）およびそれぞれの重鎖可変領域（ＶＨ）が、３つのＣＤＲおよび４つのＦＲからなり、その並びは、アミノ末端からカルボキシル末端に向かって、ＦＲ１、ＣＤＲ１、ＦＲ２、ＣＤＲ２、ＦＲ３、ＣＤＲ３およびＦＲ４である。３つの軽鎖ＣＤＲはＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２およびＬＣＤＲ３をいい、３つの重鎖ＣＤＲはＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２およびＨＣＤＲ３をいう。

用語「抗原提示細胞」または「ＡＰＣ」は、その表面上にＭＨＣとの複合体を形成するように異種抗原を提示する細胞である。Ｔ細胞はその複合体を、Ｔ細胞受容体（ＴＣＲ）を介して認識する。ＡＰＣの例は、樹状細胞（ＤＣ）、末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）、単球、Ｂリンパ芽球および単球由来樹状細胞（ＤＣ）を包含するが、それに限定されない。用語「抗原提示」とは、ＡＰＣが抗原を捕捉し、それをＴ細胞に、例えばＭＨＣ－Ｉ／ＭＨＣ－ＩＩコンジュゲートの成分として認識させるプロセスをいう。

用語「ＣＤ４０」は、細胞によって天然に発現されるＣＤ４０の任意のバリアントまたはアイソフォームを包含する。本開示の抗体は、非ヒト種由来のＣＤ４０と交差反応性でありうる。あるいは、本開示の抗体は、ヒトＣＤ４０に特異的で、他の種との交差反応性を示さないものであってもよい。ＣＤ４０またはそのバリアントもしくはアイソフォームは、それが天然に発現される細胞または組織から単離されうるか、または当分野における通常の技術および本書に記載される技術を用いる組換え法によって生産されうる。好ましくは、抗ＣＤ４０抗体は、通常のグリコシル化パターンを有するヒトＣＤ４０を標的とする。

本開示において用語「マウス抗体」とは、当分野における知識および技術にしたがって製造される、ヒトＣＤ４０に対するモノクローナル抗体をさす。製造に際し、試験対象にＣＤ４０抗原を注射し、次いで、所望の配列または機能的特徴を示す抗体を発現するハイブリドーマを単離する。本開示の好ましい一態様において、マウスＣＤ４０抗体またはその抗原結合フラグメントは、マウスκ、λ鎖の軽鎖定常領域またはそのバリアントをさらに含むか、またはマウスＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３もしくはＩｇＧ４の重鎖定常領域またはそのバリアントをさらに含む。

用語「ヒト抗体」は、ヒト生殖細胞系列免疫グロブリン配列の可変および定常領域を有する抗体を包含する。本開示のヒト抗体は、ヒト生殖細胞系列免疫グロブリン配列によってコードされないアミノ酸残基を含みうる（例えば、インビトロでランダムもしくは部位特異的変異導入によって、またはインビボで体細胞突然変異によって導入される変異）。しかしながら、用語「ヒト抗体」は、他の哺乳動物種の生殖細胞系列（例えばマウス）に由来するＣＤＲ配列がヒトフレームワーク配列にグラフトされた抗体（すなわち、「ヒト化抗体」）を包含しない。

用語「ヒト化抗体」は、ＣＤＲグラフト抗体とも称されるが、ヒト抗体の可変領域フレームワークに非ヒトＣＤＲ配列をグラフトすることによって作製される抗体をさす。ヒト化抗体は、多量の異種タンパク質成分を含むキメラ抗体によって誘導される強い免疫反応を克服する。免疫原性低下による活性低下を回避するために、抗体の可変領域は活性を維持するための最小限の復帰変異に付される。

用語「キメラ抗体」とは、異種抗体により誘導される免疫反応を低減するために、第１の種（例えばマウス）の抗体の可変領域と第２の種（例えばヒト）の抗体の定常領域を融合することによって形成される抗体をさす。マウス－ヒトキメラ抗体を確立するために、特定のマウスモノクローナル抗体を分泌するハイブリドーマを最初に確立し、次いでマウスハイブリドーマ細胞から可変領域遺伝子をクローン化し、その後、ヒト抗体の定常領域遺伝子をクローン化し、マウス可変領域遺伝子をヒト定常領域遺伝子と連結してキメラ遺伝子を形成し、これをヒトベクターに挿入することができ、最後に、真核生物または原核生物の生産系においてキメラ抗体分子を発現させる。ヒト抗体の定常領域は、ヒトＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３もしくはＩｇＧ４に由来する重鎖定常領域またはそのバリアントから選択され、好ましくはヒトＩｇＧ１またはＩｇＧ２の重鎖定常領域を含む。

用語「抗原結合フラグメント」とは、抗体または抗体アナログの抗原結合フラグメントと称され、通常、親抗体の抗原結合領域または可変領域の少なくとも一部（例えば１つ以上のＣＤＲ）を含む。抗体フラグメントは、親抗体の少なくとも部分的な結合特異性を維持する。一般に、活性がモルで表されるとき、抗体フラグメントは親の結合活性の少なくとも１０％を維持する。好ましくは、抗体フラグメントは、標的に対する親抗体の結合親和性の少なくとも２０％、５０％、７０％、８０％、９０％、９５％またはそれ以上を維持する。抗原結合フラグメントの例は、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆ（ａｂ’）_２、Ｆｖフラグメント、リニア抗体、一本鎖抗体、ナノボディ、ドメイン抗体および多重特異性抗体を包含するが、それに限定されない。抗体の改変されたバリアントについては、Holliger and Hudson (2005) Nat. Biotechnol. 23: 1126-1136に述べられている。

「Ｆａｂフラグメント」は、１つの軽鎖と、重鎖の１つのＣＨ１および可変領域からなる。Ｆａｂ分子の重鎖は、他の重鎖分子とジスルフィド結合を形成することができない。

「Ｆｃ」領域は、抗体のＣＨ２およびＣＨ３ドメインを有する重鎖フラグメントを２つ含む。２つの重鎖フラグメントは、２つ以上のジスルフィド結合によって、また、ＣＨ３ドメインの疎水性相互作用によって、結合されている。

「Ｆ（ａｂ’）_２フラグメント」は、２つの軽鎖と、ＣＨ１とＣＨ２のドメイン間の定常領域の部分を含む２つの重鎖を含み、それにより、２つの重鎖巻に鎖間ジスルフィド結合を形成する。したがって、Ｆ（ａｂ’）_２フラグメントは、２つのＦａｂ’フラグメントが２つの重鎖間のジスルフィド結合で結合したものからなる。

「Ｆｖ領域」は、重鎖および軽鎖の両方に由来する可変領域を含むが、定常領域を欠く

用語「多重特異性抗体」は、多重エピトープ特異性を有する抗体を包含するように、最も広い意味で用いられる。多重特異性抗体は、以下のものを包含するが、それに限定されない：重鎖可変領域（ＶＨ）および軽鎖可変領域（ＶＬ）を含み、ＶＨ－ＶＬ単位が多重エピトープ特異性を有する抗体；２つ以上のＶＬおよびＶＨ領域を有し、各ＶＨ－ＶＬ単位が異なる標的または同じ標的の異なるエピトープに結合する抗体；単一の可変領域を２つ以上有し、単一の可変領域のそれぞれが異なる標的または同じ標的の異なるエピトープに結合する抗体；完全長抗体、抗体フラグメント、ディアボディ、二重特異性ディアボディおよびトリアボディ、共有結合によるかまたは共有結合によらず連結されている抗体フラグメント等。

本願において、重鎖定常領域の変異位置をいうとき、用語「配列番号ｍに対応する位置ｎ」または「配列番号ｍの位置ｎ」とは、異なる抗体ナンバリングシステムにおいて、変異位置が、位置に関して、配列番号ｍの位置ｎに匹敵するまたは等しいことを意味する。当業者に知られているように、現在の抗体ナンバリングシステムは、ＥＵ、Ｋａｂａｔ、Ｃｈｏｔｈｉａ、ＩＭＧＴ（Lefranc, 2003）およびＡＨｏ（Honegger and Plueckthun, 2001）等を包含するがそれに限定されない。ある位置が、１つのナンバリングシステムにしたがって位置「ｎ」と規定されるとき、それは別のナンバリングシステムにしたがって、位置ｎ’と規定されうる。当業者は、異なるナンバリングシステム（例えばＥＵナンバリング）にしたがう特定の位置の間の対応する関係を、通常の知識に基づいて容易に決定することができる。

用語「抗体－薬物コンジュゲート」（ＡＤＣ）とは、１つ以上の化学合成分子（細胞傷害性薬剤を包含するがそれに限定されない）が抗体または抗体フラグメントにコンジュゲートされたものをさす。

用語「一本鎖抗体」は、抗体の重鎖可変領域（ＶＨ）および軽鎖可変領域（ＶＬ）の間がリンカーペプチドで連結されている一本鎖組換えタンパク質である。これは、完全な抗原結合部位を有する最も小さい抗体フラグメントである。

用語「ドメイン抗体フラグメント」は、重鎖可変領域または軽鎖可変領域鎖のみを含む、免疫学的機能を有する免疫グロブリンフラグメントである。いくつかの場合、２つ以上のＶＨ領域が共有結合によりペプチドリンカーに連結されて、二価ドメイン抗体フラグメントを形成する。二価ドメイン抗体フラグメントの２つのＶＨ領域は、同じかまたは異なる抗原を標的とすることができる。

本開示において、用語「ＣＤ４０に結合する」とは、ヒトＣＤ４０と相互作用する能力をいう。本開示において、用語「抗原結合部位」とは、本開示の抗体または抗原結合フラグメントによって認識されうる、抗原上の個々の三次元の立体的部位をいう。

用語「エピトープ」とは、免疫グロブリンまたは抗体によって特異的に結合される抗原上の部位をさす。エピトープは、隣接するアミノ酸によって、または隣接しないがタンパク質の三次折り畳みによって隣り合って並べられたアミノ酸によって形成されうる。隣接アミノ酸によって形成されるエピトープは、典型的には変性溶媒への暴露後に保持されるが、三次折り畳みによって形成されるエピトープは、典型的には変性溶媒での処理後に失われる。エピトープは通常、少なくとも３～１５アミノ酸を含んで、独特の立体コンフォメーションをとる。特定の抗体によって結合されたエピトープを決定する方法は、当分野においてよく知られており、免疫ブロットおよび免疫沈降アッセイ等が含まれる。エピトープの立体コンフォメーションを決定する方法は、当分野における技術および本書に記載される技術、例えばＸ線結晶学および二次元核磁気共鳴等を包含する。

本開示において、用語「特異的に結合する」および「選択的に結合する」は、予め決定された抗原上のエピトープへの抗体の結合をいう。典型的には、ヒトＣＤ４０がアナライトとして用いられ抗体がリガンドとして用いられるとき、抗体は、表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ）技術による装置における測定で、予め決定された抗原におよそ１０^－７Ｍまたはそれ以下よりも小さい平衡解離定数（Ｋ_Ｄ）で結合し、予め決定された抗原に対する抗体の結合親和性は、予め決定された抗原または関連性の高い抗原以外の非特異的抗原（例えばＢＳＡ等）に対する結合親和性よりも少なくとも２倍高い。本書において、用語「抗原を認識する抗体」は、用語「～に特異的に結合する抗体」と互換的に使用されうる。

用語「交差反応性」とは、異なる種に由来するＣＤ４０に結合する本開示の抗体の能力をいう。例えば、ヒトＣＤ４０に結合する本開示の抗体は、他の種に由来するＣＤ４０にも結合することができる。交差反応性は、精製された抗原との特異的反応性を結合アッセイ（例えば、ＳＰＲおよびはＥＬＩＳＡ）において検出することによって、または生理学的にＣＤ４０を発現する細胞との結合もしくは機能的相互作用を検出することによって測定される。交差反応性を測定する方法は、本書に記載されるような標準的な結合アッセイ、例えば表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ）分析、またはフローサイトメトリーを包含する。

用語「阻害する」または「遮断する」は、互換的に使用され、部分的および完全な阻害／遮断の両方を包含する。リガンドの阻害／遮断は、好ましくは、阻害または遮断なくリガンドの結合が起こるときの活性の、正常なレベルを低下するまたは種類を変更することができる。阻害および遮断はまた、抗ＣＤ４０抗体と接触しない場合と比較して、抗ＣＤ４０抗体との接触する際のリガンド結合親和性の測定可能な低下を包含することが意図される。

「増殖を阻害する」（例えば細胞に関して）という表現は、細胞増殖の測定可能な低下を包含することが意図される。

「免疫反応を誘導する」および「免疫反応を高める」という表現は互換的に使用され、特定の抗原に対する免疫反応の刺激（すなわち、受動または適応）をいう。ＣＤＣまたはＡＤＣＣに関して、用語「誘導」は、特定の直接の細胞傷害メカニズムの刺激をいう。

本開示において用いられる用語「ＡＤＣＣ」、すなわち抗体依存性細胞介在性細胞傷害とは、Ｆｃ受容体を発現する細胞が、抗体で覆われた標的細胞を、抗体Ｆｃセグメントを認識することによって直接に殺すことをいう。抗体のＡＤＣＣエフェクター機能は、ＩｇＧのＦｃセグメントの改変によって低下または喪失されうる。改変とは、抗体重鎖定常領域の変異、例えばＩｇＧ１におけるＮ２９７Ａ、Ｌ２３４Ａ、Ｌ２３５Ａ；ＩｇＧ２／４キメラ；ＩｇＧ４におけるＦ２３５ＥまたはＬ２３４Ａ／Ｅ２３５Ａ変異から選択される変異をさす。

抗体および抗原結合フラグメントを生産および精製する方法は、当分野でよく知られており、例えばAntibody Experimental Technology Guide of Cold Spring Harbor, Chapters 5-8 and 15に記載されている。例えば、マウスをヒトＣＤ４０またはそのフラグメントで免疫し、生じた抗体を、当分野でよく知られる通常の方法を用いて再生（re-nature）、精製およびシーケンスすることができる。抗原結合フラグメントも、従来の方法で調製することができる。本開示の抗体または抗原結合フラグメントは、１つまたはそれ以上のヒトフレームワーク領域（ＦＲ）を非ヒト由来ＣＤＲに導入するように遺伝子操作される。ヒトＦＲ生殖細胞系列配列は、ImMunoGeneTics（IMGT）からウェブサイトhttp://imgt.cines.frを通じて、またはThe Immunoglobulin FactsBook, 2001ISBN012441351から得ることができる。

本開示の組換え抗体または抗原結合フラグメントは、従来の方法で調製および精製しうる。例えば、対応する抗体をコードするｃＤＮＡ配列をクローン化し、ＧＳ発現ベクター中に組換えうる。次いで、組換え免疫グロブリン発現ベクターで、ＣＨＯ細胞を安定にトランスフェクトしうる。当分野でよく知られる、より推奨される方法として、哺乳動物発現系は、典型的にはＦｃ領域の高度に保存されたＮ末端において、抗体のグリコシル化をもたらしうる。ヒト抗原に特異的に結合する抗体の発現を経て、安定なクローンが得られうる。陽性のクローンを、バイオリアクター中で抗体生産のために無血清培養培地において増殖しうる。抗体が分泌されている培養培地を、従来の方法で精製および収集しうる。抗体を、一般的な技術を用いて濾過および濃縮しうる。サイズ排除またはイオン交換を包含する一般的技術によって、可溶性混合物および凝集物を効果的に除去しうる。得られた生成物は、直ちに冷凍、例えば－７０℃に冷凍するか、または凍結乾燥しうる。

本開示の抗体とは、モノクローナル抗体をさす。本開示のモノクローナル抗体（ｍＡｂ）とは、単一のクローンの細胞株から得られる抗体をさし、該細胞株は、真核生物、原核生物またはファージクローン細胞株に限定されない。モノクローナル抗体または抗原結合フラグメントは、例えばハイブリドーマ技術、組換え技術、ファージディスプレイ技術、合成技術（例えばＣＤＲグラフト）、または当分野で知られる他の技術によって、組換えによって得られうる。

動物、ヒト、実験対象、細胞、組織、器官または生物学的流体に対する「投与」、「投与する」および「処置」とは、動物、ヒト、対象、細胞、組織、器官または生物学的流体に、外来の医薬、処置剤、診断剤または組成物を接触させることをいう。「投与」、「投与する」および「処置」は、例えば、治療、薬物動態学、診断、研究および実験の方法をさしうる。細胞の処置は、薬剤を細胞と接触させること、および薬剤を細胞と接触している流体と接触させることを包含する。「投与」、「投与する」および「処置」は、インビトロおよびエクスビボの処置、例えば細胞の、薬剤、診断剤、組成物または他の細胞によるインビトロおよびエクスビボの処置をも意味する。ヒト、動物または研究対象に対する「処置」は、治療処置、予防または抑制手段、研究および診断適用をさす。

「処置する」とは、処置剤、例えば本開示の任意の抗体またはその抗原結合フラグメントを含む組成物を、該処置剤が処置活性を示すことがわかっている１つまたはそれ以上の疾患症状を持つ対象に、内用または外用で投与することを意味する。典型的には、処置剤は、処置される対象または対象のコホートにおいて１つまたはそれ以上の疾患症状を、そのような症状の退縮を誘導することによるかまたはその進行を臨床的に測定不能な程度まで抑制することによるかに関わらず、軽減するのに有効な量で投与される。

任意の特定の疾患症状を軽減するのに有効な処置剤の量（「処置有効量」とも称する）は、対象の疾患の状態、年齢および体重、ならびに対象において所望の反応を引き起こす薬剤の能力といった因子によって異なりうる。疾患症状が軽減されたかは、該症状の重篤度または進行状態を評価するために医師または他の熟練ヘルスケア提供者により通常用いられる任意の臨床的測定によって評価することができる。本開示のある態様（例えば、ある処置方法または製造物品）が、関心の疾患症状の軽減において対象全員には有効でない場合でも、当分野で知られる任意の統計学的検定法（例えばスチューデントのｔ検定、カイ二乗検定、マン-ホイットニーのＵ検定、クラスカル-ウォリス検定（Ｈ検定）、ヨンクヒール-タプストラ検定、およびウィルコクソン検定）による決定として、関心の標的疾患症状を統計学的に有意な数の対象において軽減する。

「保存的改変」または「保存的置換または置き換え」とは、タンパク質中のアミノ酸の代わりに同様の性質（例えば電荷、側鎖の大きさ、疎水性／親水性、主鎖コンフォメーションおよび剛性等）を有するアミノ酸を使用できることを意味し、そのような置換は、タンパク質の生物学的活性を変化することなく、しばしばなされうる。当業者に知られるように、一般に、ポリペプチドの本質的でない領域における単一のアミノ酸の置換は、生物学的活性の実質的な変化をもたらさない（例えばWatson et al. (1987) Molecular Biology of the Gene, The Benjamin/Cummings Pub. Co., page 224, 4th edition参照）。さらに、同様の構造または機能を有するアミノ酸の置換は、生物学的活性に影響を及ぼさないと考えられる。一般的なアミノ酸の保存的置換を次に示す：

「有効量」とは、医学的状態の症状または徴候を改善または抑制するのに十分な量を包含する。有効量は、診断を可能にするかまたは促進するのに十分な量をも意味する。ある特定の対象または動物対象に対する有効量は、処置される状態、対象の全身的健康状態、投与経路および投与量、ならびに副作用の強さ、といった因子によって異なりうる。有効量は、顕著な副作用または毒性作用を回避する最大の用量または投与レジメンであることができる。

「外来」とは、背景に応じて、生物、細胞または人体の外で産生される物質をさす。
「内因」とは、背景に応じて、細胞、生物または人体の内部で産生される物質をさす。

「同一性」とは、２つのポリヌクレオチド配列間または２つのポリペプチド間の配列類似性をさす。比較される２つの配列中の位置が同じ塩基またはアミノ酸残基で占められているとき（例えば、２つのＤＮＡ分子のそれぞれの位置がアデニンで占められている場合）、それら分子は該位置において相同であると見なされる。２つの配列間の同一性パーセントは、２つの配列間でマッチするまたは相同である位置の数を比較されるすべての位置の数で除して×１００％とした関数である。例えば、最適の配列アラインメントにおいて２つの配列の１０の位置のうちの６が互いにマッチするまたは相同である場合、２つの配列間の相同性は６０％であると見なされうる。通常、比較は、２つの配列が、相同性パーセンテージが最大となるようにアラインされたときに行われる。

本書において用語「細胞」、「細胞株」および「細胞培養物」は互換的に使用され、そのような名称はいずれも、その子孫を包含する。したがって、用語「形質転換された細胞」は、初代の対象細胞、および継代数を問わず、それに由来する培養物を包含する。また、意図的または非意図的な変異のため、子孫は必ずしも、ＤＮＡの成分および／または内容において正確に同一でなくてもよいと理解される。元の細胞と同じ機能または生物学的活性を有する変異体子孫も、該用語に包含される。

「場合により」とは、それに係る事象または状況が起こるかもしれないが必ずしも起こらないことを意味し、その記載は、事象または状況が起こる場合または起こらない場合を包含する。例えば、「場合により１～３の抗体重鎖可変領域を含む」とは、特定の配列の抗体重鎖可変領域が存在しうるが必ずしも存在しないことを意味する。

以下の実施例は、本発明をさらに説明するためのものであって、本発明の範囲を限定するものではない。本発明の実施例において特定の条件を記載していない実験方法は通常、Antibodies: A Laboratory Manual, Molecular Cloning Manual from Cold Spring Harborに記載されるような通常の条件にしたがって、または材料もしくは製品の製造者によって推奨される条件にしたがって行われる。入手先を特定していない試薬は、市販される通常の試薬である。

免疫抗原およびスクリーニング抗原の配列および準備
Ｈｉｓタグ付きヒトＣＤ４０（ｈ－ＣＤ４０－ｈｉｓ）組換えタンパク質、Ｆｃタグ付きヒトＣＤ４０（ｈ－ＣＤ４０－Ｆｃ）組換えタンパク質、Ｈｉｓタグ付きマウスＣＤ４０（ｍ－ＣＤ４０－ｈｉｓ）組換えタンパク質、およびＨｉｓタグ付きアカゲザルＣＤ４０（ｒｈｅｓｕｓ－ＣＤ４０－ｈｉｓ）組換えタンパク質（＃ＣＤ０－Ｃ５２Ｈ７）はいずれも、Acrobiosystemsから購入した市販の精製タンパク質試薬であった。各配列のソースを表１に示す。タンパク質試薬は、以下の実施例の各試験において使用することができる。

抗体ハイブリドーマの作製
抗ヒトＣＤ４０モノクローナル抗体を、マウスを免疫することによって作製した。実験用Ｃ５７ＢＬ／６マウス：６～８週齢の雌（JOINN Laboratories (Suzhou) New Medicament Research Center Co., Ltd., animal production license number: 201503259）。飼育環境：ＳＰＦレベル。

マウスを購入後、１２／１２時間の明暗サイクル、２０～２５℃の温度、４０～６０％の湿度に調節した実験室環境に１週間維持した。適応したマウスを、各ケージ５匹で２つのケージに分けた。

免疫抗原は、Ｆｃタグ付きの改変ヒトＣＤ４０組換えタンパク質であった（ｈ－ＣＤ４０－Ｆｃ；リン酸緩衝液中に１μｇ／μｌで調製）。フロイントアジュバント（Sigma, Lot No: F5881/F5506）で乳化した：初回の乳化には完全フロイントアジュバント（ＣＦＡ）を用い、それ以外の追加免疫には核酸アジュバント（CpG, Sangon Biotech）および注射可能アルミニウム（Imject Alum, Thermo, Lot No.: PH203866）を用いた。免疫日は、０、１４、２８、４２、５６および７０日目であった。２１、３５、４９、６３および７７日目に、血液検査のために採血した。マウス血清中の抗体力価を決定するために、マウス血清の検出をＥＬＩＳＡ法により行った。

４回目の免疫の後、抗体力価が高く安定であるマウスを、脾細胞融合のために選択した。融合の３日前に、リン酸緩衝液中に調製した１０μｇ／マウスの抗原の腹腔内（ＩＰ）注射により追加免疫を行った。脾臓リンパ球とミエローマ細胞Ｓｐ２／０細胞（ATCC（登録商標）CRL-8287（商標））を、最適化したＰＥＧ仲介融合ステップを用いて融合してハイブリドーマ細胞を得、好ましいインビトロ活性を示す５つのモノクローナルハイブリドーマ細胞株を選択した。

ＥＬＩＳＡ結合アッセイ
抗ＣＤ４０抗体の結合性を検出するために、ＥＬＩＳＡアッセイを用いた。ｈｉｓタグ付きのＣＤ４０組換えタンパク質で直接のコーティングを行った。抗体を加えた後、二次抗体（ＨＲＰ結合抗Ｆｃ抗体）およびＨＲＰ基質ＴＭＢを加えて、抗原に対する抗体の結合活性を検出した。

９６ウェルマイクロタイタープレートを、０．５μｇ／ｍｌの濃度でウェルにつき１００μｌのヒトまたはアカゲザルＣＤ４０－ｈｉｓタンパク質でコーティングし、４℃で一晩インキュベートした。プレートを、ウェルにつき２５０μｌの洗浄バッファーで３回洗った。確実に十分な洗浄を行うために、洗浄の度にプレートを１０秒間震盪した。２００μｌ／ウェルのブロッキング溶液を加え、室温で２時間インキュベートした。プレートを、ウェルにつき２５０μｌの洗浄バッファーで３回洗った。確実に十分な洗浄を行うために、洗浄の度にプレートを１０秒間震盪した。希釈剤で希釈した、試験する抗ＣＤ４０抗体１００μｌを各ウェルに加え、室温で１時間インキュベートした。プレートを、ウェルにつき２５０μｌの洗浄バッファーで３回洗った。希釈剤で１：２００００に希釈したＨＲＰ標識ヤギ抗ヒトＩｇＧ二次抗体１００μｌを各ウェルに加え、室温で１時間インキュベートした。プレートを、ウェルにつき２５０μｌの洗浄バッファーで３回洗った。１００μｌのＴＭＢを各ウェルに加え、暗所で１５分間反応させた。５０μｌの０．１６Ｍ硫酸を各ウェルに加えた。Thermo MultiSkanFcマイクロプレートリーダーを用いて４５０ｎｍでＯＤ値を測定し、各ＣＤ４０抗体のＣＤ４０結合のＥＣ５０値を計算した。

抗ＣＤ４０抗体によるＣＤ４０とＣＤ４０Ｌとの結合阻害の試験
本試験において、スクリーニングした抗ヒトＣＤ４０抗体を、ヒトＣＤ４０とヒトＣＤ４０Ｌとの間の結合阻害について、インビトロ阻害アッセイによって試験した。

具体的な方法は次のとおりであった：９６ウェルマイクロタイタープレートをＦｃタグ付きＣＤ４０組換えタンパク質（ｈ－ＣＤ４０－Ｆｃ）でコーティングし、十分にエピトープに結合しそれを占拠するように抗ＣＤ４０抗体を加え、その後、ｈｉｓタグ付きＣＤ４０Ｌを加え、Ｈｉｓタグを検出してＣＤ４０Ｌに対するＣＤ４０の結合量を計算し、ＣＤ４０抗体のＣＤ４０活性部位阻害のＩＣ５０値を計算した。

９６ウェルマイクロタイタープレートを、１μｇ／ｍｌの濃度でウェルにつき１００μｌのヒトＣＤ４０－Ｆｃタンパク質でコーティングし、４℃で一晩インキュベートした。プレートを、ウェルにつき２５０μｌの洗浄バッファーで３回洗った。確実に十分な洗浄を行うために、洗浄の度にプレートを１０秒間震盪した。２００μｌ／ウェルのブロッキング溶液を加え、室温で２時間インキュベートした。プレートを、ウェルにつき２５０μｌの洗浄バッファーで３回洗った。確実に十分な洗浄を行うために、洗浄の度にプレートを１０秒間震盪した。希釈剤で希釈した、試験する抗ＣＤ４０抗体１００μｌを各ウェルに加え、室温で１時間インキュベートした。プレートを、ウェルにつき２５０μｌの洗浄バッファーで３回洗った。１００μｌの希釈ＣＤ４０Ｌ－ｈｉｓを各ウェルに加え、室温で１時間インキュベートした。プレートを洗浄バッファーで３回洗った。希釈剤で１：２０００に希釈したＨＲＰ標識抗ｈｉｓタグ二次抗体１００μｌを各ウェルに加え、室温で１時間インキュベートした。プレートを、ウェルにつき２５０μｌの洗浄バッファーで３回洗った。１００μｌのＴＭＢを各ウェルに加え、暗所で１５分間反応させた。５０μｌの０．１６Ｍ硫酸を各ウェルに加えた。Thermo MultiSkanFcマイクロプレートリーダーを用いて、４５０ｎｍでＯＤ値を測定し、ＣＤ４０抗体のＣＤ４０とＣＤ４０Ｌとの結合阻害のＩＣ５０値を計算した。

ＢＩＡＣＯＲＥによる親和性決定
Human Anti-capture Kit（Cat.# BR-1008-39, GE）から利用可能な指示書に記載される方法にしたがって、Biacore装置（Biacore X100, GE）のバイオセンサーチップＣＭ５に、ヒト抗捕捉抗体を共有結合により結合させ、ある量の試験するキメラまたはヒト化抗体を親和捕捉させ、その後、チップ表面に一連の濃度勾配のＣＤ４０抗原（Acrobiosystemsから購入したＣＤ４０抗原）を流した。Biacore装置（Biacore X100, GE）を用いて反応シグナルをリアルタイムで検出し、それによって結合および解離曲線を得た。各解離サイクルの終了後、バイオチップをHuman Anti-capture Kitにより提供される再生溶液で洗って再生した。本試験に使用したアミノカップリングキットは、GEから購入し（Cat. # BR-1000-50, GE）、HBS-EP＋１０×バッファー溶液（Cat. # BR-1006-69, GE）を再蒸留水で１×（ｐＨ７．４）に希釈した。

試験により得られたデータをBiacoreX100評価ソフトウェア2.0 GEを用いて（１：１）結合モデルにフィットさせ、表１０および表１１に示す親和性の値を得た。

細胞のレポーター遺伝子に対する抗ＣＤ４０抗体の活性の試験
HEK-Blue ＣＤ４０Ｌ細胞をInvivogenから購入した（Cat#hkb-cd40）。細胞は、ヒトＣＤ４０遺伝子およびＮＦ－ｋＢ仲介ＳＥＡＰゲノムで安定にトランスフェクトされている。ＣＤ４０シグナル伝達経路の活性化レベルを特徴付けるために、上清中に分泌されたＳＥＡＰをＳＥＡＰ基質のQUANTI-Blueで検出することができる。本試験において、HEK-Blue ＣＤ４０Ｌ細胞の活性化を検出し、細胞におけるＣＤ４０抗体のインビトロ活性をＥＣ５０にしたがって評価した。

HEK-Blue ＣＤ４０Ｌ細胞を、１０％ＦＢＳ、１００μｇ／ｍｌのゼオシンおよび３０μｇ／ｍｌのブラスチシジンを含むＤＭＥＭ培地中で培養し、週に２～３回、１：５または１：１０の継代比で継代培養した。継代培養中に、培地を除去し、細胞層を５ｍｌの０．２５％トリプシンで洗い、その後トリプシンを除去し、細胞をインキュベーター内で３～５分間インキュベートし、その後、新鮮な培地を加えて細胞を再懸濁した。５×１０^５細胞／ｍｌの密度で１００μｌの細胞懸濁液を９６ウェル細胞培養プレートに入れた。培地は、１０％ＦＢＳ、１００μｇ／ｍｌのブレオマイシンのゼオシンおよび３０μｇ／ｍｌのブラスチシジンを含むＤＭＥＭであり、１００μｌの無菌水をそれだけで９６ウェルプレートの縁の壁に加えた。培養プレートをインキュベーター内で２４時間インキュベートした（３７℃、５％ＣＯ_２）。細胞の接着が観察されたら、１００μｌの試験する抗体を希釈勾配にて各ウェルに加えた。培養プレートをインキュベーター内で２０～２４時間インキュベートした（３７℃、５％ＣＯ_２）。各ウェルから４０μｌの細胞上清を新たな９６ウェル平底プレートに移し、１６０μｌのQUANTI-Blue基質溶液を加え、培養プレートを暗所においてインキュベーター内で１～３時間インキュベートした。マイクロプレートリーダー（Thermo MultiSkanFc）を用いて６２０ｎｍにおける吸光度を測定し、インビトロでの細胞におけるＣＤ４０抗体の活性の評価のためにＥＣ５０値を計算した。

抗ＣＤ４０抗体のＤＣ細胞活性化の試験
健常ヒト対象の末梢血からＰＢＭＣを単離し、ＣＤ１４ ＭＡＣＳビーズを用いて単球をソートした。ＭｏＤＣ細胞（単球由来樹状細胞）を誘導するために、１０ｎｇ／ｍｌのＩＬ４および１００ｎｇ／ｍｌのＧＭ－ＣＳＦを含むＲＰＭＩ１６４０培地を培養物に６日間加えた。６日後に細胞を収集し、ＭｏＤＣが首尾よく誘導されたかをＦＡＣＳによって分析するために、１×１０^５細胞を取ってＣＤ２０９－ＰＥ、ＣＤ１ａ－ＰｅｒＣＰ／Ｃｙ５．５およびＣＤ１４－ＰＥ／Ｃｙ７で染色した（上記手順は当分野においてルーチンな手順である）。

首尾よく誘導されたＤＣを収集し、試験する各抗体および対照抗体を加え、対応する希釈勾配の濃度を設定した（抗体の濃度勾配については図１参照）。４８時間培養後、細胞を収集し、ＣＤ８０、ＣＤ８６およびＨＬＡ－ＤＲについて染色し、ＦＡＣＳによりデータを収集した。

初代ＤＣ細胞活性化の試験のデータによると、５つのマウス抗体はいずれも、用量依存的に、ＤＣ細胞表面上の分子ＣＤ８０およびＣＤ８６の活性化において明らかな活性を示した。効果は全体的に、２つの対照抗体（PfizerのCP-870,893、およびAlligator BioscienceのADC-1013）の効果に匹敵し、それと同等であり、またはそれよりも少し良好であった（図１および図２参照）。

抗ＣＤ４０抗体のクローニングおよびシーケンシング
前記スクリーニングによって特定した５つの抗体のハイブリドーマサブクローンを取り、対数増殖期にあるハイブリドーマ細胞を収集し、（キットの指示にしたがって）Trizol (Invitrogen, 15596-018)を用いてＲＮＡを抽出し、逆転写（PrimeScript（商標）逆転写酵素, Takara, cat # 2680A）を行った。逆転写によって得たｃＤＮＡを、マウスＩｇプライマーセット（Novagen, TB326 Rev.B0503）を用いるＰＣＲによって増幅し、シーケンシング会社に送った。５つのマウス抗体の配列を得た。

（１）マウスモノクローナル抗体２Ｈ６の重鎖および軽鎖可変領域の配列は以下のとおりである：

それに含まれるＣＤＲ配列を表５に示す：

（２）９Ｅ５の重鎖および軽鎖可変領域の配列は以下のとおりである：

それに含まれるＣＤＲ配列を表６に示す：

（３）１Ｄ９の重鎖および軽鎖可変領域の配列は以下のとおりである：

それに含まれるＣＤＲ配列を表７に示す：

（４）１４Ｃ１０の重鎖および軽鎖可変領域の配列は以下のとおりである：

それに含まれるＣＤＲ配列を表８に示す：

（５）３８Ｂ４の重鎖および軽鎖可変領域の配列は以下のとおりである：

それに含まれるＣＤＲ配列を表９に示す：

それらのなかで最適な２つの抗体株（２Ｈ６および９Ｅ５）をさらなる開発のために選択した。得られた可変領域配列をそれぞれヒト抗体ＩｇＧ１定常領域配列に連結して、ヒト－マウスキメラ抗体配列を得た。分子クローニング技術を用いて、キメラ抗体の配列をｐＣＰ発現ベクター（Mabspace Biosciencesから購入）に挿入し、配列をＰＣＲによって確認した。（本パートにおける分子クローニングおよび他の分子生物学的操作は、通常の操作条件にしたがって実施する。詳細は"Molecular Cloning: A Laboratory Manual"を参照されたい。）ＨＥＫ２９３細胞発現系を用いて、ヒト－マウスキメラ抗体２Ｈ６－Ｃおよび９Ｅ５－Ｃを得た。

MabSelect SuReアフィニティークロマトグラフィー（GE Lifesciences）によって精製したキメラ抗体のさまざまな活性をインビトロで試験した。データを表１０に示す。

マウス抗体のヒト化試験
マウス抗体２Ｈ６および９Ｅ５の得られた典型的ＶＨ／ＶＬＣＤＲ構造に基づいて、重鎖可変領域および軽鎖可変領域配列を、抗体生殖細胞系列データベースに対してアラインして、相同性の高いヒト生殖細胞系列テンプレートを得た。

ヒト生殖細胞系列軽鎖フレームワーク領域は、ヒトκ軽鎖遺伝子に由来する。本開示の抗体のためのヒト生殖細胞系列軽鎖テンプレートは好ましくは、Ｖｋ１－３３／ＪＫ４（２Ｈ６用）またはＶｋ２－２８／ＪＫ４（９Ｅ５用）である。

ヒト生殖細胞系列重鎖フレームワーク領域は、ヒト重鎖に由来する。本開示の抗体のためのヒト生殖細胞系列重鎖テンプレートは好ましくは、ＶＨ１－６９／ＪＨ６（２Ｈ６用）またはＶＨ１－２／ＪＨ６（９Ｅ５用）である。以下に示すとおりである：

２Ｈ６用に好ましいヒト生殖細胞系列重鎖テンプレートＩＧＨＶ１－６９

２Ｈ６用に好ましいヒト生殖細胞系列軽鎖テンプレートＩＧｋＶ１－３３

９Ｅ５用に好ましいヒト生殖細胞系列重鎖テンプレートＩＧＨＶ１－２

９Ｅ５用に好ましいヒト生殖細胞系列軽鎖テンプレートＩＧｋＶ２－２８

マウス抗体のＣＤＲ領域を、選択したヒト化テンプレートに、ヒト化可変領域を置き換えるようにグラフトし、次いで対応するヒトＩｇＧ定常領域（好ましくは、重鎖にはＩｇＧ１；および軽鎖にはκ）と改めて結合した。マウス抗体の三次元構造に基づいて、組み込んだ残基、ＣＤＲ領域と直接相互作用する残基、ならびにＶＬおよびＶＨのコンフォメーションに重要は影響を及ぼす残基において復帰変異を行い、化学的に安定でないＣＤＲ領域中のアミノ酸残基を最適化して、最終的なヒト化分子を得た。

重鎖領域の配列を配列番号２５～３０に示し、軽鎖可変領域の配列を配列番号３１～３６に示す。

上記の軽鎖および重鎖の組み合わせの発現試験によって、および異なる数の復帰変異間の比較によって、ヒト化抗体分子ｈｕ２Ｈ６（Ｈ１ｂ重鎖およびＬ１ｃ軽鎖を有する）およびｈｕ９Ｅ５（Ｈ１ｃ重鎖およびＬ１ａ軽鎖を有する）を最終的に選択した。それぞれの完全な軽鎖および重鎖の配列を配列番号１７～２０に示す。

ヒト化抗体の試験データ
本開示は、ヒト化抗体ｈｕ２Ｈ６およびｈｕ９Ｅ５の、ヒトＣＤ４０およびアカゲザルＣＤ４０に対する結合活性および阻害活性を表１１に示す。

この結果は、本開示のヒト化抗ヒトＣＤ４０抗体が、陽性抗体Pfizer／Alligatorに匹敵するＥＬＩＳＡ結合および阻害活性を有することを示している。特に、Biacoreによって測定したｈｕ９Ｅ５のヒトＣＤ４０に対する親和性は、陽性対照抗体Alligatorの１０倍以上であり、Pfizer対照の４倍以上である。

抗ＣＤ４０抗体によるマウス腫瘍増殖の抑制
健常ヒト対象から末梢血を採取し、健常ヒト対象のＰＢＭＳを密度勾配遠心分離によって分離した。ＣＤ１４＋マイクロビーズキットを用いて単球を単離し、キットによって提供される手順にしたがってＣＤ１４＋単球を単離した。すなわち、１０^７細胞につき２０μｌの抗ＣＤ１４マイクロビーズを加え、４℃で１５分間インキュベートした。次いで、細胞を磁気カラムに導入し、カラムを３回洗い、細胞、すなわちＣＤ１４＋単球を磁気カラムから回収した。ＣＤ１４＋単球に、１０ｎｇ／ｍｌのＩＬ－４および１００ｎｇ／ｍｌのＧＭ－ＣＳＦを含むＲＰＭＩ１６４０培地を加え、６日間培養した（培養方法は、当分野において通常用いられる方法である）。次いで、ＭｏＤＣ細胞を誘導および培養し、残りの細胞にＩＬ－２を含むＲＰＭＩ１６４０を加え、懸濁細胞を培養後に収集し（細胞の培養方法および収集方法は、当分野において通常用いられる方法である）、Ｔ細胞をＣＤ３＋マイクロビーズキットによってソートした。６日後、ＭｏＤＣ細胞およびＣＤ３＋Ｔ細胞を収集および分離し、Ｒａｊｉ細胞（Cell Bank of Shanghai Academy of Biological Sciences；１０％ウシ胎仔血清を含むＲＰＭＩ１６４０中で培養したもの）と１：５：２０の比で混合した。混合物を、各ＮＯＧマウス（Nanjing Galaxy Biopharma Co., Ltd,；５日間馴化飼育）の皮下接種に使用した。実験動物を、温度および湿度が一定の個別の換気ケージ内に維持した。飼育室の温度は１８．０～２６．０℃、湿度は４０～７０％、換気は１時間当たり１０～２０回であった。１日の明暗の時間は１２時間／１２時間であった。

試験において、ヒトＩｇＧ１抗体対照群、ｈｕ２Ｈ６、ｈｕ９Ｅ５および対照抗体Ｇ１２群（すなわち、Alligator BioscienceのADC-1013）を分け、用量は各群で３ｍｇ／ｋｇとした。各群５匹のマウスに、週１回、６週間にわたり３連続投与で注射した。

試験手順は次のとおりであった：
（１）腫瘍の長径および短径をノギスで週２回測定し、腫瘍体積（ｍｍ^３）を計算した。腫瘍体積（ｍｍ^３）＝０．５×（腫瘍長径×腫瘍短径^２）
（２）相対腫瘍抑制率ＴＧＩ（％）：ＴＧＩ（％）＝（１－Ｔ／Ｃ）×１００％。Ｔ／Ｃ％は、相対腫瘍増加率である（すなわち、ある時点での対照群に対する処置群の腫瘍体積または腫瘍重量のパーセンテージの値）。ＴおよびＣはそれぞれ、ある特定の時点での処置群およびＩｇＧ１対照群の腫瘍体積（ＴＶ）または腫瘍重量（ＴＷ）である。

結果は、ヒト化抗ＣＤ４０抗体ｈｕ２Ｈ６およびｈｕ９Ｅ５はＩｇＧ１対照と比較して、非常に顕著な抗腫瘍効果を有することを示している。腫瘍は投与から２１日目にほぼ完全に消失し、抗腫瘍効果は、対照抗体Ｇ１２と同等、またはそれよりも少し良好であった。図３および図４に示されるとおりである。

重鎖定常領域に変異を含む抗ＣＤ４０抗体の作製
本実施例においては、重鎖定常領域に変異を有する前記抗ＣＤ４０抗体のバリアントを作製した。
具体的には、
・配列番号１７のｈｕ２Ｈ６重鎖の２６６位アミノ酸をセリン（Ｓ）からグルタミン酸（Ｅ）に変異させて、変異体ｈｕ２Ｈ６－Ｍを得た；
・配列番号１７のｈｕ２Ｈ６重鎖の２６６位アミノ酸をセリン（Ｓ）からグルタミン酸（Ｅ）に変異させ、３２４位アミノ酸をアスパラギン（Ｎ）からセリン（Ｓ）に変異させ、３２７位アミノ酸をロイシン（Ｌ）からフェニルアラニン（Ｆ）に変異させて、変異体ｈｕ２Ｈ６－ＳＥＬＦＮＳを得た；
・配列番号１９のｈｕ９Ｅ５重鎖の２６２位アミノ酸をセリン（Ｓ）からグルタミン酸（Ｅ）に変異させて、変異体ｈｕ９Ｅ５－Ｍを得た；
・配列番号１９のｈｕ９Ｅ５重鎖の２６２位アミノ酸をセリン（Ｓ）からグルタミン酸（Ｅ）に変異させ、３２３位アミノ酸をロイシン（Ｌ）からフェニルアラニン（Ｆ）に変異させて、変異体ｈｕ９Ｅ５－ＳＥＬＦを得た；
・配列番号１９のｈｕ９Ｅ５重鎖の２６２位アミノ酸をセリン（Ｓ）からグルタミン酸（Ｅ）に変異させ、３２０位アミノ酸をアスパラギン（Ｎ）からセリン（Ｓ）に変異させ、３２３位アミノ酸をロイシン（Ｌ）からフェニルアラニン（Ｆ）に変異させて、変異体ｈｕ９Ｅ５－ＳＥＬＦＮＳを得た；

ｈｕ２Ｈ６－Ｍおよびｈｕ２Ｈ６－ＳＥＬＦＮＳの重鎖配列は配列番号６１および６２に示すとおりであり、軽鎖配列は配列番号１８に示すとおりである。

ｈｕ９Ｅ５－Ｍ、ｈｕ９Ｅ５－ＳＥＬＦおよびｈｕ９Ｅ５－ＳＥＬＦＮＳの重鎖配列は配列番号６３、６４および６７に示すとおりであり、軽鎖配列は配列番号２０に示すとおりである。

さらに、配列番号６１、６２、６３、６４および６７の最後の位置のアミノ酸ＫをＡで置換することができる。この変異は抗体の活性に影響しないが、抗体のドラッガビリティをある程度改善することができる。

さらに、別の抗ＣＤ４０抗体であるCN104918957Aに記載されるAPX005S267Eの可変領域（すなわち、１～１２０位のアミノ酸）にしたがって、抗体００５Ｍを陽性抗体として作製した。抗体００５Ｍの重鎖の１２１～４５０位のアミノ酸配列は、抗体ｈｕ９Ｅ５－Ｍの重鎖の１１３～４４２位のアミノ酸配列と同じである。００５Ｍの具体的な配列は次のとおりである：

配列番号６５の００５Ｍ重鎖の３３１位アミノ酸をロイシン（Ｌ）からフェニルアラニン（Ｆ）に変異させて、変異体ＡＰＸ００５－ＳＥＬＦを得た。配列番号６５の００５Ｍ重鎖の３２８位アミノ酸をアスパラギン（Ｎ）からセリン（Ｓ）に変異させ、３３１位アミノ酸をロイシン（Ｌ）からフェニルアラニン（Ｆ）に変異させて、変異体ＡＰＸ００５－ＳＥＬＦＮＳを得た。

抗体ｈｕ２Ｈ６－Ｍ、ｈｕ２Ｈ６－ＳＥＬＦＮＳ、ｈｕ９Ｅ５－Ｍ、ｈｕ９Ｅ５－ＳＥＬＦ、ｈｕ９Ｅ５－ＳＥＬＦＮＳ、ならびに００５Ｍ、ＡＰＸ００５－ＳＥＬＦおよびＡＰＸ００５－ＳＥＬＦＮＳを作製し、シーケンシングにより確認した。

重鎖定常領域に変異を含む抗ＣＤ４０抗体のＤＣ細胞活性化の試験
健常ヒト対象の末梢血からＰＢＭＣを単離し、ＣＤ１４ ＭＡＣＳビーズを用いて単球をソートした。ＭｏＤＣ細胞（単球由来樹状細胞）を誘導するために、２５ｎｇ／ｍｌのＩＬ４および５０ｎｇ／ｍｌのＧＭ－ＣＳＦを含むＲＰＭＩ１６４０培地を培養物に６日間加えた。

６日後に細胞を収集し、ＭｏＤＣが首尾よく誘導されたかをＦＡＣＳによって分析するために、１×１０^５細胞を取ってＣＤ２０９－ＰＥ、ＣＤ１ａ－ＰｅｒＣＰ／Ｃｙ５．５およびＣＤ１４－ＰＥ／Ｃｙ７で染色した（上記手順は当分野においてルーチンな手順である）。首尾よく誘導されたＤＣを収集し、試験する各抗体および対照抗体を加え、抗体の勾配：０．０１ｎＭ、０．１６ｎＭ、０．８ｎＭ、４ｎＭ、２０ｎＭ、１００ｎＭを得るように、対応する希釈勾配の濃度を設定した。４８時間培養後、細胞を収集し、ＣＤ８６およびＨＬＡ－ＤＲ染色を用いて染色し、ＦＡＣＳによりデータを収集した。ＡＰＸ００５－ＳＥＬＦＮＳおよび２Ｈ６－ＳＥＬＦＮＳの両方が、Alligator対照抗体Ｇ１２よりも高いアゴニスト活性を示し、ＤＣ細胞表面上の活性化分子ＣＤ８６を用量依存的に活性化した（図６参照）。

重鎖定常領域に変異を含む抗ＣＤ４０抗体のＤＣ細胞サイトカイン産生活性化の試験
健常ヒト対象の末梢血からＰＢＭＣを単離し、ＣＤ１４ ＭＡＣＳビーズを用いて単球をソートした。ＭｏＤＣ細胞（単球由来樹状細胞）を誘導するために、２５ｎｇ／ｍｌのＩＬ４および５０ｎｇ／ｍｌのＧＭ－ＣＳＦを含むＲＰＭＩ１６４０培地を培養物に６日間加えた。６日後に細胞を収集し、ＭｏＤＣが首尾よく誘導されたかをＦＡＣＳによって分析するために、１×１０^５細胞を取ってＣＤ２０９－ＰＥ、ＣＤ１ａ－ＰｅｒＣＰ／Ｃｙ５．５およびＣＤ１４－ＰＥ／Ｃｙ７で染色した（上記手順は当分野においてルーチンな手順である）。首尾よく誘導されたＤＣを収集し、試験する各抗体および対照抗体を加え、抗体の勾配：０．０１ｎＭ、０．１６ｎＭ、０．８ｎＭ、４ｎＭ、２０ｎＭ、１００ｎＭを得るように、対応する濃度希釈勾配を設定した。４８時間培養後、上清を収集し、ＩＬ－１２ ｐ４０の含有量をＥＬＩＳＡによって検出した。

ＡＰＸ００５－ＳＥＬＦＮＳ、ＡＰＸ００５－ＳＥＬＦ、２Ｈ６－ＳＥＬＦＮおよび９Ｅ５－ＳＥＬＦＮＳはいずれも、Alligator対照抗体Ｇ１２よりも高いアゴニスト活性を示し、ＤＣ細胞からのサイトカインＩＬ－１２ ｐ４０の分泌を用量依存的に促進した。結果を図７Ａ、図７Ｂ、および表１２、表１３に示す。

重鎖定常領域に変異を含む抗ＣＤ４０抗体によるマウス腫瘍増殖抑制
本実施例においては、ＣＤ４０抗体投与の抗腫瘍効果および安全性を、ヒト化ｈＦｃγＲ／ｈＣＤ４０ Ｃ５７ＢＬ／６マウスのＭＣ３８腫瘍モデルにおいて腫瘍サイズおよびマウス体重により評価した。

ＭＣ３８細胞の培養および調製方法：ＭＣ３８マウス結腸癌細胞株を、ＤＭＥＭ（１０％ＦＢＳ、１％ペニシリン－ストレプトマイシン、１ｍＭピルビン酸ナトリウム、および１０ｍＭ ＨＥＰＥＳを含む）中で培養し、培養プレートにおいて８０％～９０％の密度に達するまで細胞を増殖させた。消化のためにトリプシン－ＥＤＴＡ（０．２５％）を加え、３７℃で３～５分間インキュベートし、１０％ＦＢＳを含む培地を用いて反応を停止させた。細胞を遠心分離し、ＰＢＳで２回洗い、最後にＰＢＳ中に再懸濁させて単細胞懸濁液を調製し、後の使用のために細胞密度を１０^７細胞／ｍｌに調節した。

ＭＣ３８腫瘍モデルの作製方法：前記のように調製したＭＣ３８単細胞懸濁液（２×１０^６のＭＣ３８細胞、２００μｌ）を、３２匹のヒト化ｈＦｃγＲ／ｈＣＤ４０ Ｃ５７ＢＬ／６マウス（LI Fubin team, Department of Medicine, Shanghai Jiaotong Universityにより提供；ＳＰＦレベルで維持）の右脇腹に７日目に皮下接種した。マウスにおける平均腫瘍体積が約５５ｍｍ^３に達したら、各群８匹の４群にランダムに振り分けた。

群に振り分けた後、単回用量の抗ＣＤ４０抗体を、表１２に示すレジメンにしたがって腹腔内投与した。腫瘍体積および体重を週２回測定し、データを記録した。このなかで、対照ＩｇＧ、ｈｕ９Ｅ５およびｈｕ９Ｅ５－ＭはShanghai Hengrui Pharmaceutical Co., Ltd.から提供され、終濃度０．３ｍｇ／ｍｌとするようＰＢＳで希釈した。

抗体の抗腫瘍活性評価の指標：
１）対象マウスを群に振り分けた後、継続的にマウスの腫瘍体積を測定し、腫瘍体積のサイズを、試験する抗体の抗腫瘍活性の評価の指標として用いた。腫瘍体積（ＴＶ）の計算式は次のとおりである：
ＴＶ＝０．５×Ｌ_{ｓｈｏｒｔ}×Ｌ_{ｓｈｏｒｔ}×Ｌ_ｌｏｎｇ
［式中、Ｌ_{ｓｈｏｒｔ}は腫瘍の最短径であり、Ｌ_ｌｏｎｇは腫瘍の最長径である。］

２）Ｔ／Ｃ％は相対腫瘍増殖率、すなわち、ある特定の時点での対照群に対する処置群の腫瘍体積のパーセンテージの値であり、次式にしたがって計算される：
Ｔ／Ｃ％＝（Ｔ－Ｔ_０）／（Ｃ－Ｃ_０）×１００
［式中、ＴおよびＣは試験終了時の腫瘍体積であり、Ｔ_０およびＣ_０は試験開始時の腫瘍体積である。］

３）相対腫瘍抑制率ＴＧＩ（％）＝（１－Ｔ／Ｃ）×１００％。

データの表示および統計学的処理：すべてのデータをGraphPad Prism 5.0ソフトウェアによって分析した。データを平均±標準偏差として表し、群間の一元配置ＡＮＯＶＡ分析を用いた。Ｐ＜０．０５は、差が統計学的に有意であることを示す。

ｈＦｃγＲ／ｈＣＤ４０ＴｇマウスＭＣ３８腫瘍モデルにおける各群の抗体のインビボ活性の結果は、腫瘍体積の変化によって判断することができる。対照抗体および試験抗体を０日目、３日目および６日目に投与した後、マウス腫瘍体積の増加は、対照群（対照ＩｇＧ）との比較で、ｈｕ９Ｅ５群、ｈｕ９Ｅ５－Ｍ群および００５Ｍ群において抑制された。相対腫瘍抑制率はそれぞれ４２．０％、６８．９％および５３．８％であった。ｈｕ９Ｅ５は、ある抗腫瘍活性を有し（ｐ＞０．０５）、ｈｕ９Ｅ５－Ｍおよび０．０５Ｍは高い抗腫瘍活性を有し（ｐ＜０．０５）、ｈｕ９Ｅ５－Ｍは００５Ｍよりも高い効果を有する。表１５および図５に示すとおりである。

結果は、本願の抗ＣＤ４０抗体のインビボ抗腫瘍効果は、配列番号１７に対応する２６６位または配列番号１９に対応する２６２位のアミノ酸変異（ＳからＥへ）によって顕著に改善できることを示している。

本発明の特定の態様を上記に記載したが、当業者は、それら態様は単に説明を目的とするものであって、それら態様に、本発明の原理および本質から外れることなく、さまざまな変更または改変を加えうることを理解すべきである。したがって、本発明の保護範囲は、添付の請求の範囲によって限定される。

Claims (23)

1. 重鎖定常領域に変異を含む抗ＣＤ４０抗体またはその抗原結合フラグメントであって、
   １）抗体軽鎖可変領域が、配列番号６、配列番号７および配列番号８にそれぞれ示されるＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２およびＬＣＤＲ３を含み；
   抗体重鎖可変領域が、配列番号３、配列番号４および配列番号５にそれぞれ示されるＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２およびＨＣＤＲ３を含む；
   または
   ２）抗体軽鎖可変領域が、配列番号１４、配列番号１５および配列番号１６にそれぞれ示されるＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２およびＬＣＤＲ３を含み；
   抗体重鎖可変領域が、配列番号１１、配列番号１２および配列番号１３にそれぞれ示されるＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２およびＨＣＤＲ３を含む；
   または
   ３）抗体軽鎖可変領域が、配列番号４２、配列番号４３および配列番号４４にそれぞれ示されるＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２およびＬＣＤＲ３を含み；
   抗体重鎖可変領域が、配列番号３９、配列番号４０および配列番号４１にそれぞれ示されるＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２およびＨＣＤＲ３を含む；
   または
   ４）抗体軽鎖可変領域が、配列番号５０、配列番号５１および配列番号５２にそれぞれ示されるＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２およびＬＣＤＲ３を含み；
   抗体重鎖可変領域が、配列番号４７、配列番号４８および配列番号４９にそれぞれ示されるＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２およびＨＣＤＲ３を含む；
   または
   ５）抗体軽鎖可変領域が、配列番号５８、配列番号５９および配列番号６０にそれぞれ示されるＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２およびＬＣＤＲ３を含み；
   抗体重鎖可変領域が、配列番号５５、配列番号５６および配列番号５７にそれぞれ示されるＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２およびＨＣＤＲ３を含む、
   抗ＣＤ４０抗体またはその抗原結合フラグメント。
2. 抗体またはその抗原結合フラグメントが、マウス抗体、キメラ抗体、ヒト化抗体、ヒト抗体、またはその抗原結合フラグメントである、請求項１に記載の抗ＣＤ４０抗体またはその抗原結合フラグメント。
3. マウス抗体またはキメラ抗体の可変領域アミノ酸配列が、
   １）配列番号１に示される重鎖可変領域、および配列番号２に示される軽鎖可変領域；
   ２）配列番号９に示される重鎖可変領域、および配列番号１０に示される軽鎖可変領域；
   ３）配列番号３７に示される重鎖可変領域、および配列番号３８に示される軽鎖可変領域；
   ４）配列番号４５に示される重鎖可変領域、および配列番号４６に示される軽鎖可変領域；および
   ５）配列番号５３に示される重鎖可変領域、および配列番号５４に示される軽鎖可変領域
   からなる群から選択される、請求項２に記載の抗ＣＤ４０抗体またはその抗原結合フラグメント。
4. ヒト化抗体の重鎖可変領域アミノ酸配列が、
   ヒトＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３もしくはＩｇＧ４の重鎖ＦＲまたはそのバリアント、
   好ましくは、ヒトＩｇＧ１、ＩｇＧ２またはＩｇＧ４の重鎖ＦＲ、
   より好ましくは、ヒトＩｇＧ１またはＩｇＧ２の重鎖ＦＲ
   をさらに含む、請求項２に記載の抗ＣＤ４０抗体またはその抗原結合フラグメント。
5. ヒト化抗体の軽鎖可変領域の軽鎖ＦＲが、
   配列番号２２に示されるヒト生殖細胞系列軽鎖ＩＧｋＶ１－３３配列、または
   配列番号２４に示されるヒト生殖細胞系列軽鎖ＩＧｋＶ２－２８配列
   に由来し；ヒト化抗体の重鎖可変領域の重鎖ＦＲが、
   配列番号２１に示されるヒト生殖細胞系列重鎖ＩＧＨＶ１－６９配列、または
   配列番号２３に示されるヒト生殖細胞系列重鎖ＩＧＨＶ１－２配列
   に由来し；好ましくは、
   ヒト化抗体の軽鎖可変領域の軽鎖ＦＲが、配列番号２２に示されるヒト生殖細胞系列軽鎖ＩＧｋＶ１－３３に由来し、ヒト化抗体の重鎖可変領域の重鎖ＦＲが、配列番号２１に示されるヒト生殖細胞系列重鎖ＩＧＨＶ１－６９に由来する；または
   ヒト化抗体の軽鎖可変領域の軽鎖ＦＲが、配列番号２４に示されるヒト生殖細胞系列軽鎖ＩＧｋＶ２－２８に由来し、ヒト化抗体の重鎖可変領域の重鎖ＦＲが、配列番号２３に示されるヒト生殖細胞系列重鎖ＩＧＨＶ１－２に由来する、
   請求項２に記載の抗ＣＤ４０抗体またはその抗原結合フラグメント。
6. ヒト化抗体軽鎖が、配列番号１８もしくは配列番号２０で示されるか、またはそのバリアントであり；バリアントが軽鎖可変領域において０～１０個のアミノ酸変異を有し、好ましくはバリアントがアミノ酸位置２および／または３に変異を有し、より好ましくは変異後のアミノ酸残基はＩ、ＶまたはＬである；および／または
   重鎖定常領域の変異前において、ヒト化抗体重鎖が、配列番号１７もしくは配列番号１９で示されるか、またはそのバリアントであり；バリアントが重鎖可変領域において０～１０個のアミノ酸変異を有し、好ましくはバリアントがアミノ酸位置６および／または８に変異を有し、より好ましくは変異後のアミノ酸残基はＩ、ＡまたはＬである、
   請求項５に記載の抗ＣＤ４０抗体またはその抗原結合フラグメント。
7. 重鎖可変領域が、配列番号２５～３０のいずれかに示されるか、またはそのバリアントであり、
   軽鎖可変領域が、配列番号３１～３６のいずれかに示されるか、またはそのバリアントであり；
   好ましくは、
   重鎖可変領域が、配列番号２６に示されるか、またはそのバリアントであり、軽鎖可変領域が、配列番号３３に示されるか、またはそのバリアントである；または
   重鎖可変領域が、配列番号３０に示されるか、またはそのバリアントであり、軽鎖可変領域が、配列番号３４に示されるか、またはそのバリアントである；または
   重鎖可変領域が、配列番号１７に示されるか、またはそのバリアントであり、軽鎖可変領域が、配列番号１８に示されるか、またはそのバリアントである；または
   重鎖可変領域が、配列番号１９に示されるか、またはそのバリアントであり、軽鎖可変領域が、配列番号２０に示されるか、またはそのバリアントである、
   請求項６に記載の抗ＣＤ４０ヒト化抗体またはその抗原結合フラグメント。
8. 重鎖が、
   １）配列番号１９に対応する位置２６２、または配列番号１７に対応する位置２６６；および／または
   ２）配列番号１９に対応する位置３２０、または配列番号１７に対応する位置３２４；および／または
   ３）配列番号１９に対応する位置３２３、または配列番号１７に対応する位置３２７
   からなる群から選択される位置のアミノ酸残基の変異を含む、請求項１～７のいずれかに記載の抗ＣＤ４０抗体またはその抗原結合フラグメント。
9. 重鎖が、
   １）配列番号１９に対応する位置２６２、または配列番号１７に対応する位置２６６のアミノ酸の、グルタミン酸への変異；および／または
   ２）配列番号１９に対応する位置３２０、または配列番号１７に対応する位置３２４のアミノ酸の、セリンへの変異；および／または
   ３）配列番号１９に対応する位置３２３、または配列番号１７に対応する位置３２７のアミノ酸の、フェニルアラニンへの変異
   からなる群から選択される変異を含む、請求項８に記載の抗ＣＤ４０抗体またはその抗原結合フラグメント。
10. 重鎖が、
    １）配列番号１９に対応する２６２Ｅ；
    ２）配列番号１９に対応する２６２Ｅおよび３２３Ｆ；
    ３）配列番号１９に対応する２６２Ｅ、３２０Ｓおよび３２３Ｆ；
    ４）配列番号１７に対応する２６６Ｅ；
    ５）配列番号１７に対応する２６６Ｅ、３２４Ｓおよび３２７Ｆ
    から選択される変異またはその組み合わせを含む、請求項９に記載の抗ＣＤ４０抗体またはその抗原結合フラグメント。
11. ヒト化抗体が、
    配列番号６１または６２に示される重鎖、および配列番号１８に示される軽鎖
    を含む；またはヒト化抗体が、
    配列番号６３、６４または６７に示される重鎖、および
    配列番号２０に示される軽鎖
    を含む、請求項１、２および４～１０のいずれかに記載の抗ＣＤ４０抗体またはその抗原結合フラグメント。
12. 重鎖のカルボキシル末端のアミノ酸残基がアラニン残基に変異しており；
    好ましくは、配列番号６１、６２、６３、６４または６７に示される重鎖のカルボキシル末端のアミノ酸残基がアラニン残基に変異している、
    を含む、請求項１～１１のいずれかに記載の抗ＣＤ４０抗体またはその抗原結合フラグメント。
13. 請求項１～１２のいずれかに記載される軽鎖可変領域および重鎖可変領域
    を含む、一本鎖抗体。
14. 抗体が、請求項１～１２のいずれかに記載される軽鎖可変領域および重鎖可変領域を含む；好ましくは、請求項１～１２のいずれかに記載される抗ＣＤ４０抗体またはその抗原結合フラグメントを含む、抗体－薬物コンジュゲート。
15. 請求項１～１２のいずれかに記載される抗ＣＤ４０抗体もしくは抗原結合フラグメントまたは請求項１３に記載される一本鎖抗体をコードする核酸分子。
16. 請求項１５に記載される核酸分子を含むベクター。
17. 請求項１６に記載されるベクターを含むまたは発現する宿主細胞。
18. 宿主細胞が、細菌、酵母および哺乳動物細胞からなる群から選択され；
    好ましくは、細胞が大腸菌であり；
    好ましくは、酵母がピキア・パストリス（Pichia pastoris）であり；
    好ましくは、哺乳動物細胞がチャイニーズハムスター卵巣細胞またはヒト胎児腎２９３細胞である、
    請求項１７に記載の宿主細胞。
19. 請求項１～１２のいずれかに記載される抗ＣＤ４０抗体もしくはその抗原結合フラグメント、請求項１３に記載される一本鎖抗体、または請求項１４に記載される抗体－薬物コンジュゲート、および
    薬学的に許容しうる賦形剤、希釈剤または担体
    を含む医薬組成物。
20. 請求項１～１２のいずれかに記載される抗ＣＤ４０抗体またはその抗原結合フラグメント、請求項１３に記載される一本鎖抗体、請求項１４に記載される抗体－薬物コンジュゲート、および請求項１９に記載される医薬組成物からなる群から選択される任意の１つの、医薬の製造における使用であって、医薬がＣＤ４０抗体仲介またはＣＤ４０Ｌ仲介疾患または状態の治療または予防のために使用され；
    好ましくは、疾患または状態が癌であり；
    最も好ましくは、癌が、リンパ腫、乳癌、卵巣癌、前立腺癌、膵臓癌、腎臓癌、肺癌、肝臓癌、胃癌、結腸直腸癌、膀胱癌、横紋筋肉腫、食道癌、子宮頸癌、多発性骨髄腫、白血病、胆嚢癌、膠芽腫および黒色腫からなる群から選択される、
    使用。
21. 請求項１～１２のいずれかに記載される抗ＣＤ４０抗体またはその抗原結合フラグメント、請求項１３に記載される一本鎖抗体、請求項１４に記載される抗体－薬物コンジュゲート、および請求項１９に記載される医薬組成物からなる群から選択される任意の１つの、医薬の製造における使用であって、医薬が、自己免疫疾患または炎症性疾患を患う患者の症状の改善のために使用される、使用。
22. ＣＤ４０抗体仲介またはＣＤ４０Ｌ仲介疾患の予防または治療方法であって、該方法が、請求項１～１２のいずれかに記載される抗ＣＤ４０抗体またはその抗原結合フラグメント、請求項１３に記載される一本鎖抗体、請求項１４に記載される抗体－薬物コンジュゲート、および請求項１９に記載される医薬組成物からなる群から選択される任意の１つの予防有効量または治療有効量を対象と接触させることを含み；
    好ましくは、疾患が癌であり；
    最も好ましくは、癌が、リンパ腫、乳癌、卵巣癌、前立腺癌、膵臓癌、腎臓癌、肺癌、肝臓癌、胃癌、結腸直腸癌、膀胱癌、横紋筋肉腫、食道癌、子宮頸癌、多発性骨髄腫、白血病、胆嚢癌、膠芽腫および黒色腫からなる群から選択される、
    方法。
23. 自己免疫疾患または炎症性疾患の症状の改善方法であって、該方法が、請求項１～１２のいずれかに記載される抗ＣＤ４０抗体またはその抗原結合フラグメント、請求項１３に記載される一本鎖抗体、請求項１４に記載される抗体－薬物コンジュゲート、および請求項１９に記載される医薬組成物からなる群から選択される任意の１つの予防有効量または治療有効量を対象と接触させることを含む、方法。

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