CN109971725B - 抗体修饰的嵌合抗原受体修饰t细胞及其用途 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及表达抗体或含有抗体的编码序列或其表达载体的T细胞，所述抗体含有任选的信号肽、抗原结合序列和突变型Fc段，其中，所述突变型Fc段为：其对应于SEQ ID NO:25所示的IgG4 Fc段的第17位和第79位的位置上的氨基酸残基分别被突变为E和Q的突变型Fc段。优选地，所述T细胞为CAR‑T细胞。本发明还涉及所述T细胞在恶性肿瘤中的治疗应用。

Description

抗体修饰的嵌合抗原受体修饰T细胞及其用途
技术领域
本发明涉及抗体修饰的嵌合抗原受体修饰T细胞及其用途。
背景技术
嵌合抗原受体T细胞(chimeric antigen receptor T cell,CAR-T)治疗技术无疑是肿瘤免疫细胞治疗领域中一颗冉冉升起的巨星。CAR-T技术是通过基因工程技术将识别某抗原分子的抗体可变区基因序列与T淋巴细胞免疫受体的胞内区序列拼接后，通过逆转录病毒或慢病毒载体、转座子或转座酶系统或直接mRNA转导到淋巴细胞内，并表达融合蛋白于细胞表面，使T淋巴细胞能通过非MHC限制性的方式识别特定抗原，增强其识别和杀伤肿瘤的能力。
CAR的结构自1989年以色列Eshhar研究小组首次提出后，经过近30年的发展，已经被证实经过CAR结构修饰的T细胞在肿瘤免疫治疗中具有较好的疗效。第一代CAR受体包含了胞外特异识别肿瘤抗原的片段(single-chain variable fragment，scFv)，胞内激活信号由CD3ζ信号链来传递。但是第一代CAR受体缺乏T细胞的共刺激信号，导致T细胞只能发挥瞬间效应，在体内存在时间短、细胞因子分泌少。第二代CAR受体增加了共刺激信号分子的胞内结构域，包括如CD28，CD134/OX40，CD137/4-1BB，lymphocyte-specific proteintyrosine kinase(LCK)，inducible T-cell co-stimulator(ICOS)以及DNAX-activationprotein 10(DAP10)等结构域，增强了T细胞的增殖能力及细胞因子的分泌功能，IL-2、IFN-γ以及GM-CSF增加，从而突破肿瘤微环境的免疫抑制、延长AICD(activation inducedcell death,AICD)。第三代CAR受体则是在共刺激结构CD28和ITAM信号链的之间再融合一个二级共刺激分子如4-1BB，因而产生了一个三重信号的CAR受体，第三代CAR受体改造的T细胞具有更好的效应功能和体内存活时间。常用的经典CAR-T结构即为二代CAR受体，其结构具体可分为以下4部分：识别肿瘤抗原的抗体单链可变区(scFv)、铰链区、跨膜区、胞内刺激信号结构区域。CAR结构铰链区负责形成正确构象，形成二聚体。铰链区的长短及氨基酸序列特征，决定了CAR的空间构象，也决定了其与肿瘤细胞表面抗原结合的能力。
目前，已有多个靶标的CAR-T细胞正在开展实体瘤治疗的临床试验，包括GD2、FR-α、L1-CAM、HER2、EGFR、EGFRvIII、VEGFR-2、IL-13Rα2、FAP、Mesothelin、c-MET、PSMA、CEA、GPC3、EphA2、MUC1、CAIX(carbonic anhydrase IX)等。其中，部分临床试验取得相对良好的结果，例如，针对GD2的CAR-T细胞治疗高风险性神经母细胞瘤的临床试验(19例患者)，8例患者回输后肿瘤完全消退，3例未消退的患者在回输后第6周的观察时间点显示完全应答，1名完全应答患者192周仍能检测到CAR-T细胞；针对HER2的CAR-T细胞治疗HER2阳性实体瘤临床试验(共19例，其中骨肉瘤16例)，4例维持无疾病进展状态12周至14月，其中3例肿瘤消退，1例消退90％以上。然而总体而言，实体瘤的CAR-T治疗相对于血液肿瘤，疗效仍存在较大差距，究其原因，主要包括：
1、抑制免疫的微环境
实体瘤组织存在免疫抑制的微环境，包括Treg细胞、肿瘤相关成纤维细胞、骨髓来源未成熟DC细胞、M2型巨噬细胞等及其它们分泌的细胞因子，如IL-6、IL-10、IDO、VEGF、TGFβ等，这些细胞及其分泌的细胞因子可以通过直接或间接的方式抑制T细胞的功能。通过放化疗破坏肿瘤微环境，免疫检查点抗体(如PD1/PDL1)或免疫负调节因子(如IDO小分子抑制剂)特异阻断相关信号通路，表观遗传修饰相关酶类的抑制剂整体调整免疫微环境，过表达免疫正调节因子(如IL-12)，直接靶向清除肿瘤基质细胞(如靶向FAP阳性肿瘤相关成纤维细胞的CAR-T)等策略，均可以作用于实体瘤免疫抑制的微环境，提高浸润的CAR-T细胞的存活能力与杀伤效果。
2、缺乏合适的CAR-T治疗靶点
实体瘤具有高度的异质性，不同患者、同一患者不同病灶、同一病灶不同肿瘤细胞之间均存在高度的差异。这种高度的异质性致使肿瘤靶向治疗陷入缺乏理想的通用、广谱靶点的不利境地，限制了CAR-T细胞治疗实体瘤的疗效。因而，为扩大CAR-T细胞的杀伤范围，有学者提出TanCAR的设计理念，将两种结合不同肿瘤相关抗原的scFv串联在一起，构成一个新的能同时识别并结合两个靶点的CAR，有效提高了CAR-T细胞的疗效。
3、在体内难以达到有效数量
T细胞杀伤肿瘤细胞必需群集效应，杀伤一个肿瘤细胞需要数个T细胞的协作，因而只有效应细胞达到一定数量后，肿瘤细胞才可被有效杀伤。所以，当T细胞接触特定靶点的肿瘤细胞后，可快速增殖，并通过直接接触与旁分泌途径，放大杀伤功能。CAR-T细胞通过静脉给药，在血液肿瘤条件下，非常容易接触肿瘤细胞，CAR-T细胞的数量可快速放大，甚至过量放大形成细胞因子风暴，因而疗效相对较好；而实体瘤条件下，血液循环中肿瘤细胞数量有限，CAR-T细胞需达到肿瘤部位才能接受刺激，难以达到有效剂量。
因而，如能在CAR-T，尤其是能广谱识别肿瘤膜抗原的CAR-T细胞基础上，表达具有直接或间接刺激T细胞增殖、存活等功能的抗体，则能有效克服实体瘤CAR-T治疗的难题，大幅提高疗效。
发明内容
本发明提供一种T细胞，所述T细胞表达抗体或含有抗体的编码序列或其表达载体，所述抗体含有任选的信号肽、抗原结合序列和突变型Fc段，其特征在于，所述突变型Fc段为：其对应于SEQ ID NO:25所示的IgG4Fc段的第17位和第79位的位置上的氨基酸残基分别被突变为E和Q的突变型Fc段。
在一个或多个实施方案中，所述突变型Fc段为突变型IgG4Fc段，其氨基酸序列优选如SEQ ID NO:1第269-497位氨基酸残基所示，优选其编码序列如SEQ ID NO:2第805-1491位碱基序列所示.
在一个或多个实施方案中，所述T细胞的基因组中整合了所述抗体的表达框。
在一个或多个实施方案中，所述信号肽为轻链信号肽，优选其氨基酸序列如SEQID NO:1第1-20位氨基酸序列所示，其编码序列优选如SEQ ID NO:2第1-60位碱基序列所示。
在一个或多个实施方案中，所述抗原结合序列来自与抗原特异性结合的抗体或其抗原结合片段，如单链抗体，或来自肿瘤微环境中起作用的蛋白的配体或其与该蛋白结合的片段；优选地，所述抗体是激活性抗体或抑制性抗体。
在一个或多个实施方案中，所述激活性抗体选自针对如下抗原的抗体：CD28、CD137、CD134、CD40、CD40L、ICOS、HVEM、CD2、CD27、CD30、GITR、LIGHT、DR3、SLAM、CD226、CD80和CD86。
在一个或多个实施方案中，所述抑制性抗体选自针对以下抗原的抗体：PD-1、CTLA4、PDL1、PDL2、PDL3、TIM3、LAG3、CD47、BTLA、TIGIT、CD160、LAIR1、B7-H1、B7-1、VSIR和CD244；优选地，所述配体为CD47的配体。
在一个或多个实施方案中，所述激活性抗体是CD40单链抗体；优选地，所述CD40单链抗体的轻链可变区氨基酸序列如SEQ ID NO:1第21-146位氨基酸残基所示，和/或所述CD40单链抗体的重链可变区氨基酸序列如SEQ ID NO:1第161-268位氨基酸残基所示；优选地，所述CD40单链抗体的氨基酸序列如SEQ ID NO:1第21-268位氨基酸残基所示。
在一个或多个实施方案中，所述抑制性抗体是PD-1单链抗体；优选地，所述PD-1单链抗体的轻链可变区氨基酸序列如SEQ ID NO:3第21-131位氨基酸残基所示，和/或所述PD-1单链抗体的重链可变区氨基酸序列如SEQ ID NO:3第147-266位氨基酸残基所示；优选地，所述PD-1单链抗体的氨基酸序列如SEQ ID NO:3第21-266位氨基酸残基所示。
在一个或多个实施方案中，所述CD47配体的氨基酸序列如SEQ ID NO:5第21-138位氨基酸残基所示。
在一个或多个实施方案中，所述CD40单链抗体的轻链可变区的编码序列如SEQ IDNO:2第60-438位碱基序列所示，和/或其重链可变区的编码序列可如SEQ ID NO:2第481-804位碱基序列所示；优选地，所述CD40单链抗体的编码序列如SEQ ID NO:2第60-804位氨基酸残基所示。
在一个或多个实施方案中，所述PD-1单链抗体的轻链可变区的编码序列可如SEQID NO:4第60-393位碱基序列所示，和/或其重链可变区的编码序列如SEQ ID NO:4第439-798位碱基序列所示；优选地，所述PD-1单链抗体的的编码序列如SEQ ID NO:4第60-798位氨基酸残基所示。
在一个或多个实施方案中，所述CD47配体的编码序列可如SEQ ID NO:6第60-414位碱基序列所示。
在一个或多个实施方案中，所述抗体为CD40抗体、PD-1抗体或CD47抗体。
在一个或多个实施方案中，所述CD40抗体的氨基酸序列如SEQ ID NO:1第21-497位所示，或如SEQ ID NO:1所示，所述PD-1抗体的氨基酸序列如SEQ ID NO:3第21-495位所示，或如SEQ ID NO:3所示，所述CD47抗体的氨基酸序列如SEQ ID NO:5第21-367位所示，或如SEQ ID NO:5所示。
在一个或多个实施方案中，所述抗体的编码序列如SEQ ID NO:2第60-1491位碱基序列所示，或如SEQ ID NO:2所示；或如SEQ ID NO:4第60-1485位碱基序列所示，或如SEQID NO:4所示；或如SEQ ID NO:6第60-1104位碱基序列所示，或如SEQ ID NO:6所示。
在一个或多个实施方案中，所述T细胞是表达嵌合抗原受体的CAR-T细胞，其中，所述T细胞的基因组中整合了所述抗体的表达框和所述嵌合抗原受体的表达框。
在一个或多个实施方案中，所述嵌合抗原受体识别、靶向或特异性结合如下抗原中的一种或多种：CD19、CD20、CEA、GD2、FR、PSMA、PMEL、CA9、CD171/L1-CAM、IL-13Rα2、MART-1、ERBB2、NY-ESO-1、MAGE家族蛋白、BAGE家族蛋白、GAGE家族蛋白、AFP、MUC1、CD22、CD23、CD30、CD33、CD44v7/8、CD70、VEGFR1、VEGFR2、IL-11Rα、EGP-2、EGP-40、FBP、GD3、PSCA、FSA、PSA、HMGA2、胎儿型乙酰胆碱受体、LeY、EpCAM、MSLN、IGFR1、EGFR、EGFRvIII、ERBB3、ERBB4、CA125、CA15-3、CA19-9、CA72-4、CA242、CA50、CYFRA21-1、SCC、AFU、EBV-VCA、POA、β2-MG和PROGRP；优选是识别、靶向或特异性结合CD19、间皮素、EGFR、粘蛋白或ErbB受体家族的嵌合抗原受体。
在一个或多个实施方案中，所述嵌合抗原受体含有任选的信号肽序列、抗原识别区、铰链区、跨膜区、胞内共刺激信号域和胞内信号域；其中，所述信号肽选自CD8信号肽、CD28信号肽、CD4信号肽和轻链信号肽；所述抗原识别区为识别、靶向或与目标抗原特异性结合的氨基酸序列；所述铰链区选自CD8的胞外铰链区、IgG1 Fc CH2CH3铰链区、IgD铰链区、CD28的胞外铰链区、IgG4 Fc CH2CH3铰链区和CD4的胞外铰链区，优选是长50个氨基酸残基以上、更优选长80个氨基酸以上的铰链区；优选地，所述铰链区是CD8α铰链区或IgG4Fc CH2CH3铰链区；所述跨膜区选自CD28跨膜区、CD8跨膜区、CD3ζ跨膜区、CD134跨膜区、CD137跨膜区、ICOS跨膜区和DAP10跨膜区；优选为CD8跨膜区或CD28跨膜区；所述胞内共刺激信号域为共刺激信号分子的胞内结构域，选自CD28、CD134/OX40、CD137/4-1BB、淋巴细胞特异性蛋白酪氨酸激酶、诱导性T细胞共刺激因子和DNAX激活蛋白10的胞内结构域，优选为CD137/4-1BB的胞内结构域或CD28的胞内结构域；和/或所述胞内信号域为CD3ζ胞内信号域或FcεRIγ胞内信号域；优选为CD3ζ胞内信号域。
在一个或多个实施方案中，所述信号肽的氨基酸序列如SEQ ID NO:7第1-21位氨基酸残基所示、或如SEQ ID NO:9第1-22位氨基酸残基所示、或如SEQ ID NO:11第1-20位氨基酸残基所示；所述抗原识别区是识别、靶向或特异性结合CD19、间皮素、EGFR或粘蛋白的单链抗体，或由识别、靶向或特异性结合ErbB受体家族的氨基酸序列组成；所述铰链区的氨基酸序列如SEQ ID NO:7第264-308位氨基酸残基所示、或如SEQ IDNO:9第273-500位氨基酸残基所示、或如SEQ ID NO:17第264-318位氨基酸残基所示；所述跨膜区的氨基酸序列如SEQ ID NO:7第309-332位氨基酸残基所示、或如SEQ ID NO:9第501-528位氨基酸残基所示、或如SEQ ID NO:17第319-344位氨基酸残基所示；所述胞内共刺激信号域的氨基酸序列如SEQ ID NO:7第333-374位氨基酸残基所示，或如SEQ ID NO:9第529-569位氨基酸残基所示；和/或所述胞内信号域的氨基酸序列如SEQ ID NO:7第375-486位氨基酸残基所示。
在一个或多个实施方案中，所述信号肽的编码序列如SEQ ID NO:8第1-63位碱基序列所示、或如SEQ ID NO:10第1-66位碱基序列所示、或如SEQ ID NO:12第1-60位碱基序列所示；所述铰链区的编码序列如SEQ ID NO:8第790-924位碱基序列所示、或如SEQ IDNO:10第817-1500位碱基序列所示、或如SEQ ID NO:18第790-954位碱基序列所示；所述跨膜区的编码序列如SEQ ID NO:8第925-996位碱基序列所示、或如SEQ ID NO:10第1501-1584位碱基序列所示、或如SEQ ID NO:18第955-1032位碱基序列所示；所述胞内共刺激信号域的编码序列如SEQ ID NO:8第997-1122位碱基序列所示、或如SEQ ID NO:10第1585-1707位碱基序列所示；和/或所述胞内信号域的编码序列如SEQ ID NO:8第1123-1458位碱基所示。
在一个或多个实施方案中，所述识别、靶向或特异性结合CD19的单链抗体的轻链可变区的氨基酸序列可如SEQ ID NO:7第22-128位氨基酸残基所示，和/或其重链可变区的氨基酸序列可如SEQ ID NO:7第144-263位氨基酸残基所示；优选地，所述单链抗体的氨基酸序列如SEQ ID NO:7第22-263位氨基酸残基所示。
在一个或多个实施方案中，所述识别、靶向或特异性结合间皮素抗原的单链抗体是针对间皮素的Region I或III的单链抗体，优选为针对间皮素的Region III的单链抗体；优选地，抗间皮素Region III的单链抗体的轻链可变区的氨基酸序列如SEQ ID NO:9第23-146位氨基酸残基所示，和/或抗间皮素Region III的单链抗体的重链可变区的氨基酸序列如SEQ ID NO:9第162-272位氨基酸残基所示；优选地，所述识别、靶向或特异性结合间皮素抗原的单链抗体的氨基酸序列如SEQ ID NO:9第23-272位氨基酸残基所示。
在一个或多个实施方案中，所述识别、靶向或特异性结合ErbB受体家族的抗原识别区含有天然的T1E与Herin的融合蛋白；其中，T1E由人转录生长因子α(TGFα)N端的七个氨基酸和表皮生长因子(EGF)C端的48个氨基酸组成，优选地，T1E的氨基酸序列如SEQ ID NO:13第23-77位氨基酸残基所示；所述Herin为Herstatin第八内含子编码的79个氨基酸，优选地，所述Herin的氨基酸序列如SEQ ID NO:13第93-171位氨基酸残基所示；优选地，所述抗原识别区如SEQ ID NO:13第23-171位氨基酸残基所示。
在一个或多个实施方案中，所述识别、靶向或特异性结合粘蛋白抗原的单链抗体的轻链可变区氨基酸序列和重链可变区氨基酸序列来自针对Muc1近膜端氨基酸序列的抗体，优选地，该Muc1近膜端氨基酸序列如SEQ ID NO:24所示；优选地，所述单链抗体的轻链可变区的氨基酸序列如SEQ ID NO:15第23-133位氨基酸残基所示，和/或重链可变区的氨基酸序列如SEQ ID NO:15第149-269位氨基酸残基所示；优选地，所述单链抗体的氨基酸序列如SEQ ID NO:15第23-269位氨基酸残基所示。
在一个或多个实施方案中，所述识别、靶向或特异性结合EGFR的抗原识别区是由EGFR的特异性抗体的轻链可变区和重链可变区形成的单链抗体；优选地，所述单链抗体的轻链可变区的氨基酸序列如SEQ ID NO:17第23-129位氨基酸残基所示，和/或重链可变区的氨基酸序列如SEQ ID NO:17第145-263位氨基酸残基所示；优选地，所述单链抗体的氨基酸序列如SEQ ID NO:17第23-263位氨基酸残基所示。
在一个或多个实施方案中，所述嵌合抗原受体从N端到C端依次含有：任选的信号肽序列、抗原识别区、CD8α铰链区或IgG4CH2CH3铰链区、CD8跨膜区或CD28跨膜区、4-1BB或CD28的胞内结构域以及CD3ζ胞内信号域。
在一个或多个实施方案中，所述嵌合抗原受体选自：
(1)靶向CD19的嵌合抗原受体，其氨基酸序列如SEQ ID NO:7第22-486位氨基酸残基所示，或者如SEQ ID NO:7所示，其编码序列优选如SEQ ID NO:8第64-1458位碱基序列所示，或者如SEQ ID NO:8所示；
(2)靶向间皮素的嵌合抗原受体，其氨基酸序列如SEQ ID NO:9第23-681位氨基酸残基所示，或者如SEQ ID NO:9所示，其编码序列优选如SEQ ID NO:10第67-2043位碱基序列所示，或者如SEQ ID NO:10所示，或者其氨基酸序列如SEQ ID NO:11第21-679位氨基酸残基所示，或者如SEQ ID NO:11所示，其编码序列优选如SEQ ID NO:12第61-2037位碱基序列所示，或者如SEQ ID NO:12所示；
(3)靶向ErbB家族的抗原识别区，其氨基酸序列如SEQ ID NO:13第23-580位氨基酸残基所示，或者如SEQ ID NO:13所示，其编码序列优选如SEQ ID NO:14第67-1740位碱基序列所示，或者如SEQ ID NO:14所示；
(4)靶向粘蛋白的嵌合抗原受体，其氨基酸序列如SEQ ID NO:15第23-678位氨基酸残基所示，或者如SEQ ID NO:15所示，其编码序列优选如SEQ ID NO:16第67-2034位碱基序列所示，或者如SEQ ID NO:16所示；和
(5)靶向EGFR的嵌合抗原受体，其氨基酸序列如SEQ ID NO:17第23-497位氨基酸残基所示，或者如SEQ ID NO:17所示，其编码序列优选如SEQ ID NO:18第67-1491位碱基序列所示，或者如SEQ ID NO:18所示。
本发明还提供一种抗体，所述抗体含有任选的信号肽、抗原结合序列和突变型Fc段，其特征在于，所述突变型Fc段为：其对应于SEQ ID NO:25所示的IgG4Fc段的第17位和第79位的位置上的氨基酸残基分别被突变为E和Q的突变型Fc段。
在一个或多个实施方案中，所述突变型Fc段为突变型IgG4Fc段，其氨基酸序列优选如SEQ ID NO:1第269-497位氨基酸残基所示，优选其编码序列如SEQ ID NO:2第805-1491位碱基序列所示。
在一个或多个实施方案中，所述信号肽为轻链信号肽，优选其氨基酸序列如SEQID NO:1第1-20位氨基酸序列所示，其编码序列优选如SEQ ID NO:2第1-60位碱基序列所示。
在一个或多个实施方案中，所述抗原结合序列来自与抗原特异性结合的抗体或其抗原结合片段，如单链抗体，或来自肿瘤微环境中起作用的蛋白的配体或其与该蛋白结合的片段；优选地，所述抗体是激活性抗体或抑制性抗体；优选地，所述激活性抗体选自针对如下抗原的抗体：CD28、CD137、CD134、CD40、CD40L、ICOS、HVEM、CD2、CD27、CD30、GITR、LIGHT、DR3、SLAM、CD226、CD80和CD86；优选地，所述抑制性抗体选自针对以下抗原的抗体：PD-1、CTLA4、PDL1、PDL2、PDL3、TIM3、LAG3、CD47、BTLA、TIGIT、CD160、LAIR1、B7-H1、B7-1、VSIR和CD244；优选地，所述配体为CD47的配体。
在一个或多个实施方案中，所述激活性抗体是CD40单链抗体；优选地，所述CD40单链抗体的轻链可变区氨基酸序列如SEQ ID NO:1第21-146位氨基酸残基所示，和/或所述CD40单链抗体的重链可变区氨基酸序列如SEQ ID NO:1第161-268位氨基酸残基所示；优选地，所述CD40单链抗体的氨基酸序列如SEQ ID NO:1第21-268位氨基酸残基所示。
在一个或多个实施方案中，所述抑制性抗体是PD-1单链抗体；优选地，所述PD-1单链抗体的轻链可变区氨基酸序列如SEQ ID NO:3第21-131位氨基酸残基所示，和/或所述PD-1单链抗体的重链可变区氨基酸序列如SEQ ID NO:3第147-266位氨基酸残基所示；优选地，所述PD-1单链抗体的氨基酸序列如SEQ ID NO:3第21-266位氨基酸残基所示。
在一个或多个实施方案中，所述CD47配体的氨基酸序列如SEQ ID NO:5第21-138位氨基酸残基所示。
在一个或多个实施方案中，所述CD40单链抗体的轻链可变区的编码序列如SEQ IDNO:2第60-438位碱基序列所示，和/或其重链可变区的编码序列可如SEQ ID NO:2第481-804位碱基序列所示；优选地，所述CD40单链抗体的编码序列如SEQ ID NO:2第60-804位氨基酸残基所示。
在一个或多个实施方案中，所述PD-1单链抗体的轻链可变区的编码序列可如SEQID NO:4第60-393位碱基序列所示，和/或其重链可变区的编码序列如SEQ ID NO:4第439-798位碱基序列所示；优选地，所述PD-1单链抗体的的编码序列如SEQ ID NO:4第60-798位氨基酸残基所示。
在一个或多个实施方案中，所述CD47配体的编码序列可如SEQ ID NO:6第60-414位碱基序列所示。
在一个或多个实施方案中，所述抗体为CD40抗体、PD-1抗体或CD47抗体。
在一个或多个实施方案中，所述CD40抗体的氨基酸序列如SEQ ID NO:1第21-497位所示，或如SEQ ID NO:1所示，所述PD-1抗体的氨基酸序列如SEQ ID NO:3第21-495位所示，或如SEQ ID NO:3所示，所述CD47抗体的氨基酸序列如SEQ ID NO:5第21-367位所示，或如SEQ ID NO:5所示。
在一个或多个实施方案中，所述抗体的编码序列如SEQ ID NO:2第60-1491位碱基序列所示，或如SEQ ID NO:2所示；或如SEQ ID NO:4第60-1485位碱基序列所示，或如SEQID NO:4所示；或如SEQ ID NO:6第60-1104位碱基序列所示，或如SEQ ID NO:6所示。
本发明还提供一种核酸序列，选自本文所述的抗体的编码序列或其互补序列。
本发明还提供一种核酸构建物，其含有本文所述的核酸序列；优选地，所述核酸构建物为表达框或载体。
在一个或多个实施方案中，所述核酸构建物为表达载体或用于在宿主细胞基因组中插入所述表达框的整合载体。
在一个或多个实施方案中，所述整合载体是在5’LTR与3’LTR之间含有可操作性连接的启动子、本文所述的抗体的编码序列以及PolyA加尾信号序列、且不含有转座酶编码序列的整合载体。
本发明还提供一种组合物，所述组合物含有本文所述的载体和任选的转染试剂；优选地，所述组合物含有本文所述的整合载体和用于将嵌合抗原受体的表达框插入宿主细胞基因组中的整合载体；优选地，所述嵌合抗原受体如本文任一实施方案所限定。
在一个或多个实施方案中，组合物中所述用于将嵌合抗原受体的表达框插入宿主细胞基因组中的整合载体与用于将本文所述抗体的表达框插入宿主细胞基因组中的整合载体的质量比为1～7：1～7，如1～5：1～5，优选1～3：1～3，更优选1～2：1～2，更优选1～2：1。
本发明还提供一种试剂盒，所述试剂盒含有本文所述的载体和任选的转染试剂；优选地，所述试剂盒含有用于将本文所述抗体的表达框插入宿主细胞基因组中的整合载体和用于将嵌合抗原受体的表达框插入宿主细胞基因组中的整合载体；优选地，所述嵌合抗原受体如本文任一实施方案所限定；
在一个或多个实施方案中，所述试剂盒含有本文所述的组合物。
本发明还提供一种药物组合物，所述药物组合物含有本文所述的T细胞或所述T细胞及其表达的本文所述的抗体。
本发明还提供一种宿主细胞，其含有本文所述的核酸序列或核酸构建物。
本发明还提供本文所述的T细胞、抗体、核酸序列、核酸构建物以及宿主细胞在制备治疗或预防恶性肿瘤用的药物中的应用。
在一个或多个实施方案中，所述恶性肿瘤选自：急性B淋巴细胞白血病、慢性B淋巴细胞白血病、套细胞淋巴瘤、非霍奇金淋巴瘤和多发性骨髓瘤；或者为癌细胞表面异常表达间皮素、至少一个EGFR家族成员蛋白、Muc1抗原、EGFR和/或CD47的恶性肿瘤；或者是受CD40或PD1介导的恶性肿瘤。
本发明还提供一种制备T细胞的方法，所述方法包括使用以下载体转染所述T细胞的步骤：
(1)用于将所述嵌合抗原受体的表达框转入所述T细胞的基因组、且含转座酶编码序列的载体，和
(2)用于将所述抗体的表达框整合入所述T细胞的基因组、且不含转座酶编码序列的载体；
优选地，以质量计，(1)和(2)所述载体的比例为1～7：1～7，如1～5：1～5，优选1～3：1～3，更优选1～2：1～2，更优选1～2：1。
附图说明
图1：CD19CAR-分泌量比较在CD19抗原刺激下IL-2，IL-4，IL-6，IL-10，TNF-α和IFN-γ细胞因子分泌的变化。
图2：CD19CAR T细胞与CD19CAR-αCD40 T细胞的增殖检测。
图3：CD19CAR T细胞、CD19CAR-αCD40-wt T，CD19CAR-αCD40 T细胞对小鼠Raji-luc移植瘤模型的治疗效果。
图4：mesoCAR-αCD40 T细胞对宫颈癌细胞Hela、卵巢癌细胞SK-OV-3和胃癌细胞HGC-27的杀伤。
图5：mesoCAR-αCD40在间皮素抗原刺激下IL-2，IL-4，IL-6,IL-10，TNF-α和IFN-γ细胞因子分泌的变化。
图6：mesoCAR T细胞与mesoCAR-αCD40 T细胞的增殖检测。
图7：mesoCAR T细胞与mesoCAR-αCD40 T细胞对SK-OV-3卵巢癌小鼠移植瘤模型的治疗效果。
图8：EHCAR-EK-28TIZ和EHCAR-EK-28TIZ-αCD40 T细胞的增殖速度对比。
图9A-9D：EHCAR-EK-28TIZ和EHCAR-EK-28TIZ-αCD40 T细胞的T细胞的细胞表型测定分析，9A表示衰老表型CD40，9B和9C分别表示活化表型CD69和CD107α，9D表示记忆表型。
图10：EHCAR-EK-28TIZ和EHCAR-EK-28TIZ-αCD40 T细胞的杀伤对比，包括人肝癌细胞HCCLM3、人肺退行性癌细胞Calu-6和人非小细胞肺癌H23。
图11：EHCAR-EK-28TIZ和EHCAR-EK-28TIZ-αCD40 T细胞在EGFR抗原刺激下IL-2，IL-4，IL-6,IL-10，TNF-α和IFN-γ细胞因子分泌的变化。
图12：EHCAR-EK-28TIZ T细胞、EHCAR-EK-28TIZ-αCD40-wt T细胞、EHCAR-EK-28TIZ-αCD40 T细胞、Mock-T细胞和PBS空白对照，分别治疗小鼠后，不同天数的肿瘤细胞荧光值变化。
图13：Muc1CAR T细胞和Muc1CAR-αCD40 T细胞的增殖速度对比。
图14A-14B：Muc1CAR T细胞和Muc1CAR-αCD40 T细胞的细胞表型测定分析，图14A表示衰老表型PD1、LAG3和活化表型CD25，图14B表示记忆表型。
图15：Muc1CAR T细胞和Muc1CAR-αCD40 T细胞的杀伤对比，包括人肝癌细胞HCCLM3和人非小细胞肺癌H23。
图16：Muc1CAR T细胞和Muc1CAR-αCD40 T细胞在Muc1抗原刺激下IL-2，IL-4，IL-6，IL-10，TNF-α和IFN-γ细胞因子分泌的变化。
图17：Muc1CAR T细胞、Muc1CAR-αCD40-wt T细胞、Muc1CAR-αCD40 T细胞、Mock-T细胞和PBS空白对照，分别治疗小鼠后，不同天数的肿瘤细胞荧光值变化。
图18：CD19CAR-anti PD1多能T细胞的杀伤作用检测。
图19：CD19CAR-anti PD1多能T细胞在体外可以增强T细胞的杀伤活性。
图20：CD19CAR-anti PD1 T细胞的体内杀伤功能检测。
图21：mesoCAR-antiPD1 T细胞对宫颈癌细胞Hela、卵巢癌细胞SK-OV-3和胃癌细胞HGC-27的杀伤。
图22：mesoCAR-antiPD1在间皮素抗原刺激下IL-2，IL-4，IL-6，IL-10，TNF-α和IFN-γ细胞因子分泌的变化。
图23：meso3CAR T细胞与mesoCAR-antiPD1 T细胞对SK-OV-3卵巢癌小鼠移植瘤模型的治疗效果。
图24：EHCAR-EK-28TIZ和EHCAR-EK-28TIZ-antiPD1 T细胞的增殖速度对比。
图25A-25D：EHCAR-EK-28TIZ和EHCAR-EK-28TIZ-antiPD1 T细胞的T细胞的细胞表型测定分析，25A表示衰老表型PD1，25B和25C分别表示活化表型CD69和CD107α，25D表示记忆表型。
图26：EHCAR-EK-28TIZ和EHCAR-EK-28TIZ-antiPD1 T细胞的杀伤对比，包括人肝癌细胞HCCLM3、人肝癌细胞Hep3B和人非小细胞肺癌H23。
图27：EHCAR-EK-28TIZ和EHCAR-EK-28TIZ-antiPD1 T细胞在EGFR抗原刺激下IL-2，IL-4，IL-6,IL-10，TNF-α和IFN-γ细胞因子分泌的变化。
图28：EHCAR-EK-28TIZ T细胞、EHCAR-EK-28TIZ-antiPD1-wt T细胞、EHCAR-EK-28TIZ-antiPD1 T细胞、Mock-T细胞和PBS空白对照，分别治疗小鼠后，不同天数的肿瘤细胞荧光值变化。
图29A-29D：Muc1CAR-anti PD1多能T细胞在体外可以增强T细胞的杀伤活性。29A：流式检测间接反映T细胞杀伤活性的标记CD107α，活化标记CD25和耗竭标记LAG3，29B：流式检测反映T细胞记忆的表型的标记蛋白CD45RO、CD62L和CCR7。29C：流式检测T细胞CD3/CD4/CD8的比例。29D：通过多因子检测试剂盒检测Muc1CAR-anti PD1多能T细胞，Muc1CAR-T细胞和Mock T细胞受Muc1抗原刺激后IL-2，IL-4，IL-6，IL-10，TNF-α和IFN-γ细胞因子的变化。
图30：Muc1CAR-anti PD1多能T细胞的杀伤作用检测。
图31：表达PD-1抗体的Muc1CAR T细胞的体内功能研究。
图32：流式检测Mock T细胞、EGFR-CAR T细胞以及αCD47-EGFR-CAR T细胞的CD47表达。
图33：αCD47-EGFR-CAR T细胞对不同肿瘤细胞的杀伤。
图34：αCD47-EGFR-CAR T细胞上清与不同肿瘤细胞共培养后封闭肿瘤细胞表面的CD47。
图35：封闭肿瘤细胞表面CD47可以提升巨噬细胞对其吞噬作用。
图36：αCD47-EGFR-CAR T细胞小鼠体内抗肿瘤效果。
图37：流式检测Mock、Meso3CAR以及αCD47-Meso3CAR T细胞的CD47表达。
图38：αCD47-Meso3CAR T细胞对肿瘤细胞株的杀伤。
图39：αCD47-Meso3CAR T细胞上清与肿瘤细胞共培养后封闭肿瘤细胞表面的CD47。
图40：封闭肿瘤细胞表面CD47可以提升巨噬细胞对其吞噬作用。
图41：αCD47-Meso3CAR T细胞的体内抗肿瘤效果。
另外，图中的纵坐标“count”为“细胞数”。
具体实施方式
应理解，在本发明范围中，本发明的上述各技术特征和在下文(如实施例)中具体描述的各技术特征之间都可以互相组合，从而构成优选的技术方案。
下面对本发明涉及的部分术语进行解释。
在本发明中，术语“表达框”是指表达一个基因所需的完整元件，包括可操作性连接的启动子和基因编码序列。
术语“编码序列”在文中定义为核酸序列中直接确定其蛋白产物(例如CAR，单链抗体，铰链区和跨膜区)的氨基酸序列的部分。编码序列的边界通常是由紧邻mRNA 5’端开放读码框上游的核糖体结合位点(对于原核细胞)和紧邻mRNA 3’端开放读码框下游的转录终止序列确定。编码序列可以包括，但不限于DNA、cDNA和重组核酸序列。
术语“Fc”即抗体的可结晶段(fragment crystallizable,Fc)，是指位于抗体分子"Y"结构的柄部末端，包含抗体重链恒定区CH2和CH3结构域的肽段，是抗体与效应分子或者细胞相互作用的部位。
术语“共刺激分子”是指存在于抗原提呈细胞表面，能与Th细胞上的共刺激分子受体结合，产生协同刺激信号的分子。淋巴细胞的增殖不仅需要抗原的结合，还需要接受共刺激分子的信号。共刺激信号传递给T细胞主要是通过表达在抗原呈递细胞表面的共刺激分子CD80，CD86与T细胞表面的CD28分子结合。B细胞接受共刺激信号可以通过一般的病原体成分例如LPS，或者通过补体成分，或者通过激活了的抗原特异性的Th细胞表面的CD40L。
术语“接头”或铰链是连接不同蛋白或多肽之间的多肽片段，其目的是使所连接的蛋白或多肽保持各自的空间构象，以维持蛋白或多肽的功能或活性。示例性的接头包括含有G和/或S的接头，以及例如Furin 2A肽。
术语“特异性结合”是指抗体或者抗原结合片段与其所针对的抗原之间的反应。在某些实施方式中，特异性结合某抗原的抗体(或对某抗原具有特异性的抗体)是指，抗体以小于大约10-5M，例如小于大约10-6M、10-7M、10-8M、10-9M或10-10M或更小的亲和力(KD)结合该抗原。“特异性识别”或“靶向”具有类似的含义。
术语“药学上可接受的辅料”是指在药理学和/或生理学上与受试者和活性成分相容的载体和/或赋形剂，其是本领域公知的(参见例如Remington's PharmaceuticalSciences.Edited by Gennaro AR,19th ed.Pennsylvania:Mack Publishing Company,1995)，并且包括但不限于：pH调节剂，表面活性剂，佐剂，离子强度增强剂。例如，pH调节剂包括但不限于磷酸盐缓冲液；表面活性剂包括但不限于阳离子，阴离子或者非离子型表面活性剂，例如Tween-80；离子强度增强剂包括但不限于氯化钠。
术语“有效量”是指可在受试者中实现治疗、预防、减轻和/或缓解本发明所述疾病或病症的剂量。
术语“疾病和/或病症”是指所述受试者的一种身体状态，该身体状态与本发明所述疾病和/或病症有关。
术语“受试者”或者“患者”可以指患者或者其它接受本发明药物组合物以治疗、预防、减轻和/或缓解本发明所述疾病或病症的动物，特别是哺乳动物，例如人、狗、猴、牛、马等。
术语“嵌合抗原受体”(CAR)是人工改造受体，能够将识别肿瘤细胞表面抗原的特异性分子(如抗体)锚定在免疫细胞(如T细胞)上，使免疫细胞识别肿瘤抗原或病毒抗原和杀死肿瘤细胞或病毒感染的细胞。CAR通常依次包含任选的信号肽、结合肿瘤细胞膜抗原的多肽如单链抗体、铰链区、跨膜区和胞内信号区。通常，结合肿瘤细胞膜抗原的多肽能够以中等亲和力结合肿瘤细胞广泛表达的膜抗原。结合肿瘤细胞膜抗原的多肽可以是天然多肽或人工合成多肽；优选地，人工合成多肽为单链抗体或Fab片段。
术语“单链抗体”(scFv)是指由抗体轻链可变区(VL区)氨基酸序列和重链可变区(VH区)氨基酸序列经铰链连接而成，具有结合抗原能力的抗体片段。在某些实施方案中，感兴趣单链抗体(scFv)来自感兴趣的抗体。感兴趣的抗体可以是人抗体，包括人鼠嵌合抗体和人源化抗体。抗体可以是分泌型或膜锚定型；优选为膜锚定型。
术语“可操作性连接的”或“可操作性连接”指DNA调节序列(如增强子、启动子等)以允许感兴趣蛋白的编码序列表达的方式与该编码序列连接。
1、突变型Fc段
有研究表明PD-1抑制性抗体和CD40激活性抗体等的IgG4Fc段容易被单核/巨噬细胞识别而被吞噬，本发明对该IgG4Fc段进行碱基突变改造，使得T细胞自身表达的抗体既可以很好的发挥功能又不引起ADCC反应。
具体而言，本发明示例性的IgG4Fc段具有SEQ ID NO:1第269-497位氨基酸残基所示的序列，其中，与野生型的IgG4Fc段(SEQ ID NO:25)相比，本发明的IgG4Fc段在第17位发生了L到E的突变，在第79位发生了N到Q的突变。
本发明也包括来自其它抗体或免疫球蛋白类型的在对应于IgG4Fc(SEQ ID NO:25)第17位的位置上的氨基酸残基突变为E和在第79位的位置上的氨基酸残基突变为Q的Fc段。所述的抗体或免疫球蛋白(Ig)类型包括但不限于本领域周知的IgM、IgD、IgG、IgA和IgE，其中，所述IgG包括IgG1、IgG2、IgG3和IgG4；IgA包括IgA1和lgA2。因此，在某些实施方案中，本发明使用突变型抗体Fc段，该Fc段与SEQ ID NO:25所示的IgG4Fc段的第17位相对应的位置上的氨基酸残基为E、与第79位相对应的位置上的氨基酸残基为Q。在某些实施方案中，本发明使用膜锚定型Ig的突变Fc段。
在某些实施方案中，本发明使用SEQ ID NO:1第269-497位氨基酸残基所示的Fc段，其示例性的编码序列可如SEQ ID NO:2第805-1491位碱基序列所示。
2、抗原结合序列
本文中，术语“抗原结合序列”包括可与抗原特异性结合的抗体或其抗原结合片段，如单链抗体，也包括肿瘤微环境中起作用的蛋白的配体或其与该蛋白结合的片段。
适用于本发明的CAR-T细胞表达的抗体可以是各种在肿瘤治疗中使用到的抗体，包括激活性抗体和抑制性抗体。
可用于本发明的激活性抗体可以是本领域周知的各种激活性抗体，包括但不限于针对如下抗原的抗体：CD28、CD137、CD134、CD40、CD40L、ICOS、HVEM、CD2、CD27、CD30、GITR、LIGHT、DR3、SLAM、CD226、CD80和CD86。在某些实施方案中，用于本发明的激活性抗体是CD40的抗体。优选地，所述CD40抗体是单链抗体。示例性的CD40单链抗体的轻链可变区(VL区)氨基酸序列可如SEQ ID NO:1第21-146位氨基酸残基所示，其示例性的编码序列可如SEQ IDNO:2第60-438位碱基序列所示；示例性的CD40单链抗体的重链可变区(VH区)氨基酸序列可如SEQ ID NO:1第161-268位氨基酸残基所示，其示例性的编码序列可如SEQ ID NO:2第481-804位碱基序列所示。所述轻链可变区与重链可变区可由含GS的铰链区连接，示例性的铰链区序列可如SEQ ID NO:1第147-160位氨基酸残基所示。在某些实施方案中，适用于本发明的CD40单链抗体的氨基酸序列如SEQ ID NO:1第21-268位氨基酸残基所示，其示例性的编码序列可如SEQ IDNO:2第60-804位氨基酸残基所示。
可用于本发明的抑制性抗体包括但不限于本领域周知的免疫检查点抑制性抗体，如针对以下抗原的抗体：PD-1、CTLA4、PDL1、PDL2、PDL3、TIM3、LAG3、CD47、BTLA、TIGIT、CD160、LAIR1、B7-H1、B7-1、VSIR和CD244。在某些实施方案中，用于本发明的抑制性抗体是PD-1或CD47的抗体。在某些实施方案中，所述PD-1抗体是单链抗体。示例性的PD-1单链抗体的轻链可变区(VL区)氨基酸序列可如SEQ ID NO:3第21-131位氨基酸残基所示，其示例性的编码序列可如SEQ ID NO:4第60-393位碱基序列所示；示例性的PD-1单链抗体的重链可变区(VH区)氨基酸序列可如SEQ ID NO:3第147-266位氨基酸残基所示，其示例性的编码序列可如SEQ ID NO:4第439-798位碱基序列所示。所述轻链可变区与重链可变区可由含GS的铰链区连接，示例性的铰链区序列可如SEQ ID NO:3第132-146位氨基酸残基所示。在某些实施方案中，适用于本发明的PD-1单链抗体的氨基酸序列如SEQ ID NO:3第21-266位氨基酸残基所示，其示例性的编码序列可如SEQ ID NO:4第60-798位氨基酸残基所示。
在某些实施方案中，本文所用的抗原结合序列为与肿瘤微环境中起作用(例如与肿瘤细胞的生长和迁移、吞噬逃避等相关)的蛋白的配体，尤其是表达在癌细胞表面的蛋白如CD47的配体。在某些实施方案中，所述CD47配体的氨基酸序列如SEQ ID NO:5第21-138位氨基酸残基所示，其示例性的编码序列可如SEQ ID NO:6第60-414位碱基序列所示。
3、CAR-T细胞所表达的抗体
本发明中，由CAR-T细胞表达的抗体通常含有本文所述的抗原结合序列和所述突变型Fc段。两者可直接相连，或者可通过合适的接头相连相连。
在某些实施方案中，本发明的抗体含有任选的信号肽、激活性抗体或抑制性抗体以及本文所述的突变型Fc段。例如，本发明的抗体可含有任选的信号肽，选自针对以下抗原的抗体以及本文所述的突变型Fc段：CD28、CD137、CD134、CD40、CD40L、ICOS、HVEM、CD2、CD27、CD30、GITR、LIGHT、DR3、SLAM、CD226、CD80和CD86。或者，本发明的抗体可含有任选的信号肽、选自针对以下抗原的抗体以及本文所述的突变型Fc段：PD-1、CTLA4、PDL1、PDL2、PDL3、TIM3、LAG3、CD47、BTLA、TIGIT、CD160、LAIR1、B7-H1、B7-1、VSIR和CD244。优选地，所述抗原结合序列是由针对所述抗原的抗体的轻链可变区与重链可变区形成的单链抗体，或者是在癌细胞表面上表达的蛋白的配体。
在某些实施方案中，所述抗体还包括信号肽序列。信号肽是引导新合成的蛋白质向分泌通路转移的短肽链(长度5-30个氨基酸)，常指新合成多肽链中用于指导蛋白质的跨膜转移(定位)的N-末端的氨基酸序列(有时不一定在N端)，它负责把蛋白质引导到细胞含不同膜结构的亚细胞器内。信号肽可以是分泌型信号肽或膜结合型信号肽。
任何合适的信号肽序列均可用于本发明。在某些实施方案中，信号肽可以是CD8信号肽、CD28信号肽、CD4信号肽或轻链信号肽。在某些实施方案中，本发明抗体中的信号肽为轻链信号肽，其示例性的氨基酸序列可如SEQ ID NO:1第1-20位氨基酸残基所示，示例性的编码序列可如SEQ ID NO:2第1-60位碱基序列所示。在某些实施方案中，本发明抗体中的信号肽是CD8信号肽，其示例性的氨基酸序列可如SEQ ID NO:7第1-21位氨基酸残基所示，其示例性的编码序列可如SEQ ID NO:8第1-63位碱基序列所示；或者如SEQ ID NO:9第1-22位氨基酸残基所示，其示例性的编码序列可如SEQ ID NO:10第1-66位碱基序列所示。
在某些实施方案中，本发明的抗体是CD40抗体，其含有任选的信号肽、CD40单链抗体与本文所述的突变型Fc段；优选地，所述信号肽为轻链信号肽；优选地，所述CD40单链抗体的氨基酸序列如SEQ ID NO:1第21-146位氨基酸残基所示，其示例性的编码序列可如SEQID NO:2第60-438位碱基序列所示；优选地，所述CD40单链抗体的重链可变区(VH区)氨基酸序列如SEQ ID NO:1第161-268位氨基酸残基所示，其示例性的编码序列可如SEQ ID NO:2第481-804位碱基序列所示。在某些实施方案中，所述CD40单链抗体的氨基酸序列如SEQ IDNO:1第21-268位氨基酸残基所示，其示例性的编码序列可如SEQ ID NO:2第60-804位氨基酸残基所示。在某些实施方案中，所述突变型Fc段的氨基酸序列如SEQ ID NO:1第269-497位氨基酸残基所示，其示例性的编码序列如SEQ ID NO:2第805-1491位碱基序列所示。在某些实施方案中，本发明的CD40抗体的氨基酸序列如SEQ ID NO:1第21-497位所示，或如SEQID NO:1所示，其示例性的编码序列如SEQ ID NO:2第60-1491位碱基序列所示，或如SEQ IDNO:2所示。
在某些实施方案中，本发明的抗体是PD-1抗体，其含有任选的信号肽、PD-1单链抗体与本文所述的突变型Fc段；优选地，所述信号肽为轻链信号肽；优选地，所述PD-1单链抗体的氨基酸序列如SEQ ID NO:3第21-131位氨基酸残基所示，其示例性的编码序列可如SEQID NO:4第60-393位碱基序列所示；优选地，所述PD-1单链抗体的重链可变区(VH区)氨基酸序列如SEQ ID NO:3第147-266位氨基酸残基所示，其示例性的编码序列如SEQ ID NO:4第439-798位碱基序列所示。在某些实施方案中，所述PD-1单链抗体的氨基酸序列如SEQ IDNO:3第21-266位氨基酸残基所示，其示例性的编码序列如SEQ ID NO:4第60-798位氨基酸残基所示。在某些实施方案中，所述突变型Fc段的氨基酸序列如SEQ ID NO:3第267-495位氨基酸残基所示，其示例性的编码序列如SEQ ID NO:2第799-1485位碱基序列所示。在某些实施方案中，本发明的PD-1抗体的氨基酸序列如SEQ ID NO:3第21-495位所示，或如SEQ IDNO:3所示，其示例性的编码序列如SEQ ID NO:4第60-1485位碱基序列所示，或如SEQ IDNO:4所示。
在某些实施方案中，本发明的抗体是CD47抗体，其含有任选的信号肽、CD47的配体序列以及本文所述的突变型Fc段；优选地，信号肽为轻链信号肽；优选地，所述配体的氨基酸序列如氨基酸序列如SEQ ID NO:5第21-138位氨基酸残基所示，其示例性的编码序列如SEQ ID NO:6第60-414位碱基序列所示。在某些实施方案中，所述突变型Fc段的氨基酸序列如SEQ ID NO:5第139-367位氨基酸残基所示，其示例性的编码序列如SEQ ID NO:6第415-1101位碱基序列所示。在某些实施方案中，本发明的CD47抗体的氨基酸序列如SEQ ID NO:5第21-367位所示，或如SEQ ID NO:5所示，其示例性的编码序列如SEQ ID NO:6第60-1104位碱基序列所示，或如SEQ ID NO:6所示。
4、嵌合抗原受体(CAR)
本发明涉及任何可在T细胞中表达的嵌合抗原受体，包括但不限于针对、靶向或特异性结合如下抗原中的一种或多种的嵌合抗原受体：CD19、CD20、CEA、GD2(又称B4GALNT1，β1,4-乙酰基-氨基半乳糖基转移酶1)、FR(Flavin还原酶)、PSMA(前列腺特异性膜抗原)、PMEL(前黑素小体蛋白)、CA9(碳酸酐酶IX)、CD171/L1-CAM、IL-13Rα2、MART-1(又称粘蛋白-A)、ERBB2、NY-ESO-1(又称CTAG1B，癌/睾丸抗原1B)、MAGE(黑素瘤相关抗原E1)家族蛋白、BAGE(B黑素瘤抗原家族)家族蛋白、GAGE(生长激素释放因子)家族蛋白、AFP(α-胎蛋白)、MUC1(mucin 1，细胞表面相关)、CD22、CD23、CD30、CD33、CD44v7/8、CD70、VEGFR1、VEGFR2、IL-11Rα、EGP-2、EGP-40、FBP、GD3(又称ST8SIA1，ST8α-N-乙酰基-神经酰胺α-2,8-唾液酸转换酶1)、PSCA(前列腺干细胞抗原)、FSA(又称KIAA1109)、PSA(又称KLK3，激肽释放酶相关的肽酶3)、HMGA2、胎儿型乙酰胆碱受体、LeY(又称FUT3)、EpCAM、MSLN(间皮素)、IGFR1、EGFR、EGFRvIII、ERBB3、ERBB4、CA125(又称MUC16，mucin 16，细胞表面相关)、CA15-3、CA19-9、CA72-4、CA242、CA50、CYFRA21-1、SCC(又称SERPINB3)、AFU(又称FUCA1)、EBV-VCA、POA(又称VDR，维生素D(1,25-二氢维生素D3)受体)、β2-MG(β-2-微球蛋白)和PROGRP(GRP胃泌素释放肽)。
本发明的嵌合抗原受体通常含有任选的信号肽序列、抗原识别区、铰链区、跨膜区、胞内共刺激信号域和胞内信号域。
适用于本发明的嵌合抗原受体中的信号肽可如前文所述，可以是分泌型信号肽或膜结合型信号肽，包括但不限于CD8信号肽、CD28信号肽、CD4信号肽和轻链信号肽。在某些实施方案中，本发明嵌合抗原受体中的信号肽为轻链信号肽，其示例性的氨基酸序列可如SEQ ID NO:11第1-20位氨基酸残基所示，示例性的编码序列可如SEQ ID NO:12第1-60位碱基序列所示。在某些实施方案中，本发明抗体中的信号肽是CD8信号肽，其示例性的氨基酸序列可如SEQ ID NO:7第1-21位氨基酸残基所示，其示例性的编码序列可如SEQ ID NO:8第1-63位碱基序列所示；或者如SEQ ID NO:9第1-22位氨基酸残基所示，其示例性的编码序列可如SEQ ID NO:10第1-66位碱基序列所示。
抗原识别区可以是单链抗体(scFv)。单链抗体可以是本领域常用的识别目标抗原的scFv，包括但不限于由识别、靶向或特异性结合前文所述抗原中的一种或多种的抗体的轻链可变区和重链可变区形成的scFv。在某些实施方案中，本发明的识别目标抗原的氨基酸序列是识别、靶向或特异性结合CD19、间皮素、EGFR或粘蛋白的单链抗体。在某些实施方案中，本发明的抗原识别区由靶向ErbB受体家族的氨基酸序列组成。
例如，示例性的识别CD19的单链抗体的轻链可变区的氨基酸序列可如SEQ ID NO:7第22-128位氨基酸残基所示，其示例性的编码序列可如SEQ ID NO:8第64-384位碱基序列所示。示例性的识别CD19的单链抗体的重链可变区的氨基酸序列可如SEQ ID NO:7第144-263位氨基酸残基所示，其示例性的编码序列可如SEQ ID NO:8第430-789位碱基序列所示。在某些实施方案中，示例性的识别CD19的单链抗体的氨基酸序列如SEQ ID NO:7第22-263位氨基酸残基所示，其示例性的编码序列如SEQ ID NO:8第64-789位碱基所示。
示例性的识别间皮素抗原的scFv可以是本领域周知的针对间皮素抗原的单链抗体。优选的是，该单链抗体的轻链可变区氨基酸序列和重链可变区氨基酸序列来自针对间皮素近膜端氨基酸序列的抗体。优选地，本文所述的抗间皮素单链抗体是针对间皮素的Region I或III的单链抗体。优选的是，该单链抗体的轻链可变区氨基酸序列和重链可变区氨基酸序列来自针对间皮素Region I或III的氨基酸序列的抗体。在某些实施方案中，间皮素Region I的氨基酸序列如SEQ ID NO:21所示；间皮素Region III的氨基酸序列如SEQ IDNO:22所示。示例性的抗间皮素Region I的单链抗体的氨基酸序列如SEQ ID NO:23。示例性的抗间皮素Region III的单链抗体的轻链可变区的氨基酸序列如SEQ ID NO:9第23-146位氨基酸残基所示，其示例性的编码序列可如SEQ ID NO:10第67-438位核苷酸序列所示；示例性的抗间皮素Region III的单链抗体的重链可变区的氨基酸序列如SEQ ID NO:9第162-272位氨基酸残基所示，其示例性的编码序列如SEQ ID NO:10第484-816位核苷酸序列所示。在某些实施方案中，本发明所述的识别间皮素抗原的scFv的氨基酸序列如SEQ ID NO:9第23-272位氨基酸残基所示，其示例性的编码序列可如SEQ ID NO:10第67-816位碱基序列所述。本文中，如果没有特别说明，间皮素指锚定在膜上的间皮素片段。
本发明中，示例性的靶向ErbB受体家族的抗原识别区含有天然的T1E和Herin的融合蛋白。本文中，T1E是一种嵌合的多肽，它由人转录生长因子α(TGFα)N端的七个氨基酸和表皮生长因子(EGF)C端的48个氨基酸组成。优选地，T1E的氨基酸序列如SEQ ID NO:13第23-77位氨基酸残基所示，其示例性的编码序列可如SEQ ID NO:14第67-231位碱基序列所示。本文中，Herin指Herstatin第八内含子编码的79个氨基酸。优选地，其氨基酸序列如SEQID NO:13第93-171位氨基酸残基所示。本发明将编码Herin氨基酸的密码子进行优化。因此，本发明优选的Herin的核苷酸序列如SEQ ID NO:14第277-513位碱基序列所示。通常，T1E和Herin可通过刚性接头序列连接。刚性接头序列的一个示例性的例子是以EAAAK为一个单元的2个或多个重复序列，本文也称为EAAAK接头。示例性的刚性接头序列如SEQ IDNO:13第78-92位氨基酸残基所示，其示例性的编码序列如SEQ ID NO:14第232-276位碱基序列所示。在某些实施方案中，本文所述的抗原识别区如SEQ ID NO:13第23-171位氨基酸残基所示，其示例性的编码序列如SEQ ID NO:14第67-513位碱基序列所示。
本发明中，示例性的识别粘蛋白(Muc1)抗原的抗原识别区可以是粘蛋白的scFv，该单链抗体可以是本领域周知的针对Muc1抗原的单链抗体。在某些实施方案中，该单链抗体的轻链可变区氨基酸序列和重链可变区氨基酸序列来自针对Muc1近膜端氨基酸序列的抗体。在某些实施方案中，该Muc1近膜端氨基酸序列如SEQ ID NO:24所示。示例性的抗Muc1单链抗体的轻链可变区的氨基酸序列如SEQ ID NO:15第23-133位氨基酸残基所示，其示例性的编码序列可如SEQ ID NO:16第67-399位碱基序列所示。示例性的抗Muc1单链抗体的重链可变区的氨基酸序列如SEQ ID NO:15第149-269位氨基酸残基所示，其示例性的编码序列可如SEQ ID NO:16第445-809位碱基序列所示。在某些实施方案中，示例性的识别粘蛋白抗原的单链抗体的氨基酸序列如SEQ ID NO:15第23-269位氨基酸残基所示，其示例性的编码序列如SEQ ID NO:16第67-807位碱基所示。
本发明中，示例性的识别EGFR的抗原识别区可以是由EGFR的特异性抗体的轻链可变区和重链可变区形成的单链抗体，该单链抗体可以是本领域周知的针对EGFR的单链抗体。示例性的识别EGFR的单链抗体的轻链可变区的氨基酸序列如SEQ ID NO:17第23-129位氨基酸残基所示，其示例性的编码序列可如SEQ ID NO:18第67-387位碱基序列所示。示例性的识别EGFR的单链抗体的重链可变区的氨基酸序列如SEQ ID NO:17第145-263位氨基酸残基所示，其示例性的编码序列可如SEQ ID NO:18第433-789位碱基序列所示。在某些实施方案中，示例性的识别EGFR的单链抗体的氨基酸序列如SEQ ID NO:17第23-263位氨基酸残基所示，其示例性的编码序列如SEQ ID NO:18第67-789位核苷酸序列所示。
本文中，铰链区指免疫球蛋白重链CH1和CH2功能区之间的区域，该区富含脯氨酸，不形成α螺旋，易发生伸展及一定程度扭曲，有利于抗体的抗原结合部位与抗原表位间的互补性结合。适用于本文的铰链区可选自CD8的胞外铰链区、IgG1Fc CH2CH3铰链区、IgD铰链区、CD28的胞外铰链区、IgG4Fc CH2CH3铰链区和CD4的胞外铰链区的任意一种或多种。铰链区优选是长50个氨基酸残基以上、更优选长80个氨基酸以上的铰链区。在某些实施方案中，本文使用CD8α铰链区或IgG4Fc CH2CH3铰链区。在某些实施方案中，CD8α铰链区的氨基酸序列如SEQ ID NO:7第264-308位氨基酸残基所示，其示例性的编码序列如SEQ ID NO:8第790-924位碱基序列所示；在其它实施方案中，CD8α铰链区的氨基酸序列如SEQ ID NO:17第264-318位氨基酸残基所示，其示例性的编码序列如SEQ ID NO:18第790-954位碱基序列所示。示例性的IgG4CH2CH3铰链区的氨基酸序列如SEQ ID NO:9第273-500位氨基酸残基所示，其示例性的编码序列如SEQ ID NO:10第817-1500位碱基序列所示。
跨膜区可以是CD28跨膜区、CD8跨膜区、CD3ζ跨膜区、CD134跨膜区、CD137跨膜区、ICOS跨膜区和DAP10跨膜区中的一种。在某些实施方案中，跨膜区是CD8跨膜区，其示例性的氨基酸序列如SEQ ID NO:7第309-332位氨基酸残基所示，其示例性的编码序列如SEQ IDNO:8第925-996位碱基序列所示。在某些实施方案中，CD8跨膜区的氨基酸序列如SEQ IDNO:17第319-344位氨基酸残基所示，其示例性的编码序列如SEQ ID NO:18第955-1032位碱基序列所示。在某些实施方案中，跨膜区是CD28跨膜区，其氨基酸序列如SEQ ID NO:9第501-528位氨基酸残基所示，其示例性的编码序列如SEQ ID NO:10第1501-1584位碱基序列所示。
胞内共刺激信号域包括共刺激信号分子的胞内结构域，可选自CD28、CD134/OX40、CD137/4-1BB、淋巴细胞特异性蛋白酪氨酸激酶(LCK)、诱导性T细胞共刺激因子(ICOS)和DNAX激活蛋白10(DAP10)的胞内结构域。在某些实施方案中，共刺激信号分子的胞内结构域为CD137/4-1BB的胞内结构域；优选地，所述CD137/4-1BB的氨基酸序列如SEQ ID NO:7第333-374位氨基酸残基所示，其示例性的编码序列如SEQ ID NO:8第997-1122位碱基序列所示。在某些实施方案中，胞内共刺激信号域是CD28的胞内结构域，其示例性的氨基酸序列如SEQ ID NO:9第529-569位氨基酸残基所示，其示例性的编码序列如SEQ ID NO:10第1585-1707位碱基序列所示。
胞内信号域优选为免疫受体酪氨酸活化基序，可以是CD3ζ胞内信号域或FcεRIγ胞内信号域；优选为CD3ζ胞内信号域，优选地所述CD3ζ胞内信号域的氨基酸序列如SEQ IDNO:7第375-486位氨基酸残基所示，其示例性的编码序列可如SEQ ID NO:8第1123-1458位碱基所示。
在某些实施方案中，本发明的嵌合抗原受体从N端到C端依次含有：任选的信号肽序列、抗原识别区、CD8α铰链区或IgG4CH2CH3铰链区、CD8跨膜区或CD28跨膜区、4-1BB或CD28的胞内结构域以及CD3ζ胞内信号域。优选地，本发明的嵌合抗原受体为：靶向CD19的嵌合抗原受体，其氨基酸序列如SEQ ID NO:7第22-486位氨基酸残基所示，或者如SEQ ID NO:7所示，其示例性的编码序列如SEQ ID NO:8第64-1458位碱基序列所示，或者如SEQ ID NO:8所示；靶向间皮素的嵌合抗原受体，其氨基酸序列如SEQ ID NO:9第23-681位氨基酸残基所示，或者如SEQ ID NO:9所示，其示例性的编码序列如SEQ ID NO:10第67-2043位碱基序列所示，或者如SEQ ID NO:10所示，或者其氨基酸序列如SEQ ID NO:11第21-679位氨基酸残基所示，或者如SEQ ID NO:11所示，其示例性的编码序列如SEQ ID NO:12第61-2037位碱基序列所示，或者如SEQ ID NO:12所示；靶向ErbB家族的抗原识别区，其氨基酸序列如SEQID NO:13第23-580位氨基酸残基所示，或者如SEQ ID NO:13所示，其示例性的编码序列如SEQ ID NO:14第67-1740位碱基序列所示，或者如SEQ ID NO:14所示；靶向粘蛋白的嵌合抗原受体，其氨基酸序列如SEQ ID NO:15第23-678位氨基酸残基所示，或者如SEQ ID NO:15所示，其示例性的编码序列如SEQ ID NO:16第67-2034位碱基序列所示，或者如SEQ ID NO:16所示；或者为靶向EGFR的嵌合抗原受体，其氨基酸序列如SEQ ID NO:17第23-497位氨基酸残基所示，或者如SEQ ID NO:17所示，其示例性的编码序列如SEQ ID NO:18第67-1491位碱基序列所示，或者如SEQ ID NO:18所示。
形成本文嵌合抗原受体的上述各部分，如信号肽、抗Muc1单链抗体的轻链可变区和重链可变区、铰链区、跨膜区、胞内共刺激信号域和胞内信号域等，相互之间可直接连接，或者可通过接头序列连接。接头序列可以是本领域周知的适用于抗体的接头序列，例如含G和S的接头序列。接头的长度可以是3～25个氨基酸残基，例如3～15、5～15、10～20个氨基酸残基。在某些实施方案中，接头序列是多甘氨酸接头序列。接头序列中甘氨酸的数量无特别限制，通常为2～20个，例如2～15、2～10、2～8个。除甘氨酸和丝氨酸来，接头中还可含有其它已知的氨基酸残基，例如丙氨酸(A)、亮氨酸(L)、苏氨酸(T)、谷氨酸(E)、苯丙氨酸(F)、精氨酸(R)、谷氨酰胺(Q)等。
5、核酸序列、核酸构建物及载体及其制备方法
本发明也包括核酸序列，其为本文所述的抗体的编码序列或其互补序列。核酸序列可以是DNA形式或RNA形式。DNA可以是单链的或是双链的。
更具体而言，本发明包括含有任选的信号肽、本文所述的抗原结合序列和所述突变型Fc段的抗体的编码序列或其互补序列。示例性的编码序列包括但不限于SEQ ID NO:2或其第60-1491位碱基序列所示的编码序列；SEQ ID NO:4或其第60-1485位碱基序列所示的编码序列；以及SEQ ID NO:6或其第60-1104位碱基序列所示的编码序列。
本发明也包括本文所述的嵌合抗原受体的编码序列或其互补序列。示例性的嵌合抗原受体的编码序列包括编码从N端到C端依次含有任选的信号肽序列、抗原识别区、CD8α铰链区或IgG4CH2CH3铰链区、CD8跨膜区或CD28跨膜区、4-1BB或CD28的胞内结构域以及CD3ζ胞内信号域的嵌合抗原受体的编码序列。示例性的编码序列包括SEQ ID NO:8或其第64-1458位碱基序列所示的编码序列，SEQ ID NO:10或其第67-2043位碱基序列所示的编码序列，SEQ ID NO:12或其第61-2037位碱基序列所示的编码序列，SEQ ID NO:14或其第67-1740位碱基序列所示的编码序列，SEQ ID NO:16或其第67-2034位碱基序列所示的编码序列，以及SEQ ID NO:18或其第67-1491位碱基序列所示的编码序列。
本发明也包括核酸构建物，所述核酸构建物含有本发明所述的抗体或嵌合抗原受体的编码序列或其互补序列。
在某些实施方案中，所述核酸构建物是表达框，其含有可操作性连接的启动子序列、抗体或嵌合抗原受体的编码序列或其互补序列以及任选的polyA加尾信号序列。启动子序列通常与本文所述的编码序列操作性连接。启动子可以是在所选择的宿主细胞中显示转录活性的任何核苷酸序列，包括突变的、截短的和杂合启动子，并且可以从编码与该宿主细胞同源或异源的胞外或胞内多肽的基因获得。表达框中通常含有转录终止子序列，转录终止子序列由宿主细胞识别以终止转录的序列。终止子序列与本文所述的编码序列3’末端可操作性连接。在选择的宿主细胞中有功能的任何终止子都可用于本发明。
在某些实施方案中，所述核酸构建物是载体。载体的类型包括但不限于质粒、噬菌粒、噬菌体衍生物、动物病毒和粘粒。载体可以是表达载体，优选是真核表达载体。表达载体可以以病毒载体形式提供给细胞。可用作载体的病毒包括但不限于逆转录病毒、腺病毒、腺伴随病毒、疱疹病毒和慢病毒。载体也可以是用于将所述编码序列或其互补序列整合入宿主细胞的整合载体。
通常，合适的载体包含在至少一种有机体中起作用的复制起点、启动子序列、方便的限制酶位点和一个或多个可选择的标记。例如，在某些实施方案中，本发明使用逆转录病毒载体，该逆转录病毒载体含有复制起始位点，3’LTR，5’LTR，本文所述抗体或嵌合抗原受体的编码序列，以及任选的可选择的标记。
本文中，合适的启动子包括但不限于即时早期巨细胞病毒(CMV)启动子序列。该启动子序列是能够驱动可操作地连接至其上的任何多核苷酸序列高水平表达的强组成型启动子序列。合适的启动子的另一个例子为延伸生长因子-1α(EF-1α)。然而，也可使用其他组成型启动子序列，包括但不限于类人猿病毒40(SV40)早期启动子、小鼠乳癌病毒(MMTV)、人免疫缺陷病毒(HIV)长末端重复(LTR)启动子、MoMuLV启动子、鸟类白血病病毒启动子、EB病毒即时早期启动子、鲁斯氏肉瘤病毒启动子、以及人基因启动子，诸如但不限于肌动蛋白启动子、肌球蛋白启动子、血红素启动子和肌酸激酶启动子。进一步地，也可考虑使用诱导型启动子。诱导型启动子的使用提供了分子开关，其能够在期限表达时打开可操作地连接诱导型启动子的多核苷酸序列的表达，而在当表达是不期望的时关闭表达。诱导型启动子的例子包括但不限于金属硫蛋白启动子、糖皮质激素启动子、孕酮启动子和四环素启动子。
在某些实施方案中，可使用CN201510021408.1所公布的各种启动子序列，包括但不限于该申请SEQ ID NO:5所示的含mCMV增强子、hCMV增强子和EF1α启动子的CCEF启动子；SEQ ID NO:7所示的含CD3e增强子、mCMV增强子、hCMV增强子和EF1α启动子的TCEF启动子；SEQ ID NO:8所示的含mCMV增强子、hCMV增强子和含内含子的EF1α启动子的CCEFI启动子；SEQ ID NO:3所示的含CD3e增强子和含内含子的EF1α启动子的TEFI启动子；以及SEQ IDNO:3所示的含CD3e增强子、mCMV增强子、hCMV增强子和含内含子的EF1α启动子的TCEFI启动子。本文将该申请的全部内容以引用的方式纳入本文。
可选择的标记包括可选择的标记基因或报道基因中的任一个或两者，以便于从被病毒载体感染的细胞群中鉴定和选择表达细胞。有用的可选择标记基因包括例如抗生素抗性基因，诸如neo等。合适的报道基因可包括编码荧光素酶、β-半乳糖苷酶、氯霉素乙酰转移酶、分泌型碱性磷酸酶或绿色萤光蛋白基因的基因。
在某些实施方案中，可将本文所述的嵌合抗原受体的编码序列和所述抗体的编码序列分别克隆到用于将目的核酸序列整合到宿主细胞的基因组中的载体(也称为整合载体)中，尤其是转座载体。在某些实施方案中，该转座载体是含有选自piggybac、sleepingbeauty、frog prince、Tn5或Ty的转座元件的真核表达载体。这类转座载体含有相应转座子的5’反向末端重复序列(5’LTR)和相应转座子的3’反向末端重复序列(3’LTR)。转座酶可以是来自piggybac、sleeping beauty、frog prince、Tn5或Ty转座系统的转座酶。当使用来自不同转座系统的转座酶时，所述载体中的5’LTR和3’LTR的序列也相应改变为与该转座系统适配的序列，这可由本领域技术人员容易地确定。在某些实施方案中，在5’LTR和3’LTR之间是本发明的CAR或抗体的表达框，包括相应的启动子序列、CAR或抗体的编码序列以及polyA加尾信号序列。
在某些实施方案中，转座酶是来自piggybac转座系统的转座酶。因此，在这些实施方案中，转座子5’反向末端重复序列和3’反向末端重复序列分别为piggybac转座子的5’反向末端重复序列和3’反向末端重复序列。在某些实施方案中，转座子5’反向末端重复序列如CN 201510638974.7(本文将其内容以引用的方式纳入本文)SEQ ID NO:1所示。在某些实施方案中，转座子3’反向末端重复序列如CN 201510638974.7SEQ ID NO:4所示。在某些实施方案中，piggybac转座酶为含c-myc核定位信号编码序列的转座酶。在某些实施方案中，piggybac转座酶的编码序列如CN 201510638974.7SEQ ID NO:5所示。
转座酶编码序列的启动子可以是本领域已知的用于控制转座酶编码序列表达的各种启动子。在某些实施方案中，使用CMV启动子控制转座酶编码序列的表达。CMV启动子的序列可如CN 201510638974.7SEQ ID NO:6所示。
在某些实施方案中，本发明含嵌合抗原受体的编码序列的载体为CN201510638974.7所公开的pNB328载体。可采用本领域常规的方法制备本发明的嵌合抗原受体的编码序列，并将其克隆入合适的载体中。
在某些实施方案中，所述用于将目的基因整合到宿主细胞的基因组中的载体不含有转座酶编码序列。例如，可在pNB328载体的基础上除去转座酶编码序列即可获得这类载体。通常，可用这类载体将本发明所述抗体的表达框整合到宿主细胞的基因组中。
可采用本领域周知的方法，如PCR扩增法获得本文所述的核酸序列。例如，可根据本文所公开的核苷酸序列来设计引物，并用市售的cDNA库或按本领域技术人员已知的常规方法所制备的cDNA库作为模板，扩增得到有关序列。当序列较长时，常常需要进行两次或多次PCR扩增，然后再将各次扩增出的片段按正确次序拼接在一起。
应理解，在基因克隆操作中，常常需要设计合适的酶切位点，这势必在所表达的氨基酸序列末端引入了一个或多个不相干的残基，而这并不影响目的序列的活性。为了构建融合蛋白、促进重组蛋白的表达、获得自动分泌到宿主细胞外的重组蛋白、或利于重组蛋白的纯化，常常需要将一些氨基酸添加至重组蛋白的N-末端、C-末端或该蛋白内的其它合适区域内，例如，包括但不限于，适合的接头肽、信号肽、前导肽、末端延伸等。因此，本文的CAR的氨基端或羧基端还可含有一个或多个多肽片段，作为蛋白标签。任何合适的标签都可以用于本文。例如，所述的标签可以是FLAG，HA，HA1，c-Myc，Poly-His，Poly-Arg，Strep-TagII，AU1，EE，T7，4A6，ε，B，gE以及Ty1。这些标签可用于对蛋白进行纯化。
6、宿主细胞及其制备
本发明还提供一种宿主细胞，所述宿主细胞含有本文所述的核酸构建物，或表达本文所述的抗体和/或嵌合抗原受体。
本发明的宿主细胞可以是本领域周知的各种适合用来表达抗体的细胞，例如293或CHO细胞。这类宿主细胞中可含有表达本文所述抗体的表达载体。
在某些实施方案中，本发明的宿主细胞是用于同时表达本文所述的抗体和嵌合抗原受体的细胞，其含有本文所述抗体及嵌合抗原受体的编码序列或表达框，优选其基因组中整合了两个表达框，即本文所述抗体的表达框及嵌合抗原受体的表达框。优选地，这类细胞是T细胞。感兴趣的T细胞包括但不限于外周血T淋巴细胞、细胞毒杀伤T细胞(CTL)、辅助T细胞、抑制/调节性T细胞、γδT细胞以及细胞因子诱导的杀伤细胞(CIK)、肿瘤浸润淋巴细胞(TIL)等混合细胞群体的T细胞。
优选地，所述T细胞中转入了用于在其基因组中整合入嵌合抗原受体表达框的含转座酶编码序列的载体，和用于在其基因组中整合入本文所述的抗体的表达框的不含转座酶编码序列的载体。更优选地，所述T细胞转入了以pNB328载体为骨架载体构建的含嵌合抗原受体表达框的载体以及以pS328载体(与pNB328相比不含转座酶编码序列)为骨架载体构建的含本文所述抗体的表达框的载体。在某些实施方案中，所述在T细胞基因组中整合入嵌合抗原受体表达框的含转座酶编码序列的载体依次含有5’LTR、启动子、CD8信号肽或轻链信号肽的编码序列、抗原识别区的编码序列、CD8α铰链区或IgG4CH2CH3铰链区的编码序列、CD8或CD28跨膜区的编码序列、4-1BB或CD28胞内结构域的编码序列、CD3ζ胞内信号域的编码序列、polyA加尾信号序列、3’LTR和转座酶的编码序列及其启动子；所述在T细胞基因组中整合入本文所述抗体的编码序列的不含转座酶编码序列的载体在5’LTR和3’LTR之间依次含有启动子、轻链信号肽或CD8信号肽的编码序列、抗体的编码序列和polyA加尾信号序列。优选地，所述抗原识别区为靶向CD19、间皮素、粘蛋白、EGFR或ErbB家族的抗原识别区，优选其氨基酸和编码序列如前文所述。优选地，所述抗体是抗PD-1抗体、抗CD47抗体或抗CD40抗体，优选地，其氨基酸序列和编码序列如前文所述。
可采用常规的转染方法将本发明的载体转入感兴趣的细胞中，这些转入方法包括但不限于：病毒转导、显微注射、粒子轰击、基因枪转化和电转等。在某些实施方案中，采用电转将本文所述的载体转染感兴趣的细胞中。优选地，转染时，含嵌合抗原受体编码序列的载体与含抗体编码序列的载体的质量比为1～7：1～7，如1～5：1～5，优选1～3：1～3，更优选1～2：1～2，更优选1～2：1。
7、组合物和试剂盒
本发明还提供一种组合物，所述组合物含有本文所述的载体，优选是含有表达本文所述嵌合抗原受体的载体与表达本文所述抗体的载体。该组合物至少用于提供转染用的载体。
本发明的组合物中，表达本文所述嵌合抗原受体的载体与表达本文所述抗体的载体质量比可为1～7：1～7，如1～5：1～5，优选1～3：1～3，更优选1～2：1～2，更优选1～2：1。该组合物中还可含有合适的试剂，包括但不限于转染用的试剂。
本发明还提供一种试剂盒，所述试剂盒含有表达本文所述嵌合抗原受体的载体与表达本文所述抗体的载体，或者含有本文所述的组合物。试剂盒中还可配有将所述载体转入细胞中的试剂和/或仪器。
本发明的组合物还可以是一种药物组合物，所述药物组合物含有本文所述的T细胞或所述T细胞及其表达的本文所述的抗体。药物组合物中可含有合适的药学上可接受的载体或辅料。合适的载体或辅料包括但不限于缓冲液和渗透压调节剂等。药物组合物中含有治疗或预防有效量的T细胞。可根据患者的病情等因素确定T细胞的治疗或预防有效量。
8、方法和用途
本发明还提供本文所述的抗体、其编码序列或互补序列、核酸构建物以及宿主细胞在制备治疗或预防恶性肿瘤中的用途。所述肿瘤包括但不限于与所述抗体所特异性结合的抗原相关的肿瘤。本发明还包括用于治疗或预防恶性肿瘤的本文所述的抗体、其编码序列或互补序列、核酸构建物以及宿主细胞。
本发明还提供本文所述的T细胞或所述T细胞及其表达的抗体或其药物组合物在制备治疗或预防恶性肿瘤的药物中的用途。本发明还包括用于治疗或预防恶性肿瘤的本文所述的T细胞或所述T细胞及其表达的抗体或其药物组合物。
本发明还提供恶性肿瘤的治疗或预防方法，所述方法包括给予需要的对象治疗或预防有效量的本发明所述的T细胞或其药物组合物。
可采用本发明的T细胞或所述T细胞及其表达的抗体或其药物组合物或本发明所述的方法治疗或预防的恶性肿瘤(癌症)可以是所述T细胞所表达的抗体和/或嵌合抗原受体能治疗或预防的恶性肿瘤。例如，当嵌合抗原受体为靶向CD19的嵌合抗原受体时，恶性肿瘤可以是恶性B细胞淋巴瘤，包括急性B淋巴细胞白血病(B-ALL)、慢性B淋巴细胞白血病(B-CLL)、套细胞淋巴瘤(MCL)、非霍奇金淋巴瘤(NHL)和多发性骨髓瘤(MM)。当所述嵌合抗原受体靶向间皮素时，恶性肿瘤可以是其癌细胞表面异常表达间皮素的癌症；优选为腺癌、间皮瘤、肺癌、结肠癌、大肠癌、乳腺癌、卵巢癌、宫颈癌、胃癌、胆管癌、胆囊癌、食管癌、黑色素瘤、非小细胞肺癌、肾细胞癌、头颈鳞状上皮细胞癌、直肠癌、霍奇金淋巴瘤、胰腺癌或前列腺癌；更优选地，所述癌症是间皮素和CA125/MUC16同时高表达的癌症。当所述嵌合抗原受体靶向ErbB家族时，所述恶性肿瘤可以是癌细胞表面异常表达至少一个EGFR家族成员蛋白的癌症，如肝癌、腺癌、肺癌、结肠癌、大肠癌、乳腺癌、卵巢癌、宫颈癌、胃癌、胆管癌、非小细胞癌、胆囊癌、食管癌、黑色素瘤、胰腺癌、尿路上皮癌、头颈癌或前列腺癌。当所述嵌合抗原受体靶向粘蛋白时，所述恶性肿瘤可以是癌细胞表面异常表达Muc1抗原的癌症，如肝癌、腺癌、肺癌、结肠癌、大肠癌、乳腺癌、卵巢癌、宫颈癌、胃癌、胆管癌、非小细胞癌、胆囊癌、食管癌、黑色素瘤、胰腺癌、尿路上皮癌、头颈癌或前列腺癌。当所述嵌合抗原受体靶向EGFR时，所述恶性肿瘤可以是癌细胞表面异常表达EGFR的癌症，如胶质细胞癌、肾癌、腺癌、肺癌、结肠癌、大肠癌、乳腺癌、卵巢癌、宫颈癌、胃癌、胆管癌、胆囊癌、食管癌、胰腺癌或前列腺癌。当抗体是CD40抗体时，合适的恶性肿瘤为受CD40介导的恶性肿瘤，包括但不限于对非小细胞癌、黑色素瘤、尿路上皮癌、高频微卫星不稳定性(MSI-H)和头颈癌等；当抗体是PD-1抗体时，合适的恶性肿瘤为受PD-1介导的恶性肿瘤，包括但不限于黑色素瘤、结肠癌、前列腺癌、非小型细胞肺癌和肾细胞癌等实体瘤。当抗体是CD47抗体时，合适的恶性肿瘤包括但不限于癌细胞表面表达CD47的任何肿瘤。
下面将结合实施案例对本发明所涉及的实施方案进行详细描述。本领域技术人员将会理解，下面的实施案例仅用于说明本发明，而不应视为限定本发明的范围。实施案例中未注明具体技术或条件者，按照本领域内的文献所描述的技术或条件(例如参考J.萨姆布鲁克等著，黄培堂等译的《分子克隆实验指南》，第三版，科学出版社)或者按照产品说明书进行。
所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可以通过市购获得的常规产品。
实施例1：重组质粒的构建
委托上海捷瑞生物公司合成下表1所示的各外源基因(抗体或CAR)，并在其上游引入多克隆酶切位点(BglII-XbaI-EcoRI-BamHI)，在其下游插入酶切位点(SalI-NheI-HindIII-SpeI)，将其装入用EcoR1+SalI双酶切的pNB328载体或pS328载体中(pNB328的结构及序列参见CN 201510638974.7，本文将其全部内容以引用的方式纳入本文；与pNB328相比，pS328缺少转座酶编码序列；嵌合抗原受体的基因装入pNB328载体中，抗体的序列装入pS328的载体中)构成重组质粒。
表1
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*：SEQ ID NO:19显示的是2A的核苷酸序列，SEQ ID NO:20显示的是IRES的核苷酸序列；所述外源基因序列的其余部分的序列与表中相同名称的外源基因的序列相同；
**：野生型IgG4Fc序列如SEQ ID NO:25所示，与突变型IgG4Fc相比存在L17E(CTG突变为GAG)、N79Q(AAC突变为CAG)突变，其余序列相同。
实施例2：CAR-T细胞的构建
利用Filcoll分离法从患者血液中分离获得外周血单核细胞(PBMCs)。将PBMC贴壁培养2-4h，其中未贴壁的悬浮细胞即为初始T细胞，将悬浮细胞收集到15ml离心管中，1200rmp离心3min，弃上清，加入生理盐水，1200rmp离心3min，弃生理盐水，并重复此步骤。
取1.5ml离心管，加入5×106个细胞，1200rmp离心3min，弃上清，取电转试剂盒(来自Lonza公司)，加入电转试剂共100ul，然后按下表2加入不同重组质粒。分别重悬混匀细胞；将混合液转移至电转杯中，放入电转仪，选取所需程序，进行电击；使用试剂盒中的微量吸管将电转好的细胞悬液转移到加好培养液的六孔板中(含2％FBS的AIM-Ⅴ培养液)，混匀，置于37℃，5％CO2培养箱培养，六小时后加入刺激因子IL-2、抗CD28抗体以及相应的抗原(CD19、间皮素、EGFR或粘蛋白)或抗CD3抗体，37℃，5％CO2培养3～4天，获得相应的T细胞。
转入两种重组质粒时，每种重组质粒的用量为4ug；单转一种重组质粒时，其用量为6ug。
表2
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实施例3：CAR-T细胞的阳性率及抗体分泌
1、流式检测CAR T细胞阳性率
收集实施例2制备得到的CAR-T细胞，各分为两份，每份1×106个细胞，生理盐水洗涤两遍，100ul生理盐水重悬细胞，一份加入1ug的生物素偶联的抗原(CD19、间皮素、EGFR或粘蛋白)，另一份不加，4℃孵育30分钟。生理盐水洗涤两遍，再次用100ul生理盐水重悬细胞，加入1ul的链霉素-PE抗体，4℃孵育30分钟。生理盐水洗涤两遍，上机检测，以只加二抗的为对照，结果如下表3所示。
表3
T细胞类型 阳性率(％)
CD19CAR-αCD40T细胞 80.52
CD19CAR-2A-αCD40T细胞 1.21
αCD40-IRES-CD19CAR T细胞 48.68
mesoCAR-αCD40T细胞 88.48
mesoCAR-2A-αCD40T细胞 23.02
αCD40-IRES-mesoCAR T细胞 53.84
EHCAR-EK-28TIZ-αCD40T细胞 56.02
EHCAR-EK-28TIZ T细胞 53.53
Muc1CAR T细胞 65.52
Muc1CAR-αCD40T细胞 71.48
CD19CAR T细胞 50.24
CD19CAR-antiPD1 T细胞 58.64
mesoCAR-antiPD1 T细胞 86.42
mesoCAR-2A-antiPD1 T细胞 68.01
antiPD1-IRES-mesoCAR T细胞 46.97
EHCAR-EK-28TIZ-antiPD1 T细胞 61.36
pS328-Muc1CAR+pNB328-antiPD1 T细胞 45.63
Muc1CAR-antiPD1 T细胞 91.17
Muc1CAR-2A-antiPD1 T细胞 10.38
antiPD1-IRES-Muc1CAR T细胞 35.33
αCD47-EGFR-CAR T细胞 67.17
αCD47-Meso3CAR T细胞 70.57
2、ELISA检测实施例2制备得到的CAR-T细胞的抗体表达量
①用包被液将相应的抗原(CD40、PD1或CD47)稀释至0.5ug/ml(5ul+1ml包被液)，100ul/孔包被酶标反应板，4℃过夜。
②用PBST清洗5遍，每次3分钟，用吸水纸拍干，200ul/孔。
③每孔加封闭液100ul，37℃孵育1小时。
④用PBST清洗5遍，每次3分钟，用吸水纸拍干，200ul/孔。
⑤加入样品及标准品，100ul/孔，设复孔和对照孔，37℃孵育1小时。
⑥用PBST清洗5遍，每次3分钟，用吸水纸拍干，200ul/孔。
⑦封闭液将IgG F4HRP1：30000稀释，100ul/孔，37℃孵育45分钟。
⑧用PBST清洗5遍，每次3分钟，用吸水纸拍干，200ul/孔。
⑨加入显色液TMB，100ul/孔，37℃避光显色10-15min。
⑩加入终止液终止反应，50ul/孔。
酶标仪上450nm处测OD值，绘制标准曲线，计算CD40抗体浓度。
结果如下表4所示。
表4
实施例4：不同质粒配比测试
采用实施例2的方法，使用实施例1构建得到的质粒组合按下表5所示的用量配比(1ug+7ug、2ug+6ug、3ug+5ug、4ug+4ug、5ug+3ug、6ug+2ug、7ug+1ug)构建CAR-T细胞。并采用实施例3所述的方法检测不同用量配比下构建测CAR T细胞阳性率及抗体分泌量(方法同实施例3)。
表5
pNB328-CD19CAR pS328-αCD40
pNB328-mesoCAR pS328-αCD40
pNB328-EHCAR-EK-28TIZ pS328-αCD40
pNB328-Muc1CAR pS328-αCD40
pNB328-CD19CAR pS328-m279V
pNB328-mesoCAR pS328-antiPD1
pNB328-EHCAR-EK-28TIZ pS328-antiPD1
pNB328-Muc1CAR pS328-m279V
pNB328-EGFR-CAR pS328-αCD47
pNB328-meso3CAR pS328-αCD47
示例性的结果如下表6和7所示。
表6
表7
结果显示，综合阳性率和抗体分泌量结果，选用5ug pNB328-EHCAR-EK-28TIZ和3ug pS328-αCD40构建EHCAR-EK-28TIZ-αCD40 T细胞，效果最好(阳性率大于60％，抗拉分泌量大于230ng/ml)；其它质粒组合中，选用4ug+4ug的效果较好。
实施例5：CD19CAR与CD19CAR-αCD40 T细胞在CD19抗原的特异性刺激下细胞因子释放对比
用2ug/ml的CD19抗原包被96孔板，4℃包被过夜，PBS清洗3遍，加入1×105的实施例2构建得到的CD19CAR与CD19CAR-αCD40 T细胞以及对照的Mock T细胞，培养24h后收集细胞上清。用BD的CBA Human Th1/Th2 Cytokine Kit II检测这三种T细胞受CD19抗原刺激后细胞因子的分泌情况，具体步骤如下：
(1)混合人的IL-2、IL-4、IL-6、IL-10、TNF-α、IFN-γ捕获磁珠，涡旋振荡混匀捕获磁珠，每管加入50ul混匀后的捕获磁珠；
(2)加入50ul人的Th1/Th2细胞因子标准品(倍比稀释5000pg/ml、2500pg/ml、1250pg/ml、625pg/ml、312.5pg/ml、156pg/ml、80pg/ml、40pg/ml、20pg/ml、0pg/ml)和50ul的待测样品(经稀释液2倍稀释)；
(3)每管加入50ul的人的Th1/Th2-II-PE的检测抗体；
(4)室温避光孵育3h；
(5)每管加入1ml的洗涤缓冲液，200离心5min，弃上清；
(6)每管加入300ul的洗涤缓冲液重悬细胞，并转移至流式管中，用流式细胞仪检测荧光值。
结果如图1所示。
实施例6：CD19CAR与CD19CAR-αCD40 T细胞增殖检测
实施例2构建得到的培养到第8天的CD19CAR T细胞、CD19CAR-αCD40 T细胞和MockT细胞各取3×105个细胞，放置到12孔板中培养，培养体积均为1ml。
2.准备96孔白色不透光板，从三组细胞中，各取100μL含细胞的培养液加入到不同的孔中，同时取不含细胞培养液作空白对照。再向各孔中加入100μL CellTiter-Glo试剂，在震荡仪上混匀2min，并在室温下孵育10min，酶标仪读Luc荧光值。所用的CellTiter-GloLuminescent Cell Viability Assay试剂盒购自Promega公司。
3.培养的第9，10，11，12，13天，每天都从12孔板中培养的细胞中，取样，按以上步骤检测，根据荧光值，绘制细胞增殖曲线。
结果显示，CD19CAR-αCD40 T细胞较CD19CAR T细胞具有较好的增殖效应，具体结果如图2所示。
实施例7：CD19CAR T细胞和CD19CAR-αCD40 T细胞的体内功能实验
实验使用4～6周龄NSG完全免疫缺陷小鼠12只，平均重量22～27g，由北京百奥赛图生物技术有限公司提供，SPF级动物实验室饲养。
体外培育人B细胞淋巴瘤Raji-luc细胞，取对数生长期生长细胞，离心、收集细胞后用PBS液重悬，3000g室温离心2分钟，弃上清，再用PBS液重悬后离心收集细胞，调整细胞悬液浓度至5×107个/ml。于小鼠右肋背部皮下接种所述Raji-luc细胞，0.1ml/只。接种10天左右后，可通过活体成像仪观察肿瘤大小，将NSG免疫缺陷小鼠随机分为5组。分别为PBS组、Mock T组、CD19CAR T组、CD19CAR-αCD40-wt T、CD19CAR-αCD40 T组，每组注射相应的T细胞(来自实施例2)为1×107个/100ul，PBS组给予100ul的PBS，给药途径为尾静脉注射。每日观察小鼠的生活状态并每隔7-8天通过活体成像仪观察小鼠肿瘤变化。
结果如图3所示。
实施例8：mesoCAR T与mesoCAR-αCD40 T细胞的杀伤功能对比
实时无标记细胞功能分析仪检测实施例2构建得到的mesoCAR T细胞与mesoCAR-αCD40 T细胞在体外对肿瘤细胞的杀伤作用。
具体而言，选取MHC class I分型匹配的效应细胞与靶细胞，应用艾森公司的实时无标记细胞功能分析仪(RTCA)检测上述两种CAR-T细胞的体外杀伤活性，具体步骤如下：
(1)调零：每孔加入50μl DMEM或1640培养液，放入仪器中，选择step 1，调零；
(2)靶细胞铺板：宫颈癌细胞Hela，卵巢癌细胞SK-OV-3、胃癌HGC-27(购买于美国菌种保藏中心ATCC)按每孔104个细胞/50μl铺在含有检测电极的板中，放置数分钟，待细胞稳定一下，再放入仪器中，开始step 2，培养细胞；
(3)加入效应细胞：靶细胞培养24h后，暂停step 2，加入效应细胞，每孔50μl，效靶比分别设置为4:1，以Mock T细胞作为对照，开始step 3，继续共培养24h后，观察细胞增殖曲线；
结果如图4所示，自表达CD40抗体的mesoCAR-αCD40 T细胞与单独的mesoCAR T细胞杀伤功能基本一致，抗体表达并没有影响CAR-T功能。
实施例9：mesoCAR与mesoCAR-αCD40 T细胞在间皮素抗原的特异性刺激下细胞因子释放对比
用2ug/ml的间皮素抗原包被96孔板，4℃包被过夜，PBS清洗3遍，加入1×105的实施例2构建得到的meso3CAR T细胞与mesoCAR-αCD40 T细胞以及对照的Mock T细胞，培养24h后收集细胞上清。用BD的CBA Human Th1/Th2 Cytokine Kit II检测这三种T细胞受间皮素抗原刺激后细胞因子的分泌情况，具体步骤如下：
(1)混合人的IL-2、IL-4、IL-6、IL-10、TNF、IFN-γ捕获磁珠，涡旋振荡混匀捕获磁珠，每管加入50ul混匀后的捕获磁珠；
(2)加入50ul人的Th1/Th2细胞因子标准品(倍比稀释5000pg/ml、2500pg/ml、1250pg/ml、625pg/ml、312.5pg/ml、156pg/ml、80pg/ml、40pg/ml、20pg/ml、0pg/ml)和50ul的待测样品(经稀释液2倍稀释)。
(3)每管加入50ul的人的Th1/Th2-II-PE的检测抗体；
(4)室温避光孵育3h；
(5)每管加入1ml的洗涤缓冲液，200离心5min，弃上清；
(6)每管加入300ul的洗涤缓冲液重悬细胞，并转移至流式管中，用流式细胞仪检测荧光值；
结果如图5所示，自表达CD40抗体的mesoCAR-αCD40 T细胞与单独的mesoCAR T细胞的细胞因子分泌量没有明显差异。
实施例10：mesoCAR与mesoCAR-αCD40 T细胞增殖检测
各取3×105个实施例2培养的第8天的mesoCAR、mesoCAR-αCD40 T细胞和Mock-T细胞，放置到12孔板中培养，培养体积均为1ml。
2.准备96孔白色不透光板，从三组细胞中，各取100μL含细胞的培养液加入到不同的孔中，同时取不含细胞培养液作空白对照。再向各孔中加入100μL CellTiter-Glo试剂，在震荡仪上混匀2min，并在室温下孵育10min，酶标仪读Luc荧光值。所用的CellTiter-GloLuminescent Cell Viability Assay试剂盒购自Promega公司。
3.培养的第9，10，11，12，13天，每天都从12孔板中培养的细胞中，取样，按以上步骤检测，根据荧光值，绘制细胞增殖曲线。
结果如图6所示，mesoCAR-αCD40 T细胞较mesoCAR T细胞具有较好的增殖效应。
实施例11：mesoCAR与mesoCAR-αCD40 T细胞对卵巢癌小鼠移植瘤模型的治疗效果
1：4～6周龄NSG完全免疫缺陷小鼠20只，平均重量22～27g，由百奥赛图生物公司提供，SPF级动物实验室饲养。
2：体外培育人卵巢癌细胞SK-OV-3-luc，取对数生长期贴壁生长细胞，0.25％胰酶消化，离心、收集细胞后用PBS重悬，1000rmp室温离心2分钟，弃上清，再用PBS液重悬后离心收集细胞，调整细胞悬液浓度至5×107个/ml。
3：于小鼠右肋背部皮下接种OVCAR-3-luc细胞，0.1ml/只。接种7天后，可通过活体成像仪观察荧光强度，以及通过游标卡尺测量肿瘤大小，将NSG免疫缺陷小鼠随机分为5组，分别为PBS组和实施例2制备得到的Mock T组、mesoCAR T组、mesoCAR-αCD40-wt T组、mesoCAR-αCD40 T组。每组注射相应的T细胞为1×107个/100ul，PBS组给予100ul的PBS，给药途径为尾静脉注射。
4：每日观察小鼠的生活状态并每隔4天通过活体成像仪观察小鼠肿瘤变化。
结果如图7所示。
实施例12：EHCAR-EK-28TIZ和EHCAR-EK-28TIZ-αCD40 T细胞增殖速率的对比
各取3×105个实施例2培养第8天的EHCAR-EK-28TIZ T细胞、EHCAR-EK-28TIZ-αCD40 T细胞和Mock-T细胞，放置到12孔板中培养，培养体积均为1ml。准备96孔白色不透光板，从三组细胞中，各取80μL含细胞的培养液加入到不同的孔中，同时补80μL营养液至原来的12孔板中。再向96孔板中加入80μL CellTiter-Glo试剂，在震荡仪上混匀2min，并在室温下孵育10min，酶标仪读Luc荧光值。所用的CellTiter-Glo Luminescent Cell ViabilityAssay试剂盒购自Promega公司。培养的第9，10，11，12，13天，每天都从12孔板中培养的细胞中，取样，按以上步骤检测，根据荧光值，绘制细胞增殖曲线。
结果如图8所示，EHCAR-EK-28TIZ-αCD40 T细胞的增殖速度明显高于EHCAR-EK-28TIZ T细胞，说明表达CD40抗体可以促进CAR-T细胞的增殖。
实施例13：EHCAR-EK-28TIZ和EHCAR-EK-28TIZ-αCD40 T细胞的细胞表型测定分析
收集实施例2获得的两种EHCAR-EK-28TIZ和EHCAR-EK-28TIZ-αCD40 T细胞，计数后以1×106个细胞/管分别加入6个1.5ml的EP管中，PBS洗涤两次，1200rpm离心5min，弃上清；其中2管分别加入检测活化T细胞表型的流式抗体anti-CD107α-PE和anti-CD69-PE，有1管加入检测记忆T细胞表型的流式抗体anti-CD45RO-PECy5+anti-CD197-FITC+anti-CD62L-PE，有1管分别加入检测抑制性T细胞表型的流式抗体anti-PD1-PE，另外2管分别加入同型对照流式抗体IgG1-PE和IgG1-PE+IgG2a-PECy5+IgG2a-PE，每种抗体2μl(均购自Jackson ImmunoResearch公司)，轻弹沉淀使其混合均匀；室温避光孵育30min后，PBS清洗一遍，1200rpm离心5min，弃上清加入400μl的生理盐水，将细胞转移至流式管中，上机检测。
实验结果发现，流式检测EHCAR-EK-28TIZ和EHCAR-EK-28TIZ-αCD40 T细胞的衰老表型PD1的表达量差不多(图9A)；EHCAR-EK-28TIZ-αCD40 T细胞的活化表型CD69和CD107α的表达量高于EHCAR-EK-28TIZ细胞(图9B和9C)；同时，CD62L(L-选择素)为中央记忆T细胞的标志，CD197为效应记忆T细胞的标志，EHCAR-EK-28TIZ-αCD40 T细胞中效应T细胞的比例明显高于EHCAR-EK-28TIZ细胞和Mock-T 细胞(图9D)。这些结果说明，表达CD40抗体可以促进CAR-T细胞的活化，增强其免疫杀伤功能。
实施例14：EHCAR-EK-28TIZ和EHCAR-EK-28TIZ-αCD40 T细胞杀伤功能对比
选取MHC class I分型匹配的效应细胞与靶细胞，应用艾森公司的实时无标记细胞功能分析仪(RTCA)检测实施例2获得的两种EHCAR-EK-28TIZ T细胞和EHCAR-EK-28TIZ-αCD40 T细胞的体外杀伤活性，具体步骤如下：
(1)调零：每孔加入50μl DMEM或1640培养液，放入仪器中，选择步骤1，调零；
(2)靶细胞铺板：人肝癌细胞HCCLM3、人肺退行性癌细胞Calu-6和人非小细胞肺癌H23(购买于美国菌种保藏中心ATCC)按每孔104个细胞/50μl铺在含有检测电极的板中，放置数分钟，待细胞稳定一下，再放入仪器中，开始步骤2，培养细胞；
(3)加入效应细胞：靶细胞培养24h后，暂停步骤2，加入效应细胞，每孔50μl，效靶比分别设置为4:1，以转入pNB328空载体的Mock T细胞作为对照，开始步骤3，继续共培养24h后，观察细胞增殖曲线；
结果如图10所示。自表达CD40抗体的EHCAR-EK-28TIZ-αCD40 T细胞对多种肿瘤细胞的杀伤作用明显强于EHCAR-EK-28TIZ T细胞以及对照T细胞。
实施例15：EHCAR-EK-28TIZ T细胞和EHCAR-EK-28TIZ-αCD40 T细胞在EGFR抗原的特异性刺激下细胞因子释放对比
用5ug/ml的EGFR抗原包被96孔板，4℃包被过夜，PBS清洗3遍，加入1×105(100ul体积)的实施例2制备得到的EHCAR-EK-28TIZ和EHCAR-EK-28TIZ-αCD40 T细胞以及对照的Mock T细胞(转入pNB328空载体)，培养24h后收集细胞上清。检测这三种T细胞受EGFR抗原刺激后细胞因子的分泌情况。
结果如图11所示，EHCAR-EK-28TIZ-αCD40的IL-2和IFN-γ分泌量相显著高于EHCAR-EK-28TIZ T细胞和Mock-T，说明自表达CD40激活性抗体可以促进CAR-T细胞分泌细胞因子。
实施例16：EHCAR-EK-28TIZ T细胞、EHCAR-EK-28TIZ-αCD40-wt T细胞和EHCAR-EK-28TIZ-αCD40 T细胞体内抗肿瘤作用
购买4～6周龄NSG小鼠20只，平均分为5组，每组4只，接种肝癌细胞株HCCLM3-LUC，每只1×107，成瘤10天后，分别尾静脉注射PBS、实施例2获得的Mock-T、EHCAR-EK-28TIZ T细胞、EHCAR-EK-28TIZ-αCD40 T细胞以及EHCAR-EK-28TIZ-αCD40-wt T细胞，每组注射相应的T细胞为1×107个/100ul，PBS组给予100ul的PBS。观察记录小鼠体内肿瘤荧光变化。
结果显示，PBS、Mock-T、EHCAR-EK-28TIZ-αCD40-wt T细胞对肿瘤模型没有治疗效果，EHCAR-EK-28TIZ T细胞、EHCAR-EK-28TIZ-αCD40 T细胞有抗肿瘤效果，但EHCAR-EK-28TIZ-αCD40 T细胞效果明显更好。具体如图12所示。
实施例17：Muc1CAR T和Muc1CAR-αCD40 T细胞增殖速率的对比
将实施例2培养的第8天的Muc1CAR T细胞、Muc1CAR-αCD40 T细胞和Mock-T 细胞计数，各取3×105个细胞，放置到12孔板中培养，培养体积均为1ml。准备96孔白色不透光板，从三组细胞中，各取80μL含细胞的培养液加入到不同的孔中，同时补80μL营养液至原来的12孔板中。再向96孔板中加入80μL CellTiter-Glo试剂，在震荡仪上混匀2min，并在室温下孵育10min，酶标仪读Luc荧光值。所用的CellTiter-Glo Luminescent Cell ViabilityAssay试剂盒购自Promega公司。培养的第9，10，11，12，13天，每天都从12孔板中培养的细胞中，取样，按以上步骤检测，根据荧光值，绘制细胞增殖曲线。
结果如图13所示，Muc1CAR-αCD40 T细胞的增殖速度明显高于Muc1CAR T细胞，说明表达CD40抗体可以促进CAR-T细胞的增殖。
实施例18：Muc1CAR T和Muc1CAR-αCD40 T细胞的细胞表型测定分析
收集实施例2获得的两种Muc1CAR T细胞和Muc1CAR-αCD40 T细胞，计数后以1×106个细胞/管分别加入7个1.5ml的EP管中，PBS洗涤两次，1200rpm离心5min，弃上清；其中1管分别加入检测活化T细胞表型的流式抗体anti-CD25-PE，有1管加入检测记忆T细胞表型的流式抗体anti-CD45RO-PECy5+anti-CD197-FITC+anti-CD62L-PE，有2管分别加入检测抑制性T细胞表型的流式抗体anti-PD1-PE和anti-LAG3-Alexa Fluor 647，另外3管分别加入同型对照流式抗体IgG1-PE、IgG1-PE+IgG2a-PECy5+IgG2a-PE和IgG1Alexa Fluor 647，每种抗体2μl(均购自Jackson ImmunoResearch公司)，轻弹沉淀使其混合均匀；室温避光孵育30min后，PBS清洗一遍，1200rpm离心5min，弃上清加入400μl的生理盐水，将细胞转移至流式管中，上机检测。
实验结果发现，流式检测Muc1CAR-αCD40 T细胞的衰老表型PD1和LAG3的表达量均低于Muc1CAR T细胞，活化表型CD25的表达量高于Muc1CAR T细胞(图14A)；同时，CD62L(L-选择素)为中央记忆T细胞的标志，CD197为效应记忆T细胞的标志，Muc1CAR-αCD40 T细胞中效应T细胞的比例明显高于Muc1CAR T细胞和Mock-T细胞(图14B)。这些结果说明，表达CD40抗体可以促进CAR-T细胞的活化，增强其免疫杀伤功能。
实施例19：Muc1CAR T和Muc1CAR-αCD40 T细胞杀伤功能对比
选取MHC class I分型匹配的效应细胞与靶细胞，应用艾森公司的实时无标记细胞功能分析仪(RTCA)检测实施例2获得的两种Muc1CAR T细胞和Muc1CAR-αCD40 T细胞的体外杀伤活性，具体步骤如下：
(1)调零：每孔加入50μl DMEM或1640培养液，放入仪器中，选择步骤1，调零；
(2)靶细胞铺板：人肝癌细胞HCCLM3和人非小细胞肺癌H23(购买于美国菌种保藏中心ATCC)按每孔104个细胞/50μl铺在含有检测电极的板中，放置数分钟，待细胞稳定一下，再放入仪器中，开始步骤2，培养细胞；
(3)加入效应细胞：靶细胞培养24h后，暂停步骤2，加入效应细胞，每孔50μl，效靶比分别设置为4:1，以转入pNB328空载体的Mock T细胞作为对照，开始步骤3，继续共培养24h后，观察细胞增殖曲线。
结果如图15所示。自表达CD40抗体的Muc1CAR-αCD40 T细胞对多种肿瘤细胞的杀伤作用明显强于Muc1CAR T细胞以及对照T细胞。
实施例20：Muc1CAR T和Muc1CAR-αCD40 T细胞的细胞在Muc1抗原的特异性刺激下细胞因子释放对比
用5ug/ml的Muc1抗原包被96孔板，4℃包被过夜，PBS清洗3遍，加入1×105(100ul体积)的实施例2制备得到的Muc1CAR T细胞和Muc1CAR-αCD40 T细胞以及对照的Mock T细胞(转入pNB328空载体)，培养24h后收集细胞上清。检测这三种T细胞受Muc1抗原刺激后细胞因子的分泌情况。
结果如图16所示，Muc1CAR-αCD40 T细胞的IL-2、TNFα和IFN-γ分泌量相显著高于Muc1CAR T细胞和Mock-T，说明自表达CD40激活性抗体可以促进CAR-T细胞分泌细胞因子。
实施例21：Muc1CAR-T、Muc1CAR-αCD40-wt T细胞和Muc1CAR-αCD40 T细胞体内抗肿瘤作用
购买4～6周龄NSG小鼠20只，平均分为5组，每组4只，接种肝癌细胞株HCCLM3-LUC，每只1×107，成瘤10天后，分别尾静脉注射PBS、实施例2构建得到的Mock-T、Muc1CAR-T和Muc1CAR-αCD40T细胞以及Muc1CAR-αCD40-wt T细胞，每组注射相应的T细胞为1×107个/100ul，PBS组给予100ul的PBS，观察记录小鼠体内肿瘤荧光变化。
结果显示PBS、Mock-T、Muc1CAR-αCD40-wt T细胞对肿瘤模型没有治疗效果，Muc1CAR-T和Muc1CAR-αCD40 T细胞都有抗肿瘤效果，但Muc1CAR-αCD40 T细胞效果明显更好。具体如图17所示。
实施例22：Mock T细胞、CD19CAR T细胞及CD19CAR-antiPD1 T细胞在体外对培养的肿瘤细胞的杀伤实验
选取MHC class I分型匹配的效应细胞与靶细胞，应用DELFIA EuTDA细胞毒性实验检测CAR T细胞的体外杀伤活性，具体步骤如下：
(1)离心收集Raji细胞，并用PBS清洗1次；
(2)离心，收集细胞沉淀并用1640培养基重悬细胞并计数，调整细胞密度为1×106/ml；
(3)取2-4ml上述细胞，加入5ul荧光增强配体，置于37℃，5％CO2细胞培养箱中20min；
(4)PBS清洗细胞3-5次；
(5)离心，收集细胞沉淀并用1640培养基重悬细胞并计数，调整细胞密度为5×104/ml，取100ul细胞悬液加入96孔培养板中。
(6)将实施例2构建得到的Mock T细胞、CD19CAR T细胞和CD19CAR-antiPD1 T细胞进行细胞计数，按照不同的效靶比4：1取100ul细胞悬液对应加入上述Raji细胞中，并设置高对照组(肿瘤细胞加裂解液裂解)，低对照组(仅含有肿瘤细胞)，空白对照组(仅含有培养基)；
(7)置于37℃，5％CO2细胞培养箱中20min共培养3h；
(8)转移20ul培养上清至96孔白板中；
(9)加入200ul Europium溶液；
(10)室温振荡混匀15min；
(11)在酶标仪中使用时间分辨荧光检测，读值；
结果如图18所示，CD19CAR T细胞及CD19CAR-antiPD1 T具有较强的对肿瘤细胞的杀伤作用且杀伤作用相当。
实施例23：流式检测Mock T细胞、CD19CAR T细胞和CD19CAR-antiPD1 T细胞活化表型和细胞因子分泌的区别
1、收集悬浮的实施例2构建得到的Mock T细胞、CD19CAR T细胞和CD19CAR-antiPD1 T细胞，PBS清洗两遍，1200rpm离心5min，分别加入2ul的同型对照抗体IgG1-PE，荧光流式抗体anti-CD69-PE、anti-KLRG1-PE，anti-PD1-PE；同型对照抗体IgG1-PC5，荧光流式抗体anti-CD107-PC5；同型对照抗体IgG1FITC，荧光流式抗体anti-CD62L-FITC；同型对照抗体IgG1-PC5，荧光流式抗体anti-CD45RO-PC5；同型对照抗体IgG1-PE，荧光流式抗体anti-CCR7-PE。轻弹沉淀使其混合均匀，室温避光孵育30min，PBS清洗一遍，加入400ul PBS将细胞转移至流式管中，上机检测。
结果如图19(第1和2张图)所示，CD19CAR-antiPD1 T细胞分泌的PD-1单链抗体可以很好的封闭T细胞表面的PD-1蛋白，且CD19CAR T细胞和CD19CAR-antiPD1 T细胞在体外均有明显的杀伤活性，同时也能促进记忆T的形成，而活化标记CD69明显高于Mock T细胞而耗竭标记LAG3要明显低于Mock T细胞。
2、用5ug/ml的CD19抗原包被24孔板，4℃包被过夜，PBS清洗3遍，加入3×105的Mock T细胞、CD19CAR T细胞或CD19CAR-antiPD1 T细胞，培养24h后收集细胞上清。用BDTMCBA Human Th1/Th2Cytokine Kit II检测CD19CAR T细胞和CD19CAR-antiPD1 T细胞受CD19抗原刺激后细胞因子的分泌情况：
(1)混合人的IL-2、IL-4、IL-6、IL-10、TNF-α、IFN-γ捕获磁珠，涡旋振荡混匀捕获磁珠，每管加入50ul混匀后的捕获磁珠；
(2)加入50ul人的Th1/Th2细胞因子标准品(倍比稀释5000pg/ml、2500pg/ml、1250pg/ml、625pg/ml、312.5pg/ml、156pg/ml、80pg/ml、40pg/ml、20pg/ml、0pg/ml)和50ul的待测样品(经稀释液2倍稀释)；
(3)每管加入50ul的人的Th1/Th2-II-PE的检测抗体；
(4)室温避光孵育3h；
(5)每管加入1ml的洗涤缓冲液，200离心5min，弃上清；
(6)每管加入300ul的洗涤缓冲液重悬细胞，并转移至流式管中，用流式细胞仪检测荧光值；
结果如图19(第3张图)所示，CD19CAR T细胞及CD19CAR-antiPD1 T细胞分泌的IL-2，TNF-α和IFN-γ相比于Mock T细胞而言有了很大的提高，而三种细胞分泌的IL-4、IL-6和IL-10并没有实质差异。
3、收集1×106个的CD19CAR T细胞和CD19CAR-antiPD1 T细胞，分别加入1.5ml的EP管中，PBS清洗两遍，1200rpm离心5min，加入2ul的α-CD3CD4CD8抗体，室温避光孵育30min，PBS清洗一遍，加入400ul PBS将细胞转移至流式管中，上机检测。
结果如图19(第4张图)所示，CD19CAR T细胞、CD19CAR-antiPD1 T细胞和MockT中CD3+CD4+、CD3+CD8+细胞所占的百分比并没有很大的差异。
实施例24:CD19CAR T细胞、CD19CAR-antiPD1 T细胞以及CD19CAR-antiPD1-wt T细胞的体内功能实验
实验使用4～6周龄NSG完全免疫缺陷小鼠12只，平均重量22～27g，由北京百奥赛图生物技术有限公司提供，SPF级动物实验室饲养。
体外培育人B细胞淋巴瘤Raji-luc细胞，取对数生长期生长细胞，离心、收集细胞后用PBS液重悬，3000g室温离心2分钟，弃上清，再用PBS液重悬后离心收集细胞，调整细胞悬液浓度至5×107个/ml。于小鼠右肋背部皮下接种所述Raji-luc细胞，0.1ml/只。接种10天左右后，可通过活体成像仪观察肿瘤大小，将NSG免疫缺陷小鼠随机分分为4组。分别为PBS组、Mock T组、CD19CAR T组、CD19CAR-antiPD1 T组和CD19CAR-antiPD1-wt T组(实施例2构建得到的T细胞)，每组注射相应的T细胞为1×107个/100ul，PBS组给予100ul的PBS，给药途径为尾静脉注射。每日观察小鼠的生活状态并每隔7-8天通过活体成像仪观察小鼠肿瘤变化。
结果如图20所示。
实施例25：meso3CAR T与mesoCAR-antiPD1 T细胞的杀伤功能对比
采用实时无标记细胞功能分析仪检测实施例2构建得到的meso3CAR T与mesoCAR-antiPD1 T细胞在体外对肿瘤细胞的杀伤作用。
具体而言，选取MHC class I分型匹配的效应细胞与靶细胞，应用艾森公司的实时无标记细胞功能分析仪(RTCA)检测上述两种CAR-T细胞的体外杀伤活性，具体步骤如下：
(1)调零：每孔加入50μl DMEM或1640培养液，放入仪器中，选择step 1，调零；
(2)靶细胞铺板：宫颈癌细胞Hela，卵巢癌细胞SK-OV-3、胃癌HGC-27(均购买于美国菌种保藏中心ATCC)按每孔104个细胞/50μl铺在含有检测电极的板中，放置数分钟，待细胞稳定一下，再放入仪器中，开始step 2，培养细胞；
(3)加入效应细胞：靶细胞培养24h后，暂停step 2，加入效应细胞，每孔50μl，效靶比分别设置为4:1，以未转质粒的Mock T细胞作为对照，开始step 3，继续共培养24h后，观察细胞增殖曲线。
结果如图21所示，自表达PD1抗体的mesoCAR-antiPD1 T细胞与单独的meso3CAR T细胞杀伤功能基本一致，抗体表达并没有影响CAR-T功能。
实施例26：meso3CAR与mesoCAR-antiPD1 T细胞在间皮素抗原的特异性刺激下细胞因子释放对比
用2ug/ml的间皮素抗原包被96孔板，4℃包被过夜，PBS清洗3遍，分别加入1×105个实施例2构建得到的meso3CAR、mesoCAR-antiPD1 T细胞以及对照的Mock T细胞(转入，培养24h后收集细胞上清。用BDTMCBA Human Th1/Th2 Cytokine Kit II检测这三种T细胞受间皮素抗原刺激后细胞因子的分泌情况，具体步骤如下：
(1)混合人的IL-2、IL-4、IL-6、IL-10、TNF-α、IFN-γ捕获磁珠，涡旋振荡混匀捕获磁珠，每管加入50ul混匀后的捕获磁珠；
(2)加入50ul人的Th1/Th2细胞因子标准品(倍比稀释5000pg/ml、2500pg/ml、1250pg/ml、625pg/ml、312.5pg/ml、156pg/ml、80pg/ml、40pg/ml、20pg/ml、0pg/ml)和50ul的待测样品(经稀释液2倍稀释)；
(3)每管加入50ul的人的Th1/Th2-II-PE的检测抗体；
(4)室温避光孵育3h；
(5)每管加入1ml的洗涤缓冲液，200离心5min，弃上清；
(6)每管加入300ul的洗涤缓冲液重悬细胞，并转移至流式管中，用流式细胞仪检测荧光值。
结果如图22所示，自表达PD1抗体的mesoCAR-antiPD1 T细胞与单独的meso3CART细胞的细胞因子分泌量没有明显差异。
实施例27：meso3CAR与mesoCAR-antiPD1 T细胞对卵巢癌小鼠移植瘤模型的治疗效果
1、4～6周龄NSG完全免疫缺陷小鼠25只，平均重量22～27g，由百奥赛图生物公司提供，SPF级动物实验室饲养。
2、体外培育人卵巢癌细胞SK-OV-3-luc，取对数生长期贴壁生长细胞，0.25％胰酶消化，离心、收集细胞后用PBS重悬，1000rmp室温离心2分钟，弃上清，再用PBS液重悬后离心收集细胞，调整细胞悬液浓度至5×107个/ml。
3、于小鼠右肋背部皮下接种SK-OV-3-luc细胞，0.1ml/只。接种7天后，可通过活体成像仪观察荧光强度，将NSG免疫缺陷小鼠随机分为5组。每组注射相应的T细胞为1×107个/100ul，PBS组给予100ul的PBS，给药途径为尾静脉注射。
4、每日观察小鼠的生活状态并每隔4天通过活体成像仪观察小鼠肿瘤变化。
结果如图23所示，在SK-OV-3卵巢癌小鼠移植瘤模型中，MesoCAR-antiPD1 T细胞较Meso3CAR T细胞具有明显较好的治疗作用，而Meso3CAR-wt-antiPD1 T细胞基本没有效果。
实施例28：EHCAR-EK-28TIZ和EHCAR-EK-28TIZ-antiPD1 T细胞增殖速率的对比
各取3×105个细胞实施例2培养至第8天的EHCAR-EK-28TIZ T细胞、EHCAR-EK-28TIZ-antiPD1 T细胞和Mock-T细胞，放置到12孔板中培养，培养体积均为1ml。准备96孔白色不透光板，从三组细胞中，各取80μL含细胞的培养液加入到不同的孔中，同时补80μL营养液至原来的12孔板中。再向96孔板中加入80μL CellTiter-Glo试剂，在震荡仪上混匀2min，并在室温下孵育10min，酶标仪读Luc荧光值。所用的CellTiter-Glo Luminescent CellViability Assay试剂盒购自Promega公司。培养的第9，10，11，12，13天，每天都从12孔板中培养的细胞中取样，按以上步骤检测，根据荧光值绘制细胞增殖曲线。
结果如图24所示，EHCAR-EK-28TIZ-antiPD1 T细胞的增殖速度明显高于EHCAR-EK-28TIZ T细胞，说明表达PD1抗体可以促进CAR-T细胞的增殖。
实施例29：EHCAR-EK-28TIZ和EHCAR-EK-28TIZ-antiPD1 T细胞的细胞表型测定分析
收集实施例2获得的两种EHCAR-EK-28TIZ T细胞和EHCAR-EK-28TIZ-antiPD1 T细胞，计数后以1×106个细胞/管分别加入6个1.5ml的EP管中，PBS洗涤两次，1200rpm离心5min，弃上清；其中2管分别加入检测活化T细胞表型的流式抗体anti-CD107α-PE和anti-CD69-PE，有1管加入检测记忆T细胞表型的流式抗体anti-CD45RO-PECy5+anti-CD197-FITC+anti-CD62L-PE，有1管分别加入检测抑制性T细胞表型的流式抗体anti-PD1-PE，另外2管分别加入同型对照流式抗体IgG1-PE和IgG1-PE+IgG2a-PECy5+IgG2a-PE，每种抗体2μl(均购自Jackson ImmunoResearch公司)，轻弹沉淀使其混合均匀；室温避光孵育30min后，PBS清洗一遍，1200rpm离心5min，弃上清加入400μl的生理盐水，将细胞转移至流式管中，上机检测。
实验结果发现，流式检测EHCAR-EK-28TIZ-antiPD1 T细胞的衰老表型PD1的表达量显著低于EHCAR-EK-28TIZ(图25A)；EHCAR-EK-28TIZ-antiPD1 T细胞的活化表型CD69和CD107α的表达量高于EHCAR-EK-28TIZ细胞(图25B和25C)；同时，CD62L(L-选择素)为中央记忆T细胞的标志，CD197为效应记忆T细胞的标志，EHCAR-EK-28TIZ-antiPD1 T细胞中效应T细胞的比例明显高于EHCAR-EK-28TIZ细胞和Mock-T细胞(图25D)。这些结果说明，表达PD1抗体可以抑制CAR-T细胞的耗竭，促进CAR-T细胞的活化，增强其免疫杀伤功能。
实施例30：EHCAR-EK-28TIZ和EHCAR-EK-28TIZ-antiPD1 T细胞杀伤功能对比
选取MHC class I分型匹配的效应细胞与靶细胞，应用艾森公司的实时无标记细胞功能分析仪(RTCA)检测实施例2获得的两种EHCAR-EK-28TIZ T细胞和EHCAR-EK-28TIZ-antiPD1 T细胞的体外杀伤活性，具体步骤如下：
(1)调零：每孔加入50μl DMEM或1640培养液，放入仪器中，选择步骤1，调零；
(2)靶细胞铺板：人肝癌细胞HCCLM3、人肝癌细胞Hep3B和人非小细胞肺癌H23(购买于美国菌种保藏中心ATCC)按每孔104个细胞/50μl铺在含有检测电极的板中，放置数分钟，待细胞稳定一下，再放入仪器中，开始步骤2，培养细胞；
(3)加入效应细胞：靶细胞培养24h后，暂停步骤2，加入效应细胞，每孔50μl，效靶比分别设置为4:1，以转入pNB328空载体的Mock T细胞作为对照，开始步骤3，继续共培养24h后，观察细胞增殖曲线；
结果如图26所示。自表达PD1抗体的EHCAR-EK-28TIZ-antiPD1 T细胞对多种肿瘤细胞的杀伤作用明显强于EHCAR-EK-28TIZ T细胞以及对照T细胞。
实施例31：EHCAR-EK-28TIZ T细胞和EHCAR-EK-28TIZ-antiPD1 T细胞在EGFR抗原的特异性刺激下细胞因子释放对比
用5ug/ml的EGFR抗原包被96孔板，4℃包被过夜，PBS清洗3遍，加入1×105(100ul体积)的实施例2制备得到的EHCAR-EK-28TIZ T细胞和EHCAR-EK-28TIZ-antiPD1 T细胞以及对照的Mock T细胞(转入pNB328空载体)，培养24h后收集细胞上清。检测这三种T细胞受EGFR抗原刺激后细胞因子的分泌情况。
结果如图27所示，EHCAR-EK-28TIZ-antiPD1 T细胞的IL-2和IFN-γ分泌量相显著高于EHCAR-EK-28TIZ T细胞和Mock-T，说明自表达PD1抗体可以促进CAR-T细胞分泌细胞因子。
实施例32：EHCAR-EK-28TIZ T细胞、EHCAR-EK-28TIZ-antiPD1-wt T细胞和EHCAR-EK-28TIZ-antiPD1 T细胞体内抗肿瘤作用
购买4～6周龄NSG小鼠20只，平均分为5组，每组4只，接种肝癌细胞株HCCLM3-LUC，每只1×107，成瘤10天后，尾静脉注射PBS、Mock-T、EHCAR-EK-28TIZT细胞、EHCAR-EK-28TIZ-antiPD1-wt T细胞和EHCAR-EK-28TIZ-antiPD1 T细胞，每组注射相应的T细胞为1×107个/100ul，PBS组给予100ul的PBS，观察记录小鼠体内肿瘤荧光变化。
结果显示PBS、Mock-T、EHCAR-EK-28TIZ-antiPD1-wt T细胞对肿瘤模型没有治疗效果，EHCAR-EK-28TIZ T细胞和EHCAR-EK-28TIZ-antiPD1 T细胞具有很好抗肿瘤效果，但EHCAR-EK-28TIZ-antiPD1 T细胞效果明显更好。具体如图28所示。
实施例33：不同患者来源的PBMCs细胞经Muc1CAR基因及PD-1抗体基因修饰后T细胞基因组中Muc1CAR基因组表达水平的检测
提取实施例2得到的Mock T细胞、Muc1CAR T细胞及Muc1CAR-antiPD1 T细胞的基因组DNA(试剂盒法)，实验步骤参照试剂盒内附带的说明书，测定Mock T细胞、Muc1CAR T细胞及Muc1CAR-antiPD1 T细胞的DNA浓度，采用实时荧光定量PCR的方法检测Muc1CAR基因组的表达水平，反应程序为：50℃，2min→95℃,10min→95℃,15s→60℃,1min，40个循环。得到的Muc1CAR基因组的CT值及Actin的CT值根据相应的公式计算出绝对拷贝数含量。
结果发现，经PB转座酶系统，Muc1CAR基因组被整合到T细胞基因组中，具体如下表8所示：
表8
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实施例34：流式检测Mock T细胞，Muc1CAR T细胞和Muc1CAR-antiPD1 T细胞活化表型和细胞因子分泌的区别
1、收集实施例2得到的悬浮的Mock T细胞，Muc1CAR T细胞和转入了pNB328-Muc1CAR与pS328-m279V质粒的Muc1CAR-antiPD1 T细胞，PBS清洗两遍，1200rpm离心5min，分别加入2ul的同型对照抗体IgG1-PE，荧光流式抗体anti-CD25-PE，anti-LAG3-PE，anti-PD1-PE；同型对照抗体IgG1-PC5，荧光流式抗体anti-CD107-PC5；同型对照抗体IgG1FITC，荧光流式抗体anti-CD62L-FITC；同型对照抗体IgG1-PC5，荧光流式抗体anti-CD45RO-PC5；同型对照抗体IgG1-PE，荧光流式抗体anti-CCR7-PE，轻弹沉淀使其混合均匀，室温避光孵育30min，PBS清洗一遍，加入400ul PBS将细胞转移至流式管中，上机检测。
结果发现Muc1CAR-antiPD1 T细胞分泌的PD-1单链抗体可以很好的封闭T细胞表面的PD-1蛋白，且Muc1CAR T细胞和Muc1CAR-antiPD1 T细胞在体外均有明显的杀伤活性，也能促进效应记忆T的形成，活化标记CD25明显高于Mock T细胞而Muc1CAR-antiPD1 T细胞的耗竭标记LAG3要明显低于Mock T细胞和Muc1CAR T细胞，具体如图29A、29B所示。
2、收集1×106个的实施例2得到的Muc1CAR T细胞和转入了pNB328-Muc1CAR与pS328-m279V质粒的Muc1CAR-antiPD1 T细胞，分别加入1.5ml的EP管中，PBS清洗两遍，1200rpm离心5min，加入2ul的-CD3CD4CD8抗体，室温避光孵育30min，PBS清洗一遍，加入400ul PBS将细胞转移至流式管中，上机检测。
结果发现Muc1CAR T细胞、Muc1CAR-antiPD1 T细胞和Mock T中CD3+CD4+，CD3+CD8+细胞所占的百分比并没有很大的差异，具体如29C所示。
3、用5ug/ml的Muc1抗原包被24孔板，4℃包被过夜，PBS清洗3遍，加入3×105个实施例2得到的Mock T细胞，Muc1CAR T细胞和转入了pNB328-Muc1CAR与pS328-m279V质粒的Muc1CAR-antiPD1 T细胞，培养24h后收集细胞上清。用BDTMCBAHuman Th1/Th2Cytokine KitII检测Muc1CAR T细胞和Muc1CAR-antiPD1 T细胞受Muc1抗原刺激后细胞因子的分泌情况：
(1)混合人的IL-2、IL-4、IL-6、IL-10、TNF-α、IFN-γ捕获磁珠，涡旋振荡混匀捕获磁珠，每管加入50ul混匀后的捕获磁珠；
(2)加入50ul人的Th1/Th2细胞因子标准品(倍比稀释5000pg/ml、2500pg/ml、1250pg/ml、625pg/ml、312.5pg/ml、156pg/ml、80pg/ml、40pg/ml、20pg/ml、0pg/ml)和50ul的待测样品(经稀释液2倍稀释)；
(3)每管加入50ul的人的Th1/Th2-II-PE的检测抗体；
(4)室温避光孵育3h；
(5)每管加入1ml的洗涤缓冲液，200g离心5min，弃上清；
(6)每管加入300ul的洗涤缓冲液重悬细胞，并转移至流式管中，用流式细胞仪检测荧光值。
结果发现Muc1CAR T细胞及Muc1CAR-antiPD1 T细胞分泌的IL-2，TNF-α和IFN-γ相比于Mock T细胞而言有了很大的提高，而三种细胞分泌的IL-4、IL-6和IL-10并没有什么差异，具体如图29D所示。
实施例35：Mock T细胞,Muc1CAR T细胞及Muc1CAR-antiPD1 T细胞在体外对培养的肿瘤细胞的杀伤实验
选取MHC class I分型匹配的效应细胞与靶细胞，应用实时无标记细胞功能分析仪(RTCA)检测细胞的体外杀伤活性，具体步骤如下：
(1)调零：每孔加入50μl DMEM或1640培养液，放入仪器中，选择步骤1，调零；
(2)靶细胞铺板：宫颈癌细胞Hela，肝癌细胞HCC-LM3，肺癌细胞A549(购买于美国菌种保藏中心ATCC)按每孔104个细胞/50μl铺在含有检测电极的板中，放置数分钟，待细胞稳定一下，再放入仪器中，开始步骤2，培养细胞；
(3)加入效应细胞：靶细胞培养24h后，暂停步骤2，加入效应细胞(实施例2得到的Mock T细胞，Muc1CAR T细胞和转入了pNB328-Muc1CAR与pS328-m279V质粒的Muc1CAR-antiPD1 T细胞)，每孔50μl，效靶比设置为4:1，以未转质粒的Mock T细胞作为对照，开始步骤3，继续共培养24h后，获得细胞增殖曲线。
结果显示，表达PD-1抗体的Muc1CAR T细胞对三种肿瘤细胞的杀伤均优于Muc1CART细胞。具体如图30所示。
实施例36：表达PD-1抗体的Muc1CAR T细胞的体内功能研究
第一步：4～6周龄NSG完全免疫缺陷小鼠15只，平均重量22～27g，由北京维通达生物技术有限公司提供，SPF级动物实验室饲养。
第二步：体外培育人宫颈癌细胞Hela，取对数生长期贴壁生长细胞，0.25％胰酶消化，离心、收集细胞后用PBS液重悬，3000g室温离心2分钟，弃上清，再用PBS液重悬后离心收集细胞，调整细胞悬液浓度至5×107个/ml。
第三步：于小鼠右肋背部皮下接种Hela-luc细胞，0.1ml/只。接种10天左右后，通过活体成像仪观察肿瘤大小，将NSG免疫缺陷小鼠随机分为4组，每组5只小鼠，分别给予PBS以及实施例2获得的Mock T细胞、Muc1CAR T细胞、转入了pNB328-Muc1CAR和pS328-m279V-wt的Muc1CAR-antiPD1-wt T细胞及转入了pNB328-Muc1CAR与pS328-m279V质粒的Muc1CAR-antiPD1 T细胞(1×107个/只)，PBS组给予100ul PBS。给药途径为尾静脉注射。
第四步：每日观察小鼠的生活状态并每隔10天通过活体成像仪观察小鼠肿瘤变化。
结果如图31所示。
实施例37：检测Mock T细胞、EGFR-CAR T细胞以及αCD47-EGFR-CAR T细胞的CD47表达
收集实施例2构建得到的Mock T细胞、EGFR-CAR T细胞以及αCD47-EGFR-CAR T细胞，使用BD的流式抗体鼠抗人CD47-FITC检测CD47的表达，流式方法同实施例3。
结果如图32所示，αCD47-EGFR-CAR T分泌的CD47抗体可以封闭细胞自身的CD47表达。
实施例38：Mock T细胞、EGFR-CAR T细胞以及αCD47-EGFR-CAR T细胞对肿瘤细胞的杀伤作用
选取肺癌细胞株H23、卵巢癌细胞株SKOV3、胰腺癌细胞株ASPC-1三种EGFR阳性细胞为靶细胞，应用艾森公司的实时无标记细胞功能分析仪(RTCA)检测实施例2获得的MockT细胞、EGFR-CAR T细胞以及αCD47-EGFR-CAR T细胞的体外杀伤活性，具体步骤如下：
(1)调零：每孔加入50μl DMEM或1640培养液，放入仪器中，选择步骤1，调零；
(2)靶细胞铺板：肺癌细胞株H23、卵巢癌细胞株SKOV3、胰腺癌细胞株ASPC-1(购买于美国菌种保藏中心ATCC)按每孔104个细胞/50μl铺在含有检测电极的板中，放置数分钟，待细胞稳定一下，再放入仪器中，开始步骤2，培养细胞；
(3)加入效应细胞：靶细胞培养24h后，暂停步骤2，加入效应细胞，每孔50μl，效靶比分别设置为4:1，以转入pNB328空载体的Mock T细胞作为对照，开始步骤3，继续共培养24h后，观察细胞增殖曲线。
结果如图33所示。EGFR-CAR T细胞以及αCD47-EGFR-CAR T细胞的体外杀伤活性要明显高于Mock T细胞，且自表达CD47抗体并不会影响CAR-T细胞的杀伤功能。
实施例39：αCD47-EGFR-CAR T细胞培养上清可以封闭肿瘤细胞表面CD47
将实施例2获得的αCD47-EGFR-CAR T细胞的培养上清分别与肺癌细胞株H23、卵巢癌细胞株SKOV3、胰腺癌细胞株ASPC-1共培养，24小时后，收集肿瘤细胞，检测CD47的表达，以未与αCD47-EGFR-CAR T细胞上清共培养的为对照。流式检测方法同实施例3。
结果如图34所示，αCD47-EGFR-CAR T细胞上清中的CD47抗体可以封闭肿瘤细胞表面CD47。
实施例40：封闭肿瘤细胞表面CD47可以提升巨噬细胞对其吞噬作用
1.巨噬细胞的分离及培养：Ficoll密度梯度离心法分离出外周血单核细胞(PBMC)，置于37℃，5％CO2培养箱贴壁培养4h，用预温的培养基洗去未贴壁细胞，加入AIM-V培养基及rhGM-CSF(终浓度1000U/ml)。隔两天半量换液，培养7天，得贴壁细胞，即为巨噬细胞。
2.巨噬细胞对肿瘤细胞的吞噬作用：将肿瘤细胞用Hoechst染料染成蓝色，将巨噬细胞用CM-Dil染成红色，具体染色方法见染料说明书。将染色好的两种细胞混合，分为两份，一份加入实施例2构建得到的EGFR-CAR T细胞的培养上清作为对照，另一份加入实施例2构建得到的αCD47-EGFR-CAR T细胞的培养上清，共聚焦显微镜观察吞噬作用，并计数统计吞噬效率。
结果如图35所示，加入αCD47-EGFR-CAR T细胞的培养上清组其巨噬细胞的吞噬作用要明显高于对照组。
实施例41：αCD47-EGFR-CAR T细胞体内抗肿瘤作用
购买4～6周龄NSG小鼠20只，平均分为5组，每组4只，接种肺癌细胞株H23，每只1×107个细胞，成瘤10天后，分别尾静脉注射PBS和实施例2获得的Mock T细胞、EGFR-CAR T细胞、wt-αCD47-EGFR-CAR T细胞和αCD47-EGFR-CAR T细胞，每组注射相应的T细胞为1×107个/100ul，PBS组给予100ul的PBS，观察记录肿瘤体积。结果显示PBS、Mock T细胞、wt-αCD47-EGFR-CAR T细胞对肿瘤模型没有治疗效果，EGFR-CAR T细胞和αCD47-EGFR-CAR T细胞都有很好的抗肿瘤效果，且αCD47-EGFR-CAR T细胞效果更好。具体如图36所示。
实施例42：检测Mock、Meso3CAR以及αCD47-Meso3CAR T细胞的CD47表达
收集实施例2获得的Mock T细胞、Meso3CAR T细胞以及αCD47-Meso3CAR T细胞，使用BD的流式抗体FITC-鼠抗人CD47检测PD1的表达，流式方法同实施例3。
结果如图37所示，αCD47-Meso3CAR T分泌的CD47抗体可以封闭细胞表面的CD47的表达。
实施例43：Mock、Meso3CAR以及αCD47-Meso3CAR T细胞对肿瘤细胞的杀伤作用
选取胃癌细胞株Hgc27、卵巢癌细胞株SKOV3、胰腺癌细胞株ASPC-1三种EGFR阳性细胞为靶细胞，应用艾森公司的实时无标记细胞功能分析仪(RTCA)检测实施例2中获得的Mock、Meso3CAR以及αCD47-Meso3CAR T细胞的体外杀伤活性，具体步骤如下：
(1)调零：每孔加入50μl DMEM或1640培养液，放入仪器中，选择步骤1，调零；
(2)靶细胞铺板：胃癌细胞株Hgc27、卵巢癌细胞株SKOV3、胰腺癌细胞株ASPC-1(购买于美国菌种保藏中心ATCC)按每孔104个细胞/50μl铺在含有检测电极的板中，放置数分钟，待细胞稳定一下，再放入仪器中，开始步骤2，培养细胞；
(3)加入效应细胞：靶细胞培养24h后，暂停步骤2，加入效应细胞，每孔50μl，效靶比分别设置为4:1，以转入pNB328空载体的Mock T细胞作为对照，开始步骤3，继续共培养24h后，观察细胞增殖曲线。
结果如图38所示。Meso3CAR以及αCD47-Meso3CAR T细胞的体外杀伤活性要明显高于Mock T细胞，且表达CD47抗体并不会影响CAR-T细胞的杀伤功能。
实施例44：αCD47-Meso3CAR T细胞培养上清可以封闭肿瘤细胞表面CD47
将实施例2获得的αCD47-Meso3CAR T细胞的培养上清分别与胃癌细胞株Hgc27、卵巢癌细胞株SKOV3、胰腺癌细胞株ASPC-1共培养，24小时后，收集肿瘤细胞，检测CD47的表达，以未与αCD47-Meso3CAR T细胞上清共培养的为对照。流式检测方法同上。
结果如图39所示，αCD47-Meso3CAR T细胞上清中的CD47抗体可以封闭肿瘤细胞表达CD47。
实施例45：封闭肿瘤细胞表面CD47可以提升巨噬细胞对其吞噬作用
1、巨噬细胞的分离及培养：Ficoll密度梯度离心法分离出外周血单核细胞(PBMC)，置于37℃，5％CO2培养箱贴壁培养4h，用预温的培养基洗去未贴壁细胞，加入AIM-V培养基及rhGM-CSF(终浓度1000U/ml)。隔两天半量换液，培养7天，得贴壁细胞，及为巨噬细胞。
2、巨噬细胞对肿瘤细胞的吞噬作用：将肿瘤细胞用Hoechst染料染成蓝色，将巨噬细胞用CM-Dil染成红色，具体染色方法见染料说明书。将染色好的两种细胞混合，分为两份，一份加入实施例2获得的Meso3CAR T细胞培养上清作为对照，一份加入实施例2获得的αCD47-Meso3CAR T细胞培养上清，共聚焦显微镜观察吞噬作用，并计数统计吞噬效率。
结果显示加入αCD47-Meso3CAR T细胞培养上清组其巨噬细胞的吞噬作用要明显高于对照组。统计结果如图40所示。
实施例46：αCD47-Meso3CAR T细胞体内抗肿瘤作用
购买4～6周龄NSG小鼠20只，平均分为5组，每组4只，接种肺癌细胞株H23，每只1×107个，成瘤10天后，分别尾静脉注射PBS和实施例2获得的Mock、Meso3CAR、wt-αCD47-Meso3CAR、αCD47-Meso3CAR T细胞(1×107个/只)，PBS组给予100ul PBS，观察记录肿瘤体积。
结果显示PBS、Mock、wt-αCD47-Meso3CAR T细胞对肿瘤模型没有治疗效果，而αCD47-Meso3CAR T细胞有很好的抗肿瘤效果。
具体如图41所示。
序列表
<110> 上海细胞治疗研究院
上海细胞治疗工程技术研究中心集团有限公司
<120> 抗体修饰的嵌合抗原受体修饰T细胞及其用途
<130> 17A314
<160> 25
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 497
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 1
Met Glu Ala Pro Ala Gln Leu Leu Phe Leu Leu Leu Leu Trp Leu Pro
1 5 10 15
Asp Thr Thr Gly Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys
20 25 30
Lys Pro Gly Ala Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr
35 40 45
Phe Thr Gly Tyr Tyr Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly
50 55 60
Leu Glu Trp Met Gly Trp Ile Asn Pro Asp Ser Gly Gly Thr Asn Tyr
65 70 75 80
Ala Gln Lys Phe Gln Gly Arg Val Thr Met Thr Arg Asp Thr Ser Ile
85 90 95
Ser Thr Ala Tyr Met Glu Leu Asn Arg Leu Arg Ser Asp Asp Thr Ala
100 105 110
Val Tyr Tyr Cys Ala Arg Asp Gln Pro Leu Gly Tyr Cys Thr Asn Gly
115 120 125
Val Cys Ser Tyr Phe Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val
130 135 140
Ser Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly
145 150 155 160
Ser Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Val Ser Ala Ser Val
165 170 175
Gly Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Gly Ile Tyr Ser
180 185 190
Trp Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Asn Leu Leu
195 200 205
Ile Tyr Thr Ala Ser Thr Leu Gln Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser
210 215 220
Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln
225 230 235 240
Pro Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Ala Asn Ile Phe Pro
245 250 255
Leu Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys Glu Ser Lys Tyr
260 265 270
Gly Pro Pro Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Phe Glu Gly Gly Pro
275 280 285
Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser
290 295 300
Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser Gln Glu Asp
305 310 315 320
Pro Glu Val Gln Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn
325 330 335
Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Phe Gln Ser Thr Tyr Arg Val
340 345 350
Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu
355 360 365
Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Gly Leu Pro Ser Ser Ile Glu Lys
370 375 380
Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr
385 390 395 400
Leu Pro Pro Ser Gln Glu Glu Met Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr
405 410 415
Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu
420 425 430
Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu
435 440 445
Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Arg Leu Thr Val Asp Lys
450 455 460
Ser Arg Trp Gln Glu Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu
465 470 475 480
Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Leu Gly
485 490 495
Lys
<210> 2
<211> 1491
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 2
atggaagccc cagctcagct tctcttcctc ctgctactct ggctcccaga taccaccgga 60
caggtgcagc tggtgcagtc tggggctgag gtgaagaagc ctggggcctc agtgaaggtc 120
tcctgcaagg cttctggata caccttcacc ggctactata tgcactgggt gcgacaggcc 180
cctggacaag ggcttgagtg gatgggatgg atcaaccctg acagtggtgg cacaaactat 240
gcacagaagt ttcagggcag ggtcaccatg accagggaca cgtccatcag cacagcctac 300
atggagctga acaggctgag atctgacgac acggccgtgt attactgtgc gagagatcag 360
cccctaggat attgtactaa tggtgtatgc tcctactttg actactgggg ccagggaacc 420
ctggtcaccg tctcctcagg tggaggcggt tcaggcggag gtggcagcgg cggtggcggg 480
tcggacatcc agatgaccca gtctccatct tccgtgtctg catctgtagg agacagagtc 540
accatcactt gtcgggcgag tcagggtatt tacagctggt tagcctggta tcagcagaaa 600
ccagggaaag cccctaacct cctgatctat actgcatcca ctttacaaag tggggtccca 660
tcaaggttca gcggcagtgg atctgggaca gatttcactc tcaccatcag cagcctgcaa 720
cctgaagatt ttgcaactta ctattgtcaa caggctaaca ttttcccgct cactttcggc 780
ggagggacca aggtggagat caaagagtcc aaatatggtc ccccatgccc accatgccca 840
gcacctgagt tcgagggggg accatcagtc ttcctgttcc ccccaaaacc caaggacact 900
ctcatgatct cccggacccc tgaggtcacg tgcgtggtgg tggacgtgag ccaggaagac 960
cccgaggtcc agttcaactg gtacgtggat ggcgtggagg tgcataatgc caagacaaag 1020
ccgcgggagg agcagttcca gagcacgtac cgtgtggtca gcgtcctcac cgtcctgcac 1080
caggactggc tgaacggcaa ggagtacaag tgcaaggtct ccaacaaagg cctcccgtcc 1140
tccatcgaga aaaccatctc caaagccaaa gggcagcccc gagagccaca ggtgtacacc 1200
ctgcccccat cccaggagga gatgaccaag aaccaggtca gcctgacctg cctggtcaaa 1260
ggcttctacc ccagcgacat cgccgtggag tgggagagca atgggcagcc ggagaacaac 1320
tacaagacca cgcctcccgt gctggactcc gacggctcct tcttcctcta cagcaggcta 1380
accgtggaca agagcaggtg gcaggagggg aatgtcttct catgctccgt gatgcatgag 1440
gctctgcaca accactacac acagaagagc ctctccctgt ctctgggtaa a 1491
<210> 3
<211> 495
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 3
Met Glu Ala Pro Ala Gln Leu Leu Phe Leu Leu Leu Leu Trp Leu Pro
1 5 10 15
Asp Thr Thr Gly Glu Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Ala Thr Leu Ser
20 25 30
Leu Ser Pro Gly Glu Arg Ala Thr Leu Ser Cys Arg Ala Ser Lys Gly
35 40 45
Val Ser Thr Ser Gly Tyr Ser Tyr Leu His Trp Tyr Gln Gln Lys Pro
50 55 60
Gly Gln Ala Pro Arg Leu Leu Ile Tyr Leu Ala Ser Tyr Leu Glu Ser
65 70 75 80
Gly Val Pro Ala Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr
85 90 95
Leu Thr Ile Ser Ser Leu Glu Pro Glu Asp Phe Ala Val Tyr Tyr Cys
100 105 110
Gln His Ser Arg Asp Leu Pro Leu Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val
115 120 125
Glu Ile Lys Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly
130 135 140
Gly Ser Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Val Glu Val Lys Lys Pro
145 150 155 160
Gly Ala Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr
165 170 175
Asn Tyr Tyr Met Tyr Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu
180 185 190
Trp Met Gly Gly Ile Asn Pro Ser Asn Gly Gly Thr Asn Phe Asn Glu
195 200 205
Lys Phe Lys Asn Arg Val Thr Leu Thr Thr Asp Ser Ser Thr Thr Thr
210 215 220
Ala Tyr Met Glu Leu Lys Ser Leu Gln Phe Asp Asp Thr Ala Val Tyr
225 230 235 240
Tyr Cys Ala Arg Arg Asp Tyr Arg Phe Asp Met Gly Phe Asp Tyr Trp
245 250 255
Gly Gln Gly Thr Thr Val Thr Val Ser Ser Glu Ser Lys Tyr Gly Pro
260 265 270
Pro Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Phe Glu Gly Gly Pro Ser Val
275 280 285
Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr
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Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser Gln Glu Asp Pro Glu
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Val Gln Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys
325 330 335
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Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys
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Cys Lys Val Ser Asn Lys Gly Leu Pro Ser Ser Ile Glu Lys Thr Ile
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Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro
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Pro Ser Gln Glu Glu Met Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu
405 410 415
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Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser
435 440 445
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<210> 4
<211> 1488
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 4
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aacggcggca ccaacttcaa cgagaagttc aagaaccggg tgaccctgac caccgactcc 660
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tactgcgcca ggcgggacta ccggttcgac atgggcttcg actactgggg ccagggcacc 780
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gagttcgagg ggggaccatc agtcttcctg ttccccccaa aacccaagga cactctcatg 900
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<211> 367
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<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 5
Met Glu Ala Pro Ala Gln Leu Leu Phe Leu Leu Leu Leu Trp Leu Pro
1 5 10 15
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130 135 140
Pro Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Phe Glu Gly Gly Pro Ser Val
145 150 155 160
Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr
165 170 175
Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser Gln Glu Asp Pro Glu
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Val Gln Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys
195 200 205
Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Phe Gln Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser
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Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys
225 230 235 240
Cys Lys Val Ser Asn Lys Gly Leu Pro Ser Ser Ile Glu Lys Thr Ile
245 250 255
Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro
260 265 270
Pro Ser Gln Glu Glu Met Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu
275 280 285
Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn
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Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Arg Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg
325 330 335
Trp Gln Glu Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu
340 345 350
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<210> 6
<211> 1104
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 6
atggaagccc cagctcagct tctcttcctc ctgctactct ggctcccaga taccaccgga 60
gaggaggagc tgcagatcat tcagcctgac aagtccgtgt tggttgcagc tggagagaca 120
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ggagctggac caggccgggt gttaatctac aatcaaagac agggcccctt cccccgggta 240
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ttcctgttcc ccccaaaacc caaggacact ctcatgatct cccggacccc tgaggtcacg 540
tgcgtggtgg tggacgtgag ccaggaagac cccgaggtcc agttcaactg gtacgtggat 600
ggcgtggagg tgcataatgc caagacaaag ccgcgggagg agcagttcca gagcacgtac 660
cgtgtggtca gcgtcctcac cgtcctgcac caggactggc tgaacggcaa ggagtacaag 720
tgcaaggtct ccaacaaagg cctcccgtcc tccatcgaga aaaccatctc caaagccaaa 780
gggcagcccc gagagccaca ggtgtacacc ctgcccccat cccaggagga gatgaccaag 840
aaccaggtca gcctgacctg cctggtcaaa ggcttctacc ccagcgacat cgccgtggag 900
tgggagagca atgggcagcc ggagaacaac tacaagacca cgcctcccgt gctggactcc 960
gacggctcct tcttcctcta cagcaggcta accgtggaca agagcaggtg gcaggagggg 1020
aatgtcttct catgctccgt gatgcatgag gctctgcaca accactacac acagaagagc 1080
ctctccctgt ctctgggtaa atga 1104
<210> 7
<211> 486
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 7
Met Ala Leu Pro Val Thr Ala Leu Leu Leu Pro Leu Ala Leu Leu Leu
1 5 10 15
His Ala Ala Arg Pro Asp Ile Gln Met Thr Gln Thr Thr Ser Ser Leu
20 25 30
Ser Ala Ser Leu Gly Asp Arg Val Thr Ile Ser Cys Arg Ala Ser Gln
35 40 45
Asp Ile Ser Lys Tyr Leu Asn Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Asp Gly Thr
50 55 60
Val Lys Leu Leu Ile Tyr His Thr Ser Arg Leu His Ser Gly Val Pro
65 70 75 80
Ser Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Tyr Ser Leu Thr Ile
85 90 95
Ser Asn Leu Glu Gln Glu Asp Ile Ala Thr Tyr Phe Cys Gln Gln Gly
100 105 110
Asn Thr Leu Pro Tyr Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Ile Thr
115 120 125
Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Glu
130 135 140
Val Lys Leu Gln Glu Ser Gly Pro Gly Leu Val Ala Pro Ser Gln Ser
145 150 155 160
Leu Ser Val Thr Cys Thr Val Ser Gly Val Ser Leu Pro Asp Tyr Gly
165 170 175
Val Ser Trp Ile Arg Gln Pro Pro Arg Lys Gly Leu Glu Trp Leu Gly
180 185 190
Val Ile Trp Gly Ser Glu Thr Thr Tyr Tyr Asn Ser Ala Leu Lys Ser
195 200 205
Arg Leu Thr Ile Ile Lys Asp Asn Ser Lys Ser Gln Val Phe Leu Lys
210 215 220
Met Asn Ser Leu Gln Thr Asp Asp Thr Ala Ile Tyr Tyr Cys Ala Lys
225 230 235 240
His Tyr Tyr Tyr Gly Gly Ser Tyr Ala Met Asp Tyr Trp Gly Gln Gly
245 250 255
Thr Ser Val Thr Val Ser Ser Thr Thr Thr Pro Ala Pro Arg Pro Pro
260 265 270
Thr Pro Ala Pro Thr Ile Ala Ser Gln Pro Leu Ser Leu Arg Pro Glu
275 280 285
Ala Cys Arg Pro Ala Ala Gly Gly Ala Val His Thr Arg Gly Leu Asp
290 295 300
Phe Ala Cys Asp Ile Tyr Ile Trp Ala Pro Leu Ala Gly Thr Cys Gly
305 310 315 320
Val Leu Leu Leu Ser Leu Val Ile Thr Leu Tyr Cys Lys Arg Gly Arg
325 330 335
Lys Lys Leu Leu Tyr Ile Phe Lys Gln Pro Phe Met Arg Pro Val Gln
340 345 350
Thr Thr Gln Glu Glu Asp Gly Cys Ser Cys Arg Phe Pro Glu Glu Glu
355 360 365
Glu Gly Gly Cys Glu Leu Arg Val Lys Phe Ser Arg Ser Ala Asp Ala
370 375 380
Pro Ala Tyr Gln Gln Gly Gln Asn Gln Leu Tyr Asn Glu Leu Asn Leu
385 390 395 400
Gly Arg Arg Glu Glu Tyr Asp Val Leu Asp Lys Arg Arg Gly Arg Asp
405 410 415
Pro Glu Met Gly Gly Lys Pro Arg Arg Lys Asn Pro Gln Glu Gly Leu
420 425 430
Tyr Asn Glu Leu Gln Lys Asp Lys Met Ala Glu Ala Tyr Ser Glu Ile
435 440 445
Gly Met Lys Gly Glu Arg Arg Arg Gly Lys Gly His Asp Gly Leu Tyr
450 455 460
Gln Gly Leu Ser Thr Ala Thr Lys Asp Thr Tyr Asp Ala Leu His Met
465 470 475 480
Gln Ala Leu Pro Pro Arg
485
<210> 8
<211> 1461
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 8
atggccttac cagtgaccgc cttgctcctg ccgctggcct tgctgctcca cgccgccagg 60
ccggacatcc agatgacaca gactacatcc tccctgtctg cctctctggg agacagagtc 120
accatcagtt gcagggcaag tcaggacatt agtaaatatt taaattggta tcagcagaaa 180
ccagatggaa ctgttaaact cctgatctac catacatcaa gattacactc aggagtccca 240
tcaaggttca gtggcagtgg gtctggaaca gattattctc tcaccattag caacctggag 300
caagaagata ttgccactta cttttgccaa cagggtaata cgcttccgta cacgttcgga 360
ggggggacta agttggaaat aacaggtgga ggcggttcag gcggaggtgg cagcggcggt 420
ggcgggtcgg aggtgaaact gcaggagtca ggacctggcc tggtggcgcc ctcacagagc 480
ctgtccgtca catgcactgt ctcaggggtc tcattacccg actatggtgt aagctggatt 540
cgccagcctc cacgaaaggg tctggagtgg ctgggagtaa tatggggtag tgaaaccaca 600
tactataatt cagctctcaa atccagactg accatcatca aggacaactc caagagccaa 660
gttttcttaa aaatgaacag tctgcaaact gatgacacag ccatttacta ctgtgccaaa 720
cattattact acggtggtag ctatgctatg gactactggg gtcaaggaac ctcagtcacc 780
gtctcctcaa ccacgacgcc agcgccgcga ccaccaacac cggcgcccac catcgcgtcg 840
cagcccctgt ccctgcgccc agaggcgtgc cggccagcgg cggggggcgc agtgcacacg 900
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tatatattca aacaaccatt tatgagacca gtacaaacta ctcaagagga agatggctgt 1080
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ggaaagccga gaaggaagaa ccctcaggaa ggcctgtaca atgaactgca gaaagataag 1320
atggcggagg cctacagtga gattgggatg aaaggcgagc gccggagggg caaggggcac 1380
gatggccttt accagggtct cagtacagcc accaaggaca cctacgacgc ccttcacatg 1440
caggccctgc cccctcgctg a 1461
<210> 9
<211> 681
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 9
Met Ala Leu Pro Val Thr Ala Leu Leu Leu Pro Leu Ala Leu Leu Leu
1 5 10 15
His Ala Ala Arg Pro Ser Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly
20 25 30
Leu Val Gln Pro Gly Gly Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly
35 40 45
Phe Asp Leu Gly Phe Tyr Phe Tyr Ala Cys Trp Val Arg Gln Ala Pro
50 55 60
Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val Ser Cys Ile Tyr Thr Ala Gly Ser Gly
65 70 75 80
Ser Thr Tyr Tyr Ala Ser Trp Ala Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg
85 90 95
Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala
100 105 110
Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ala Arg Ser Thr Ala Asn Thr Arg
115 120 125
Ser Thr Tyr Tyr Leu Asn Leu Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val
130 135 140
Ser Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly
145 150 155 160
Ser Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val
165 170 175
Gly Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Gln Ala Ser Gln Arg Ile Ser Ser
180 185 190
Tyr Leu Ser Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Val Pro Lys Leu Leu
195 200 205
Ile Tyr Gly Ala Ser Thr Leu Ala Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser
210 215 220
Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln
225 230 235 240
Pro Glu Asp Val Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Ser Tyr Ala Tyr Phe Asp
245 250 255
Ser Asn Asn Trp His Ala Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys
260 265 270
Glu Ser Lys Tyr Gly Pro Pro Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Pro Val
275 280 285
Ala Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu
290 295 300
Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser
305 310 315 320
Gln Glu Asp Pro Glu Val Gln Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu
325 330 335
Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Phe Gln Ser Thr
340 345 350
Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn
355 360 365
Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Gly Leu Pro Ser Ser
370 375 380
Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln
385 390 395 400
Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Gln Glu Glu Met Thr Lys Asn Gln Val
405 410 415
Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val
420 425 430
Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro
435 440 445
Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Arg Leu Thr
450 455 460
Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Glu Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val
465 470 475 480
Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu
485 490 495
Ser Leu Gly Lys Pro Phe Trp Val Leu Val Val Val Gly Gly Val Leu
500 505 510
Ala Cys Tyr Ser Leu Leu Val Thr Val Ala Phe Ile Ile Phe Trp Val
515 520 525
Arg Ser Lys Arg Ser Arg Leu Leu His Ser Asp Tyr Met Asn Met Thr
530 535 540
Pro Arg Arg Pro Gly Pro Thr Arg Lys His Tyr Gln Pro Tyr Ala Pro
545 550 555 560
Pro Arg Asp Phe Ala Ala Tyr Arg Ser Arg Val Lys Phe Ser Arg Ser
565 570 575
Ala Asp Ala Pro Ala Tyr Gln Gln Gly Gln Asn Gln Leu Tyr Asn Glu
580 585 590
Leu Asn Leu Gly Arg Arg Glu Glu Tyr Asp Val Leu Asp Lys Arg Arg
595 600 605
Gly Arg Asp Pro Glu Met Gly Gly Lys Pro Arg Arg Lys Asn Pro Gln
610 615 620
Glu Gly Leu Tyr Asn Glu Leu Gln Lys Asp Lys Met Ala Glu Ala Tyr
625 630 635 640
Ser Glu Ile Gly Met Lys Gly Glu Arg Arg Arg Gly Lys Gly His Asp
645 650 655
Gly Leu Tyr Gln Gly Leu Ser Thr Ala Thr Lys Asp Thr Tyr Asp Ala
660 665 670
Leu His Met Gln Ala Leu Pro Pro Arg
675 680
<210> 10
<211> 2043
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 10
atggccttac cagtgaccgc cttgctcctg ccgctggcct tgctgctcca cgccgccagg 60
ccgagcgagg tgcagctggt ggagtccggg ggaggcctgg tccagcctgg gggatccctg 120
agactctcct gcgcagcctc tggattcgac ctcggtttct acttttacgc ctgttgggtc 180
cgccaggctc cagggaaggg cctggagtgg gtctcatgca tttatactgc tggtagtggt 240
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gcgagatcta ctgctaatac tagaagtact tattatctta acttgtgggg ccaaggcacc 420
ctggtcaccg tctcctcagg cggaggcgga tcaggtggtg gcggatctgg aggtggcgga 480
agcgacatcc agatgaccca gtctccatcc tccctgtctg catctgtggg agacagagtc 540
accatcactt gccaggccag tcagaggatt agtagttact tatcctggta tcagcagaaa 600
ccagggaaag ttcccaagct cctgatctat ggtgcatcca ctctggcatc tggggtcccc 660
tcgcggttca gtggcagtgg atctgggaca gatttcactc tcaccatcag cagcctgcag 720
cctgaagatg ttgccactta ctactgtcag agttatgctt attttgatag taataattgg 780
catgctttcg gcggagggac caaggtggag atcaaagagt ccaaatatgg tcccccatgc 840
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ccacgcgact tcgcagccta tcgctccaga gtgaagttca gcaggagcgc agacgccccc 1740
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agtgagattg ggatgaaagg cgagcgccgg aggggcaagg ggcacgatgg cctttaccag 1980
ggtctcagta cagccaccaa ggacacctac gacgcccttc acatgcaggc cctgccccct 2040
cgc 2043
<210> 11
<211> 679
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 11
Met Glu Ala Pro Ala Gln Leu Leu Phe Leu Leu Leu Leu Trp Leu Pro
1 5 10 15
Asp Thr Thr Gly Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val
20 25 30
Gln Pro Gly Gly Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Asp
35 40 45
Leu Gly Phe Tyr Phe Tyr Ala Cys Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys
50 55 60
Gly Leu Glu Trp Val Ser Cys Ile Tyr Thr Ala Gly Ser Gly Ser Thr
65 70 75 80
Tyr Tyr Ala Ser Trp Ala Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn
85 90 95
Ser Lys Asn Thr Leu Tyr Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp
100 105 110
Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ala Arg Ser Thr Ala Asn Thr Arg Ser Thr
115 120 125
Tyr Tyr Leu Asn Leu Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser
130 135 140
Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Asp
145 150 155 160
Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly Asp
165 170 175
Arg Val Thr Ile Thr Cys Gln Ala Ser Gln Arg Ile Ser Ser Tyr Leu
180 185 190
Ser Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Val Pro Lys Leu Leu Ile Tyr
195 200 205
Gly Ala Ser Thr Leu Ala Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly Ser
210 215 220
Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro Glu
225 230 235 240
Asp Val Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Ser Tyr Ala Tyr Phe Asp Ser Asn
245 250 255
Asn Trp His Ala Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys Glu Ser
260 265 270
Lys Tyr Gly Pro Pro Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Pro Val Ala Gly
275 280 285
Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile
290 295 300
Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser Gln Glu
305 310 315 320
Asp Pro Glu Val Gln Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His
325 330 335
Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Phe Gln Ser Thr Tyr Arg
340 345 350
Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys
355 360 365
Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Gly Leu Pro Ser Ser Ile Glu
370 375 380
Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr
385 390 395 400
Thr Leu Pro Pro Ser Gln Glu Glu Met Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu
405 410 415
Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp
420 425 430
Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val
435 440 445
Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Arg Leu Thr Val Asp
450 455 460
Lys Ser Arg Trp Gln Glu Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His
465 470 475 480
Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Leu
485 490 495
Gly Lys Pro Phe Trp Val Leu Val Val Val Gly Gly Val Leu Ala Cys
500 505 510
Tyr Ser Leu Leu Val Thr Val Ala Phe Ile Ile Phe Trp Val Arg Ser
515 520 525
Lys Arg Ser Arg Leu Leu His Ser Asp Tyr Met Asn Met Thr Pro Arg
530 535 540
Arg Pro Gly Pro Thr Arg Lys His Tyr Gln Pro Tyr Ala Pro Pro Arg
545 550 555 560
Asp Phe Ala Ala Tyr Arg Ser Arg Val Lys Phe Ser Arg Ser Ala Asp
565 570 575
Ala Pro Ala Tyr Gln Gln Gly Gln Asn Gln Leu Tyr Asn Glu Leu Asn
580 585 590
Leu Gly Arg Arg Glu Glu Tyr Asp Val Leu Asp Lys Arg Arg Gly Arg
595 600 605
Asp Pro Glu Met Gly Gly Lys Pro Arg Arg Lys Asn Pro Gln Glu Gly
610 615 620
Leu Tyr Asn Glu Leu Gln Lys Asp Lys Met Ala Glu Ala Tyr Ser Glu
625 630 635 640
Ile Gly Met Lys Gly Glu Arg Arg Arg Gly Lys Gly His Asp Gly Leu
645 650 655
Tyr Gln Gly Leu Ser Thr Ala Thr Lys Asp Thr Tyr Asp Ala Leu His
660 665 670
Met Gln Ala Leu Pro Pro Arg
675
<210> 12
<211> 2040
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 12
atggaagccc cagctcagct tctcttcctc ctgctactct ggctcccaga taccaccgga 60
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ttcggcggag ggaccaaggt ggagatcaaa gagtccaaat atggtccccc atgcccacca 840
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gaccccgagg tccagttcaa ctggtacgtg gatggcgtgg aggtgcataa tgccaagaca 1020
aagccgcggg aggagcagtt ccagagcacg taccgtgtgg tcagcgtcct caccgtcctg 1080
caccaggact ggctgaacgg caaggagtac aagtgcaagg tctccaacaa aggcctcccg 1140
tcctccatcg agaaaaccat ctccaaagcc aaagggcagc cccgagagcc acaggtgtac 1200
accctgcccc catcccagga ggagatgacc aagaaccagg tcagcctgac ctgcctggtc 1260
aaaggcttct accccagcga catcgccgtg gagtgggaga gcaatgggca gccggagaac 1320
aactacaaga ccacgcctcc cgtgctggac tccgacggct ccttcttcct ctacagcagg 1380
ctaaccgtgg acaagagcag gtggcaggag gggaatgtct tctcatgctc cgtgatgcat 1440
gaggctctgc acaaccacta cacacagaag agcctctccc tgtctctggg taaacccttt 1500
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tttattattt tctgggtgag gagtaagagg agcaggctcc tgcacagtga ctacatgaac 1620
atgactcccc gccgccccgg gcccacccgc aagcattacc agccctatgc cccaccacgc 1680
gacttcgcag cctatcgctc cagagtgaag ttcagcagga gcgcagacgc ccccgcgtac 1740
cagcagggcc agaaccagct ctataacgag ctcaatctag gacgaagaga ggagtacgat 1800
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agtacagcca ccaaggacac ctacgacgcc cttcacatgc aggccctgcc ccctcgctga 2040
<210> 13
<211> 580
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 13
Met Ala Leu Pro Val Thr Ala Leu Leu Leu Pro Leu Ala Leu Leu Leu
1 5 10 15
His Ala Ala Arg Pro Ser Val Val Ser His Phe Asn Asp Cys Pro Leu
20 25 30
Ser His Asp Gly Tyr Cys Leu His Asp Gly Val Cys Met Tyr Ile Glu
35 40 45
Ala Leu Asp Lys Tyr Ala Cys Asn Cys Val Val Gly Tyr Ile Gly Glu
50 55 60
Arg Cys Gln Tyr Arg Asp Leu Lys Trp Trp Glu Leu Arg Glu Ala Ala
65 70 75 80
Ala Lys Glu Ala Ala Ala Lys Glu Ala Ala Ala Lys Gly Thr His Ser
85 90 95
Leu Pro Pro Arg Pro Ala Ala Val Pro Val Pro Leu Arg Met Gln Pro
100 105 110
Gly Pro Ala His Pro Val Leu Ser Phe Leu Arg Pro Ser Trp Asp Leu
115 120 125
Val Ser Ala Phe Tyr Ser Leu Pro Leu Ala Pro Leu Ser Pro Thr Ser
130 135 140
Val Pro Ile Ser Pro Val Ser Val Gly Arg Gly Pro Asp Pro Asp Ala
145 150 155 160
His Val Ala Val Asp Leu Ser Arg Tyr Glu Gly Glu Ser Lys Tyr Gly
165 170 175
Pro Pro Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Pro Val Ala Gly Pro Ser Val
180 185 190
Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr
195 200 205
Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser Gln Glu Asp Pro Glu
210 215 220
Val Gln Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys
225 230 235 240
Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Phe Gln Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser
245 250 255
Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys
260 265 270
Cys Lys Val Ser Asn Lys Gly Leu Pro Ser Ser Ile Glu Lys Thr Ile
275 280 285
Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro
290 295 300
Pro Ser Gln Glu Glu Met Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu
305 310 315 320
Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn
325 330 335
Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser
340 345 350
Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Arg Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg
355 360 365
Trp Gln Glu Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu
370 375 380
His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Leu Gly Lys Pro
385 390 395 400
Phe Trp Val Leu Val Val Val Gly Gly Val Leu Ala Cys Tyr Ser Leu
405 410 415
Leu Val Thr Val Ala Phe Ile Ile Phe Trp Val Arg Ser Lys Arg Ser
420 425 430
Arg Leu Leu His Ser Asp Tyr Met Asn Met Thr Pro Arg Arg Pro Gly
435 440 445
Pro Thr Arg Lys His Tyr Gln Pro Tyr Ala Pro Pro Arg Asp Phe Ala
450 455 460
Ala Tyr Arg Ser Arg Val Lys Phe Ser Arg Ser Ala Asp Ala Pro Ala
465 470 475 480
Tyr Gln Gln Gly Gln Asn Gln Leu Tyr Asn Glu Leu Asn Leu Gly Arg
485 490 495
Arg Glu Glu Tyr Asp Val Leu Asp Lys Arg Arg Gly Arg Asp Pro Glu
500 505 510
Met Gly Gly Lys Pro Arg Arg Lys Asn Pro Gln Glu Gly Leu Tyr Asn
515 520 525
Glu Leu Gln Lys Asp Lys Met Ala Glu Ala Tyr Ser Glu Ile Gly Met
530 535 540
Lys Gly Glu Arg Arg Arg Gly Lys Gly His Asp Gly Leu Tyr Gln Gly
545 550 555 560
Leu Ser Thr Ala Thr Lys Asp Thr Tyr Asp Ala Leu His Met Gln Ala
565 570 575
Leu Pro Pro Arg
580
<210> 14
<211> 1740
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 14
atggccttac cagtgaccgc cttgctcctg ccgctggcct tgctgctcca cgccgccagg 60
ccgagcgtgg tgtcccattt taatgactgt cccctgtccc acgatgggta ctgcctccat 120
gatggtgtgt gcatgtatat tgaagcattg gacaagtatg catgcaactg tgttgttggc 180
tacatcgggg agcgatgtca gtaccgagac ctgaagtggt gggaactgcg cgaagctgcc 240
gctaaggagg ccgcagccaa agaggccgct gcaaagggca cccacagcct gcccccccgc 300
cccgccgccg tgcccgtgcc cctgcgcatg cagcccggcc ccgcccaccc cgtgctgagc 360
ttcctgcgcc ccagctggga cctggtgagc gccttctaca gcctgcccct ggcccccctg 420
agccccacca gcgtgcccat cagccccgtg agcgtgggcc gcggccccga ccccgacgcc 480
cacgtggccg tggacctgag ccgctacgag ggcgagtcca aatatggtcc cccatgccca 540
ccatgcccag cacctcccgt ggccggacca tcagtcttcc tgttcccccc aaaacccaag 600
gacactctca tgatctcccg gacccctgag gtcacgtgcg tggtggtgga cgtgagccag 660
gaagaccccg aggtccagtt caactggtac gtggatggcg tggaggtgca taatgccaag 720
acaaagccgc gggaggagca gttccagagc acgtaccgtg tggtcagcgt cctcaccgtc 780
ctgcaccagg actggctgaa cggcaaggag tacaagtgca aggtctccaa caaaggcctc 840
ccgtcctcca tcgagaaaac catctccaaa gccaaagggc agccccgaga gccacaggtg 900
tacaccctgc ccccatccca ggaggagatg accaagaacc aggtcagcct gacctgcctg 960
gtcaaaggct tctaccccag cgacatcgcc gtggagtggg agagcaatgg gcagccggag 1020
aacaactaca agaccacgcc tcccgtgctg gactccgacg gctccttctt cctctacagc 1080
aggctaaccg tggacaagag caggtggcag gaggggaatg tcttctcatg ctccgtgatg 1140
catgaggctc tgcacaacca ctacacacag aagagcctct ccctgtctct gggtaaaccc 1200
ttttgggtgc tggtggtggt tggtggagtc ctggcttgct atagcttgct agtaacagtg 1260
gcctttatta ttttctgggt gaggagtaag aggagcaggc tcctgcacag tgactacatg 1320
aacatgactc cccgccgccc cgggcccacc cgcaagcatt accagcccta tgccccacca 1380
cgcgacttcg cagcctatcg ctccagagtg aagttcagca ggagcgcaga cgcccccgcg 1440
taccagcagg gccagaacca gctctataac gagctcaatc taggacgaag agaggagtac 1500
gatgttttgg acaagagacg tggccgggac cctgagatgg ggggaaagcc gagaaggaag 1560
aaccctcagg aaggcctgta caatgaactg cagaaagata agatggcgga ggcctacagt 1620
gagattggga tgaaaggcga gcgccggagg ggcaaggggc acgatggcct ttaccagggt 1680
ctcagtacag ccaccaagga cacctacgac gcccttcaca tgcaggccct gccccctcgc 1740
<210> 15
<211> 678
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 15
Met Ala Leu Pro Val Thr Ala Leu Leu Leu Pro Leu Ala Leu Leu Leu
1 5 10 15
His Ala Ala Arg Pro Ser Asp Ile Val Ile Thr Gln Ser Thr Ala Ser
20 25 30
Leu Gly Val Ser Leu Gly Gln Arg Ala Thr Ile Ser Cys Arg Ala Ser
35 40 45
Lys Ser Val Ser Thr Ser Gly Tyr Ser Tyr Met His Trp Tyr Gln Gln
50 55 60
Arg Pro Gly Gln Pro Pro Lys Leu Leu Ile Tyr Leu Ala Ser Asn Leu
65 70 75 80
Glu Ser Gly Val Pro Ala Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp
85 90 95
Phe Thr Leu Asn Ile His Pro Val Glu Glu Glu Asp Ala Ala Thr Tyr
100 105 110
Tyr Cys Gln His Ser Arg Glu Leu Pro Phe Thr Phe Gly Gly Gly Thr
115 120 125
Lys Leu Glu Ile Lys Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly
130 135 140
Gly Gly Gly Ser Glu Val Gln Leu Glu Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val
145 150 155 160
Lys Pro Gly Gly Ser Leu Lys Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr
165 170 175
Phe Ser Gly Tyr Ala Met Ser Trp Val Arg Gln Thr Pro Glu Lys Arg
180 185 190
Leu Glu Trp Val Ala Thr Ile Ser Ser Gly Gly Thr Tyr Ile Tyr Tyr
195 200 205
Pro Asp Ser Val Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys
210 215 220
Asn Thr Leu Tyr Leu Gln Met Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala
225 230 235 240
Met Tyr Tyr Cys Ala Arg Leu Gly Gly Asp Asn Tyr Tyr Glu Tyr Phe
245 250 255
Asp Val Trp Gly Ala Gly Thr Thr Val Thr Val Ser Ser Glu Ser Lys
260 265 270
Tyr Gly Pro Pro Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Pro Val Ala Gly Pro
275 280 285
Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser
290 295 300
Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser Gln Glu Asp
305 310 315 320
Pro Glu Val Gln Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn
325 330 335
Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Phe Gln Ser Thr Tyr Arg Val
340 345 350
Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu
355 360 365
Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Gly Leu Pro Ser Ser Ile Glu Lys
370 375 380
Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr
385 390 395 400
Leu Pro Pro Ser Gln Glu Glu Met Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr
405 410 415
Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu
420 425 430
Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu
435 440 445
Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Arg Leu Thr Val Asp Lys
450 455 460
Ser Arg Trp Gln Glu Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu
465 470 475 480
Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Leu Gly
485 490 495
Lys Pro Phe Trp Val Leu Val Val Val Gly Gly Val Leu Ala Cys Tyr
500 505 510
Ser Leu Leu Val Thr Val Ala Phe Ile Ile Phe Trp Val Arg Ser Lys
515 520 525
Arg Ser Arg Leu Leu His Ser Asp Tyr Met Asn Met Thr Pro Arg Arg
530 535 540
Pro Gly Pro Thr Arg Lys His Tyr Gln Pro Tyr Ala Pro Pro Arg Asp
545 550 555 560
Phe Ala Ala Tyr Arg Ser Arg Val Lys Phe Ser Arg Ser Ala Asp Ala
565 570 575
Pro Ala Tyr Gln Gln Gly Gln Asn Gln Leu Tyr Asn Glu Leu Asn Leu
580 585 590
Gly Arg Arg Glu Glu Tyr Asp Val Leu Asp Lys Arg Arg Gly Arg Asp
595 600 605
Pro Glu Met Gly Gly Lys Pro Arg Arg Lys Asn Pro Gln Glu Gly Leu
610 615 620
Tyr Asn Glu Leu Gln Lys Asp Lys Met Ala Glu Ala Tyr Ser Glu Ile
625 630 635 640
Gly Met Lys Gly Glu Arg Arg Arg Gly Lys Gly His Asp Gly Leu Tyr
645 650 655
Gln Gly Leu Ser Thr Ala Thr Lys Asp Thr Tyr Asp Ala Leu His Met
660 665 670
Gln Ala Leu Pro Pro Arg
675
<210> 16
<211> 2037
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 16
atggccttac cagtgaccgc cttgctcctg ccgctggcct tgctgctcca cgccgccagg 60
ccgagcgaca ttgtgatcac acagtctaca gcttccttag gtgtatctct ggggcagagg 120
gccaccatct catgcagggc cagcaaaagt gtcagtacat ctggctatag ttatatgcac 180
tggtaccaac agagaccagg acagccaccc aaactcctca tctatcttgc atccaaccta 240
gaatctgggg tccctgccag gttcagtggc agtgggtctg ggacagactt caccctcaac 300
atccatcctg tggaggagga ggatgctgca acctattact gtcagcacag tagggagctt 360
ccgttcacgt tcggaggggg gaccaagctg gagataaaag gtggaggcgg ttcaggcgga 420
ggtggcagcg gcggtggcgg gtcggaggtc cagctggagg agtcaggggg aggcttagtg 480
aagcctggag ggtccctgaa actctcctgt gcagcctctg gattcacttt cagtggctat 540
gccatgtctt gggttcgcca gactccggag aagaggctgg agtgggtcgc aaccattagt 600
agtggtggta cttatatcta ctatccagac agtgtgaagg ggcgattcac catctccaga 660
gacaatgcca agaacaccct gtacctgcaa atgagcagtc tgaggtctga ggacacggcc 720
atgtattact gtgcaagact tgggggggat aattactacg aatacttcga tgtctggggc 780
gcagggacca cggtcaccgt ctcctccgag tccaaatatg gtcccccatg cccaccatgc 840
ccagcacctc ccgtggccgg accatcagtc ttcctgttcc ccccaaaacc caaggacact 900
ctcatgatct cccggacccc tgaggtcacg tgcgtggtgg tggacgtgag ccaggaagac 960
cccgaggtcc agttcaactg gtacgtggat ggcgtggagg tgcataatgc caagacaaag 1020
ccgcgggagg agcagttcca gagcacgtac cgtgtggtca gcgtcctcac cgtcctgcac 1080
caggactggc tgaacggcaa ggagtacaag tgcaaggtct ccaacaaagg cctcccgtcc 1140
tccatcgaga aaaccatctc caaagccaaa gggcagcccc gagagccaca ggtgtacacc 1200
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accgtggaca agagcaggtg gcaggagggg aatgtcttct catgctccgt gatgcatgag 1440
gctctgcaca accactacac acagaagagc ctctccctgt ctctgggtaa acccttttgg 1500
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attattttct gggtgaggag taagaggagc aggctcctgc acagtgacta catgaacatg 1620
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ttcgcagcct atcgctccag agtgaagttc agcaggagcg cagacgcccc cgcgtaccag 1740
cagggccaga accagctcta taacgagctc aatctaggac gaagagagga gtacgatgtt 1800
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caggaaggcc tgtacaatga actgcagaaa gataagatgg cggaggccta cagtgagatt 1920
gggatgaaag gcgagcgccg gaggggcaag gggcacgatg gcctttacca gggtctcagt 1980
acagccacca aggacaccta cgacgccctt cacatgcagg ccctgccccc tcgctga 2037
<210> 17
<211> 497
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 17
Met Ala Leu Pro Val Thr Ala Leu Leu Leu Pro Leu Ala Leu Leu Leu
1 5 10 15
His Ala Ala Arg Pro Ser Asp Ile Leu Leu Thr Gln Ser Pro Val Ile
20 25 30
Leu Ser Val Ser Pro Gly Glu Arg Val Ser Phe Ser Cys Arg Ala Ser
35 40 45
Gln Ser Ile Gly Thr Asn Ile His Trp Tyr Gln Gln Arg Thr Asn Gly
50 55 60
Ser Pro Arg Leu Leu Ile Lys Tyr Ala Ser Glu Ser Ile Ser Gly Ile
65 70 75 80
Pro Ser Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Ser
85 90 95
Ile Asn Ser Val Glu Ser Glu Asp Ile Ala Asp Tyr Tyr Cys Gln Gln
100 105 110
Asn Asn Asn Trp Pro Thr Thr Phe Gly Ala Gly Thr Lys Leu Glu Leu
115 120 125
Lys Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser
130 135 140
Gln Val Gln Leu Lys Gln Ser Gly Pro Gly Leu Val Gln Pro Ser Gln
145 150 155 160
Ser Leu Ser Ile Thr Cys Thr Val Ser Gly Phe Ser Leu Thr Asn Tyr
165 170 175
Gly Val His Trp Val Arg Gln Ser Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Leu
180 185 190
Gly Val Ile Trp Ser Gly Gly Asn Thr Asp Tyr Asn Thr Pro Phe Thr
195 200 205
Ser Arg Leu Ser Ile Asn Lys Asp Asn Ser Lys Ser Gln Val Phe Phe
210 215 220
Lys Met Asn Ser Leu Gln Ser Asn Asp Thr Ala Ile Tyr Tyr Cys Ala
225 230 235 240
Arg Ala Leu Thr Tyr Tyr Asp Tyr Glu Phe Ala Tyr Trp Gly Gln Gly
245 250 255
Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Phe Val Pro Val Phe Leu Pro Ala Lys
260 265 270
Pro Thr Thr Thr Pro Ala Pro Arg Pro Pro Thr Pro Ala Pro Thr Ile
275 280 285
Ala Ser Gln Pro Leu Ser Leu Arg Pro Glu Ala Cys Arg Pro Ala Ala
290 295 300
Gly Gly Ala Val His Thr Arg Gly Leu Asp Phe Ala Cys Asp Ile Tyr
305 310 315 320
Ile Trp Ala Pro Leu Ala Gly Thr Cys Gly Val Leu Leu Leu Ser Leu
325 330 335
Val Ile Thr Leu Tyr Cys Asn His Arg Ser Lys Arg Ser Arg Leu Leu
340 345 350
His Ser Asp Tyr Met Asn Met Thr Pro Arg Arg Pro Gly Pro Thr Arg
355 360 365
Lys His Tyr Gln Pro Tyr Ala Pro Pro Arg Asp Phe Ala Ala Tyr Arg
370 375 380
Ser Arg Val Lys Phe Ser Arg Ser Ala Asp Ala Pro Ala Tyr Gln Gln
385 390 395 400
Gly Gln Asn Gln Leu Tyr Asn Glu Leu Asn Leu Gly Arg Arg Glu Glu
405 410 415
Tyr Asp Val Leu Asp Lys Arg Arg Gly Arg Asp Pro Glu Met Gly Gly
420 425 430
Lys Pro Arg Arg Lys Asn Pro Gln Glu Gly Leu Tyr Asn Glu Leu Gln
435 440 445
Lys Asp Lys Met Ala Glu Ala Tyr Ser Glu Ile Gly Met Lys Gly Glu
450 455 460
Arg Arg Arg Gly Lys Gly His Asp Gly Leu Tyr Gln Gly Leu Ser Thr
465 470 475 480
Ala Thr Lys Asp Thr Tyr Asp Ala Leu His Met Gln Ala Leu Pro Pro
485 490 495
Arg
<210> 18
<211> 1494
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 18
atggccttac cagtgaccgc cttgctcctg ccgctggcct tgctgctcca cgccgccagg 60
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ccttccaggt ttagtggcag tggatcaggg acagatttta ctcttagcat caacagtgtg 300
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caagttttct ttaaaatgaa cagtctgcaa tctaatgaca cagccatata ttactgtgcc 720
agagccctca cctactatga ttacgagttt gcttactggg gccaagggac tctggtcact 780
gtctcttcgt tcgtgccggt cttcctgcca gcgaagccca ccacgacgcc agcgccgcga 840
ccaccaacac cggcgcccac catcgcgtcg cagcccctgt ccctgcgccc agaggcgtgc 900
cggccagcgg cggggggcgc agtgcacacg agggggctgg acttcgcctg tgatatctac 960
atctgggcgc ccctggccgg gacttgtggg gtccttctcc tgtcactggt tatcaccctt 1020
tactgcaacc acaggagtaa gaggagcagg ctcctgcaca gtgactacat gaacatgact 1080
ccccgccgcc ccgggcccac ccgcaagcat taccagccct atgccccacc acgcgacttc 1140
gcagcctatc gctccagagt gaagttcagc aggagcgcag acgcccccgc gtaccagcag 1200
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gacaagagac gtggccggga ccctgagatg gggggaaagc cgagaaggaa gaaccctcag 1320
gaaggcctgt acaatgaact gcagaaagat aagatggcgg aggcctacag tgagattggg 1380
atgaaaggcg agcgccggag gggcaagggg cacgatggcc tttaccaggg tctcagtaca 1440
gccaccaagg acacctacga cgcccttcac atgcaggccc tgccccctcg ctga 1494
<210> 19
<211> 78
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 19
cgtaggaaac gaggcagcgg cgccacaaac ttctctctgc taaagcaagc aggtgatgtt 60
gaagaaaacc ccgggcct 78
<210> 20
<211> 197
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 20
ccggcgggtt tctgacatcc ggcgggtttc tgacatccgg cgggtttctg acatccggcg 60
ggtttctgac atccggcggg tttctgacat ccggcgggtt tctgacatcc ggcgggtttc 120
tgacatccgg cgggtttctg acatccggcg ggtttctgac atccggcggg tgactcacaa 180
ccccagaaac agacata 197
<210> 21
<211> 94
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 21
Glu Val Glu Lys Thr Ala Cys Pro Ser Gly Lys Lys Ala Arg Glu Ile
1 5 10 15
Asp Glu Ser Leu Ile Phe Tyr Lys Lys Trp Glu Leu Glu Ala Cys Val
20 25 30
Asp Ala Ala Leu Leu Ala Thr Gln Met Asp Arg Val Asn Ala Ile Pro
35 40 45
Phe Thr Tyr Glu Gln Leu Asp Val Leu Lys His Lys Leu Asp Glu Leu
50 55 60
Tyr Pro Gln Gly Tyr Pro Glu Ser Val Ile Gln His Leu Gly Tyr Leu
65 70 75 80
Phe Leu Lys Met Ser Pro Glu Asp Ile Arg Lys Trp Asn Val
85 90
<210> 22
<211> 111
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 22
Tyr Pro Lys Ala Arg Leu Ala Phe Gln Asn Met Asn Gly Ser Glu Tyr
1 5 10 15
Phe Val Lys Ile Gln Ser Phe Leu Gly Gly Ala Pro Thr Glu Asp Leu
20 25 30
Lys Ala Leu Ser Gln Gln Asn Val Ser Met Asp Leu Ala Thr Phe Met
35 40 45
Lys Leu Arg Thr Asp Ala Val Leu Pro Leu Thr Val Ala Glu Val Gln
50 55 60
Lys Leu Leu Gly Pro His Val Glu Gly Leu Lys Ala Glu Glu Arg His
65 70 75 80
Arg Pro Val Arg Asp Trp Ile Leu Arg Gln Arg Gln Asp Asp Leu Asp
85 90 95
Thr Leu Gly Leu Gly Leu Gln Gly Gly Ile Pro Asn Gly Tyr Leu
100 105 110
<210> 23
<211> 240
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 23
Gln Val Gln Leu Gln Gln Ser Gly Pro Glu Leu Glu Lys Pro Gly Ala
1 5 10 15
Ser Val Lys Ile Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Ser Phe Thr Gly Tyr
20 25 30
Thr Met Asn Trp Val Lys Gln Ser His Gly Lys Ser Leu Glu Trp Ile
35 40 45
Gly Leu Ile Thr Pro Tyr Asn Gly Ala Ser Ser Tyr Asn Gln Lys Phe
50 55 60
Arg Gly Lys Ala Thr Leu Thr Val Asp Lys Ser Ser Ser Thr Ala Tyr
65 70 75 80
Met Asp Leu Leu Ser Leu Thr Ser Glu Asp Ser Ala Val Tyr Phe Cys
85 90 95
Ala Arg Gly Gly Tyr Asp Gly Arg Gly Phe Asp Tyr Trp Gly Gln Gly
100 105 110
Thr Thr Val Thr Val Ser Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly
115 120 125
Ser Gly Gly Gly Gly Ser Asp Ile Glu Leu Thr Gln Ser Pro Ala Ile
130 135 140
Met Ser Ala Ser Pro Gly Glu Lys Val Thr Met Thr Cys Ser Ala Ser
145 150 155 160
Ser Ser Val Ser Tyr Met His Trp Tyr Gln Gln Lys Ser Gly Thr Ser
165 170 175
Pro Lys Arg Trp Ile Tyr Asp Thr Ser Lys Leu Ala Ser Gly Val Pro
180 185 190
Gly Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Asn Ser Tyr Ser Leu Thr Ile
195 200 205
Ser Ser Val Glu Ala Glu Asp Asp Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Trp
210 215 220
Ser Lys His Pro Leu Thr Tyr Gly Ala Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys
225 230 235 240
<210> 24
<211> 45
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 24
Gly Thr Ile Asn Val His Asp Val Glu Thr Gln Phe Asn Gln Tyr Lys
1 5 10 15
Thr Glu Ala Ala Ser Arg Tyr Asn Leu Thr Ile Ser Asp Val Ser Val
20 25 30
Ser Asp Val Pro Phe Pro Phe Ser Ala Gln Ser Gly Ala
35 40 45
<210> 25
<211> 229
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 25
Glu Ser Lys Tyr Gly Pro Pro Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Phe
1 5 10 15
Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr
20 25 30
Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val
35 40 45
Ser Gln Glu Asp Pro Glu Val Gln Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val
50 55 60
Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Phe Asn Ser
65 70 75 80
Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu
85 90 95
Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Gly Leu Pro Ser
100 105 110
Ser Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro
115 120 125
Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Gln Glu Glu Met Thr Lys Asn Gln
130 135 140
Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala
145 150 155 160
Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr
165 170 175
Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Arg Leu
180 185 190
Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Glu Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser
195 200 205
Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser
210 215 220
Leu Ser Leu Gly Lys
225

Claims (56)

1.一种T细胞，其特征在于，所述T细胞表达抗体，所述抗体含有任选的信号肽、抗原结合区和突变型Fc段，其特征在于，所述突变型Fc段的氨基酸序列如SEQ ID NO:1第269-497位氨基酸残基所示；其中，所述T细胞是表达嵌合抗原受体的CAR-T细胞，所述嵌合抗原受体从N端到C端依次含有：任选的信号肽、抗原识别区、CD8α铰链区或IgG4 CH2CH3铰链区、CD8跨膜区或CD28跨膜区、4-1BB或CD28的胞内结构域以及CD3ζ胞内信号域，其中，所述IgG4 FcCH2CH3铰链区的氨基酸序列如SEQ ID NO:9第273-500位氨基酸残基所示。
2.如权利要求1所述的T细胞，其特征在于，所述突变型IgG4 Fc段的编码序列如SEQ IDNO:2第805-1491位碱基序列所示。
3.如权利要求1所述的T细胞，其特征在于，所述抗体中：
所述信号肽为轻链信号肽；和/或
所述抗原结合区来自与抗原特异性结合的抗体或其抗原结合片段，或来自肿瘤微环境中起作用的蛋白的配体或其与该蛋白结合的片段。
4.如权利要求3所述的T细胞，其特征在于，所述轻链信号肽的氨基酸序列如SEQ IDNO:1第1-20位氨基酸序列所示。
5.如权利要求3所述的T细胞，其特征在于，所述轻链信号肽的编码序列如SEQ ID NO:2第1-60位碱基序列所示。
6.如权利要求3所述的T细胞，其特征在于，所述抗原结合区为单链抗体。
7.如权利要求3所述的T细胞，其特征在于，所述抗体是激活性抗体或抑制性抗体。
8.如权利要求7所述的T细胞，其特征在于，所述激活性抗体选自针对如下抗原的抗体：CD28、CD137、CD134、CD40、CD40L、ICOS、HVEM、CD2、CD27、CD30、GITR、LIGHT、DR3、SLAM、CD226、CD80和CD86。
9.如权利要求7所述的T细胞，其特征在于，所述抑制性抗体选自针对以下抗原的抗体：PD-1、CTLA4、PDL1、PDL2、PDL3、TIM3、LAG3、CD47、BTLA、TIGIT、CD160、LAIR1、B7-H1、B7-1、VSIR和CD244。
10.如权利要求3所述的T细胞，其特征在于，所述配体为CD47的配体。
11.如权利要求8所述的T细胞，其特征在于，所述激活性抗体是CD40单链抗体。
12.如权利要求11所述的T细胞，其特征在于，所述CD40单链抗体的轻链可变区氨基酸序列如SEQ ID NO:1第21-146位氨基酸残基所示，和/或所述CD40单链抗体的重链可变区氨基酸序列如SEQ ID NO:1第161-268位氨基酸残基所示。
13.如权利要求11所述的T细胞，其特征在于，所述CD40单链抗体的氨基酸序列如SEQID NO:1第21-268位氨基酸残基所示。
14.如权利要求9所述的T细胞，其特征在于，所述抑制性抗体是PD-1单链抗体。
15.如权利要求14所述的T细胞，其特征在于，所述PD-1单链抗体的轻链可变区氨基酸序列如SEQ ID NO:3第21-131位氨基酸残基所示，和/或所述PD-1单链抗体的重链可变区氨基酸序列如SEQ ID NO:3第147-266位氨基酸残基所示。
16.如权利要求14所述的T细胞，其特征在于，所述PD-1单链抗体的氨基酸序列如SEQID NO:3第21-266位氨基酸残基所示。
17.如权利要求11所述的T细胞，其特征在于，所述CD40单链抗体的轻链可变区的编码序列如SEQ ID NO:2第60-438位碱基序列所示，和/或其重链可变区的编码序列可如SEQ IDNO:2第481-804位碱基序列所示。
18.如权利要求11所述的T细胞，其特征在于，所述CD40单链抗体的编码序列如SEQ IDNO:2第60-804位氨基酸残基所示。
19.如权利要求14所述的T细胞，其特征在于，所述PD-1单链抗体的轻链可变区的编码序列可如SEQ ID NO:4第60-393位碱基序列所示，和/或其重链可变区的编码序列如SEQ IDNO:4第439-798位碱基序列所示。
20.如权利要求14所述的T细胞，其特征在于，所述PD-1单链抗体的编码序列如SEQ IDNO:4第60-798位氨基酸残基所示。
21.如权利要求10所述的T细胞，其特征在于，所述CD47配体的编码序列可如SEQ IDNO:6第60-414位碱基序列所示。
22.如权利要求1所述的T细胞，其特征在于，所述抗体为CD40抗体、PD-1抗体或CD47抗体；
其中，所述CD40抗体的氨基酸序列如SEQ ID NO:1第21-497位所示，或如SEQ ID NO:1所示，所述PD-1抗体的氨基酸序列如SEQ ID NO:3第21-495位所示，或如SEQ ID NO:3所示，所述CD47抗体的氨基酸序列如SEQ ID NO:5第21-367位所示，或如SEQ ID NO:5所示；或者
其中，所述抗体的编码序列如SEQ ID NO:2第60-1491位碱基序列所示，或如SEQ IDNO:2所示；或如SEQ ID NO:4第60-1485位碱基序列所示，或如SEQ ID NO:4所示；或如SEQID NO:6第60-1104位碱基序列所示，或如SEQ ID NO:6所示。
23.如权利要求1所述的T细胞，其特征在于，所述T细胞的基因组中整合了所述抗体的表达框和所述嵌合抗原受体的表达框。
24.如权利要求1所述的T细胞，其特征在于，所述嵌合抗原受体识别、靶向或特异性结合如下抗原中的一种或多种：CD19、CD20、CEA、GD2、FR、PSMA、PMEL、CA9、CD171/L1-CAM、IL-13Rα2、MART-1、ERBB2、NY-ESO-1、MAGE家族蛋白、BAGE家族蛋白、GAGE家族蛋白、AFP、MUC1、CD22、CD23、CD30、CD33、CD44v7/8、CD70、VEGFR1、VEGFR2、IL-11Rα、EGP-2、EGP-40、FBP、GD3、PSCA、FSA、PSA、HMGA2、胎儿型乙酰胆碱受体、LeY、EpCAM、MSLN、IGFR1、EGFR、EGFRvIII、ERBB3、ERBB4、CA125、CA15-3、CA19-9、CA72-4、CA242、CA50、CYFRA21-1、SCC、AFU、EBV-VCA、POA、β2-MG和PROGRP。
25.如权利要求24所述的T细胞，其特征在于，所述嵌合抗原受体是识别、靶向或特异性结合CD19、间皮素、EGFR、粘蛋白或ErbB受体家族的嵌合抗原受体。
26.如权利要求1所述的T细胞，其特征在于，
所述信号肽的氨基酸序列如SEQ ID NO:7第1-21位氨基酸残基所示；
所述抗原识别区是识别、靶向或特异性结合CD19、间皮素、EGFR或粘蛋白的单链抗体，或由识别、靶向或特异性结合ErbB受体家族的氨基酸序列组成；
所述CD8α铰链区的氨基酸序列如SEQ ID NO:7第264-308位氨基酸残基所示或如SEQID NO:17第264-318位氨基酸残基所示；
所述CD8跨膜区的氨基酸序列如SEQ ID NO:7第309-332位氨基酸残基所示或如SEQ IDNO:17第319-344位氨基酸残基所示，所述CD28跨膜区的氨基酸序列如SEQ ID NO:9第501-528位氨基酸残基所示；
所述4-1BB胞内结构域的氨基酸序列如SEQ ID NO:7第333-374位氨基酸残基所示，所述CD28的胞内结构域的氨基酸序列如SEQ ID NO:9第529-569位氨基酸残基所示；和/或
所述CD3ζ胞内信号域的氨基酸序列如SEQ ID NO:7第375-486位氨基酸残基所示。
27.如权利要求1所述的T细胞，其特征在于，
所述信号肽的编码序列如SEQ ID NO:8第1-63位碱基序列所示；
所述CD8α铰链区的编码序列如SEQ ID NO:8第790-924位碱基序列所示或如SEQ IDNO:18第790-954位碱基序列所示，所述IgG4 CH2CH3铰链区的编码序列如SEQ ID NO:10第817-1500位碱基序列所示；
所述CD8跨膜区的编码序列如SEQ ID NO:8第925-996位碱基序列所示或如SEQ ID NO:18第955-1032位碱基序列所示，所述CD28跨膜区的编码序列如SEQ ID NO:10第1501-1584位碱基序列所示；
所述4-1BB胞内结构域的编码序列如SEQ ID NO:8第997-1122位碱基序列所示，所述CD28的胞内结构域的编码序列如SEQ ID NO:10第1585-1707位碱基序列所示；和/或
所述CD3ζ胞内信号域的编码序列如SEQ ID NO:8第1123-1458位碱基所示。
28.如权利要求26所述的T细胞，其特征在于，
所述识别、靶向或特异性结合CD19的单链抗体的轻链可变区的氨基酸序列如SEQ IDNO:7第22-128位氨基酸残基所示，和/或其重链可变区的氨基酸序列如SEQ ID NO:7第144-263位氨基酸残基所示；
所述识别、靶向或特异性结合间皮素抗原的单链抗体是针对间皮素的Region I或III的单链抗体；
所述识别、靶向或特异性结合ErbB受体家族的抗原识别区含有天然的T1E与Herin的融合蛋白；其中，T1E由人转录生长因子α N端的七个氨基酸和表皮生长因子C端的48个氨基酸组成；所述Herin为Herstatin第八内含子编码的79个氨基酸；
所述识别、靶向或特异性结合粘蛋白抗原的单链抗体的轻链可变区氨基酸序列和重链可变区氨基酸序列来自针对Muc1近膜端氨基酸序列的抗体；
所述识别、靶向或特异性结合EGFR的抗原识别区是由EGFR的特异性抗体的轻链可变区和重链可变区形成的单链抗体。
29.如权利要求28所述的T细胞，其特征在于，
所述识别、靶向或特异性结合CD19的单链抗体的氨基酸序列如SEQ ID NO:7第22-263位氨基酸残基所示；
所述识别、靶向或特异性结合间皮素抗原的单链抗体是针对间皮素的Region III的单链抗体；
所述T1E的氨基酸序列如SEQ ID NO:13第23-77位氨基酸残基所示，所述Herin的氨基酸序列如SEQ ID NO:13第93-171位氨基酸残基所示；
所述Muc1近膜端氨基酸序列如SEQ ID NO:24所示；
所述由EGFR的特异性抗体的轻链可变区和重链可变区形成的单链抗体的轻链可变区的氨基酸序列如SEQ ID NO:17第23-129位氨基酸残基所示，和/或重链可变区的氨基酸序列如SEQ ID NO:17第145-263位氨基酸残基所示。
30.如权利要求28所述的T细胞，其特征在于，
所述抗间皮素Region III的单链抗体的轻链可变区的氨基酸序列如SEQ ID NO:9第23-146位氨基酸残基所示，和/或抗间皮素Region III的单链抗体的重链可变区的氨基酸序列如SEQ ID NO:9第162-272位氨基酸残基所示；
所述识别、靶向或特异性结合ErbB受体家族的抗原识别区如SEQ ID NO:13第23-171位氨基酸残基所示；
所述识别、靶向或特异性结合粘蛋白抗原的单链抗体的轻链可变区的氨基酸序列如SEQ ID NO:15第23-133位氨基酸残基所示，和/或重链可变区的氨基酸序列如SEQ ID NO:15第149-269位氨基酸残基所示；
所述由EGFR的特异性抗体的轻链可变区和重链可变区形成的单链抗体的氨基酸序列如SEQ ID NO:17第23-263位氨基酸残基所示。
31.如权利要求28所述的T细胞，其特征在于，
所述识别、靶向或特异性结合间皮素抗原的单链抗体的氨基酸序列如SEQ ID NO:9第23-272位氨基酸残基所示；
所述识别、靶向或特异性结合粘蛋白抗原的单链抗体的氨基酸序列如SEQ ID NO:15第23-269位氨基酸残基所示。
32.如权利要求1所述的T细胞，其特征在于，所述嵌合抗原受体选自：
（1）靶向CD19的嵌合抗原受体，其氨基酸序列如SEQ ID NO:7第22-486位氨基酸残基所示，或者如SEQ ID NO:7所示，其编码序列如SEQ ID NO:8第64-1458位碱基序列所示，或者如SEQ ID NO:8所示；
（2）靶向间皮素的嵌合抗原受体，其氨基酸序列如SEQ ID NO:9第23-681位氨基酸残基所示，或者如SEQ ID NO:9所示，其编码序列如SEQ ID NO:10第67-2043位碱基序列所示，或者如SEQ ID NO:10所示，或者其氨基酸序列如SEQ ID NO:11第21-679位氨基酸残基所示，或者如SEQ ID NO:11所示，其编码序列如SEQ ID NO:12第61-2037位碱基序列所示，或者如SEQ ID NO:12所示；
（3）靶向ErbB家族的抗原识别区，其氨基酸序列如SEQ ID NO:13第23-580位氨基酸残基所示，或者如SEQ ID NO:13所示，其编码序列如SEQ ID NO:14第67-1740位碱基序列所示，或者如SEQ ID NO:14所示；
（4）靶向粘蛋白的嵌合抗原受体，其氨基酸序列如SEQ ID NO:15第23-678位氨基酸残基所示，或者如SEQ ID NO:15所示，其编码序列如SEQ ID NO:16第67-2034位碱基序列所示，或者如SEQ ID NO:16所示；和
（5）靶向EGFR的嵌合抗原受体，其氨基酸序列如SEQ ID NO:17第23-497位氨基酸残基所示，或者如SEQ ID NO:17所示，其编码序列如SEQ ID NO:18第67-1491位碱基序列所示，或者如SEQ ID NO:18所示。
33.一种组合物，其特征在于，所述组合物含有：
（1）表达载体或用于在宿主细胞基因组中插入表达框的整合载体，所述表达载体或整合载体含有一核酸分子，该核酸分子的多核苷酸序列选自含有任选的信号肽、抗原结合区和突变型Fc段的抗体的编码序列或其互补序列，其中，所述突变型IgG4 Fc段的氨基酸序列如SEQ ID NO:1第269-497位氨基酸残基所示；
（2）用于将嵌合抗原受体的表达框插入宿主细胞基因组中的整合载体，其中，所述嵌合抗原受体从N端到C端依次含有：任选的信号肽序列、抗原识别区、CD8α铰链区或IgG4CH2CH3铰链区、CD8跨膜区或CD28跨膜区、4-1BB或CD28的胞内结构域以及CD3ζ胞内信号域，其中，所述IgG4 Fc CH2CH3铰链区的氨基酸序列如SEQ ID NO:9第273-500位氨基酸残基所示；和
（3）任选的转染试剂。
34.如权利要求33所述的组合物，其特征在于，所述组合物含有（1）所述的整合载体和（2）所述的整合载体。
35.如权利要求33所述的组合物，其特征在于，所述嵌合抗原受体如权利要求24-32中任一项所限定。
36.如权利要求33所述的组合物，其特征在于，所述抗体如权利要求2-22中任一项所限定。
37.如权利要求33所述的组合物，其特征在于，（1）所述的整合载体是在5’LTR与3’LTR之间含有可操作性连接的启动子、所述抗体的编码序列以及PolyA加尾信号序列、且不含有转座酶编码序列的整合载体。
38.如权利要求33所述的组合物，其特征在于，组合物中（1）所述的整合载体与（2）所述的整合载体的质量比为1～7：1～7。
39.如权利要求38所述的组合物，其特征在于，所述质量比为1～5：1～5。
40.如权利要求38所述的组合物，其特征在于，所述质量比为1～3：1～3。
41.如权利要求38所述的组合物，其特征在于，所述质量比为1～2：1～2。
42.如权利要求38所述的组合物，其特征在于，所述质量比为1～2：1。
43.一种试剂盒，所述试剂盒含有：
（1）表达载体或用于在宿主细胞基因组中插入表达框的整合载体，所述表达载体或整合载体含有一核酸分子，该核酸分子的多核苷酸序列选自含有任选的信号肽、抗原结合区和突变型Fc段的抗体的编码序列或其互补序列，其中，所述突变型IgG4 Fc段的氨基酸序列如SEQ ID NO:1第269-497位氨基酸残基所示；
（2）用于将嵌合抗原受体的表达框插入宿主细胞基因组中的整合载体，其中，所述嵌合抗原受体从N端到C端依次含有：任选的信号肽序列、抗原识别区、CD8α铰链区或IgG4CH2CH3铰链区、CD8跨膜区或CD28跨膜区、4-1BB或CD28的胞内结构域以及CD3ζ胞内信号域，其中，所述IgG4 Fc CH2CH3铰链区的氨基酸序列如SEQ ID NO:9第273-500位氨基酸残基所示；和
（3）任选的转染试剂。
44.如权利要求43所述的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒含有（1）所述的整合载体和（2）所述的整合载体。
45.如权利要求43所述的试剂盒，其特征在于，所述嵌合抗原受体如权利要求24-32中任一项所限定。
46.如权利要求43所述的试剂盒，其特征在于， 所述抗体如权利要求2-22中任一项所限定。
47.如权利要求43所述的试剂盒，其特征在于，（1）所述的整合载体是在5’LTR与3’LTR之间含有可操作性连接的启动子、所述抗体的编码核酸以及PolyA加尾信号、且不含有转座酶编码核酸的整合载体。
48.一种药物组合物，所述药物组合物含有权利要求1-32中任一项所述的T细胞，或所述药物组合物含有所述T细胞及其表达的抗体。
49.权利要求1-32中任一项所述的T细胞在制备治疗或预防恶性肿瘤用的药物中的应用。
50.如权利要求49所述的应用，其特征在于，所述恶性肿瘤选自：急性B淋巴细胞白血病、慢性B淋巴细胞白血病、套细胞淋巴瘤、非霍奇金淋巴瘤和多发性骨髓瘤；或者为癌细胞表面异常表达间皮素、至少一个EGFR家族成员蛋白、Muc1抗原、EGFR和/或CD47的恶性肿瘤；或者是受CD40或PD1介导的恶性肿瘤。
51.权利要求1-32中任一项所述的T细胞的制备方法，所述方法包括使用以下载体转染所述T细胞的步骤：
（1）用于将所述嵌合抗原受体的表达框转入所述T细胞的基因组、且含转座酶编码核酸的载体，和
（2）用于将所述抗体的表达框整合入所述T细胞的基因组、且不含转座酶编码核酸的载体。
52.如权利要求51所述的方法，其特征在于，以质量计，（1）和（2）所述载体的比例为1～7：1～7。
53.如权利要求52所述的方法，其特征在于，以质量计，（1）和（2）所述载体的比例为1～5：1～5。
54.如权利要求52所述的方法，其特征在于，以质量计，（1）和（2）所述载体的比例为1～3：1～3。
55.如权利要求52所述的方法，其特征在于，以质量计，（1）和（2）所述载体的比例为1～2：1～2。
56.如权利要求52所述的方法，其特征在于，以质量计，（1）和（2）所述载体的比例为1～2：1。
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