CN104988141A - BRCA2基因g.32912799T＞C突变及其在乳腺癌辅助诊断中的应用 - Google Patents

Abstract

本发明属于基因工程及肿瘤医学领域，公开了BRCA2基因g.32912799T>C突变及其在乳腺癌辅助诊断中的应用。该BRCA2基因突变与BRCA2正常基因序列相比具有g.32912799T>C位点突变。本发明提供了乳腺癌致病的新的突变位点，可用于早期诊断乳腺癌。

Description

BRCA2基因g.32912799T＞C突变及其在乳腺癌辅助诊断中的应用

发明领域

本发明属于基因工程及肿瘤医学领域，涉及BRCA2基因g.32912799T>C突变及其在乳腺癌辅助诊断中的应用。

背景技术

乳腺癌是女性最为常见的恶性肿瘤。据世界卫生组织国际癌症研究中心统计，2012年全球女性乳腺癌新发病例达167万，占全部女性恶性肿瘤发病的25％。同时乳腺癌是全球第五位常见的恶性肿瘤死亡原因，居女性恶性肿瘤死亡原因之首，全球共52万人因乳腺癌死亡，占所有女性恶性肿瘤死亡的14.7％。

中国的女性乳腺癌的发病率也日趋上升，对妇女的健康造成了很大的威胁。

乳腺癌是具有很强遗传背景的恶性肿瘤，5-10％的乳腺癌是因为携带高外显率的乳腺癌易感基因突变所致。BRCA1，BRCA2，TP53，PALB2，PTEN，CHEK2，ATM，RAD50等被认定为乳腺癌易感基因，携带这些基因胚系突变的乳腺癌被称为遗传性乳腺癌。

突变位点的存在被认为赋予了个体不同的表型性状，以及对于环境暴露、药物治疗等因素的不同反应性，因此突变位点可能是导致个体对常见疾病发病易感性差异的重要遗传基础。将疾病的突变位点谱用于疾病的辅助诊断，具有广阔的应用前景。近年来，利用突变位点对疾病进行辅助诊断已经成为临床和科研工作者的研究热点，在肿瘤、先天性疾病和心脑血管疾病等常见重大疾病上的应用价值已初见端倪。

携带BRCA2功能性突变的个体极有可能发展为乳腺癌患者，尤其是乳腺癌家族史携带者。针对突变携带者采取一系列的预防措施，例如较早的进入乳腺癌筛查，并提高筛查频率，以及预防性手术的实施将早期发现乳腺癌而取得较好的干预和治疗效果。中国的BRCA2基因检测起步较晚，尽管有几项相关的研究，但是尚未发现足够量的突变“热点”，尤其是中国人群特异的乳腺癌相关突变。并且由于种族差异，欧美国家的突变谱也不完全适用于中国人群，若能筛选出乳腺癌发病相关的突变位点作为生物标志物，并研制相应的诊断试剂盒，对我国乳腺癌筛查和早期诊断必将是一次有力的推动。

发明内容

本发明的目的是提供一种具有新的突变位点的BRCA2突变基因。

本发明另一个目的是提供检测上述突变位点的特异性引物。

本发明第三个目的是提供上述BRCA2突变基因及特异性引物在制备乳腺癌辅助诊断试剂盒中的应用。

本发明第四个目的是提供一种乳腺癌辅助诊断试剂盒。

发明人通过分离和研究乳腺癌患者及与其年龄匹配的健康对照外周血DNA中的突变，寻找与乳腺癌相关的高特异性的突变位点，并研制出可临床或人群应用的乳腺癌辅助诊断试剂盒，为乳腺癌的筛查和诊断提供支持。

本发明的目的是通过下列技术方案实现的：

一种用于乳腺癌辅助诊断的BRCA2突变基因，该突变基因与BRCA2正常基因序列相比具有g.32912799T>C位点突变。

用于检测上述BRCA2基因的突变位点的特异性测序引物，其上游引物的序列如为SEQ ID NO.3所示，下游引物的序列如SEQ ID NO.4所示。

用于检测上述BRCA2基因的检测方法，该方法采用Sanger测序方法，使用PCR扩增引物，对BRCA2基因进行突变检测；其中PCR扩增引物的上游引物的序列如为SEQ ID NO.3所示，下游引物的序列如SEQ ID NO.4所示。

上述的BRCA2突变基因在制备乳腺癌辅助诊断试剂盒中的应用。

上述的引物在制备乳腺癌辅助诊断试剂盒中的应用。

一种乳腺癌辅助诊断试剂盒，该试剂盒用于检测BRCA2基因是否具有g.32912799T>C位点突变。

所述的试剂盒，该试剂盒含有上述引物(上游引物的序列如为SEQ ID NO.3所示，下游引物的序列如SEQ ID NO.4所示)，该试剂盒还可以含有PCR技术所需的常用试剂。

具体地说

采用Sanger测序技术在70例具有乳腺癌家族史的中国汉族女性乳腺癌患者中，我们发现有1例患者存在BRCA2基因组第13号染色体的32912799位置发生T碱基到C碱基的突变；随后进行无家族史乳腺癌样本验证，在3000例无家族史中国汉族乳腺癌女性乳腺癌患者中，存在8例患者携带该突变；在3000例无肿瘤家族史，年龄匹配的正常女性对照人群中，未发现突变个体。因此，该突变对乳腺癌的阳性预测值为100％，人群家族性乳腺癌患者中发生率为1.43％，散发性乳腺癌中发生率为0.27％。为进一步提高该突变致乳腺癌的可靠性，我们在2004年建立的正常人群队列(排除任何肿瘤患者，排除乳腺癌家族史患者)中女性7120名(36岁-70岁)检测该突变，发现突变阳性1例(基线时为47岁)，随访至2013年，共发生25例新发乳腺癌患者，其中包含该突变阳性者。该突变位点为本研究首次在中国汉族女性乳腺癌患者中发现，且在正常人群中不存在该突变，通过纳入前瞻性队列研究，证明了携带该突变的患者最终发展成了乳腺癌，证明了该位点是乳腺癌的致病因素。

以上研究所发现的与乳腺癌辅助诊断相关的突变位点为g.32912799T>C(NC_000013.10)，该突变发生于第13号染色体的32912799位置(NCBI参考序列GRCh37.p13)，该基因在NCBI参考数据库GRCh37.p13中的编号为NC_000013.10(32889617-32973809)，这里列出在该数据库中本突变位点前后100bp的碱基序列供参考，如SEQ ID NO:1所示，BRCA2基因突变序列对应的序列如SEQ ID NO:2所示，其中突变位点为在SEQ ID NO:1序列的第101位由碱基T突变为C碱基。

SEQ ID NO:1

ACTTCAAATAAAGAACAGTTAACTGCTACTAAAACGGAGCAAAATATAAAAGATTTTGAGACTTCTGATACATTTTTTCAGACTGCAAGTGGGAAAAATATTAGTGTCGCCAAAGAGTCATTTAATAAAATTGTAAATTTCTTTGATCAGAAACCAGAAGAATTGCATAACTTTTCCTTAAATTCTGAATTACATTCTGAC

SEQ ID NO:2

ACTTCAAATAAAGAACAGTTAACTGCTACTAAAACGGAGCAAAATATAAAAGATTTTGAGACTTCTGATACATTTTTTCAGACTGCAAGTGGGAAAAATACTAGTGTCGCCAAAGAGTCATTTAATAAAATTGTAAATTTCTTTGATCAGAAACCAGAAGAATTGCATAACTTTTCCTTAAATTCTGAATTACATTCTGAC

本发明解决问题的技术方案包括：(1)筛选出人群中BRCA2与乳腺癌发生相关的新突变，提供位点的突变后碱基序列(2)建立统一标准的标本库和数据库：以标准操作程序(SOP)采集符合标准的血液样本，系统收集完整的人口学资料和临床资料。(3)突变筛选和验证其作用：采用Sanger测序技术在70例具有乳腺癌家族史的中国汉族女性乳腺癌患者中，我们发现有1例患者存在BRCA2基因的基因组序列中32912799位置T碱基突变为C；随后进行无家族史乳腺癌样本验证，在3000例无家族史中国汉族女性乳腺癌患者中，存在8例患者携带该突变；在3000例无肿瘤家族史，年龄匹配的中国汉族正常女性对照人群中，未发现突变个体。我们在2004年建立的中国汉族正常人群队列(排除任何肿瘤患者，排除乳腺癌家族史患者)中女性7120名(36岁-70岁)检测该突变，发现突变阳性1例(基线时为47岁)，随访至2013年，共发生25例新发乳腺癌患者，其中包含该突变阳性者。(3)对筛选出的突变位点，需要满足在正常人群中无频率。(4)乳腺癌辅助诊断试剂盒的研制：根据乳腺癌病例所独有的突变位点开发突变位点辅助诊断试剂盒。

本发明人以标准操作程序(SOP)采集符合标准的血液样本，系统收集完整的人口学资料、临床资料等，并采用了Sanger测序对BRCA2基因的外显子编码区域进行扫描。

具体来说研究的实验方法主要包括以下几个部分：

1.研究样本的选择(均为中国汉族)

(1)经病理学明确诊断的具有乳腺癌家族史的乳腺癌病例；

(2)经病理学明确诊断的散发型乳腺癌病例；

(3)与病例年龄匹配的健康女性对照；

(4)社区来源的全人群队列样本。

本研究共采用13190例符合标准的样本进行研究。

2.酚-氯仿法提取外周血基因组DNA，按常规方法操作。通常能得到20-50ng/μlDNA，纯度(紫外260OD与280OD比值)在1.6-2.0。

3.Sanger测序技术筛选突变位点

(1)取受试者全基因组DNA样本；

(2)采用Primer 3软件在线设计引物；

(3)采用Sanger测序对BRCA2基因的外显子编码区进行扫描；

(4)检测并比较各基因型在乳腺癌病例与健康女性对照中的分别差异。

4.单个突变位点采用Sanger测序平台进行基因分型

(1)取受试者DNA样本；

(2)采用Primer 3软件在线设计引物；

(3)采用Sanger测序对BRCA2基因突变的外显子编码区进行扫描；

(4)检测并比较乳腺癌病例与健康女性对照中不同基因型的分布差异。

5.诊断试剂盒制备方法

采用Sanger测序对BRCA2基因的外显子编码区进行扫描和单个突变位点检测后确定乳腺癌病例与健康对照中基因型分布差异的突变位点，作为乳腺癌诊断的指标。最后筛选出的与乳腺癌发病有关的突变位点组成辅助诊断试剂盒(g.32912799T>C)。诊断试剂可以包括该突变位点的特异性引物以及Taq酶、dNTP等试剂。

6.统计分析方法

运用卡方检验(用于分类变量)或者student t检验(用于连续性变量)比较人口学特征等在研究对象组间分布的差异。

统计学分析均通过专门的统计学分析软件完成(PLINK1.07)。统计学显著性水平P值设为0.05，所有统计学检验均为双侧检验。

以下是本发明进一步的说明：

在上述70例有家族史的乳腺癌病例中我们采用Sanger测序对BRCA2基因的外显子编码区进行扫描得相关结果。

根据Sanger测序检测结果，本发明人检测到在“乳腺癌病例”组中的1名患者存在g.32912799T>C突变。

根据上述检测结果，我们将这个与乳腺癌发病相关的突变位点在中国汉族无家族史乳腺癌样本验证，在3000例无家族史中国汉族乳腺癌患者中，存在8例患者携带该突变；在3000例中国汉族无肿瘤家族史，年龄匹配的正常女性对照人群中，未发现突变个体。

在3000例散发性中国汉族乳腺癌患者中，存在8例患者携带该突变；在3000例中国汉族正常人群中，未发现突变个体。进一步在队列人群中对该突变位点用于乳腺癌诊断的效果进行评价，发现其能够进行乳腺癌的早期诊断，且在正常人群中无突变个体。

根据上述实验结果，本发明人发现了一个能用于乳腺癌辅助诊断的突变位点。

具体而言，该突变位点的碱基序列的改变有助于乳腺癌的辅助诊断，为临床医生快速准确掌握患者的疾病状态和病情严重程度，及时采取更具个性化的防治方案提供支持。

本发明有益效果：

本发明提供的突变位点序列改变作为乳腺癌辅助判断的标志物的优越性在于：

(1)突变位点是一种新型基因生物标志物，区别于传统生物标志物，稳定、微创、易于检测，将大大提高疾病诊断的敏感性和特异性，该类生物标志物的成功开发将为乳腺癌的诊断和治疗开创全新局面，为其他疾病生物标志物的研制提供借鉴。

(2)采用严密的验证和评价体系，本发明人初期采用Sanger测序对BRCA2基因的外显子编码区进行扫描以获取疾病相关的突变位点谱，并应用Sanger测序方法在大样本散发型中国汉族乳腺癌患者中进行了验证；以上方法和策略的应用加速和保证了突变位点生物标志物和诊断试剂盒在临床上的应用，也为其他疾病生物标志物的研制提供方法和策略上的借鉴。该突变位点为本研究首次在中国汉族女性乳腺癌患者中发现，且在正常人群中不存在该突变，数据库显示欧美人群该区域的扫描也未发现该突变位点。通过纳入前瞻性队列研究，证明了携带该突变的患者最终发展成了乳腺癌，证明了该位点是乳腺癌的致病因素。

本发明通过控制年龄对疾病发展的影响因素，研究突变位点在乳腺癌辅助诊断的应用前景，阐述突变位点对于乳腺癌进展的影响，揭示其诊断价值。因此，本发明获得了乳腺癌发病相关突变位点谱和特异性标志物；通过突变位点序列的改变进行相关诊断试剂盒的研制和应用，可使得乳腺癌的诊断更加方便易行，为临床医生快速准确掌握患者病情，为临床治疗效果评价奠定基础，并为发现具有潜在治疗价值的新型小分子药物靶标提供帮助。

具体实施方式

实施例1样品的收集和样品资料的整理

发明人于2004年开始至2013年从南京医科大学肿瘤中心及社区正常人群中收集了大量的中国汉族女性乳腺癌患者及正常人群的血标本，通过对样品资料的整理，发明人从中选择了符合下列标准的样本Sanger测序扫描分型的实验样品：

1、病理学明确诊断的具有乳腺癌家族史的乳腺癌患者70例；

2、病理学明确诊断的无家族史散发型乳腺癌患者3000例；

3、无肿瘤家族史，与病例年龄匹配的健康女性对照3000例；

4、社区来源的全人群队列中的女性样本7120例。

并系统采集了这些样本的人口学资料和临床资料等情况。

实施例2外周血DNA中突变位点的测序扫描

在上述70例有家族史的乳腺癌患者和健康对照中，采用Sanger测序检测获得相关结果，测序过程遵循Sanger测序的标准操作，人工设计Sanger测序引物，引物序列为F:5’-GGCCAGTTTATGAAGGAGGG-3’(SEQ ID NO:3)和R:5’-TGGCACCACAGTCTCAATAGA-3’(SEQ ID NO:4)，引物序列由南京金斯瑞公司合成(详见表1)。

具体步骤为：

1、向储存于2ml冻存管中的白细胞加入溶血试剂(即裂解液，40份量配置方法如下：蔗糖219.72g、氯化镁2.02g和曲拉通X-100(amresco 0694)20ml混合后，用TrisHcl溶液定容至2000ml，下同)，颠倒混匀后完全转入。

2、去除红细胞：用溶血试剂将5ml离心管补至4ml，颠倒混匀，4000rpm离心10分钟，弃上清。向沉淀中加入4ml溶血试剂，再次颠倒混匀清洗一次，4000rpm离心10分钟，弃上清。

3、抽提DNA：向沉淀中加1ml抽提液(每300ml中含有122.5ml 0.2M氯化钠，14.4ml 0.5M乙二胺四乙酸，15ml 10％十二烷基硫酸钠，148.1ml双蒸水，下同)和8μl蛋白酶K，震荡器上充分震荡混匀，37℃水浴过夜。

4、去除蛋白质：加1ml饱和酚充分混匀(手轻摇15分钟)，4000rpm离心10分钟，取上清转入新的5ml离心管中。在上清液中加入等体积氯仿与异戊醇混合液(氯仿：异戊醇＝24：1，v/v，下同)，充分混匀后(手摇15分钟)，4000rpm离心10分钟，取上清(分入两个1.5ml的离心管)。

5、DNA沉淀：在上清液中加入3M的醋酸钠60μl,再加入与上清液等体积的冰无水乙醇，上下轻摇，可见白色絮状沉淀物，再以12000rpm离心10min。

6、DNA洗涤：在沉淀中加入冰无水乙醇1ml,12000rpm离心10min,弃上清后真空抽干或置于清洁干燥环境中蒸干。

7、测量浓度:通常能得到20-50ng/μl DNA，纯度(紫外260OD与280OD比值)在1.6-2.0。

8、PCR反应体系30微升，包括：模板50ng；引物F：1微升和引物R：1微升；2×MIX 15微升；H₂O补足至30微升。

9、PCR反应程序：95℃5min；(95℃30s；56℃30s；72℃30s)×40个循环；72℃6min；4℃保存。

10、采用ABI3730平台进行Sanger测序；

11、使用Chromas2软件进行序列比较和分析。

12、Sanger测序结果的分析与处理:在“乳腺癌病例”组中发现有1例患者存在BRCA2基因的基因组序列32912799位置T碱基突变为C。

实施例3单个突变位点的Sanger测序基因分型

将上述Sanger测序扫描发现与乳腺癌发病有关的突变位点在3000例病理学明确诊断的无家族史散发型中国汉族女性乳腺癌患者和3000例无肿瘤家族史，与病例年龄匹配的中国汉族女性健康女性对照中进行检测，具体步骤为：

1、向储存于2ml冻存管中的白细胞加入溶血试剂，颠倒混匀后完全转入。

2、去除红细胞：用溶血试剂将5ml离心管补至4ml，颠倒混匀，4000rpm离心10分钟，弃上清。向沉淀中加入4ml溶血试剂，再次颠倒混匀清洗一次，4000rpm离心10分钟，弃上清。

3、抽提DNA：向沉淀中加1ml抽提液和8μl蛋白酶K，震荡器上充分震荡混匀，37℃水浴过夜。

4、去除蛋白质：加1ml饱和酚充分混匀(手轻摇15分钟)，4000rpm离心10分钟，取上清转入新的5ml离心管中。在上清液中加入等体积氯仿与异戊醇混合液(氯仿：异戊醇＝24：1)，充分混匀后(手摇15分钟)，4000rpm离心10分钟，取上清(分入两个1.5ml的离心管)。

5、DNA沉淀：在上清液中加入3M的醋酸钠60μl,再加入与上清液等体积的冰无水乙醇，上下轻摇，可见白色絮状沉淀物，再以12000rpm离心10min。

6、DNA洗涤：在沉淀中加入冰无水乙醇1ml,12000rpm离心10min,弃上清后真空抽干或置于清洁干燥环境中蒸干。

7、测量浓度:通常能得到20-50ng/μl DNA，纯度(紫外260OD与280OD比值)在1.6-2.0。

8、采用Sanger测序平台对于发生突变的外显子进行基因分型。对Sanger测序扫描发现与乳腺癌发病有关的突变位点设计特异性引物(表1)。

9、PCR反应体系30微升，包括：模板50ng；引物F：1微升和引物R：1微升；2×MIX 15微升；H₂O补足至30微升。

10、PCR反应程序：95℃5min；(95℃30s；56℃30s；72℃30s)×40个循环；72℃6min；4℃保存。

11、采用ABI3730平台进行Sanger测序；

12、使用Chromas2软件进行序列比较和分析，在3000例中国汉族散发性乳腺癌患者中，存在8例患者携带该突变；在3000例正常人群中，未发现突变个体。

因此，本发明人证明了采用BRCA2基因g.32912799T>C突变能够很好地将健康对照和乳腺癌患者区分。

实施例4全人群队列样本中单个突变位点的Sanger测序基因分型

将上述Sanger测序扫描发现与乳腺癌发病有关的突变位点在2004年建立的全人群队列中的女性7120例进行检测，具体步骤为：

1、向储存于2ml冻存管中的白细胞加入溶血试剂，颠倒混匀后完全转入。

2、去除红细胞：用溶血试剂将5ml离心管补至4ml，颠倒混匀，4000rpm离心10分钟，弃上清。向沉淀中加入4ml溶血试剂，再次颠倒混匀清洗一次，4000rpm离心10分钟，弃上清。

3、抽提DNA：向沉淀中加1ml抽提液和8μl蛋白酶K，震荡器上充分震荡混匀，37℃水浴过夜。

4、去除蛋白质：加1ml饱和酚充分混匀(手轻摇15分钟)，4000rpm离心10分钟，取上清转入新的5ml离心管中。在上清液中加入等体积氯仿与异戊醇混合液(氯仿：异戊醇＝24：1)，充分混匀后(手摇15分钟)，4000rpm离心10分钟，取上清(分入两个1.5ml的离心管)。

5、DNA沉淀：在上清液中加入3M的醋酸钠60μl,再加入与上清液等体积的冰无水乙醇，上下轻摇，可见白色絮状沉淀物，再以12000rpm离心10min。

6、DNA洗涤：在沉淀中加入冰无水乙醇1ml,12000rpm离心10min,弃上清后真空抽干或置于清洁干燥环境中蒸干。

7、测量浓度:通常能得到20-50ng/μl DNA，纯度(紫外260OD与280OD比值)在1.6-2.0。

8、采用Sanger测序平台对于发生突变的外显子进行基因分型。对Sanger测序扫描发现与乳腺癌发病有关的突变位点设计特异性引物(表1)。

9、PCR反应体系30微升，包括：模板50ng；引物F：1微升和引物R：1微升；2×MIX 15微升；H₂O补足至30微升。

10、PCR反应程序：95℃5min；(95℃30s；56℃30s；72℃30s)×40个循环；72℃6min；4℃保存。

11、采用ABI3730平台进行Sanger测序；

12、使用Chromas2软件进行序列比较和分析，我们在2004年建立的中国汉族正常人群队列(排除任何肿瘤患者，排除乳腺癌家族史患者)中女性7120名(36岁-70岁)检测该突变，发现突变阳性1例(基线时为47岁)，随访至2013年，共发生25例新发乳腺癌患者，其中包含该突变阳性者。

因此，本发明人证明了采用BRCA2基因g.32912799T>C突变能够很好地将健康对照和乳腺癌患者区分。

实施例5用于乳腺癌辅助诊断突变位点试剂盒的制作

突变位点试剂盒的制作和操作流程是基于Sanger测序扫描检测分型技术。试剂盒含有一批突变位点特异性引物(包括下列引物：g.32912799T>C突变位点的引物序列为SEQ ID No:3和SEQ ID No:4)，该试剂盒还可以包括PCR反应常用的试剂，如Taq酶、dNTP混合液、MgCl₂溶液、去离子水等；这些常用试剂都是本领域技术人员熟知的，另外还可以含有标准品和/或对照品(如确定基因型的标准品和空白对照等)。此试剂盒的价值在于只需要外周血而不需要其它组织样品，通过最精简和特异的引物对检测突变位点，再通过突变位点谱辅助判断乳腺癌，不仅稳定，检测方便，且精确，大大提高疾病诊断的敏感性和特异性，因此将此试剂盒投入实践，可以帮助指导诊断和更有效的个体化治疗。

表1.相关突变位点引物和探针信息

Claims (9)

1.一种用于乳腺癌辅助诊断的BRCA2突变基因，其特征在于该突变基因与BRCA2正常基因序列相比具有g.32912799T>C位点突变。

2.用于检测权利要求1所述BRCA2基因的突变位点的特异性测序引物，其特征在于上游引物的序列如为SEQ ID NO.3所示，下游引物的序列如SEQ ID NO.4所示。

3.用于检测权利要求1所述BRCA2基因的检测方法，其特征在于：采用Sanger测序方法，使用PCR扩增引物，对BRCA2基因进行突变检测。

4.根据权利要求3所述的检测方法，其特征在于：所述PCR扩增引物的上游引物的序列如为SEQ ID NO.3所示，下游引物的序列如SEQ ID NO.4所示。

5.权利要求1所述的BRCA2突变基因在制备乳腺癌辅助诊断试剂盒中的应用。

6.权利要求2所述的引物在制备乳腺癌辅助诊断试剂盒中的应用。

7.一种乳腺癌辅助诊断试剂盒，其特征在于该试剂盒用于检测BRCA2基因是否具有g.32912799T>C位点突变。

8.根据权利要求7所述的试剂盒，其特征在于该试剂盒含有权利要求2所述的引物。

9.根据权利要求8所述的试剂盒，其特征在于该试剂盒还含有PCR技术所需的常用试剂。