CN107254546A - 一种与乳腺癌新辅助化疗疗效相关的snp标志物及其应用 - Google Patents

Abstract

本发明涉及一种与乳腺癌新辅助化疗疗效相关的SNP标志物及其应用，具体为与乳腺癌新辅助紫杉醇类方案化疗疗效相关的SNP标志物及其应用，所述SNP标志物包括FGFR2基因上的rs2981578位点和FGFR4基因上rs1966265位点。作为上述SNP标记的应用，本发明还提供用于检测或预测乳腺癌新辅助化疗疗效的试剂盒。本发明可用于检测或预测乳腺癌新辅助紫杉醇类方案化疗疗效，为此类病患个体化治疗的实现提供依据，用于指导个体化治疗、改善患者的预后，提高临床用药的有效性和安全性。

Description

一种与乳腺癌新辅助化疗疗效相关的SNP标志物及其应用

技术领域

本发明涉及基因工程与肿瘤学技术领域，具体地，本发明涉及一种与乳腺癌新辅助化疗疗效相关的SNP标志物及其应用。

背景技术

乳腺癌是女性最常见的恶性肿瘤之一，发病率占全身各种恶性肿瘤的7-10％，位居女性恶性肿瘤发病率的第一位。全球每年有120万妇女患乳腺癌，50万妇女死于乳腺癌。化学治疗已与手术治疗、放射治疗一样成为肿瘤治疗的主要手段。乳腺癌新辅助化疗(Neoadjuvant Chemotherapy，NACT)又称术前化疗或初始化疗，本质属于辅助化疗，它是指对非转移性肿瘤在局部治疗前进行的全身性、系统性的细胞毒性药物治疗。目前，诸多新辅助化疗方案不但可以用于晚期乳腺癌患者，而且还能让越来越多的早期乳腺癌患者受益，取得了良好的社会和经济效益。随着化疗药物的不断更新，乳腺癌在化学治疗方面已取得了令人瞩目的进展。紫杉醇类和蒽环类药物经过多年的临床实践已成为乳腺癌化疗的两大基石，广泛用于一线和二线局部晚期以及复发、转移性乳腺癌的治疗，规范的治疗能明显改善乳腺癌的预后。但在临床实践和研究中也发现，乳腺癌的化疗疗效和毒副反应存在个体差异，紫杉醇单药用于一线治疗的有效率为32-62％，多西紫杉醇用于转移性乳腺癌的治疗反应率为30-50％。

NACT的临床应用已有30多年的历史，近年来虽然取得了较大进步，但随着研究的深入也发现了亟待解决的问题和不足：约20％的乳腺癌患者对NACT不敏感，对于这部分患者来说，如果NACT不敏感而疗程过长可能会延误局部治疗的时机，正是这个原因使部分医师和患者在开展NACT时过分保守，pCR率低于10％。这就需要一种精确的疗效预测指标，用以在化疗前预测NACT的疗效，避免治疗的盲目性。

对NACT疗效有预测作用的相关指标的研究有助于选择可能从NACT中获益的病人进行术前化疗，提高乳腺癌NACT的病理完全缓解率和长期生存率，同时避免对化疗无效的病人进行不必要的术前化疗，以免延误其最佳的治疗时机。NACT能在短期内获得乳腺癌对化疗方案敏感性的信息，这个特点决定了其在预测辅助化疗的疗效方面具有更高的效率。

因此，从药物遗传学和药物基因组学角度研究患者之间药物敏感性的差异，寻找可靠的预测指标，指导个体化治疗，对于指导个体化治疗、改善患者的预后，提高临床用药的有效性和安全性具有极其重要的意义。而单核苷酸多态性(Single NucleotidePolymorphisms，SNP)的作用也得到了越来越多的关注。SNP是指单个核苷酸的改变而引起的DNA序列的改变，它是人类最常见的可遗传变异，在人类基因组中广泛存在。SNP赋予个体对环境暴露、药物治疗等的不同反应，从而产生不同的表型，因此SNP可能是导致个体疾病发生发展差异的重要遗传基础。

最近大量的研究表明成纤维细胞生长因子受体(Fibroblast Growth FactorReceptor，FGFR)与乳腺癌的发生、发展及预后密切相关，FGFR的基因多态性也与患者对乳腺癌化疗/放疗的治疗敏感性密切相关，因此在本发明中选择FGFR基因作为研究基因，同时选择FGFR基因上的SNP位点作为研究方向，以筛选出能够检测或预测乳腺癌新辅助化疗疗效的SNP位点。

发明内容

本发明的目的在于克服现有技术中的缺陷，提供一种与乳腺癌新辅助化疗疗效相关的SNP标志物及其应用，具体的说，提供一种能够检测或预测乳腺癌新辅助化疗患者紫杉醇类化疗疗效的SNP标志物及其应用，发明人通过对乳腺癌患者外周血基因组DNA的分子标记进行检测，寻找一种与乳腺癌新辅助化疗患者紫杉醇类化疗疗效相关的高特异性和敏感性的SNP标志物，并研制出可便于临床应用的与乳腺癌新辅助化疗相关的试剂盒，以用于指导个体化治疗、改善患者的预后，提高临床用药的有效性和安全性。

为实现上述目的，本发明采用如下技术方案：

本发明的第一个目的是提供一种与乳腺癌新辅助化疗疗效相关的SNP标志物，其包括FGFR2基因上的rs2981578、FGFR4基因上的rs1966265中的至少一种；其中所述SNP标志物与乳腺癌新辅助紫杉醇类方案化疗疗效相关，所述紫杉醇类方案为以紫杉醇类药物(如：紫杉醇、多西紫杉醇、紫杉醇脂质体等)为主，同时联合环磷酰胺和蒽环类(如多柔比星、表柔比星等)药物的化疗方案。本发明的第二个目的是提供一种上述SNP标志物的特异性扩增引物，该特异性引物是指针对上述两个基因多态位点而设计，能特异性扩增出包含这2个SNP位点中的至少一个的DNA片段的引物对。特异性引物对可用常规的合成技术进行合成。上述SNP标志物的特异性扩增引物包括rs2981578的扩增引物、rs1966265的扩增引物中的至少一种；其中，rs2981578的扩增引物序列为SEQ ID No：1和SEQ ID No：2，rs1966265的扩增引物序列为SEQ ID No：3和SEQ ID No：4。

上述SNP位点：rs2981578和rs1966265的引物信息如下表所示：

表1.相关SNP位点的引物信息

本发明的第三个目的是提供一种上述SNP标志物的特异性扩增引物在制备用于检测或预测乳腺癌新辅助化疗疗效的试剂盒中的应用。

本发明的第四个目的是提供一种上述SNP标志物在制备乳腺癌新辅助化疗紫杉醇类药物中的应用。

本发明的第五个目的是提供一种含有上述SNP标志物的特异性扩增引物的用于检测或预测乳腺癌新辅助化疗疗效的试剂盒。

优选地，该试剂盒用于检测外周血DNA中的rs2981578和/或rs1966265。

优选地，该试剂盒还可以包括PCR反应常用的酶和试剂，如Taq酶、dNTP混合液、MgCl₂溶液、去离子水(蒸馏水)等；还可以含有标准品和/或对照品。

本发明的第六个目的是提供一种使用上述试剂盒对乳腺癌患者新辅助化疗疗效进行预测和检测的方法，其包括如下步骤：

(1)采集被检测者的外周血2ml，保存于-20℃冰箱；

(2)从外周血标本中抽提基因组DNA；

(3)使用上述试剂盒中的特异性扩增引物特异性扩增包含FGFR2基因上rs2981578和/或FGFR4基因上rs1966265位点的DNA片段，并对所获得的DNA片段进行测序，得到位点的基因型数据；

(4)根据所得到的位点基因型数据对被检测者进行化疗疗效评估。

本发明的技术方案具体包括：

(1)采集符合标准的血液样本，系统收集完整的人口学资料和临床资料；

(2)基因型检测：选择乳腺癌化疗病例，查阅已有文献，找出与乳腺癌风险或预后相关的SNP；对筛选出的SNP，进一步采用基因分型进行检测，找出与乳腺癌新辅助化疗疗效相关的SNP。

(3)用于检测或预测乳腺癌新辅助化疗疗效的试剂盒的研制：根据乳腺癌新辅助化疗病例中不同化疗疗效的患者基因型分布频率有显著差异的SNP位点开发用于检测或预测乳腺癌新辅助化疗疗效的试剂盒。

具体来说研究的实验方法主要包括以下几个部分：

1.研究样本的选择；

本发明所使用的肿瘤患者血样样本来自复旦大学附属华山医院(北院)，乳腺癌血液样本来自90例接受新辅助化疗的患者。研究首先收集以紫杉醇类(环磷酰胺+表柔比星+紫杉醇/多西他赛)方案行新辅助化疗的乳腺癌患者病史资料，对患者的化疗疗效进行评价，同时采集患者的外周静脉血样，提取患者全血DNA，检测FGFR的单核苷酸多态性。研究样本的入选标准如下：年龄为18～70岁的女性；经病理穿刺活检或细胞学确诊的乳腺癌患者；经乳腺钼靶或B超证实具有可测量的肿瘤病灶；接受环磷酰胺(C)+表柔比星(E)+紫杉醇或多西他赛(T)方案的新辅助化疗；新辅助化疗后接受左/右乳根治术；身体一般状况评分PS0-2；无主要脏器的功能障碍，血常规、肝肾功能及心脏功能基本正常；能获得完整的随访信息。所有研究对象均为无血缘关系的汉族人群，地理上主要来自上海及其周边地区。所有患者均是首次接受紫杉醇类为基础的一线治疗方案。

对上述纳入病患，收集整理其基本信息、临床信息以及治疗信息，并依据知情同意原则签署知情同意书。患者在入组接受两周期治疗后，按照实体瘤疗效评价标准RECIST1.0版本进行疗效评价，判定标准如下：完全缓解(CR)，部分缓解(PR)，疾病稳定(SD)与疾病进展(PD)。近期客观有效为CR+PR。

说明：疗效评估标准(RESICT)：测量所有靶病灶的最长径，并计算所有靶病灶的最长径之和，与基线状态的最长径之和相比，肿瘤客观疗效评价标准如下：完全缓解(CR)—所有靶病灶消失；部分缓解(PR)—靶病灶最长径之和与基线状态比较，至少减少30％；病变进展(PD)—靶病灶最长径之和与治疗开始之后所纪录到的最小的靶病灶最长径之和比较，增加20％，或者出现一个或多个新病灶；病变稳定(SD)—介于部分缓解和疾病进展之间。

2.基因组DNA的抽提；

患者化疗前使用EDTA抗凝的采血管收集研究对象的外周静脉血2ml，离心分离血清和血细胞后保存于-80℃冰箱。采用可以特异性结合DNA的离心吸附柱和独特的缓冲系统，提取外周血基因组DNA，按常规方法操作。通常能得到20-50ng/μLDNA，纯度(紫外2600D：2800D)在1.6-2.0。

3.SNPs分型；

对包含FGFR2基因rs2981578和FGFR4基因rs1966265多态位点的DNA片段进行特异性扩增，并对所获得的DNA片段进行测序，得到rs2981578和rs1966265位点的基因型数据。

4.统计分析；

运用卡方检验(用于分类变量)或者student t检验(用于连续性变量)比较人口学特征、吸烟、组织类型、分期等在研究对象组间分布的差异；以logistic回归模型为rs2981578和rs1966265多态位点计算出优势比(Odds Ratio，OR)及其95％置信区间(95％confidence interval，95％CI)，以此评估基因位点多态性对乳腺癌患者新辅助化疗疗效的影响。

5.结果分析；

FGFR4基因rs1966265位点基因型为A/A时，紫杉醇类化疗有效率更高，A/A型患者比G/G基因型获得更好的化疗疗效，隐形模型(AA vs.AG/GG)显示患者的化疗疗效好坏之间存在明显差异：(P＝0.004，OR＝6.882，95％CI＝1.880-25.19)。同时，rs1966265位点中碱基为A的患者其化疗的疗效也明显好于碱基为G的位点。FGFR2基因rs2981578碱基从G突变为A，乳腺癌患者化疗疗效升高(P＝0.025，OR＝2.103，95％CI＝1.096-4.034)。

6.预测试剂盒制备方法；

单个SNP检测后确定乳腺癌新辅助化疗病例中不同化疗疗效的患者基因型分布频率有显著差异的SNP，作为乳腺癌新辅助化疗疗效判定的指标。筛选出的与乳腺癌化疗疗效有关的SNP辅助诊断试剂盒，其包含FGFR2基因上rs2981578和/或FGFR4基因上rs1966265位点的特异性扩增引物，以及Taq酶、dNTPs等试剂。

7.利用本发明人制备的乳腺癌辅助诊断试剂盒检测待筛查的乳腺癌患者并与实际临床检测相比较以确定了乳腺癌辅助诊断试剂盒的有效性。具体包括测定受试者血标本cDNA中上述SNP的特异性扩增引物和其他检测试剂，为临床医生快速准确掌握患者的疾病状态和病情严重程度，及时采取更具个性化的防治方案提供支持。

与现有技术相比，本发明具有以下有益效果：

本发明通过对乳腺癌患者外周血基因组DNA的分子标记进行检测，筛选出一种与乳腺癌新辅助化疗患者紫杉醇类化疗疗效相关的高特异性和敏感性的SNP标志物，其有助于选择可能从NACT中获益的病人进行术前化疗，提高乳腺癌NACT的病理完全缓解率和长期生存率，同时避免对化疗无效的病人进行不必要的术前化疗，以免延误其最佳的治疗时机。

本发明所述的用于检测或预测乳腺癌新辅助化疗疗效的试剂盒只需要外周血而不需要其它组织样品，通过最精简和特异的扩增引物及延伸引物检测SNP，再通过SNP谱评价接受药物化疗的肿瘤患者毒副反应，不仅稳定，检测方便，且精确，大大提高疾病诊断的敏感性和特异性，因此将此试剂盒投入实践，可以帮助指导高危人群的筛检和更有效的个体化治疗。

具体实施方式

下面结合实施例，对本发明的具体实施方式作进一步描述。以下实施例仅用于更加清楚地说明本发明的技术方案，而不能以此来限制本发明的保护范围。若未特别指明，实施例中所用的技术手段为本领域技术人员所熟知的常规手段。

实施例一

本实施例为样品的收集和样品资料的整理。

发明人于2015年9月至2016年11月在上复旦大学附属华山医院收集了大量的乳腺癌化疗患者血标本，通过对样品资料的整理，发明人从中选择了90例符合下列标准的样本：(1)年龄为18～70岁的女性；(2)经病理穿刺活检或细胞学确诊的乳腺癌患者；(3)经乳腺钼靶或B超证实具有可测量的肿瘤病灶；(4)接受4周期的环磷酰胺(C)+表柔比星(E)+紫杉醇或多西他赛(T)方案的新辅助化疗；(5)新辅助化疗后接受左/右乳根治术；(6)身体一般状况评分PS 0-2；(7)无主要脏器的功能障碍，血常规、肝肾功能及心脏功能基本正常；(8)能获得完整的随访信息；并系统采集了这些样本的人口学资料和临床资料等情况。

实施例二

本实施例为外周血DNA提取、基因型检测及结果分析。

在上述实施例一种符合条件的90例乳腺癌患者中，其疾病状态和生理状态均衡可比，物统计学差异。

具体步骤为：

1)提取200μl新鲜血液，加入20ul Proteinase K溶液，混匀；

2)加入200μl缓冲液GB，充分颠倒混匀，70℃放置10min，简短离心以去除管盖内壁的水珠；

3)加人200μl无水乙醇，充分振荡混匀15sec，简短离心以去除管盖内壁的水珠；

4)将上一步所得溶液和絮状沉淀都加入一个吸附柱CB3中(吸附柱放入收集管中)，12000rpm(～13400×g)离心30sec，倒掉废液，将吸附柱CB3放回收集管中。再重复操作该步骤一次；

5)将吸附柱CB3放回收集管中，12000rpm(～13400×g)离心2min，倒掉废液。将吸附柱CB3置于室温放置数分钟，以彻底晾干吸附材料中残余的漂洗液。

6)将吸附柱CB3转入一个干净的离心管中，向吸附膜的中间部位悬空滴加50-200μl洗脱缓冲液TE，室温放置2-5min，12000rpm(～13400×g)离心2min，将溶液收集到离心管中。

7)测量浓度：通常能得到20-50ng/μLDNA，纯度(紫外2600D：2800D)在1.8-2.0。

8)测序：对与乳腺癌化疗方案疗效有关的2个SNP设计特异性扩增引物；PCR扩增结束后，取5μL扩增产物，1％琼脂糖凝胶电泳，电泳30min，染色20min，然后将凝胶块置于凝胶成像仪中观察，根据比对Marker的片段大小情况，初步判断扩增片段是否正确。进而对符合要求的扩增产物进行纯化：采用Mag-Bind Oligonucleotide Purification Kit试剂盒，并按试剂盒要求进行操作。上样测序：采用ABI公司BigDye3.1SequencingKit试剂盒，并按试剂盒要求进行操作；用ABI公司3730型测序仪进行测序。

9)数据分析与处理：通过对单核苷酸多态性与乳腺癌患者不同化疗疗效的关联分析可知，FGFR4基因的rs1966265位点的AA基因型患者比GG基因型获得更好的化疗疗效(P＝0.019，OR＝0.167，95％CI＝0.037-0.740)，隐形模型(AA vs.AG/GG)存在明显差异(P＝0.004，OR＝6.882，95％CI＝1.880-25.19)。rs1966265位点中，单个碱基A其化疗的疗效也明显好于碱基G(P＝0.009，OR＝0.427，95％CI＝0.226-0.809)。FGFR2rs2981578碱基从G突变为A，乳腺癌患者化疗疗效升高(P＝0.025，OR＝2.103，95％CI＝1.096-4.034)。结果见表2。

表2单核苷酸多态性与乳腺癌患者不同程度化疗疗效的关联分析结果

实施例三

本实施例为用于检测或预测乳腺癌新辅助化疗紫杉醇类方案疗效的试剂盒的制作。

该SNP试剂盒的制作和操作流程是基于Sequenom Mass ARRAY基因分型平台检测技术。试剂盒含有一组SNP标志物的特异性扩增引物(包括下列引物：序列为SEQ ID No:1和SEQ ID No:2的rs2981578扩增引物和/或序列为SEQ ID No:3和SEQ ID No:4的rs1966265，详见上表1)，还可以有相应PCR技术所需的常用试剂，如：dNTPs，MgCl₂，双蒸水等，这些常用试剂都是本领域技术人员熟知的，另外还可以有标准品和对照(如确定基因型的标准品和空白对照等)。此试剂盒的价值在于只需要外周血而不需要其它组织样品，通过最精简和特异的扩增引物检测SNP位点，再通过SNP谱评价接受药物化疗的肿瘤患者毒副反应，不仅稳定，检测方便，且精确，大大提高疾病诊断的敏感性和特异性，因此将此试剂盒投入实践，可以帮助指导高危人群的筛检和更有效的个体化治疗。

以上对本发明的具体实施例进行了详细描述，但其只作为范例，本发明并不限制于以上描述的具体实施例。对于本领域技术人员而言，任何对本发明进行的等同修改和替代也都在本发明的范畴之中。因此，在不脱离本发明的精神和范围下所作的均等变换和修改，都应涵盖在本发明的范围内。

SEQUENCE LISTING

<110> 复旦大学附属华山医院

<120> 一种与乳腺癌新辅助化疗疗效相关的SNP标志物及其应用

<160> 4

<170> PatentIn version 3.5

<210> 1

<211> 19

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> SNP位点rs2981578的上游引物，5'-3'

<400> 1

ctgctttgga ggattgtga 19

<210> 2

<211> 20

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> SNP位点rs2981578的下游引物，5'-3’

<400> 2

gagactggga aacagatggt 20

<210> 3

<211> 18

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> SNP位点rs1966265的上游引物，5'-3'

<400> 3

gccgccttgt cagttgtg 18

<210> 4

<211> 19

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> SNP位点rs1966265的下游引物，5'-3'

<400> 4

tcctggtgcc cactcttcc 19

Claims (8)

1.一种与乳腺癌新辅助化疗疗效相关的SNP标志物，其特征在于，包括FGFR2基因上的rs2981578、FGFR4基因上的rs1966265中的至少一种。

2.根据权利要求1所述的一种与乳腺癌新辅助化疗疗效相关的SNP标志物，其特征在于，所述SNP标志物与乳腺癌新辅助紫杉醇类方案化疗疗效相关。

3.一种如权利要求1或2所述的SNP标志物的特异性扩增引物，其特征在于，包括rs2981578的扩增引物、rs1966265的扩增引物中的至少一种；其中，rs12981578的扩增引物序列为SEQ ID No：1和SEQ ID No：2，rs1966265的扩增引物序列为SEQ ID No：3和SEQ IDNo：4。

4.一种如权利要求3所述的SNP标志物的特异性扩增引物在制备用于检测或预测乳腺癌新辅助化疗疗效的试剂盒中的应用。

5.一种如权利要求1所述的SNP标志物在制备乳腺癌新辅助化疗紫杉醇类药物中的应用。

6.一种用于检测或预测乳腺癌新辅助化疗疗效的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒包括权利要求3所述的SNP标志物的特异性扩增引物。

7.根据权利要求6所述的一种用于检测或预测乳腺癌新辅助化疗疗效的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒还包括PCR技术常用的试剂。

8.根据权利要求6所述的一种用于检测或预测乳腺癌新辅助化疗疗效的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒的检测样本为外周血。