KR101200188B1 - 항 ｃｄ４０ 항체의 변이체 - Google Patents

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Abstract

치료 효과를 기대할 수 있는 항 CD40 항체에 대하여, 의약품으로서의 최적화가 도모된 ADCC 활성 및 CDC 활성이 감소된 변이체의 제공. 적어도 힌지 영역이 인간 IgG2에서 유래하는 힌지 영역이고, 불변 영역에 ADCC 및(또는) CDC 활성의 감소를 초래하는 1 아미노산 이상의 변이 및(또는) 치환을 포함하는, 아고니스틱 항 CD40 모노클로날 항체의 변이체 및 불변 영역에 ADCC 및(또는) CDC 활성의 감소를 초래하는 1 이상의 변이 또는 치환을 포함하는 안타고니스틱 항 CD40 항체의 변이체.
항 CD40 항체

Description

항 ＣＤ４０ 항체의 변이체 {MUTANTS OF ANTI-CD40 ANTIBODY}
본 발명은 면역에 관여하는 세포막 분자인 CD40을 인식하는 항 CD40 항체에 관한 것이다. 또한, 본 발명은 아고니스틱(agonistic), 안타고니스틱(antagonistic) 활성을 유지하면서 ADCC 활성, CDC 활성을 감소시키기 위해서 인간 항체 불변 영역에 변이를 도입한 항체, 또는 서브클래스의 일부 구조를 치환한 항체에 관한 것이다.
1. CD40
CD40은 분자량 50 kDa의 세포막 표면에 존재하는 항원이고, B 세포, 수상 세포(dendritic cell; DC), 어떤 종류의 암 세포, 또한 흉선 상피 세포에 발현되고 있다. CD40은 B 세포나 DC의 증식, 분화에 중요한 기능을 하고 있는 것으로 알려져 있다. CD40은 인간 B 세포 표면에 발현하는 항원으로서 동정되고(E. A. Clark et. al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 83: 4494, 1986, I. Stamenkovic et. al., EMBO J, 8:1403, 1989), 아미노산 서열의 상동성으로부터, CD40은 저친화성 NGF 수용체나 TNF 수용체, CD27, OX40, CD30 등이 속해 있는 TNF 수용체 패밀리 중 하나의 멤버로서 생각 되고 있다. 인간 및 마우스의 CD40에 대한 리간드(CD40L)는, 최근 유전자 클로닝되어 II형 막 단백질인 것 및 활성화된 CD40+T 세포에 발현되고 있는 것을 알 수 있었다. CD40L은 강력한 활성화 시그널을 인간 및 마우스의 B 세포에 도입하는 것도 알았다.
또한, 수상 세포에는 B 세포보다 많은 CD40 발현이 확인되고 있고, 중요한 역할을 담당하고 있는 것이 분명해졌다. CD40이 CD40L과 결합하면, 항원 제시 세포(APC)의 활성화, 즉 CD80(B7-1)이나 CD86(B7-2) 등의 보조 자극 분자의 발현, 또는 IL-I2의 생산이 증강된다(Caux, C., et al.: Activation of human dendritic cells through CD40 cross-linking. J. Exp. Med., 180:1263, 1994), (Shu, U., et al.: Activated T cells induce interleukin-12 production by monocyte via CD40-CD40 ligand interaction. Eur. J. Immunol., 25: 1125. 1995). 수상 세포는 강한 항원 제시능을 가지고, 강력한 핼퍼 T(Th) 세포 활성화능을 가지고 있다. 또한, 나이브(naive) Th 세포의 Th1 또는 Th2 세포로의 분화를 수상 세포가 제어하고 있다고 생각되었다. 미엘로이드계 수상 세포인 말초혈 단구를 GM-CSF 및 IL-4와 함께 배양하여 CD40L에 의해 성숙시킨 수상 세포(DC1)은 시험관 내에서 IL-12 생산능을 가지고, 이계(異系) 나이브 Th 세포를 자극 활성화하여, IFNγ 생산 T 세포를 유도한다(즉 Th1로의 분화를 촉진시킴). 이 작용은 항 IL-12 항체에 의해 저해되기 때문에, IL-12를 통한 반응이라고 생각된다. 한편 림프 조직 T 영역이나, 말초혈에 존재하는 형질세포 T 세포를 IL-3, CD40 리간드와 동시에 배양한 림프구계수상 세포(DC2)는, IL-12 생산능은 가지지 않고, 또한 이계 나이브 Th 세포를 자극 활성화하여, IL-4 생산 T 세포를 유도하고, Th2로의 분화를 촉진시키는 것이 나타났다. Th1 세포는 세포성 면역의 활성화에 관계되고, Th2 세포는 액성 면역능을 높이면서 동시에 세포성 면역능의 억제에 관여한다고 생각되었다. Th1 세포의 도움으로 활성화된 세포 상해성 T 세포(CTL)는 세포질 내에서 증식하는 병원체(많은 바이러스, 리스테리아균, 결핵균 및 톡소플라즈마 원충 등)나 종양 세포를 제거할 수 있다.
막 표면에 발현한 CD40을 인식하는 항 CD40 모노클로날 항체가, B 세포에 대하여 각종 생물 활성을 나타내는 것으로 개시되어 왔다. 항 CD40 모노클로날 항체는, CD40과 CD40L과의 상호 작용에 대하여 아고니스틱인 것과 안타고니스틱인 것으로 크게 구별된다.
2. 아고니스틱 항체
아고니스틱 항체의 작용으로서, B 세포의 활성화가 알려져 있다. 예를 들면, 항 CD40 항체가 세포 접착을 유도하고(Barrett et al., J. Immunol 146: 1722, 1991; Gordon et al., J. Immunol. 140: 1425, 1988), 세포의 크기를 증진시키며(Gordon et al. J. Immunol. 140: 1425, 1988; Valle et al., Eur. J. Immunol. 19: 1463, 1989), 항 IgM 항체, 항 CD20 항체 또는 포르볼 에스테르만으로 활성화된 B 세포의 분열을 유도하고(Clark and Ledbetter, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 83: 4494, 1986; Gordon et al., LEUCOCYTE TYPING III. A. J. McMicheal ed. 0xford University Press. 0xford, p.426: Paulie et al., J. Immunol. 142: 590, 1989), IL4 존재하에서 B 세포의 분열을 유도하며(Valle et al., Eur. J. Immunol. 19: 1463, 1989; Gordon et al., Eur. J. Immunol. 17: 1535, 1987), IL-4 자극, T 세포 제거 배양 세포의 IgE(Jabara et al, J. Exp. Med. 172: 1861, 1990: Gascan et al, J. Immunol. 147: 8, 1991), IgG, IgM(Gascan et al., J. Immunol, 147: 8, 1991)의 발현을 유도하고, IL-4에 의한 B 세포로부터의 가용성 CD23/FceRII의 분비와(Gordon and Guy, Immunol. Today 8:339, 1987; Cairns et al., Eur. J. Immunol. 18: 349, 1988) 세포 상의 발현 증강(Challa A, Allergy, 54: 576, 1999)을 수행하며, IL-6의 생산을 촉진시키는(Clark and Shu, J. Immunol. 145: 1400, 1990) 것이 보고되어 있다. 또한, CDw32+ 접착 세포 존재하에서 IL-4 및 항 CD40 항체를 첨가함으로써, 인간 초대 배양 B 세포로부터 B 세포 클론을 수립하는 것이나(Bancherau et al. Science 241:70, 1991), 배(胚) 중심의 중심 세포의 아포토시스가, 항원 수용체의 작용에 불문하고, CD40을 통해 저해되는 것(Liu et al., Nature 342: 929, 1989)이 보고되어 있다. 이상과 같이 CD40은 인간 B 세포 표면에 발현하는 항원으로서 동정되었기 때문에, 단리된 항체의 대부분은 주로 인간 B 세포에 대한 증식 분화 유도 기능, 암 세포에 있어서의 세포사 유도 활성을 지표로 평가되어 왔다(Katira, A. et. al., LEUKOCYTE TYPING V. S. F. Schlossossman, et. al. eds., p.547. 0xford University Press. 0xford, W. C. Flansow et. al., LEUKOCYTE TYPING V. S. F. Schlossossman, et. al. eds. p.555. 0xford University Press. Oxford, J. D. Pound et. al., International Immunology, 11: 11, 1999).
항 CD40 항체가 DC를 성숙시키는 것이 개시되었다(Z. H, Zhou et, al., Hybridoma, 18:471 1999). 또한, 항원 특이적 CD8T 세포 프라이밍에 있어서의 CD4T 세포의 역할은, CD40-CD40L 시그널링을 통한 DC의 활성화에 있는 것이 보고되 고, 항 CD40 모노클로날 항체(mAb)에 의해 수상 세포(DC)의 활성화에 있어서의 CD4 핼퍼 T 세포의 역할을 대체할 수 있는 것이 개시되었다(Shoenbergerv S. P., et. al.: T-cell help for cytotoxic T lymphocytes is mediated by CD40-CD40L interactions. Nature, 480, 1998). 또한, 마우스에 있어서 항 CD40 항체의 투여에 의해 CD40을 발현하는 종양 세포뿐만 아니라 비발현 종양 세포로부터도 생체를 방어 가능한 것이 개시되었다(French, R. R., et. al.: CD40 antibody evokes a cytotoxic T-cell response that eradicates lymphoma and bypasses T-cell help. Nature Medicine, 5, 1999).
상술한 기능에 기초하여, 아고니스틱 항 CD40 항체는 세균, 바이러스 등의 감염증 치료, 암 치료 등에 사용할 수 있는 것으로 생각되었다. WO02/088186에는 우수한 아고니스틱 활성을 갖는 항 CD40 항체가 기재되어 있다. 상기 아고니스틱 항체의 대표예로서 KM341-1-19 항체 및 2105 항체를 들 수 있다. KM341-1-19 항체를 생산하는 하이브리도마 KM341-1-19는 2001년 9월 27일 2105 항체를 생산하는 하이브리도마 2105는 2002년 4월 17일에, 독립 행정 법인 산업 기술 종합 연구소 특허 생물 기탁 센터(이바라기껭 쯔꾸바시 히가시 1쪼메 1반지 1주오 다이 6)에 부다페스트 조약에 기초하여 국제 기탁되어 있다. 수탁 번호는 FERM BP-7759(KM341-1-19) 및 FERM BP-8024(2105)이다.
3. 안타고니스틱 항체
한편, 상기한 바와 같이, CD40가 면역 반응에 있어서 중요한 역할을 담당하고 있기 때문에, CD40과 그의 리간드의 결합을 저해함으로써, 장기 이식시의 면역 억제나 자기 면역 질환의 치료약을 개발할 수 있다고 기대된다. Sawada-Hase 등은, 클론병 환자의 말초혈 중의 단구에서는 CD40을 강하게 발현하는 세포의 비율이 상승하는 것을 보고하였다. 그러나, CD40과 그의 리간드의 결합을 저해하는 항체에 대해서는, 아직 잘 알려져 있지 않다. 그와 같은 저해성 항체는, 예를 들면 CD40의 기능 해석이나, CD40의 활성화가 필요한 질환의 치료에 유효할 가능성이 있다. 또한, CD40 리간드에 대한 저해 항체도, CD40과 CD40 리간드와의 결합이 관여하는 질환약으로서 유효한 가능성이 나타나 있다. 그러나, CD40L은 활성화된 혈소판에 발현한다는 보고(V. Henn et. al., Nature 391: 591, 1998)가 있기 때문에, 항 CD40L 항체를 치료약으로서 사용한 경우, 혈전을 야기할 위험성이 존재하는 것이 보고되어 있다(T. Kawai et. al., Nat. Medi. 6: 114, 2000). 이러한 관점에서, CD40과 그의 리간드의 결합을 저해하는 항체 치료약으로서는, 항 CD40L 항체보다 오히려 CD40에 대한 항체의 경우가 안전성이 우수하다고 기대할 수 있다. 항 CD40 항체로서는 CD40L의 CD40에의 결합을 억제하고, 또한 항체 자체가 CD4D를 활성화하지 않는 것이 필요하다.
상술한 기능에 기초하여, 안타고니스틱 항 CD40 항체는, 자기 면역 질환의 치료, 장기, 골수 등의 이식에 있어서의 거절 반응의 억제에 사용할 수 있을 것으로 생각된다. WO02/088186에는 우수한 안타고니스틱 활성을 갖는 항 CD40 항체가 기재되어 있다. 상기 안타고니스틱 항체의 대표예로서 4D11 항체를 들 수 있다. 4D11 항체를 생산하는 하이브리도마 4D11은 2001년 9월 27일에, 독립 행정 법인 산업 기술 종합 연구소 특허 생물 기탁 센터(이바라기껭 쯔꾸바시 히가시 1쪼메 1반 지 1주오 다이 6)에 부다페스트 조약에 기초하여 국제 기탁되어 있다. 수탁 번호는 FERM BP-7758이다.
특허 문헌 1: W002/088186호 공보
<발명의 개시>
본건 발명은 WO02/088186에 개시된, 치료 효과를 기대할 수 있는 항 CD40 항체에 대하여, 의약품으로서의 최적화가 도모된 변이체를 제조하는 것을 목적으로 한다.
본 발명자들은 예의 연구한 결과, 종래 알고 있었던 항 CD40 항체에 비해, 보다 질환에의 치료 효과가 높다고 생각되는 신규한 아고니스틱 항체, 및 안타고니스틱 항체의 변이체를 제조하는 것에 성공하여 본 발명을 완성하였다. 본건 발명에 있어서의 항 CD40 항체의 개변에 대한 기본적인 생각 방법을 하기에 상술한다.
본 명세서는 본원의 우선권의 기초인 일본 특허 출원 2003-431408호의 명세서 및(또는) 도면에 기재되는 내용을 포함한다.
도 1A-1은 항 CD40 아고니스트 항체의 CD40을 배열을 기초로 제조한 펩티드에의 결합 부위를 나타낸 도면이다.
도 1A-2는 항 CD40 아고니스트 항체의 CD40을 배열을 기초로 제조한 펩티드에의 결합 부위를 나타낸 도면이다(도 1A-1의 계속).
도 1B-1은 항 CD40 안타고니스트 항체의 CD40을 배열을 기초로 제조한 펩티 드에의 결합 부위를 나타낸 도면이다.
도 1B-2는 항 CD40 안타고니스트 항체의 CD40을 배열을 기초로 제조한 펩티드에의 결합 부위를 나타낸 도면이다(도 1B-1의 계속).
도 2A는 변이 CD40에 대한 항 CD40 항체의 결합성을 나타낸 도면이다.
도 2B는 변이 CD40에 대한 항 CD40 항체의 결합성을 나타낸 도면이다.
도 2C는 변이 CD40에 대한 항 CD40 항체의 결합성을 나타낸 도면이다.
도 3A는 KM341-1-19 항체에 P331S의 변이를 도입하여도, Ramos 세포에의 결합 활성이 동일한 정도인 것을 나타낸 도면이다.
도 3B는 KM341-1-19 항체에 P331S의 변이를 도입하여도, Ramos 세포에의 CD95 발현 촉진 활성이 동일한 정도인 것을 나타낸 도면이다.
도 4A는 KM341-1-19 항체에 P331S의 변이를 도입하면, 토끼 보체를 사용한 CDC 활성이 억제되는 것을 나타낸 도면이다.
도 4B는 인간 보체를 사용한 경우, G2/4가 낮은 보체 활성이 있는 것을 나타낸 도면이다.
도 5A-1은 2105 항체의 서브클래스를 IgG2로부터 다른 서브클래스로 변환한 경우, Ramos 세포에의 결합은 변화하지 않는 것을 나타낸 도면이다.
도 5A-2는 KM341-1-19 항체의 서브클래스를 IgG2로부터 다른 서브클래스로 변환한 경우, Ramos 세포에의 결합은 변화하지 않는 것을 나타낸 도면이다.
도 5B-1은 2105 항체의 서브클래스를 IgG2로부터 다른 서브클래스로 변환한 경우, Ramos 세포에의 CD95 발현 촉진 활성이 저하하는 것을 나타낸 도면이다.
도 5B-2는 KM341-1-19 항체의 서브클래스를 IgG2로부터 다른 서브클래스로 변환한 경우, Ramos 세포에의 CD95 발현 촉진 활성이 저하하는 것을 나타낸 도면이다.
도 6A-1은, KM341-1-19 항체의 Ramos 세포에의 결합능은 힌지(hinge)의 구조에 의존되지 않는 것을 나타낸 도면이다.
도 6A-2는, 2105 항체의 Ramos 세포에의 결합능은 힌지의 구조에 의존되지 않는 것을 나타낸 도면이다.
도 6B-1은, KM341-1-19 항체의 Ramos 세포에의 CD95 발현 촉진 활성은 상부(upper) 힌지, 중부(middle) 힌지가 중요한 것을 나타낸 도면이다.
도 6B-2는, 2105 항체의 Ramos 세포에의 CD95 발현 촉진 활성은 상부 힌지, 중부 힌지가 중요한 것을 나타낸 도면이다.
도 7A는, F72를 IgG2 서브클래스로 변환하면, Ramos 세포에의 결합능은 변화하지 않는 것을 나타낸 도면이다.
도 7B는, F72를 IgG2 서브클래스로 변환하면, CD95 발현 촉진 활성은 상승되는 것을 나타낸 도면이다.
도 8A는, 4D11 항체의 서브클래스를 IgG1로부터 IgG4로 변환한 경우, Ramos 세포에의 결합은 변화하지 않는 것을 나타낸 도면이다.
도 8B는, 4D11 항체의 서브클래스를 IgG1로부터 IgG4로 변환한 경우, CD40 리간드에 의한 Ramos 세포에 있어서의 CD95의 발현 상승을 동일한 정도 저해하는 것을 나타낸 도면이다.
도 9는, 4D11 항체의 서브클래스를 IgG1로부터 IgG4, IgG4PE로 변환시킨 경우, ADCC 활성이 저감된 것을 나타낸 도면이다.
도 10은, 4D11 항체의 서브클래스를 IgG1로부터 IgG4P로 변환시킨 경우, CDC 활성이 감소된 것을 나타낸 도면이다.
도 11은 4D11G1, 4D11G4P, 4D11G4PE를 인간 CD40 트랜스제닉 마우스에게 투여한 후의 혈 중 B 세포수의 변화(말초혈 림프구 중의 B220 양성 세포)를 나타낸 도면이다.
도 12A는 항 CD40 항체를 인간 CD40 트랜스제닉 마우스에게 투여한 후 비장 B 세포의 CD23의 발현 상승(비장 B 세포 중의 CD23 양성 세포)을 나타낸 도면이다.
도 12B는 항 CD40 항체를 인간 CD40 트랜스제닉 마우스에 투여한 후의 비장 B 세포의 CD86의 발현 상승(비장 B 세포 중의 CD86양성 세포)을 나타낸 도면이다.
도 12C는 항 CD40 항체를 인간 CD40 트랜스제닉 마우스에 투여한 후의 비장 B 세포의 CD95의 발현 상승(비장 세포 중의 CD95 양성 세포)을 나타낸 도면이다.
도 13A는 인간 CD40 트랜스제닉 마우스에 있어서의 4D11, 281-1-10에 의한 항원 특이적 항체(IgG1) 생산 억제 활성을 나타낸 도면이다.
도 13B는 인간 CD40 트랜스제닉 마우스에 있어서의 4D11, 281-1-10에 의한 항원 특이적 항체(IgM) 생산 억제 활성을 나타낸 도면이다.
도 14A는 항원 특이적 항체 생산 억제 활성 시험시의 혈 중 B 세포수(말초혈 림프구 중의 B220 양성 세포)를 나타낸 도면이다.
도 14B는 항원 특이적 항체 생산 억제 활성 시험시의 비장 중 B 세포수(비장 림프구 중의 B220 양성 세포)를 나타낸 도면이다.
도 15는 카니쿠이 원숭이(cynomolgus monkey)에 30 mg/kg의 4D11G4P, 4D11G4PE를 투여한 경우의 혈중 B 세포수(말초혈 림프구 중의 B220 양성 세포)의 변화를 나타낸 도면이다.
도 16은 도 15의 시험시의 혈중 IL-12 농도를 나타낸 도면이다.
도 17은 4D11G4PE의 원숭이 DTH 억제 효과(수컷 카니쿠이 원숭이에 있어서의 지연형 과민증)를 나타낸 도면이다.
도 18은 도 17에 결과를 나타내는 시험에서의 항 테타누스 톡신 IgG의 역치를 나타낸 도면이다.
도 19는 도 17에 결과를 나타내는 시험에서의 항 테타누스 톡신 I9M의 역치를 나타낸다.
도 20A는 4D11G4PE와 5C8(항 CD40 리간드 항체)의 혈소판 응집에 대한 영향을 나타낸 도면이다.
도 20B는 4D11G4PE와 5C8(항 CD40 리간드 항체)의 혈소판 응집에 대한 영향을 나타낸 도면이다.
도 21은 4D11G4P, 4D11G4PE, 4D11G2Ser, 4D11G4/2/4를 pH 2.7, 37 ℃에서 인큐베이팅한 후의 올리고머 함유율의 변화를 나타낸 도면이다.
도 22는 항 CD40 안타고니스틱 항체에 의한 피부 이식편 거절 억제 작용을 나타낸 도면이다.
도 23은 Ramos 세포를 이식한 담암 마우스에게 341G2Ser을 투여한 경우의 세 포 이식 후의 종양 체적의 변화를 나타낸 도면이다.
도 24는 T24 세포를 이식한 담암 마우스에게 341G2Ser을 투여한 경우의 세포 이식 후의 종양 체적의 변화를 나타낸 도면이다.
도 25는 Hs 766T 세포를 이식한 담암 마우스에게 341G2Ser을 투여한 경우의 세포 이식 후의 종양 체적의 변화를 나타낸 도면이다.
도 26은 Capan-2 세포를 이식한 담암 마우스에게 341G2Ser을 투여한 경우의 세포 이식 후의 종양 체적의 변화를 나타낸 도면이다.
<발명을 실시하기 위한 최선의 형태>
1. 아고니스틱 항체의 개변(modification)
항체는 본래 외래의 미생물, 바이러스나 암에 대한 생체 방어 기능을 수행하는 분자이기 때문에, 항체가 결합한 세포를 살상하고, 제거하는 작용을 겸비하고 있다.
이 살상 기능에는 2종류가 있고, 항체 의존성 세포성 세포 상해 활성(Antibody-Dependent Cellular Cytotoxicity. 이하, ADCC라 약기), 및 보체 의존성 세포 상해 활성(Complement-Dependent Cytotoxicity. 이하, CDC라 약기)이라고 되어 있다.
ADCC는 매크로파지, NK 세포, 호중구 등의 표면에 발현되고 있는 Fc 수용체를 통해 항체의 불변 영역과 결합함으로써 세포를 인식하고, 인식한 세포가 활성화됨으로써 유도되는 세포 장해 활성의 것을 말한다. 한편, CDC는 항체가 항원과 결합함으로써, 활성화된 보체계에 의해 야기되는 세포 장해 활성의 것을 말한다. 이들 활성은, 항체의 서브클래스에 의해서 그 활성의 강약이 다른 것으로 이해되고 있고, 그것은, 항체의 불변 영역의 구조의 차이에서 기인하는 것으로 알려져 있다(Charles A. Janeway et. al. Immunobiology, 1997, Current Biology Ltd/Garland Publishing Inc.).
항 CD40 아고니스틱 항체는, 면역 활성화라는 작용 메카니즘으로부터 ADCC, CDC라 하는, CD40 발현 세포의 세포사를 일으키는 활성을 갖지 않는 것이 치료약으로서 보다 바람직하다고 생각된다. 만일, ADCC, CDC 활성에 의해서 CD40 발현 세포가 장해를 받아 버린 경우, 기대하는 면역 활성화와는 반대의 면역 억제 상태가 될 가능성을 생각할 수 있고, 질환의 증악을 초래할 가능성이 생각된다. 또한,감염증의 치료약으로서 사용하는 경우, 원래 환자의 CDC, ADCC 활성이 항진될 가능성을 생각할 수 있고, 정상의 인간 혈청이나, 말초혈을 이용한 경우, 그의 활성을 검출할 수 없었다고 해도, 보다 강한 활성을 갖는 토끼 보체 등을 이용하여 안전성에 대하여 보다 신중하게 평가할 필요가 있다. 그 때문에, ADCC, CDC 활성을 갖지 않는 변이체나, 재조합체를 제조하여 그의 활성을 조사하였다.
ADCC, CDC 활성은, 항체의 서브클래스에 따라서 활성이 다른 것이 알려져 있기 때문에, ADCC, CDC 활성의 감소는 서브클래스의 변환에 의해 가능하다고 생각된다. 예를 들면, 일반적으로 인간 IgG 서브클래스 중에서, IgG4는 ADCC, CDC 활성이 낮은 서브클래스로서 알려져 있고, IgG2는 CDC 활성은 있지만, ADCC 활성은 낮으며, IgG1은 ADCC, CDC 활성의 양방(兩方) 모두 높은 것이 보고되어 있다(Charles A. Janeway et. al. Immunobiology, 1997, Current Biology Ltd/Garland Publishing Inc.). 이 특징을 활용하여, 특정 서브클래스를 선택함으로써 세포 장해 활성이 적은 항체로 할 수 있다. 또한, 특정 서브클래스의 항체와 이하에 나타내는 점 변이의 조합에 의해 목적하는 활성을 갖는 항체를 만들 수 있다. 또한, ADCC, CDC 활성을 감소시키는 방법으로서는, 항체 불변 영역에 변이를 도입함으로써 가능하다는 것이 보고되어 있다. 예를 들면, L235, D265, D270, K322, P331, P329(알파벳은 아미노산의 1 문자 표기. 숫자는 Kabat 등에 의한 EU 인덱스(Kabat et. al., Sequences of proteins of Immunological Interest. 1991 Fifth edition)를 나타낸다. 이하, 동일함)는, 인간 IgG의 보체 활성화능에 중요한 역할을 수행한다고 생각되고 있고, 이 부위를 다른 아미노산으로 치환함으로써 CDC 활성을 감소시킬 수 있다(Esohe E. Idusogie et. al. J. Immunol. 2000, 164:4178-4184, Yuanyuan Xu et. al. J. Biol. Chem. 1994, 269:3469-3474, Brekkev 0. H. et. al. Eur. J. Immunol. 1994, 24:2542, Morgan, A., et. al., Immunology 1995, 86:319, Lund, J., et. al., J. Immunol., 1996, 157:4963. Tao, M. H., et. al., J. Exp. Med. 1993, 178:661). 구체적으로는, D270, K322, P329, P331을 A로 치환함으로써 가능하다. 또한, P331을 S나 G로 변환함으로써도 가능하다.
또한, Glu233-Ser239, Gly316-Lys338, Lys274-Arg301, Tyr407-Arg416, Asn297, Glu318, Leu234-Ser239, AsP265-Glu269, Asn297-Thr299, Ala327-Ile332는 IgG과 FcR의 결합에 관여하고 있다고 생각되고 있고(Duncan, A. R., Woof, J. M., Partridge, L. J., Burton, D. R., and Winter, G.(1988) Nature 332, 563-564, Gessner, J. E., Heiken, H., Tamm, A., and Schmidt, R. E.(1998) Ann. Hematol. 76, 231-248, Gavin, A., Hulettv M., and Hogarth, P. M.(1998) in The Immunoglobulin Receptors and Their Physiological and Pathological Roles in Immunity(van de Winkel, J.G.J., and Hogarth, P. M., eds), pp.11-35, Kluwer Academic Publishers Gloup, Dordrecht, The Netherlands, Sautes, C.(1997) in Cell-mediated Effects of Immunoglobulins(Fridman, W. H., and Sautes, C., eds) . pp.29-66, R. G. Landes C0., Austin, TX, Da'ron, M.(1997) Annu. Rev. Immunol. 15, 203-234, Canfield, S. M., and Morrison, S. L.(1991) J. Exp. Med. 173, 1483-1491, Chappel, M. S., Isenman, D. E., Everett, M., Xu, Y. -Y., Dorringon, K. J., and Klein, M. H.(1991) Proc. Natl. Acad. Sci. U,S.A. 88, 9036-9040, Woof. J. M., Partridge, L. J., Jefferis, R., and Burton, D. R.(1986) Mol. Immunol. 23, 319-330, Wines, B. D., Powell, M. S., Parren, P.W. H.I., Barnes, N., and Hogarth, P. M.(2000) J. Immunol. 164, 5313-5318), 영역에 변이를 도입함으로써 ADCC 활성의 감소가 가능하다고 생각된다. 구체적으로는 L235를 E, G237을 A로 치환함으로써 FcR과의 결합능을 감소시키는 것은 가능하다.
본 발명의 항체는, 상기 ADCC 및(또는) CDC 활성을 감소시키는 아미노산의 변이를 1 이상, 바람직하게는 1 내지 20개, 1 내지 17개, 1 내지 16개, 1 내지 15개, 1 내지 14개, 1 내지 13개, 1 내지 12개, 1 내지 11개, 1 내지 10개, 1 내지 9개, 1 내지 8개, 1 내지 7개, 1 내지 6개, 1 내지 5개, 1 내지 4개, 1 내지 3개 또는 1 또는 2개 갖는다.
일부 항 CD40 항체에 대해서는, 강력한 아고니스트 활성의 발현에 대하여 IgG2의 힌지 영역이 중요한 것이 본 발명에서 나타났다. 따라서, 가변 영역과, 힌지 영역 이외의 불변 영역을 임의의 서브클래스로 치환하는 것이나 점 변이를 도입함으로써, ADCC, CDC 활성의 조정뿐 아니라, 항체의 생산성의 향상, 정제 및 보존시에 있어서의 안정성, 혈 중 동체(動體)의 향상을 기대할 수 있다.
항체 의약의 생산에 있어서는, 항체의 정제 및 보존시의 안정성은 매우 중요한 포인트가 된다. 지금까지 개발된 항체는 IgG1 서브클래스가 가장 많기 때문에, 상술한 항 CD40 아고니스트 항체의 물성을 보다 향상시키기 위해서는, 가변 영역과 힌지 영역 이외에는 IgG1 서브클래스 유래의 배열로 하는 것도 효과적일 것이다.
본건 발명은 이하의 아고니스틱 항 CD40 항체 가변체 등을 제공한다.
[1] 인간 IgG2의 상부 힌지 및 중부 힌지를 가지고, 불변 영역에 ADCC 및(또는) CDC의 증가 또는 감소를 일으키는 1 이상의 아미노산의 결실 또는 치환 또는 1 이상의 아미노산이 부가된 아고니스트 활성을 갖는 CD40에 결합하는 모노클로날 항체의 중쇄.
[2] 불변 영역이 인간 IgG인 [1]의 중쇄.
[3] 인간 IgG가 인간 IgG1인 [2]의 중쇄.
[4] 인간 IgG가 인간 IgG2인 [2]의 중쇄.
[5] 인간 IgG가 인간 IgG3인 [2]의 중쇄.
[6] 인간 IgG가 인간 IgG4인 [2]의 중쇄.
[7] 불변 영역의 아미노산의 치환이, Kabat 등에 의한 EU 인덱스에 의해 표시되는 331 위치의 프롤린의 세린으로의 치환인 [3] 내지 [5] 중 어느 것의 중쇄.
[8] [1] 내지 [7] 중 어느 것의 중쇄를 포함하는 모노클로날 항체.
[9] 하이브리도마 KM341-1-19(수탁 번호 FERM BP-7759)가 생산하는 모노클로날 항체의 중쇄의 가변 영역을 갖는 [1] 내지 [7] 중 어느 것의 중쇄.
[10] [9]의 중쇄 및 하이브리도마 KM341-1-19(수탁 번호 FERM BP-7759)가 생산하는 모노클로날 항체의 경쇄의 가변 영역을 갖는 경쇄로 이루어지는 모노클로날 항체.
[11] 서열 38로 표시되는 폴리펩티드의 가변 영역을 갖는 [1] 내지 [7] 중 어느 것의 중쇄.
[12] [11]의 중쇄 및 서열 40으로 표시되는 폴리펩티드의 가변 영역을 갖는 모노클로날 항체의 경쇄로 이루어지는 모노클로날 항체.
[13] 서열 132로 표시되는 폴리펩티드로부터 시그널 서열을 제외한 부분을 포함하는 [1]의 중쇄.
[14] [13]의 중쇄 및 서열 134로 표시되는 폴리펩티드로부터 시그널 서열을 제외한 부분으로 이루어지는 모노클로날 항체의 경쇄로 이루어지는 모노클로날 항체.
[15] 서열 131로 표시되는 폴리뉴클레오티드 숙주로부터 생산되는 [1]의 중쇄.
[16] 서열 131로 표시되는 폴리뉴클레오티드 및 서열 133으로 표시되는 폴리뉴클레오티드를 갖는 발현 벡터를 포함하는 숙주로부터 생산되는 [8]의 모노클로 날 항체.
[17] 하이브리도마 2105(수탁 번호 FERM BP-8024)가 생산하는 모노클로날 항체의 중쇄의 가변 영역을 갖는 [1] 내지 [7] 중 어느 것의 중쇄.
[18] [17]의 중쇄 및 하이브리도마 2105(수탁 번호 FERM BP-8024)가 생산하는 모노클로날 항체의 경쇄의 가변 영역을 갖는 경쇄로 이루어지는 모노클로날 항체.
[19] 서열 42로 표시되는 폴리펩티드의 가변 영역을 갖는 [1] 내지 [7] 중 어느 것의 중쇄.
[20] [19]의 중쇄 및 서열 44로 표시되는 폴리펩티드의 가변 영역을 갖는 모노클로날 항체의 경쇄로 이루어지는 모노클로날 항체.
[21] 서열 136으로 표시되는 폴리펩티드로부터 시그널 서열을 제외한 부분을 포함하는 [1]의 중쇄.
[22] [21]의 중쇄 및 서열 138로 표시되는 폴리펩티드로부터 시그널 서열을 제외한 부분으로 이루어지는 모노클로날 항체의 경쇄로 이루어지는 모노클로날 항체.
[23] 서열 135로 표시되는 폴리뉴클레오티드를 갖는 발현 벡터를 포함하는 숙주로부터 생산되는 [1]의 중쇄.
[24] 서열 135로 표시되는 폴리뉴클레오티드 및 서열 137로 표시되는 폴리뉴클레오티드를 갖는 발현 벡터를 포함하는 숙주로부터 생산되는 [8]의 모노클로날 항체.
[25] 서열 131로 표시되는 폴리뉴클레오티드.
[26] 서열 133으로 표시되는 폴리뉴클레오티드.
[27] [25]의 폴리뉴클레오티드를 갖는 발현 벡터.
[28] [26]의 폴리뉴클레오티드를 갖는 발현 벡터.
[29] [25] 및 [26]의 폴리뉴클레오티드를 갖는 발현 벡터.
[30] [27]의 발현 벡터를 포함하는 숙주.
[31] [28]의 발현 벡터를 포함하는 숙주.
[32] [29]의 발현 벡터를 포함하는 숙주.
[33] [30]의 숙주를 배양액 중에서 배양하고, 상기 배양물 및(또는) 상기 숙주로부터 모노클로날 항체의 중쇄를 취득하는 공정을 포함하는, 모노클로날 항체의 중쇄를 제조하는 방법.
[34] [32]의 숙주를 배양액 중에서 배양하고, 상기 배양물 및(또는) 상기 숙주로부터 모노클로날 항체를 취득하는 공정을 포함하는, 모노클로날 항체를 제조하는 방법.
[35] 서열 135로 표시되는 폴리뉴클레오티드.
[36] 서열 137로 표시되는 폴리뉴클레오티드.
[37] [35]의 폴리뉴클레오티드를 갖는 발현 벡터.
[38] [36]의 폴리뉴클레오티드를 갖는 발현 벡터.
[39] [35] 및 [36]의 폴리뉴클레오티드를 갖는 발현 벡터.
[40] [37]의 발현 벡터를 포함하는 숙주.
[41] [38]의 발현 벡터를 포함하는 숙주.
[42] [39]의 발현 벡터를 포함하는 숙주.
[43] [40]의 숙주를 배양액 중에서 배양하고, 상기 배양물 및(또는) 상기 숙주로부터 모노클로날 항체의 중쇄를 취득하는 공정을 포함하는, 모노클로날 항체의 중쇄를 제조하는 방법.
[44] [42]의 숙주를 배양액 중에서 배양하고, 상기 배양물 및(또는) 상기 숙주로부터 모노클로날 항체를 취득하는 공정을 포함하는, 모노클로날 항체를 제조하는 방법.
[45] 인간 IgG2의 상부 힌지 및 중부 힌지를 가지고 있지 않은 항체의 상부 힌지 및 중부 힌지를, 인간 IgG2의 상부 힌지 및 중부 힌지로 치환하는 공정을 포함하는, 아고니스트 활성을 갖는 CD40에 결합하는 모노클로날 항체의 중쇄의 제조 방법.
[46] CD40에 결합하는 모노클로날 항체의 중쇄의 가변 영역의 폴리펩티드를 특정하는 공정을 포함하는, 상기 가변 영역과 인간 IgG2의 상부 힌지 및 중부 힌지를 갖는 모노클로날 항체의 중쇄의 제조 방법.
[47] 인간 IgG2의 상부 힌지 및 중부 힌지를 가지고 있지 않은 항체의 상부 힌지 및 중부 힌지를, 인간 IgG2의 상부 힌지 및 중부 힌지로 치환하는 공정을 포함하는, 아고니스트 활성을 갖는 CD40에 결합하는 모노클로날 항체의 제조 방법.
[48] CD40에 결합하는 모노클로날 항체의 중쇄의 가변 영역의 폴리펩티드를 특정하는 공정을 포함하는, 상기 가변 영역과 인간 IgG2의 상부 힌지 및 중부 힌지 를 갖는 모노클로날 항체의 제조 방법.
[49] [8], [10], [12], [14], [16], [18], [20], [22] 및 [24] 중 어느 것의 모노클로날 항체를 유효 성분으로서 포함하는 의약 조성물.
[50] 악성 종양, 병원체 또는 자기 면역 질환의 예방 또는 치료에 이용되는 [49]의 의약 조성물.
[51] [49]의 의약 조성물을 포유 동물에게 투여하는 것을 포함하는, 악성 종양, 병원체 또는 자기 면역 질환을 예방 또는 치료하는 방법.
[52] 악성 종양, 병원체 또는 자기 면역 질환의 예방 또는 치료에 이용되는 의약 조성물을 제조하기 위한 [8], [10], [12], [14], [16], [18], [20], [22] 및 [24] 중 어느 것의 모노클로날 항체의 사용.
[89] 서열 131로 표시되는 폴리뉴클레오티드로부터 시그널 서열을 코딩하는 부분을 제외한 폴리뉴클레오티드.
[90] 서열 133으로 표시되는 폴리뉴클레오티드로부터 시그널 서열을 코딩하는 부분을 제외한 폴리뉴클레오티드.
[91] 서열 135로 표시되는 폴리뉴클레오티드로부터 시그널 서열을 코딩하는 부분을 제외한 폴리뉴클레오티드.
[92] 서열 137로 표시되는 폴리뉴클레오티드로부터 시그널 서열을 코딩하는 부분을 제외한 폴리뉴클레오티드.
또한, 본건 발명은 인간 IgG2에 속하는 아고니스트 항 CD40 항체를 개변시킨 항체이며, 상부 힌지 및 중부 힌지 영역 이외의 불변 영역이 다른 서브클래스 유래의 배열로 치환된 변이체를 제공한다. 바람직한 다른 서브클래스는 IgG1이다. 또한, 본건 발명은 인간 IgG2에 속하는 아고니스트 항 CD40 항체를 개변시킨 항체이며, 힌지 영역 이외의 불변 영역이 다른 서브클래스 유래의 배열로 치환된 변이체를 제공한다. 바람직한 다른 서브클래스는 IgG1이다.
여기서, ADCC 활성 및 CDC 활성이 저하한다는 것은, 상기 변이체가 아니라, 항 CD40 모노클로날 항체에 비해 ADCC 활성 및 CDC이 저하한다는 것을 말하고, 예를 들면 하이브리도마 KM341-1-19(수탁 번호 FERM BP-7759) 또는 2105(수탁 번호 FERM BP-8024)가 생산하는 모노클로날 항체에 비해 ADCC 활성 및 CDC가 저하한다는 것을 말한다. ADCC 활성 및 CDC 활성은 공지된 방법에 의해 측정할 수 있고, 예를 들면 본 명세서의 실시예에 기재된 방법으로 측정할 수도 있다. 하이브리도마 KM341-1-19(수탁 번호 FERM BP-7759) 또는 2105(수탁 번호 FERM BP-8024)가 생산하는 모노클로날 항체의 중쇄 및 경쇄 가변 영역 배열은 이하에 나타내는 바와 같다.
KM341-J-19 항체의 중쇄 및 경쇄의 가변 영역을 코딩하는 DNA 및 중쇄 및 경쇄의 아미노산 서열을 각각 이하에 나타낸다.
KM341-1-19 항체의 중쇄 염기 서열(서열 37)에 있어서의 시그널 서열은 50번째의 아데닌(A)로부터 시작된다. 시그널 서열과 가변 영역의 경계는 109 번째의 [아데닌]([A])와 110번째의 시토신(C) 사이에 위치하고, 가변 영역과 불변 영역의 경계는 493번째의 아데닌(A)와 494번째의 구아닌(G) 사이에 위치한다(유전자 배열 예측 소프트웨어(Signal P ver.2)를 사용).
KM341-1-19 항체의 중쇄 아미노산 서열(서열 38)에 있어서의 시그널 서열과 가변 영역의 경계는 20번째의 세린(S)와 21번째의 글루타민(Q) 사이에 위치하고, 가변 영역과 불변 영역의 경계는 148번째의 세린(S)와 149번째의 알라닌(A) 사이에 위치한다.
이상으로부터, KM341-1-19 항체의 중쇄 가변 영역의 염기 서열은 서열 37에 있어서의 110번째의 시토신(C)로부터 493번째의 아데닌(A)까지이다. 또한, KM341-1-19 항체의 중쇄 가변 영역의 아미노산 서열은 서열 38에 있어서의 21번째의 글루타민(Q)로부터 148번째의 세린(S)까지이다.
KM341-1-19 항체의 경쇄 염기 서열(서열 39)에 있어서의 시그널 서열은 29번째의 아데닌(A)로부터 시작된다. 시그널 서열과 가변 영역의 경계는 88번째의 [아데닌]([A])와 89번째의 구아닌(G) 사이에 위치하고, 가변 영역과 불변 영역의 경계는 400번째의 아데닌(A)와 401번째의 [시토신]([C]) 사이에 위치한다(유전자 배열 예측 소프트웨어(Signal P ver.2)를 사용).
KM341-1-19 항체의 경쇄 아미노산 서열(서열 40)에 있어서의 시그널 서열과 가변 영역의 경계는 20번째의 글리신(G)와 21번째의 글루탐산(E) 사이에 위치하고, 가변 영역과 불변 영역의 경계는 124번째의 리신(K)와 125번째의 [아르기닌]([R]) 사이에 위치한다.
이상으로부터, KM341-1-19 항체의 경쇄 가변 영역의 염기 서열은 서열 39에 있어서의 89번째의 구아닌(G)로부터 400번째의 아데닌(A)까지이다. 또한, KM341-1-19 항체의 경쇄 가변 영역의 아미노산 서열은 서열 40에 있어서의 21번째의 글루탐산(E)로부터 124번째의 리신(K)까지이다.
KM341-1-19 항체 중쇄 염기 서열(서열 37):
Figure 112006051903862-pct00001
KM341-1-19 항체 중쇄 아미노산 서열(서열 38)
Figure 112006051903862-pct00002
KM341-1-19 항체 경쇄 염기 서열(서열 39):
Figure 112006051903862-pct00003
KM341-1-19 항체 경쇄 아미노산 서열(서열 40)
Figure 112006051903862-pct00004
2105 항체의 중쇄 및 경쇄 가변 영역을 코딩하는 DNA 및 중쇄 및 경쇄의 아미노산 서열을 각각 이하에 나타낸다.
2105 항체의 중쇄 염기 서열(서열 41)에 있어서의 시그널 서열은 70번째 아데닌(A)로부터 시작된다. 시그널 서열과 가변 영역의 경계는 126번째의 [티민]([T])와 127번째의 구아닌(G) 사이에 위치하고, 가변 영역과 불변 영역의 경계는 495번째의 아데닌(A)와 496번째의 구아닌(G) 사이에 위치한다(유전자 배열 예측 소프트웨어(Signal P ver.2)를 사용).
2105 항체의 중쇄 아미노산 서열(서열 42)에 있어서의 시그널 서열과 가변 영역의 경계는 19번째의 시스테인(C)와 20번째의 글루탐산(E) 사이에 위치하고, 가변 영역과 불변 영역의 경계는 142번째의 세린(S)와 143번째의 알라닌(A) 사이에 위치한다.
이상으로부터, 2105 항체의 중쇄 가변 영역의 염기 서열은 서열 41에 있어서 의 127번째의 구아닌(G)로부터 495번째의 아데닌(A)까지이다. 또한, 2105 항체의 중쇄 가변 영역의 아미노산 서열은 서열 42에 있어서의 20 번째의 글루탐산(E)로부터 142번째의 세린(S)까지이다.
2105 항체의 경쇄 염기 서열(서열 43)에 있어서의 시그널 서열은 28번째의 아데닌(A)로부터 시작된다. 시그널 서열과 가변 영역의 경계는 87번째의 [아데닌]([A])와 88번째의 구아닌(G) 사이에 위치하고, 가변 영역과 불변 영역의 경계는 405번째의 아데닌(A)와 406번째의 [시토신]([C]) 사이에 위치한다(유전자 배열 예측 소프트웨어(Signal P ver.2)를 사용).
2105 항체의 경쇄 아미노산 서열(서열 44)에 있어서의 시그널 서열과 가변 영역의 경계는 20번째의 글리신(G)와 21번째의 글루탐산(E) 사이에 위치하고, 가변 영역과 불변 영역의 경계는 126번째의 리신(K)와 127번째의 [아르기닌]([R]) 사이에 위치한다.
이상으로부터, 2105 항체의 경쇄 가변 영역의 염기 서열은 서열 43에 있어서의 88번째의 구아닌(G)로부터 405번째의 아데닌(A)까지이다. 또한, 2105 항체의 경쇄 가변 영역의 아미노산 서열은 서열 44에 있어서의 21번째의 글루탐산(E)로부터 126번째의 리신(K)까지이다.
2105 항체 중쇄 염기 서열(서열: 41)
Figure 112006051903862-pct00005
2105 항체 중쇄 아미노산 서열(서열: 42)
Figure 112006051903862-pct00006
2105 항체 경쇄 염기 서열(서열: 43)
2105 항체 경쇄 아미노산 서열(서열: 44)
Figure 112006051903862-pct00008
341G2Ser의 중쇄 염기 서열(서열 131)에 있어서의 시그널 서열과 가변 영역의 경계는 60번째의 [아데닌]([A])와 61번째의 시토신(C) 사이에 위치하고, 가변 영역과 불변 영역의 경계는 444번째의 아데닌[A]와 445번째의 구아닌(G) 사이에 위치한다(유전자 배열 예측 소프트웨어(Signal P ver.2)를 사용).
341G2Ser의 중쇄 아미노산 서열(서열 132)에 있어서의 시그널 서열과 가변 영역의 경계는 20번째의 세린(S)와 21번째의 글루타민(Q) 사이에 위치하고, 가변 영역과 불변 영역의 경계는 148번째의 세린(S)와 149번째의 알라닌(A) 사이에 위치한다.
이상으로부터, 341G2Ser의 중쇄 가변 영역의 염기 서열은 서열 131에 있어서의 61번째의 시토신(C)로부터 444번째의 아데닌(A)까지이다. 또한, 341G2Ser의 중쇄 가변 영역의 아미노산 서열은 서열 132에 있어서의 21번째의 글루타민(Q)로부터 148번째의 세린(S)까지이다.
341G2Ser 중쇄 전체 염기 서열(서열: 131)
Figure 112006051903862-pct00009
341G2Sser 중쇄 전체 아미노산 서열(서열: 132)
Figure 112006051903862-pct00010
341G2Ser의 경쇄 염기 서열(서열 133)에 있어서의 시그널 서열과 가변 영역의 경계는 60번째의 [아데닌]([A])와 61번째의 구아닌(G) 사이에 위치하고, 가변 영역과 불변 영역의 경계는 372번째의 아데닌(A)와 373번째의 [시토신]([C]) 사이에 위치한다(유전자 배열 예측 소프트웨어(Signal P ver.2)를 사용).
341G2Ser의 경쇄 아미노산 서열(서열 134)에 있어서의 시그널 서열과 가변 영역의 경계는 20번째의 글리신(G)와 21번째의 글루탐산(E) 사이에 위치하고, 가변 영역과 불변 영역의 경계는 124번째의 리신(K)와 125번째의 [아르기닌]([R]) 사이에 위치한다. 이상으로부터, 341G2Ser의 경쇄 가변 영역의 염기 서열은 서열 133에 있어서의 61번째의 구아닌(G)로부터 372번째의 아데닌(A)까지이다. 또한, 341G2Ser의 경쇄 가변 영역의 아미노산 서열은 서열 134에 있어서의 21번째의 글루탐산(E)로부터 124번째의 리신(K)까지이다.
341G2Ser 경쇄 전체 염기 서열(서열: 133)
Figure 112006051903862-pct00011
341G2Ser 경쇄 전체 아미노산 서열(서열: 134)
Figure 112006051903862-pct00012
2105G2Ser의 중쇄 염기 서열(서열 135)에 있어서의 시그널 서열과 가변 영역의 경계는 57번째의 [티민]([T])와 58번째의 구아닌(G) 사이에 위치하고, 가변 영역과 불변 영역의 경계는 426번째의 아데닌(A)와 427번째의 구아닌(G) 사이에 위치한다(유전자 배열 예측 소프트웨어(Signal P ver.2)를 사용).
2105G2Ser의 중쇄 아미노산 서열(서열 136)에 있어서의 시그널 서열과 가변 영역의 경계는 19번째의 시스테인(C)와 20번째의 글루타민(E) 사이에 위치하고, 가변 영역과 불변 영역의 경계는 142번째의 세린(S)와 143번째의 알라닌(A) 사이에 위치한다.
이상으로부터, 2105G2Ser의 중쇄 가변 영역의 염기 서열은 서열 135에 있어서의 58번째의 구아닌(G)로부터 426번째의 아데닌(A)까지이다. 또한, 2105G2Ser 의 중쇄 가변 영역의 아미노산 서열은 서열 136에 있어서의 20번째의 글루탐산(E)로부터 142번째의 세린(S)까지이다.
2105G2Ser 중쇄 전체 염기 서열(서열: 135)
Figure 112006051903862-pct00013
2105G2Ser 중쇄 전체 아미노산 서열(서열: 136)
Figure 112006051903862-pct00014
2105G2Ser의 경쇄 염기 서열(서열 137)에 있어서의 시그널 서열과 가변 영역의 경계는 60번째의 [아데닌]([A])와 61번째의 구아닌(G) 사이에 위치하고, 가변 영역과 불변 영역의 경계는 378번째의 아데닌(A)와 379번째의 [시토신]([C]) 사이에 위치한다(유전자 배열 예측 소프트웨어(Signal P ver.2)를 사용).
2105G2Ser의 경쇄 아미노산 서열(서열 138)에 있어서의 시그널 서열과 가변 영역의 경계는 20번째의 글리신(G)와 21번째의 글루탐산(E) 사이에 위치하고, 가변 영역과 불변 영역의 경계는 126번째의 리신(K)와 127번째의 [아르기닌]([R]) 사이에 위치한다. 이상으로부터, 2105G2Ser의 경쇄 가변 영역의 염기 서열은 서열 137에 있어서의 61번째의 구아닌(G)로부터 378번째의 아데닌(A)까지이다. 또한, 2105G2Ser의 경쇄 가변 영역의 아미노산 서열은 서열 138에 있어서의 21번째의 글루탐산(E)로부터 126번째의 리신(K)까지이다.
2105G2Ser 경쇄 전체 염기 서열(서열: 137)
Figure 112006051903862-pct00015
2105G2Ser 경쇄 전체 아미노산 서열(서열: 138)
Figure 112006051903862-pct00016
2. 안타고니스틱 항체의 개변
항 CD40 안타고니스틱 항체에 대해서도, 아고니스틱 항체와 동일하게 그의 작용 메카니즘으로부터 ADCC 활성, CDC 활성이 없는 것이 의약품으로서 보다 바람직하다고 생각된다. 또한, 안타고니스틱 항체의 경우, ADCC 활성을 검출할 수 없는 경우에도, 생체 내에서의 Fc 수용체를 통한 항체의 가교에 의해서 시그널을 유도하는 활성을 회피하는 것이 중요하다. 즉, 생체 내에 있어서 면역을 활성화하지 않는 것을 확인하는 것이 필요하고, 그와 같은 활성을 갖는 항체가 의약품으로서는 필요하다고 생각된다. 항 CD40 안타고니스트 항체는 자기 면역 질환이나 장기 이식 거절 등의 치료약으로서 기대되고 있지만, 만일 항체 투여 후에 어떠한 기능에서 미약하더라도 아고니스트 활성을 유도해 버리는 경우가 있는 경우, 증상의 증악을 초래하여, 기대한 치료 효과의 반대 결과가 될 가능성이 생각되기 때문에, 아고니스트 활성이 전혀 없는 항체가 의약품으로서는 보다 바람직하다. 본 발명에 있어서는, 원숭이를 이용한 시험에 의해 생체 내에서도 아고니스트 활성을 보다 감소시키기 위해서는 IgG4에 점 변이 L235E(235번째의 L을 E로 치환하는 것을 의미한다. 이하, 동일함)를 도입하는 것이 효과적인 것을 나타내었다. 또한, ADCC, CDC 활성이 낮은 항체 서브클래스로서, IgG4를 들 수 있지만, IgG4는 재조합 단백질로서 CH0 등의 세포에서 발현시키는 경우, 중쇄간의 SS 결합의 형성이 불충분하여, 반량체가 분비되는 것이 보고되어 있다(Rob C. Aalberse et. al., Immunology, 105, 9-19, 2002). 이 때문에, 항체 불변 영역에 변이를 도입함으로써 SS 결합의 형성을 촉진시킬 수 있는 것이 보고되어 있고, 이 변이의 유용성에 대해서도 평가하였다. 구체적으로는, 228번째의 S를 P로 치환하는 변이를 도입하였다(S. Angal et. al., Molecular Immunology, vol 30, no 1, 105-108, 1993).
아고니스트 항체와 동일하게 안타고니스트 항체에 있어서도, 항체의 정제 보존시의 안정성은 매우 중요한 포인트가 된다. 몇가지 방법에 의해 안타고니스트 활성을 유지하면서 보다 물성적으로 우수한 항체를 제조하는 것이 가능하다고 생각된다. 현재까지 시판된 항체 의약품은, IgG1 서브클래스에 속하는 것이 대부분을 차지하고, 제제상의 문제점은 특히 보고되어 있지 않다. 이 때문에, 항체의 불변 영역이 IgG1인 것이 물성적으로는 유리한 가능성을 생각할 수 있다. 그러나, 항 CD40 안타고니스트 항체의 경우에는, ADCC, CDC 활성이 감소된 것이 바람직하다. 이 때문에, IgG1의 불변 영역에 몇개의 점 변이를 도입한 것이 요구된다. 방법으로서는, 상술한 변이를 도입함으로써 가능해진다. 예를 들면, P331G 점 변이를 도입함으로써 ADCC, CDC 활성을 감소시킨 IgG1 불변 영역을 만드는 것이 가능하다고 생각된다. 또한, IgG4에 점 변이 L235E를 도입함으로써 생체 내에서 미약한 아고니스트 활성이 소실되어, 약효적으로는 우수한 활성을 나타내지만, 물성면에서는 낮은 pH에서의 안정성이 저하된다는 감소가 보였다. 이 때문에, L235를 E 이외의 다른 아미노산으로 치환함으로써 물성면에서의 기능 향상을 기대할 수 있다. 또한, 4D11 항체에 대해서는, 그의 가변 영역의 구조가 매우 유사한 2B11 항체가 있다. 2B11 항체는, 안타고니스트 활성은 4D11 항체에 뒤떨어지지만, 낮은 pH에서의 안정성은 4D11 항체보다 우수하다. 이것을 이용하여, 가변 영역의 2B11 유래의 아미노산의 일부를 4D11 항체에 도입함으로써, 안정성을 향상시키는 것은 가능하다고 생각된다. 구체적으로는, 중쇄의 L38V, P58R, G62W, I79M, K81Y, H87Y, S98A, K109R, V120M, T124A 및 경쇄의 N75S의 점 변이와 그의 조합에 의해서 가능하다고 생각된다. 구체적으로는, 4D11 항체 중쇄 가변 영역의 38번째 L을 V로 치환한 변이체(L38V라고 약기. 이하, 동일함), P58R 변이체, G62W 변이체, I79M 변이체, K81Y 변이체, H87Y 변이체, S98A 변이체, K109R 변이체, V120M 변이체, T124A 변이체, 및 경쇄의 N75S 변이체, 또는 상술한 점 변이의 조합에 의해서 가능하다고 생각된다.
본 발명의 항체는 상기 ADCC 및(또는) CDC 활성을 감소시키는 아미노산의 변이를 1 이상, 바람직하게는 1 내지 15개, 1 내지 13개, 1 내지 12개, 1 내지 11개, 1 내지 10개, 1 내지 9개, 1 내지 8개, 1 내지 7개, 1 내지 6개, 1 내지 5개, 1 내지 4개, 1 내지 3개 또는 1 또는 2개 갖는다.
본건 발명은 이하의 안타고니스틱 항 CD40 항체 변이체 등을 제공한다.
[53] 불변 영역에 ADCC 및(또는) CDC의 증가 또는 감소를 일으키는 1 이상의 아미노산의 결실 또는 치환 또는 1 이상의 아미노산이 부가된 안타고니스트 활성을 갖는 CD40에 결합하는 모노클로날 항체의 중쇄.
[54] 불변 영역이 인간 IgG인 [53]의 중쇄.
[55] 인간 IgG가 인간 IgG1인 [541의 중쇄.
[56] 인간 IgG가 인간 IgG2인 [54]의 중쇄.
[57] 인간 IgG가 인간 IgG3인 [54]의 중쇄.
[58] 인간 IgG가 인간 IgG4인 [54]의 중쇄.
[59] 불변 영역의 아미노산의 치환이, Kabat 등에 의한 EU 인덱스에 의해 표시되는 235 위치의 류신으로부터 글루탐산으로의 치환인 [55], [57] 및 [58] 중 어느 것의 중쇄.
[60] 불변 영역에, 중쇄끼리의 SS 결합 형성을 촉진시키는 1 이상의 아미노산의 결실 또는 치환 또는 1 이상의 아미노산이 부가되어 있는 [53] 내지 [58] 중 어느 것의 중쇄.
[61] 불변 영역의 아미노산의 치환이, Kabat 등에 의한 EU 인덱스에 의해 표시되는 228 위치의 세린으로부터 프롤린으로의 치환인 [60]의 항체의 중쇄.
[62] [53] 내지 [61] 중 어느 것의 중쇄를 포함하는 모노클로날 항체.
[63] 하이브리도마 4D11(수탁 번호 FERM BP-7758)이 생산하는 모노클로날 항체의 중쇄의 가변 영역을 갖는 [53] 내지 [61] 중 어느 것의 중쇄.
[64] [63]의 중쇄 및 하이브리도마 4D11(수탁 번호 FERM BP-7758)이 생산하는 모노클로날 항체의 경쇄의 가변 영역을 갖는 경쇄로 이루어지는 모노클로날 항체.
[65] 서열 46으로 표시되는 폴리펩티드의 가변 영역을 갖는 [53] 내지 [61] 중 어느 것의 중쇄.
[66] [65]의 중쇄 및 서열 48로 표시되는 폴리펩티드의 가변 영역을 갖는 모노클로날 항체의 경쇄로 이루어지는 모노클로날 항체.
[67] 서열 140으로 표시되는 폴리펩티드로부터 시그널 서열을 제외한 부분을 포함하는 [53]의 중쇄.
[68] [67]의 중쇄 및 서열 142로 표시되는 폴리펩티드로부터 시그널 서열을 제외한 부분으로 이루어지는 모노클로날 항체의 경쇄로 이루어지는 모노클로날 항체.
[69] 서열 139로 표시되는 폴리뉴클레오티드를 갖는 발현 벡터를 포함하는 숙주로부터 생산되는 [53]의 중쇄.
[70] 서열 139로 표시되는 폴리뉴클레오티드 및 서열 141로 표시되는 폴리뉴클레오티드를 갖는 발현 벡터를 포함하는 숙주로부터 생산되는 [62]의 모노클로날 항체.
[71] 서열 139로 표시되는 폴리뉴클레오티드.
[72] 서열 141로 표시되는 폴리뉴클레오티드.
[73] [71]의 폴리뉴클레오티드를 갖는 발현 벡터.
[74] [72]의 폴리뉴클레오티드를 갖는 발현 벡터.
[75] [71] 및 [72]의 폴리뉴클레오티드를 갖는 발현 벡터.
[76] [73]의 발현 벡터를 포함하는 숙주.
[77] [74]의 발현 벡터를 포함하는 숙주.
[78] [75]의 발현 벡터를 포함하는 숙주.
[79] [76]의 숙주를 배양액 중에서 배양하고, 상기 배양물 및(또는) 상기 숙주로부터 모노클로날 항체의 중쇄를 취득하는 공정을 포함하는, 모노클로날 항체의 중쇄를 제조하는 방법.
[80] [78]의 숙주를 배양액 중에서 배양하고, 상기 배양물 및(또는) 상기 숙주로부터 모노클로날 항체를 취득하는 공정을 포함하는, 모노클로날 항체를 제조하는 방법.
[81] [62], [64], [66], [68] 및 [70] 중 어느 것의 모노클로날 항체를 유효 성분으로서 포함하는 의약 조성물.
[82] 이식 거절, 자기 면역 질환, 알레르기 또는 혈액 응고 제VIII 인자 저해 증후군의 예방 또는 치료에 이용되는 [81]의 의약 조성물.
[83] [81]의 의약 조성물을 포유 동물에 투여하는 것을 포함하는, 이식 거절, 자기 면역 질환, 알레르기 또는 혈액 응고 제VIII 인자 저해 증후군을 예방 또는 치료하는 방법.
[84] 이식 거절, 자기 면역 질환, 알레르기 또는 혈액 응고 제VIII 인자 저해 증후군의 예방 또는 치료에 이용되는 의약 조성물을 제조하기 위한 [62], [641, [66], [68] 및 [70] 중 어느 것의 모노클로날 항체의 사용.
[85] 인간 항체의 중쇄 불변 영역에 1 이상의 아미노산의 결실 또는 치환 또는 1 이상의 아미노산을 부가하는 공정을 포함하는, 아고니스틱 활성이 감소된 안타고니스트 활성을 갖는 CD40에 결합하는 모노클로날 항체의 중쇄의 제조 방법.
[86] 불변 영역이 인간 IgG인 [85]의 방법.
[87] 인간 IgG가 인간 IgG4인 [86]의 방법.
[88] 불변 영역의 아미노산의 치환이, Kabat 등에 의한 EU 인덱스에 의해 표시되는 235 위치의 류신으로부터 글루탐산으로의 치환인 [85] 내지 [87] 중 어느 것의 방법.
[93] 서열 139로 표시되는 폴리뉴클레오티드로부터 시그널 서열을 코딩하는 부분을 제외한 폴리뉴클레오티드.
[94] 서열 141로 표시되는 폴리뉴클레오티드로부터 시그널 서열을 코딩하는 부분을 제외한 폴리뉴클레오티드.
그 밖에, 본 발명은 이하의 것을 제공한다.
하이브리도마 4D11(수탁 번호 FERM BP-7758)이 생산하는 모노클로날 항체의 중쇄 가변 영역의 38번째 L의 V로의 치환, 58번째 P의 R로의 치환, 62번째 G의 W로의 치환, 79번째 I의 M으로의 치환, 81번째 K의 Y로의 치환, 87번째 H의 Y로의 치환, 98번째 S의 A로의 치환, 109번째 K의 R로의 치환, 120번째 V의 M으로의 치환, 124번째 T의 A로의 치환으로 이루어지는 군에서 선택되는 적어도 하나의 치환을 포함하는 상기 안타고니스틱 항 CD40 항체의 변이체, 및 4D11 항체 경쇄 가변 영역의 75번째 N을 S로 치환한 상기 안타고니스틱 항 CD40 항체의 변이체.
여기서, ADCC 활성 및 CDC 활성이 저하한다는 것은, 상기 변이체가 아니라, 항 CD40 모노클로날 항체에 비해 ADCC 활성 및 CDC이 저하한다는 것을 말하고, 예를 들면 하이브리도마 4D11(수탁 번호 FERM BP-7758)이 생산하는 모노클로날 항체에 비해 ADCC 활성 및 CDC이 저하한다는 것을 말한다. ADCC 활성 및 CDC 활성은 공지된 방법에 의해 측정할 수 있고, 예를 들면 본 명세서의 실시예에 기재된 방법으로 측정할 수 있다. 하이브리도마 4D11(수탁 번호 FERM BP-7758)이 생산하는 모노클로날 항체의 중쇄 및 경쇄 가변 영역 배열은 이하에 나타내는 바와 같다.
4D11 항체의 중쇄 및 경쇄 가변 영역을 코딩하는 DNA 및 중쇄 및 경쇄의 아 미노산 서열을 각각 이하에 나타낸다.
4D11 항체의 중쇄 염기 서열(서열 45)에 있어서의 시그널 서열과 가변 영역의 경계는 93번째의 [시토신]([C])와 94번째의 시토신(C) 사이에 위치하고, 가변 영역과 불변 영역의 경계는 456번째의 아데닌(A)와 457번째의 구아닌(G) 사이에 위치한다(유전자 배열 예측 소프트웨어(Signal P ver. 2)를 사용).
4D11 항체의 중쇄 아미노산 서열(서열 46)에 있어서의 시그널 서열과 가변 영역의 경계는 26번째의 세린(S)와 27번째의 글루타민(Q) 사이에 위치하고, 가변 영역과 불변 영역의 경계는 147번째의 세린(S)와 148번째의 알라닌(A) 사이에 위치한다.
이상으로부터, 4D11 항체의 중쇄 가변 영역의 염기 서열은 서열 45에 있어서의 94번째의 시토신(C)로부터 456번째의 아데닌(A)까지이다. 또한, 4D11 항체의 중쇄 가변 영역의 아미노산 서열은 서열 46에 있어서의 27번째의 글루타민(Q)로부터 147번째의 세린(S)까지이다.
4D11 항체의 경쇄 염기 서열(서열 47)에 있어서의 시그널 서열과 가변 영역의 경계는 124번째의 [티민]([T])와 125번째의 구아닌(G) 사이에 위치하고, 가변 영역과 불변 영역의 경계는 442번째의 아데닌(A)와 443번째의 [시토신]([C]) 사이에 위치한다(유전자 배열 예측 소프트웨어(Signal P ver.2)를 사용).
4D11 항체의 경쇄 아미노산 서열(서열 48)에 있어서의 시그널 서열과 가변 영역의 경계는 22번째의 시스테인(C)와 23번째의 알라닌(A) 사이에 위치하고, 가변 영역과 불변 영역의 경계는 128번째의 리신(K)와 129번째의 [아르기닌]([R]) 사이에 위치한다.
이상으로부터, 4D11 항체의 경쇄 가변 영역의 염기 서열은 서열 47에 있어서의 125번째의 구아닌(G)로부터 442번째의 아데닌(A)까지이다. 또한, 4D11 항체의 경쇄 가변 영역의 아미노산 서열은 서열 48에 있어서의 23번째의 알라닌(A)로부터 128번째의 리신(K)까지이다.
4D11 항체 중쇄 염기 서열(서열: 45)
Figure 112006051903862-pct00017
4Dl1 항체 중쇄 아미노산 서열(서열: 46)
Figure 112006051903862-pct00018
4D11 항체 경쇄 염기 서열(서열: 47)
Figure 112006051903862-pct00019
4D11 항체 경쇄 아미노산 서열(서열: 48)
Figure 112006051903862-pct00020
4D11 항체 G4PE의 중쇄 염기 서열(서열 139)에 있어서의 시그널 서열과 가변 영역의 경계는 78번째의 [시토신]([C])와 79번째의 시토신(C) 사이에 위치하고, 가변 영역과 불변 영역의 경계는 441번째의 아데닌(A)와 442번째의 구아닌(G) 사이에 위치한다(유전자 배열 예측 소프트웨어(Signal P ver.2)를 사용).
4D11 항체의 중쇄 아미노산 서열(서열 140)에 있어서의 시그널 서열과 가변 영역의 경계는 26번째의 세린(S)와 27번째의 글루타민(Q) 사이에 위치하고, 가변 영역과 불변 영역의 경계는 147번째의 세린(S)와 148번째의 알라닌(A) 사이에 위치한다.
이상으로부터, 4D11 항체의 중쇄 가변 영역의 염기 서열은 서열 139에 있어서의 79번째의 시토신(C)로부터 441번째의 아데닌(A)까지이다. 또한, 4D11 항체의 중쇄 가변 영역의 아미노산 서열은 서열 140에 있어서의 27번째의 글루타민(Q)로부터 147번째의 세린(S)까지이다.
4D11G4PE 중쇄 전체 염기 서열(서열: 139)
Figure 112006051903862-pct00021
4D11G4PE 중쇄 전체 아미노산 서열(서열: 140)
Figure 112006051903862-pct00022
4D11G4PE의 경쇄 염기 서열(서열 141)에 있어서의 시그널 서열과 가변 영역의 경계는 66번째의 [티민]([T])와 67번째의 구아닌(G) 사이에 위치하고, 가변 영역과 불변 영역의 경계는 384번째의 아데닌(A)와 385번째의 [시토신]([C]) 사이에 위치한다(유전자 배열 예측 소프트웨어(Signal P ver.2)를 사용).
4D11G4PE의 경쇄 아미노산 서열(서열 142)에 있어서의 시그널 서열과 가변 영역의 경계는 22번째의 시스테인(C)와 23번째의 알라닌(A) 사이에 위치하고, 가변 영역과 불변 영역의 경계는 128번째의 리신(K)와 129번째의 [아르기닌]([R]) 사이에 위치한다.
이상으로부터, 4D11G4PE의 경쇄 가변 영역의 염기 서열은 서열 141에 있어서의 67번째의 구아닌(G)로부터 384번째의 아데닌(A)까지이다. 또한, 4D11G4PE의 경쇄 가변 영역의 아미노산 서열은 서열 142에 있어서의 23번째의 알라닌(A)로부터 128번째의 리신(K)까지이다.
4D11G4PE 경쇄 전체 염기 서열(서열: 141)
Figure 112006051903862-pct00023
4D11G4PE 경쇄 전체 아미노산 서열(서열: 142)
Figure 112006051903862-pct00024
3. 정의
본 명세서에서 사용되는 용어의 정의는 이하와 같다.
본 발명에서 말하는 「CD40」란, 클라크 등(E. A. Clark et. al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 83: 4494, 1986) 또는 스타멘코빅 등(I. Stamenkovic et. al., EMBO J. 8:1403, 1989)에 의해 개시된 아미노산 서열을 갖는 폴리펩티드를 의미하고, 특히 B 세포, DC, 매크로파지, 내피 세포, 상피 세포, 또는 이들의 종양 세포 표면에 발현하는 항원 폴리펩티드이다.
「항 CD40 항체」란, 세포 발현 CD40, 전장 CD40 또는 부분 길이 CD40에 대한 모노클로날 항체 중 어느 것을 의미한다.
또한, 본 발명에서 「항체」란, 면역 글로불린을 구성하는 중쇄 가변 영역 및 중쇄 불변 영역 및 경쇄의 가변 영역 및 경쇄의 불변 영역을 코딩하는 유전자(「항체 유전자」라고 총칭함)에서 유래하는 것이다. 인간의 면역 글로불린에는, IgG, IgA, IgM, IgD 및 IgE로 이루어지는 5개의 다른 클래스가 존재한다. IgG는 또한 IgG1, IgG2, IgG3 및 IgG4로 이루어지는 4개의 서브클래스, 또한 IgA는 또한 IgA1 및 IgA2로 이루어지는 2개의 서브클래스로 분류할 수 있다. IgG1, IgG2, IgG3, IgG4는 인간 염색체의 14q32.33에 위치한다. 면역 글로불린의 기본 구조는 2개의 상동인 L쇄(경쇄)와 2개의 상동인 H쇄(중쇄)로 이루어져 있다. 면역 글로불린의 클래스와 서브클래스는 H쇄에 의해서 결정된다. 본 발명의 항체에는, 모든 면역 글로불린 클래스ㆍ서브클래스 및 아이소타입을 갖는 항체를 포함한다. 본 발명에 있어서의 항체의 「기능적 단편」이란, 상기에서 정의한 항체의 일부분(부분단편)이며, 항체의 항원에의 작용을 하나 이상 유지하는 것을 의미하고, 구체적으로는 F(ab')2, Fab', Fab, Fv, 디술피드 결합 FV, 1본쇄 FV(scFV), 및 이들의 중합체 등을 들 수 있다(D. J. King., Applications and Engineering of Monoclonal Antibodies., 1998 T. J. International Ltd).
지금까지 알려져 있는 IgG1로서는 J00228, Z17370 또는 Y14737 등을, IgG2로서는 J00230, AJ250170, AF449616, AF449617, AF449618, Z49802 또는 Z49801 등을, IgG3으로서는 M12958, KO1313, X16110, X99549, AJ390236, AJ390237, AJ390238, AJ390241, AJ390242, AJ390246, AJ390247, AJ390252, AJ390244, AJ390254, AJ390260, AJ390262, AJ390272, AJ390276 또는 AJ390279 등을, IgG4로서는 K01316, AJ001563, AJ001564 등을 들 수 있다(이상의 기호는 유전자의 등록(accession) 번호이다).
본 발명에 있어서의 CH1, 힌지, CH2, CH3이란, 항체 중쇄 불변 영역의 일부분을 나타내고, Kabat 등의 EU 인덱스(Kabat et. al., Sequences of proteins of immunological interest, 1991 Fifth edition)에 기초하고 있다. CH1은 EU 인덱스 118로부터 215, 힌지는 EU 인덱스 216으로부터 230, CH2는 EU 인덱스 231로부터 340, CH3은 EU 인덱스 341로부터 446으로 정의된다.
본 발명에서 「인간 항체」란, 인간 유래의 항체 유전자의 발현 산물인 항체를 의미한다.
「아고니스틱」이란, B 세포, 종양 세포 또는 수상 세포 등의 세포 표면 상에 발현하는 CD40에 그의 리간드가 결합하는 것을 촉진시키는 작용, 또는 CD40 리간드가 CD40 발현 세포에 주는 영향 중 하나 이상을, CD40을 발현하는 세포에 제공하는 작용을 의미하고, 「아고니스틱 항체」란, 그와 같은 아고니스틱 작용을 갖는 항체를 의미한다. CD40 발현 세포에 주는 영향 중 하나로서, 예를 들면 CD95의 발현 촉진을 들 수 있다.
「안타고니스틱」이란, B 세포, 종양 세포 또는 수상 세포 등의 세포 표면 상에 발현하는 CD40에 그의 리간드가 결합하는 것을 저해하는 작용, 또는 CD40 리간드가 CD40 발현 세포에 주는 영향 중 하나 이상을 중화시키는 작용을 의미하고, 「안타고니스틱 항체」란, 그와 같은 작용을 갖는 항체를 의미한다. CD40 발현 세포에 제공하는 영향 중 하나로서, 예를 들면 B 세포 증식 억제 또는 항체 생산 억제를 들 수 있다.
본 출원에 있어서, 아미노산 서열에 의해서 항체 또는 그의 중쇄 가변 영역 또는 경쇄 가변 영역을 명시하고 있지만, 1 이상, 바람직하게는 1 내지 10개, 1 내지 9개, 1 내지 8개, 1 내지 7개, 1 내지 6개, 1 내지 5개, 1 내지 4개, 1 내지 3개 또는 1 또는 2개의 아미노산이 결실되거나 또는 치환되거나 또는 부가된 것도 본 발명의 범주에 포함된다.
본 발명에 있어서는, 항 CD40 항체는 항체 유전자를 발현 벡터에 조립하여 벡터를 적당한 숙주 세포에 도입하고, 세포 또는 세포의 배양 상청으로부터 회수, 정제함으로써 얻을 수 있다.
벡터에는, 숙주 세포에서 자율적으로 증식할 수 있거나, 숙주 세포의 염색체에 조립될 수 있는 파지 또는 플라스미드가 사용된다. 플라스미드 DNA로서는, 대장균, 고초균 또는 효모 유래의 플라스미드 등을 들 수 있고, 파지 DNA로서는 λ 파지 등을 들 수 있다.
형질 전환에 사용되는 숙주로서는, 목적 유전자를 발현할 수 있는 것이라면 특별히 한정되는 것은 아니다. 예를 들면, 세균(대장균, 고초균 등), 효모, 동물 세포(COS 세포, CHO 세포 등), 곤충 세포를 들 수 있다.
숙주에의 유전자의 도입 방법은 공지되어 있고, 임의의 방법(예를 들면 칼슘 이온을 이용하는 방법, 전기 천공법, 스페로플라스트법, 아세트산 리튬법, 인산칼슘법, 리포펙션법 등)을 들 수 있다. 또한, 후술하는 동물에게 유전자를 도입하는 방법으로서는, 마이크로인젝션법, ES 세포에 전기 천공이나 리포펙션법을 사용하여 유전자를 도입하는 방법, 핵 이식법 등을 들 수 있다.
본 발명에 있어서 「배양물」이란, (a) 배양 상청, (b) 배양 세포 또는 배양 균체 또는 그의 파쇄물, (c) 형질 전환체의 분비물 중 어느 것을 의미하는 것이다. 형질 전환체를 배양하기 위해서는, 사용하는 숙주에게 적합한 배지를 이용하여 정치 배양법, 롤러 보틀에 의한 배양법 등이 채용된다.
배양 후, 목적 단백질이 균체 내 또는 세포 내에 생산되는 경우에는, 균체 또는 세포를 파쇄함으로써 항체를 채취한다. 또한, 목적 항체가 균체 밖 또는 세포 밖에 생산되는 경우에는, 배양액을 그대로 사용하거나 원심 분리 등에 의해 균체 또는 세포를 제거한다. 그 후, 단백질의 단리 정제에 이용되는 각종 크로마토그래피를 이용한 일반적인 생화학적 방법을 단독으로 또는 적절하게 조합하여 이용함으로써 상기 배양물 중에서 목적하는 항체를 단리 정제할 수 있다.
또한, 트랜스제닉 동물 제조 기술을 이용하여 목적 항체의 유전자가 내재성 유전자에 조립된 동물 숙주, 예를 들면 트랜스제닉 소, 트랜스제닉 염소, 트랜스제닉 양 또는 트랜스제닉 돼지를 제조하고, 그 트랜스제닉 동물로부터 분비되는 젖 중에서 그의 항체 유전자에서 유래하는 모노클로날 항체를 대량으로 취득하는 것도 가능하다(Wright, G., et al.(1991) Bio/Technology 91 830-834). 하이브리도마 를 시험관 내에서 배양하는 경우에는, 배양하는 세포종의 특성, 시험 연구의 목적 및 배양 방법 등의 여러가지 조건에 따라서 하이브리도마를 증식, 유지 및 보존시키고, 배양 상청 중에 모노클로날 항체를 생산시키기 위해서 이용되는 기지의 영양 배지, 또는 기지의 기본 배지로부터 유도 제조되는 모든 영양 배지를 이용하여 실시하는 것이 가능하다.
4. 항체의 성질
(1) 아고니스틱 항체의 경우
본 발명의 아고니스틱 항체의 변이체는 아고니스틱 활성을 유지하면서 ADCC, CDC 활성이 오리지널 항체에 비해 동일 정도 이하로 되어 있기 때문에, 면역 담당 세포를 상해하지 않고 면역계를 활성화시킬 수 있다고 생각된다. 그 때문에, 오리 지널 항체에 비해 동일한 정도 이상의 면역 활성화 작용과 동일한 정도 이하의 CD40 발현 세포에의 장해에 의한 독성을 나타내는 것이 기대된다.
(2) 안타고니스틱 항체의 경우
본 발명의 안타고니스틱 항 CD40 항체의 변이체는 CD40L에 의한 면역 활성화 시그널을 억제하는 활성을 유지하면서 개변 전의 항체에 비해 ADCC, CDC 활성이 감소된다. 또한, 생체 내에서도, Fc 수용체를 개재하는 것으로 생각되는 시그널 유도 활성의 저하가 기대된다.
5. 의약 조성물
또한, 본 발명의 항체의 정제된 제제를 함유하는 의약 조성물도 또한 본 발명의 범위 내에 포함된다. 이러한 의약 조성물은 바람직하게는 항체뿐 아니라, 생리학적으로 허용될 수 있는 희석제 또는 캐리어를 포함하고, 다른 항체 또는 항생 물질과 같은 다른 약제와의 혼합물일 수도 있다. 적절한 캐리어에는, 생리적 식염수, 인산 완충 생리 식염수, 인산 완충 생리 식염수 글루코스액 및 완충 생리 식염수가 포함되지만, 이것으로 한정되는 것은 아니다. 또는, 항체는 동결 건조(freeze-dry)시키고, 필요한 때에 상기한 것과 같은 완충 수용액을 첨가함으로써 재구성하여 사용할 수도 있다. 투여 경로는 경구 루트 및 정맥 내, 근육 내, 피하 및 복강 내의 주사 또는 배약(配藥)을 포함하는 비경장적 루트이다.
이 경우, 본 발명의 항체의 유효량과 적절한 희석제 및 약리학적으로 사용할 수 있는 캐리어와의 조합으로서 투여되는 유효량은, 1회에 대하여 체중 1 kg당 0.0001 mg 내지 100 mg이고, 2일 내지 8주간 간격으로 투여된다.
본 발명의 항체를 포함하는 의약 조성물을 사용하는 경우에는, 아고니스틱 항체에 대해서는 면역 부활화제(항바이러스제, 항감염증제)이고, 병원체로서는 A, B, C, D 또는 E형 간염 바이러스, HIV, 인플루엔자 바이러스, 단순 헤르페스 바이러스, 사이토메갈로 바이러스, EB 바이러스, 파필로마 바이러스, 클라미디아, 마이코플라즈마, 톡소플라즈마, 말라리아, 트리파노솜, 결핵 등이 예시된다. 또는 항종양제이고, 대상 종양으로서는 CD40을 발현한 암 세포를 포함하는 악성 종양, 예를 들면 췌장암, 방광암, 림프종(예를 들면 호지킨 림프종), 백혈병, 악성 흑색종, 비장암, 폐암, 난소암, 방광암, 유방암, 대장암, 전립선암, 두경부암을 들 수 있다. 또는 자기 면역 질환 치료제이고, 대상 질환으로서는 류마티스가 예시된다. 또는, 이들 질환이 복수개 병발할 수도 있다. 또는, 암 특이적 펩티드 등의 백신과 어쥬번트로서 병용할 수도 있다. 또한, 안타고니스틱 항체에 대해서는, 장기 이식시에 있어서의 면역 억제제(췌도(膵島) 이식이나 신장 등의 이식시에 있어서의 거절 반응, GVHD의 예방 또는 치료제)로서, 또는 자기 면역 질환(예를 들면, 류마치, 건선, 궤양성 대장염, 클론병, 전신성 홍반성 루푸스, 다발성 경화증, 근무력증, 강피증, 항인지질 항체 증후군, 자기 면역성 간염, 특발성 혈소판 감소성 자반병, 베체트병, 동맥 경화, 신장염, 호흡 절박 증후군)의 치료제, 천식 등 알레르기의 치료제, 혈액 응고제 VIII 인자 저해 증후군의 치료제로서 유용하고, 이들 질환이 복수개 병발할 수도 있다.
6. 에피토프
우수한 아고니스트 활성을 갖는 KM341-1-19 항체 및 2105 항체, 우수한 안타 고니스트 활성을 갖는 4D11 항체의 CD40에 대한 결합 에피토프가 결정되었다(실시예 2). 본건 발명은 상기 항체와는 다른 가변 영역 배열을 가지고, 또한 상기 항체 중 어느 것과 동일한 에피토프를 인식하는 아고니스틱 또는 안타고니스틱 항 CD40 항체를 제공한다. 이러한 항체는 하기의 요령에 의해서 취득할 수 있다.
예를 들면 KM341-1-19 항체와 동일한 에피토프를 인식하는 아고니스틱 항 CD40 항체를 취득하는 경우, CD40을 마우스 등에 면역시켜 얻어진 모노클로날 항체 중에서, CD40에의 결합에 있어서 KM341-1-19 항체와 경합하는 것을 통상법에 의해 선발한다. 선발된 것에 대하여 실시예 2에 기재된 방법에 기초하여, 펩티드에 대한 결합 패턴이 KM341-1-19 항체와 동일한 것을 선발한다.
이하, 실시예를 들어 본 발명을 더욱 상세히 설명하지만, 본 발명이 그 실시예에 기재되는 형태로만 한정되는 것은 아니다. ㆍ
실시예 1 항체, 항원 단백질의 발현 정제
항체 발현 세포는, 항체의 가변 영역을 포함하는 벡터 플라스미드를 CHO 세포(ATCC)에 유전자 도입하여 G418에 의해 선택함으로써 안정 발현주를 제조하였다. 또한, 변이형 항원의 발현은 벡터를 일과성으로 HEK 세포(ATCC)에 도입함으로써 실시하였다.
상기 배양 상청으로부터의 항 CD40 항체의 정제는 이하의 방법으로 행하였다. 항 CD40 항체를 포함하는 배양 상청을 Hyper D Protein A 칼럼(닛본 가이시 제조) 또는 마우스 IgG1의 정제에는 Protein G 칼럼(아마샴 파마시아 바이오테크)를 이용하여, 부속 설명서에 따라서 흡착 완충액으로서 PBS(-), 용출 완충액으로서 0.1 M 시트르산나트륨 완충액(pH 3)을 이용하여 어피니티(affinity) 정제하였다. 용출 분획은 1 M Tris-HCl(pH 8.0) 또는 Na2HPO4 용액을 첨가하여 pH 7.2 부근으로 조정하였다. 제조된 항체 용액은 투석막(10000 컷트, Spectrum Laboratories사 제조) 또는 SP 칼럼(아마샴 파마시아 바이오테크)를 이용하여 PBS(-)로 치환하고, 공경 0.22 ㎛의 멤블레인 필터 MILLEX-GV(MILLIPORE 제조)로 여과 멸균하였다. 정제 항체의 농도는 280 nm의 흡광도를 측정하고, 1 mg/ml를 1.450D로서 산출하였다.
실시예 2 에피토프의 결정
CD40의 세포 밖 영역의 175 아미노산(서열 1)을 커버하는, 13-mer 펩티드를 2 아미노산씩 변이시켜 합계 82종의 펩티드(서열 49로부터 130)를 셀룰로오스막 상에 C 말단으로부터 스폿 형상으로 합성하고, N 말단을 아세틸화하였다(JERINI 사: 독일). 이후의 반응은 통상법의 웨스턴 해석(Reineke, U. 등. (2001). "Epitope mapping with synthetic Peptides prepared by SPOT synthesis." Antibody Engineering(Springer Lab Manual) Eds.: Kontermann/Dubel. 433-459. 등 참조)을 바탕으로 실시하였다. 해석은 LumiImagerTM(Boehringer-Mannheim사)을 사용하여 각 스폿의 발색 강도를 수치화하였다(도 1A-1, A-2, B-1, B-2).
그 결과, 4D11 항체는 20 내지 24번째와 41번째의 펩티드, 2105 항체는 12 내지 23번째와 64번째, KM341-1-19 항체는 41, 42번째의 펩티드, KM643-4-11은 43번째의 펩티드, F72는 75번째, 110은 64번째의 펩티드를, F4-465는 34, 35, 54, 55, 65, 66, 75번째의 펩티드를, KM281-1 내지 10은 21, 24, 64, 75번째의 펩티드를, 2B11(신규항체)는 21, 24, 64번째의 펩티드를, 76(신규 항체)는 21, 35, 51, 52번째의 펩티드를 강하게 인식하는 것을 알았다.
항 CD40 항체의 결합 부위를 확정하기 위해서, 변이를 도입한 CD40-FC 융합 단백질을 제조하여 결합능을 ELISA에 의해 조사하였다. 항 CD40 항체는 마우스의 B 세포에 대하여 교차성을 나타내지 않기 때문에, 마우스 CD40의 아미노산 서열에 부분적으로 변환한 5 종류의 CD40Fc 융합 단백질을 제조하여, 이 항원에 대한 항체의 결합을 조사하였다. 변이형 CD40-FC 융합 단백질의 제조 방법은 이하에 나타낸다. 변이 부위는, 항체가 강하게 결합하는 펩티드 서열의 부분에 마우스 CD40의 서열을 도입함으로써 제조하였다. CD40mut1은 15번째 펩티드에 상당하는 부위의 EFTE를 ALEK로, CD40mut2는 21번째 펩티드에 상당하는 부위의 LDT를 SAQ로, CD40mut3은 24번째 펩티드에 상당하는 부위의 TH를 IR로, CD40mut4는 42번째 펩티드에 상당하는 부위의 EEGW를 KEGQ로, CD40mut5는 64번째 펩티드에 상당하는 부위를 VSSA에서 QSSL로 변환하였다. 변이체의 제조는 유전자 공학적 수법에 따라서 실시하였다(도 2A, B, C). 해석의 결과, 2105 항체는 CD40mut1에의 결합능을 현저히 저하시키는 것을 알았다. 또한, 4D11 항체, 2B11은 CD40mut2에의 결합능을 저하시키는 것을 알았다.
실시예 3 항 CD40 아고니스틱 항체의 Ramos 세포에 대한 결합 활성
2x106/ml의 농도로 Ramos 세포주를 0.1 ％ NaN3, 2 ％ FCS 함유 PBS의 염색 완충액(SB)에 부유시켰다. 세포 부유액(100 μl/웰)을 96-웰 둥근 바닥 플레이트(벡톤 디킨슨사 제조)에 분주하였다. 각각의 하이브리도마의 배양 상청(50 μl)를 첨가하고, 빙온하에 30 분간 배양하였다. 음성 대조군으로서 인간 혈청 알부민에 대한 인간 IgG1 항체를 이용하고, 하이브리도마 배양 배지에서 2 ㎍/ml의 농도로 제조하여, 50 μl 첨가 후 빙온하에 15 분간 인큐베이팅하였다. SB로 세정한 후, 250배 희석한 R-PE 형광 표지 항 인간 항체(Southern Biotechnology사 제조) 50 μl를 첨가하고, 빙온하 15 분간 배양하였다. SB로 2회 세정한 후, 300 내지 500 μl의 FACS 완충액에 현탁시키고, FACS(FACSort, FACScan, 벡톤 디킨슨사 제조)로 각 세포의 형광 강도를 측정하였다.
실시예 4 항 CD40 아고니스틱 항체의 Ramos 세포에 대한 아고니스틱 활성 평가
5.0x105개/ml의 Ramos 세포 현탁액을 96웰 플레이트에 100 μL/웰로 파종하였다. 하이브리도마 배양 상청 또는 정제 항체를 20 ㎍/ml로 배지로 희석하고, 96웰 플레이트에 100 μl/웰의 농도로 첨가하였다. 밤새 배양 후, 세포를 모아 R-PE 표지 항 CD95 항체(Pharmingen NJ)를 이용하고, FACSCan 또는 FACSsort(벡톤 디킨슨)을 사용하여 해석하였다.
실시예 5 Ramos 세포에 있어서의 항 CD40 안타고니스틱 항체에 의한 CD95 발현 억제
1.0x106개/ml의 Ramos 세포 현탁액을 96웰 플레이트에 50 μl/웰로 파종하였 다. 하이브리도마 배양 상청 또는 정제 항체를 2 ㎍/ml로 배지로 희석하고, 96웰 플레이트에 100 μl/웰의 농도로 첨가하였다. 가용성 CD40 리간드(ALEXIS CORPORATION)를 4 ㎍/ml와 항 FLAG 항체(M2, 시그마) 4 ㎍/ml를 배지에 첨가하고, 96웰 플레이트에 50 μL/웰 첨가하였다. 밤새 배양 후, 세포를 모아 R-PE 표지 항 CD95 항체(Pharmingen NJ)를 이용하고, FACS를 사용하여 해석하였다.
실시예 6 항 CD40 항체 CDC 활성의 측정
CDC 앗세이는 Cr51 표지한 타겟 세포 2000개에 대하여 최종 농도 5 ％의 인간 혈청 유래 보체(SIGMA사 제조) 또는 토끼 혈청 유래 보체(CEDARLANE LABORATORIES LIMITED, 온타리오, 캐나다)를, 둥근 바닥 96웰 플레이트 중에서 전체 용량 200 μL로 각 항체 농도와 함께 37 ℃, 5 ％ CO2 존재하에 2 시간 배양하였다.
배양 후, 플레이트를 원심하여 세포를 침전시킨 후, 상청 50 μL를 분말 신틸레이터 함유의 96웰 플레이트(LumaplatTM-96: 팩커드사 제조)에 옮기고, 55 ℃, 1.5 시간으로 건조시켰다. 건조를 확인한 후, 전용 커버(TopSealTM-A: 96-웰 마이크로플레이트: 팩커드사 제조)로 플레이트를 덮고, 신틸레이션 카운터(톱 카운트: 팩커드사 제조)로 γ 선량을 측정하였다.
실시예 7 항 CD40 항체의 ADCC 활성 측정
항체를 통한 세포 상해성 활성은 NK 세포 또는 호중구 등의 킬러 활성을 갖 는 세포와 항체의 존재하에서 타겟 세포에의 상해 활성(항체 의존성 세포성 세포 상해 활성(Antibody-Dependent Cellular Cytotoxicity), 이하 ADCC), 및 보체와 항체의 존재하에서 타겟 세포에의 상해 활성(보체 의존성 세포 상해 활성(Complement-Dependent Cytotoxicity) 이하, CDC)의 측정을 실시하였다. 대조군으로서 hIgG를 이용하였다.
방법은 간단하게는, 타겟 세포에 방사성 크롬(Cr51)을 세포질 내에 취입하고, 세포사에 의해 배양액 중에 유리되는 Cr51량을 γ 선량으로 측정하였다.
구체적으로는, 타겟 세포로서 바키트 림프종 세포주 Raji(ATCC CCL-86)을 106개를 15 μL의 Fetal Calf Serum(FCS)에 현탁시키고, 50 μL(37 MBq/mL)의 Cr51 표지된 크롬산나트륨(파키엘마사 제조: 이하 Cr51이라 함)을 첨가하고, 1 시간 37 ℃에서 배양하였다. 다음에, 배지를 10 mL 첨가하고, 원심시켜 배지를 버리는 것을 3회 반복함으로써 세포 내에 취입되지 않은 Cr51을 제거하였다.
ADCC 앗세이는 Cr51 표지한 타겟 세포 2000개에 대하여 실시예 6에 기재된 방법으로 취득한 건강 정상인 말초혈 단핵구 200000개를 둥근 바닥 96웰 플레이트(Falcon사 제조) 중에서 전체 용량 200 μL로 각 항체 농도와 함께 37 ℃, 5 ％ CO2 존재하에 4 시간 배양하였다.
배양 후, 플레이트를 원심하여 세포를 침전시킨 후, 상청 50 μL를 분말 신틸레이터 함유의 96웰 플레이트(LumaplatTM-96: 팩커드사 제조)에 옮기고, 55 ℃, 1.5 시간으로 건조시켰다. 건조를 확인한 후, 전용 커버(TopSealTM-A: 96-웰 마이크로플레이트: 팩커드사 제조)로 플레이트를 덮고, 신틸레이션 카운터(톱 카운트: 팩커드사 제조)로 γ 선량을 측정하였다.
실시예 8 항 CD40 아고니스틱 항체 P331S 변이체의 제조와 활성 평가
항 CD40 아고니스틱 항체 KM341-1-19 및 2105의 유전자 클로닝에 대해서는 WO02/099186에 기재되어 있다. IgG2 불변 영역의 331번째 Pro를 Ser로 변환함으로써 CDC 활성이 감소된다는 보고가 있다. KM341-1-19 항체, 2105 항체에 대해서도 CDC 활성을 감소시키기 위해서 P331S 변이를 IgG2 불변 영역에 도입하였다.
항체 발현 벡터 N5KGl-Val Lark(IDEC Pharmaceuticals: 이하 N5KG1이라 약기함)의 인간 IgG1 불변 영역을 인간 IgG2로 대체한 것(N5KG2)를 제조하고, IgG2의 331번째 Pro를 Ser로 변환한 변이를 제조하였다. IgG2 불변 영역의 cDNA 클로닝은 KM341-1-19 하이브리도마를 원심에 의해 모아 TRIZOL(Gibco BRL)을 첨가하고, 취급 설명서에 따라서 Total RNA를 추출하였다. 항체 cDNA의 가변 영역의 클로닝은 CLONTECH사의 SMART RACE cDNA amplification Kit를 이용하여 첨부 설명서에 따라서 행하였다. 5 ㎍의 total RNA를 주형으로 하고, 1st Strand cDNA를 제조하였다. 프라이머의 서열은 tnIgG3Nhe: atatGCTAGCACCAAGGGCCCATCGGTCTTCCCCCTGGC(서열 2) G, tnIgG2Bam: atatggatccTCATTTACCCGGAGACAGGGAGAGGCTC(서열 3)을 사용하고, ZtaqPCR kit(Takara)를 이용하여 98 ℃ 1 초, 55 ℃ 30 초, 72 ℃ 1 분 x 30 사이클로 PCR을 행하여 유전자를 증폭시켰다. 반응 후, QIAGEN PCR 정제용 키트로 정제하고, NheI, BamHI로 소화하며 N5KG1에 조립하여 서열을 확인하였다. 이 벡터를 N5KG2라 하였다.
N5KG2Ser(331번째를 Ser로 변환시킨 것)은 N5KG2를 주형으로 하고, 프라이머 IgG3Nhe: atatGCTAGCACCAAGGGCCCATCGGTCTTCCCCCTGGCG(서열 4), G2Ser2: GTTTTCTCGATGGAGGCTGGGAGGCC(서열 5)로 98 ℃ 1 초, 60 ℃ 30 초, 72 ℃ 30 초의 반응을 15회 행하였다. 동시에, N5KG2를 주형으로 하고, 프라이머 IgG2Bam: atatggatccTCATTTACCCGGAGACAGGGAGAGGCTC(서열 6), G2Ser1: GGCCTCCCAGCCTCCATCGAGAAAAC(서열 7)을 이용하여 98 ℃ 1 초, 60 ℃ 30 초, 72 ℃ 30 초의 반응을 15회 행하였다. 증폭시킨 DNA 단편을 PCR 정제용 키트로 정제하고, 2개의 정제 DNA 단편을 등량 혼합한 후, 98 ℃ 1 초, 60 ℃ 30 초, 72 ℃ 30 초의 반응을 5회 행하고, 프라이머 IgG3Nhe, IgG2Bam을 첨가하여 15회 반응하였다. 증폭시킨 DNA 단편을 NheI, BamHI로 절단하여 N5KC1 벡터의 IgG1 불변 영역과 치환하였다(N5KG2Ser). BglII, NheI로 소화한 항체 가변 영역의 배열을 포함하는 단편을 N5KG2ser 벡터에 조립하였다.
상술한 방법으로 발현 정제한 항체를 이용하여 Ramos 세포에 대한 결합능(도 3A), 아고니스틱 활성(도 3B)의 평가를 실시하였다. P331S의 변이의 도입에 의해서 활성의 변동은 보이지 않았다.
실시예 9 항 CD40 아고니스틱 항체 331ser 변이체의 CDC 활성의 측정
상술한 방법에 의해 CDC 활성을 측정하였다. 토끼 혈청 유래 보체를 사용하 고, Ramos 세포를 표적 세포로서 사용하였다. 그 결과, KM341-1-19 항체는 1 ㎍/ml의 항체 농도에서는 IgG2에 비해 IgG2ser이 현저히 CDC 활성이 감소한 것을 알았다(도 4A). 한편, 인간 보체를 사용한 경우에는, 변화는 보이지 않았다(도 4B).
실시예 10 아고니스트 항 CD40 항체 불변 영역 변환체의 제조와 활성 측정
WO02/088186에 기재된 항 CD40 항체 중, 가장 강한 아고니스틱 활성을 나타내는 것 2개(KM341-1-19 항체, 2105 항체)는 IgG2 서브클래스였다. IgG2 서브클래스가 CD40의 활성화에 중요한지 어떤지 조사하기 위해서, IgG1, IgG3, IgG4에 항체 불변 영역을 변환한 재조합 단백질을 제조하고, 항원에의 결합능과 Ramos 세포에 있어서의 CD95 발현 촉진 활성은 실시예 4, 6에 따라서 실시하였다. IgG1형의 발현에 대해서는, N5KG1을 IgG2, Ig3의 발현에 대해서는, N5KG1의 불변 영역을 각각 IgG2, IgG3으로 변환시킨 발현 벡터, N5KG2, N5KG3을 이용하였다. IgG3 불변 영역의 cDNA 클로닝은 IgG2의 클로닝 방법을 일부 개변하고, IgG3 특이적 프라이머를 사용함으로써 실시하였다. IgG4의 발현에는 N5KG4PE(IDEC Pharmaceuticals)를 이용하였다.
항체 단백질의 발현은 실시예 1에 따라서 실시하였다. 인간 CD40을 발현하고 있는 Ramos 세포에의 결합 활성은, KM341-1-19 항체, 2105 항체 모두 IgG2로부터 IgG1, 3, 4로 변환한 것에 의한 영향은 보이지 않았지만(도 5A-1, 도 5A-2), Ramos 세포에 있어서의 CD95의 발현 촉진 활성은 1/10 이상 저하한 것을 알았다(도 5B-1, 도 5B-2). 이것은, 2105 항체, KM341-1-19 항체의 강한 아고니스틱 활성은, 항체의 결합 영역을 결정하는 가변 영역의 구조 이외에 항체의 불변 영역의 구조도 중요한 것을 시사하였다. 따라서, IgG2의 불변 영역 내의 어떤 영역이 아고니스틱 활성에 중요한지 어떤지 조사하기 위해서, IgG2와 IgG4의 구조를 혼합한 도메인 교환 변종을 제조하여 활성을 측정하였다. 이하에 서술하는 바와 같이, 도메인 교환 변종의 제조에 있어서는, 힌지 영역의 치환을 행하지만, 이 경우의 "힌지 영역"은 0le H Brekke et. al. Immunology Today 1995, 16, 85-90에 기재된 상부 힌지(Kabat EU code 216으로부터), 중부 힌지(Kabat EU code 226으로부터) 및 하부 힌지(Kabat EU code 231로부터)를 합한 것이다. 도메인 교환 변종은 KM341-1-19 항체, 2105 항체의 각각에 대하여 IgG2/4(CH1, 힌지 영역은 IgG2, 그 이후는 IgG4), IgG4/2/4(힌지 영역은 IgG2, 그 이외는 IgG4), IgG2/4/4(CH1은 IgG2, 그 이외는 IgG4), IgG4/2/2(CH1은 IgG4, 그 이외는 IgG2)의 4 종류씩 제조하였다.
IgG2/4 항체 발현을 위한 벡터 N5KG2/4는 Ztaq PCR kit(Takara)을 이용하여 제조하였다. N5KG2를 주형으로 하고, 프라이머 IgG3Bam: atatggatccTCATTTACCCGGAGACAGGGAGAGGC(서열 8), 24Chi4: AGGGGTCCGGGAGATCATGAGAGTGTCCTT(서열 9)로 98 ℃ 1 초, 60 ℃ 30 초, 72 ℃ 30 초의 반응을 15회 행하였다. 동시에, N5KG4(IDEC Pharmaceuticals)를 주형으로 하고, 프라이머 24Chi3: AAGGACACTCTCATGATCTCCCGGACCCCT(서열 10), linkH2: tgatcatacgtagatatcacggc(서열 11)를 이용하여 98 ℃ 1 초, 60 ℃ 30 초, 72 ℃ 30 초의 반응을 15회 행하였다. 증폭시킨 DNA 단편을 PCR 정제용 키트로 정제하고, 2개의 정제 DNA 단편을 등량 혼합한 후, 98 ℃ 1 초, 60 ℃ 30 초, 72 ℃ 30 초의 반응을 5회 행하고, 프라이머 IgG3Bam, linkH2: tgatcatacgtagatatcacggc(서열 12)를 첨가하여 15회 반응하였다. 증폭시킨 DNA 단편을 NheI, BamHI로 절단하여 N5KG1 벡터의 IgG1 불변 영역과 치환하였다.
IgG4/2/4 발현을 위한 벡터 N5KG4/2/4는, N5KG4를 주형으로 하고, linkH: gggtacgtcctcacattcacgtgatcag(서열 13), G2Hin3: TTTGCGCTCAACTGTCTTGTCCACCTTGGTGTTGCTGGG(서열 14)와 linkH2: tgatcatacgtagatatcacggc(서열 15), G2Hin4: ACAGTTGAGCGCAAATGTTGTGTCGAGTGCCCACCG(서열 16)을 이용하여 각각 98 ℃ 1 초, 60 ℃ 30 초, 72 ℃ 30 초의 반응을 15회 행하였다. 증폭시킨 DNA 단편을 PCR 정제용 키트로 정제하고, 2개의 정제 DNA 단편을 등량 혼합한 후, 이것을 주형으로 하여 98 ℃ 1 초, 60 ℃ 30 초, 72 ℃ 30 초의 반응을 5회 행하고, linkH, linkH2 프라이머를 첨가하여 15회 반응하였다. 증폭시킨 DNA 단편을 NheI, BamHI로 절단하여 N5KG1 벡터의 IgG1 불변 영역과 치환하였다.
IgG2/4/4 발현을 위한 벡터 N5KG2/4/4는, N5KG2를 주형으로 하고, 프라이머 linkH: gggtacgtcctcacattcagtgatcag(서열 17), G4CH1-2: GGTGTTGCTGGGCTTGTGATCTACGTTGCAG(서열 18)로 98 ℃ 1 초, 60 ℃ 30 초, 72 ℃ 30 초의 반응을 15회 행하였다. 동시에, N5KG4를 주형으로 하고, 프라이머 G4CH1-1: CTGCAACGTAGATCACAAGCCCAGCAACACC(서열 19), linkH2: tgatcatacgtagatatcacggc(서열 20)을 이용하여 98 ℃ 1 초, 60 ℃ 30 초, 72 ℃ 30 초의 반응을 15회 행하였다. 증폭시킨 DNA 단편을 PCR 정제용 키트로 정제하고, 2개의 정제 DNA 단편을 등량 혼합한 후, 98 ℃ 1 초, 60 ℃ 30 초, 72 ℃ 30 초의 반응을 5회 행하고, 프라이머 linkH, linkH2를 첨가하여 15회 반응하였다. 증폭시킨 DNA 단편을 NheI, BamHI로 절단하여 N5KG1 벡터의 IgG1 불변 영역과 치환하였다.
IgG4/2/2 발현을 위한 벡터 N5KG4/2/2는, N5KG4를 주형으로 하고, 프라이머 linkH: gggtacgtcctcacattcagtgatcag(서열 21), G4CH1-2: GGTGTTGCTGGGCTTGTGATCTACGTTGCAG(서열 22)로 98 ℃ 1 초, 60 ℃ 30 초, 72 ℃ 30 초의 반응을 15회 행하였다. 동시에, N5KG2를 주형으로 하고, 프라이머 G4CH1-1: CTGCAACGTAGATCACAAGCCCAGCAACACC(서열 23), linkH2: tgatcatacgtagatatcacggc(서열 24)를 이용하여 98 ℃ 1 초, 60 ℃ 30 초, 72 ℃ 30 초의 반응을 15회 행하였다. 증폭시킨 DNA 단편을 PCR 정제용 키트로 정제하여 2개의 정제 DNA 단편을 등량 혼합한 후, 98 ℃ 1 초, 60 ℃ 30 초, 72 ℃ 30 초의 반응을 5회 행하고, 프라이머 linkH, linkH2를 첨가하여 15회 반응하였다. 증폭시킨 DNA 단편을 NheI, BamHI로 절단하여 N5KG1 벡터의 IgG1 불변 영역과 치환하였다.
KM34l-1-19 항체, 2105 항체에 대하여 각각 4종의 도메인 교환 변종의 결합 활성을 조사한 결과에서는, 오리지널 IgG2와의 차이는 확인되지 않았지만(도 6A-1, 도 6A-2), 아고니스틱 활성에 대해서는, KM341-1-19 항체, 2105 항체의 양자 모두 IgG2/4/4만이 활성이 현저하게 저하되었다(도 6B-1, 도 6B-2). 이 결과로부터는, IgG2의 힌지 영역이 아고니스틱 활성에 중요한 것을 알았다.
또한, 힌지 영역 내에서 어떤 배열이 중요한지 조사하였다. 힌지 영역은 상부 힌지, 중부 힌지, 하부 힌지의 3개의 부위로 나뉘어지지만(Ole H Brekke et. al. Immunology Today 1995, 16, 85-90), 그 중 각각, IgG2에 특이적인 배열을 IgG4의 것으로 치환하였다. 상부 힌지(Kabat EU code 216으로부터), 중부 힌지(Kabat EU code 226으로부터), 하부 힌지(Kabat EU code 231로부터)에 변이를 도입한 항체를 IgG2UH4, IgG2MH4, IgG2LH4로 하고, 각각의 발현 벡터는 N5KG2UH4, N5KG2MH4, N5KG2LH4로 하였다. 또한, Kabat et. al., Sequences of ploteins of immunological interest, 1991 Fifth edition에 기초하면, "힌지"는 EU 인덱스 216으로부터 230이라고 정의되어 있다.
N5KG2UH4는, N5KG2를 주형으로 하고, 프라이머 linkH: gggtacgtcctcacattcagtgatcag(서열 25), UH4-2: CACAACATTTggaCTCAACTcTCTTGTCCACC(서열 26)로 98 ℃ 1 초, 60 ℃ 30 초, 72 ℃ 30 초의 반응을 15회 행하였다. 동시에, N5KG2를 주형으로 하고, 프라이머 UH4-1: GGTGGACMGAgAGTTGAGtccAAATGTTGTG(서열 27), linkH2: tgatcatacgtagatatcacggc(서열 28)을 이용하여 98 ℃ 1 초, 60 ℃ 30 초, 72 ℃ 30 초의 반응을 15회 행하였다. 증폭시킨 DNA 단편을 PCR 정제용 키트로 정제하여 2개의 정제 DNA 단편을 등량 혼합한 후, 98 ℃ 1 초, 60 ℃ 30 초, 72 ℃ 30 초의 반응을 5회 행하고, 프라이머 linkH, linkH2를 첨가하여 15회 반응하였다. 증폭시킨 DNA 단편을 NheI, BamHI로 절단하여 N5KGI 벡터의 IgGI 불변 영역과 치환하였다.
N5KG2MH4는, N5KC2를 주형으로 하고, 프라이머 linkH: gggtacgtcctcacattcagtgatcag(서열 29), UM4-2: GGCACGGTGGGCAtgggggaccataTTTGCGCTC(서열 30)로 98 ℃ 1 초, 60 ℃ 30 초, 72 ℃ 30 초의 반응을 15회 행하였다. 동시에, N5KG2를 주형으로 하고, 프라이머 UM4-1: GAGCGCAAAtatggtcccccaTGCCCACCGTGCC(서열 31), linkH2: tgatcatacgtagatatcacggc(서열 32)를 이용하여 98 ℃ 1 초, 60 ℃ 30 초, 72 ℃ 30 초의 반응을 15회 행하였다. 증폭시킨 DNA 단편을 PCR 정제용 키트로 정제하여 2개의 정제 DNA 단편을 등량 혼합한 후, 98 ℃ 1 초, 60 ℃ 30 초, 72 ℃ 30 초의 반응을 5회 행하고, 프라이머 linkH, linkH2를 첨가하여 15회 반응하였다. 증폭시킨 DNA 단편을 NheI, BamHI로 절단하여 N5KGI 벡터의 IgG1 불변 영역과 치환하였다.
N5KG2LH4는, N5KG2를 주형으로 하고, 프라이머 linkH: gggtacgtcctcacattcagtgatcag(서열 33), UL4-2: GAAGACTGACGGTCCccccaggaactcTGGTGCTGGGCA(서열 34)로 98 ℃ 1 초, 60 ℃ 30 초, 72 ℃ 30 초의 반응을 15회 행하였다. 동시에, N5KG2를 주형으로 하고, 프라이머 UL4-1: TGCCCAGCACCAgagttcctggggGGACCGTCAGTCTTC(서열 35), linkH2: tgatcatacgtagatatcacggc(서열 36)을 이용하여 98 ℃ 1 초, 60 ℃ 30 초, 72 ℃ 30 초의 반응을 15회 행하였다. 증폭시킨 DNA 단편을 PCR 정제용 키트로 정제하여 2개의 정제 DNA 단편을 등량 혼합한 후, 98 ℃ 1 초, 60 ℃ 30 초, 72 ℃ 30 초의 반응을 5회 행하고, 프라이머 linkH, linkH2를 첨가하여 15회 반응하였다. 증폭시킨 DNA 단편을 NheI, BamHI로 절단하여 N5KG1 벡터의 IgG1 불변 영역과 치환하였다.
KM341-1-19 항체, 2105 항체에 대하여 각각 3 종류의 도메인 교환 변종의 항원에 대한 결합 활성을 조사하였지만 동등하였다(도 6A-1, 도 6A-2). 한편 Ramos 세포에 대한 아고니스틱 활성에 대해서는 IgG2UH4, IgG2MH4에서 현저히 저하하였다(도 6B-1, 도 6B-2). 이상의 점으로부터, 항 CD40 항체 KM341-1-19, 2105의 IgG2 서브클래스 의존의 아고니스틱 활성은, 힌지 영역 중 상부 힌지, 중부 힌지의 구조가 중요한 것을 알았다.
IgG2 서브클래스가 아고니스틱 활성에 중요한 것이 판명되었기 때문에, IgG2 이외의 서브클래스의 항체를 IgG2 서브클래스로 변환하여 아고니스틱 활성이 증강되는지 여부 조사하였다. 수개의 클론에 대하여 조사한 가운데, F76은 IgG1로부터 IgG2로 서브클래스를 변환함으로써 아고니스틱 활성을 증강시킬 수 있었다(도 7A, B).
실시예 11 항 CD40 안타고니스트 항체 이변체의 제조
원래의 서브클래스는 IgG1인, WO02/088186에 기재된 4D11 항체 유전자의 중쇄, 경쇄를 포함하는 DNA 단편을 BglII, NheI로 소화, 정제한 후, N5KG4PE, N5KG4P, N5KG4 벡터(IDEC Pharmaceuticals)에 통합하였다. N5KG4PE는 IgG4 불변 영역에, S228P 및 L235E, N5KG4P는 S228P의 점 변이를 각각 포함한다. 항체 단백질의 발현, 정제는 상술한 방법에 의해서 실시하였다. 정제 항체는 Ramos 세포에의 결합을 지표로 상술한 방법에 따라서 실시하였다. IgG1, IgG4, IgG4P, IgG4PE의 Ramos 세포에의 결합 활성의 변화는 보이지 않았다(도 8A). 또한 상술한 방법에 의해 안타고니스틱 활성의 비교를 행하였지만, IgG1과 IgG4 각종 이변체와의 사이에는, 안타고니스틱 활성에 대해서는 차이가 발견되지 않았다(도 8B).
실시예 12 항 CD40 안타고니스트 항체 이변체의 ADCC 활성, CDC 활성 평가
항 CD40 변이 항체의 ADCC 활성, CDC 활성은 상술한 방법에 의해서 실시하였 다.
인간 MNC을 이펙터 세포로서, CD40 발현 Daudi 세포를 표적으로서 사용한 경우, 4D11 항체의 원래 서브클래스인 IgG1과 비교하여, IgG4, IgG4PE의 2개의 변이체는 각각 ADCC 활성의 현저한 저하가 관찰되었다(도 9).
CDC 활성에 대해서는, IgG1과 IgG4P의 활성 비교를 Daudi 세포를 표적으로 하여 측정하였다. IgG1에 비해, IgG4P는 CDC 활성이 현저히 저하된 것을 알 수 있었다(도 10).
실시예 13 항 CD40 안타고니스틱 항체의 B 세포에 미치는 영향
마우스 내인성 CD40 파괴에 대하여 호모 접합체가 유전자 배경을 가지고, 또한 인간 CD40 유전자의 트랜스 유전자를 가지고 있는 마우스(Yasui. et al. Int. Immunol. 2002 Vol 14: 319)에 4D11 항체의 IgG1, IgG4P 및 IgG4PE를 각각 100 ㎍ 꼬리 정맥 내 투여하였다. 투여 24 시간 후에 안와(眼窩) 정맥총으로부터 채혈하고, 0.16 mol/L의 염화암모늄으로써 용혈 후, FITC 표지 항 B220 항체를 이용하고, FACS를 이용하여 해석하였다. 도 11에 결과를 나타낸다. 도면 중 종축은 전체 림프구 중의 B 세포의 비율을 나타낸다. B 세포 비율의 감약(減弱)의 정도는 IgG1> IgG4P>IgG4PE의 순서로 컸다. 또한, 투여 24 시간 후에 비장을 적출하고, 슬라이드 유리로 짓이김으로써 세포 부유액을 제조하였다. 세포 부유액을 용혈 후, PE 표지 항 B220 항체와 FITC 표지 항 CD23, CD86 또는 CD95 항체를 이용하고, FACS를 이용하여 해석하였다. 도 12A, B, C에 결과를 나타낸다. 도면 중 종축은 전체 림프구 중의 각 표면 마커를 발현하는 B 세포의 비율을 나타낸다. 4D11은 어떤 마커 도 시판 항체인 마우스 항 인간 CD40 아고니스틱 항체 5C3(파민젠)과 동등한 발현 상승을 볼 수 있었다. IgG4PE는 IgG1 및 IgG4P에 비해 각 활성화 표면 마커의 발현 상승의 정도는 낮았다.
실시예 14 항 CD40 안타코니스틱 항체에 의한 항원 특이적 항체 생산 억제작용 및 B 세포수의 변화
마우스 내인성 CD40 파괴에 대하여 호모 접합체의 유전자 배경을 가지고, 또한 인간 CD40 유전자의 트랜스 유전자를 가지고 있는 마우스(Yasui. et al. Int. Immunol. 2002 Vol 14: 319)에 4-히드록시-3-니트로페닐아세틸-치켄 γ-글로불린 컨쥬게이트(NP-CGG: 오사까 대학 미생물병 연구소 기쿠타니 히토시 교수로부터 분여)와 알럼(Alum: 수산화알루미늄 겔)의 복합체를 100 ㎍(NP-CGG량으로서) 복강 내 주사함으로써 감작시켰다. 각 항체는 항원 감작 직전에 50 또는 100 ㎍의 양을 꼬리 정맥 내 투여하였다. 음성 대조로서 항 인간 알부민 인간 IgG4PE 항체 100 ㎍을 투여하였다. 감작 7 및 14일 후, 안와 정맥총으로부터 채혈하고, 혈청 중의 NP 특이적 IgG1 및 IgM 항체량을 ELISA법에 의해 측정하였다. ELISA법은 NP를 결합한 소혈청 알부민(NP-BSA: 2.5 ㎍/ml) 50 μl/웰을 ELISA용 96웰 마이크로플레이트(Maxisorp, Nunc사 제조)의 각 웰에 가하고, 4 ℃에서 배양하여 NP-BSA를 흡착시켰다. 이어서, 상청을 버리고, 각 웰에 블로킹 시약(수퍼블럭, Pierce사 제조)를 첨가하여 실온에서 인큐베이팅하여 블로킹한 후, 각 웰을 0.1 ％ Tween20 함유 인산 완충액(PBS-T)으로 3회 세정하였다. 이어서, 각 웰에 10 ％ 블록에이스 함유 PBS-T로 희석한 각 혈청(50 μl/웰)을 첨가하고, 37 ℃에서 2 시간 배양하여 반응시켰 다. 마이크로플레이트를 PBS-T로 3회 세정 후, 알칼리 포스파타아제로 표지된 염소 항 마우스 IgG1 항체 또는 IgM 항체(코스모바이오, 1070-04 또는 1020-04)를 10 ％ 블록에이스 함유 PBS-T로 1,000배에 희석한 용액(50 ㎍/웰)을 각 웰에 가하여 37 ℃에서 2 시간 배양하였다. 이어서, 마이크로플레이트를 PBS-T로 3회 세정 후, 발색 기질액(50 μl/웰, Sigma104, phosphatase substrate)를 각 웰에 가하고, 파장 405 nm에서의 흡광도를 마이크로플레이트 리더로 측정하였다. 그 결과를 도 13A, B에 나타낸다. 도면 중 종축은 NP-CGG를 C57BL/6 마우스에 2회 주사한 후 채혈하여 풀(pool)한 혈청에 대하여, IgG1의 경우에는 10,000배 희석한 것을, IgM 항체의 경우에는 100배한 것을 각각 1 유닛으로 하여 환산한 값을 나타낸다. 4D11 항체 및 281의 IgG4P 또는 IgG4PE 항체는 NP 특이적인 IgG1 및 IgM 항체 생산을 동등하게 강하게 억제하였다.
항체 생산 억제 작용의 검토에 이용한 마우스의 말초혈 중 및 비장 중의 B 세포수의 변화를 실시예 1과 동일한 방법으로 측정하였다. 그 결과를 도 14A, B에 나타낸다. 4D11 및 281의 IgG4P 항체는 IgG4PE 항체에 비해 말초혈 중 B 세포 비율의 감소가 보다 현저하였다. 또한, 항원 감작 14일 후에 적출한 비장 중 B 세포의 비교적 대해서도 IgG4PE 항체 100 ㎍의 투여에서는 변화를 볼 수 없었던 것에 대하여, IgG4P의 투여에서는 감소 또는 감소 경향을 볼 수 있었다.
실시예 15 항 CD40 안타고니스틱 항체의 카니쿠이 원숭이에 있어서의 작용
4D11 항체의 IgG4P 또는 IgG4PE의 30 mg/kg을 카니쿠이 원숭이의 전완(前腕) 요측(橈側) 피부 정맥 내에 투여하고, 일정 시간 후에 대퇴 정맥으로부터 채혈하였 다. 말초혈 림프구 서브셋트 해석은 각 세포 부유액을 FITC 표지 항 CD3 항체, PE 표지 항 CD20 항체 및 APC 표지 항 CD45 항체를 이용하고, FACS를 이용하여 양성 세포 비율의 계측을 행하여, CD45 양성 세포에 있어서의 비율을 산출하였다. 그 결과를 도 15에 나타낸다. 도면 중 종축은 항체 투여 전의 CD20 양성 세포 비율에 대한 각 시간에서의 CD20 양성 세포 비율의 비율을 나타낸다. IgG4P 항체 투여 개체에서는 항체 투여 1 내지 7일 후의 사이에 CD20 양성 세포는 약 40 ％ 감소하였지만, IgG4PE 항체 투여 개체에서는 4일 후에 약 20 ％ 감소할 뿐이었다.
혈청 중의 IL12 농도는 ELISA법으로써 측정하였다. 대퇴 정맥으로부터 채취한 혈액을 실온에서 20 내지 60 분간 정치 후, 실온에서 3000 rpm, 15 분간 원심 분리하여 얻어진 혈청을 monkey IL12 ELISA kit(Biosource사)를 이용하여 측정하였다. 그 결과를 도 16에 나타낸다. IgG4PE 항체는 모든 채혈 포인트에서 IL12의 생산 증가는 확인되지 않았지만, IgG4P 항체는 4일째를 피크로 IL12 생산을 볼 수 있었다.
실시예 16 항 CD40 안타고니스틱 항체의 카니쿠이 원숭이 지연형 과민증 모델에 있어서의 작용
테타누스 독소(Tetanus toxoid: TTx)(10 Lf/ml; 덴카 세이켄 가부시끼가이샤)를 수컷 카니쿠이 원숭이 9 마리에 가죽 내 및 근육 내에 감작시켜 TTx에 대한 지연형 과민증을 유발시킴과 동시에, 감작 개시 10 분 전에 0.1 및 10 mg/kg 4D11G4PE 항체의 정맥 내 투여를 각 3 마리에 3회(1주간마다 1회) 실시하여 4D11G4PE의 지연형 과민증에 대한 작용을 검토하였다. 케타민의 근육 내 투여에 의한 마취하에, 감작은 배부(背部) 가죽 내(50 μL/site×12 부위) 및 대퇴부 근육 내(0.6 mL/body)에, 야기는 감작 21일 후에 흉부 가죽 내(10 μL/site, 3 부분씩: 0 내지 10 Lf/ml)에 TTx를 투여하였다. 야기 후 24 및 48 시간에 투여 부위의 피부 반응을 관찰하여, Draize의 피부 장해 판정 기준에 따라서 평가하였다. 또한, TTx 각 농도 3 부분에서의 결과는 각각을 평균한 것을 이용하였다. 그 결과를 도 17에 나타낸다. 4D11G4PE 항체의 투여에 의해, 24 및 48 시간 후에 볼 수 있는 지연형 과민증 반응은 분명히 억제되었다.
TTx 특이적 IgG 및 IgM 항체가에 미치는 영향을 검토하였다. 경시적으로 대퇴 정맥으로부터 채취한 혈액을 실온에서 20 내지 60 분간 정치 후, 실온에서 3000 rpm, 15 분간 원심 분리하여 얻어진 혈청 중의 항체가를 ELISA법을 이용하여 측정하였다. ELISA법은 TTx(0.5 Lf/ml) 100 μL/웰을 ELISA용 96웰 마이크로플레이트(Maxisorp, Nunc사 제조)의 각 웰에 가하여 4 ℃에서 밤새 인큐베이팅하여 TTx를 흡착시켰다. 이어서, 상청을 버리고, 각 웰에 블로킹 시약(0.5 ％ BSA 함유 인산 완충액)를 첨가하여 실온에서 인큐베이팅하여 블로킹한 후, 각 웰을 0.05 ％ Tween20 함유 인산 완충액(PBS-T)으로 3회 세정하였다. 이어서, 각 웰에 0.5 ％ BSA 함유 PBS-T로 희석한 각 혈청(100 내지 819200배 희석, 희석 배율=2; 100 μl/웰)을 가하여 실온에서 2 시간 배양하여 반응시켰다. 마이크로플레이트를 PBS-T로 3회 세정 후, 퍼옥시다아제로 표지된 염소 항 원숭이 IgG 항체 또는 IgM 항체(Nordic Immunology)를 0.5 ％ BSA 함유 PBS-T로 3,000배에 희석한 용액(100 ㎍/웰)을 각 웰에 가하여 실온에서 1 시간 인큐베이팅하였다. 이어서, 마이크로플레 이트를 PBS-T로 3회 세정 후, 발색 기질액(100 μL/웰, O-페닐렌디아민염산염+과산화수소수)를 각 웰에 가하고, 파장 492 nm에서의 흡광도를 마이크로플레이트 리더로 측정하였다. 항 TTx 항체가는 흡광도가 0.1 이상이 되는 최대 희석 배율로 하고, 100배 희석에 있어서도 흡광도가 0.1에 달하지 않는 경우에는 0이라 하였다. 그 결과를 도 18 및 19에 나타낸다. 4D11G4PE 1 mg/kg의 투여에 의해, TTX 특이적 IgG 및 IgM 항체가는 약 1/10로 억제되었다. 또한, 10 mg/kg의 투여에서는 모든 채혈 포인트에서 항체가는 검출 감도 이하였다.
실시예 17 항 CD40 안타고니스틱 항체의 혈소판 혈전 형성에 주는 영향
정상 인간으로부터 채취한 혈액을 4 등분하여(각 6 ml), 각각 100 ㎍/ml의 농도가 되도록 대조군 인간 IgG4PE, 대조군 마우스 IgG2a, 인간 항 인간 CD40 IgG4PE(4D11), 마우스 항 인간 CD154 IgG2A(5C8)을 첨가하여 37 ℃에서 10 분간 인큐베이팅하였다. Flat perfusion chamber(Glycotech사) 및 콜라겐 코팅 페트리디쉬를 부속 설명서에 따라서 조립하여, 그 챔버에 각종 항체로 처리한 혈액을 1500/s의 전단 응력이 부가되는 속도로 7 분간 흘렸다. 그 후, 4 ％ 파라포름알데히드 인산 완충액을 동일하게 1500/s의 전단 응력이 부가되는 속도로 10 분간 흘려, 페트리디쉬 상에 형성된 혈소판 응집 덩어리를 고정하고, 또한 혈소판 특이적 PE 표지 항 CD41a 항체로 염색한 후 형광 현미경으로 관찰하였다. 그 결과를 도 20A, B에 나타낸다. 인간 항 인간 CD40 IgG4PE(4D11)로 처리한 혈액은, 대조군 항체로 처리한 혈액과 동일하게 콜라겐 코팅 페트리디쉬 상에 혈소판 응집 덩어리를 형성하였지만, 마우스 항 인간 CD154IgG2a로 처리한 혈액은 혈소판 응집 덩어리를 형성하지 않았다.
실시예 18 항 CD40 안타고니스틱 항체의 안정성 평가
4D11 항체의 불변 영역 개변 항체의 안정성을 비교 검토하였다. 방법으로서는 G4P, G4PE, G2Ser 및 G4/2/4를 HEK293 세포에서 일과성 발현함으로써 얻어진 배양 상청을 Protein A 칼럼(아마샴 바이오사이언스사)에 채워 0.1 M 시트르산 완충액(pH 2.7)에 의해 용출시킨 후 37 ℃에서 1 분간 및 10 분간 배양하였다. 그 후 50 mM 인산 완충액(pH 7.0)에 의해 중화하였다. 얻어진 항체 용액의 올리고머 함유율을 겔 여과 칼럼(도소사)를 이용하여 측정하였다. 그 결과, 인큐베이팅 시간에 따라서 올리고머 함유율이 증가하고, G4/2/4>G4PE>G2Ser>G4P의 순서로 올리고머가 생성되기 쉬운 것이 판명되었다(도 21).
실시예 19 항 CD40 안타고니스틱 항체에 의한 피부 이식편 거절 억제 작용
마우스 내인성 CD40 파괴에 대하여 호모 접합체의 유전자 배경을 가지고, 또한 인간 CD40 유전자의 트랜스 유전자를 가지고 있는 C57BL/6 배경 마우스 측흉 배후에 DBA/2 마우스 꼬리부로부터 채취한 이식편을 심어 반창고로 7 일간 고정하였다. 피검 물질 4D11G4PE 100 ㎍ 또는 비히클은 피부 이식 당일로부터 0, 2, 4, 7, 9, 11, 14일 후에 각각 꼬리 정맥 내 투여하였다. NK 세포에 의한 이식편 거절을 억제하기 위해서, 수술 3일 및 술후 1, 4, 9일 후에 각각 항아시알로 GM1 항체 100 ㎍을 전체 마우스에 복강 내 투여하였다. 도 22에 결과를 나타낸다. 4D11G4PE 투여군에 있어서, 비히클 투여군과 비교하여 유의한 이식편 거절 지연이 관찰되었다.
실시예 20 인간 종양 세포주에 있어서의 CD40의 발현 해석
바키트 인포머 세포주 Ramos, 방광암 세포주 T24(ATCC, HTB-4), 췌장암 세포주 Hs 766T(ATCC, HTB-134) 및 Capan-2(ATCC, HTB-80)에 있어서의 CD40의 발현은 341G2Ser을 이용한 FACS 해석에 의해 확인하였다.
각 세포주를 T24, Hs766T, CaPan-2에 대해서는, 트립신 소화 후, Ramos에 대해서는 그대로 회수하여 PBS로 세정 후, 341G2SeR 1 ㎍/ml를 포함하는 염색용 완충액에 재현탁하였다. 염색용 완충액은 PBS에 0.5 mM EDTA, 0.05 ％ 아지화나트륨, 5 ％ 비동화(非動化) 종료 소혈청을 첨가하여 제조하였다. 4 ℃에서 15 분간 배양 후, 세포를 염색용 완충액으로 2회 세정하고, PE 결합 염소 항 인간 IgG(γ)(Southern Biotechnology Associates, Inc)를 염색용 완충액으로 1:250으로 희석한 용액에 재현탁하였다. 4 ℃에서 15 분간 배양 후, 세포를 염색용 완충액으로 2회 세정하여 FACSCalibur(BD 바이오사이언스사 제조)로 분석하였다. 음성 대조군에는, 등량의 인간 항 2,4-디니트로페놀(DNP) 항체를 이용하였다. 데이터 해석 소프트는 Cellquest(BD 바이오사이언스사 제조)로 행하고, 평균 형광 강도를 산출하였다.
그 결과, Ramos, T24, Hs 766T, Capan-2에서는, 341G2Ser로 염색한 경우의 평균 형광 강도가 음성 대조군과 비교하고 명확하게 높고, CD40의 발현이 확인되었다.
실시예 21 인간 종양 세포주에 대한 항 CD40 아고니스틱 항체의 효과
Ramos는 2.5×103개, T24는 2.5×102개, Hs 766T 및 CaPan-2는 5×103개를 배지에 현탁시키고, 평저(平底) 96웰 플레이트(FALCON사 제조) 중에서 전체 용량 100 μL로 341G2Ser 1 ng/ml 내지 1000 ng/ml의 농도와 함께 37 ℃, 5 ％ C02 존재하에서, Ramos 및 Hs 766T는 66 시간, Capan-2는 90 시간, T24는 114 시간 배양하였다. 10 μL(3.7 MBq/mL)의 3H 표지된 티미딘(아마샴 바이오사이언스사 제조)을 첨가하여 37 ℃, 5 ％ CO2 존재하에서 6 시간 배양하였다. Ramos는, 96 Micro cell harvester(SKATRON사 제조)를 이용하고, Printed Filtermat A(퍼킨 엘머사 제조)에 세포를 회수하여 샘플 백(퍼킨 엘머사 제조)으로 커버하고, 베타플레이트신티(퍼킨 엘머사 제조) 12 ml를 첨가하여, 액체 신틸레이션 카운터(파마시아 1205 베타플레이트: 파마시아사 제조)로 β 선량을 측정하였다. Hs 766T, T24 및 CaPan-2는, 하베스터(퍼킨 엘머사 제조)를 이용하여 단일 필터(퍼킨 엘머사 제조)에 세포를 회수하여, 뒤에 전용 시일을 붙이고, 마이크로신티 20(퍼킨 엘머사 제조)을 20 μL/well 첨가하여 신틸레이션 카운터(톱 카운트: 팩커드사 제조)로 β 선량을 측정하였다. 데이터는, 3개의 독립된 실험에서 얻어진 3중 반복 측정값의 평균을 비 처리 대조값으로 나누어 세포 생존율(％)로서 표시하였다.
그 결과, 모든 세포주에서 341G2Ser의 농도 의존적으로 세포 생존율이 저하하였다(표 1). 341G2Ser 100 ng/ml 첨가시의 세포 생존율은, Ramos에서는 58 ％, T24에 있어서는 22 ％, Hs 766T에서는 15 ％, Capan-2에 있어서는 77 ％이고, 341G2Ser이 Ramos, T24, Hs 766T 및 Capan-2의 세포 증식을 억제하는 활성을 갖는 것이 분명해졌다.
Figure 112006051903862-pct00025
실시예 22 마우스 담암 모델에 대한 항 CD40 아고니스틱 항체의 효과
(1) Ramos 세포
6주령의 암컷 Balb/c 누드 마우스(닛본 구레아(주)사로부터 구입)에 3 Gy의 방사선을 조사하고, 배부 피하에 Ramos를 2×107개/마우스 개체로 이식하였다. 이식 16일 후에, 생착한 종양의 크기를 측정하여, 종양의 크기가 50 내지 170 mm3인 담암 마우스를 5 마리 1군으로 하여 나누었다. 담암 마우스의 정맥 내에 341G2Ser 100 ㎍/마우스 개체(200 μl의 1 ％ 누드 마우스 혈청을 포함하는 PBS에 용해시킨 것)을 16 일째에 1회 투여하여, 47 일째까지 종양 크기를 측정하였다. 음성 대조군으로서 인간 항 인간 혈청 알부민(HAS) 항체를 사용하였다.
(2) T24 세포
누드 마우스 배부 피하에서 계대를 3회 반복한 T24 세포 덩어리를 적출하여, 6주령의 암컷 Balb/c 누드 마우스(닛본 구레아(주)사로부터 구입)의 배부 피하에 이식하였다. 이식하는 종양 세포 덩어리는 3 mm 사방 정도가 적당하다. 이식 10일 후에 생착한 종양의 크기를 측정하여, 종양의 크기가 80 내지 200 mm3인 담암 마우스를 5 마리 1군으로 하여 나누었다. 담암 마우스의 정맥 내에 341G2Ser 100 ㎍/마우스 개체(200 μl의 1 ％ 누드 마우스 혈청을 포함하는 PBS에 용해시킨 것)을 10 일째에 1회 투여하여, 29 일째까지 종양 크기를 측정하였다. 음성 대조군으로서, 등량의 인간 항 DNP 항체를 사용하였다.
(3) Hs 766T 세포
8주령의 암컷 Balb/c 누드 마우스(닛본 구레아(주)사로부터 구입)의 배부 피하에 Hs 766T 7×106개/마우스 개체로 이식하였다. 이식 16일 후에, 생착한 종양의 크기를 측정하여, 종양의 크기가 50 내지 140 mm3인 담암 마우스를 5 마리 1군으로 하여 나누었다. 담암 마우스의 정맥 내에 341G2Ser 100 ㎍/마우스 개체(200 μl의 1 ％ 누드 마우스 혈청을 포함하는 PBS에 용해시킨 것)을 16 일째에 1회 투여하여, 32일째까지 종양 크기를 측정하였다. 음성 대조군으로서, 등량의 인간 항 DNP 항체를 사용하였다.
(4) Capan-2 세포
6주령의 암컷 Balb/c 누드 마우스(닛본 구레아(주)사로부터 구입)의 배부 피하에 Capan-2 2×106개/마우스 개체로 이식하였다. 이식 13일 후에, 생착한 종양의 크기를 측정하여, 종양의 크기가 30 내지 130 mm3인 담암 마우스를 5 마리 1군으로 하여 나누었다. 담암 마우스의 정맥 내에 341G2Ser 10 또는 100 ㎍/마우스 개체(200 μl의 1 ％ 누드 마우스 혈청을 포함하는 PBS에 용해시킨 것)을 13일째로부터 주 2회 투여하여, 34일째까지 종양 크기를 측정하였다. 음성 대조군으로서, 인간 폴리클로날 항체(hIgG)(시그마사 제조)를 사용하였다.
종양 증식 억제율(TGIR)은 이하의 식으로 계산하였다.
100-[{(341G2Ser 투여군의 최종 측정일의 평균 종양 체적 - 341G2Ser 투여군의 항체 투여 개시일의 평균 종양 체적)/(음성 대조군 투여군의 최종 측정일의 평균 종양 체적 - 음성 대조군 투여군의 항체 투여 개시일의 평균 종양 체적)}×100]
그 결과, T24, Hs 766T 및 Capan-2 담암 마우스에서는 TGIR이 100 ％를 초과하고, 종양 체적의 퇴축(退縮)이 관찰되었다. 한편, Ramos 담암 마우스에서도 TGIR 73.4 ％이고, 종양 체적의 증대가 대폭 억제되었다(표 2). 도 23으로부터 26에 각각 Ramos 세포, T24 세포, Hs 766T 세포 및 CaPan-2 세포를 이식한 담암 마우스에 341G2Ser을 투여한 경우의 세포 이식 후의 종양 체적의 변화를 나타낸다.
Figure 112006051903862-pct00026
억제율은, 각 세포주 모두 측정 마지막 날에 있어서의 값을 나타낸다.
실시예에 나타낸 바와 같이, 불변 영역에 변이를 도입한 본 발명의 항 CD40 항체 및 서브클래스의 일부의 구조를 다른 서브클래스의 것으로 치환한 항 CD40 항체는 그의 활성을 유지하면서, ADCC 활성 및 CDC 활성이 감소되었다. 따라서, 본 발명의 항체를 치료용 항체로서 피검체에 투여한 경우, CD40 발현 세포에 대한 세포 장해 활성이 약하여 안전하게 사용할 수 있다.
본 명세서에서 인용한 모든 간행물, 특허 및 특허 출원을 그대로 참고로서 본 명세서에 포함하는 것으로 한다.
서열 목록 프리텍스트
서열 2 내지 36: 합성 DNA
서열 49 내지 130: 합성 펩티드
SEQUENCE LISTING <110> KIRIN BEER KABUSHIKI KAISHA <120> A mutant of anti CD40 antibody <130> PH-2356-PCT <140> <141> <150> JP 2003-431408 <151> 2003-12-25 <160> 142 <170> PatentIn Ver. 2.1 <210> 1 <211> 175 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 1 Glu Pro Pro Thr Ala Cys Arg Glu Lys Gln Tyr Leu Ile Asn Ser Gln 1 5 10 15 Cys Cys Ser Leu Cys Gln Pro Gly Gln Lys Leu Val Ser Asp Cys Thr 20 25 30 Glu Phe Thr Glu Thr Glu Cys Leu Pro Cys Gly Glu Ser Glu Phe Leu 35 40 45 Asp Thr Trp Asn Arg Glu Thr His Cys His Gln His Lys Tyr Cys Asp 50 55 60 Pro Asn Leu Gly Leu Arg Val Gln Gln Lys Gly Thr Ser Glu Thr Asp 65 70 75 80 Thr Ile Cys Thr Cys Glu Glu Gly Trp His Cys Thr Ser Glu Ala Cys 85 90 95 Glu Ser Cys Val Leu His Arg Ser Cys Ser Pro Gly Phe Gly Val Lys 100 105 110 Gln Ile Ala Thr Gly Val Ser Asp Thr Ile Cys Glu Pro Cys Pro Val 115 120 125 Gly Phe Phe Ser Asn Val Ser Ser Ala Phe Glu Lys Cys His Pro Trp 130 135 140 Thr Ser Cys Glu Thr Lys Asp Leu Val Val Gln Gln Ala Gly Thr Asn 145 150 155 160 Lys Thr Asp Val Val Cys Gly Pro Gln Asp Arg Leu Arg Ala Leu 165 170 175 <210> 2 <211> 39 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence:Synthetic DNA <400> 2 atatgctagc accaagggcc catcggtctt ccccctggc 39 <210> 3 <211> 38 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence:Synthetic DNA <400> 3 atatggatcc tcatttaccc ggagacaggg agaggctc 38 <210> 4 <211> 40 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence:Synthetic DNA <400> 4 atatgctagc accaagggcc catcggtctt ccccctggcg 40 <210> 5 <211> 26 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence:Synthetic DNA <400> 5 gttttctcga tggaggctgg gaggcc 26 <210> 6 <211> 38 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence:Synthetic DNA <400> 6 atatggatcc tcatttaccc ggagacaggg agaggctc 38 <210> 7 <211> 26 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence:Synthetic DNA <400> 7 ggcctcccag cctccatcga gaaaac 26 <210> 8 <211> 36 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence:Synthetic DNA <400> 8 atatggatcc tcatttaccc ggagacaggg agaggc 36 <210> 9 <211> 30 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence:Synthetic DNA <400> 9 aggggtccgg gagatcatga gagtgtcctt 30 <210> 10 <211> 30 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence:Synthetic DNA <400> 10 aaggacactc tcatgatctc ccggacccct 30 <210> 11 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence:Synthetic DNA <400> 11 tgatcatacg tagatatcac ggc 23 <210> 12 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence:Synthetic DNA <400> 12 tgatcatacg tagatatcac ggc 23 <210> 13 <211> 27 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence:Synthetic DNA <400> 13 gggtacgtcc tcacattcag tgatcag 27 <210> 14 <211> 39 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence:Synthetic DNA <400> 14 tttgcgctca actgtcttgt ccaccttggt gttgctggg 39 <210> 15 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence:Synthetic DNA <400> 15 tgatcatacg tagatatcac ggc 23 <210> 16 <211> 36 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence:Synthetic DNA <400> 16 acagttgagc gcaaatgttg tgtcgagtgc ccaccg 36 <210> 17 <211> 27 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence:Synthetic DNA <400> 17 gggtacgtcc tcacattcag tgatcag 27 <210> 18 <211> 31 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence:Synthetic DNA <400> 18 ggtgttgctg ggcttgtgat ctacgttgca g 31 <210> 19 <211> 31 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence:Synthetic DNA <400> 19 ctgcaacgta gatcacaagc ccagcaacac c 31 <210> 20 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence:Synthetic DNA <400> 20 tgatcatacg tagatatcac ggc 23 <210> 21 <211> 27 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence:Synthetic DNA <400> 21 gggtacgtcc tcacattcag tgatcag 27 <210> 22 <211> 31 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence:Synthetic DNA <400> 22 ggtgttgctg ggcttgtgat ctacgttgca g 31 <210> 23 <211> 31 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence:Synthetic DNA <400> 23 ctgcaacgta gatcacaagc ccagcaacac c 31 <210> 24 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence:Synthetic DNA <400> 24 tgatcatacg tagatatcac ggc 23 <210> 25 <211> 27 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence:Synthetic DNA <400> 25 gggtacgtcc tcacattcag tgatcag 27 <210> 26 <211> 32 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence:Synthetic DNA <400> 26 cacaacattt ggactcaact ctcttgtcca cc 32 <210> 27 <211> 32 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence:Synthetic DNA <400> 27 ggtggacaag agagttgagt ccaaatgttg tg 32 <210> 28 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence:Synthetic DNA <400> 28 tgatcatacg tagatatcac ggc 23 <210> 29 <211> 27 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence:Synthetic DNA <400> 29 gggtacgtcc tcacattcag tgatcag 27 <210> 30 <211> 34 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence:Synthetic DNA <400> 30 ggcacggtgg gcatggggga ccatatttgc gctc 34 <210> 31 <211> 34 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence:Synthetic DNA <400> 31 gagcgcaaat atggtccccc atgcccaccg tgcc 34 <210> 32 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence:Synthetic DNA <400> 32 tgatcatacg tagatatcac ggc 23 <210> 33 <211> 27 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence:Synthetic DNA <400> 33 gggtacgtcc tcacattcag tgatcag 27 <210> 34 <211> 39 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence:Synthetic DNA <400> 34 gaagactgac ggtcccccca ggaactctgg tgctgggca 39 <210> 35 <211> 39 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence:Synthetic DNA <400> 35 tgcccagcac cagagttcct ggggggaccg tcagtcttc 39 <210> 36 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence:Synthetic DNA <400> 36 tgatcatacg tagatatcac ggc 23 <210> 37 <211> 1480 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 37 gtcgacgctg aattctggct gaccagggca gccaccagag ctccagacaa tgtctgtctc 60 cttcctcatc ttcctgcccg tgctgggcct cccatggggt gtcctgtcac aggtccaact 120 gcagcagtca ggtccaggac tggtgaagcc ctcgcagacc ctctcactca cctgtgccat 180 ctccggggac agtgtctcta 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cgttgtgcac caggactggc tgaacggcaa 1080 ggagtacaag tgcaaggtct ccaacaaagg cctcccagcc cccatcgaga aaaccatctc 1140 caaaaccaaa gggcagcccc gagaaccaca ggtgtacacc ctgcccccat cccgggagga 1200 gatgaccaag aaccaggtca gcctgacctg cctggtcaaa ggcttctacc ccagcgacat 1260 cgccgtggag tgggagagca atgggcagcc ggagaacaac tacaagacca cacctcccat 1320 gctggactca gacggctcct tcttcctcta cagcaagctc accgtggaca agagcaggtg 1380 gcagcagggg aacgtcttct catgctccgt gatgcatgag gctctgcaca accactacac 1440 gcagaagagc ctctccctgt ctccgggtaa atgaggatcc 1480 <210> 38 <211> 474 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 38 Met Ser Val Ser Phe Leu Ile Phe Leu Pro Val Leu Gly Leu Pro Trp 1 5 10 15 Gly Val Leu Ser Gln Val Gln Leu Gln Gln Ser Gly Pro Gly Leu Val 20 25 30 Lys Pro Ser Gln Thr Leu Ser Leu Thr Cys Ala Ile Ser Gly Asp Ser 35 40 45 Val Ser Ser Asn Ser Ala Thr Trp Asn Trp Ile Arg Gln Ser Pro Ser 50 55 60 Arg Asp Leu Glu Trp Leu Gly Arg Thr Tyr Tyr Arg Ser Lys Trp Tyr 65 70 75 80 Arg Asp Tyr Val Gly Ser Val Lys Ser Arg Ile Ile Ile Asn Pro 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acacagtctc cagccaccct 120 gtctttgtct ccaggggaaa gagccaccct ctcctgcagg gccagtcaga gtgttagcag 180 ctacttagcc tggtaccaac agaaacctgg ccaggctccc aggctcctca tctatgatgc 240 atccaacagg gccactggca tcccagccag gttcagtggc agtgggtctg ggacagactt 300 cactctcacc atcagcagcc tagagcctga agattttgca gtttattact gtcagcagcg 360 tagcaacact ttcggccctg ggaccaaagt ggatatcaaa cgtacg 406 <210> 40 <211> 126 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 40 Met Glu Ala Pro Ala Gln Leu Leu Phe Leu Leu Leu Leu Trp Leu Pro 1 5 10 15 Asp Thr Thr Gly Glu Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Ala Thr Leu Ser 20 25 30 Leu Ser Pro Gly Glu Arg Ala Thr Leu Ser Cys Arg Ala Ser Gln Ser 35 40 45 Val Ser Ser Tyr Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ala Pro 50 55 60 Arg Leu Leu Ile Tyr Asp Ala Ser Asn Arg Ala Thr Gly Ile Pro Ala 65 70 75 80 Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser 85 90 95 Ser Leu Glu Pro Glu Asp Phe Ala Val Tyr Tyr Cys Gln Gln Arg Ser 100 105 110 Asn Thr Phe Gly Pro Gly Thr Lys Val Asp Ile Lys Arg Thr 115 120 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accatatccg tagacacgtc caagaaccag ttctccctga agctgagctc tgtgaccgcc 360 gcagacacgg ctgtgtatta ctgtacgaga cctgtagtac gatattttgg gtggttcgac 420 ccctggggcc agggaaccct ggtcaccgtc tcctcagcta gc 462 <210> 46 <211> 149 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 46 Met Asp Leu Met Cys Lys Lys Met Lys His Leu Trp Phe Phe Leu Leu 1 5 10 15 Leu Val Ala Ala Pro Arg Trp Val Leu Ser Gln Leu Gln Leu Gln Glu 20 25 30 Ser Gly Pro Gly Leu Leu Lys Pro Ser Glu Thr Leu Ser Leu Thr Cys 35 40 45 Thr Val Ser Gly Gly Ser Ile Ser Ser Pro Gly Tyr Tyr Gly Gly Trp 50 55 60 Ile Arg Gln Pro Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Ile Gly Ser Ile Tyr 65 70 75 80 Lys Ser Gly Ser Thr Tyr His Asn Pro Ser Leu Lys Ser Arg Val Thr 85 90 95 Ile Ser Val Asp Thr Ser Lys Asn Gln Phe Ser Leu Lys Leu Ser Ser 100 105 110 Val Thr Ala Ala Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Thr Arg Pro Val Val 115 120 125 Arg Tyr Phe Gly Trp Phe Asp Pro Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr 130 135 140 Val Ser Ser Ala Ser 145 <210> 47 <211> 448 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 47 agatcttaag caagtgtaac aactcagagt acgcggggag acccactcag gacacagcat 60 ggacatgagg gtccccgctc agctcctggg gcttctgctg ctctggctcc caggtgccag 120 atgtgccatc cagttgaccc agtctccatc ctccctgtct gcatctgtag gagacagagt 180 caccatcact tgccgggcaa gtcagggcat tagcagtgct ttagcctggt atcagcagaa 240 accagggaaa gctcctaagc tcctgatcta tgatgcctcc aatttggaaa gtggggtccc 300 atcaaggttc agcggcagtg gatctgggac agatttcact ctcaccatca gcagcctgca 360 gcctgaagat tttgcaactt attactgtca acagtttaat agttacccga cgttcggcca 420 agggaccaag gtggaaatca aacgtacg 448 <210> 48 <211> 130 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 48 Met Asp Met Arg Val Pro Ala Gln Leu Leu Gly Leu Leu Leu Leu Trp 1 5 10 15 Leu Pro Gly Ala Arg Cys Ala Ile Gln Leu Thr Gln Ser Pro Ser Ser 20 25 30 Leu Ser Ala Ser Val Gly Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser 35 40 45 Gln Gly Ile Ser Ser Ala Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys 50 55 60 Ala Pro Lys Leu Leu Ile Tyr Asp Ala Ser Asn Leu Glu Ser Gly Val 65 70 75 80 Pro Ser Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp 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58 Ser Leu Cys Gln Pro Gly Gln Lys Leu Val Ser Asp Cys 1 5 10 <210> 59 <211> 13 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence:Synthetic peptide <400> 59 Cys Gln Pro Gly Gln Lys Leu Val Ser Asp Cys Thr Glu 1 5 10 <210> 60 <211> 13 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence:Synthetic peptide <400> 60 Pro Gly Gln Lys Leu Val Ser Asp Cys Thr Glu Phe Thr 1 5 10 <210> 61 <211> 13 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence:Synthetic peptide <400> 61 Gln Lys Leu Val Ser Asp Cys Thr Glu Phe Thr Glu Thr 1 5 10 <210> 62 <211> 13 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence:Synthetic peptide <400> 62 Leu Val Ser Asp Cys Thr Glu Phe Thr Glu Thr Glu Cys 1 5 10 <210> 63 <211> 13 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence:Synthetic peptide <400> 63 Ser Asp Cys Thr Glu Phe Thr Glu Thr Glu Cys Leu Pro 1 5 10 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Description of Artificial Sequence:Synthetic peptide <400> 69 Pro Cys Gly Glu Ser Glu Phe Leu Asp Thr Trp Asn Arg 1 5 10 <210> 70 <211> 13 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence:Synthetic peptide <400> 70 Gly Glu Ser Glu Phe Leu Asp Thr Trp Asn Arg Glu Thr 1 5 10 <210> 71 <211> 13 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence:Synthetic peptide <400> 71 Ser Glu Phe Leu Asp Thr Trp Asn Arg Glu Thr His Cys 1 5 10 <210> 72 <211> 13 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence:Synthetic peptide <400> 72 Phe Leu Asp Thr Trp Asn Arg Glu Thr His Cys His Gln 1 5 10 <210> 73 <211> 13 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence:Synthetic peptide <400> 73 Asp Thr Trp Asn Arg Glu Thr His Cys His Gln His Lys 1 5 10 <210> 74 <211> 13 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence:Synthetic peptide <400> 74 Trp 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Description of Artificial Sequence:Synthetic peptide <400> 85 Gln Lys Gly Thr Ser Glu Thr Asp Thr Ile Cys Thr Cys 1 5 10 <210> 86 <211> 13 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence:Synthetic peptide <400> 86 Gly Thr Ser Glu Thr Asp Thr Ile Cys Thr Cys Glu Glu 1 5 10 <210> 87 <211> 13 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence:Synthetic peptide <400> 87 Ser Glu Thr Asp Thr Ile Cys Thr Cys Glu Glu Gly Trp 1 5 10 <210> 88 <211> 13 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence:Synthetic peptide <400> 88 Thr Asp Thr Ile Cys Thr Cys Glu Glu Gly Trp His Cys 1 5 10 <210> 89 <211> 13 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence:Synthetic peptide <400> 89 Thr Ile Cys Thr Cys Glu Glu Gly Trp His Cys Thr Ser 1 5 10 <210> 90 <211> 13 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence:Synthetic peptide <400> 90 Cys 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Artificial Sequence:Synthetic peptide <400> 122 Cys Glu Thr Lys Asp Leu Val Val Gln Gln Ala Gly Thr 1 5 10 <210> 123 <211> 13 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence:Synthetic peptide <400> 123 Thr Lys Asp Leu Val Val Gln Gln Ala Gly Thr Asn Lys 1 5 10 <210> 124 <211> 13 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence:Synthetic peptide <400> 124 Asp Leu Val Val Gln Gln Ala Gly Thr Asn Lys Thr Asp 1 5 10 <210> 125 <211> 13 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence:Synthetic peptide <400> 125 Val Val Gln Gln Ala Gly Thr Asn Lys Thr Asp Val Val 1 5 10 <210> 126 <211> 13 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence:Synthetic peptide <400> 126 Gln Gln Ala Gly Thr Asn Lys Thr Asp Val Val Cys Gly 1 5 10 <210> 127 <211> 13 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence:Synthetic peptide <400> 127 Ala Gly 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acccagacac atccaacaac 300 cagttctccc tgcagctgaa ctctgtgact cccgaggaca cggctatata ttactgtaca 360 agagcacagt ggctgggagg ggattacccc tactactaca gtatggacgt ctggggccaa 420 gggaccacgg tcaccgtctc ctcagctagc accaagggcc catcggtctt ccccctggcg 480 ccctgctcca ggagcacctc cgagagcaca gcggccctgg gctgcctggt caaggactac 540 ttccccgaac cggtgacggt gtcgtggaac tcaggcgctc tgaccagcgg cgtgcacacc 600 ttcccagctg tcctacagtc ctcaggactc tactccctca gcagcgtggt gaccgtgccc 660 tccagcaact tcggcaccca gacctacacc tgcaacgtag atcacaagcc cagcaacacc 720 aaggtggaca agacagttga gcgcaaatgt tgtgtcgagt gcccaccgtg cccagcacca 780 cctgtggcag gaccgtcagt cttcctcttc cccccaaaac ccaaggacac cctcatgatc 840 tcccggaccc ctgaggtcac gtgcgtggtg gtggacgtga gccacgaaga ccccgaggtc 900 cagttcaact ggtacgtgga cggcgtggag gtgcataatg ccaagacaaa gccacgggag 960 gagcagttca acagcacgtt ccgtgtggtc agcgtcctca ccgttgtgca ccaggactgg 1020 ctgaacggca aggagtacaa gtgcaaggtc tccaacaaag gcctcccagc ctccatcgag 1080 aaaaccatct ccaaaaccaa agggcagccc cgagaaccac aggtgtacac cctgccccca 1140 tcccgggagg agatgaccaa gaaccaggtc agcctgacct gcctggtcaa aggcttctac 1200 cccagcgaca tcgccgtgga gtgggagagc aatgggcagc cggagaacaa ctacaagacc 1260 acacctccca tgctggactc cgacggctcc ttcttcctct acagcaagct caccgtggac 1320 aagagcaggt ggcagcaggg gaacgtcttc tcatgctccg tgatgcatga ggctctgcac 1380 aaccactaca cgcagaagag cctctccctg tctccgggta aatga 1425 <210> 132 <211> 474 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 132 Met Ser Val Ser Phe Leu Ile Phe Leu Pro Val Leu Gly Leu Pro Trp 1 5 10 15 Gly Val Leu Ser Gln Val Gln Leu Gln Gln Ser Gly Pro Gly Leu Val 20 25 30 Lys Pro Ser Gln Thr Leu Ser Leu Thr Cys Ala Ile Ser Gly Asp Ser 35 40 45 Val Ser Ser Asn Ser Ala Thr Trp Asn Trp Ile Arg Gln Ser Pro Ser 50 55 60 Arg Asp Leu Glu Trp Leu Gly Arg Thr Tyr Tyr Arg Ser Lys Trp Tyr 65 70 75 80 Arg Asp Tyr Val Gly Ser Val Lys Ser Arg Ile Ile Ile Asn Pro Asp 85 90 95 Thr Ser Asn Asn Gln Phe Ser Leu Gln Leu Asn Ser Val Thr Pro Glu 100 105 110 Asp Thr Ala Ile Tyr Tyr Cys Thr Arg Ala Gln Trp Leu Gly Gly Asp 115 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catcccagcc 240 aggttcagtg gcagtgggtc tgggacagac ttcactctca ccatcagcag cctagagcct 300 gaagattttg cagtttatta ctgtcagcag cgtagcaaca ctttcggccc tgggaccaaa 360 gtggatatca aacgtacggt ggctgcacca tctgtcttca tcttcccgcc atctgatgag 420 cagttgaaat ctggaactgc ctctgttgtg tgcctgctga ataacttcta tcccagagag 480 gccaaagtac agtggaaggt ggataacgcc ctccaatcgg gtaactccca ggagagtgtc 540 acagagcagg acagcaagga cagcacctac agcctcagca gcaccctgac gctgagcaaa 600 gcagactacg agaaacacaa agtctacgcc tgcgaagtca cccatcaggg cctgagctcg 660 cccgtcacaa agagcttcaa caggggagag tgttga 696 <210> 134 <211> 231 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 134 Met Glu Ala Pro Ala Gln Leu Leu Phe Leu Leu Leu Leu Trp Leu Pro 1 5 10 15 Asp Thr Thr Gly Glu Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Ala Thr Leu Ser 20 25 30 Leu Ser Pro Gly Glu Arg Ala Thr Leu Ser Cys Arg Ala Ser Gln Ser 35 40 45 Val Ser Ser Tyr Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ala Pro 50 55 60 Arg Leu Leu Ile Tyr Asp Ala Ser Asn Arg Ala Thr Gly Ile Pro Ala 65 70 75 80 Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser 85 90 95 Ser Leu Glu Pro Glu Asp Phe Ala Val Tyr Tyr Cys Gln Gln Arg Ser 100 105 110 Asn Thr Phe Gly Pro Gly Thr Lys Val Asp Ile Lys Arg Thr Val Ala 115 120 125 Ala Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu Gln Leu Lys Ser 130 135 140 Gly Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe Tyr Pro Arg Glu 145 150 155 160 Ala Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln Ser Gly Asn Ser 165 170 175 Gln Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser Thr Tyr Ser Leu 180 185 190 Ser Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu Lys His Lys Val 195 200 205 Tyr Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser Ser Pro Val Thr Lys 210 215 220 Ser Phe Asn Arg Gly Glu Cys 225 230 <210> 135 <211> 1407 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 135 atggagttgg gactgagctg gattttcctt ttggctattt taaaaggtgt ccagtgtgaa 60 gtgcagctgg tggagtctgg gggaggcttg gtacagcctg gcaggtccct gagactctcc 120 tgtgcagcct ctggattcac ctttgatgat tatgccatgc actgggtccg gcaagctcca 180 gggaagggcc tggagtgggt ctcaggtatt agttggaata gtggtagctt ggtgcatgcg 240 gactctgtga agggccgatt caccatctcc agagacaacg ccaagaactc cctgtatctg 300 caaatgaaca gtctgagagc tgaggacacg gccttgtatt actgtgcaag agataggcta 360 tttcggggag ttaggtacta cggtatggac gtctggggcc aagggaccac ggtcaccgtc 420 tcctcagcta gcaccaaggg cccatcggtc ttccccctgg cgccctgctc caggagcacc 480 tccgagagca cagcggccct gggctgcctg gtcaaggact acttccccga accggtgacg 540 gtgtcgtgga actcaggcgc tctgaccagc ggcgtgcaca ccttcccagc tgtcctacag 600 tcctcaggac tctactccct cagcagcgtg gtgaccgtgc cctccagcaa cttcggcacc 660 cagacctaca cctgcaacgt agatcacaag cccagcaaca ccaaggtgga caagacagtt 720 gagcgcaaat gttgtgtcga gtgcccaccg tgcccagcac cacctgtggc aggaccgtca 780 gtcttcctct tccccccaaa acccaaggac accctcatga tctcccggac ccctgaggtc 840 acgtgcgtgg tggtggacgt gagccacgaa gaccccgagg tccagttcaa ctggtacgtg 900 gacggcgtgg aggtgcataa tgccaagaca aagccacggg aggagcagtt caacagcacg 960 ttccgtgtgg tcagcgtcct caccgttgtg caccaggact ggctgaacgg caaggagtac 1020 aagtgcaagg tctccaacaa aggcctccca gcctccatcg agaaaaccat ctccaaaacc 1080 aaagggcagc cccgagaacc acaggtgtac accctgcccc catcccggga ggagatgacc 1140 aagaaccagg tcagcctgac ctgcctggtc aaaggcttct accccagcga catcgccgtg 1200 gagtgggaga gcaatgggca gccggagaac aactacaaga ccacacctcc catgctggac 1260 tccgacggct ccttcttcct ctacagcaag ctcaccgtgg acaagagcag gtggcagcag 1320 gggaacgtct tctcatgctc cgtgatgcat gaggctctgc acaaccacta cacgcagaag 1380 agcctctccc tgtctccggg taaatga 1407 <210> 136 <211> 468 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 136 Met Glu Leu Gly Leu Ser Trp Ile Phe Leu Leu Ala Ile Leu Lys Gly 1 5 10 15 Val Gln Cys Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln 20 25 30 Pro Gly Arg Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe 35 40 45 Asp Asp Tyr Ala Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu 50 55 60 Glu Trp Val Ser Gly Ile Ser Trp Asn Ser Gly Ser Leu Val His Ala 65 70 75 80 Asp Ser Val Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn 85 90 95 Ser Leu Tyr Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Leu 100 105 110 Tyr 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Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Val His Gln Asp Trp Leu Asn 325 330 335 Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Gly Leu Pro Ala Ser 340 345 350 Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Thr Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln 355 360 365 Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Glu Glu Met Thr Lys Asn Gln Val 370 375 380 Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val 385 390 395 400 Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro 405 410 415 Pro Met Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr 420 425 430 Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val 435 440 445 Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu 450 455 460 Ser Pro Gly Lys 465 <210> 137 <211> 702 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 137 atggaagccc cagctcagct tctcttcctc ctgctactct ggctcccaga taccaccgga 60 gaaattgtgt tgacacagtc tccagccacc ctgtctttgt ctccagggga aagagccacc 120 ctctcctgca gggccagtca gagtgttagc agctacttag cctggtacca acagaaacct 180 ggccaggctc ccaggctcct catctatgat gcatccaaca gggccactgg catcccagcc 240 aggttcagtg gcagtgggtc tgggacagac ttcactctca ccatcagcag cctagagcct 300 gaagattttg cagtttatta ctgtcagcag cgtagccact ggctcacttt cggcgggggg 360 accaaggtgg agatcaaacg tacggtggct gcaccatctg tcttcatctt cccgccatct 420 gatgagcagt tgaaatctgg aactgcctct gttgtgtgcc tgctgaataa cttctatccc 480 agagaggcca aagtacagtg gaaggtggat aacgccctcc aatcgggtaa ctcccaggag 540 agtgtcacag agcaggacag caaggacagc acctacagcc tcagcagcac cctgacgctg 600 agcaaagcag actacgagaa acacaaagtc tacgcctgcg aagtcaccca tcagggcctg 660 agctcgcccg tcacaaagag cttcaacagg ggagagtgtt ga 702 <210> 138 <211> 233 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 138 Met Glu Ala Pro Ala Gln Leu Leu Phe Leu Leu Leu Leu Trp Leu Pro 1 5 10 15 Asp Thr Thr Gly Glu Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Ala Thr Leu Ser 20 25 30 Leu Ser Pro Gly Glu Arg Ala Thr Leu Ser Cys Arg Ala Ser Gln Ser 35 40 45 Val Ser Ser Tyr Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ala Pro 50 55 60 Arg Leu Leu Ile Tyr Asp Ala Ser Asn Arg Ala Thr Gly Ile Pro Ala 65 70 75 80 Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser 85 90 95 Ser Leu Glu Pro Glu Asp Phe Ala Val Tyr Tyr Cys Gln Gln Arg Ser 100 105 110 His Trp Leu Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys Arg Thr 115 120 125 Val Ala Ala Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu Gln Leu 130 135 140 Lys Ser Gly Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe Tyr Pro 145 150 155 160 Arg Glu Ala Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln Ser Gly 165 170 175 Asn Ser Gln Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser Thr Tyr 180 185 190 Ser Leu Ser Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu Lys His 195 200 205 Lys Val Tyr Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser Ser Pro Val 210 215 220 Thr Lys Ser Phe Asn Arg Gly Glu Cys 225 230 <210> 139 <211> 1425 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 139 atggatctca tgtgcaagaa aatgaagcac ctgtggttct tcctcctgct ggtggcggct 60 cccagatggg tcctgtccca gctgcagctg caggagtcgg gcccaggact actgaagcct 120 tcggagaccc tgtccctcac ctgcactgtc tctggcggct ccatcagcag tcctggttac 180 tacgggggct ggatccgcca gcccccaggg aaggggctgg agtggattgg gagtatctat 240 aaaagtggga gcacctacca caacccgtcc ctcaagagtc gagtcaccat atccgtagac 300 acgtccaaga accagttctc cctgaagctg agctctgtga ccgccgcaga cacggctgtg 360 tattactgta cgagacctgt agtacgatat tttgggtggt tcgacccctg gggccaggga 420 accctggtca ccgtctcctc agctagcacc aaggggccat ccgtcttccc cctggcgccc 480 tgctccagga gcacctccga gagcacagcc gccctgggct gcctggtcaa ggactacttc 540 cccgaaccgg tgacggtgtc gtggaactca ggcgccctga ccagcggcgt gcacaccttc 600 ccggctgtcc tacagtcctc aggactctac tccctcagca gcgtggtgac cgtgccctcc 660 agcagcttgg gcacgaagac ctacacctgc aacgtagatc acaagcccag caacaccaag 720 gtggacaaga gagttgagtc caaatatggt cccccatgcc caccatgccc agcacctgag 780 ttcgaggggg gaccatcagt cttcctgttc cccccaaaac ccaaggacac tctcatgatc 840 tcccggaccc ctgaggtcac gtgcgtggtg gtggacgtga gccaggaaga ccccgaggtc 900 cagttcaact ggtacgtgga tggcgtggag gtgcataatg ccaagacaaa gccgcgggag 960 gagcagttca acagcacgta ccgtgtggtc agcgtcctca ccgtcctgca ccaggactgg 1020 ctgaacggca aggagtacaa gtgcaaggtc tccaacaaag gcctcccgtc ctccatcgag 1080 aaaaccatct ccaaagccaa agggcagccc cgagagccac aggtgtacac cctgccccca 1140 tcccaggagg agatgaccaa gaaccaggtc agcctgacct gcctggtcaa aggcttctac 1200 cccagcgaca tcgccgtgga gtgggagagc aatgggcagc cggagaacaa ctacaagacc 1260 acgcctcccg tgctggactc cgacggctcc ttcttcctct acagcaggct aaccgtggac 1320 aagagcaggt ggcaggaggg gaatgtcttc tcatgctccg tgatgcatga ggctctgcac 1380 aaccactaca cacagaagag cctctccctg tctctgggta aatga 1425 <210> 140 <211> 474 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 140 Met Asp Leu Met Cys Lys Lys Met Lys His Leu Trp Phe Phe Leu Leu 1 5 10 15 Leu Val Ala Ala Pro Arg Trp Val Leu Ser Gln Leu Gln Leu Gln Glu 20 25 30 Ser Gly Pro Gly Leu Leu Lys Pro Ser Glu Thr Leu Ser Leu Thr Cys 35 40 45 Thr Val Ser Gly Gly Ser Ile Ser Ser Pro Gly Tyr Tyr Gly Gly Trp 50 55 60 Ile Arg Gln Pro Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Ile Gly Ser Ile Tyr 65 70 75 80 Lys Ser Gly Ser Thr Tyr His Asn Pro Ser Leu Lys Ser Arg Val Thr 85 90 95 Ile Ser Val Asp 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gtcaccatca cttgccgggc aagtcagggc attagcagtg ctttagcctg gtatcagcag 180 aaaccaggga aagctcctaa gctcctgatc tatgatgcct ccaatttgga aagtggggtc 240 ccatcaaggt tcagcggcag tggatctggg acagatttca ctctcaccat cagcagcctg 300 cagcctgaag attttgcaac ttattactgt caacagttta atagttaccc gacgttcggc 360 caagggacca aggtggaaat caaacgtacg gtggctgcac catctgtctt catcttcccg 420 ccatctgatg agcagttgaa atctggaact gcctctgttg tgtgcctgct gaataacttc 480 tatcccagag aggccaaagt acagtggaag gtggataacg ccctccaatc gggtaactcc 540 caggagagtg tcacagagca ggacagcaag gacagcacct acagcctcag cagcaccctg 600 acgctgagca aagcagacta cgagaaacac aaagtctacg cctgcgaagt cacccatcag 660 ggcctgagct cgcccgtcac aaagagcttc aacaggggag agtgttga 708 <210> 142 <211> 235 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 142 Met Asp Met Arg Val Pro Ala Gln Leu Leu Gly Leu Leu Leu Leu Trp 1 5 10 15 Leu Pro Gly Ala Arg Cys Ala Ile Gln Leu Thr Gln Ser Pro Ser Ser 20 25 30 Leu Ser Ala Ser Val Gly Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser 35 40 45 Gln Gly Ile Ser Ser Ala Leu Ala 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  6. 서열 140에 있어서의 27번째의 글루타민(Q)부터 474번째의 리신(K)까지의 아미노산 서열로 각각 표시되는 2개의 중쇄, 및 서열 142에 있어서의 23번째의 알라닌(A)부터 235번째의 시스테인(C)까지의 아미노산 서열로 각각 표시되는 2개의 경쇄로 이루어지는 항-CD40 모노클로날 항체를 유효 성분으로서 포함하는, 이식 거절, 자기 면역 질환, 또는 알레르기의 예방 또는 치료에 이용되는 의약 조성물.
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