CN104293908A

CN104293908A - 用于检测非酒精性脂肪肝的血清miRNA标志物组合及应用

Info

Publication number: CN104293908A
Application number: CN201410273783.0A
Authority: CN
Inventors: 谭友文; 潘腾莉
Original assignee: THIRD PEOPLE'S HOSPITAL OF ZHENJIANG
Current assignee: THIRD PEOPLE'S HOSPITAL OF ZHENJIANG
Priority date: 2014-06-18
Filing date: 2014-06-18
Publication date: 2015-01-21

Abstract

本发明涉及本发明属生物技术领域，涉及一种用于区分非酒精脂肪肝与正常人的血清miRNA标志物组合及应用。本发明的用于检测非酒精性脂肪肝的血清miRNA标志物组合包括下列四种has-miRNA：hsa-miR-122-5p,hsa-miR-1290,hsa-miR-27b-3pandhsa-miR-192-5p。本发明能够实现非酒精性脂肪肝的早期发现以及迅速的无创性检测。

Description

用于检测非酒精性脂肪肝的血清miRNA标志物组合及应用

技术领域

本发明涉及本发明属生物技术领域，涉及一种用于区分非酒精脂肪肝与正常人的血清miRNA标志物组合及应用。

背景技术

非酒精性脂肪肝(Nonalcoholic fatty liver disease，NAFLD)是指除外过量饮酒和其他明确的损肝因素所致的，以弥漫性肝细胞大泡性脂肪变为主要特征的临床病理综合征。大量流行病学研究表明，NAFLD己成为一种呈现全球化趋势的常见慢性肝病。随着肥胖及其相关代谢紊乱的增多，近10余年来我国NAFLD患病率增长迅速。肝组织学检查仍然是诊断NAFLD的金标准，但肝穿刺的副作用以及局限性往往制约了这项诊断技术的开展。因此，寻找新的诊断标志物、新的诊断模型一直是研究热点。新的非创伤性手段主要集中在两个方面，一是寻找新的血清标志物，二是寻找新的影像学诊断依据。近二十年来，如Steatotest，包含了12个变量因素如α2-巨球蛋白，触珠蛋白和载脂蛋白A1等，2006年Bedogni等发布的脂肪肝指数(Fatty Liver Index，FLI)，以及近年的脂肪肝分数(NAFLD Liver Fat Score)等包含了胰岛素抵抗，天冬氨酸转氨酶(AST)和AST/丙氨酸转氨酶(ALT)等指标。这些模型的共同点是现有已知可能与NAFLD有关指标的组合。还有在影像学方面主要是Firbroscan等依靠肝脏硬度而开发的仪器。这些模型和仪器在NAFLD的应用方面发挥了较好的价值。但有各有其不足，如特异性不强、敏感性不够等均制约了其应用。

miRNA(microRNA)是一类内源性非编码单链小分子RNA，长度为18～24个核苷酸。miRNA普遍存在于人类的体液中，性质稳定，可以定量检测，且存在显著的疾病特异性。近年的研究表明，血液、唾液、尿液、乳汁及脑脊液等体液miRNA检测可应用于妊娠等生理状态的判断以及肿瘤、感染、代谢及阿尔海默茨病等疾病的诊断和预后判断。体液特异性miRNA检测的临床意义及应用前景已引起高度关注，miRNA作为一类非编码调节性的小分子RNA有可能取代传统的特异蛋白为代表的生物标志物。体液miRNA含量丰富且性质稳定，具备成为优异生物标志物的潜质，并且拥有以蛋白质为代表的传统生物标志物不具备的特性，无需抗体制备且易于精确定量，可能克服抗原抗体类生物标志物的制备瓶颈。

发明内容

本发明所要解决的技术问题是，提供一种能够用于非酒精性脂肪肝的早期发现以及进行快速的无创性检测的血清miRNA标志物组合及应用。

本发明包括以下技术方案：

本发明的用于检测非酒精性脂肪肝的血清miRNA标志物组合包括下列四种has-miRNA：hsa-miR-122-5p,hsa-miR-1290,hsa-miR-27b-3p and hsa-miR-192-5p。

本发明的用于检测非酒精性脂肪肝的miRNA探针组合，包括以下序列：SEQ ID N0.1、SEQ ID N0.2、SEQ ID N0.3、SEQ ID N0.4。

上述用于检测非酒精性脂肪肝的miRNA探针组合在制备检测非酒精性脂肪肝的试剂中的应用。

本发明的用于检测非酒精性脂肪肝的试剂盒，包括上述用于检测非酒精性脂肪肝的miRNA探针组合，还包括Taq酶、氯化镁和PCR缓冲液。

本发明的权利要求用于检测非酒精性脂肪肝的miRNA引物组合是基于下列核酸序列，包括以下序列：SEQ ID N0.1、SEQ ID N0.2、SEQ ID N0.3、SEQ ID N0.4。

本发明权利要求用于检测非酒精性脂肪肝的试剂盒，包括上述用于检测非酒精性脂肪肝的miRNA引物组合，还包括Taq酶、氯化镁和PCR缓冲液。

本发明能够实现非酒精性脂肪肝的早期发现以及迅速的无创性检测。

附图说明

图1是本发明实施例的两组mappable reads数据及长度分析图；

图2训练集NAFLD六种miRNA与正常对照组的比较；

图3六种miRNA在训练集ROC曲线下面积；

图4miRNA组合在训练集和验证集ROC曲线下面积；

图5miRNA组合在不同NAFLD活动指数中的应用；

图6miRNA组合与ALT的ROC曲线下面积；

图7miRNA组合与单一miRNA的ROC曲线下面积。

具体实施方式

研究对象

对照组为健康志愿者；实验组为NAFLD患者，筛选阶段NAFLD20名，正常对照20名；训练集NAFLD152名，正常对照90名；验证集NAFLD103名，正常对照80名，NAFLD患者来自门诊及住院患者。所有患者经过门诊B超筛选，参考根据日本学者研究，具备以下3项腹部超声异常发现中的任意两项或两项以上者可诊断为脂肪肝:(1)肝脏近场回声弥漫性增强(明亮肝)，回声强度高于肾脏或脾脏；(2)肝内管道结构显示不清；(3)肝脏远场回声逐渐衰减。需高度怀疑NAFLD可能。排除标准1.排除大量饮酒(男性每日折含乙醇量>60g或每周乙醇摄人量>420g，女性每日乙醇摄人量>40g或每周乙醇摄人量>280g)对于NAFLD的诊断至关重要。2.除外存在可导致脂肪肝的全身性性疾病以及正在服用或近期内曾经服用可引起血清ALT和 GGT升高的药物(包括中药)的患者。3.需排除乙型肝炎、丙型肝炎、自身免疫性肝病、肝豆状核变性、a-1抗胰蛋白酶缺乏症等慢性肝病，以及肝脏恶性肿瘤、感染和胆道疾病。在B超拟似NAFLD后，根据病人自愿原则进行肝穿刺，持穿刺枪，用16G肝穿针吸取，要求肝组织标本至少1cm以上，包含4个及4个以上可供评价汇管区。标本立即置于10％甲醛固定，常规石蜡包埋，连续切片，行苏木精--伊红染色。肝活组织检查病理组织学诊断和临床治疗试验的疗效评估采纳美国国立卫生研究院NASH临床研究网病理工作组2005年所定指南，无论是常规病理报告还是科学研究进行NAFLD活动度积分(a NAFLD activity score，NAS)和纤维化积分。该组织学评分系统包括14项病理改变，其中4项指标进行了半定量评估:肝脂肪变(0～3)、小叶内炎症(0～2)、肝细胞气球样变(0～2)、肝纤维化(0～4)，其余指标以“有或无(1/0)”表示。根据前3项计算NAS，NAS≥5者可明确NASH的诊断，NAS<3可排除NASH，两者之间者为NASH可能。正常对照组均为我院健康体检中心无器质性疾病以及精神性疾病人群。患者和健康人群基本情况见表1，NAFLD患者NAS评分见表2。

表1三阶段NAFLD以及健康人群的一般特征及临床特点

¹男性每日折含乙醇量<60g或每周乙醇摄人量<420g，女性每日乙醇摄人量<40g或每周乙醇摄人量<280g,²NAS:非酒精性脂肪肝活动指数。^a独立样本t test。^b Pearson卡方检验。

续表1

表2三阶段非酒精性脂肪肝活动指数

Pearson卡方检验

实验方法

样品采集：患者在首次门诊或住院时采集新鲜血液5ml于医用血清管中(无肝素抗凝)，上下轻轻颠倒混匀，立即将全血置于4O℃冰盒中保存，并在2h内4000g，离心10min。将上层血清转移至1.5ml离心管(RNase free)中，13000g，离心2min。最后将上清液转移至2ml旋盖尖底离心管中(RNase free)，每个管子吸入250ul血清进行分装，弃去血细胞沉淀。置于-80℃长期保存。

总RNA提取及质检：血清RNA的抽提采用LCS TRK1001试剂盒(LC Sciences)操作说明书进行。随机抽取两个在血清中稳定表达的miRNA作为标准检测总RNA提取质量，分别为hsa-miR-16、hsa-miR-192。然后各取2μl，以上述引物对应的逆转录引物分别逆转录(反应体系为10μl)；以1μl/孔的cDNA为模板，进行realtimePCR，反应体系为20μl，复孔为三个，同时做引物NTC(模板以水代替)。然后检测hsa-miR-16和hsa-miR-192PCR扩展曲线、溶解曲线以及CT值。

文库构建：使用Illumina Truseq Small RNA Preparation kit试剂盒参照试剂盒说明书Illumina’s TruSeq Small RNA Sample Preparation Guide构建小RNA文库。总RNA链接5，接头和3，接头后经RT-PCR扩增形成小分子RNA的cDNA文库，经过6％TBE变性胶电泳分离，将长度范围在147bp的小分子RNA切胶回收。

第二代测序：cDNA经纯化后在Illumina’s Cluster Station上生成DNA簇后上机(Illumina GAIIx)进行测序。通过Illumina’s Sequencing Control Studio software version2.8(SCS v2.8)软件实时分析测序图片并使用Illumina's Real-Time Analysis version1.8.70(RTA v1.8.70)提取base-calling。提取的原始序列利用ACGT101-miR v4.2(LC Sciences)软件分析，生成RawData数据库，同时去除由于样品制备、测序化学与处理以及测序仪器的光学数码处理而产生的非纯序列。剩下的序列(长度在15和32bases)按照families进行分组，生成 mappableReads。Mappable序列与最新版本的miRbase数据库以及测序物种基因组进行序列比对，鉴定该物种已知的miRNA；同时发现新的5p或者3p miRNA序列，鉴定在其它近源物种中已有报道，在该物种中崭新的miRNA序列。其中Mappable序列能与Rfam(ie rRNA,tRNA,snRNA,snoRNA and others)，Repbase以及mRNA序列比对上的均被去除。除此之外，为了保证筛选到高质量的基因结果，我们把reads数小于10的基因剔除掉。最后分析实验组和对照组之间差异表达的miRNAs，两组间表达差异miRNA经过差异倍数2倍以上和P<0.05筛选。

差异表达miRNA的RT-PCR验证

挑选共同表达差异的miRNAs进行验证，根据既往实验报道和我们预实验miR-24获得了稳定表达，以miR-24为内参照。取3ul总RNA进行逆转录，然后取1.5ul的cDNA加入20ul的反应体系中。qRT-PCR反应中样本均重复三次后放入Rotor-gene3000仪器中完成反应条件的循环。经过55℃，30s预变性，98oC，5min变性，经过40个60℃15s，95℃30s循环后在65oC溶解。miRNAs的表达水平由Ct值衡量。两组差异表达基因的比较用2^-△△ct表示。

ΔΔCT＝[CT(target,test)–CT(ref,test)]–[CT(target,calibrator)–CT(ref,calibrator)]

所有引物均由杭州联川生物设计，invitrogen公司合成。

统计学处理

计量数据以均数±标准差表示，三阶段样本集的临床资料均有SPSS21.0处理；两组差异表达基因的比较用2^-△△ct表示，Mann-Whitney非配对t检验；logistic regression和ROC曲线下面积均由MedCalc检验。

实验结果

第二代测序结果分析

通过上述测序分析，健康对照组经过初级分析后得到906,910条原始序列，经过去除冗余后剩余494,523条，占总序列的54.53％；PBC组得到944,362条原始序列，462,263条可比对序列，占48.95％。对两组mappable reads数据进行长度分析见图2。可见miRNAs的长度集中在22nt。占38.85％。

差异目标miRNA的筛选

对NAFLD组和正常组进行数据归一化后比较两者的表达差异。P<0.05表示有统计学差异。共发现143条有差异显著性的miRNAs，其中表达上调的有105条，表达下调的有38条。符合表达差异倍数2倍以上，P<0.05的6个miRNA均为上调基因hsa-miR-122-5p,hsa-miR-1290,hsa-miR-27b-3p,hsa-miR-192-5p,hsa-miR-148a-3p,hsa-miR-99a-5p.见表3

表3正常对照以及NAFLD的差异miRNA

训练集验证差异miRNA表达及目的miRNA的ROC曲线下面积

在训练集使用qRT-PCR检测差异表达的6个候选miRNA，152个非酒精性脂肪肝和90个正常对照样本进行检验，每个样本检测三次目的基因Ct值，取均数，计算2^-△△ct。6个候选miRNA在训练集表达见图3，两组间比较，has-miR-122-5p,has-miR-1290,has-miR-27b-3p,has-miR-192-5p差异有显著性。

has-miR-122-5p,has-miR-1290,has-miR-27b-3p,has-miR-192-5p.hsa-miR-99a-5p和has-miR-148a-3p的ROC曲线下面积分别为0.729,0.629,0.693,0.652,0.54和 0.559。见图4。

Logistic回归分析建立联合预测因子，经过逐步Logistic回归建立LogitP，具体统计结果见表4

表4Logistic回归建立联合预测因子

进入方程P<0.05,剔除方程P>0.1；x²＝104.103,P<0.0001，

Logit(P)＝43.9507-0.91756miR_122-0.50132miR_1290-0.30842miR_192-0.19964miR27b；AUC＝0.856。

训练集和验证集验证联合预测因子建立的miRNA组合

miRNA组合在两个标本集ROC曲线下面积分别为0.856(95％CI,0.804to0.907；sensitivity_85.55％,specificity_73.3％,图5A)和0.891(95％CI,0.842to0.941；sensitivity_90.3％,specificity_76.2％,图5B)。

在验证集验证不同NAS的评分，miRNA组合ROC曲线下面积分别为NAS<3,≥3～5,and≥5were0.826,0.937,0.860，见图6。

比较miRNA组合与ALT和各个目的miRNA的诊断价值，可以看到miRNA组合具有更高的诊断价值。见图7；表5,6。

表5miRNA组合和ALT的诊断价值比较

表6miRNA组合和各个目的miRNA的诊断价值比较

序列表

<110> 江苏省镇江市第三人民医院

<120> 用于检测非酒精性脂肪肝的血清miRNA标志物组合及应用

<130> 2014

<160> 4

<170> PatentIn version 3.3

<210> 1

<211> 22

<212> RNA

<213> 人工序列

<400> 1

uggaguguga caaugguguu ug 22

<210> 2

<211> 19

<212> RNA

<213> 人工序列

<400> 2

uggauuuuug gaucaggga 19

<210> 3

<211> 21

<212> RNA

<213> 人工序列

<400> 3

uucacagugg cuaaguucug c 21

<210> 4

<211> 21

<212> RNA

<213> 人工序列

<400> 4

cugaccuaug aauugacagc c 21

Claims

1.一种用于检测非酒精性脂肪肝的血清miRNA标志物组合，其特征是：包括下列四种has-miRNA：hsa-miR-122-5p,hsa-miR-1290,hsa-miR-27b-3p andhsa-miR-192-5p。

2.一种用于检测非酒精性脂肪肝的miRNA探针组合，其特征是：包括以下序列：SEQ ID N0.1、SEQ ID N0.2、SEQ ID N0.3、SEQ ID N0.4。

3.一种用于检测非酒精性脂肪肝的试剂盒，其特征是：包括权利要求2所述的miRNA探针组合，还包括Taq酶、氯化镁和PCR缓冲液。

4.一种用于检测非酒精性脂肪肝的miRNA引物组合，其特征是：是基于下列核酸序列，包括以下序列：SEQ ID N0.1、SEQ ID N0.2、SEQ ID N0.3、SEQ ID N0.4。

5.一种用于检测非酒精性脂肪肝的试剂盒，其特征是：包括权利要求4所述的miRNA引物组合，还包括Taq酶、氯化镁和PCR缓冲液。