CN102534008A - 一种与非贲门癌辅助诊断相关的snp标志物及其应用 - Google Patents
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Abstract
本发明属于基因工程及肿瘤医学领域，公开了一种与非贲门癌辅助诊断相关的SNP标志物及其应用。该标志物为rs1950476、rs238889、rs7973779、rs1445227、rs7528071、rs1549058、rs9841504、rs749130、rs17032274、rs3027247、rs9578831、rs714842、rs17262413、rs16924994、rs13361707、rs12496648、rs2826151、rs12416175、rs3753473、rs7349868、rs6026313等25个SNP的组合。该标志物可用于制备非贲门癌辅助诊断试剂盒。
Description
发明领域
本发明属于基因工程及肿瘤医学领域，涉及一种与非贲门癌辅助诊断相关的SNP标志物及其应用。
背景技术
胃癌是全球最常见的恶性肿瘤之一。据世界卫生组织估计，2008年全球范围内大约100万胃癌新发病例，占全部肿瘤发病的7.8％，仅次于肺癌、乳腺癌和结直肠癌。超过70％的胃癌病例发生在发展中国家，其中50％发生在中国。在我国，胃癌年龄标化发病率男性为41.3/10万，女性为18.5/10万，仅次于肺癌。大约90％-95％的胃癌为腺癌，起源于胃部上皮组织。从解剖学上可分为贲门癌和非贲门癌。贲门癌是发生在胃贲门部食管胃交界线下2cm范围内的腺癌。非贲门癌主要包括发生在胃底、胃角、胃窦和幽门部恶性肿瘤。根据国内以往的统计，贲门癌约占全部胃癌的20％，而非贲门癌占据了80％。尽管在全球范围内胃癌的发病率及死亡率均处于下降趋势，而我国仍处于较高发病的及死亡水平。随着人口基数的不断增大和胃癌期望寿命的延长，庞大的胃癌，特别是非贲门癌患病和死亡人数，将在未来相当长一段时期内给我国带来严重的负担，仍然是肿瘤预防及控制的重点。
目前，胃癌的初步诊断方法主要为病史询问、体格检查、实验室检查、胃肠X线检查、纤维内窥镜检查、脱落细胞学检查、B超以及CT检查、肿瘤标记物检测等。鉴别诊断主要依靠X线钡餐造影、胃镜和活组织病理检查。但是现在临床常用的X线钡餐造影和纤维内窥镜检查也存在一些弊端。X线钡餐造影对局部粘膜上较小的肿瘤难以发现，或难以肯定；检查有一定的盲区，可能漏掉小病变，不能确定病变的性质，可能有假阳性或假阴性。纤维内窥镜检查对胃壁整体蠕动情况及胃的形态观察欠完整；对肿瘤的浸润深度、有无转移了解不清；对外压性肿物还是胃壁内肿物难以区别。目前临床所用胃癌标志物特异性不强。血清癌胚抗原(CEA)对诊断意义不大，虽半数患者的胃液中CEA有明显升高，超过100ng/ml，但也与慢性萎缩性胃炎的胃液中含量有重叠。病理活组织检查作为胃癌诊断的金标准，在临床胃癌确诊中居于重要地位，但由于需要做胃镜取尾部组织，不适合作为临床健康筛查。
胃癌的形成是一个复杂的多因素、多阶段的过程，从慢性萎缩性胃炎、肠化生、不典型增生等癌前病变最终进展为胃癌。不过目前其确切发病机制还不是很清楚。宏观流行病学及遗传流行病学研究表明，胃癌的发生是环境因素和个体遗传因素共同作用的结果。其中，幽门螺杆菌(H.pylori)感染已经在1993年被世界卫生组织(WHO)确认为一级致癌物，是胃癌的明确危险因素。然而，相同的环境危险因素暴露下仅有少数个体最终发生胃癌，这说明不同个体对环境暴露的反应存在不同的易感性，这种易感性目前被认为是由个体的遗传因素所决定。例如，全球人群的H.pylori感染率大约在40％-80％，但其中只有1％的H.pylori感染患者进展为胃癌，这说明遗传因素在胃癌的发生发展中起了重要的作用。单核苷酸多态性(single nucleotidepolymorphism，SNP)是指在基因组水平上由单个核苷酸的变异所引起的DNA序列多态性。它是人类可遗传的变异中最常见的一种。SNP的存在被认为赋予了个体不同的表型性状，以及对于环境暴露、药物治疗等因素的不同反应性，因此SNP可能是导致个体对常见疾病发病和预后易感性差异的重要遗传基础。利用疾病易感的SNP谱预测疾病的发生，不仅灵敏、准确和快速，具有广阔的应用前景，而且通过SNP预测谱的构建，还可以实现中国古语中“上医治未病”的理想，对疾病作出前瞻性的“基因诊断”。近年来，利用SNP预测疾病的发生发展已经成为临床和科研工作者的研究热点，在肿瘤和心脑血管疾病等常见重大疾病预测上的应用价值已初见端倪。
然而，目前还没有将SNP应用于非贲门癌诊断的报道，若能筛选出非贲门癌易感的SNP作为生物标志物，并研制相应的诊断试剂盒，对我国非贲门癌诊断现状必将是一次有力的推动，也为其药物筛选、药效评价及靶向治疗开辟了新的途径。
发明内容
本发明的目的是针对上述技术问题，提出一种与非贲门癌辅助诊断相关的SNP标志物及其应用。
本发明的第二个目的是提供上述SNP标志物的特异性引物。
本发明的第三个目的是提供上述SNP标志物的特异性荧光探针对。
本发明的第四个目的是提供上述SNP标志物及其特异性引物和特异性荧光探针在制备非贲门癌辅助诊断试剂盒中的应用。
本发明第五个目的是提供非贲门癌辅助诊断试剂盒。
发明人通过分离和研究非贲门癌患者及与其年龄匹配的健康对照外周血DNA中的单核苷酸多态性，寻找一组与非贲门癌高度相关的高特异性和敏感性的SNP，并研制出可便于临床应用的非贲门癌辅助诊断试剂盒，为非贲门癌的筛查和诊断提供数据支持，为发现具有潜在治疗价值的新型小分子药物提供数据支持。
本发明的目的是通过下列技术方案实现的：
一种与非贲门癌辅助诊断相关的SNP标志物，该标志物为rs1950476、rs238889、rs7973779、rs1445227、rs7528071、rs1549058、rs9841504、rs749130、rs17032274、rs3027247、rs9578831、rs714842、rs17262413、rs16924994、rs13361707、rs12496648、rs2826151、rs12416175、rs3753473、rs7349868、rs6026313、rs12974407、rs17248007、rs1345355和rs10260816的组合。
所述的SNP标志物的特异性引物，这些引物为：
rs1950476的引物序列为SEQ ID No：1和SEQ ID No：2；rs238889的引物序列为SEQ ID No：5和SEQ ID No：6；rs7973779的引物序列为SEQ ID No：9和SEQ ID No：10；rs1445227的引物序列为SEQ ID No：13和SEQ ID No：14；rs7528071的引物序列为SEQID No：17和SEQ ID No：18；rs1549058的引物序列为SEQ ID No：21和SEQ ID No：22；rs9841504的引物序列为SEQ ID No：25和SEQ ID No：26；rs749130的引物序列为SEQID No：29和SEQ ID No：30；rs17032274的引物序列为SEQ ID No：33和SEQ ID No：34；rs3027247的引物序列为SEQ ID No：37和SEQ ID No：38；rs9578831的引物序列为SEQID No：41和SEQ ID No：42；rs714842的引物序列为SEQ ID No：45和SEQ ID No：46；rs17262413的引物序列为SEQ ID No：49和SEQ ID No：50；rs16924994的引物序列为SEQ ID No：53和SEQ ID No：54；rs13361707的引物序列为SEQ ID No：57和SEQ IDNo：58；rs12496648的引物序列为SEQ ID No：61和SEQ ID No：62；rs2826151的引物序列为SEQ ID No：65和SEQ ID No：66；rs12416175的引物序列为SEQ ID No：69和SEQ ID No：70；rs3753473的引物序列为SEQ ID No：73和SEQ ID No：74；rs7349868的引物序列为SEQ ID No：77和SEQ ID No：78；rs6026313的引物序列为SEQ IDNo：81和SEQ ID No：82；rs12974407的引物序列为SEQ ID No：85和SEQ ID No：86；rs17248007的引物序列为SEQ ID No：89和SEQ ID No：90；rs1345355的引物序列为SEQ ID No：93和SEQ ID No：94；rs10260816的引物序列为SEQ ID No：97和SEQ IDNo：98。
所述的SNP标志物的特异性荧光探针对，这些荧光探针为：
rs1950476的荧光探针对序列为SEQ ID No：3和SEQ ID No：4；rs238889的荧光探针对序列为SEQ ID No：7和SEQ ID No：8；rs7973779的荧光探针对序列为SEQ IDNo：11和SEQ ID No：12；rs1445227的荧光探针对序列为SEQ ID No：15和SEQ IDNo：16；rs7528071的荧光探针对序列为SEQ ID No：19和SEQ ID No：20；rs1549058的荧光探针对序列为SEQ ID No：23和SEQ ID No：24；rs9841504的荧光探针对序列为SEQ ID No：27和SEQ ID No：28；rs749130的荧光探针对序列为SEQ ID No：31和SEQID No：32；rs17032274的荧光探针对序列为SEQ ID No：35和SEQ ID No：36；rs3027247的荧光探针对序列为SEQ ID No：39和SEQ ID No：40；rs9578831的荧光探针对序列为SEQ ID No：43和SEQ ID No：44；rs714842的荧光探针对序列为SEQ ID No：47和SEQ ID No：48；rs17262413的荧光探针对序列为SEQ ID No：51和SEQ ID No：52；rs16924994的荧光探针对序列为SEQ ID No：55和SEQ ID No：56；rs13361707的荧光探针对序列为SEQ ID No：59和SEQ ID No：60rs12496648的荧光探针对序列为SEQID No：63和SEQ ID No：64；rs2826151的荧光探针对序列为SEQ ID No：67和SEQ IDNo：68；rs12416175的荧光探针对序列为SEQ ID No：71和SEQ ID No：72；rs3753473的荧光探针对序列为SEQ ID No：75和SEQ ID No：76；rs7349868的荧光探针对序列为SEQ ID No：79和SEQ ID No：80；rs6026313的荧光探针对序列为SEQ ID No：83和SEQ ID No：84；rs12974407的荧光探针对序列为SEQ ID No：87和SEQ ID No：88；rs17248007的荧光探针对序列为SEQ ID No：91和SEQ ID No：92；rs1345355的荧光探针对序列为SEQ ID No：95和SEQ ID No：96；rs10260816的荧光探针对序列为SEQID No：99和SEQ ID No：100。
所述的SNP标志物在制备非贲门癌辅助诊断试剂盒中的应用。
所述的SNP标志物的特异性引物在制备非贲门癌辅助诊断试剂盒中的应用。
所述的SNP标志物的特异性荧光探针对在制备非贲门癌辅助诊断试剂盒中的应用。
一种非贲门癌辅助诊断试剂盒，该试剂盒用于检测外周血DNA中rs1950476、rs238889、rs7973779、rs1445227、rs7528071、rs1549058、rs9841504、rs749130、rs17032274、rs3027247、rs9578831、rs714842、rs17262413、rs16924994、rs13361707、rs12496648、rs2826151、rs12416175、rs3753473、rs7349868、rs6026313、rs12974407、rs17248007、rs1345355和rs10260816。
所述的诊断试剂盒，该试剂盒含有上述SNP标志物的特异性引物和/或特异性荧光探针。
所述的诊断试剂盒，该试剂盒含有的SNP标志物的特异性引物为：
rs1950476的引物序列为SEQ ID No：1和SEQ ID No：2；rs238889的引物序列为SEQ ID No：5和SEQ ID No：6；rs7973779的引物序列为SEQ ID No：9和SEQ ID No：10；rs1445227的引物序列为SEQ ID No：13和SEQ ID No：14；rs7528071的引物序列为SEQID No：17和SEQ ID No：18；rs1549058的引物序列为SEQ ID No：21和SEQ ID No：22；rs9841504的引物序列为SEQ ID No：25和SEQ ID No：26；rs749130的引物序列为SEQID No：29和SEQ ID No：30；rs17032274的引物序列为SEQ ID No：33和SEQ ID No：34；rs3027247的引物序列为SEQ ID No：37和SEQ ID No：38；rs9578831的引物序列为SEQID No：41和SEQ ID No：42；rs714842的引物序列为SEQ ID No：45和SEQ ID No：46；rs17262413的引物序列为SEQ ID No：49和SEQ ID No：50；rs16924994的引物序列为SEQ ID No：53和SEQ ID No：54；rs13361707的引物序列为SEQ ID No：57和SEQ IDNo：58；rs12496648的引物序列为SEQ ID No：61和SEQ ID No：62；rs2826151的引物序列为SEQ ID No：65和SEQ ID No：66；rs12416175的引物序列为SEQ ID No：69和SEQ ID No：70；rs3753473的引物序列为SEQ ID No：73和SEQ ID No：74；rs7349868的引物序列为SEQ ID No：77和SEQ ID No：78；rs6026313的引物序列为SEQ IDNo：81和SEQ ID No：82；rs12974407的引物序列为SEQ ID No：85和SEQ ID No：86；rs17248007的引物序列为SEQ ID No：89和SEQ ID No：90；rs1345355的引物序列为SEQ ID No：93和SEQ ID No：94；rs10260816的引物序列为SEQ ID No：97和SEQ IDNo：98。
所述的诊断试剂盒，该试剂盒含有的SNP标志物的特异性荧光探针对为：
rs1950476的荧光探针对序列为SEQ ID No：3和SEQ ID No：4；rs238889的荧光探针对序列为SEQ ID No：7和SEQ ID No：8；rs7973779的荧光探针对序列为SEQ IDNo：11和SEQ ID No：12；rs1445227的荧光探针对序列为SEQ ID No：15和SEQ IDNo：16；rs7528071的荧光探针对序列为SEQ ID No：19和SEQ ID No：20；rs1549058的荧光探针对序列为SEQ ID No：23和SEQ ID No：24；rs9841504的荧光探针对序列为SEQ ID No：27和SEQ ID No：28；rs749130的荧光探针对序列为SEQ ID No：31和SEQID No：32；rs17032274的荧光探针对序列为SEQ ID No：35和SEQ ID No：36；rs3027247的荧光探针对序列为SEQ ID No：39和SEQ ID No：40；rs9578831的荧光探针对序列为SEQ ID No：43和SEQ ID No：44；rs714842的荧光探针对序列为SEQ ID No：47和SEQ ID No：48；rs17262413的荧光探针对序列为SEQ ID No：51和SEQ ID No：52；rs16924994的荧光探针对序列为SEQ ID No：55和SEQ ID No：56；rs13361707的荧光探针对序列为SEQ ID No：59和SEQ ID No：60 rs12496648的荧光探针对序列为SEQID No：63和SEQ ID No：64；rs2826151的荧光探针对序列为SEQ ID No：67和SEQ IDNo：68；rs12416175的荧光探针对序列为SEQ ID No：71和SEQ ID No：72；rs3753473的荧光探针对序列为SEQ ID No：75和SEQ ID No：76；rs7349868的荧光探针对序列为SEQ ID No：79和SEQ ID No：80；rs6026313的荧光探针对序列为SEQ ID No：83和SEQ ID No：84；rs12974407的荧光探针对序列为SEQ ID No：87和SEQ ID No：88；rs17248007的荧光探针对序列为SEQ ID No：91和SEQ ID No：92；rs1345355的荧光探针对序列为SEQ ID No：95和SEQ ID No：96；rs10260816的荧光探针对序列为SEQID No：99和SEQ ID No：100。
所述诊断试剂盒，该试剂盒还可以包括PCR反应常用的酶和试剂，如Taq酶、dNTP混合液、Mgcl2溶液、去离子水等；还可以含有标准品和/或对照品。
具体地说，本发明解决问题的技术方案包括：(1)建立统一标准的标本库和数据库：以标准操作程序(SOP)采集符合标准的血液样本，系统收集完整的人口学资料和临床资料。(2)基因型检测：选择非贲门癌病例，与非贲门癌病例年龄、性别匹配的对照，利用高密度SNP芯片，在全基因组范围内找出与非贲门癌相关的SNP。(3)对筛选出的阳性关联SNP，进一步在另外的样本中进行检测，以判断其关联的稳定性。(4)非贲门癌辅助诊断试剂盒的研制：根据非贲门癌病例和健康对照中基因型分布频率有显著差异的SNP开发SNP辅助诊断试剂盒。
本发明人以标准操作程序(SOP)采集符合标准的血液样本，系统收集完整的人口学资料、临床资料等，并采用了Affymetrix6.0芯片进行全基因组扫描，TaqMan基因分型进行单个位点的检测等。
具体来说研究的实验方法主要包括以下几个部分：
1.研究样本的选择
(1)经病理学明确诊断的非贲门癌病例；
(2)与病例年龄、性别匹配的对照；
本研究共采用7263例符合标准的样本进行研究。
2.酚-氯仿法提取外周血基因组DNA，按常规方法操作。通常能得到20-50ng/μlDNA，纯度(紫外260OD与280OD比值)在1.6-2.0。
3.Affymetrix 6.0芯片检测
(1)取受试者全基因组DNA样本；
(2)在Affymetrix 6.0芯片(购于美国昂飞公司，下同)上进行全基因组扫描；
(3)检测并比较各基因型在非贲门癌病例与健康对照中的分别差异。
4.单个SNP的TaqMan基因分型
(1)取受试者DNA样本；
(2)设计单个SNP的特异性引物和特异性荧光探针对；
(3)进行PCR反应；
(4)检测并比较非贲门癌病例与健康对照中不同基因型的分布差异。
5.诊断试剂盒制备方法
Affymetrix6.0芯片进行全基因组扫描和单个SNP检测后确定非贲门癌病例与健康对照中基因型分布频率有显著差异的SNP，作为非贲门癌诊断的指标。最后筛选出的与非贲门癌发病有关的SNP组成辅助诊断试剂盒(rs1950476、rs238889、rs7973779、rs1445227、rs7528071、rs1549058、rs9841504、rs749130、rs17032274、rs3027247、rs9578831、rs714842、rs17262413、rs16924994、rs13361707、rs12496648、rs2826151、rs12416175、rs3753473、rs7349868、rs6026313、rs12974407、rs17248007、rs1345355和rs10260816)。诊断试剂可以包括这些SNP的特异性引物和特异性荧光探针对，以及Taq酶、dNTP等试剂。
6.统计分析方法
运用x2检验(用于分类变量)或者student t检验(用于连续性变量)比较人口学特征等在研究对象组间分布的差异。用logistic回归分析中的additive模型进行关联分析。
为了进一步研究这25个SNP构成的综合指征用于早期诊断的效果，我们构建了一个数学公式，综合考虑每个SNP与非贲门癌发病的正、负关联情况和联系强度。具体来说，我们对每个SNP的三种基因型进行评分，野生纯合型＝“0”，杂合型＝“1”，变异纯合型＝“2”，以单个SNP分析时的additive模型下的回归系数为权重，综合考虑每个SNP的情况给每个研究研究对照确定一个危险分值。危险分值的计算方法如下：危险分值＝(0.220×rs1950476的评分)+(0.183×rs238889的评分)+(0.176×rs7973779的评分)+(0.275×rs1445227的评分)+(-0.328×rs7528071的评分)+(-0.225×rs1549058的评分)+(-0.567×rs9841504的评分)+(0.205×rs749130的评分)+(-0.413×rs17032274的评分)+(0.194×rs3027247的评分)+(0.239×rs9578831的评分)+(0.251×rs714842的评分)+(-0.278×rs17262413的评分)+(-0.409×rs16924994的评分)+(-0.391×rs13361707的评分)+(0.203×rs12496648的评分)+(-0.185×rs2826151的评分)+(-0.214×rs12416175的评分)+(0.370×rs3753473的评分)+(-0.254×rs7349868的评分)+(-0.482×rs6026313的评分)+(-0.134×rs12974407的评分)+(0.359×rs17248007的评分)+(0.287×rs1345355的评分)+(-0.252×rs10260816的评分)，获得的危险分值系数以及界限值被直接应用于全基因组关联研究的3279例样本中。
统计学分析均通过专门的统计学分析软件完成(PLINK1.07)。统计学显著性水平P值设为0.05，所有统计学检验均为双侧检验。
以下是本发明进一步的说明：
在上述1006例符合条件的非贲门癌病例及2273例健康对照中，两组年龄、性别均衡可比。我们将这两组人群经Affymetrix6.0芯片进行全基因组扫描获得相关结果。
根据Affymetrix6.0芯片检测，本发明人检测到在“非贲门癌病例”组和“健康对照”组中基因型分布频率存在差异的SNP包括：rs1950476、rs238889、rs7973779、rs1445227、rs7528071、rs1549058、rs9841504、rs749130、rs17032274、rs3027247、rs9578831、rs714842、rs17262413、rs16924994、rs13361707、rs12496648、rs2826151、rs12416175、rs3753473、rs7349868、rs6026313、rs12974407、rs17248007、rs1345355和rs10260816。
根据上述检测结果，我们将这25个与非贲门癌发病相关的SNP在另外1894例非贲门癌病例和与其年龄、性别匹配的2090例健康对照中进行了单个SNP的检测，结果与芯片检测一致。
单因素和多因素Logistic回归分析结果均表明，这25个SNP与非贲门癌的发病存在着显著关联。
进一步分析这25个SNP的组合用于非贲门癌诊断的效果，发现其组合能够很好的区分病例与对照。
根据上述实验结果，本发明人制备了一种能用于非贲门癌辅助诊断的试剂盒，包含测定受试者血标本DNA中上述SNP的特异性引物、特异性荧光探针对和其他检测试剂。
具体而言，这25个SNP的组合，或者这25个SNP的特异性引物及特异性荧光探针对的组合构成的相关诊断试剂盒有助于非贲门癌的辅助诊断，为临床医生快速准确掌握患者的疾病状态和病情严重程度，及时采取更具个性化的防治方案提供支持。
本发明有益效果：
本发明提供的SNP标志物作为非贲门癌辅助判断的标志物的优越性在于：
(1)SNP是一种新型基因生物标志物，区别于传统生物标志物，稳定、微创、易于检测，将大大提高疾病诊断的敏感性和特异性，该类生物标志物的成功开发将为非贲门癌的诊断和治疗开创全新局面，为其他疾病生物标志物的研制提供借鉴。
(2)SNP试剂盒是一种系统、全面的诊断试剂盒，可用于非贲门癌的辅助诊断，有助于反映患者的疾病状态，为临床医生快速准确掌握患者病情、及时采取更具个性化的防治方案提供支持。
(3)采用严密的验证和评价体系，本发明人初期采用全基因组芯片扫描以获取疾病相关的SNP谱，并应用TaqMan基因分型方法在大样本中进行了验证；以上方法和策略的应用加速和保证了SNP生物标志物和诊断试剂盒在临床上的应用，也为其他疾病生物标志物的研制提供方法和策略上的借鉴。
本发明通过控制年龄、性别、吸烟、饮酒等对疾病发展的影响因素，研究SNP在非贲门癌辅助诊断的应用前景，阐述SNP对于非贲门癌进展的影响，揭示其诊断价值。因此，本发明获得了非贲门癌发病相关SNP谱和特异性标志物；通过SNP生物标志物和诊断试剂盒的研制和应用，可使得非贲门癌的诊断更加方便易行，为临床医生快速准确掌握患者病情，为临床治疗效果评价奠定基础，并为发现具有潜在治疗价值的新型小分子药物靶标提供帮助。
附图说明
图1：显示全基因组关联研究病例组和对照组的ROC曲线。
显示非贲门癌病例组对健康对照组为参照的ROC曲线。
具体实施方式
实施例1样品的收集和样品资料的整理
发明人于2004年开始至2010年从南京医科大学肿瘤中心收集了大量的非贲门癌患者血标本，通过对样品资料的整理，发明人从中选择了7263例符合下列标准的样本全基因组芯片扫描和单个SNP TaqMan基因分型的实验样品：
1、病理学明确诊断的非贲门癌患者；
2、与病例年龄、性别匹配的健康对照；
并系统采集了这些样本的人口学资料和临床资料等情况。
实施例2外周血DNA中SNP的全基因组扫描
在上述符合条件的1006例非贲门癌患者和2273例健康对照中，两组年龄、性别匹配。将这两组人群经Affymetrix6.0芯片检测获得相关结果。具体步骤为：
1、向储存于2ml冻存管中的白细胞加入溶血试剂，颠倒混匀后完全转入。
2、去除红细胞：用溶血试剂将5ml离心管补至4ml，颠倒混匀，4000rpm离心10分钟，弃上清。向沉淀中加入4ml溶血试剂，再次颠倒混匀清洗一次，4000rpm离心10分钟，弃上清。
3、抽提DNA：向沉淀中加1ml抽提液(每300ml中含有122.5ml 0.2M氯化钠，14.4ml 0.5M乙二胺四乙酸，15ml 10％十二烷基硫酸钠，148.1ml双蒸水，下同)和8μl蛋白酶K，震荡器上充分震荡混匀，37℃水浴过夜。
4、去除蛋白质：加1ml饱和酚充分混匀(手轻摇15分钟)，4000rpm离心10分钟，取上清转入新的5ml离心管中。在上清液中加入等体积氯仿与异戊醇混合液(氯仿∶异戊醇＝24∶1，v/v，下同)，充分混匀后(手摇15分钟)，4000rpm离心10分钟，取上清(分入两个1.5ml的离心管)。
5、DNA沉淀：在上清液中加入3M的醋酸钠60μl，再加入与上清液等体积的冰无水乙醇，上下轻摇，可见白色絮状沉淀物，再以12000rpm离心10min。
6、DNA洗涤：在沉淀中加入冰无水乙醇1ml，12000rpm离心10min，弃上清后真空抽干或置于清洁干燥环境中蒸干。
7、测量浓度：通常能得到20-50ng/μl DNA，纯度(紫外260OD与280OD比值)在1.6-2.0。
8、进行全基因组扫描；
9、数据分析与处理：在“非贲门癌病例”组和“健康对照”组中发现的基因型分布频率有显著差异的SNP在上文中已经罗列出，结果见表1。
实施例3单个SNP的TaqMan基因分型
将上述全基因组扫描发现与非贲门癌发病有关的SNP在另外1894非贲门癌病例和2090健康对照中进行检测，具体步骤为：
1、向储存于2ml冻存管中的白细胞加入溶血试剂，颠倒混匀后完全转入。
2、去除红细胞：用溶血试剂将5ml离心管补至4ml，颠倒混匀，4000rpm离心10分钟，弃上清。向沉淀中加入4ml溶血试剂，再次颠倒混匀清洗一次，4000rpm离心10分钟，弃上清。
3、抽提DNA：向沉淀中加1ml抽提液和8μl蛋白酶K，震荡器上充分震荡混匀，37℃水浴过夜。
4、去除蛋白质：加1ml饱和酚充分混匀(手轻摇15分钟)，4000rpm离心10分钟，取上清转入新的5ml离心管中。在上清液中加入等体积氯仿与异戊醇混合液(氯仿∶异戊醇＝24∶1)，充分混匀后(手摇15分钟)，4000rpm离心10分钟，取上清(分入两个1.5ml的离心管)。
5、DNA沉淀：在上清液中加入3M的醋酸钠60μl，再加入与上清液等体积的冰无水乙醇，上下轻摇，可见白色絮状沉淀物，再以12000rpm离心10min。
6、DNA洗涤：在沉淀中加入冰无水乙醇1ml，12000rpm离心10min，弃上清后真空抽干或置于清洁干燥环境中蒸干。
7、测量浓度：通常能得到20-50ng/μl DNA，纯度(紫外260OD与280OD比值)在1.6-2.0。
8、进行TaqMan基因分型。对全基因组扫描发现的25个阳性关联的SNP设计特异性引物和特异性荧光探针对(表2)。反应体系包括2.5μl 2X TaqMan基因分型Master Mix、每对正向和反向引物的混合物0.25μl(20pmol/μl)、0.125μl TaqMan荧光探针(10pmol/μl，同时含有相应的两种等位基因的荧光探针)和1.25μl双蒸水。加入0.5μl DNA。仪器使用的是ABI Prism 7900荧光定量PCR仪，PCR反应条件为：95℃、5分钟进行1个循环→95℃、15秒，60℃、1分钟进行40个循环。
9、基因型判读：采用ABI Prism 7900荧光定量PCR仪进行。
10、数据处理和分析：利用logistic回归模型中的addtive模型比较每个SNP的三种基因型在病例组合对照组中分布频率的差异，结果与全基因组扫描类似不再列出。
实施例4利用危险度评分方法进一步分析SNP与非贲门癌发病
根据上述结果，本发明人通过对2组样品(“非贲门癌病例组”和“健康对照组”)基因型分布频率的比较，选择阳性关联的SNP，以全基因组扫描样本中单个SNP回归系数为权重，进一步求得危险分值，绘制ROC来评估预测的灵敏性和特异性，进而评估这些SNP对非贲门癌发病的判断能力。对25个SNP标志物的联合分析发现，这25个SNP以74％的AUC将健康对照组和非贲门癌病例组分开，最佳临界点的灵敏度为75.85％，特异度：56.02％(图1)。
因此，本发明人证明了采用rs1950476、rs238889、rs7973779、rs1445227、rs7528071、rs1549058、rs9841504、rs749130、rs17032274、rs3027247、rs9578831、rs714842、rs17262413、rs16924994、rs13361707、rs12496648、rs2826151、rs12416175、rs3753473、rs7349868、rs6026313、rs12974407、rs17248007、rs1345355和rs10260816的组合能够很好地将健康对照和非贲门癌患者区分。
实施例5用于非贲门癌辅助诊断SNP试剂盒的制作
SNP试剂盒的制作和操作流程是基于Affymetrix6.0芯片检测和TaqMan基因分型技术。试剂盒含有一批SNP特异性引物(包括下列引物：rs1950476的引物序列为SEQ ID No：1和SEQ ID No：2；rs238889的引物序列为SEQ ID No：5和SEQ ID No：6；rs7973779的引物序列为SEQ ID No：9和SEQ ID No：10；rs1445227的引物序列为SEQID No：13和SEQ ID No：14；rs7528071的引物序列为SEQ ID No：17和SEQ ID No：18；rs1549058的引物序列为SEQ ID No：21和SEQ ID No：22；rs9841504的引物序列为SEQID No：25和SEQ ID No：26；rs749130的引物序列为SEQ ID No：29和SEQ ID No：30；rs17032274的引物序列为SEQ ID No：33和SEQ ID No：34；rs3027247的引物序列为SEQ ID No：37和SEQ ID No：38；rs9578831的引物序列为SEQ ID No：41和SEQ IDNo：42；rs714842的引物序列为SEQ ID No：45和SEQ ID No：46；rs17262413的引物序列为SEQ ID No：49和SEQ ID No：50；rs16924994的引物序列为SEQ ID No：53和SEQID No：54；rs13361707的引物序列为SEQ ID No：57和SEQ ID No：58；rs12496648的引物序列为SEQ ID No：61和SEQ ID No：62；rs2826151的引物序列为SEQ ID No：65和SEQ ID No：66；rs12416175的引物序列为SEQ ID No：69和SEQ ID No：70；rs3753473的引物序列为SEQ ID No：73和SEQ ID No：74；rs7349868的引物序列为SEQ IDNo：77和SEQ ID No：78；rs6026313的引物序列为SEQ ID No：81和SEQ ID No：82；rs12974407的引物序列为SEQ ID No：85和SEQ ID No：86；rs17248007的引物序列为SEQ ID No：89和SEQ ID No：90；rs1345355的引物序列为SEQ ID No：93和SEQ IDNo：94；rs10260816的引物序列为SEQ ID No：97和SEQ ID No：98)、特异性荧光探针对(包括下列荧光探针：rs1950476的荧光探针对序列为SEQ ID No：3和SEQ ID No：4；rs238889的荧光探针对序列为SEQ ID No：7和SEQ ID No：8；rs7973779的荧光探针对序列为SEQ ID No：11和SEQ ID No：12；rs1445227的荧光探针对序列为SEQ IDNo：15和SEQ ID No：16；rs7528071的荧光探针对序列为SEQ ID No：19和SEQ IDNo：20；rs1549058的荧光探针对序列为SEQ ID No：23和SEQ ID No：24；rs9841504的荧光探针对序列为SEQ ID No：27和SEQ ID No：28；rs749130的荧光探针对序列为SEQ ID No：31和SEQ ID No：32；rs17032274的荧光探针对序列为SEQ ID No：35和SEQ ID No：36；rs3027247的荧光探针对序列为SEQ ID No：39和SEQ ID No：40；rs9578831的荧光探针对序列为SEQ ID No：43和SEQ ID No：44；rs714842的荧光探针对序列为SEQ ID No：47和SEQ ID No：48；rs17262413的荧光探针对序列为SEQ IDNo：51和SEQ ID No：52；rs16924994的荧光探针对序列为SEQ ID No：55和SEQ IDNo：56；rs13361707的荧光探针对序列为SEQ ID No：59和SEQ ID No：60 rs12496648的荧光探针对序列为SEQ ID No：63和SEQ ID No：64；rs2826151的荧光探针对序列为SEQ ID No：67和SEQ ID No：68；rs12416175的荧光探针对序列为SEQ ID No：71和SEQ ID No：72；rs3753473的荧光探针对序列为SEQ ID No：75和SEQ ID No：76；rs7349868的荧光探针对序列为SEQ ID No：79和SEQ ID No：80；rs6026313的荧光探针对序列为SEQ ID No：83和SEQ ID No：84；rs12974407的荧光探针对序列为SEQID No：87和SEQ ID No：88；rs17248007的荧光探针对序列为SEQ ID No：91和SEQ IDNo：92；rs1345355的荧光探针对序列为SEQ ID No：95和SEQ ID No：96；rs10260816的荧光探针对序列为SEQ ID No：99和SEQ ID No：100)，还可以有相应PCR技术所需的常用试剂，如：dNTPs，MgCl2，双蒸水，荧光探针，Taq酶等，这些常用试剂都是本领域技术人员熟知的，另外还可以有标准品和对照(如确定基因型的标准品和空白对照等)。此试剂盒的价值在于只需要外周血而不需要其它组织样品，通过最精简和特异的引物及荧光探针对检测SNP，再通过SNP谱辅助判断非贲门癌，不仅稳定，检测方便，且精确，大大提高疾病诊断的敏感性和特异性，因此将此试剂盒投入实践，可以帮助指导诊断和更有效的个体化治疗。
表1.病例组与对照组全基因组关联分析结果
表2.相关SNP引物和探针信息
Claims (9)
1.一种与非贲门癌辅助诊断相关的SNP标志物，其特征在于该标志物为rs1950476、rs238889、rs7973779、rs1445227、rs7528071、rs1549058、rs9841504、rs749130、rs17032274、rs3027247、rs9578831、rs714842、rs17262413、rs16924994、rs13361707、rs12496648、rs2826151、rs12416175、rs3753473、rs7349868、rs6026313、rs12974407、rs17248007、rs1345355和rs10260816的组合。
2.权利要求1所述的SNP标志物的特异性引物，其特征在于该引物为：
rs1950476的引物序列为SEQ ID No：1和SEQ ID No：2；
rs238889的引物序列为SEQ ID No：5和SEQ ID No：6；
rs7973779的引物序列为SEQ ID No：9和SEQ ID No：10；
rs1445227的引物序列为SEQ ID No：13和SEQ ID No：14；
rs7528071的引物序列为SEQ ID No：17和SEQ ID No：18；
rs1549058的引物序列为SEQ ID No：21和SEQ ID No：22；
rs9841504的引物序列为SEQ ID No：25和SEQ ID No：26；
rs749130的引物序列为SEQ ID No：29和SEQ ID No：30；
rs17032274的引物序列为SEQ ID No：33和SEQ ID No：34；
rs3027247的引物序列为SEQ ID No：37和SEQ ID No：38；
rs9578831的引物序列为SEQ ID No：41和SEQ ID No：42；
rs714842的引物序列为SEQ ID No：45和SEQ ID No：46；
rs17262413的引物序列为SEQ ID No：49和SEQ ID No：50；
rs16924994的引物序列为SEQ ID No：53和SEQ ID No：54；
rs13361707的引物序列为SEQ ID No：57和SEQ ID No：58；
rs12496648的引物序列为SEQ ID No：61和SEQ ID No：62；
rs2826151的引物序列为SEQ ID No：65和SEQ ID No：66；
rs12416175的引物序列为SEQ ID No：69和SEQ ID No：70；
rs3753473的引物序列为SEQ ID No：73和SEQ ID No：74；
rs7349868的引物序列为SEQ ID No：77和SEQ ID No：78；
rs6026313的引物序列为SEQ ID No：81和SEQ ID No：82；
rs12974407的引物序列为SEQ ID No：85和SEQ ID No：86；
rs17248007的引物序列为SEQ ID No：89和SEQ ID No：90；
rs1345355的引物序列为SEQ ID No：93和SEQ ID No：94；
rs10260816的引物序列为SEQ ID No：97和SEQ ID No：98。
3.权利要求1所述的SNP标志物的特异性荧光探针对，其特征在于该荧光探针为：
rs1950476的荧光探针对序列为SEQ ID No：3和SEQ ID No：4；
rs238889的荧光探针对序列为SEQ ID No：7和SEQ ID No：8；
rs7973779的荧光探针对序列为SEQ ID No：11和SEQ ID No：12；
rs1445227的荧光探针对序列为SEQ ID No：15和SEQ ID No：16；
rs7528071的荧光探针对序列为SEQ ID No：19和SEQ ID No：20；
rs1549058的荧光探针对序列为SEQ ID No：23和SEQ ID No：24；
rs9841504的荧光探针对序列为SEQ ID No：27和SEQ ID No：28；
rs749130的荧光探针对序列为SEQ ID No：31和SEQ ID No：32；
rs17032274的荧光探针对序列为SEQ ID No：35和SEQ ID No：36；
rs3027247的荧光探针对序列为SEQ ID No：39和SEQ ID No：40；
rs9578831的荧光探针对序列为SEQ ID No：43和SEQ ID No：44；
rs714842的荧光探针对序列为SEQ ID No：47和SEQ ID No：48；
rs17262413的荧光探针对序列为SEQ ID No：51和SEQ ID No：52；
rs16924994的荧光探针对序列为SEQ ID No：55和SEQ ID No：56；
rs13361707的荧光探针对序列为SEQ ID No：59和SEQ ID No：60；
rs12496648的荧光探针对序列为SEQ ID No：63和SEQ ID No：64；
rs2826151的荧光探针对序列为SEQ ID No：67和SEQ ID No：68；
rs12416175的荧光探针对序列为SEQ ID No：71和SEQ ID No：72；
rs3753473的荧光探针对序列为SEQ ID No：75和SEQ ID No：76；
rs7349868的荧光探针对序列为SEQ ID No：79和SEQ ID No：80；
rs6026313的荧光探针对序列为SEQ ID No：83和SEQ ID No：84；
rs12974407的荧光探针对序列为SEQ ID No：87和SEQ ID No：88；
rs17248007的荧光探针对序列为SEQ ID No：91和SEQ ID No：92；
rs1345355的荧光探针对序列为SEQ ID No：95和SEQ ID No：96；
rs10260816的荧光探针对序列为SEQ ID No：99和SEQ ID No：100。
4.权利要求1所述的SNP标志物在制备非贲门癌辅助诊断试剂盒中的应用。
5.权利要求2所述的SNP标志物的特异性引物在制备非贲门癌辅助诊断试剂盒中的应用。
6.权利要求3所述的SNP标志物的特异性荧光探针对在制备非贲门癌辅助诊断试剂盒中的应用。
7.一种非贲门癌辅助诊断试剂盒，其特征在于该试剂盒用于检测外周血DNA中rs1950476、rs238889、rs7973779、rs1445227、rs7528071、rs1549058、rs9841504、rs749130、rs17032274、rs3027247、rs9578831、rs714842、rs17262413、rs16924994、rs13361707、rs12496648、rs2826151、rs12416175、rs3753473、rs7349868、rs6026313、rs12974407、rs17248007、rs1345355和rs10260816。
8.根据权利要求7所述的诊断试剂盒，其特征在于该试剂盒含有权利要求2所述SNP标志物的特异性引物和/或权利要求3所述SNP标志物的特异性荧光探针对。
9.根据权利要求7或8所述诊断试剂盒，其特征在于该试剂盒还可以包括PCR技术常用的试剂。
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Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| C06 | Publication | ||
| PB01 | Publication | ||
| C10 | Entry into substantive examination | ||
| SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
| GR01 | Patent grant | ||
| GR01 | Patent grant | ||
| EE01 | Entry into force of recordation of patent licensing contract |
Application publication date: 20120704 Assignee: Luo Shi bio tech ltd, Shanghai Assignor: Nanjing Medical University Contract record no.: 2015990001013 Denomination of invention: SNP (Single Nucleotide Polymorphism) marker correlated to assistant diagnosis of noncardia cancer and application thereof Granted publication date: 20140319 License type: Exclusive License Record date: 20151207 |
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| LICC | Enforcement, change and cancellation of record of contracts on the licence for exploitation of a patent or utility model |