CN103923971A - 大肠直肠癌相关基因K-ras基因突变检测方法和相关检测试剂盒 - Google Patents

大肠直肠癌相关基因K-ras基因突变检测方法和相关检测试剂盒 Download PDF

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Abstract

本发明涉及一种大肠直肠癌相关基因K-ras基因突变检测方法，包括步骤：a.提取肿瘤组织的基因组DNA；b.根据K-ras基因的包含第13号密码子的核苷酸序列设计一对PCR引物对，并设计一条与第13号密码子的突变核苷酸序列匹配的TaqMan MGB荧光探针，对基因组DNA进行荧光定量PCR；c.根据荧光定量PCR中收集的荧光信号而形成的实时扩增曲线，与阴性对照和阳性对照的结果进行比较和分析，从而鉴定基因组DNA中是否发生突变。还提供了相关检测试剂盒。本发明的大肠直肠癌相关基因K-ras基因突变检测方法设计巧妙，操作简单，可以筛检出可能对标靶药物有效的病人族群，检测结果准确可靠，从而可作为医师用药的参考依据，可指引医师与病人是否适合使用标靶治疗，适于大规模推广应用。

Description

大肠直肠癌相关基因K-ras基因突变检测方法和相关检测试剂盒
技术领域
本发明涉及疾病相关基因突变检测技术领域，更具体地，涉及大肠直肠癌相关基因突变检测方法技术领域，特别是指一种大肠直肠癌相关基因K-ras基因突变检测方法和相关检测试剂盒。 
背景技术
目前癌症治疗除了化学治疗、手术切除、放射疗法等方式外，还有针对癌细胞进行攻击的标靶治疗（Target therapy）。标靶治疗是利用癌细胞中独特的结构或分子，以专一性的药物攻击这些特殊结构进而杀死癌细胞。最重要的是，标靶药物较不会攻击正常细胞，对正常细胞伤害较小，可减少许多副作用(如白血球、血小板降低、贫血、呕吐、掉头发等现象)，也可抑制癌细胞增长、转移与抗药性的恶性转化能力。标靶治疗也是近年来癌症治疗的新趋势，也是医学界最热门的研究重点，许多以此为目标的临床试验研究正持续进行中。 
根据研究显示大肠直肠癌的发生与其中癌细胞表皮生长因子受体表现有关，目前使用在大肠直肠癌的标靶药物有可与肿瘤细胞表皮生长因子受体（EGFR）结合，进而抑制EGFR作用的IgG1单株抗体的Cetuximab及IgG2kappa单株抗体的Panitumumab其原理是它可以专一性地与EGFR结合，竞争性的抑制表皮生长因子的功能，使得癌细胞无法进行复制、繁殖与血管再生，诱发癌细胞走向死亡。EGFR，全名为Epidermal Growth Factor Receptor，中文名称为表皮细胞生长因子受体，是存在癌细胞和正常细胞膜表面的蛋白质，可传递细胞外生长、增殖以及抗亡的致癌讯号至细胞内，有可能会促成癌症的快速生长、转移与抗药性，患者的病况因而恶化。K-ras是EGFR下游的调控因子，为ras致癌基因家族成员之一，当K-ras基因发生突变时，会引起一系列的蛋白质磷酸化，造成更多细胞核转录因子的磷酸化，促使癌细胞过量的成长分裂。大部份的K-Ras基因的突变发生在第13号密码子。 
由于每个病患间基因型态的差异对同样的标靶药物会产生不同的反应，而影响治疗效果。用药前的基因检测，可帮助医师与病患了解是否适合使用标靶治疗，量身订作个人化治疗，挑选适当药物，更有助于增加标靶治疗的专一疗效而达到更佳的治疗效果。 大肠癌的标靶药物Cetuximab/Panitumumab是针对EGFR进行抑制，将其阻断，停止后续一连串的癌细胞进展，个人基因型态的差异会影响标靶药物抑制EGFR机制的作用结果。 
大肠直肠癌与标靶药物之临床研究已有许多期刊报告可寻，相关新闻亦可利用搜寻网站键入“大肠癌标靶治疗”关键词搜寻。Lievre等人于2008年在J Clin Oncol期刊发表有关大肠直肠癌第一线化疗失败后，投与Cetuximab的研究指出：K-ras突变型对Cetuximab具有抗药性，而且疗效反应较差。再一次确认了Cetuximab在K-ras野生型才具有疗效。结论简报于下表： 
2008年底，比利时Eric Van Cutsem博士在美国临床肿瘤协会（ASCO）年会中发表了名称为“CRYSTAL”的临床试验结果，这个高达1,198名病患的试验结果显示，将Cetuximab加入FOLFIRI化疗处方中，相较于单用FOLFIRI，减少了转移大肠直肠癌风险。文章中强调Cetuximab的好处仅限于“K-ras野生型”肿瘤病患，K-ras突变的病患无法获利（N Engl J Med.2009;360:1408-1417） 
最新的发展是，2009年中，美国食品和药品管理局（FDA）在Erbitux临床研究与临床使用之信息提出更新，加入注明Erbitux不建议使用在K-ras密码子12、13基因突变之大肠直肠癌病人。当时权威期刊GEN News（Jul20,2009）以“FDA Says Erbitux No Good for Those with Certain K-ras Mutations”为标题，为基因与药物的发展下了最好的批注。 
由于K-ras是EGFR传递系统的一员，因此可作为一种预测肿瘤型态的生物标记。K-ras基因检测是了解大肠直肠癌患者癌组织基因状况最直接、最有效的方法，可以得知个人的基因情况，筛检出这些可能对标靶药物有效的病人族群。研究结果显示，标靶治疗的作用机制与K-ras有无突变有相关性，如果为K-ras野生型（K-ras wild-type），使用标靶药物的效果比突变型（K-ras mutate-type）来的有效。大肠直肠癌患者在进入个体化标靶治疗疗程之前可检测个人K-ras基因型，作为标靶医疗的依据。检测方法是利用病患手术取下之肿瘤组织切片，进行基因检测，分析DNA型态。K-ras基因检测可以帮患者把关，作为医师用药的参考依据，可指引医师与病人是否适合使用标靶治疗。所以，个人的K-ras基因突变检测可以帮助病患更准确的用药，得到最好的治疗，节省不必要的开销！ 
发明内容
本发明的主要目的就是针对以上存在的问题与不足，提供一种大肠直肠癌相关基因K-ras基因突变检测方法和相关检测试剂盒，该检测方法设计巧妙，操作简单，可以筛检出可能对标靶药物有效的病人族群，检测结果准确可靠，从而可作为医师用药的参考依据，可指引医师与病人是否适合使用标靶治疗，适于大规模推广应用。 
为了实现上述目的，在本发明的第一方面，提供了一种大肠直肠癌相关基因K-ras基因突变检测方法，其特点是，包括步骤： 
a.提取肿瘤组织的基因组DNA； 
b.根据K-ras基因的包含第13号密码子的核苷酸序列设计一对PCR引物对，并设计 一条与所述第13号密码子的突变序列匹配的TaqMan MGB荧光探针，对所述基因组DNA进行荧光定量PCR； 
c.同时以含有所述的K-ras基因的包含第13号密码子的核苷酸序列的阴性对照以及含有所述的K-ras基因的包含第13号密码子的核苷酸序列且所述第13号密码子为所述突变核苷酸序列的阳性对照为模板，采用所述PCR引物对和所述TaqMan MGB荧光探针进行荧光定量PCR； 
d.将对所述基因组DNA进行的所述荧光定量PCR中收集的荧光信号而形成的实时扩增曲线与对所述阴性对照和所述阳性对照进行的所述荧光定量PCR中收集的荧光信号而形成的实时扩增曲线分别进行比较分析，从而鉴定所述基因组DNA中是否发生突变。 
较佳地，所述PCR引物对是SEQ ID NO:1和SEQ ID NO:2所示的核苷酸序列，所述TaqMan MGB荧光探针具有的核苷酸序列是SEQ ID NO:3所示的核苷酸序列或SEQ ID NO:4所示的核苷酸序列。 
阴性对照和阳性对照可以是DNA片段，也可以是插入DNA片段的质粒，较佳地，所述阴性对照为阴性对照质粒，所述阴性对照质粒的插入片段为SEQ ID NO:5所示的核苷酸序列，所述阳性对照为阳性对照质粒，所述阳性对照质粒的插入片段为SEQ ID NO:6所示的核苷酸序列。 
较佳地，如果对所述基因组DNA进行的所述荧光定量PCR中收集的荧光信号而形成的实时扩增曲线与对所述阴性对照进行的所述荧光定量PCR中收集的荧光信号而形成的实时扩增曲线一致，则所述基因组DNA中未发生突变；如果对所述基因组DNA进行的所述荧光定量PCR中收集的荧光信号而形成的实时扩增曲线与对所述阳性对照进行的所述荧光定量PCR中收集的荧光信号而形成的实时扩增曲线一致，则所述基因组DNA中发生突变。 
在本发明的第二方面，提供了一种大肠直肠癌相关基因K-ras基因突变检测试剂盒，其特点是，包括引物容器、荧光探针容器、阴性对照容器和阳性对照容器，所述引物容器内具有根据K-ras基因的包含第13号密码子的核苷酸序列设计的PCR引物对干燥粉末或溶液，所述荧光探针容器内具有与所述第13号密码子的突变核苷酸序列匹配的TaqMan MGB荧光探针干燥粉末或溶液，所述阴性对照容器包括含有所述的K-ras基因的包含第13号密码子的核苷酸序列的阴性对照干燥粉末或溶液，所述阳性对照容器包括含有所述的K-ras基因的包含第13号密码子的核苷酸序列且所述第13号密码子为所述突变核苷酸序列 的阳性对照干燥粉末或溶液。 
较佳地，所述PCR引物对是SEQ ID NO:1和SEQ ID NO:2所示的核苷酸序列，所述TaqMan MGB荧光探针具有的核苷酸序列是SEQ ID NO:3所示的核苷酸序列或SEQ ID NO:4所示的核苷酸序列。 
较佳地，所述阴性对照为阴性对照质粒，所述阴性对照质粒的插入片段为SEQ ID NO:5所示的核苷酸序列，所述阳性对照为阳性对照质粒，所述阳性对照质粒的插入片段为SEQ ID NO:6所示的核苷酸序列。 
本发明的创新点在于根据中国患者主要的K-ras基因的突变位点设计特异的TaqMan MGB荧光探针，从而提高检测灵敏度、降低检测成本、缩短检测时间，解决传统K-ras基因检测方法即PCR（聚合酶链式反应）加DNA测序法存在的灵敏度较低、检测成本高、操作过程繁琐等缺点，计巧妙，操作简单，可以筛检出可能对标靶药物有效的病人族群，检测结果准确可靠，从而可作为医师用药的参考依据，可指引医师与病人是否适合使用标靶治疗，适于大规模推广应用。 
附图说明
图1是Taqman实验结果分析图。其中左上角圆圈表示的区域内的点为Allele Y，右下角圆圈表示的区域内的点为Allele X，左上角圆圈区域和右下角圆圈区域之间的点为Both。 
具体实施方式
为更好的理解本发明的内容，下面结合具体实施例作进一步说明。 
1.基因组DNA提取： 
1.1试剂和仪器: 
1.1.1试剂和耗材:基因组DNA抽提试剂盒(QiAmp DNA Mini Kit(QIAGNE,Cat No:51304)；含蛋白酶K、裂解液、漂洗液A、漂洗液B、洗脱液、收集管、吸附柱；0.5%吐温20。 
1.1.2仪器：DENVILLE260离心机，XW-80A旋涡混合器，H.H.S指针式电热恒温水浴锅 
1.2提取步骤 
从石蜡组织或者新鲜组织中提取基因组DNA 
1.2.1切片组织刮取 
如果组织切片经过病理评估（理想状况），需将肿瘤区域标识出来。通常本方法使用适当数量5μm厚度切片，刮取肿瘤组织面积约4cm2抽提的DNA量足够检测之用。DNA 提取的得率和质量很大程度上取决于组织本身的质量以及切片制备过程的标准化程度。 
1.2.1.1将相应的样本号标识于1.5mL离心管上。 
1.2.1.2加入200ul溶液1至离心管中。 
1.2.1.3吸取微量的溶液1滴于切片正面以防止刮片时组织飞散。 
1.2.1.4用一次性的解剖刀将组织刮至1.5mL离心管中，注意需刮肿瘤标识区域的组织。 
1.2.1.5重复步骤4直至同一样本的所有切片上的肿瘤组织均已被刮至同一离心管中，颠倒混匀后离心数秒，将所有组织离心至管底。 
1.2.2DNA消化及脱蜡 
1.2.2.1将样本管置于90℃孵育10分钟。 
1.2.2.255℃冷却5分钟。 
1.2.2.3加入4ul10mg/mL蛋白激酶K，混合均匀。55℃孵育1小时，其间混匀2次。之后每间隔1小时再加等量蛋白激酶K，至少两次。如果组织过多，需增加蛋白酶K的加入次数至6次。55℃孵育过夜。 
1.2.2.499℃孵育10分钟。 
1.2.2.5将离心管置于4℃离心机中10500g离心15分钟。 
1.2.2.6将离心管放置于冰上15分钟硬化上层石蜡。 
1.2.2.7吸取石蜡层下的溶液至一新的1.5mL离心管中。注意吸取时应尽量小心以避免吸入石蜡等污染物。 
1.2.3提取DNA 
1.2.3.1.将200ul裂解液加入含有样本的离心管中，振荡混匀15秒。 
1.2.3.256℃孵育10分钟，离心数秒去除管壁上的液滴。 
1.2.3.3加入200ul的无水乙醇，振荡混匀15秒，离心数秒去除管壁上的液滴。 
1.2.3.4吸取离心管中溶液400ul加至吸附柱，盖上盖子，室温14,000rpm离心1分钟。倒掉收集管中的滤出液。 
1.2.3.5重复步骤4直至所有的样本均被移至吸附柱中。将吸附柱置于一个新的收集管中。 
1.2.3.6加漂洗液A（漂洗液A使用前加入25ml无水乙醇）500ul至吸附柱，盖上盖子，室温14000rmp离心1分钟。将吸附柱移至一个新的收集管中。 
1.2.3.7加漂洗液B（漂洗液B使用前加入30ml无水乙醇）500ul至吸附柱，盖上 盖子，室温14000rmp离心3分钟。倒掉收集管中的滤出液，将吸附柱重新放回收集管中。 
1.2.3.8室温14,000rpm空离2分钟。 
1.2.3.9将吸附柱置于一新的1.5mL离心管中，将60ul洗脱液加入至吸附柱中心，盖上盖子，室温放置5分钟，室温14000rmp离心1分钟。 
1.2.3.10将洗脱至离心管的60ul溶液重复上吸附柱，盖上盖子，室温放置5分钟，室温14000rmp离心1分钟。 
1.2.3.11将DNA置于-20℃冰箱保存至下一步检测使用。 
2.Taqman探针法检测SNP的实验方法： 
2.1实验试剂及仪器 
2.1.1实验试剂 
荧光定量试剂：ABI TaqMan2×PCR Master mix（P/N:4326614，Lot:G15502） 
普通PCR试剂：宝生物工程(大连)有限公司的Ex Taq DNA聚合酶（P/N:DRR100B，Lot:CKA1801A） 
2.1.2实验仪器：ABI9700型PCR仪和ABI7900HT型荧光定量PCR仪 
2.1.3检测位点探针及引物表 
注：粗体为与要检测的突变序列匹配的序列。 
2.1.4阴性对照质粒和阳性对照质粒 
阴性对照质粒：将SEQ ID NO:5所示的核苷酸序列平末端克隆至上海捷瑞生物工程有限公司的质粒pGH，插入位置为SmaI。当然也可以选用其它质粒。 
阳性对照质粒：将SEQ ID NO:6所示的核苷酸序列平末端克隆至上海捷瑞生物工程有限公司的质粒pGH，插入位置为SmaI。当然也可以选用其它质粒。 
2.2实验步骤 
2.2.1将所有样本DNA的浓度调整到20ng/ul~50ng/ul。阴性对照质粒和阳性对照质粒的浓度为10pg/ul。 
2.2.2引物检测 
a.PCR反应体系： 
b.PCR循环条件： 
2.2.3探针检测 
a.PCR反应体系: 
b.PCR循环条件： 
2.2.4引物和探针检测通过后，即按照2.2.3反应条件进行正式实验。 
3.Taqman实验结果分析 
根据最终终点读板结果分型图分析，样本可分为两群或三群（视位点突变频率及检测样本数目而定），利用阴性对照质粒和阳性对照质粒为标准，可将待检sample归类。 
例如，请参见图1所示，采用ABI SDS2.2软件默认参数分析,结果如图，阳性质粒的结果分布在左上角圆圈表示的区域,阴性质粒的结果分布在右下角圆圈表示的区域,两个区域能够很鲜明的分开。被检样品如果分布在左上角圆圈区域,可鉴定为Kras-2阳性,如果分布在右下角圆圈区域,可鉴定为Kras-2阴性；如果既不分布在左上角圆圈区域，也不分布在右下角圆圈区域，则是杂合类型。 
大肠癌罹患风险预测检测信息： 
4．体检结果： 
对照下表的K-ras各位点不同结果参考图谱可知：在所提供的样本中未检测到K-ras基因中第13位密码子（Condon13）的点突变。 
根据上述检测结果，可以判断上述受检的肿瘤组织的K-ras基因的第13号密码子均正常，没有发生变异，使用标靶药物的效果将比突变型（K-ras mutate-type）来的有效，从而可作为医师用药的参考依据，可指引医师与病人是否适合使用标靶治疗。 
综上所述，本发明的大肠直肠癌相关基因K-ras基因突变检测方法设计巧妙，操作简单，可以筛检出可能对标靶药物有效的病人族群，检测结果准确可靠，从而可作为医师用药的参考依据，可指引医师与病人是否适合使用标靶治疗，适于大规模推广应用。 
在此说明书中，本发明已参照其特定的实施例作了描述。但是，很显然仍可以作出各种修改和变换而不背离本发明的精神和范围。因此，说明书和附图应被认为是说明性的而非限制性的。 

Claims (7)

1.一种大肠直肠癌相关基因K-ras基因突变检测方法，其特征在于，包括步骤：
a.提取肿瘤组织的基因组DNA；
b.根据K-ras基因的包含第13号密码子的核苷酸序列设计一对PCR引物对，并设计一条与所述第13号密码子的突变核苷酸序列匹配的TaqMan MGB荧光探针，对所述基因组DNA进行荧光定量PCR；
c.同时以含有所述的K-ras基因的包含第13号密码子的核苷酸序列的阴性对照以及含有所述的K-ras基因的包含第13号密码子的核苷酸序列且所述第13号密码子为所述突变核苷酸序列的阳性对照为模板，采用所述PCR引物对和所述TaqManMGB荧光探针进行荧光定量PCR；
d.将对所述基因组DNA进行的所述荧光定量PCR中收集的荧光信号而形成的实时扩增曲线与对所述阴性对照和所述阳性对照进行的所述荧光定量PCR中收集的荧光信号而形成的实时扩增曲线分别进行比较分析，从而鉴定所述基因组DNA中是否发生突变。
2.根据权利要求1所述的大肠直肠癌相关基因K-ras基因突变检测方法，其特征在于，所述PCR引物对是SEQ ID NO:1和SEQ ID NO:2所示的核苷酸序列，所述TaqMan MGB荧光探针具有的核苷酸序列是SEQ ID NO:3所示的核苷酸序列或SEQ ID NO:4所示的核苷酸序列。
3.根据权利要求1所述的大肠直肠癌相关基因K-ras基因突变检测方法，其特征在于，所述阴性对照为阴性对照质粒，所述阴性对照质粒的插入片段为SEQ ID NO:5所示的核苷酸序列，所述阳性对照为阳性对照质粒，所述阳性对照质粒的插入片段为SEQ IDNO:6所示的核苷酸序列。
4.根据权利要求1所述的大肠直肠癌相关基因K-ras基因突变检测方法，其特征在于，如果对所述基因组DNA进行的所述荧光定量PCR中收集的荧光信号而形成的实时扩增曲线与对所述阴性对照进行的所述荧光定量PCR中收集的荧光信号而形成的实时扩增曲线一致，则所述基因组DNA中未发生突变；如果对所述基因组DNA进行的所述荧光定量PCR中收集的荧光信号而形成的实时扩增曲线与对所述阳性对照进行的所述荧光定量PCR中收集的荧光信号而形成的实时扩增曲线一致，则所述基因组DNA中发生突变。
5.一种大肠直肠癌相关基因K-ras基因突变检测试剂盒，其特征在于，包括引物容器、荧光探针容器、阴性对照容器和阳性对照容器，所述引物容器内具有根据K-ras基因的包含第13号密码子的核苷酸序列设计的PCR引物对干燥粉末或溶液，所述荧光探针容器内具有与所述第13号密码子的突变核苷酸序列匹配的TaqMan MGB荧光探针干燥粉末或溶液，所述阴性对照容器包括含有所述的K-ras基因的包含第13号密码子的核苷酸序列的阴性对照干燥粉末或溶液，所述阳性对照容器包括含有所述的K-ras基因的包含第13号密码子的核苷酸序列且所述第13号密码子为所述突变核苷酸序列的阳性对照干燥粉末或溶液。
6.根据权利要求5所述的大肠直肠癌相关基因K-ras基因突变检测试剂盒，其特征在于，所述PCR引物对是SEQ ID NO:1和SEQ ID NO:2所示的核苷酸序列，所述TaqMan MGB荧光探针具有的核苷酸序列是SEQ ID NO:3所示的核苷酸序列或SEQ ID NO:4所示的核苷酸序列。
7.根据权利要求5所述的大肠直肠癌相关基因K-ras基因突变检测试剂盒，其特征在于，所述阴性对照为阴性对照质粒，所述阴性对照质粒的插入片段为SEQ ID NO:5所示的核苷酸序列，所述阳性对照为阳性对照质粒，所述阳性对照质粒的插入片段为SEQ IDNO:6所示的核苷酸序列。
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