BR112021009835A2 - anticorpo anti-cd40, fragmento de ligação ao antígeno e uso farmacêutico dos mesmos - Google Patents

Abstract

ANTICORPO ANTI-CD40, FRAGMENTO DE LIGAÇÃO AO ANTÍGENO E USO FARMACÊUTICO DOS MESMOS. A presente invenção se refere a um anticorpo anti-CD40, um fragmento de ligação ao antígeno e um uso farmacêutico do mesmo. As regiões constantes de cadeia pesada do anticorpo anti-CD40 e o fragmento de ligação ao antígeno do mesmo contêm mutações. Devido às mutações, o anticorpo anti-CD40 perde a atividade de ligação ao FcRIII e a ligação do anticorpo anti-CD40 e FcRIIB é aumentada, perdendo assim a citotoxicidade dependente do anticorpo (ADCC), mas melhorando a reticulação de anticorpo mediada por FcRIIB. As mutações nas regiões constantes de cadeia pesada aumentam a ativação do CD40, e aumentam a apresentação das células dendríticas aos antígenos. O anticorpo anti-CD40 e o fragmento de ligação ao antígeno do mesmo podem ser usados como fármacos anticâncer para tratar doenças ou sintomas mediados por CD40.

Description

Relatório Descritivo da Patente de Invenção para: “ANTICORPO ANTI-CD40, FRAGMENTO DE LIGAÇÃO AO ANTÍGENO E USO FARMACÊUTICO DOS MESMOS”

[001] O presente pedido reivindica a prioridade do pedido de patente chinês "anticorpo anti-CD40, fragmento de ligação ao antígeno e uso farmacêutico do mesmo" (pedido número CN201811448228.1) depositado em 30 de novembro de

2018.

CAMPO DA INVENÇÃO

[002] A presente divulgação se refere a um anticorpo anti-CD40 ou fragmento de ligação ao antígeno do mesmo compreendendo mutação(ões) na região constante de cadeia pesada, um anticorpo quimérico ou um anticorpo humanizado compreendendo CDRs do anticorpo anti-CD40 e uma composição farmacêutica compreendendo o anticorpo CD40 anti-humano ou fragmento de ligação ao antígeno do mesmo, e a utilização do mesmo como um agente anticâncer.

FUNDAMENTOS DA INVENÇÃO

[003] O câncer se tornou o maior desafio de saúde enfrentado pela sociedade humana por muito tempo. Terapias tradicionais tais como cirurgia, quimioterapia e radioterapia apresentam pouco efeito no tratamento de tumores sólidos disseminados. A imunoterapia tumoral é um ponto importante no campo da terapia tumoral, e a imunoterapia tumoral por células T está em uma posição central. A imunoterapia de tumor faz uso total das células T assassinas e mobiliza as células T assassinas em pacientes com tumor para matar o tumor. A imunoterapia tumoral pode ser uma das formas mais eficazes e seguras de tratar tumores.

A imunoterapia tumoral atualmente apresenta perspectivas favoráveis para o tratamento de diversos tipos de cânceres, incluindo tumores metastáticos disseminados.

[004] A ativação das células T no corpo humano adota um sistema de via de sinal duplo: os peptídeos do antígeno do MHC são apresentados às células T através das células apresentadoras de antígeno (APC) para fornecer o primeiro sinal; uma série de moléculas coestimuladoras são necessárias para fornecer o segundo sinal e, então, as células T produzem uma resposta imunológica normal. Este sistema de via de sinal duplo desempenha um papel vital no equilíbrio do sistema imunológico in vivo. Ele regula estritamente as diferentes respostas imunológicas do corpo a antígenos próprios e não-próprios. Na ausência do segundo sinal fornecido pela molécula coestimuladora, as células T não responderão ou não gerarão uma resposta imune específica sustentada, resultando consequentemente em tolerância.

Portanto, a segunda via de sinal desempenha um papel regulador muito crítico em todo o processo de resposta imunológica do corpo.

[005] O CD40 é uma das glicoproteínas expressas na superfície celular. É uma glicoproteína intra-membrana do tipo I com peso molecular de cerca de 48 kDa. O CD40 pertence à superfamília do receptor do fator de necrose tumoral (TNFR) e desempenha um papel importante no sistema imunológico. O CD40 é expresso em uma variedade de células do sistema imunológico, tais como células B, células dendríticas, monócitos e macrófagos. Quando a transdução de sinal ocorre através do CD40, células apresentadoras de antígenos especializadas são ativadas. O ligante natural de CD40 é denominado CD154 ou CD40L e é conhecido por ser expresso principalmente em linfócitos T maduros. A transdução de sinal mediada por CD40L pode desencadear alguns eventos biológicos celulares, incluindo ativação de células imunes, proliferação e produção de citocinas e quimiocinas. A sinalização de CD40 é muito importante para as respostas imunes dependentes de células T, especialmente no contexto do ambiente do tumor. As células dendríticas estimuladas por CD40 podem ativar as células T efetoras específicas do tumor, que têm o potencial de erradicar as células tumorais.

[006] A expressão de CD40 pode ser encontrada em muitas células normais e células tumorais, incluindo linfócitos B.

Por exemplo, o melanoma é um tumor que expressa CD40, e 30% a 70% dos tumores sólidos também exibem expressão de CD40.

No momento, sabe-se que a ativação de CD40 pode efetivamente desencadear respostas antitumorais (Tong et al., Cancer Gene Therapy, 2003, 10: 1-13), incluindo ativação imune de respostas de células T específicas de tumor, efeito direto na apoptose de tumores CD40-positivos, e resposta humoral mediada por estimulação de ADCC. Foi observado que a erradicação do tumor está fortemente correlacionada com a presença de linfócitos T citotóxicos específicos do tumor.

Ao mesmo tempo, deve-se notar que a administração sistêmica de anticorpo CD40 está associada a efeitos colaterais, tais como síndrome de choque e síndrome de liberação de citocinas (van Mierlo et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 2002, 99: 5561-5566).

[007] Atualmente, muitas empresas farmacêuticas internacionais estão desenvolvendo anticorpos monoclonais contra CD40 como mencionado acima, que estimulam especificamente a ativação imunológica para maximizar o sistema imunológico do próprio paciente para responder a tumores, de modo a alcançar o objetivo de matar células tumorais. Patentes relacionadas envolvem tais como PCT/CN2018/089252, CN1198647, CN1369015, CN1582165, CN100430419, CN101014386, CN101237882, CN101289510, CN101490086, CN103842382, CN104918957, WO2002028904, WO2011123489, WO2012149356, WO2013034904, WO201509853, WO2016196314, WO2017040932, WO2017004006 etc. Até agora, os anticorpos anti-CD40 disponíveis na Pfizer (produtos relacionados foram licenciados para a Roche), Alligator e outras empresas foram observados tendo efeitos favoráveis na eliminação de tumores em modelos animais pré-clínicos, e entraram em testes clínicos de Fase I.

[008] Quanto às mutações na região constante do anticorpo, os documentos WO2006019447, WO2014145806, US8734791, US9657106, US8084582, WO2008150494, WO2004099249 divulgam mutações de S267E, L328F e N325S da cadeia pesada do anticorpo. As mutações eliminam a habilidade de ligação do anticorpo a FcγRIII, enquanto aumentam a habilidade de ligação a FcγRIIB. Portanto, a citotoxicidade celular dependente de anticorpo (ADCC) é excluída, enquanto a reticulação mediada por FcγRIIB é aumentada, aumentando assim a ativação do CD40 e aumentando a apresentação do antígeno pelas células dendríticas.

[009] A presente divulgação visa fornecer um anticorpo anti-CD40 com alta afinidade, alta seletividade e alta atividade biológica, que carece de citotoxicidade celular dependente de anticorpo (ADCC), mas tem reticulação mediada por FcγRIIB aumentada, inibindo assim o crescimento tumoral in vivo. Os anticorpos da presente divulgação podem ser usados como medicamento ou usados em uma composição para o tratamento de cânceres mediados por CD40 e mediados pela via de CD40.

SUMÁRIO DA INVENÇÃO

[0010] A presente divulgação fornece um anticorpo CD40 ou fragmento de ligação ao antígeno do mesmo, que compreende: uma região variável de cadeia leve do anticorpo, compreendendo pelo menos um LCDR mostrado como uma sequência selecionada do grupo que consiste em: SEQ ID NO: 6, SEQ ID NO: 7, SEQ ID NO: 8; SEQ ID NO: 14, SEQ ID NO: 15, SEQ ID NO: 16; SEQ ID NO: 42, SEQ ID NO: 43, SEQ ID NO: 44; SEQ ID NO: 50, SEQ ID NO: 51, SEQ ID NO: 52; SEQ ID NO: 58, SEQ ID NO: 59 e SEQ ID NO: 60; e/ou uma região variável de cadeia pesada do anticorpo, compreendendo pelo menos um HCDR mostrado como uma sequência selecionada do grupo que consiste em: SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 5, SEQ ID NO: 11, SEQ ID NO: 12, SEQ ID NO: 13; SEQ ID NO: 39, SEQ ID NO: 40, SEQ ID NO: 41; SEQ ID NO: 47, SEQ ID NO: 48, SEQ ID NO: 49; SEQ ID NO: 55, SEQ ID NO: 56 e SEQ ID NO: 57.

[0011] Em algumas modalidades, o anticorpo anti-CD40 ou fragmento de ligação ao antígeno do mesmo, conforme descrito acima, compreende uma região variável de cadeia leve compreendendo LCDR1 como mostrado na SEQ ID NO: 6, SEQ ID NO: 14, SEQ ID NO: 42, SEQ ID NO: 50 ou SEQ ID NO: 58.

[0012] Em algumas modalidades, o anticorpo anti-CD40 ou fragmento de ligação ao antígeno do mesmo, conforme descrito acima, compreende uma região variável de cadeia leve do anticorpo compreendendo LCDR2 como mostrado na SEQ ID NO: 7,

SEQ ID NO: 15, SEQ ID NO: 43, SEQ ID NO: 51 ou SEQ ID NO:

59.

[0013] Em algumas modalidades, o anticorpo anti-CD40 ou fragmento de ligação ao antígeno do mesmo, conforme descrito acima, compreende uma região variável de cadeia leve do anticorpo compreendendo LCDR3 como mostrado na SEQ ID NO: 8, SEQ ID NO: 16, SEQ ID NO: 44, SEQ ID NO: 52 ou SEQ ID NO:

60.

[0014] Em algumas modalidades, o anticorpo anti-CD40 ou fragmento de ligação ao antígeno do mesmo, conforme descrito acima, compreende uma região variável de cadeia pesada do anticorpo compreendendo HCDR1 como mostrado na SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 11, SEQ ID NO: 39, SEQ ID NO: 47 ou SEQ ID NO:

55.

[0015] Em algumas modalidades, o anticorpo anti-CD40 ou fragmento de ligação ao antígeno do mesmo, conforme descrito acima, compreende uma região variável de cadeia pesada do anticorpo compreendendo HCDR2 como mostrado na SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 12, SEQ ID NO: 40, SEQ ID NO: 48 ou SEQ ID NO:

56.

[0016] Em algumas modalidades, o anticorpo anti-CD40 ou fragmento de ligação ao antígeno do mesmo, conforme descrito acima, compreende uma região variável de cadeia pesada do anticorpo compreendendo HCDR3 como mostrado na SEQ ID NO: 5,

SEQ ID NO: 13, SEQ ID NO: 41, SEQ ID NO: 49 ou SEQ ID NO:

57.

[0017] Em algumas modalidades, o anticorpo anti-CD40 ou fragmento de ligação ao antígeno do mesmo, conforme descrito acima, compreende uma região variável de cadeia leve do anticorpo compreendendo LCDR1, LCDR2 e LCDR3 como mostrado em SEQ ID NO: 6, SEQ ID NO: 7 e SEQ ID NO: 8, respectivamente.

[0018] Em algumas modalidades, o anticorpo anti-CD40 ou fragmento de ligação ao antígeno do mesmo, conforme descrito acima, compreende uma região variável de cadeia leve do anticorpo compreendendo LCDR1, LCDR2 e LCDR3 como mostrado em SEQ ID NO: 14, SEQ ID NO: 15 e SEQ ID NO: 16, respectivamente.

[0019] Em algumas modalidades, o anticorpo anti-CD40 ou fragmento de ligação ao antígeno do mesmo, conforme descrito acima, compreende uma região variável de cadeia leve do anticorpo compreendendo LCDR1, LCDR2 e LCDR3 como mostrado em SEQ ID NO: 42, SEQ ID NO: 43 e SEQ ID NO: 44, respectivamente.

[0020] Em algumas modalidades, o anticorpo anti-CD40 ou fragmento de ligação ao antígeno do mesmo, conforme descrito acima, compreende uma região variável de cadeia leve do anticorpo compreendendo LCDR1, LCDR2 e LCDR3 como mostrado em SEQ ID NO: 50, SEQ ID NO: 51 e SEQ ID NO: 52, respectivamente.

[0021] Em algumas modalidades, o anticorpo anti-CD40 ou fragmento de ligação ao antígeno do mesmo, conforme descrito acima, compreende uma região variável de cadeia leve do anticorpo compreendendo LCDR1, LCDR2 e LCDR3 como mostrado em SEQ ID NO: 58, SEQ ID NO: 59 e SEQ ID NO: 60, respectivamente.

[0022] Em algumas modalidades, o anticorpo anti-CD40 ou fragmento de ligação ao antígeno do mesmo, conforme descrito acima, compreende uma região variável de cadeia pesada do anticorpo compreendendo HCDR1, HCDR2 e HCDR3 como mostrado em SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 4 e SEQ ID NO: 5, respectivamente.

[0023] Em algumas modalidades, o anticorpo anti-CD40 ou fragmento de ligação ao antígeno do mesmo, conforme descrito acima, compreende uma região variável de cadeia pesada do anticorpo compreendendo HCDR1, HCDR2 e HCDR3 como mostrado em SEQ ID NO: 11, SEQ ID NO: 12 e SEQ ID NO: 13, respectivamente.

[0024] Em algumas modalidades, o anticorpo anti-CD40 ou fragmento de ligação ao antígeno do mesmo, conforme descrito acima, compreende uma região variável de cadeia pesada do anticorpo que compreende HCDR1, HCDR2 e HCDR3 como mostrado em SEQ ID NO: 39, SEQ ID NO: 40 e SEQ ID NO: 41, respectivamente.

[0025] Em algumas modalidades, o anticorpo anti-CD40 ou fragmento de ligação ao antígeno do mesmo, conforme descrito acima, compreende uma região variável de cadeia pesada do anticorpo compreendendo HCDR1, HCDR2 e HCDR3 como mostrado em SEQ ID NO: 47, SEQ ID NO: 48 e SEQ ID NO: 49, respectivamente.

[0026] Em algumas modalidades, o anticorpo anti-CD40 ou fragmento de ligação ao antígeno do mesmo, conforme descrito acima, compreende uma região variável de cadeia pesada do anticorpo compreendendo HCDR1, HCDR2 e HCDR3 como mostrado em SEQ ID NO: 55, SEQ ID NO: 56 e SEQ ID NO: 57, respectivamente.

[0027] Em algumas modalidades particulares, o anticorpo anti-CD40 ou fragmento de ligação ao antígeno do mesmo compreende uma região variável de cadeia leve do anticorpo que compreende: LCDR1, LCDR2 e LCDR3 como mostrado em SEQ ID NO: 6, SEQ ID NO: 7 e SEQ ID NO: 8, respectivamente; ou LCDR1, LCDR2 e LCDR3 como mostrado em SEQ ID NO: 14, SEQ ID NO: 15 e SEQ ID NO: 16, respectivamente; ou LCDR1, LCDR2 e LCDR3 como mostrado em SEQ ID NO: 42, SEQ ID NO: 43 e SEQ ID NO: 44, respectivamente; ou LCDR1, LCDR2 e LCDR3 como mostrado em SEQ ID NO: 50, SEQ ID NO: 51 e SEQ ID NO: 52, respectivamente; ou LCDR1, LCDR2 e LCDR3 como mostrado em SEQ ID NO: 58, SEQ ID NO: 59 e SEQ ID NO: 60, respectivamente; e,

uma região variável de cadeia pesada do anticorpo que compreende: HCDR1, HCDR2 e HCDR3 como mostrado em SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 4 e SEQ ID NO: 5, respectivamente; ou HCDR1, HCDR2 e HCDR3 como mostrado em SEQ ID NO: 11, SEQ ID NO: 12 e SEQ ID NO: 13, respectivamente; ou HCDR1, HCDR2 e HCDR3 como mostrado em SEQ ID NO: 39, SEQ ID NO: 40 e SEQ ID NO: 41, respectivamente; ou HCDR1, HCDR2 e HCDR3 como mostrado em SEQ ID NO: 47, SEQ ID NO: 48 e SEQ ID NO: 49, respectivamente; ou HCDR1, HCDR2 e HCDR3 como mostrado em SEQ ID NO: 55, SEQ ID NO: 56 e SEQ ID NO: 57, respectivamente.

[0028] Em algumas modalidades particulares, o anticorpo anti-CD40 ou fragmento de ligação ao antígeno do mesmo pode ser qualquer um selecionado a partir de: (1) a região variável de cadeia leve do anticorpo compreende LCDR1, LCDR2 e LCDR3 como mostrado em SEQ ID NO: 6, SEQ ID NO: 7 e SEQ ID NO: 8, respectivamente; a região variável de cadeia pesada do anticorpo compreende HCDR1, HCDR2 e HCDR3 como mostrado em SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 4 e SEQ ID NO: 5, respectivamente; (2) a região variável de cadeia leve do anticorpo compreende LCDR1, LCDR2 e LCDR3 como mostrado em SEQ ID NO: 14, SEQ ID NO: 15 e SEQ ID NO: 16, respectivamente; a região variável de cadeia pesada do anticorpo compreende HCDR1,

HCDR2 e HCDR3 como mostrado na SEQ ID NO: 11, SEQ ID NO: 12 e SEQ ID NO: 13, respectivamente; (3) a região variável de cadeia leve do anticorpo compreende LCDR1, LCDR2 e LCDR3 como mostrado na SEQ ID NO: 42, SEQ ID NO: 43 e SEQ ID NO: 44, respectivamente; a região variável de cadeia pesada do anticorpo compreende HCDR1, HCDR2 e HCDR3 como mostrado em SEQ ID NO: 39, SEQ ID NO: 40 e SEQ ID NO: 41, respectivamente; (4) a região variável de cadeia leve do anticorpo compreende LCDR1, LCDR2 e LCDR3 como mostrado em SEQ ID NO: 50, SEQ ID NO: 51 e SEQ ID NO: 52, respectivamente; a região variável de cadeia pesada do anticorpo compreende HCDR1, HCDR2 e HCDR3 como mostrado na SEQ ID NO: 47, SEQ ID NO: 48 e SEQ ID NO: 49, respectivamente; e (5) a região variável de cadeia leve do anticorpo compreende LCDR1, LCDR2 e LCDR3 como mostrado em SEQ ID NO: 58, SEQ ID NO: 59 e SEQ ID NO: 60, respectivamente; a região variável de cadeia pesada do anticorpo compreende HCDR1, HCDR2 e HCDR3 como mostrado na SEQ ID NO: 55, SEQ ID NO: 56 e SEQ ID NO: 57, respectivamente.

[0029] Em algumas modalidades particulares, a sequência da região variável de cadeia leve do anticorpo é selecionada a partir do grupo que consiste em SEQ ID NO: 2 ou SEQ ID NO: 10; a sequência da região variável de cadeia pesada é selecionada de SEQ ID NO: 1 ou SEQ ID NO: 9.

[0030] O anticorpo anti-CD40 ou fragmento de ligação ao antígeno do mesmo descrito acima pode ser um anticorpo murino ou um anticorpo quimérico.

[0031] Em algumas modalidades particulares, a sequência de aminoácidos da região variável de cadeia pesada do anticorpo murino ou do anticorpo quimérico é como mostrado na SEQ ID NO: 1, e a sequência de aminoácidos da região variável de cadeia leve é como mostrado na SEQ ID NO: 2.

[0032] Em outras modalidades particulares, a sequência de aminoácidos da região variável de cadeia pesada do anticorpo murino ou do anticorpo quimérico é como mostrado na SEQ ID NO: 9, e a sequência de aminoácidos da região variável de cadeia leve é como mostrado na SEQ ID NO: 10.

[0033] Em outras modalidades particulares, a região variável de cadeia leve LCVR do anticorpo ou fragmento de antígeno é como mostrado na sequência SEQ ID NO: 38, e a região variável de cadeia pesada HCVR é como mostrado na sequência SEQ ID NO: 37.

[0034] Em outras modalidades particulares, a região variável de cadeia leve LCVR do anticorpo ou fragmento de antígeno é como mostrado na sequência SEQ ID NO: 46, e a região variável de cadeia pesada HCVR é como mostrado na sequência SEQ ID NO: 45.

[0035] Em outras modalidades particulares, a região variável de cadeia leve LCVR do anticorpo ou fragmento de antígeno é como mostrado na sequência SEQ ID NO: 54, e a região variável de cadeia pesada HCVR é como mostrado na sequência SEQ ID NO: 53.

[0036] Em algumas modalidades particulares, o anticorpo anti-CD40 ou fragmento de ligação ao antígeno do mesmo é um anticorpo murino, um anticorpo quimérico, um anticorpo humanizado, um anticorpo humano ou fragmento(s) do mesmo.

[0037] Em algumas modalidades particulares, quando o anticorpo anti-CD40 ou fragmento de ligação ao antígeno do mesmo é um anticorpo murino ou fragmento do mesmo, a região variável de cadeia leve do anticorpo compreende ainda região(ões) FR da cadeia leve ou região(ões) constante(s) da cadeia leve de cadeia κ, λ de murino ou variante(s) das mesmas; e/ou a região variável de cadeia pesada do anticorpo compreende ainda a(s) região(ões) FR da cadeia pesada ou região(ões) constante(s) da cadeia pesada de IgG1, IgG2, IgG3, IgG4 murino ou variante(s) das mesmas.

[0038] Em algumas modalidades particulares, quando o anticorpo anti-CD40 ou fragmento de ligação ao antígeno do mesmo é um anticorpo quimérico ou fragmento do mesmo, ele compreende a(s) região(ões) constante(s) da cadeia κ, λ humana ou variante(s) das mesmas, e/ou compreende a(s) região(ões) constante(s) da cadeia pesada de IgG1, IgG2, IgG3 ou IgG4 humana ou variante(s) das mesmas. Em algumas modalidades particulares, a sequência da região variável de cadeia leve é mostrada na SEQ ID NO: 2 ou SEQ ID NO: 10, e/ou a sequência da região variável de cadeia pesada é mostrada na SEQ ID NO: 1 ou SEQ ID NO: 9.

[0039] Em algumas modalidades particulares, quando o anticorpo anti-CD40 ou fragmento de ligação ao antígeno do mesmo é um anticorpo humanizado ou fragmento do mesmo, a sequência da cadeia leve do anticorpo é: SEQ ID NO: 18 ou SEQ ID NO: 20 ou variante dos mesmos; em particular, a variante tem 0-10 alteração(ões) de aminoácidos na cadeia leve, mais especificamente, tem mutação(ões) de aminoácidos nas posições 2 e 3. Os aminoácidos após a mutação nas posições 2 e 3 são, cada um, independentemente selecionados de I, V ou L; a sequência da cadeia pesada do anticorpo é: SEQ ID NO: 17 ou SEQ ID NO: 19 ou variante das mesmas; a variante tem 0-10 alteração(ões) de aminoácido(s) na cadeia pesada, mais especificamente, tem mutação(ões) de aminoácido(s) nas posições 6 e 8. Os aminoácidos após a mutação são, cada um, independentemente selecionados de I, A ou L.

[0040] Em algumas modalidades particulares do anticorpo humanizado anti-CD40 ou fragmento do mesmo, como descrito acima, a região variável de cadeia pesada do anticorpo humanizado compreende ainda região(ões) constante(s) da cadeia pesada ou região(ões) FR de IgG1, IgG2, IgG3, IgG4 humano, ou variante(s) das mesmas, em particular compreende região(ões) constante(s) de cadeia pesada ou região(ões) FR de IgG1, IgG2 ou IgG4 humano, em particular compreende região(ões) constante(s) de cadeia pesada ou região(ões) FR de IgG1 ou IgG2 humano; e/ou compreende região(ões) FR de cadeia leve da cadeia κ, λ humana ou variante(s) das mesmas.

[0041] Em algumas modalidades particulares do anticorpo humanizado anti-CD40 ou fragmento do mesmo, como descrito acima, a sequência da região FR da cadeia leve na região variável de cadeia leve do anticorpo humanizado é derivada, por exemplo, de uma cadeia leve da linhagem germinativa humana IGkV1-33 como mostrado na sequência SEQ ID NO: 22; ou derivado de uma cadeia leve de linhagem germinativa humana IGkV2-28 como mostrado na sequência SEQ ID NO: 24.

[0042] Em algumas modalidades particulares do anticorpo humanizado anti-CD40 ou fragmento do mesmo, como descrito acima, a variante da região variável de cadeia leve do anticorpo humanizado tem, particularmente, 0-10 alteração(ões) de aminoácidos na região variável de cadeia leve; mais particularmente, tem mutação(ões) de aminoácidos nas posições 2 e 3; em particular, os aminoácidos após a mutação são I, V ou L.

[0043] Em algumas modalidades particulares, o anticorpo humanizado anti-CD40 ou o fragmento do mesmo, conforme descrito acima, compreende ainda uma região constante da cadeia leve de uma cadeia kappa, lambda humana ou variante da mesma.

[0044] Em algumas modalidades particulares do anticorpo humanizado anti-CD40 ou fragmento do mesmo, como descrito acima, a sequência da região FR da cadeia pesada na região variável de cadeia pesada do anticorpo humanizado é derivada de, por exemplo, uma cadeia pesada da linhagem germinativa humana IGHV1-69 como mostrado na sequência SEQ ID NO: 21, e/ou derivado de uma cadeia pesada de linhagem germinativa humana IGkV1-33 como mostrado na sequência SEQ ID NO: 22; derivado de uma cadeia pesada de linhagem germinativa humana IGHV1-2 como mostrado na sequência SEQ ID NO: 23, e/ou derivado de uma cadeia pesada de linhagem germinativa humana IGkV2-28 como mostrado na sequência SEQ ID NO: 24.

[0045] Em algumas modalidades particulares do anticorpo humanizado anti-CD40 ou fragmento do mesmo, a região variável de cadeia pesada é selecionada a partir da sequência como mostrado em uma das SEQ ID NOs: 25-30 ou variante das mesmas, e a região variável de cadeia leve é selecionada a partir da sequência como mostrado em uma das SEQ ID NOs: 31-36 ou variante das mesmas.

[0046] Em algumas modalidades particulares do anticorpo humanizado anti-CD40 ou fragmento do mesmo, a região variável de cadeia pesada é como mostrada na SEQ ID NO: 26 ou variante da mesma, e a região variável de cadeia leve é como mostrado na SEQ ID NO: 33 ou variante da mesma.

[0047] Em algumas modalidades particulares, a região variável de cadeia pesada é como mostrada na SEQ ID NO: 30 ou variante da mesma, e a região variável de cadeia leve é como mostrada na sequência SEQ ID NO: 34 ou variante da mesma.

[0048] Em algumas modalidades particulares, a cadeia pesada do anticorpo anti-CD40 humanizado é como mostrada na SEQ ID NO: 17 e a cadeia leve é como mostrada na SEQ ID NO:

18.

[0049] Em algumas modalidades particulares, a cadeia pesada é como mostrada na SEQ ID NO: 19 e a cadeia leve é como mostrada na SEQ ID NO: 20.

[0050] Em algumas modalidades particulares do anticorpo humanizado anti-CD40 ou fragmento do mesmo, a sequência da cadeia pesada do anticorpo humanizado é como mostrada na SEQ ID NO: 61, 62, 63, 64 ou 67 ou variante das mesmas e/ou região variável de cadeia leve é como mostrada na SEQ ID NO: 18, 20 ou variante das mesmas.

[0051] Em algumas modalidades particulares, a sequência da cadeia pesada do anticorpo humanizado anti-CD40 ou o fragmento do mesmo é a sequência como mostrada na SEQ ID NO: 61 ou 62 ou uma variante das mesmas, e a sequência da cadeia leve é a sequência como mostrada na SEQ ID NO: 18 ou variante da mesma; a sequência da cadeia pesada é a sequência como mostrada na SEQ ID NO: 63, 64 ou 67 ou variante das mesmas, e a sequência da cadeia leve é a sequência como mostrada na SEQ ID NO: 20 ou variante da mesma.

[0052] A variante tem 0-10 alteração(ões) de aminoácidos na região variável de cadeia pesada, em particular, tem mutações de aminoácidos nas posições 6 e 8 e, em particular, os aminoácidos após a mutação são I, A ou L.

[0053] Aqui, a sequência mostrada na SEQ ID NO: 61 compreende um resíduo de aminoácido mutado em ácido glutâmico (E) na posição 266 correspondendo à SEQ ID NO: 17 (por exemplo, S266E); a sequência mostrada na SEQ ID NO: 62 compreende um resíduo de aminoácido mutado em ácido glutâmico (E) na posição 266 correspondendo à SEQ ID NO: 17 (por exemplo, S266E), um resíduo de aminoácido mutado em serina (S) na posição 324 correspondendo à SEQ ID NO: 17 (por exemplo, N324S), e um resíduo de aminoácido mutado em fenilalanina (F) na posição 327 correspondendo à SEQ ID NO: 17 (por exemplo, L327F); a sequência mostrada na SEQ ID NO: 63 compreende um resíduo de aminoácido mutado em ácido glutâmico (E) na posição 262 correspondendo à SEQ ID NO: 19 (por exemplo, S262E);

a sequência mostrada na SEQ ID NO: 64 compreende um resíduo de aminoácido mutado em ácido glutâmico (E) na posição 262 correspondendo à SEQ ID NO: 19 (por exemplo, S262E), e um resíduo de aminoácido mutado em fenilalanina (F) na posição 323 correspondendo à SEQ ID NO: 19 (por exemplo, L323F); a sequência mostrada na SEQ ID NO: 67 compreende um resíduo de aminoácido mutado em ácido glutâmico (E) na posição 262 correspondendo à SEQ ID NO: 19 (por exemplo, S262E); um resíduo de aminoácido mutado em serina (S) na posição 320 correspondendo à SEQ ID NO: 19 (por exemplo, N320S), e um resíduo de aminoácido mutado em fenilalanina (F) na posição 323 correspondendo à SEQ ID NO: 19 (por exemplo, L323F). Dentre eles, a numeração da posição dos aminoácidos está de acordo com a ordem natural. Em algumas modalidades, o aminoácido na última posição (tal como lisina) da sequência de aminoácidos da cadeia pesada do anticorpo anti-CD40 ou fragmento de ligação ao antígeno do mesmo descrito acima é mutado para alanina (A).

[0054] Em algumas modalidades particulares, o aminoácido na última posição da sequência da cadeia pesada, como mostrado na SEQ ID NO: 61, 62, 63, 64 ou 67 é mutado em A.

[0055] Em outras modalidades particulares, é fornecido um anticorpo que compreende uma cadeia pesada como mostrado em SEQ ID NO: 69 e uma cadeia leve como mostrado em SEQ ID NO: 66.

[0056] Em outras modalidades particulares, é fornecido um anticorpo que compreende uma cadeia pesada como mostrado em SEQ ID NO: 68 e uma cadeia leve como mostrado em SEQ ID NO: 66.

[0057] Em algumas modalidades particulares do anticorpo anti-CD40 ou fragmento de ligação ao antígeno do mesmo, como descrito acima, o fragmento de ligação ao antígeno é Fab, Fv, sFv, F(ab')2, anticorpo linear, anticorpo de cadeia única, nanocorpo, anticorpo de domínio ou anticorpo multiespecífico.

[0058] A presente divulgação fornece ainda um anticorpo de cadeia única, que compreende a região variável de cadeia pesada e a região variável de cadeia leve do anticorpo anti- CD40 ou fragmento de ligação ao antígeno do mesmo, conforme descrito acima.

[0059] A presente divulgação fornece ainda um anticorpo multiespecífico, que compreende a região variável de cadeia pesada e a região variável de cadeia leve do anticorpo anti- CD40 ou fragmento de ligação ao antígeno do mesmo, conforme descrito acima.

[0060] A presente divulgação fornece ainda uma molécula de ácido nucleico (DNA ou RNA) que codifica o anticorpo anti- CD40 ou fragmento de ligação ao antígeno do mesmo, anticorpo multiespecífico ou anticorpo de cadeia única como descrito acima.

[0061] A presente divulgação fornece ainda um vetor de expressão que compreende a molécula de ácido nucleico conforme descrito acima.

[0062] A presente divulgação fornece ainda uma célula hospedeira, que compreende ou é transformada com o vetor de expressão conforme descrito acima. Em algumas modalidades particulares, a célula hospedeira é uma célula de bactéria, de levedura ou de mamífero, em particular Escherichia coli, Pichia pastoris, célula de ovário de hamster chinês (CHO) ou célula de rim embrionário humano (HEK) 293.

[0063] A presente divulgação fornece ainda um conjugado anticorpo-fármaco que compreende a região variável de cadeia leve do anticorpo anti-CD40 e/ou a região variável de cadeia pesada, conforme descrito acima. O conjugado anticorpo- fármaco é bem conhecido na técnica e é formado pela conexão de anticorpo, ligante e fármaco. Os ligantes conhecidos envolvem ligantes cliváveis e ligantes não cliváveis. Por exemplo, os ligantes envolvem, mas não estão limitados a SMCC, SPDP e semelhantes. Os fármacos também são bem conhecidos na técnica, tais como DM1, DM4, MMAE, MMAF etc.

[0064] A presente divulgação fornece ainda uma composição farmacêutica, que compreende o anticorpo anti- CD40 ou fragmento de ligação ao antígeno do mesmo, anticorpo multiespecífico ou anticorpo de cadeia única e excipiente(s), diluente(s) ou carreador(es) farmaceuticamente aceitáveis.

[0065] Em algumas modalidades, a dose unitária da composição farmacêutica pode compreender de 0,01% a 99% (em peso) do anticorpo anti-CD40 ou fragmento do mesmo, ou a quantidade do anticorpo CD40 ou do fragmento do mesmo em dose unitária da(s) composição(ões) farmacêutica(s) é de 0,1 mg a 2000 mg; em algumas modalidades, de 1 mg a 1000 mg.

[0066] A presente divulgação fornece ainda o uso do anticorpo anti-CD40 ou fragmento de ligação ao antígeno do mesmo, o anticorpo multiespecífico, o anticorpo de cadeia única ou a(s) composição(ões) farmacêutica(s) compreendendo os mesmos como descrito acima, na preparação de um medicamento para o tratamento de doenças ou condições mediadas por CD40 ou mediadas por CD40L; em particular, a doença é câncer; em particular, o câncer é selecionado a partir do grupo que consiste em linfoma, câncer de mama, câncer de ovário, câncer de próstata, câncer de pâncreas, câncer de rim, câncer de pulmão, câncer de fígado, câncer gástrico, câncer colorretal, câncer de bexiga, rabdomiossarcoma, câncer de esôfago, câncer cervical, mieloma múltiplo, leucemia, câncer de vesícula biliar, glioblastoma e melanoma.

[0067] A presente divulgação fornece ainda um método para tratar e prevenir doenças ou condições mediadas por CD40 ou CD40L, o método compreendendo o contato de um indivíduo com uma quantidade profilaticamente efetiva ou uma quantidade terapeuticamente efetiva do anticorpo anti-CD40 ou fragmento de ligação ao antígeno do mesmo, o anticorpo multiespecífico, o anticorpo de cadeia única ou a(s) composição(ões) farmacêutica(s) dos mesmos como descrito acima; em particular, a doença ou condição é câncer; em particular, o câncer é selecionado a partir do grupo que consiste em linfoma, câncer de mama, câncer de ovário, câncer de próstata, câncer de pâncreas, câncer de rim, câncer de pulmão, câncer de fígado, câncer gástrico, câncer colorretal, câncer de bexiga, rabdomiossarcoma, câncer de esôfago, câncer cervical, mieloma múltiplo, leucemia, câncer de vesícula biliar, glioblastoma e melanoma.

[0068] A presente divulgação fornece ainda o uso do anticorpo anti-CD40 ou fragmento de ligação ao antígeno do mesmo, o anticorpo multiespecífico, o anticorpo de cadeia única ou a(s) composição(ões) farmacêutica(s) dos mesmos como descrito acima na preparação de um medicamento para melhorar o(s) sintoma(s) de um paciente que sofre de doenças autoimunes.

[0069] A presente divulgação fornece ainda o uso do anticorpo anti-CD40 ou fragmento de ligação ao antígeno do mesmo, o anticorpo multiespecífico, o anticorpo de cadeia única ou a(s) composição(ões) farmacêutica(s) dos mesmos como descrito acima na preparação de um medicamento para melhorar o(s) sintoma(s) de um paciente que sofre de doenças inflamatórias.

BREVE DESCRIÇÃO DOS DESENHOS

[0070] A Figura 1 mostra o efeito de ativação dos anticorpos CD40 anti-humanos murinos em células DC com base na molécula ativadora de CD80.

[0071] A Figura 2 mostra o efeito de ativação dos anticorpos CD40 anti-humanos murinos em células DC com base na molécula ativadora de CD86.

[0072] A Figura 3 mostra a curva de crescimento do tumor de linfoma de Raji transplantado, após co-transplante de linfoma de Raji transplantado com células PBMC e DC humanas.

[0073] A Figura 4 mostra a curva de mudança de peso corporal de camundongos NOG, após co-transplante de linfoma de Raji transplantado com células PBMC e DC humanas em camundongos NOG.

[0074] A Figura 5 mostra a curva de crescimento do tumor após injeção intraperitoneal de uma dose única dos anticorpos anti-CD40 em modelo de camundongo de câncer de cólon MC38.

[0075] A Figura 6 mostra o efeito de ativação dos anticorpos anti-CD40 possuindo mutação(ões) na região constante da cadeia pesada em células DC.

[0076] A Figura 7A e a Figura 7B mostram que os anticorpos anti-CD40 possuindo mutação(ões) na região constante da cadeia pesada ativam as células DC e promovem a produção de citocinas.

DESCRIÇÃO DETALHADA DA INVENÇÃO

1. TERMOS

[0077] A fim de compreender mais prontamente a presente divulgação, certos termos técnicos e científicos são, em particular, definidos abaixo. A menos que claramente indicado em outro lugar no documento, todos os outros termos técnicos e científicos usados neste documento têm o significado comumente entendido por um versado na técnica ao qual a presente divulgação se refere.

[0078] Tal como aqui utilizado, o código de três letras e o código de uma letra para os aminoácidos são conforme descritos em J. Biol. Chem, 243, (1968) p3558.

[0079] Tal como aqui utilizado, "anticorpo" se refere a imunoglobulina, uma estrutura de quatro cadeias de peptídeos ligadas entre si por ligações dissulfeto entre duas cadeias pesadas idênticas e duas cadeias leves idênticas. Diferentes regiões constantes de cadeia pesada de imunoglobulina exibem diferentes composições de aminoácidos e ordens de sequência, portanto, apresentam diferentes tipos de antigenicidade. Consequentemente, as imunoglobulinas podem ser divididas em cinco categorias, ou chamadas de isotipos de imunoglobulina, nomeadamente IgM, IgD, IgG, IgA e IgE; suas cadeias pesadas correspondentes são cadeia µ, cadeia δ, cadeia γ, cadeia α e cadeia ε, respectivamente. De acordo com sua composição de aminoácidos da região de dobradiça e o número e localização das ligações dissulfeto da cadeia pesada, o mesmo tipo de Ig pode ser dividido em diferentes subcategorias, por exemplo, IgG pode ser dividido em IgG1, IgG2, IgG3 e IgG4. As cadeias leves podem ser divididas em cadeias κ ou λ, devido às diferentes regiões constantes. Cada IgG entre os cinco tipos possui cadeia κ ou λ.

[0080] Na presente divulgação, a cadeia leve do anticorpo aqui descrita compreende ainda uma região constante da cadeia leve, que compreende uma cadeia κ, λ humana ou murina ou variante(s) da mesma.

[0081] Na presente divulgação, a cadeia pesada do anticorpo aqui descrita compreende ainda uma região constante da cadeia pesada, que compreende IgG1, IgG2, IgG3, IgG4 humana ou murina ou variante(s) das mesmas.

[0082] A sequência de cerca de 110 aminoácidos perto do terminal N das cadeias pesada e leve do anticorpo é altamente variável, conhecida como região variável (região V); a sequência restante de aminoácidos próxima ao terminal C é relativamente estável, conhecida como região constante (região C). A região variável compreende três regiões hipervariáveis (HVRs) e quatro regiões estruturais relativamente conservadas (FRs). As três regiões hipervariáveis determinam a especificidade do anticorpo, também conhecidas como regiões determinantes de complementaridade (CDRs). Cada região variável de cadeia leve (VL) e cada região variável de cadeia pesada (VH) é composta por três CDRs e quatro FRs, com ordem sequencial do terminal amino para o terminal carboxila sendo: FR1, CDR1, FR2, CDR2, FR3, CDR3 e FR4. Os três CDRs de cadeia leve referem-se a LCDR1, LCDR2 e LCDR3; e os três CDRs de cadeia pesada referem-se a HCDR1, HCDR2 e HCDR3.

[0083] O termo "célula apresentadora de antígeno" ou "APC" é uma célula que exibe um antígeno estranho para formar um complexo com MHC em sua superfície. As células T reconhecem este complexo usando o receptor de células T (TCR). Exemplos de APCs incluem, mas não estão limitados a células dendríticas (DC), células mononucleares de sangue periférico (PBMC), monócitos, linfoblastos B e células dendríticas derivadas de monócitos (DC). O termo "apresentação de antígeno" se refere ao processo durante o qual APCs capturam antígenos e os fazem serem reconhecidos por células T, por exemplo, como um componente de conjugados MHC-I/MHC-II.

[0084] O termo "CD40" inclui qualquer variante ou isoforma de CD40 que é naturalmente expressa por uma célula.

Os anticorpos da presente divulgação podem ter reatividade cruzada com CD40 de espécies não humanas. Alternativamente, os anticorpos também podem ser específicos para CD40 humano e podem não exibir reatividade cruzada com outras espécies.

O CD40 ou qualquer variante ou isoforma do mesmo pode ser isolado a partir de células ou tecidos nos quais são naturalmente expressos ou produzidos por técnicas recombinantes usando técnicas comuns na técnica e aquelas aqui descritas. De um modo preferido, os anticorpos anti- CD40 têm como alvo o CD40 humano com padrão de glicosilação normal.

[0085] O termo "anticorpo murino" na presente divulgação se refere a um anticorpo monoclonal contra CD40 humano preparado de acordo com o conhecimento e habilidades na técnica. Durante a preparação, o indivíduo de teste é injetado com antígeno CD40 e, em seguida, o hibridoma que expressa o anticorpo que mostra as sequências desejadas ou características funcionais é isolado. Em uma modalidade preferida da presente divulgação, o anticorpo CD40 murino ou fragmento de ligação ao antígeno do mesmo pode compreender ainda a região constante da cadeia leve de cadeia κ, λ ou variante das mesmas, ou ainda compreender a região constante da cadeia pesada de IgG1, IgG2, IgG3 ou IgG4 murino ou variante dos mesmos.

[0086] O termo "anticorpo humano" inclui anticorpos possuindo regiões variáveis e constantes de sequências de imunoglobulina de linhagem germinativa humana. Os anticorpos humanos da presente divulgação podem incluir resíduos de aminoácidos que não são codificados por sequências de imunoglobulina da linhagem germinativa humana (tais como mutações introduzidas por mutagênese aleatória ou sítio específica in vitro ou por mutação somática in vivo). No entanto, o termo "anticorpo humano" não inclui tais anticorpos em que as sequências CDR derivadas de outra linhagem germinativa de espécie de mamífero, tal como um camundongo, foram enxertadas na sequência estrutural humana (isto é, "anticorpo humanizado").

[0087] O termo "anticorpo humanizado", também conhecido como anticorpo enxertado com CDR, se refere a um anticorpo gerado por enxerto de sequências de CDR não humanas em uma estrutura de região variável de um anticorpo humano. O anticorpo humanizado supera a forte resposta imunológica induzida pelo anticorpo quimérico que carrega uma grande quantidade de componentes de proteína heteróloga. Para evitar a diminuição da atividade causada pela redução da imunogenicidade, a região variável do anticorpo é submetida a uma retromutação mínima para manter a atividade.

[0088] O termo "anticorpo quimérico" é um anticorpo que é formado pela fusão da região variável de um anticorpo de primeira espécie (tal como murino) com a região constante de outra espécie de anticorpo (tal como humano), de modo a aliviar a resposta imune induzida pelo anticorpo heterólogo.

Para estabelecer um anticorpo quimérico murino-humano, um hibridoma secretor de anticorpo monoclonal murino específico é primeiro estabelecido, genes de região variável são então clonados a partir de células de hibridoma murino e, em seguida, genes de região constante de anticorpo humano são clonados, os genes de região variável murina são ligados com genes da região constante humana para formar um gene quimérico que pode ser inserido em um vetor humano e, finalmente, a molécula de anticorpo quimérico é expressa em um sistema industrial eucariótico ou procariótico. A região constante do anticorpo humano é selecionada a partir da região constante da cadeia pesada derivada de IgG1, IgG2, IgG3 ou IgG4 humana ou variante(s) das mesmas; e de um modo preferido compreende a região constante da cadeia pesada derivada de IgG1 ou IgG2 humana.

[0089] O termo "fragmento de ligação ao antígeno", referido como fragmentos de ligação ao antígeno de um anticorpo ou análogos de anticorpos, geralmente compreende pelo menos parte das regiões de ligação ao antígeno ou regiões variáveis (por exemplo, um ou mais CDRs) de um anticorpo parental. Os fragmentos de anticorpos retêm, pelo menos, a especificidade de ligação parcial do anticorpo parental. Geralmente, quando a atividade é expressa em mol, o fragmento de anticorpo retém pelo menos 10% da atividade de ligação parental. De um modo preferido, o fragmento de anticorpo retém pelo menos 20%, 50%, 70%, 80%, 90%, 95% ou mais da afinidade de ligação do anticorpo parental para o alvo. Exemplos de fragmentos de ligação ao antígeno incluem, mas não estão limitados a: Fab, Fab', F(ab')2, fragmento Fv, anticorpo linear, anticorpo de cadeia única, nanocorpo, anticorpo de domínio e anticorpo multiespecífico. Variantes modificadas de anticorpos são revisadas em Holliger e Hudson (2005) Nat. Biotechnol. 23: 1126-1136.

[0090] O "fragmento Fab" consiste em uma cadeia leve e um CH1 e região variável de cadeia pesada. A cadeia pesada de uma molécula Fab não pode formar uma ligação dissulfeto com outra molécula de cadeia pesada.

[0091] A região "Fc" compreende dois fragmentos de cadeia pesada com domínios CH2 e CH3 do anticorpo. Os dois fragmentos de cadeia pesada são mantidos juntos por duas ou mais ligações dissulfeto e também por interação hidrofóbica do domínio CH3.

[0092] O "fragmento F(ab')2" compreende duas cadeias leves e duas cadeias pesadas compreendendo a porção da região constante entre os domínios CH1 e CH2, formando assim uma ligação dissulfeto intercadeias entre as duas cadeias pesadas. Portanto, o fragmento F(ab')2 é composto por dois fragmentos Fab' mantidos juntos por uma ligação dissulfeto entre as duas cadeias pesadas.

[0093] A "região Fv" compreende regiões variáveis de ambas as cadeias pesadas e leves, mas não tem a região constante.

[0094] O termo "anticorpo multiespecífico" é usado no seu sentido mais amplo para abranger anticorpos com especificidade de múltiplos epítopos. Estes anticorpos multiespecíficos envolvem, mas não estão limitados a, anticorpos que compreendem uma região variável de cadeia pesada (VH) e uma região variável de cadeia leve (VL), em que a unidade VH-VL tem especificidade de múltiplos epítopos; anticorpos com duas ou mais regiões VL e VH, cada unidade VH-VL se ligando a um alvo diferente ou epítopo diferente do mesmo alvo; anticorpos tendo duas ou mais regiões variáveis únicas, cada região variável única se ligando a um alvo diferente ou epítopo diferente do mesmo alvo; anticorpos de comprimento total, fragmentos de anticorpos, diacorpos, diacorpos biespecíficos e triacorpos, fragmentos de anticorpos que foram ligados covalentemente ou não covalentemente e semelhantes.

[0095] No contexto deste pedido, quando se refere a uma posição de mutação da região constante da cadeia pesada, o termo "posição(ões) n correspondendo à SEQ ID NO: m" ou "posição(ões) n da SEQ ID NO: m" significa: em diferentes sistemas de numeração de anticorpos, um local de mutação é comparável ou equivalente à posição n da SEQ ID NO: m, em termos de posição. Os especialistas sabem que os sistemas de numeração de anticorpos atuais incluem, mas não estão limitados a UE, Kabat, Chothia, IMGT (Lefranc, 2003) e AHo (Honegger e Plückthun, 2001) e assim por diante. Quando uma certa posição é definida como posição “n” de acordo com um sistema de numeração, ela pode ser definida como posição n' de acordo com outro sistema de numeração. Os especialistas podem determinar facilmente a relação correspondente entre locais específicos de acordo com diferentes sistemas de numeração (por exemplo, numeração da UE) com base no conhecimento comum.

[0096] O termo "conjugado anticorpo-fármaco" (ADC) se refere a uma ou mais moléculas sintetizadas quimicamente (incluindo, mas não se limitando a agentes citotóxicos) conjugadas a um anticorpo ou fragmento de anticorpo.

[0097] O termo "anticorpo de cadeia única" é uma proteína recombinante de cadeia única ligada por um peptídeo ligante entre a região variável de cadeia pesada (VH) e a região variável de cadeia leve (VL) de um anticorpo. É o menor fragmento de anticorpo com sítios de ligação ao antígeno completos.

[0098] O termo "fragmento de anticorpo de domínio" é um fragmento de imunoglobulina com função imunológica, que compreende apenas uma região variável de cadeia pesada ou uma cadeia de região variável de cadeia leve. Em alguns casos, duas ou mais regiões VH são covalentemente ligadas a um ligante de peptídeo para formar um fragmento de anticorpo de domínio bivalente. Duas regiões VH do fragmento de anticorpo de domínio bivalente podem ter como alvo os mesmos antígenos ou antígenos diferentes.

[0099] O termo "ligação ao CD40" na presente divulgação se refere à habilidade de interagir com o CD40 humano. O termo "sítio(s) de ligação ao antígeno" na presente divulgação se refere a um sítio espacial tridimensional discreto em um antígeno que pode ser reconhecido pelo anticorpo ou fragmento de ligação ao antígeno da presente divulgação.

[00100] O termo "epítopo" se refere a um local em um antígeno que é especificamente ligado por uma imunoglobulina ou anticorpo. Os epítopos podem ser formados a partir de aminoácidos adjacentes ou aminoácidos não adjacentes, mas justapostos por dobramento terciário da proteína. Os epítopos formados a partir de aminoácidos adjacentes são normalmente retidos após a exposição ao solvente desnaturante; no entanto, os epítopos formados por dobramento terciário são tipicamente perdidos após o tratamento com solvente desnaturante. Os epítopos geralmente têm uma conformação espacial única, incluindo pelo menos 3 a 15 aminoácidos. Os métodos para determinar qual epítopo está ligado a um determinado anticorpo são bem conhecidos na técnica, incluindo imunotransferência e ensaios de imunoprecipitação e semelhantes. Os métodos para determinar a conformação espacial de um epítopo incluem técnicas na arte e técnicas aqui descritas, tais como cristalografia de raios-X e ressonância magnética nuclear bidimensional e semelhantes.

[00101] Conforme usado na presente divulgação, os termos "ligar especificamente" e "ligar seletivamente" se referem à ligação de um anticorpo a um epítopo em um antígeno predeterminado. Normalmente, quando o CD40 humano é usado como um analito e um anticorpo é usado como um ligante, o anticorpo se liga a um antígeno predeterminado a uma constante de dissociação de equilíbrio (KD) inferior a cerca de 10-7 M ou até menos, conforme medido por técnicas de ressonância plasmônica de superfície (SPR) em um instrumento, e a afinidade do anticorpo para a ligação a um antígeno predeterminado é pelo menos duas vezes maior do que para a ligação a um antígeno não específico diferente do antígeno predeterminado ou antígeno intimamente relacionado (tal como BSA, etc). O termo "anticorpo que reconhece um antígeno" pode ser usado intercambiavelmente aqui com o termo "anticorpo que se liga especificamente a".

[00102] O termo "reatividade cruzada" se refere à capacidade de um anticorpo da presente divulgação para se ligar ao CD40 de uma espécie diferente. Por exemplo, um anticorpo da presente divulgação que se liga ao CD40 humano também pode se ligar ao CD40 de outra espécie. A reatividade cruzada é medida pela detecção da reatividade específica com antígenos purificados em ensaios de ligação (por exemplo, SPR e ELISA), ou pela detecção da ligação ou interações funcionais com células que expressam CD40 fisiologicamente.

Os métodos para determinar a reatividade cruzada incluem ensaios de ligação padrão como aqui descritos, tais como análise de ressonância plasmônica de superfície (SPR) ou citometria de fluxo.

[00103] O termo "inibição" ou "bloqueio" pode ser usado indistintamente e abrange inibição/bloqueio parcial e completo. De um modo preferido, a inibição/bloqueio de um ligante pode reduzir o nível normal ou alterar o tipo de atividade quando a ligação do ligante ocorre sem inibição ou bloqueio. A inibição e o bloqueio também se destinam a incluir qualquer diminuição mensurável da afinidade de ligação ao ligante quando em contato com um anticorpo anti- CD40, em comparação com aquele quando não contatado com um anticorpo anti-CD40.

[00104] O termo "inibir o crescimento" (por exemplo, quando se refere a células) destina-se a incluir qualquer diminuição mensurável no crescimento celular.

[00105] Os termos "indução de uma resposta imune" e "aumento de uma resposta imune" são usados indistintamente e se referem à estimulação (isto é, passiva ou adaptativa) de uma resposta imune a um antígeno particular. No contexto do CDC ou ADCC, o termo "indução" se refere à estimulação de um mecanismo citotóxico direto particular.

[00106] Conforme usado na presente divulgação, o termo "ADCC", nomeadamente citotoxicidade mediada por células dependente de anticorpos, se refere a que as células que expressam receptores Fc matam diretamente as células alvo revestidas por um anticorpo, reconhecendo o segmento Fc do anticorpo. A função efetora ADCC do anticorpo pode ser reduzida ou eliminada pela modificação do segmento Fc de IgG. A modificação se refere a mutações na região constante da cadeia pesada do anticorpo, tais como mutações selecionadas a partir de N297A, L234A, L235A em IgG1; Quimera IgG2/4; ou mutação F235E ou L234A/E235A em IgG4.

[00107] Os métodos para a produção e purificação de anticorpos e fragmentos de ligação ao antígeno são bem conhecidos na técnica e podem ser encontrados, por exemplo, em Antibody Experimental Technology Guide of Cold Spring Harbor, Capítulos 5-8 e 15. Por exemplo, camundongos podem ser imunizados com CD40 humano, ou fragmentos dos mesmos e os anticorpos resultantes podem então ser renovados, purificados e sequenciados usando métodos convencionais bem conhecidos na técnica. Os fragmentos de ligação ao antígeno também podem ser preparados por métodos convencionais. O anticorpo ou o fragmento de ligação ao antígeno da presente divulgação é geneticamente modificado para introduzir uma ou mais regiões estruturais humanas (FRs) em um CDR derivado não humano. As sequências da linhagem germinativa FR humana podem ser obtidas na ImMunoGeneTics (IMGT) através do seu website http://imgt.cines.fr ou no The Immunoglobulin FactsBook, 2001ISBN012441351.

[00108] O anticorpo modificado ou fragmento de ligação ao antígeno da presente divulgação pode ser preparado e purificado usando métodos convencionais. Por exemplo, a sequência de cDNA que codifica o anticorpo correspondente pode ser clonada e recombinada em um vetor de expressão GS.

O vetor de expressão de imunoglobulina recombinante pode então transfectar células CHO de forma estável. Como um método mais recomendado bem conhecido na técnica, o sistema de expressão de mamífero resultará na glicosilação do anticorpo, tipicamente no terminal N altamente conservado na região de FC. Os clones estáveis são obtidos através da expressão de um anticorpo que se liga especificamente ao antígeno humano. Os clones positivos podem ser expandidos em um meio de cultura sem soro para a produção de anticorpos em biorreatores. O meio de cultura, para o qual um anticorpo foi secretado, pode ser purificado e coletado por técnicas convencionais. O anticorpo pode ser filtrado e concentrado usando técnicas comuns. A mistura solúvel e o agregado podem ser efetivamente removidos por técnicas comuns, incluindo exclusão por tamanho ou troca iônica. O produto obtido pode ser imediatamente congelado, por exemplo a -70°C, ou pode ser liofilizado.

[00109] O anticorpo da presente divulgação se refere a um anticorpo monoclonal. O anticorpo monoclonal (mAb) da presente divulgação se refere a um anticorpo obtido a partir de um único clone de cepa celular, e a cepa celular não está limitada a uma cepa de células clonais eucarióticas, procarióticas ou fágicas. Os anticorpos monoclonais ou fragmentos de ligação ao antígeno podem ser obtidos de forma recombinante usando, por exemplo, técnicas de hibridoma, técnica recombinante, técnica de exibição de fago, técnica sintética (por exemplo, enxerto de CDR) ou outras técnicas na técnica anterior.

[00110] "Administração", "administrar" e "tratamento", conforme aplicado a um animal, humano, indivíduo experimental, célula, tecido, órgão ou fluido biológico, se referem ao contato de um produto farmacêutico exógeno, agente terapêutico, agente de diagnóstico, ou composição com o animal, humano, indivíduo, célula, tecido, órgão ou fluido biológico. "Administração", "administrar" e "tratamento" podem referir-se, por exemplo, a métodos terapêuticos, farmacocinéticos, diagnósticos, de pesquisa e experimentais. O tratamento de uma célula envolve o contato de um reagente com a célula, bem como o contato de um reagente com um fluido, em que o fluido está em contato com a célula.

"Administração", "administrar" e "tratamento" também significam tratamentos in vitro e ex vivo, por exemplo, de uma célula, por um reagente, diagnóstico, composição ou por outra célula. "Tratamento", conforme se aplica a um ser humano, veterinário ou um indivíduo a ser estudado, se refere ao tratamento terapêutico, medidas profiláticas ou preventivas, aplicações de pesquisa e diagnóstico.

[00111] "Tratar" significa administrar um agente terapêutico, tal como uma composição compreendendo qualquer um dos anticorpos ou fragmento de ligação ao antígeno do mesmo na presente divulgação, interna ou externamente a um indivíduo com um ou mais sintomas de doença para os quais o agente tem atividade terapêutica conhecida. Normalmente, o agente é administrado em uma quantidade efetiva para aliviar um ou mais sintomas da doença no indivíduo tratado ou coorte de indivíduos, independentemente de induzir a regressão de tal(is) sintoma(s) ou inibir a progressão para qualquer grau clinicamente não mensurável.

[00112] A quantidade de um agente terapêutico que é efetivo para aliviar qualquer sintoma de doença particular (também referido como "quantidade terapeuticamente eficaz") pode variar de acordo com fatores tais como o estado de doença, idade e peso do indivíduo, e a capacidade do agente para obter uma resposta desejada no indivíduo. Se um sintoma de doença foi aliviado pode ser avaliado por qualquer medição clínica normalmente usada por médicos ou outros profissionais de saúde qualificados para avaliar a gravidade ou o estado de progressão desse sintoma. Mesmo se uma modalidade da presente divulgação (por exemplo, um método de tratamento ou artigo de fabricação) não for efetivo em aliviar o(s) sintoma(s) da doença de interesse em cada indivíduo, ela alivia o(s) sintoma(s) da doença alvo de interesse em um número estatisticamente significativo de indivíduos, conforme determinado por qualquer teste estatístico conhecido na técnica (tal como o teste t de Student, o teste do qui-quadrado, o teste U de acordo com Mann e Whitney, o teste de Kruskal-Wallis (H-teste), teste de Jonckheere-Terpstra e teste de Wilcoxon).

[00113] "Modificação conservativa" ou "substituição ou reposição conservativa" significa que um aminoácido com características semelhantes (tais como carga, tamanho da cadeia lateral, hidrofobicidade/hidrofilicidade, conformação da cadeia principal e rigidez etc.) pode ser usado para substituir um aminoácido em uma proteína; tal substituição pode ser frequentemente realizada sem alterar a atividade biológica da proteína.

Aqueles versados na técnica sabem que, de um modo geral, a substituição por um único aminoácido em uma região não essencial de um polipeptídeo não altera substancialmente a atividade biológica (ver, por exemplo, Watson et al. (1987) Molecular

Biology of the Gene, The Benjamin/Cummings Pub.

Co., página

224, 4ª edição). Além disso, é improvável que a substituição do aminoácido com estrutura ou função semelhante interrompa a atividade biológica.

As substituições conservativas comuns de aminoácidos são as seguintes:

Resíduo Substituintes exemplares Substituintes original preferidos

Ala (A) Val, Leu, Ile Val

Arg (R) Lys, Gln, Asn Lys

Asn (N) Gln, His, Asp, Lys, Arg Gln

Asp (D) Glu, Asn Glu

Cys (C) Ser, Ala Ser

Gln (Q) Asn, Glu Asn

Glu (E) Asp, Gln Asp

Gly (G) Ala Ala

His (H) Arg, Asn, Gln, Lys Arg

Ile (I) Leu, Val, Met, Ala, Phe, Leu Norleucine Leu (L) Ile, Norleucina, Val, Ile Met, Ala, Phe Lys (K) Arg, Gln, Asn Arg Met (M) Leu, Phe, Ile Leu Phe (F) Tyr, Leu, Val, Ile, Ala Tyr Pro (P) Ala Ala Ser (S) Thr Thr Thr (T) Ser Ser Trp (W) Tyr, Phe Tyr Tyr (Y) Phe, Trp, Thr, Ser Phe Val (V) Leu, Ile, Met, Phe, Ala, Leu.

Norleucina

[00114] "Quantidade efetiva" envolve uma quantidade suficiente para melhorar ou prevenir um sintoma ou sinal de uma condição médica. Quantidade efetiva também significa uma quantidade suficiente para permitir ou facilitar o diagnóstico. Uma quantidade efetiva para um determinado indivíduo ou indivíduo veterinário pode variar dependendo de fatores tais como a condição a ser tratada, a saúde geral do indivíduo, a via e a dose de administração e a gravidade dos efeitos colaterais. Uma quantidade efetiva pode ser a dose máxima ou o regime de dosagem que evita efeitos colaterais significativos ou efeitos tóxicos.

[00115] "Exógeno" se refere a substâncias que são produzidas fora de um organismo, célula ou corpo humano, dependendo do contexto.

[00116] "Endógeno" se refere a substâncias que são produzidas dentro de um organismo, célula ou corpo humano, dependendo do contexto.

[00117] "Homologia" se refere à similaridade de sequência entre duas sequências de polinucleotídeos ou entre dois polipeptídeos. Quando as posições nas duas sequências comparadas são ocupadas pela mesma base ou resíduo de aminoácido (por exemplo, se cada posição de duas moléculas de DNA é ocupada por adenina), então as moléculas são consideradas homólogas nessa posição. A homologia percentual entre duas sequências é uma função do número de posições correspondentes ou homólogas compartilhadas por duas sequências dividido pelo número de todas as posições a serem comparadas × 100%. Por exemplo, em um alinhamento de sequência ideal, se 6 das 10 posições em duas sequências corresponderem uma à outra ou forem homólogas, então as duas sequências serão consideradas 60% homólogas. De um modo geral, a comparação é realizada quando duas sequências são alinhadas para obter a porcentagem ótima de homologia.

[00118] Tal como aqui utilizadas, as expressões "célula", "linhagem celular" e "cultura celular" são utilizadas intercambiavelmente e todas essas designações incluem a sua descendência. Assim, o termo "célula transformada" se refere à célula primária do indivíduo e culturas derivadas da mesma, sem considerar o número de passagens. É também entendido que toda a progênie pode não ser precisamente idêntica no aspecto do componente e/ou conteúdo do DNA, devido a mutações deliberadas ou indeliberadas. A progênie mutante que tem a mesma função ou atividade biológica da célula original também é abrangida por este termo.

[00119] "Opcional" ou "opcionalmente" significa que o evento ou situação que se segue pode, mas não necessariamente, ocorrer, e a descrição inclui as instâncias em que o evento ou circunstância ocorre ou não. Por exemplo, "opcionalmente compreende 1 a 3 regiões variáveis da cadeia pesada do anticorpo" significa que a região variável de cadeia pesada do anticorpo com sequência específica pode estar, mas não necessariamente, presente.

EXEMPLOS

[00120] Os exemplos seguintes são usados para descrever melhor a presente invenção, mas estes exemplos não limitam o escopo da presente invenção. Os métodos experimentais que não especificam condições específicas nos exemplos da presente invenção geralmente seguem condições convencionais, tais como Antibodies: A Laboratory Manual, Molecular Cloning Manual from Cold Spring Harbor; ou de acordo com as condições recomendadas pelo fabricante dos materiais ou produtos. Os reagentes para os quais as fontes não são especificamente indicadas são reagentes convencionais comercialmente disponíveis.

EXEMPLO 1 AS SEQUÊNCIAS E PREPARAÇÃO DE ANTÍGENO IMUNE

E ANTÍGENO DE VARREDURA

[00121] Proteína recombinante CD40 humana marcada com His (h-CD40-his), proteína recombinante CD40 humana marcada com Fc (h-CD40-Fc), proteína recombinante CD40 de camundongo marcada com His (m-CD40-his) e proteína recombinante CD40 de macaco rhesus marcado com His (rhesus-CD40-his) (# CD0- C52H7) foram todos reagentes de proteína comercial purificados adquiridos da Acrobiosystems, e cada fonte de sequência é mostrada na Tabela 1. Os reagentes de proteína podem ser usados em cada teste dos exemplos a seguir.

Tabela 1. Fontes para sequências de aminoácidos de proteínas recombinantes Nome Sequência de aminoácidos No. de acesso (do início ao fim) do Genbank h-CD40-his Glu21-Arg193 AAH12419.1 h-CD40-Fc Glu21-Arg193 NP_001241.1 m-CD40-his Val24-Arg193 P27512 rhesus-CD40-his Glu21-Arg193 NP_001252791.1 EXEMPLO 2 PREPARAÇÃO DE HIBRIDOMA DE ANTICORPO

[00122] O anticorpo monoclonal CD40 anti-humano foi produzido imunizando camundongos. Camundongo de laboratório C57BL/6: fêmea, de 6 a 8 semanas de idade (JOINN Laboratories (Suzhou) New Medicament Research Center Co., Ltd., número de licença de produção animal: 201503259). Ambiente de reprodução: nível SPF.

[00123] Após a compra dos camundongos, os mesmos foram mantidos em ambiente de laboratório por 1 semana, ajustado para ciclo claro/escuro de 12/12 horas; a uma temperatura de 20-25ºC; com umidade de 40-60%. Os camundongos adaptados foram divididos em 2 gaiolas, 5 em cada gaiola.

[00124] O antígeno imune é uma proteína recombinante humana-CD40 modificada com uma marcação Fc (h-CD40-Fc, preparada em uma solução tampão de fosfato, a 1μg/μl). A emulsificação foi realizada com adjuvante de Freund (Sigma, Lote No.: F5881/F5506): adjuvante completo de Freund (CFA) para a primeira emulsificação; e adjuvante de ácido nucleico (CpG, Sangon Biotech) e alumínio injetável (Imject Alum, Thermo, Lot No.: PH203866) para as imunizações de reforço de repouso. A data de imunização foi no dia 0, 14, 28, 42, 56 e 70. O sangue foi coletado para teste de sangue no dia 21, 35, 49, 63 e 77. O soro de camundongo foi detectado pelo método ELISA para determinar o título do anticorpo no soro de camundongo.

[00125] Após a quarta imunização, o camundongo com um título de anticorpo alto e estável foi selecionado para a fusão de células do baço. 3 dias antes da fusão, a imunização de reforço foi realizada por injeção intraperitoneal (IP) de 10 μg/camundongo de antígeno formulado em solução tampão de fosfato. Etapas de fusão mediadas por PEG otimizadas foram usadas para fundir linfócitos esplênicos e células de mieloma Sp2/0 (ATCC® CRL-8287™) para obter células de hibridoma, e cinco linhagens de células de hibridoma monoclonais mostrando atividade in vitro favorável foram selecionadas.

EXEMPLO 3 ENSAIO DE LIGAÇÃO DE ELISA

[00126] O ensaio ELISA foi usado para detectar as propriedades de ligação de anticorpos anti-CD40. A proteína CD40 recombinante foi diretamente revestida com a marcação his. Depois que o anticorpo foi adicionado, um anticorpo secundário (anticorpo anti-Fc conjugado com HRP) e substrato TMB de HRP foram adicionados para detectar a atividade de ligação do anticorpo ao antígeno.

[00127] A proteína CD40-his humana ou de macaco rhesus foi revestida em uma placa de microtitulação de 96 cavidades, 100 μl por cavidade a uma concentração de 0,5 μg/mL e incubada durante a noite a 4°C. A placa foi lavada com tampão de lavagem três vezes, 250 μl por cavidade. A placa foi agitada durante 10 segundos durante cada lavagem para garantir uma lavagem suficiente. Solução de bloqueio de 200 μl/cavidade foi adicionada e incubada em temperatura ambiente por 2 horas. A placa foi lavada com tampão de lavagem três vezes, 250 μl por cavidade. A placa foi agitada durante 10 segundos durante cada lavagem para garantir uma lavagem suficiente. 100 μl de anticorpo anti-CD40 a ser testado diluído com diluente foram adicionados a cada cavidade e incubados por 1 hora em temperatura ambiente. A placa foi lavada com tampão de lavagem três vezes, 250 μl por cavidade. 100 μl de anticorpo secundário de IgG de cabra anti-humano marcado com HRP diluído a 1:20000 com um diluente foi adicionado a cada cavidade, e incubado por 1 hora em temperatura ambiente. A placa foi lavada com tampão de lavagem três vezes, 250 μl por cavidade. 100 μl de TMB foram adicionados a cada cavidade e a reação foi realizada por 15 minutos no escuro. 50 μl de ácido sulfúrico 0,16 M foram adicionados a cada cavidade. O leitor de microplaca Thermo MultiSkanFc foi usado para ler o valor de OD abaixo de 450 nm, e o valor de EC50 para cada anticorpo CD40 para ligação ao CD40 foi calculado.

Tabela 2. Resultados do ensaio de ligação ELISA de anticorpos de hibridoma murino contra CD40 de diferentes linhagens germinativas Cepa de ELISA EC50 (ng/mL) anticorpo hCD40-his Rhesus CD40-his murino CD40-his

1D9 10,01 9,808 sem ligação 2H6 7,063 7,207 sem ligação 9E5 5,996 6,704 sem ligação 14C10 8,808 9,494 sem ligação 38B4 12,9 11,81 sem ligação EXEMPLO 4 TESTE DE ANTICORPO ANTI-CD40 BLOQUEANDO A LIGAÇÃO ENTRE CD40 E CD40L

[00128] Neste teste, através de um ensaio de bloqueio in vitro, os anticorpos CD40 anti-humano assim selecionados foram testados quanto ao bloqueio da ligação entre o CD40 humano e o CD40L humano.

[00129] O método particular era o seguinte: a proteína recombinante de CD40 marcada com Fc (h-CD40-Fc) foi revestida em uma placa de microtitulação de 96 cavidades, o anticorpo anti-CD40 foi adicionado para se ligar totalmente e ocupar os epítopos, e então o CD40L marcado com his foi adicionado e o marcador His foi detectado para calcular a quantidade de ligação de CD40 ao CD40L, e o valor IC50 para o anticorpo CD40 para bloquear os locais de atividade de CD40 foi calculado.

[00130] A proteína CD40-Fc humana foi revestida em uma placa de microtitulação de 96 cavidades, 100 μl por cavidade a uma concentração de 1 μg/mL e incubada durante a noite a 4°C. A placa foi lavada com tampão de lavagem três vezes, 250 μl por cavidade. A placa foi agitada durante 10 segundos durante cada lavagem para garantir uma lavagem suficiente. Solução de bloqueio de 200 μl/cavidade foi adicionada e incubada em temperatura ambiente por 2 horas.

A placa foi lavada com tampão de lavagem três vezes, 250 μl por cavidade. A placa foi agitada durante 10 segundos durante cada lavagem para garantir uma lavagem suficiente. 100 μl de anticorpo anti-CD40 a ser testado diluído com diluente foram adicionados a cada cavidade e incubados por 1 hora em temperatura ambiente. A placa foi lavada com tampão de lavagem três vezes, 250 μl por cavidade. 100μl de CD40L-his diluído foram adicionados a cada cavidade e incubados por 1 hora em temperatura ambiente. A placa foi lavada com tampão de lavagem três vezes. 100 μl de anticorpo secundário com marcação anti-his etiquetado com HRP diluído a 1: 2000 com um diluente foi adicionado a cada cavidade e incubado por 1 hora em temperatura ambiente. A placa foi lavada com tampão de lavagem três vezes, 250 μl por cavidade. 100 μl de TMB foram adicionados a cada cavidade e a reação foi realizada por 15 minutos no escuro. 50 μl de ácido sulfúrico 0,16 M foram adicionados a cada cavidade. O leitor de microplaca Thermo MultiSkanFc foi usado para ler o valor de OD abaixo de 450 nm, e o valor de IC50 para o anticorpo CD40 para bloquear a ligação de CD40 a CD40L foi calculado.

Tabela 3. Resultados do ensaio ELISA para bloquear a ligação de hCD40/hCD40L humano Cepa de anticorpo IC50 (μg/mL) 1D9 0,2634 2H6 0,2682 9E5 0,2787 14C10 0,3001 38B4 0,2934 EXEMPLO 5 DETERMINAÇÃO DE AFINIDADE POR BIACORE

[00131] De acordo com o método descrito nas instruções disponíveis no Kit Anti-captura Humano (Cat. # BR-1008-39, GE), o anticorpo anti-captura humano foi covalentemente acoplado ao chip de biossensor CM5 do instrumento Biacore (Biacore X100, GE), uma certa quantidade de anticorpos quiméricos ou humanizados a serem testados foi capturada por afinidade e, em seguida, uma série de gradientes de concentração do antígeno CD40 (antígeno CD40 adquirido da Acrobiosystems) fluiu através da superfície do chip. O instrumento Biacore (Biacore X100, GE) foi utilizado para detectar o sinal de reação em tempo real, obtendo assim as curvas de associação e dissociação. Após a conclusão de cada ciclo de dissociação, o biochip foi lavado e regenerado com uma solução de regeneração fornecida pelo Kit Anti-captura Humano. O kit de acoplamento amino utilizado no teste foi adquirido da GE (Cat. # BR-1000-50, GE), e HBS-EP + solução tampão 10 × (Cat. # BR-1006-69, GE) foi diluído para 1 × (pH 7,4) com água bidestilada.

[00132] Os dados obtidos no teste foram ajustados a um modelo de ligação (1:1) usando o software de avaliação BiacoreX1002.0 GE, e o valor de afinidade foi obtido, conforme mostrado na Tabela 10 e Tabela 11.

EXEMPLO 6 TESTE DE ATIVIDADE DE ANTICORPO ANTI-CD40 NO

GENE REPÓRTER EM CÉLULAS

[00133] As células HEK-Blue CD40L foram adquiridas da Invivogen (Cat # hkb-cd40). As células foram transfectadas de forma estável com o gene CD40 humano e genoma SEAP mediado por NF-kB. SEAP secretado no sobrenadante pode ser detectado pelo substrato SEAP QUANTI-Blue, para caracterizar o nível de ativação da via de sinalização de CD40. Neste teste, foi detectada a ativação de células HEK-Blue CD40L, e a atividade in vitro de anticorpos CD40 foi avaliada na célula de acordo com a EC50.

[00134] As células HEK-Blue CD40L foram cultivadas em meio DMEM compreendendo 10% de FBS, 100 μg/mL de Zeocina e 30 μg/mL de Blasticidina, e subcultivadas de 2 a 3 vezes por semana em uma proporção de passagem de 1:5 ou de 1:10.

Durante a subcultura, o meio foi removido, a camada de células foi lavada com 5 mL de 0,25% de tripsina, em seguida, a tripsina foi removida, as células foram incubadas em uma incubadora por 3 a 5 minutos e, em seguida, meio fresco foi adicionado para ressuspender as células. 100 μL de suspensão de células foram adicionados a uma placa de cultura de células de 96 cavidades a uma densidade de 5 × 105 células/mL.

O meio era DMEM compreendendo 10% de FBS, 100 μg/mL de Zeocina de bleomicina e 30 μg/mL de blasticidina, e 100 μl de água estéril sozinha foi adicionado às cavidades periféricas da placa de 96 cavidades. A placa de cultura foi incubada em uma incubadora por 24 horas (37°C, 5% de CO2).

Uma vez observada a aderência das células, 100 μl do anticorpo a ser testado em um gradiente de diluições foram adicionados a cada cavidade. A placa de cultura foi incubada em uma incubadora por 20-24 horas (37°C, 5% de CO2). 40μl de sobrenadante celular foram transferidos de cada cavidade para uma nova placa de fundo plano de 96 cavidades, 160μl de solução de substrato QUANTI-Blue foram adicionados e a placa de cultura foi incubada em uma incubadora no escuro por 1-3 horas. A absorbância a 620 nm foi medida com um leitor de microplaca (Thermo MultiSkanFc), e o valor de EC50 foi calculado para avaliar a atividade do anticorpo CD40 in vitro nas células.

Tabela 4. Resultados do teste de atividade do anticorpo anti-CD40 no gene repórter nas células

Cepa de teste de atividade em células HEK293-CD40L, anticorpo EC50 (μg/mL) 1D9 +++ 0,01454 2H6 +++ 0,01511 9E5 ++ 0,01712 14C10 +++ 0,01087 38B4 ++ 0,0365 EXEMPLO 7 TESTE DE ANTICORPO ANTI-CD40 PARA ATIVAR

CÉLULAS DC

[00135] PBMCs foram isolados a partir do sangue periférico de um indivíduo humano normal e, em seguida, os monócitos foram classificados usando esferas MACS de CD14.

Meio RPMI 1640 compreendendo 10 ng/mL de IL4 e 100 ng/mL de GM-CSF foi adicionado para cultivo durante 6 dias para induzir células MoDC (células dendríticas derivadas de monócitos). As células foram coletadas após 6 dias, 1 × 105 células foram tomadas e coradas com CD209-PE, CD1a- PerCP/Cy5.5 e CD14-PE/Cy7 para analisar se MoDC foi induzido com sucesso por FACS (as operações acima são de rotina operações na técnica).

[00136] As DCs induzidas com sucesso foram coletadas, cada anticorpo a ser testado e o anticorpo de controle foram adicionados, e o gradiente de diluição correspondente de concentrações foi estabelecido (ver Figura 1 para o gradiente de concentrações de anticorpo). Após cultivo por 48 horas, as células foram coletadas e coradas para CD80, CD86 e HLA- DR, e os dados foram coletados por FACS.

[00137] De acordo com os dados de um teste de ativação de células DC primárias, todos os cinco anticorpos murinos apresentaram atividade óbvia na ativação das moléculas CD80 e CD86 na superfície das células DC, de forma dose- dependente. O efeito geral foi comparável, equivalente a, ou mesmo ligeiramente melhor do que aquele dos dois anticorpos de controle (CP-870.893 da Pfizer e ADC-1013 da Alligator Bioscience) (ver Figura 1 e Figura 2).

EXEMPLO 8 CLONAGEM E SEQUÊNCIA DE ANTICORPO ANTI-CD40

[00138] Os subclones de hibridoma dos 5 anticorpos identificados na triagem acima foram tomados, as células de hibridoma na fase de crescimento logarítmico foram coletadas; O RNA foi extraído com Trizol (Invitrogen, 15596- 018) (seguindo as instruções do kit) e a transcrição reversa (PrimeScript™ Reverse Transcriptase, Takara, cat # 2680A) foi realizada. O cDNA obtido por transcrição reversa foi amplificado por PCR usando Ig-Primer Set de camundongo (Novagen, TB326 Rev.B0503), e entregue a uma empresa para sequenciamento. Finalmente, as sequências de 5 anticorpos murinos foram obtidas.

[00139] (1) As sequências da região variável de cadeia pesada e de cadeia leve do anticorpo monoclonal murino 2H6 são as seguintes: 2H6 HCVR

QVQLQQSGAELVRPGTSVKVSCKASGYAFSDYLIEWAKQRPGQGLEWIGVINPG

SGGSNYNEKIKDRATLTADKSSSTAYMQLSSLTSEDSAVYFCARGGGGFTYWGQGTLVT VSA (SEQ ID NO: 1); 2H6 LCVR

EIQLTQTTSSLSASLGDRVTISCRASQDISNYLNWYQQKPDGTIKLLLNFASRL HSGVPSRFSGSGSGTDFFLTISNLEQDDIATYFCQQGSTLPWTFGGGTKLEIK (SEQ ID NO: 2);

[00140] As sequências de CDR aí incluídas são mostradas na Tabela 5 abaixo: Tabela 5. Sequências de CDR de 2H6 Nome Sequência SEQ ID NO HCDR1 GYAFSDYLIE SEQ ID NO: 3 HCDR2 VINPGSGGSNYNEKIKD SEQ ID NO: 4 HCDR3 GGGGFTY SEQ ID NO: 5 LCDR1 RASQDISNYLN SEQ ID NO: 6 LCDR2 FASRLHS SEQ ID NO: 7 LCDR3 QQGSTLPWT SEQ ID NO: 8

[00141] (2) As sequências da região variável de cadeia pesada e da cadeia leve de 9E5 são as seguintes: 9E5 HCVR

QVQLQQPGADLVKPGASVKMSCKASGYILTTYWITWVKQRPGQGLEWIGDIHPG

SGSTKYNEKFKSKATLTVDTSSSTAYMQLTRLSSEDSAVYYCARRDYWGQGTTLTVSS (SEQ ID NO: 9); 9E5 LCVR

DVLMTQSPLSLPVSLGDQASISCRSSQNIVNSQGNTYLEWYLQKPGESPKLLIY

KVTNRFSGVPDRFSGSGSGTDFTLKISRVEAEDLGVYYCFQASLVPWTFGGGTKLEIK (SEQ ID NO: 10);

[00142] As sequências de CDR aí incluídas são mostradas na Tabela 6 abaixo: Tabela 6. Sequências de CDR de 9E5 Nome Sequência SEQ ID NO HCDR1 GYILTTYWIT SEQ ID NO: 11 HCDR2 DIHPGSGSTKYNEKFKS SEQ ID NO: 12 HCDR3 RDY SEQ ID NO: 13 LCDR1 RSSQNIVNSQGNTYLE SEQ ID NO: 14 LCDR2 KVTNRFS SEQ ID NO: 15 LCDR3 FQASLVPWT SEQ ID NO: 16

[00143] (3) As sequências da região variável de cadeia pesada e da cadeia leve de 1D9 são as seguintes: 1D9 HCVR

QVRLQQSGAELVRPGTSMRVSCKASGYAFTNYLINWVKQRPGQGLEWIGILNPG

SGGTNYNENFKDKATLTADKSSNTAYMQLSSLTSEDSAVYFCIRGSPGFAYWGQGTLVT VSA (SEQ ID NO: 37); 1D9 LCVR

DIQMTQTTSSLSASLGDRVTISCRASQDINIYLNWYQQKPDGTVKLLIYSTSGL HSGVPSRFNGSGSGTDYSLTISNLEQEDIATYFCQQGYTLPYTFGGGTKLEIK (SEQ ID NO: 38);

[00144] As sequências de CDR aí incluídas são mostradas na Tabela 7 abaixo: Tabela 7. Sequências de CDR de 1D9 Nome Sequência SEQ ID NO HCDR1 GYAFTNYLIN SEQ ID NO: 39 HCDR2 ILNPGSGGTNYNENFKD SEQ ID NO: 40 HCDR3 GSPGFAY SEQ ID NO: 41 LCDR1 RASQDINIYLN SEQ ID NO: 42 LCDR2 STSGLHS SEQ ID NO: 43 LCDR3 QQGYTLPYT SEQ ID NO: 44

[00145] (4) As sequências da região variável de cadeia pesada e da cadeia leve de 14C10 são as seguintes: 14C10 HCVR

QVQVQQSGAELVRPGTSVKVSCKASGYAFTNYLIEWVKQRPGQGLEWIGVINPE

FGGTNYNEKFKGKATLTADKSSSTAYMQLSSLTSEDSAVYFCARGGGGFTYWGQGTLVT VSA (SEQ ID NO: 45); 14C10 LCVR

HIQMTQTTSSLSASLGDRVTISCRASQDISSHLNWYQQKPDGTVKLLISYTSRL HSGVPSRFSGSGSGADYSLTISNLEQEDIATYFCQQGNTLPWTFGGGTKLEIK (SEQ ID NO: 46);

[00146] As sequências de CDR aí incluídas são mostradas na Tabela 8 abaixo: Tabela 8. Sequências de CDR de 14C10 Nome Sequência SEQ ID NO HCDR1 GYAFTNYLIE SEQ ID NO: 47 HCDR2 VINPEFGGTNYNEKFKG SEQ ID NO: 48 HCDR3 GGGGFTY SEQ ID NO: 49 LCDR1 RASQDISSHLN SEQ ID NO: 50 LCDR2 YTSRLHS SEQ ID NO: 51 LCDR3 QQGNTLPWT SEQ ID NO: 52

[00147] (5) As sequências da região variável de cadeia pesada e da cadeia leve de 38B4 são as seguintes: 38B4 HCVR

QVRLKQSGAELVRPGASVKVSCKASGYTFTDYYINWVKQRPGQGLEWIAGIYPG

TGNTYYNEKFKGKATLTAERSSSTAYMQLTSLTSEDSAVYFCTRRGLPSLCFDYWGQGT TLTVSS (SEQ ID NO: 53); 38B4 LCVR

DFQMTQTTSSLSASLGDRVTISCSASQGISNYLNWYQQKPDGTVKLLIYYTSSL HSGVPSRFSGSGSGTDYSLTISNLEPEDIATYYCQQYSKLPPTFGGGTKLEIK (SEQ ID NO: 54);

[00148] As sequências de CDR aí incluídas são mostradas na Tabela 9 abaixo: Tabela 9. Sequências de CDR de 38B4

Nome Sequência SEQ ID NO HCDR1 GYTFTDYYIN SEQ ID NO: 55 HCDR2 GIYPGTGNTYYNEKFKG SEQ ID NO: 56 HCDR3 RGLPSLCFDY SEQ ID NO: 57 LCDR1 SASQGISNYLN SEQ ID NO: 58 LCDR2 YTSSLHS SEQ ID NO: 59 LCDR3 QQYSKLPPT SEQ ID NO: 60

[00149] Entre eles, as duas cepas ideais de anticorpos (2H6 e 9E5) foram selecionadas para o desenvolvimento de acompanhamento. As sequências de região variável obtidas foram respectivamente conectadas a sequências de região constante de anticorpo humano IgG1 para obter sequências de anticorpo quimérico humano-camundongo. Usando tecnologia de clonagem molecular, a sequência do anticorpo quimérico foi inserida no vetor de expressão pCP (adquirido na Mabspace Biosciences) e, em seguida, a sequência foi identificada por PCR (clonagem molecular e outras operações biológicas moleculares nesta parte são realizadas de acordo com a operação convencional. Para obter mais detalhes, consulte "Molecular Cloning: A Laboratory Manual"). O sistema de expressão de células HEK293 foi usado para obter anticorpos quiméricos humano-camundongo 2H6-C e 9E5-C.

[00150] Os anticorpos quiméricos purificados por cromatografia de afinidade MabSelect SuRe (GE Lifesciences)

foram testados para várias atividades in vitro. Os dados são mostrados na Tabela 10.

Tabela 10. Atividade in vitro de anticorpos quiméricos EC50 de EC50 de hCD40/hCD40L ligação a ELISA de humano, Afinidade Anticorpo células CD40-his bloqueando Biacore quimérico HEK293- humano (ng ELISA IC50 KD (M) CD40 /mL) (μg/mL) (μg/mL) 2H6-C 4,565 0,6275 0,02593 3,98 9E5-C 1,346 0,1218 0,03333 2,68 Controle Pfizer 5,628 0,2583 0,01638 20,35 (hIgG4) controle Alligator 3,288 0,7233 0,39650 65,9 (hIgG1) EXEMPLO 9 TESTE DE HUMANIZAÇÃO DE ANTICORPO DE MURINO

[00151] Com base nas estruturas VH/VLCDR típicas obtidas dos anticorpos murinos 2H6 e 9E5, as sequências da região variável de cadeia pesada e da região variável de cadeia leve foram alinhadas contra um banco de dados de linhagem germinativa de anticorpo para obter um modelo de linhagem germinativa humana com alta homologia.

[00152] A região estrutural da cadeia leve da linhagem germinativa humana é derivada do gene da cadeia leve kappa humana. O modelo de cadeia leve da linhagem germinativa humana para o anticorpo da presente divulgação é de um modo preferido Vk1-33/JK4 (para 2H6) ou Vk2-28/JK4 (para 9E5).

[00153] A região estrutural da cadeia pesada da linhagem germinativa humana é derivada da cadeia pesada humana. O modelo de cadeia pesada da linhagem germinativa humana para o anticorpo da presente divulgação é de um modo preferido VH1-69/JH6 (para 2H6) ou VH1-2/JH6 (para 9E5), como mostrado abaixo: Modelo preferido da cadeia pesada da linhagem germinativa humana IGHV1-69 para 2H6

QVQLVQSGAEVKKPGSSVKVSCKASGGTFSSYAISWVRQAPGQGLEWMGGIIPI FGTANYAQKFQGRVTITADKSTSTAYMELSSLRSEDTAVYYCAR (SEQ ID NO: 21); Modelo preferido de cadeia leve de linhagem germinativa humana IGkV1-33 para 2H6

DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCQASQDISNYLNWYQQKPGKAPKLLIYDASNL ETGVPSRFSGSGSGTDFTFTISSLQPEDIATYYCQQYDNLP (SEQ ID NO: 22); Modelo de cadeia pesada de linhagem germinativa humana preferível IGHV1-2 para 9E5

QVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASGYTFTGYYMHWVRQAPGQGLEWMGWINPN SGGTNYAQKFQGRVTMTRDTSISTAYMELSRLRSDDTAVYYCAR (SEQ ID NO: 23);

Modelo preferido de cadeia leve de linhagem germinativa humana IGkV2-28 para 9E5

DIVMTQSPLSLPVTPGEPASISCRSSQSLLHSNGYNYLDWYLQKPGQSPQLLIY LGSNRASGVPDRFSGSGSGTDFTLKISRVEAEDVGVYYCMQALQTP (SEQ ID NO: 24);

[00154] As regiões CDR do anticorpo murino foram enxertadas no modelo humanizado selecionado, para substituir as regiões variáveis humanizadas e, em seguida, recombinadas com as regiões constantes de IgG humana correspondentes (de um modo preferido IgG1 para a cadeia pesada; e kappa para a cadeia leve). Com base na estrutura tridimensional do anticorpo murino, as mutações reversas foram realizadas nos resíduos incorporados, nos resíduos que interagem diretamente com as regiões CDR, e nos resíduos que têm um impacto importante na conformação de VL e VH, e nos resíduos de aminoácido em regiões CDR que não são quimicamente estáveis foram otimizados para obter as moléculas humanizadas finais.

[00155] As sequências das regiões variáveis da cadeia pesada são mostradas em SEQ ID NOs: 25-30; As sequências das regiões variáveis da cadeia leve são mostradas em SEQ ID NOs: 31-36.

hu2H6-H1a:

QVQLVQSGAEVKKPGSSVKVSCKASGGTFSDYLIEWVRQAPGQGLEWMGVINPG

SGGSNYNEKIKDRVTITADKSTSTAYMELSSLRSEDTAVYYCARGGGGFTYWGQGTLVT VSS (SEQ ID NO: 25); hu2H6-H1b:

QVQLVQSGAEVKKPGSSVKVSCKASGYAFSDYLIEWVRQAPGQGLEWMGVINPG

SGGSNYNEKIKDRVTLTADKSTSTAYMELSSLRSEDTAVYYCARGGGGFTYWGQGTLVT VSS (SEQ ID NO: 26); hu2H6-H1c:

QVQLVQSGAEVKKPGSSVKVSCKASGYAFSDYLIEWVRQAPGQGLEWIGVINPG

SGGSNYNEKIKDRATLTADKSTSTAYMELSSLRSEDTAVYYCARGGGGFTYWGQGTLVT VSSFGQGTKLEIK (SEQ ID NO: 27); hu9E5-H1a:

QVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASGYTFTTYWITWVRQAPGQGLEWMGDIHPG

SGSTKYNEKFKSRVTMTVDTSISTAYMELSRLRSEDTAVYYCARRDYWGQGTTVTVSS (SEQ ID NO: 28); hu9E5-H1b:

QVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASGYTFTTYWITWVRQAPGQGLEWMGDIHPG

SGSTKYNEKFKSRVTLTVDTSISTAYMELSRLRSEDTAVYYCARRDYWGQGTTVTVSS (SEQ ID NO: 29); hu9E5-H1c:

QVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASGYILTTYWITWVRQAPGQGLEWMGDIHPG

SGSTKYNEKFKSRVTLTVDTSISTAYMELSRLRSEDTAVYYCARRDYWGQGTTVTVSS (SEQ ID NO: 30); hu2H6-L1a:

DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASQDISNYLNWYQQKPGKAPKLLLNFASRL HSGVPSRFSGSGSGTDFTFTISSLQPEDIATYYCQQGSTLPWTFGGGTKVEIK (SEQ ID NO: 31); hu2H6-L1b:

DIQLTQSPSSLSASVGDRVTITCRASQDISNYLNWYQQKPGKAPKLLLNFASRL HSGVPSRFSGSGSGTDFTFTISSLQPEDIATYYCQQGSTLPWTFGGGTKVEIK (SEQ ID NO: 32); hu2H6-L1c:

DIQLTQSPSSLSASVGDRVTITCRASQDISNYLNWYQQKPGKTIKLLLNFASRL HSGVPSRFSGSGSGTDFTFTISSLQPEDIATYYCQQGSTLPWTFGGGTKVEIK (SEQ ID NO: 33); hu9E5-L1a:

DIVMTQSPLSLPVTPGEPASISCRSSQNIVNSQGNTYLEWYLQKPGQSPQLLIY

KVTNRFSGVPDRFSGSGSGTDFTLKISRVEAEDVGVYYCFQASLVPWTFGGGTKVEIK (SEQ ID NO: 34); hu9E5-L1b:

DVVMTQSPLSLPVTPGEPASISCRSSQNIVNSQGNTYLEWYLQKPGQSPQLLIY

KVTNRFSGVPDRFSGSGSGTDFTLKISRVEAEDVGVYYCFQASLVPWTFGGGTKVEIK (SEQ ID NO: 35); hu9E5-L1c:

DVLMTQSPLSLPVTPGEPASISCRSSQNIVNSQGNTYLEWYLQKPGQSPQLLIY

KVTNRFSGVPDRFSGSGSGTDFTLKISRVEAEDVGVYYCFQASLVPWTFGGGTKVEIK (SEQ ID NO: 36).

[00156] Pelo teste de expressão das combinações acima de cadeias leves e pesadas e por comparações entre diferentes números de mutações reversas, as moléculas de anticorpo humanizado hu2H6 (com cadeia pesada H1b e cadeia leve L1c) e hu9E5 (com cadeia pesada H1c e cadeia leve L1a) foram finalmente selecionados, e as respectivas sequências completas de cadeia leve e de cadeia pesada são mostradas na SEQ ID NO: 17-20.

hu2H6 HC:

QVQLVQSGAEVKKPGSSVKVSCKASGYAFSDYLIEWVRQAPGQGLEWMGVINPG SGGSNYNEKIKDRVTLTADKSTSTAYMELSSLRSEDTAVYYCARGGGGFTYWGQGTLVT VSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAV LQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSCDKTHTCPPCPAP ELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKP REEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYT

LPPSRDELTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSK LTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK (SEQ ID NO: 17); hu2H6 LC:

DIQLTQSPSSLSASVGDRVTITCRASQDISNYLNWYQQKPGKTIKLLLNFASRL HSGVPSRFSGSGSGTDFTFTISSLQPEDIATYYCQQGSTLPWTFGGGTKVEIKRTVAAP

SVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDST YSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC (SEQ ID NO: 18); hu9E5 HC:

QVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASGYILTTYWITWVRQAPGQGLEWMGDIHPG SGSTKYNEKFKSRVTLTVDTSISTAYMELSRLRSEDTAVYYCARRDYWGQGTTVTVSSA STKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSS GLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSCDKTHTCPPCPAPELLG GPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQ YNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPS

RDELTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVD KSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK (SEQ ID NO: 19); hu9E5 LC:

DIVMTQSPLSLPVTPGEPASISCRSSQNIVNSQGNTYLEWYLQKPGQSPQLLIY KVTNRFSGVPDRFSGSGSGTDFTLKISRVEAEDVGVYYCFQASLVPWTFGGGTKVEIKR

TVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQD SKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC (SEQ ID NO: 20).

EXEMPLO 10 DADOS DE TESTE DE ANTICORPO HUMANIZADO

[00157] A presente divulgação mostra a atividade de ligação e a atividade de bloqueio dos anticorpos humanizados hu2H6 e hu9E5 para CD40 humano e CD40 rhesus, como mostrado na Tabela 11.

[00158] Os resultados mostram que os anticorpos CD40 anti-humanos humanizados da presente divulgação têm ligação ELISA e atividade de bloqueio comparável à dos anticorpos positivos Pfizer/Alligator. Em particular, a afinidade de hu9E5 para CD40 humano medida por Biacore é 10 vezes ou mais do que a do anticorpo Alligator, um controle positivo, e 4 vezes ou mais do que a do Controle Pfizer.

Tabela 11 Atividades in vitro de anticorpos humanizados hu2H6 e hu9E5

EC50 de EC50 de EC50 de hCD40/hCD40 ELISA de ligação a ELISA de L humano, Afinidade CD40- células CD40-his bloqueando Biacore his HEK293- Rhesus ELISA IC50 KD (M) humano CD40 (ng/mL) (μg/mL) (ng/mL) (μg/mL) Hu2H6-11 3,680 2,945 0,6735 0,01538 1,120E-8 Hu9E5-25 1,650 1,661 0,3084 0,13970 5,301E-9 Controle 1,293 1,243 0,6471 1,36200 1,66E-7 Alligator (hIgG1) Controle 3,976 3,561 0,3106 0,01907 2,035E-8 Pfizer (hIgG4) EXEMPLO 11 INIBIÇÃO DE CRESCIMENTO DE TUMOR DE CAMUNDONGO POR ANTICORPO ANTI-CD40

[00159] O sangue periférico de um indivíduo humano normal foi retirado, e PBMCs de indivíduo humano saudável foram separados por centrifugação em gradiente de densidade.

Os monócitos foram isolados com o kit de microesferas CD14+, os monócitos CD14+ foram isolados de acordo com o procedimento fornecido pelo kit, ou seja, 20 μl de microesferas anti-CD14 foram adicionadas a cada 107 células e incubadas a 4°C por 15 minutos. Em seguida, as células foram adicionadas à coluna magnética, e a coluna foi lavada três vezes, as células foram coletadas da coluna magnética, ou seja, monócitos CD14+. Monócitos CD14+ foram adicionados com meio RPMI 1640 compreendendo 10 ng/mL de IL-4 e 100 ng/mL de GM-CSF, e foram cultivados por 6 dias (o método de cultivo é um método convencional na técnica); em seguida, as células MoDC foram induzidas e cultivadas, e as células restantes foram adicionadas com RPMI 1640 compreendendo IL-2; as células suspensas foram coletadas após o cultivo (o método de cultivo e o método de coleta de células são métodos convencionais na técnica), as células T foram classificadas pelo kit de microesferas CD3+. Seis dias depois, as células MoDC e as células CD3+T foram coletadas e separadas; e misturado com células Raji (Cell Bank of Shanghai Academy of Biological Sciences, cultivado em meio RPMI1640 compreendendo 10% de soro fetal bovino) em uma proporção de 1:5:20. A mistura foi usada para inocular subcutaneamente cada camundongo NOG (Nanjing Galaxy Biopharma Co., Ltd, reprodução adaptativa por 5 dias). Os animais de laboratório foram mantidos em uma gaiola independente ventilada com temperatura e umidade constantes. A temperatura na sala de reprodução era de 18,0-26,0ºC, a umidade era de 40-70% e a taxa de ventilação era de 10-20 vezes por hora. O horário alternado para dia e noite foi de 12h/12h.

[00160] O grupo de controle de anticorpo IgG1 humano, hu2H6, hu9E5 e o grupo de controle de anticorpo G12 (ou seja, ADC-1013 da Alligator Bioscience) foram divididos no teste, e a dose foi de 3 mg/kg para cada grupo. Cada grupo de 5 camundongos foi injetado uma vez por semana, durante seis semanas, com 3 doses consecutivas.

[00161] Os procedimentos para o teste foram os seguintes:

[00162] (1) O diâmetro longo e o diâmetro curto do tumor foram medidos duas vezes por semana, com um paquímetro, e o volume do tumor (mm3) foi calculado como = 0,5 × (diâmetro longo do tumor × diâmetro curto do tumor2).

[00163] (2) Taxa de inibição relativa do tumor TGI (%): TGI% = (1-T/C) × 100%. T/C% é a taxa de proliferação relativa do tumor (ou seja, o valor percentual do volume do tumor ou peso do tumor no grupo de tratamento em relação ao grupo de controle, em um determinado ponto de tempo). T e C são o volume do tumor (TV) ou peso do tumor (TW) do grupo de tratamento e grupo de controle de IgG1 em um ponto de tempo específico, respectivamente.

[00164] Os resultados mostram que os anticorpos anti- CD40 humanizados hu2H6 e hu9E5 têm efeitos antitumorais muito significativos quando comparados aos do controle IgG1. O tumor foi quase completamente eliminado no dia 21 após a administração; o efeito antitumoral foi equivalente ou ligeiramente melhor do que o do anticorpo de controle G12, como mostrado na Figura 3 e Figura 4.

EXEMPLO 12 PREPARAÇÃO DE ANTICORPO ANTI-CD40 COMPREENDENDO MUTAÇÃO(ÕES) NA REGIÃO CONSTANTE DE CADEIA

PESADA

[00165] Neste exemplo, foram preparadas variantes do anticorpo anti-CD40 descrito acima, que possuem mutação(ões) na região constante da cadeia pesada.

[00166] Em particular: - O aminoácido na posição 266 da cadeia pesada hu2H6 da SEQ ID NO: 17 foi mutado de serina (S) para ácido glutâmico (E), para obter o mutante hu2H6-M; - O aminoácido na posição 266 da cadeia pesada hu2H6 da SEQ ID NO: 17 foi mutado de serina (S) para ácido glutâmico (E), o aminoácido na posição 324 foi mutado de asparagina (N) para serina (S), e o aminoácido na posição 327 foi mutado de leucina (L) para fenilalanina (F), para obter hu2H6-SELFNS mutante; - O aminoácido na posição 262 da cadeia pesada hu9E5 da SEQ ID NO: 19 foi mutado de serina (S) para ácido glutâmico (E), para obter o mutante hu9E5-M; - O aminoácido na posição 262 da cadeia pesada hu9E5 da SEQ ID NO: 19 foi mutado de serina (S) para ácido glutâmico (E), e o aminoácido na posição 323 foi mutado de leucina (L) para fenilalanina (F), para obter o mutante hu9E5-SELF; - O aminoácido na posição 262 da cadeia pesada hu9E5 da SEQ ID NO: 19 foi mutado de serina (S) para ácido glutâmico (E), o aminoácido na posição 320 foi mutado de asparagina (N) para serina (S), e o aminoácido na posição 323 foi mutado de leucina (L) para fenilalanina (F), para obter o mutante hu9E5-SELFNS.

[00167] As sequências da cadeia pesada de hu2H6-M e hu2H6-SELFNS são mostradas nas SEQ ID NOs: 61 e 62, e a sequência da cadeia leve é mostrada na SEQ ID NO: 18.

[00168] As sequências da cadeia pesada de hu9E5-M, hu9E5-SELF e hu9E5-SELFNS são mostradas na SEQ ID NO: 63, 64 e 67 e a sequência da cadeia leve é mostrada na SEQ ID NO:

20.

hu2H6-M HC:

QVQLVQSGAEVKKPGSSVKVSCKASGYAFSDYLIEWVRQAPGQGLEWMGVINPG SGGSNYNEKIKDRVTLTADKSTSTAYMELSSLRSEDTAVYYCARGGGGFTYWGQGTLVT VSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAV LQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSCDKTHTCPPCPAP ELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVEHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKP REEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYT

LPPSRDELTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSK LTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK (SEQ ID NO: 61); hu2H6-SELFNS HC:

QVQLVQSGAEVKKPGSSVKVSCKASGYAFSDYLIEWVRQAPGQGLEWMGVINPG SGGSNYNEKIKDRVTLTADKSTSTAYMELSSLRSEDTAVYYCARGGGGFTYWGQGTLVT VSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAV LQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSCDKTHTCPPCPAP ELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVEHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKP REEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSSKAFPAPIEKTISKAKGQPREPQVYT

LPPSRDELTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSK LTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK (SEQ ID NO: 62); hu9E5-M HC:

QVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASGYILTTYWITWVRQAPGQGLEWMGDIHPG SGSTKYNEKFKSRVTLTVDTSISTAYMELSRLRSEDTAVYYCARRDYWGQGTTVTVSSA STKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSS GLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSCDKTHTCPPCPAPELLG GPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVEHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQ YNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPS

RDELTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVD KSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK (SEQ ID NO: 63); hu9E5-SELF HC:

QVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASGYILTTYWITWVRQAPGQGLEWMGDIHPG SGSTKYNEKFKSRVTLTVDTSISTAYMELSRLRSEDTAVYYCARRDYWGQGTTVTVSSA STKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSS GLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSCDKTHTCPPCPAPELLG GPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVEHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQ YNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKAFPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPS

RDELTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVD KSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK (SEQ ID NO: 64); hu9E5-SELFNS HC:

QVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASGYILTTYWITWVRQAPGQGLEWMGDIHPG SGSTKYNEKFKSRVTLTVDTSISTAYMELSRLRSEDTAVYYCARRDYWGQGTTVTVSSA STKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSS GLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSCDKTHTCPPCPAPELLG GPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVEHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQ YNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSSKAFPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPS

RDELTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVD KSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK (SEQ ID NO: 67).

[00169] Além disso, o aminoácido K na última posição da SEQ ID NO: 61, 62, 63, 64 e 67 pode ser substituído por A. Esta mutação não afeta a atividade do anticorpo, mas pode melhorar a capacidade de fármaco do anticorpo até um certo nível.

[00170] Além disso, de acordo com a região variável de outro anticorpo anti-CD40 APX005S267E descrito em CN104918957A (isto é, aminoácidos nas posições 1-120), o anticorpo 005M foi preparado como um controle positivo e a sequência de aminoácidos das posições 121 a 450 da cadeia pesada do anticorpo 005M é a mesma que a sequência de aminoácidos das posições 113 a 442 da cadeia pesada do anticorpo hu9E5-M. As sequências específicas de 005M são as seguintes: 005M-HC:

QVQLVESGGGVVQPGRSLRLSCAASGFSFSSTYVCWVRQAPGKGLEWIACIYTG DGTNYSASWAKGRFTISKDSSKNTVYLQMNSLRAEDTAVYFCARPDITYGFAINFWGPG TLVTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHT FPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSCDKTHTCPP CPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVEHEDPEVKFNWYVDGVEVHNA KTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREP

QVYTLPPSRDELTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFF LYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK (SEQ ID NO:65); 005M-LC:

DIQMTQSPSSLSASVGDRVTIKCQASQSISSRLAWYQQKPGKPPKLLIYRASTL ASGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDVATYYCQCTGYGISWPIGGGTKVEIKRTVAA

PSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDS TYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC (SEQ ID NO:66);

[00171] O aminoácido na posição 331 da cadeia pesada 005M da SEQ ID NO: 65 foi mutado de leucina (L) para fenilalanina (F) para obter o mutante APX005-SELF; O aminoácido na posição 328 da cadeia pesada 005M da SEQ ID NO: 65 foi mutado de asparagina (N) para serina (S), e o aminoácido na posição 331 foi mutado de leucina (L) para fenilalanina (F) para obter o mutante APX005-SELFNS.

APX005-SELF HC (L331F):

QVQLVESGGGVVQPGRSLRLSCAASGFSFSSTYVCWVRQAPGKGLEWIACIYTG DGTNYSASWAKGRFTISKDSSKNTVYLQMNSLRAEDTAVYFCARPDITYGFAINFWGPG TLVTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHT FPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSCDKTHTCPP CPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVEHEDPEVKFNWYVDGVEVHNA KTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKAFPAPIEKTISKAKGQPREP

QVYTLPPSRDELTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFF LYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK (SEQ ID NO:68); APX005-SELFNS HC (L331F, N328S):

QVQLVESGGGVVQPGRSLRLSCAASGFSFSSTYVCWVRQAPGKGLEWIACIYTG DGTNYSASWAKGRFTISKDSSKNTVYLQMNSLRAEDTAVYFCARPDITYGFAINFWGPG TLVTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHT FPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSCDKTHTCPP CPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVEHEDPEVKFNWYVDGVEVHNA KTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSSKAFPAPIEKTISKAKGQPREP

QVYTLPPSRDELTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFF LYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK (SEQ ID NO:69);

[00172] Os anticorpos hu2H6-M, hu2H6-SELFNS, hu9E5- M, hu9E5-SELF, hu9E5-SELFNS e 005M, APX005-SELF e APX005- SELFNS foram preparados e confirmados por sequenciamento.

EXEMPLO 13 TESTE DE ANTICORPO ANTI-CD40 COMPREENDENDO MUTAÇÃO(ÕES) NA REGIÃO CONSTANTE DE CADEIA PESADA PARA ATIVAR

CÉLULAS DC

[00173] PBMCs foram isolados do sangue periférico de um indivíduo humano normal e, em seguida, os monócitos foram classificados usando esferas MACS CD14. Meio RPMI 1640 compreendendo 25 ng/mL de IL-4 e 50 ng/mL de GM-CSF foi adicionado para cultivo por 6 dias para induzir células MoDC (células dendríticas derivadas de monócitos).

[00174] As células foram coletadas após 6 dias, 1 × 105 células foram tomadas, e coradas com CD209-PE, CD1a- PerCP/Cy5.5 e CD14-PE/Cy7 para analisar se MoDC foi induzido com sucesso por FACS (as operações acima são operações de rotina na técnica). As DCs induzidas com sucesso foram coletadas, cada anticorpo a ser testado e o anticorpo de controle foram adicionados, e os gradientes de diluição de concentração correspondentes foram configurados para obter gradientes de anticorpo: 0,01 nM, 0,16 nM, 0,8 nM, 4 nM, 20 nM, 100 nM. Depois de cultivar por 48 horas, as células foram coletadas e coradas usando coloração de CD86 e HLA-DR, e os dados foram coletados por FACS. Ambos APX005M-SELFNS e 2H6- SELFNS mostraram atividade agonista mais forte do que a do anticorpo de controle Alligator G12 e ativaram a molécula de ativação CD86 na superfície das células DC de uma forma dependente da dose (ver Figura 6).

EXEMPLO 14 TESTE DE ANTICORPO ANTI-CD40 COMPREENDENDO MUTAÇÃO(ÕES) NA REGIÃO CONSTANTE DE CADEIA PESADA PARA

ATIVAÇÃO DE CÉLULAS DC PARA PRODUZIR CITOCINAS

[00175] PBMCs foram isolados do sangue periférico de um indivíduo humano normal e, em seguida, os monócitos foram classificados usando esferas MACS CD14. Meio RPMI 1640 compreendendo 25 ng/mL de IL-4 e 50 ng/mL de GM-CSF foi adicionado para cultivo por 6 dias para induzir células MoDC (células dendríticas derivadas de monócitos). As células foram coletadas após 6 dias, 1 × 105 células foram tomadas e coradas com CD209-PE, CD1a-PerCP/Cy5.5 e CD14-PE/Cy7 para analisar se MoDC foi induzido com sucesso por FACS (as operações acima são operações de rotina na técnica). As DCs induzidas com sucesso foram coletadas, cada anticorpo a ser testado e o anticorpo de controle foram adicionados, e os gradientes de diluição de concentração correspondentes foram configurados para obter gradientes de anticorpo: 0,01 nM, 0,16 nM, 0,8 nM, 4 nM, 20 nM, 100 nM. Após cultivo por 48 horas, o sobrenadante foi coletado e o conteúdo de IL-12 p40 foi detectado por ELISA.

[00176] APX005M-SELFNS, APX005M-SELF, 2H6-SELFNS e 9E5-SELFNS todos mostraram atividade agonista mais forte do que o anticorpo de controle Alligator G12 e promoveram a secreção de citocina IL-12 p40 de células DC de uma forma dependente da dose. Os resultados são mostrados na Figura 7A, Figura 7B e Tabela 12, Tabela 13.

Tabela 12. Resultados de anticorpo anti-CD40 promovendo a secreção de citocina IL-12 p40 a partir de células DC Concent hIgG1 APX005 Alligato 9E5 2H6 2H6- ração de M- r G12 SELFNS anticor SELFNS po (nM) 100 65,205 23129, 42475,28 13998,98 7668,062 29300, ± 857±11 0±4060,0 7± ± 717±27 14,145 23,371 51 349,462 773,460 41,181 20 76,817 42648, 24147,46 11397,87 5633,816 36753, ± 367±13 3±1685,8 0± ± 370±38 33,036 38,211 12 428,991 335,383 12,485

4 35,016 52787, 11789,56 / / 40700, ± 687±28 0±375,84 567±46 6,301 54,792 8 21,792 0,8 34,952 50373, 7762,352 / / 36329, ± 157±51 ± 460±79 4,832 8,778 189,066 0,604 0,16 20,899 24311, 2110,560 / / 18411, ± 430±22 ± 147±16 2,246 8,650 87,567 39,285 0,01 35,562 35,562 35,562± / / 35,562 ± ± 12,971 ± 12,971 12,971 12,971 (Nota: "/" significa que a concentração não foi testada).

Tabela 13. Resultados de anticorpo anti-CD40 promovendo a secreção de citocina IL-12 p40 a partir de células DC Conc. de anticorp o nM

EXEMPLO 15 INIBIÇÃO DO CRESCIMENTO DO TUMOR DE CAMUNDONGO POR ANTICORPO ANTI-CD40 COMPREENDENDO MUTAÇÃO(ÕES) NA REGIÃO

CONSTANTE DA CADEIA PESADA

[00177] Neste exemplo, o efeito antitumoral e a segurança da administração do anticorpo CD40 foram avaliados pelo tamanho do tumor e pelo peso dos camundongos em um modelo de tumor MC38 de camundongo hFcγR/hCD40 C57BL/6 humanizado.

[00178] O método para cultivar e preparar células MC38: a linhagem de células de câncer de cólon de camundongo MC38 foi cultivada em DMEM (compreendendo 10% de FBS, 1% de penicilina-estreptomicina, 1 mM de piruvato de sódio e 10 mM de HEPES), e as células foram proliferadas para atingir uma densidade de 80%-90% na placa de cultura. Foi adicionada tripsina-EDTA (0,25%) e incubada a 37°C durante 3 a 5 minutos para digestão, e meio compreendendo FBS a 10% foi usado para terminar a reação. As células foram centrifugadas e lavadas duas vezes com PBS e finalmente ressuspensas em PBS para preparar uma suspensão de células individuais, e a densidade celular foi ajustada para 107 células/mL para uso posterior.

[00179] O método para estabelecer o modelo de tumor MC38: a suspensão de célula única MC38 preparada acima (2×106 células MC38, 200 μL) foi usada para inocular subcutaneamente 32 camundongos hFcγR/hCD40 C57BL/6 humanizados (fornecido pela equipe LI Fubin, Departamento de Medicina, Shanghai

Jiaotong University, mantida em nível de SPF) no flanco direito no dia 7. Quando o volume médio do tumor em camundongos atingiu cerca de 55 mm3, eles foram divididos aleatoriamente em 4 grupos com 8 camundongos em cada grupo.

[00180] Após o agrupamento, uma única dose de anticorpo anti-CD40 foi administrada intraperitonealmente de acordo com o regime mostrado na Tabela 12. O volume do tumor e o peso corporal foram medidos duas vezes por semana, e os dados foram registrados. Entre eles, o controle IgG, hu9E5 e hu9E5-M foram fornecidos por Shanghai Hengrui Pharmaceutical Co., Ltd. e diluídos com PBS para obter uma concentração final de 0,3 mg/mL.

[00181] Indicadores para avaliar a atividade antitumoral do anticorpo: 1) O volume do tumor dos camundongos foi medido continuamente após os camundongos em questão serem divididos em grupos, e o tamanho do volume do tumor foi usado como um indicador para avaliar a atividade antitumoral do anticorpo a ser testado. A fórmula para calcular o volume do tumor (TV) é a seguinte: TV = 0,5 × Lcurto × Lcurto × Llongo, onde Lcurto é o diâmetro mais curto do tumor e Llongo é o diâmetro mais longo do tumor.

2) T/C% é a taxa de proliferação tumoral relativa, ou seja, o valor percentual do volume do tumor no grupo de tratamento em relação ao do grupo de controle, em um determinado ponto de tempo, que é calculado da seguinte forma: T/C% = (T-T0)/(C-C0) ×100 onde T e C se referem ao volume do tumor no final do teste; T0, C0 se referem ao volume do tumor no início do teste.

3) Taxa de inibição relativa do tumor TGI (%) = (1-T/C) × 100%.

[00182] Expressão dos dados e processamento estatístico: Todos os dados foram analisados pelo software GraphPad Prism 5.0. Os dados são expressos como Média ± desvio padrão e a análise ANOVA de um fator foi usada entre os grupos. P <0,05 indica que a diferença é estatisticamente significativa.

Tabela 14. Grupo de teste e regime de dosagem Agrupamento Número Agrupamento Dose Regime Via de de teste (mg/kg) de administração dosagem Grupo 1 8 Controle 3 D0, D3, ip (Controle D6 IgG) Grupo 2 8 hu9E5 3 D0, D3, ip D6

Grupo 3 8 hu9E5-M 3 D0, D3, ip D6 Grupo 4 8 005M 3 D0, D3, ip D6 (Nota: uma vez a cada três dias e por 3 vezes no total; ip: injeção intraperitoneal).

[00183] Os resultados da atividade in vivo para cada grupo de anticorpos no modelo de tumor MC38 de camundongo hFcγR/hCD40Tg podem ser avaliados pela mudança no volume do tumor. Depois que o anticorpo de controle e os anticorpos de teste foram administrados no dia 0, dia 3 e dia 6, o crescimento do volume do tumor do camundongo foi inibido no grupo hu9E5, grupo hu9E5-M e grupo 005M, quando comparado com aquele no grupo controle (IgG de controle) As taxas de inibição relativa do tumor foram 42,0%, 68,9% e 53,8%, respectivamente. Hu9E5 tem certa atividade antitumoral (p> 0,05), hu9E5-M e 005M têm forte atividade antitumoral (p <0,05) e hu9E5-M tem mais efeitos benéficos do que 005M, como mostrado na Tabela 15 e na Figura 5.

Tabela 15. Volume do tumor (cm3) Agrupamento Taxa de inibição volume do tumor do volume do (média ± SEM) tumor (%) D0 D18 D18

Grupo Controle 0,052± 0,794± / 1 (Controle 0,015 0,29 IgG) Grupo hu9E5 0,053± 0,483± 42,0% 2 0,016 0,159 Grupo hu9E5-M 0,060± 0,291± 68,9%* 3 0,022 0,139 Grupo 005M 0,069± 0,412± 53,8%* 4 0,03 0,105 (Nota: *p<0,05 ou inferior, indicando significância estatística).

[00184] Os resultados mostram que a mutação de aminoácidos (de S para E) na posição 266 correspondendo à SEQ ID NO: 17 ou na posição 262 correspondendo à SEQ ID NO: 19 pode melhorar significativamente o efeito antitumoral in vivo dos anticorpos anti-CD40 do presente pedido.

[00185] Embora as modalidades específicas da presente invenção sejam descritas acima, aqueles versados na técnica devem entender que essas modalidades são apenas para fins exemplares, várias alterações ou modificações podem ser feitas a essas modalidades sem se afastar do princípio e da essência da presente invenção. Portanto, o escopo de proteção da presente invenção é definido pelas reivindicações anexas.

Claims (1)

1. REIVINDICAÇÕES

   1. Anticorpo anti-CD40 ou fragmento de ligação ao antígeno do mesmo, caracterizado pelo fato de que compreende mutação(ões) na região constante da cadeia pesada, em que: 1) uma região variável de cadeia leve do anticorpo compreende LCDR1, LCDR2 e LCDR3 como mostrado na SEQ ID NO: 6, SEQ ID NO: 7 e SEQ ID NO: 8, respectivamente; e uma região variável de cadeia pesada do anticorpo compreende HCDR1, HCDR2 e HCDR3 como mostrado na SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 4 e SEQ ID NO: 5, respectivamente; ou, 2) uma região variável de cadeia leve do anticorpo compreende LCDR1, LCDR2 e LCDR3 como mostrado na SEQ ID NO: 14, SEQ ID NO: 15 e SEQ ID NO: 16, respectivamente; e uma região variável de cadeia pesada do anticorpo compreende HCDR1, HCDR2 e HCDR3 como mostrado na SEQ ID NO: 11, SEQ ID NO: 12 e SEQ ID NO: 13, respectivamente; ou, 3) uma região variável de cadeia leve do anticorpo compreende LCDR1, LCDR2 e LCDR3 como mostrado na SEQ ID NO: 42, SEQ ID NO: 43 e SEQ ID NO: 44, respectivamente; e uma região variável de cadeia pesada do anticorpo compreende HCDR1, HCDR2 e HCDR3 como mostrado na SEQ ID NO: 39, SEQ ID NO: 40 e SEQ ID NO: 41, respectivamente; ou,

   4) uma região variável de cadeia leve do anticorpo compreende LCDR1, LCDR2 e LCDR3 como mostrado na SEQ ID NO: 50, SEQ ID NO: 51 e SEQ ID NO: 52, respectivamente; e uma região variável de cadeia pesada do anticorpo compreende HCDR1, HCDR2 e HCDR como mostrado na SEQ ID NO: 47, SEQ ID NO: 48 e SEQ ID NO: 49, respectivamente; ou, 5) uma região variável de cadeia leve do anticorpo compreende LCDR1, LCDR2 e LCDR3 como mostrado na SEQ ID NO: 58, SEQ ID NO: 59 e SEQ ID NO: 60, respectivamente; e uma região variável de cadeia pesada do anticorpo compreende HCDR1, HCDR2 e HCDR3 como mostrado na SEQ ID NO: 55, SEQ ID NO: 56 e SEQ ID NO: 57, respectivamente.

   2. Anticorpo anti-CD40 ou fragmento de ligação ao antígeno do mesmo, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que o anticorpo ou o fragmento de ligação ao antígeno do mesmo é um anticorpo murino, um anticorpo quimérico, um anticorpo humanizado, um anticorpo humano ou fragmento de ligação ao antígeno do mesmo.

   3. Anticorpo anti-CD40 ou fragmento de ligação ao antígeno do mesmo, de acordo com a reivindicação 2, caracterizado pelo fato de que as sequências de aminoácidos da região variável do anticorpo murino ou do anticorpo quimérico são selecionadas do grupo que consiste em:

   1) uma região variável de cadeia pesada como mostrado na SEQ ID NO: 1, e uma região variável de cadeia leve como mostrado na SEQ ID NO: 2; 2) uma região variável de cadeia pesada como mostrado na SEQ ID NO: 9, e uma região variável de cadeia leve como mostrado na SEQ ID NO: 10; 3) uma região variável de cadeia pesada como mostrado na SEQ ID NO: 37, e uma região variável de cadeia leve como mostrado na SEQ ID NO: 38; 4) uma região variável de cadeia pesada como mostrado na SEQ ID NO: 45, e uma região variável de cadeia leve como mostrado na SEQ ID NO: 46; e 5) uma região variável de cadeia pesada como mostrado na SEQ ID NO: 53, e uma região variável de cadeia leve como mostrado na SEQ ID NO: 54.

   4. Anticorpo anti-CD40 ou fragmento de ligação ao antígeno do mesmo, de acordo com a reivindicação 2, caracterizado pelo fato de que a região variável de cadeia pesada do anticorpo humanizado compreende ainda: FRs de cadeia pesada de IgG1, IgG2, IgG3 ou IgG4 humana ou variantes das mesmas, de um modo preferido, FRs de cadeia pesada de IgG1, IgG2 ou IgG4 humana, de um modo mais preferido, FRs de cadeia pesada de IgG1 ou IgG2 humana.

   5. Anticorpo anti-CD40 ou fragmento de ligação ao antígeno do mesmo, de acordo com a reivindicação 2,

   caracterizado pelo fato de que:

   os FRs da cadeia leve na região variável de cadeia leve do anticorpo humanizado são derivados de:

   uma sequência IGkV1-33 de cadeia leve de linhagem germinativa humana como mostrado na SEQ ID NO: 22, ou uma sequência IGkV2-28 de cadeia leve da linhagem germinativa humana como mostrado na SEQ ID NO: 24;

   os FRs de cadeia pesada na região variável de cadeia pesada do anticorpo humanizado são derivados de:

   uma sequência IGHV1-69 de cadeia pesada de linhagem germinativa humana como mostrado na SEQ ID NO: 21, ou uma sequência IGHV1-2 de cadeia pesada de linhagem germinativa humana como mostrado na SEQ ID NO: 23;

   de um modo preferido, os FRs de cadeia leve na região variável de cadeia leve do anticorpo humanizado são derivados de uma cadeia leve da linhagem germinativa humana IGkV1-33 como mostrado na SEQ ID NO: 22, e os FRs de cadeia pesada na região variável de cadeia pesada do anticorpo humanizado são derivados de uma cadeia pesada de linhagem germinativa humana

   IGHV1-69 como mostrado na SEQ ID NO: 21; ou,

   as FRs da cadeia leve na região variável de cadeia leve do anticorpo humanizado são derivadas de uma cadeia leve de linhagem germinativa humana IGkV2-28 como mostrado na SEQ ID

   NO: 24, e as FRs de cadeia pesada na região variável de cadeia pesada são derivadas de uma cadeia pesada de linhagem germinativa humana IGHV1-2 como mostrado na SEQ ID NO: 23.

   6. Anticorpo anti-CD40 ou fragmento de ligação ao antígeno do mesmo, de acordo com a reivindicação 5, caracterizado pelo fato de que: a cadeia leve do anticorpo humanizado é como mostrada na SEQ ID NO: 18 ou SEQ ID NO: 20 ou variante da mesma; a variante tem 0 a 10 mutação(ões) de aminoácido(s) na região variável de cadeia leve, de um modo preferido a variante tem mutação(ões) nas posições de aminoácido 2 e/ou 3, de um modo mais preferido o resíduo de aminoácido após a mutação é I, V ou L; e/ou antes da mutação da região constante de cadeia pesada, a cadeia pesada do anticorpo humanizado é como mostrada na SEQ ID NO: 17 ou SEQ ID NO: 19 ou variante das mesmas; a variante tem 0 a 10 mutação(ões) de aminoácidos na região variável de cadeia pesada, de um modo preferido a variante tem mutação(ões) nas posições de aminoácidos 6 e/ou 8, de um modo mais preferido o resíduo de aminoácido após a mutação é I, A ou L.

   7. Anticorpo anti-CD40 ou fragmento de ligação ao antígeno do mesmo, de acordo com a reivindicação 6, caracterizado pelo fato de que:

   a região variável de cadeia pesada é como mostrada em uma das SEQ ID NOs: 25-30 ou variante da mesma, a região variável de cadeia leve é como mostrada em uma das SEQ ID NOs: 31-36 ou variante da mesma; de um modo preferido, selecionado a partir do seguinte: a região variável de cadeia pesada é como mostrada na SEQ ID NO: 26 ou variante da mesma, e a região variável de cadeia leve é como mostrada na SEQ ID NO: 33 ou variante da mesma; ou a região variável de cadeia pesada é como mostrada na SEQ ID NO: 30 ou variante da mesma, e a região variável de cadeia leve é como mostrada na SEQ ID NO: 34 ou variante da mesma; ou a região variável de cadeia pesada é como mostrada na SEQ ID NO: 17 ou variante da mesma, e a região variável de cadeia leve é como mostrada na SEQ ID NO: 18 ou variante da mesma; ou a região variável de cadeia pesada é como mostrada na SEQ ID NO: 19 ou variante da mesma, e a região variável de cadeia leve é como mostrada na SEQ ID NO: 20 ou variante da mesma.

   8. Anticorpo anti-CD40 ou fragmento de ligação ao antígeno do mesmo, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 7, caracterizado pelo fato de que a cadeia pesada compreende mutação(ões) de resíduo(s) de aminoácido(s) na(s) posição(ões) selecionada(s) do grupo que consiste em: 1) posição 262 correspondendo a SEQ ID NO: 19 ou posição 266 correspondendo a SEQ ID NO: 17; e/ou 2) posição 320 correspondendo a SEQ ID NO: 19 ou posição 324 correspondendo a SEQ ID NO: 17; e/ou 3) posição 323 correspondendo à SEQ ID NO: 19 ou posição 327 correspondendo à SEQ ID NO: 17.

   9. Anticorpo anti-CD40 ou fragmento de ligação ao antígeno do mesmo, de acordo com a reivindicação 8, caracterizado pelo fato de que a cadeia pesada compreende mutação(ões) selecionada(s) do grupo que consiste em: 1) o resíduo de aminoácido na posição 262 correspondendo à SEQ ID NO: 19 ou na posição 266 correspondendo à SEQ ID NO: 17 é mutado para ácido glutâmico; e/ou 2) o resíduo de aminoácido na posição 320 correspondendo à SEQ ID NO: 19 ou na posição 324 correspondendo à SEQ ID NO: 17 é mutado para serina; e/ou 3) o resíduo de aminoácido na posição 323 correspondendo à SEQ ID NO: 19 ou na posição 327 correspondendo à SEQ ID NO: 17 é mutado para fenilalanina.

   10. Anticorpo anti-CD40 ou fragmento de ligação ao antígeno do mesmo, de acordo com a reivindicação 9, caracterizado pelo fato de que a cadeia pesada compreende mutação(ões) selecionada(s) a partir das seguintes, ou a combinação das mesmas: 1) 262E correspondendo a SEQ ID NO: 19; 2) 262E e 323F correspondendo a SEQ ID NO: 19; 3) 262E, 320S e 323F correspondendo a SEQ ID NO: 19; 4) 266E correspondendo a SEQ ID NO: 17; 5) 266E, 324S e 327F correspondendo a SEQ ID NO: 17.

   11. Anticorpo anti-CD40 ou fragmento de ligação ao antígeno do mesmo, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 2 e 4 a 10, caracterizado pelo fato de que o anticorpo humanizado compreende: uma cadeia pesada como mostrado na SEQ ID NO: 61 ou 62, e uma cadeia leve como mostrado na SEQ ID NO: 18; ou o anticorpo humanizado compreende: uma cadeia pesada como mostrado na SEQ ID NO: 63, 64 ou 67, e uma cadeia leve como mostrado na SEQ ID NO: 20.

   12. Anticorpo anti-CD40 ou fragmento de ligação ao antígeno do mesmo, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 11, caracterizado pelo fato de que o resíduo de aminoácido no terminal carboxila da cadeia pesada é mutado para resíduo de alanina; de um modo preferido, o resíduo de aminoácido no terminal carboxila da cadeia pesada como mostrado em SEQ ID NO: 61, 62, 63, 64 ou 67 é mutado para resíduo de alanina.

   13. Anticorpo de cadeia única caracterizado pelo fato de que compreende: a região variável de cadeia leve e a região variável de cadeia pesada conforme definido em qualquer uma das reivindicações 1 a 12.

   14. Conjugado anticorpo-fármaco caracterizado pelo fato de que o anticorpo compreende a região variável de cadeia leve e a região variável de cadeia pesada, conforme definido em qualquer uma das reivindicações 1 a 12; de um modo preferido, compreende o anticorpo anti-CD40 ou fragmento de ligação ao antígeno do mesmo, conforme definido em qualquer uma das reivindicações 1 a 12.

   15. Molécula de ácido nucleico caracterizada pelo fato de que codifica o anticorpo anti-CD40 ou o fragmento de ligação ao antígeno, conforme definido em qualquer uma das reivindicações 1 a 12, ou o anticorpo de cadeia única, conforme definido na reivindicação 13.

   16. Vetor caracterizado pelo fato de que compreende a molécula de ácido nucleico conforme definido na reivindicação 15.

   17. Célula hospedeira caracterizada pelo fato de que compreende ou expressa o vetor conforme definido na reivindicação 16.

   18. Célula hospedeira, de acordo com a reivindicação 17, caracterizada pelo fato de que a célula hospedeira é selecionada a partir do grupo que consiste em bactéria, levedura e célula de mamífero; de um modo preferido, a bactéria é Escherichia coli; de um modo preferido, a levedura é Pichia pastoris; de um modo preferido, a célula de mamífero é uma célula de ovário de hamster chinês ou célula de rim embrionário humano 293.

   19. Composição farmacêutica caracterizada pelo fato de que compreende: o anticorpo anti-CD40 ou fragmento de ligação ao antígeno do mesmo, conforme definido em qualquer uma das reivindicações 1 a 12, o anticorpo de cadeia única conforme definido na reivindicação 13, ou o conjugado anticorpo- fármaco, conforme definido na reivindicação 14, e um excipiente, diluente ou carreador farmaceuticamente aceitável.

   20. Uso de qualquer um selecionado do grupo que consiste no anticorpo anti-CD40 ou fragmento de ligação ao antígeno do mesmo, conforme definido em qualquer uma das reivindicações 1 a 12, o anticorpo de cadeia única conforme definido na reivindicação 13, o conjugado anticorpo-fármaco conforme definido na reivindicação 14 e a composição farmacêutica conforme definido na reivindicação 19, caracterizado pelo fato de ser na preparação de um medicamento, e o medicamento é usado para tratar ou prevenir uma doença ou condição mediada por CD40 ou CD40L; de um modo preferido, a doença ou condição é câncer; de um modo mais preferido, o câncer é selecionado do grupo que consiste em: linfoma, câncer de mama, câncer de ovário, câncer de próstata, câncer de pâncreas, câncer de rim, câncer de pulmão, câncer de fígado, câncer de estômago, câncer colorretal, câncer de bexiga, rabdomiossarcoma, câncer de esôfago, câncer cervical, mieloma múltiplo, leucemia, câncer de vesícula biliar, glioblastoma e melanoma.

   21. Uso de qualquer um selecionado a partir do grupo que consiste no anticorpo anti-CD40 ou fragmento de ligação ao antígeno do mesmo, conforme definido em qualquer uma das reivindicações 1 a 12, o anticorpo de cadeia única, conforme definido na reivindicação 13, o conjugado anticorpo-fármaco, conforme definido na reivindicação 14 e a composição farmacêutica conforme definida na reivindicação 19, caracterizado pelo fato de ser na preparação de um medicamento; e o medicamento é usado para melhorar o(s) sintoma(s) de um paciente que sofre de uma doença autoimune ou inflamatória.

   22. Método para prevenir ou tratar doença mediada por CD40 ou CD40L, o método caracterizado pelo fato de que compreende o contato de um indivíduo com uma quantidade profilaticamente efetiva ou uma quantidade terapeuticamente efetiva de qualquer um selecionado do grupo que consiste em anticorpo anti-CD40 ou fragmento de ligação ao antígeno do mesmo, conforme definido em qualquer uma das reivindicações 1 a 12, o anticorpo de cadeia única conforme definido na reivindicação 13, o conjugado anticorpo-fármaco conforme definido na reivindicação 14 e a composição farmacêutica conforme definido na reivindicação 19; de um modo preferido, a doença é câncer; de um modo mais preferido, o câncer é selecionado a partir do grupo que consiste em linfoma, câncer de mama, câncer de ovário, câncer de próstata, câncer de pâncreas, câncer de rim, câncer de pulmão, câncer de fígado, câncer de estômago, câncer colorretal, câncer de bexiga, rabdomiossarcoma, câncer de esôfago, cervical câncer, mieloma múltiplo, leucemia, câncer de vesícula biliar, glioblastoma e melanoma.

   23. Método para melhorar o(s) sintoma(s) de uma doença autoimune ou inflamatória, o método caracterizado pelo fato de que compreende o contato de um indivíduo com uma quantidade profilaticamente efetiva ou uma quantidade terapeuticamente efetiva de qualquer um selecionado do grupo que consiste em anticorpo anti-CD40 ou fragmento de ligação ao antígeno do mesmo, conforme definido em qualquer uma das reivindicações 1 a 12, o anticorpo de cadeia única conforme definido na reivindicação 13, o conjugado anticorpo-fármaco conforme definido na reivindicação 14 e a composição farmacêutica conforme definida na reivindicação 19.