CN116574748B - 一种用于靶向KRAS高频突变肿瘤的嵌合型nTCR-T构建方法 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及一种用于靶向KRAS高频突变肿瘤的嵌合型nTCR‑T构建方法，用高亲和识别KRAS高频突变MHCI表位的T细胞受体α和β链高变区（V）的CDR3片段，替换患者自身TCR相应区域的CDR3片段，构建KRAS高频突变肿瘤TCR的胞外识别片段；将改造后的α链V区和β链V区经3‑4个G4S肽段串联，并在其羧基端融合铰链区、跨膜区、胞内信号转导区，组成新的嵌合型nTCR‑T细胞治疗技术。本发明以KRAS高频突变或肿瘤特异性高频突变为“新抗原表位”代表，具有肿瘤特异强、免疫原性高、无异质性表达或丢失发生、可被蛋白酶体自然处理，并由HLA等位基因递呈等诸多优点。
Description
技术领域
本发明涉及肿瘤免疫细胞治疗技术领域，具体涉及一种用于靶向KRAS高频突变肿瘤的嵌合型nTCR-T构建方法，通过G4S肽段连接KRAS-TCR的α链和β链胞外区段作为胞外识别区后，并在其羧基端融合铰链区（CD28-Hinge）、跨膜区（CD8-TM）、胞内信号转导区（CD28、41BB及CD3ζ的胞内区段融合）组成新的嵌合型TCR-T（nTCR-T）。
背景技术
近年来，随着T细胞受体(TCR)分离技术和基因工程技术的进步，以肿瘤新抗原为基础的基因工程TCR-T细胞治疗技术得到了广泛重视，并在临床应用中实现良好的肿瘤控制和疾病缓解。该技术首先筛选出可特异识别MHC递呈肿瘤新抗原的T细胞克隆，并经单细胞测序，分别获取该克隆的配对TCR-α链和β链信息；再用编码该TCR-α链和β链全长基因序列的慢病毒，转导患者外周血T淋巴细胞，从而得到特异性识别MHC-肿瘤相关抗原的TCR-T细胞，经体外大量扩增后回输患者，实现肿瘤治疗的目的。
在满足HLA限制性的前提下，TCR-T识别肿瘤突变抗原无瘤种和个体差异性，这使得以肿瘤高频突变新抗原为代表的TCR-T技术蓬勃发展。KRAS是人类恶性肿瘤中突变率最高的致癌驱动基因之一，约占所有肿瘤的15%~20%。其中50%以上肺腺癌、胰腺癌、结直肠癌等高死亡率肿瘤患者伴随KRAS突变，且超过97%的KRAS突变发生于外显子2和3(G12、G13位点)。以KRAS高频突变为代表的肿瘤特异性驱动突变产生的“新抗原表位”，因其具有肿瘤特异强、免疫原性高、无异质性表达或丢失发生、可被蛋白酶体自然处理，并由HLA等位基因递呈等诸多优点，现已成为TCR-T疗法治疗多种恶性肿瘤的广谱、特异、理想靶抗原。
然而，常规TCR-T（cTCR-T）疗法中，TCR-α链和β链需要与三个CD3的二聚体（包括：CD3γε，CD3δε，CD3ζζ）形成一个8条链、10个ITAM的TCR-CD3复合体，结构极为复杂；其信号传递模式需要TCR与抗原肽-MHC分子复合物的识别提供第一信号，共刺激分子（如CD28）提供第二信号，细胞因子提供第三信号，信号传递效率极低，加之“错配”异源二聚体可能产生不可预测风险，严重限制了TCR-T疗法的进一步临床应用的发展。
发明内容
针对上述问题，本发明基于优化TCR-T结构，提升TCR-T信号传递和肿瘤控制效率的目的，提供了一种靶向KRAS高频突变肿瘤新抗原的嵌合型nTCR-T构建方法，通过将TCR-α链和β链胞外区段，通过G4S肽段连接，并在其羧基端融合铰链区（Hinge）、跨膜区（TM）和胞内信号转导区（CD28、41BB及CD3ζ胞内区段融合）组成，形成一个可以特异性识别以KRAS高频突变抗原肽表位-MHC复合体为代表靶抗原的nTCR-T技术。本发明提供的方法不仅可以避免“错配”异源二聚体风险，同时可以实现TCR-T信号高效传递，提升抗肿瘤疗效。
一种用于靶向KRAS高频突变肿瘤的嵌合型nTCR-T构建方法，G4S肽段连接KRAS-TCR的α链和β链胞外区段作为胞外识别区后，通过在胞外识别区的羧基端融合铰链区、跨膜区、胞内信号转导区组成新的嵌合型nTCR-T。
优选的，所述α链的CDR3核苷酸序列如SEQ ID NO.7所示。
优选的，所述β链的CDR3核苷酸序列如SEQ ID NO.15所示。
优选的，所述G4S肽段的数量为3至4个，核苷酸序列如SEQ ID NO.9所示。
优选的，所述铰链区的核苷酸序列如SEQ ID NO.17所示。
优选的，所述跨膜区的核苷酸序列如SEQ ID NO.18所示。
优选的，所述胞内信号转导区的CD28核苷酸序列如SEQ ID NO.19所示。
优选的，所述胞内信号转导区的41BB的核苷酸序列如SEQ ID NO.20所示。
优选的，所述胞内信号转导区的CD3ζ包括如SEQ ID NO.21所示的核苷酸序列。
本发明的核心是：
1、用高亲和识别KRAS高频突变MHCI表位的T细胞受体α和β链高变区（V）的CDR3片段，替换患者自身TCR相应区域的CDR3片段，从而获得KRAS高频突变肿瘤TCR的胞外识别片段；
2、将改造后的α链V区和β链V区经3-4个G4S肽段串联，并在其羧基端融合铰链区（CD28-Hinge）、跨膜区（CD8-TM）、胞内信号转导区（CD28、41BB及CD3ζ的胞内区段融合），组成新的嵌合型TCR-T（nTCR-T）细胞治疗技术。
本发明具有以下优势：
1、以KRAS高频突变或肿瘤特异性高频突变为代表的“新抗原表位”，具有肿瘤特异强、免疫原性高、无异质性表达或丢失发生、可被蛋白酶体自然处理，并由HLA等位基因递呈等诸多优点。
2、嵌合型nTCR结构简单且自带信号转导和共刺激信号，可高效识别KRAS高频突变肽表位-MHC复合体，可避免常规TCR-T疗法中信号传递复杂、效率低，易“错配”等问题。
附图说明
图1是HLA-A*11：01且KRAS高频突变胰腺癌患者TCR-α链和β链信息获取和CDR3替换图，其中，对具有HLA-A*11：01且KRAS高频突变胰腺癌患者的外周血进行单细胞测序，获得构建具有HLA限制性配对TCR-α链和β链的序列信息；并用表2中已报道的CDR3区域序列信息替换该配对TCR-α/β链的CDR3区域，从而获得具有KRAS-G12V/D抗原肽高识别功能的HLA限制性TCR-α/β链序列信息。
图2是3-4个G4S作为Linker连接KRAS-TCR-α链和β两条链的嵌合型nTCR-T设计示意图。
图3是嵌合型TCR（nTCR-T）的设计元件和序列示意图。
图4是嵌合型nTCR-T与常规cTCR-T的对比图。
图5是pCDH-CMV-KRAS-G12D-TCR-α-3 G4S-β-28BBZ目的质粒构建、病毒包装、Jurkat和T细胞感染及表达验证。
图6是嵌合型KRAS-nTCR-T细胞与HLA-A*11:01基因型且KRAS-G12D突变胰腺癌细胞进行共培养3天后的效果验证图，其中，细胞因子IL2，IL4，IL6，TNFα和IFNγ在嵌合型KRAS-nTCR-T细胞组均显著增加，而抑制性细胞因子IL10呈现显著下降。
具体实施方式
本发明涉及基于个体化肿瘤高频突变MHCI抗原表位识别的TCRα链V区和β链V区CDR3片段的基因取代其自身相应区域基因，并用3-4个G4S肽段串联形成胞外识别区，进一步在其羧基端融合铰链区（CD28-Hinge）、跨膜区（CD8-TM）、胞内的信号转导区（CD28、41BB及CD3ζ的胞内区段融合），构建新的、结构简单、自带信号转导和共刺激信号的嵌合型nTCR-T。本发明涉及利用识别KRAS高频突变（G12C, G12V）MHCI抗原表位的TCRα链区V区和β链V区CDR3基因片段，取代患者自身TCR相应区域的嵌合型nTCR-T构建与应用。本发明涉及3-4个G4S肽段作为连接子串联上述改造后的TCR-α链V区和β链V区肽段，作为胞外抗原识别区的结构设计和应用。本发明涉及胞外抗原识别区的羧基端融合铰链区CD28-Hinge、跨膜区CD8-TM，胞内信号转导区CD28、41BB及CD3ζ的胞内区段融合为嵌合型TCR-T的结构设计和应用。本发明还涉及基于linker连接TCR-α链和β链胞外区段，在其羧基端融合Hinge、跨膜区，并由CD28、41BB及CD3ζ胞内区段融合组成胞内信号转导区的嵌合型TCR-T疗法结构设计和应用。
本发明的第一个目的是：确定能特异识别MHC递呈KRAS突变肽的TCR-α链和β链信息（尤其是CDR3区）。
针对KRAS高频突变的特异性受体T细胞疗法（TCR-T）需要确定三个关键因素：KRAS高频突变新抗原肽、具备结合KRAS突变肽能力的HLA分型以及能特异识别HLA结合肽的TCR-α链和β链信息（尤其是CDR3区）。通过多肽与MHC分子结合预测网站（NetMHC-4.0），首先确定了中国人群HLA亚型频率较高的HLA-A*11:01可以亲和KRAS高频突变肽表位，其%Rank值均小于2，如表1（多肽与MHC分子结合预测网站（NetMHC-4.0）KRAS-G12D/C/V三种突变肽表位均可高效亲和HLA-A*11:01基因型）中所示。已报道的可以特异性识别高频KRAS突变肽表位的TCR-α链和β链中CDR3信息，如表2所示。将HLA-A*11：01分型且KRAS-G12V高频突变患者外周血进行单细胞测序，获得配对TCR-α链和β链信息，进一步将其CDR3区域替换可识别KRAS-G12V/D抗原肽的CDR3区域，最终获得对KRAS-G12V/D抗原肽具有高反应性的TCR-α链和β链信息。本发明中针对KRAS-G12V且HLA-A*11:01的特异性TCR-α链的核苷酸序列包括SEQ IDNO.2至8的核苷酸片段。TCR-β链的核苷酸序列包括SEQ ID NO.10至16的核苷酸片段。
本发明的第二个目的是：以G4S作为linker，连接特异性识别KRAS突变肽的TCR-α链和β链胞外片段的长度设计和应用。
为确定何种长度的Linker用于嵌合型nTCR-T构建最为合适，采用结构预测网站Robetta，进行2个，3个，4个和5个G4S连接的特异性识别KRAS突变肽表位的嵌合型nTCR的结构预测，如图2所示，分析何种Linker长度最为合适用于连接KRAS-TCR-α链和β两条链的胞外区（CDJ区）。为了确保嵌合型nTCR-T对肿瘤抗原表位肽的识别能力，采用已发表的复合物结构（PDB编号：3GH1）作为结构比对模板（图2A）。串联TCR-α和β链胞外区结构比对的结果显示（图2B）：3个，4个和5个G4S作为Linker连接KRAS-TCR-α/β两条链的胞外区（CDJ区）均可保证其形成正确的配对识别构象，然而2个G4S作为Linker连接KRAS-TCR-α/β两条链的胞外区，由于连接太短，无法形成正确的配对识别构象。基于确保正确配对构象形成，且避免Linker冗余导致蛋白不稳定，3-4个G4S可作为Linker连接KRAS-TCR-α链和β两条链的嵌合型nTCR-T设计。
本发明的第三个目的是：以CD28-Hinge、CD8跨膜区作为胞外识别和胞内信号转导区的连接部分，以CD28、41BB及CD3ζ胞内区段融合作为胞内信号转导区的嵌合型nTCR-T结构设计和应用。
3-4个G4S肽段连接KRAS-TCR-α链和β链胞外区段作为胞外识别区后，通过在胞外识别区（G4S肽段连接KRAS-TCR-α链和β链胞外区段）的羧基端融合CD28-Hinge、CD8跨膜区和CD28、41BB及CD3ζ胞内区段，共同组成嵌合型nTCR-T的跨膜和胞内信号转导区。
将全序列通过全基因合成和酶切连接的方式，构建于pCDH-CMV载体多克隆位点XbaI和BmgbI之间，获得pCDH-CMV-KRAS-G12D-TCR-α-G4S-β-28BBZ目的质粒。
本发明的第四个目的是：嵌合型nTCR-T细胞制备及其在KRAS突变肿瘤中的应用。
将pCDH-CMV-KRAS-G12D-TCR-α-G4S-β-28BBZ目的质粒进行293T细胞慢病毒包装和浓缩，并通过Lenti-Pac™慢病毒滴度检测试剂盒测定病毒滴度，按照MOI=100分别感染T细胞，获得嵌合型KRAS-nTCR-T细胞，并确定全长目的基因序列是否正常转录表达。随后，嵌合型KRAS-nTCR-T细胞与HLA-A*11:01基因型且KRAS-G12D突变的胰腺癌肿瘤细胞共培养后，检测其细胞因子分泌情况，以确定嵌合型KRAS-nTCR-T细胞的抗肿瘤效果。
实施例1
构建后的pCDH-CMV-KRAS-G12D-TCR-α-G4S-β-28BBZ目的质粒进行293T细胞慢病毒包装和浓缩，并通过Lenti-Pac™慢病毒滴度检测试剂盒测定病毒滴度，按照MOI=10和MOI=100分别感染Jurkat细胞和T细胞，并于感染后第三天取1x105细胞提取mRNA，随后逆转录为cDNA，并用常规PCR验证Jurkat细胞和T细胞中全长nTCR-T的mRNA水平。结果显示：Jurkat细胞和T细胞中均表达了nTCR-T的全长mRNA。
目的基因全长验证引物：
TCR-CMV-F：GTAGGCGTGTACGGTGGGAG
TCR-WPRE-R：AGCAGCGTATCCACATAGCG
实施例2
嵌合型KRAS-nTCR-T细胞与HLA-A*11:01基因型且KRAS-G12D突变的胰腺癌肿瘤细胞共培养后，细胞因子分泌情况显示：相较于NC-T孵育组，细胞因子IL2，IL4，IL6，TNFα和IFNγ在嵌合型KRAS-nTCR-T细胞共孵育组均有显著上升，抑制性细胞因子IL10呈现显著下降趋势，表明嵌合型KRAS-nTCR-T细胞可对HLA-A*11:01基因型递呈KRAS-G12D突变肽表位复合物起特异性反应，体现了嵌合型KRAS-nTCR-T细胞的抗肿瘤效果。
上面结合实施例对本发明的实例作了详细说明，但是本发明并不限于上述实例，在本领域普通技术人员所具备的知识范围内，还可以在不脱离本发明宗旨的前提下作出的各种变化，也应视为本发明的保护范围。
Claims (6)
1.一种用于靶向KRAS高频突变肿瘤的嵌合型nTCR-T构建方法，其特征在于，G4S肽段连接KRAS-TCR的α链和β链胞外区段作为胞外识别区后，通过在胞外识别区的羧基端融合铰链区、跨膜区、胞内信号转导区组成新的嵌合型nTCR-T；
所述α链的CDR3核苷酸序列如SEQ ID NO.7所示；
所述β链的CDR3核苷酸序列如SEQ ID NO.15所示；
所述G4S肽段的数量为3至4个，核苷酸序列如SEQ ID NO.9所示。
2.根据权利要求1所述的用于靶向KRAS高频突变肿瘤的嵌合型nTCR-T构建方法，其特征在于，所述铰链区的核苷酸序列如SEQ ID NO.17所示。
3.根据权利要求2所述的用于靶向KRAS高频突变肿瘤的嵌合型nTCR-T构建方法，其特征在于，所述跨膜区的核苷酸序列如SEQ ID NO.18所示。
4.根据权利要求3所述的用于靶向KRAS高频突变肿瘤的嵌合型nTCR-T构建方法，其特征在于，所述胞内信号转导区的CD28的核苷酸序列如SEQ ID NO.19所示。
5.根据权利要求4所述的用于靶向KRAS高频突变肿瘤的嵌合型nTCR-T构建方法，其特征在于，所述胞内信号转导区的41BB的核苷酸序列如SEQ ID NO.20所示。
6.根据权利要求5所述的用于靶向KRAS高频突变肿瘤的嵌合型nTCR-T构建方法，其特征在于，所述胞内信号转导区的CD3ζ包括如SEQ ID NO.21所示的核苷酸序列。
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