CN105400882A - 一种适用于后纵韧带骨化诊断的血清miRNA标志物及应用 - Google Patents
一种适用于后纵韧带骨化诊断的血清miRNA标志物及应用 Download PDFInfo
- Publication number
- CN105400882A CN105400882A CN201510936874.2A CN201510936874A CN105400882A CN 105400882 A CN105400882 A CN 105400882A CN 201510936874 A CN201510936874 A CN 201510936874A CN 105400882 A CN105400882 A CN 105400882A
- Authority
- CN
- China
- Prior art keywords
- mirna
- test kit
- longitudinal ligament
- seqidno
- application
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Granted
Links
- 239000002679 microRNA Substances 0.000 title claims abstract description 90
- 210000002966 serum Anatomy 0.000 title claims abstract description 50
- 108091070501 miRNA Proteins 0.000 title claims abstract description 24
- 238000003745 diagnosis Methods 0.000 title claims abstract description 16
- 208000001040 ossification of the posterior longitudinal ligament of the spine Diseases 0.000 title claims description 34
- 208000009469 Ossification of Posterior Longitudinal Ligament Diseases 0.000 title 1
- 206010058660 Spinal ligament ossification Diseases 0.000 title 1
- 210000004446 longitudinal ligament Anatomy 0.000 claims abstract description 41
- 239000003153 chemical reaction reagent Substances 0.000 claims abstract description 32
- 238000001514 detection method Methods 0.000 claims abstract description 17
- 238000009007 Diagnostic Kit Methods 0.000 claims abstract description 3
- 201000002044 ossification of the posterior longitudinal ligament of spine Diseases 0.000 claims description 33
- 238000012360 testing method Methods 0.000 claims description 29
- 238000000034 method Methods 0.000 claims description 16
- 239000000523 sample Substances 0.000 claims description 13
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 claims description 11
- 239000012472 biological sample Substances 0.000 claims description 6
- 239000002773 nucleotide Substances 0.000 claims description 5
- 125000003729 nucleotide group Chemical group 0.000 claims description 5
- WSFSSNUMVMOOMR-UHFFFAOYSA-N Formaldehyde Chemical compound O=C WSFSSNUMVMOOMR-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 4
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 claims description 3
- 210000000601 blood cell Anatomy 0.000 claims description 2
- 210000001124 body fluid Anatomy 0.000 claims description 2
- 239000010839 body fluid Substances 0.000 claims description 2
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 claims description 2
- 210000001519 tissue Anatomy 0.000 claims description 2
- 238000012216 screening Methods 0.000 abstract description 13
- 239000000090 biomarker Substances 0.000 abstract description 4
- 238000011161 development Methods 0.000 abstract description 3
- 230000001225 therapeutic effect Effects 0.000 abstract description 3
- 239000003596 drug target Substances 0.000 abstract description 2
- 230000000694 effects Effects 0.000 abstract description 2
- 230000011164 ossification Effects 0.000 abstract 4
- 108700011259 MicroRNAs Proteins 0.000 description 67
- 238000011160 research Methods 0.000 description 10
- 238000004458 analytical method Methods 0.000 description 7
- 208000037265 diseases, disorders, signs and symptoms Diseases 0.000 description 7
- 102100034343 Integrase Human genes 0.000 description 6
- 108010092799 RNA-directed DNA polymerase Proteins 0.000 description 6
- 238000006243 chemical reaction Methods 0.000 description 5
- 201000010099 disease Diseases 0.000 description 5
- 238000007689 inspection Methods 0.000 description 5
- 238000010839 reverse transcription Methods 0.000 description 5
- HEDRZPFGACZZDS-UHFFFAOYSA-N Chloroform Chemical compound ClC(Cl)Cl HEDRZPFGACZZDS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N Ethanol Chemical compound CCO LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 239000003550 marker Substances 0.000 description 4
- 108091032973 (ribonucleotides)n+m Proteins 0.000 description 3
- 210000004369 blood Anatomy 0.000 description 3
- 239000008280 blood Substances 0.000 description 3
- 238000010241 blood sampling Methods 0.000 description 3
- 238000005119 centrifugation Methods 0.000 description 3
- 230000008859 change Effects 0.000 description 3
- 239000003795 chemical substances by application Substances 0.000 description 3
- 238000013399 early diagnosis Methods 0.000 description 3
- 238000003753 real-time PCR Methods 0.000 description 3
- 230000000391 smoking effect Effects 0.000 description 3
- 239000006228 supernatant Substances 0.000 description 3
- 238000001356 surgical procedure Methods 0.000 description 3
- 241000208340 Araliaceae Species 0.000 description 2
- 235000005035 Panax pseudoginseng ssp. pseudoginseng Nutrition 0.000 description 2
- 235000003140 Panax quinquefolius Nutrition 0.000 description 2
- 238000011529 RT qPCR Methods 0.000 description 2
- 230000009471 action Effects 0.000 description 2
- 239000008346 aqueous phase Substances 0.000 description 2
- 238000007622 bioinformatic analysis Methods 0.000 description 2
- 230000006835 compression Effects 0.000 description 2
- 238000007906 compression Methods 0.000 description 2
- 208000035475 disorder Diseases 0.000 description 2
- 238000005516 engineering process Methods 0.000 description 2
- 235000008434 ginseng Nutrition 0.000 description 2
- 208000014674 injury Diseases 0.000 description 2
- 210000003041 ligament Anatomy 0.000 description 2
- 238000012417 linear regression Methods 0.000 description 2
- 238000013507 mapping Methods 0.000 description 2
- 108020004999 messenger RNA Proteins 0.000 description 2
- 238000012986 modification Methods 0.000 description 2
- 230000004048 modification Effects 0.000 description 2
- 210000005259 peripheral blood Anatomy 0.000 description 2
- 239000011886 peripheral blood Substances 0.000 description 2
- 238000004321 preservation Methods 0.000 description 2
- 239000000047 product Substances 0.000 description 2
- 208000024891 symptom Diseases 0.000 description 2
- 230000008733 trauma Effects 0.000 description 2
- 108091070482 Caenorhabditis elegans miR-39 stem-loop Proteins 0.000 description 1
- 208000017667 Chronic Disease Diseases 0.000 description 1
- KCXVZYZYPLLWCC-UHFFFAOYSA-N EDTA Chemical compound OC(=O)CN(CC(O)=O)CCN(CC(O)=O)CC(O)=O KCXVZYZYPLLWCC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 206010020751 Hypersensitivity Diseases 0.000 description 1
- KFZMGEQAYNKOFK-UHFFFAOYSA-N Isopropanol Chemical compound CC(C)O KFZMGEQAYNKOFK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 208000019428 Ligament disease Diseases 0.000 description 1
- 241000244206 Nematoda Species 0.000 description 1
- 206010028980 Neoplasm Diseases 0.000 description 1
- 206010033799 Paralysis Diseases 0.000 description 1
- 206010037714 Quadriplegia Diseases 0.000 description 1
- 238000002123 RNA extraction Methods 0.000 description 1
- 238000012300 Sequence Analysis Methods 0.000 description 1
- 208000020307 Spinal disease Diseases 0.000 description 1
- 208000020339 Spinal injury Diseases 0.000 description 1
- 238000007605 air drying Methods 0.000 description 1
- 208000026935 allergic disease Diseases 0.000 description 1
- 230000002785 anti-thrombosis Effects 0.000 description 1
- 239000003146 anticoagulant agent Substances 0.000 description 1
- 229940127219 anticoagulant drug Drugs 0.000 description 1
- 229960004676 antithrombotic agent Drugs 0.000 description 1
- 230000009286 beneficial effect Effects 0.000 description 1
- 230000033228 biological regulation Effects 0.000 description 1
- 230000023555 blood coagulation Effects 0.000 description 1
- YTRQFSDWAXHJCC-UHFFFAOYSA-N chloroform;phenol Chemical compound ClC(Cl)Cl.OC1=CC=CC=C1 YTRQFSDWAXHJCC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000002299 complementary DNA Substances 0.000 description 1
- 230000009514 concussion Effects 0.000 description 1
- 238000005336 cracking Methods 0.000 description 1
- 238000005138 cryopreservation Methods 0.000 description 1
- 230000001186 cumulative effect Effects 0.000 description 1
- 230000006378 damage Effects 0.000 description 1
- 230000006837 decompression Effects 0.000 description 1
- 238000013461 design Methods 0.000 description 1
- 230000008034 disappearance Effects 0.000 description 1
- 238000004090 dissolution Methods 0.000 description 1
- 230000004064 dysfunction Effects 0.000 description 1
- 238000002474 experimental method Methods 0.000 description 1
- 238000000605 extraction Methods 0.000 description 1
- 239000012634 fragment Substances 0.000 description 1
- 230000036541 health Effects 0.000 description 1
- 210000003677 hemocyte Anatomy 0.000 description 1
- 229940000351 hemocyte Drugs 0.000 description 1
- 238000000265 homogenisation Methods 0.000 description 1
- 230000009610 hypersensitivity Effects 0.000 description 1
- 238000003384 imaging method Methods 0.000 description 1
- 230000034540 ligamentous ossification Effects 0.000 description 1
- 238000011068 loading method Methods 0.000 description 1
- 238000007477 logistic regression Methods 0.000 description 1
- 239000006166 lysate Substances 0.000 description 1
- 206010025482 malaise Diseases 0.000 description 1
- 239000000463 material Substances 0.000 description 1
- 108091035155 miR-10a stem-loop Proteins 0.000 description 1
- 108091040501 miR-129 stem-loop Proteins 0.000 description 1
- 108091045757 miR-129-3 stem-loop Proteins 0.000 description 1
- 108091090758 miR-129-4 stem-loop Proteins 0.000 description 1
- 108091065139 miR-129-5 stem-loop Proteins 0.000 description 1
- 108091064378 miR-196b stem-loop Proteins 0.000 description 1
- 108091084213 miR-563 stem-loop Proteins 0.000 description 1
- 238000002156 mixing Methods 0.000 description 1
- 238000010369 molecular cloning Methods 0.000 description 1
- 238000011017 operating method Methods 0.000 description 1
- 239000012071 phase Substances 0.000 description 1
- 238000001556 precipitation Methods 0.000 description 1
- 230000008569 process Effects 0.000 description 1
- 238000004393 prognosis Methods 0.000 description 1
- 238000011002 quantification Methods 0.000 description 1
- 239000002994 raw material Substances 0.000 description 1
- 230000004044 response Effects 0.000 description 1
- 238000005070 sampling Methods 0.000 description 1
- 238000012163 sequencing technique Methods 0.000 description 1
- 230000000405 serological effect Effects 0.000 description 1
- 229940126586 small molecule drug Drugs 0.000 description 1
- 210000005070 sphincter Anatomy 0.000 description 1
- 210000000278 spinal cord Anatomy 0.000 description 1
- 210000000273 spinal nerve root Anatomy 0.000 description 1
- 210000002784 stomach Anatomy 0.000 description 1
- 210000000115 thoracic cavity Anatomy 0.000 description 1
- 210000003462 vein Anatomy 0.000 description 1
- XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N water Substances O XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
- C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
- C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
- C12Q1/6876—Nucleic acid products used in the analysis of nucleic acids, e.g. primers or probes
- C12Q1/6883—Nucleic acid products used in the analysis of nucleic acids, e.g. primers or probes for diseases caused by alterations of genetic material
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
- C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
- C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
- C12Q2600/00—Oligonucleotides characterized by their use
- C12Q2600/158—Expression markers
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
- C12Q2600/00—Oligonucleotides characterized by their use
- C12Q2600/178—Oligonucleotides characterized by their use miRNA, siRNA or ncRNA
Landscapes
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Zoology (AREA)
- Wood Science & Technology (AREA)
- Analytical Chemistry (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Microbiology (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Physics & Mathematics (AREA)
- Immunology (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- General Engineering & Computer Science (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Biophysics (AREA)
- Pathology (AREA)
- Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)
Abstract
本发明涉及医学生物检测技术领域，具体是一种适用于后纵韧带骨化症早期筛查及诊断的血清miRNA标志物及其在制备后纵韧带骨化的诊断试剂或试剂盒中的应用。本发明首次发现了对后纵韧带骨化具有较高诊断价值的生物标志物miRNA-563、miRNA-196b、miRNA-10a、miRNA-129；通过血清miRNA标志物和诊断试剂盒的研制和应用，可以使后纵韧带骨化的早期筛查更加方便易行，为临床医生快速并准确掌握患者病情，为提高临床治疗效果奠定基础，并为发现具有潜在治疗价值的新型小分子药物靶标提供帮助。
Description
技术领域
本发明涉及医学生物检测技术领域，具体地说，是一种适用于后纵韧带骨化症早期筛查及诊断的血清miRNAs标志物及检测应用。
背景技术
后纵韧带骨化症(ossificationoftheposteriorlongitudinalligament，OPLL)是常见的脊柱疾患之一，骨化物造成脊髓压迫，引起患者四肢与躯干感觉、运动及括约肌功能障碍，最终导致四肢瘫痪和大小便失禁，是严重危害人类健康的疾病。OPLL亚洲人群尤其多见，日本发病率为1.9～4.3％(StapletonCJ,PhamMH,AttenelloFJ,etal.Ossificationoftheposteriorlongitudinalligament:geneticsandpathophysiology[J].NeurosurgFocus,2011,30(3):E6.)。由于骨化物质地坚硬，减压手术风险大，容易因脊髓损伤导致患者发生瘫痪等严重并发症。在诊断方面，由于其早期首发症状往往来源于脊髓神经根受压，与其他脊柱脊髓疾患易混淆造成漏诊误诊；而从治疗角度考虑，由于骨化范围广，脊髓压迫重，椎管的储备间隙小，其手术治疗是脊柱外科的巨大挑战(SeichiA,HoshinoY,KimuraA,etal.Neurologicalcomplicationsofcervicallaminoplastyforpatientswithossificationoftheposteriorlongitudinalligament-amulti-institutionalretrospectivestudy.Spine(PhilaPa1976).2011,36(15):E998-1003.)。因此，为后纵韧带骨化的早期诊断寻找高敏感性或特异性的早期筛查生物标志物已成为一个急需解决的问题。
近年来，随着人类基因组计划的进一步开展，大量的非编码序列越来越受到关注，其中microRNA(miRNA)的发现最引人注目。miRNA是一类全长仅有20-24bp的非编码短链核苷酸片段，进化上具有高度的保守性，其在生长发育、肿瘤发生、免疫应答等方面具有广泛的作用。由于miRNA作用方式的是以靶位点序列特异性为基础，一个miRNA可能作用于多个mRNA，而一个mRNA又可能接受多个miRNA的调控，个别miRNA的缺失可能对生物的发育及生存并没有明显的影响，但却为某些疾病的发生埋下了伏笔(FlyntAS,LaiEC.BiologicalprinciplesofmicroRNA-mediatedregulation:sharedthemesamiddiversity.NatRevGenet.2008,9(11):831-842.)。而由于miRNA作用方式的特殊性，使其在许多慢性疾病中都起到了至关重要的作用(CeribelliA,NahidMA,SatohM,etal.MicroRNAsinrheumatoidarthritis.FEBSLett.2011,585(23):3667-74.)，其有望成为重大疾病发生、诊断和预后的重要候选标志物。现已证明miRNA在外周血中性质稳定且存在显著的疾病特异性，但含量较低、检测不易。因此开发易于检测、成本低廉、快速有效的检测试剂盒成品则能够有效提高检测效率并达到良好的可重复性。然而，目前还没有应用血清miRNA标志物对后纵韧带骨化早期筛查的研究报道，若能筛选出后纵韧带骨化异常表达的血清miRNA作为生物标志物，并研制相应的筛选试剂盒，必将对我国后纵韧带骨化的早期诊断具有重要意义。
发明内容
本发明的首要目的是针对上述技术问题，提出一种与后纵韧带骨化相关的血清miRNAs标志物。
为解决上述技术问题，本发明的第一方面，提供适用于后纵韧带骨化症早期筛查及诊断的血清miRNAs标志物：包括miRNA-563、miRNA-196b、miRNA-10a、miRNA-129。
本发明所述的miRNA-563，Accessionnumber：MIMAT0003227，具体序列如下：
agguugacauacguuuccc(SEQIDNO:1)。
本发明所述的miRNA-196b，Accessionnumber：MIMAT0001080，具体序列如下：
uagguaguuuccuguuguuggg(SEQIDNO:2)。
本发明所述的miRNA-10a，Accessionnumber：MIMAT0000253，具体序列如下：
uacccuguagauccgaauuugug(SEQIDNO:3)。
本发明所述的miRNA-129，Accessionnumber：MIMAT0000242，具体序列如下：
cuuuuugcggucugggcuugc(SEQIDNO:4)。
miRNA-563、miRNA-196b、miRNA-10a、miRNA-129在血清中的表达水平与后纵韧带骨化程度成正相关。因此，通过检测血清中miRNA-563、miRNA-196b、miRNA-10a、miRNA-129的表达水平，可以评估待检人群中后纵韧带骨化的风险及程度。
本发明的第二方面，提供上述血清miRNA标志物在制备后纵韧带骨化的诊断试剂或试剂盒中的应用。优选的，所述的诊断试剂或试剂盒为血清学检测试剂或检测试剂盒。
所述的诊断试剂或试剂盒检测生物样品中miRNA-563、miRNA-196b、miRNA-10a、miRNA-129中的一种或两种以上的miRNA的表达量。所述的生物样品选自：获自对象的新鲜组织或细胞、福尔马林固定或石蜡包埋组织或细胞、血液或体液。优选的，所述的生物样品为血清。
所述的诊断试剂或试剂盒包括：对miRNA-563、miRNA-196b、miRNA-10a、miRNA-129中的一种或两种以上具有检测特异性的探针、基因芯片，或PCR引物。
优选的，所述的诊断试剂或试剂盒为采用Real-timeRT-PCR(qPCR)方法检测miRNA表达量的试剂或试剂盒。
优选的，所述的对miRNA-563、miRNA-196b、miRNA-10a、miRNA-129具有检测特异性的PCR引物的核苷酸序列分别如SEQIDNO:5、SEQIDNO:6、SEQIDNO:7、SEQIDNO:8所示。
本发明的第三方面，提供一种诊断后纵韧带骨化的试剂盒，所述的试剂盒中包括用于检测miRNA表达量的试剂，所述的miRNA选自miRNA-563、miRNA-196b、miRNA-10a、miRNA-129中的一种或两种以上。
优选的，所述的用于检测miRNA表达量的试剂为采用Real-timeRT-PCR方法检测miRNA表达量的试剂。
优选的，所述的试剂盒中包括：对miRNA-563、miRNA-196b、miRNA-10a、miRNA-129具有检测特异性的PCR引物的核苷酸序列，分别如SEQIDNO:5、SEQIDNO:6、SEQIDNO:7、SEQIDNO:8所示。
本发明的第四方面，提供检测miRNA-563、miRNA-196b、miRNA-10a、miRNA-129表达水平的试剂在制备后纵韧带骨化诊断或筛查用试剂盒中的用途。
本发明的第五方面，提供如SEQIDNO.5、SEQIDNO.6、SEQIDNO.7、SEQIDNO.8所示的引物在制备后纵韧带骨化诊断或筛查用试剂盒中的用途。
本发明的试剂盒通过检测miRNA-563、miRNA-196b、miRNA-10a、miRNA-129的表达水平，可以筛查待检测人群患后纵韧带骨化的风险：若miRNA-563、miRNA-196b、miRNA-10a、miRNA-129中任一miRNA的表达水平高于正常值范围(上述miRNA的正常值范围依次为6649±1554，1800±901，63717±17258，1075±651拷贝数每500微升外周静脉血血清)，则患后纵韧带骨化的风险较高；若miRNA-563、miRNA-196b、miRNA-10a、miRNA-129中任一miRNA的表达水平低于正常值范围(上述miRNA的正常值范围依次为1800±901，6649±1554，63717±17258，1075±651拷贝数每500微升外周静脉血血清)，则患后纵韧带骨化的风险低。
本发明的技术方案包括：(1)建立统一标准的标本采集及处理程序，即标准化操作程序(SOP)；(2)建立系统的待测者临床信息取样流程及资料保管储存程序；(3)血清miRNA筛查试剂盒的研制：根据后纵韧带骨化和健康人对照的特异血清miRNA开发miRNA对于OPLL的流行病学筛查试剂盒。
本发明可用于对后纵韧带骨化高危人群进行后纵韧带骨化症疾病的早期诊断筛查，本发明通过检测上述miRNA的血清含量同时利用4种miRNA的线性拟合公式(miRNA-563每500微升外周静脉血血清拷贝数×0.004+miRNA-196b每500微升外周静脉血血清拷贝数×0.03+miRNA-10a每500微升外周静脉血血清拷贝数×0.003+miRNA-129每500微升外周静脉血血清拷贝数×0.05-353)得出拟合值，新的拟合值大于0则具有较高可能患后纵韧带骨化症，而小于0则患后纵韧带骨化症的可能较低。此应用可早期筛查后纵韧带骨化症的患者，以期及早进行干预或预防，最大限度的延缓患者病情进展，降低致残率。
本发明的有益效果在于：本发明首次发现了对后纵韧带骨化具有较高诊断价值的生物标记物miRNA-563、miRNA-196b、miRNA-10a、miRNA-129；通过血清miRNA标志物和诊断试剂盒的研制和应用，可以使后纵韧带骨化的早期筛查更加方便易行，为临床医生快速并准确掌握患者病情，为提高临床治疗效果奠定基础，并为发现具有潜在治疗价值的新型小分子药物靶标提供帮助。
附图说明
图1示高通量miRNA测序后通过将对照组(非后纵韧带骨化症患者组织)与病例组(后纵韧带骨化症患者组织)的miRNA平均值进行散点图分析后，显示差异表达的miRNA。其中变化倍数最高的10个miRNA(由黑色字体标出)被作为进行后续验证的候选miRNA。
图2为选取10例后纵韧带骨化症患者血清以及10例非后纵韧带骨化症患者血清进行候选miRNA的血清表达量检测。通过real-timePCR法，将测得的miRNA表达量进行统计分析后我们可以看到骨化症患者血清中miRNA-563、miRNA-196b、miRNA-10a及miRNA-129的表达量明显高于对照组，提示该4个miRNA可能具有诊断价值，值得进一步研究。**，P<0.01。
图3为实施例2中36个OPLL患者及30个正常健康人的血清miRNA-563、miRNA-196b、miRNA-10a及miRNA-129的检测情况。通过将CT值最高的样本作为对照，并通过计算外参cel-miR-39含量排除操作因素得出的相对量值。结果显示利用本发明相关试剂方法检测OPLL组患者血清miRNAs表达量均显著高于后纵韧带(PLL)正常对照组。*，P<0.05；**，P<0.01。
图4为实施例3中68个OPLL患者及45个非OPLL患者的血清miRNA-563、miRNA-196b、miRNA-10a及miRNA-129的检测情况。通过将real-timePCR的值与标准曲线进行绝对定量，得出每个样本的miRNA拷贝数(拷贝数/500微升血清)并进行作图分析。结果显示利用本发明相关试剂方法检测OPLL组患者血清4个miRNAs总体表达量均显著高于对照组。**，P<0.01。
图5将图4中的结果进行ROC曲线的作图及分析，可见4个miRNA每一个单独都具有一定的特异性，且4种miRNA的ROC曲线分析结果均较为显著(P<0.05)。将4种miRNA的绝对定量值进行logistic多因素回归分析，拟合出新的代表4种miRNA水平的拟合值，将该拟合值进行ROC检验。结果显示拟合值的特异性较单个miRNA特异性高，且P<0.01。结果提示4种miRNA均能对诊断OPLL提供重要参考价值，其中将4种miRNA进行logistic回归后的拟合值能够达到更高的诊断特异性。
具体实施方式
下面结合实施例对本发明提供的具体实施方式作详细说明。
本发明所用试剂和原料均市售可得或可按文献方法制备。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件如Sambrook等《分子克隆：实验室指南》(NewYork：ColdSpringHarborLaboratoryPress，1989)中所述的条件，或按照常规条件，或按照制造厂商所建议的条件。
实施例1
一、研究对象
选取后纵韧带骨化症患者的后纵韧带组织(n＝3)以及外伤手术中正常后纵韧带组织(n＝3)进行高通量测序及miRNA组的生物信息学分析。病例组与对照组的年龄、吸烟、饮酒等因素的分部差异无统计学意义(P>0.05)。
二、研究方法
1.手术中选取患者的韧带组织，立即转入RNAlater(Ambion公司或其它同等产品)低温短暂保存。转运至实验室后立即进行-80℃低温冻存。
2.待样本收齐后将保存好的组织样品一并交予公司(烈冰信息、伯豪生物等高通量测序公司)进行高通量RNA的抽提及质检。
3.质检通过的样品由公司进行miRNA库的构建及测序，测序采用Hiseq2000(illumina公司)或以上平台。
4.测序数据进行均一化处理后，对表达量在病例组及对照组间存在明显差异的miRNA进行筛选，选取FDR<0.5且变化倍数最高的10个miRNA进行后续验证研究。
5.将候选miRNA在额外的6个后纵韧带骨化症组织以及正常韧带组织中进行表达量的验证。
6.为了筛选出在外周血具有诊断意义的miRNA，抽取10例后纵韧带骨化症患者以及10例正常人静脉血5ml，并于室温凝血后作500×g短暂离心3min，取上清500微升，利用QIAGEN血清miRNA回收试剂盒进行miRNA的收集、逆转录及检测。
三、实验结果
通过高通量测序及生物信息学分析对后纵韧带骨化症患者的后纵韧带组织以及外伤手术中正常后纵韧带中的miRNA进行高通量测序筛选，选取表达差异最高的10条miRNA作为研究对象，如图1所示。候选miRNA在经过组织层面表达验证后遂进行后纵韧带骨化症患者及正常患者的静脉血血清miRNA的检测。如图2所示，上述10条差异miRNA在后纵韧带骨化症患者血清中仅有miRNA-563、miRNA-196b、miRNA-10a及miRNA-129相较于正常人血清中含量明显升高，提示miRNA-563、miRNA-196b、miRNA-10a及miRNA-129可能具有后纵韧带骨化症的血清学特异性，可进行进一步的深入研究。
实施例2：针对入院患者进行血清OPLL特异性miRNA筛查
一、研究对象
病例组为2015年6月至2015年9月在上海长征医院收集的36例病例，均经颈椎或胸椎CT三维重建确诊后纵韧带骨化症，采血前未经任何治疗。对照组为同期进行社区疾病筛查的健康个体30例，所有样本采集前告知采集目的并获得患者同意。病例组与对照组的年龄、吸烟、饮酒等因素的分部差异无统计学意义(P>0.05)。
二、研究方法
1.晨起空腹，使用EDTA抗凝管采肘静脉血5ml，采血后轻轻摇动，使抗凝剂与血液混合均匀，室温静置40min之后1800转离心20min，将血清与血细胞分离，装入1.5mlEP管中，-80℃保存；
2.将TakaraRNAiso(Takara公司提供)或TRIzolReagent(LifeTechnology提供，或同等酚氯仿RNA抽提试剂)加入至500μl血清样本至总体积1.2ml，并于室温(25℃左右)下放置10min，确保完全裂解；加入氯仿(0.2ml氯仿/每1mlRNA抽提试剂)剧烈上下震荡15s后，在室温下静置5min以上待其分层，上层水相即为所需RNA；13000×g低温离心15min(4℃)，将上层澄清水相用无核酶枪头小心地吸出700μl，加入至等量异丙醇中，充分颠倒混匀于室温下静置约15min以上。再次13000×g，低温离心10min(4℃)。小心保留沉淀并弃去上清，加入75％(V/V)乙醇(1ml75％乙醇/ml裂解液)，颠倒混合样本；7500×g低温离心5min(4℃)。小心弃去上清，同时于空气中干燥5min(注意不可使RNA过分干燥，或将影响其溶解)；加入14μl预热的DEPC水溶解总RNA，同时加入1μl人工合成的线虫miRNAcel-miR-39(5’-UCACCGGGUGUAAAUCAGCUUG-3’，10nM，SEQIDNO:10)作为外参直接加入每个样品，至于4℃冰箱用于逆转录。
3.Real-timeRT-PCR(qPCR)方法
(1)取受试者血清总RNA，利用TOYOBOReverTra逆转录试剂盒(或同等产品)制备20μl体积的逆转录反应体系，并通过37℃水浴锅(或同等环境下)进行逆转录15min获得cDNA样品；
(2)引物设计，逆转录所用引物如下；
miR-563逆转录引物：
GTCGTATCCAGTGCGAACTGTGGCGATCGGTACGGGCTACACTCGGCAATTGCACTGGATACGACGGGAA(SEQIDNO:5)
miR-196b逆转录引物：
GTCGTATCCAGTGCGAACTGTGGCGATCGGTACGGGCTACACTCGGCAATTGCACTGGATACGACCCCAA(SEQIDNO:6)
miR-10a逆转录引物：
GTCGTATCCAGTGCGAACTGTGGCGATCGGTACGGGCTACACTCGGCAATTGCACTGGATACGACTATTC(SEQIDNO:7)
miR-129逆转录引物：
GTCGTATCCAGTGCGAACTGTGGCGATCGGTACGGGCTACACTCGGCAATTGCACTGGATACGACATGCT(SEQIDNO:8)
Cel-39逆转录引物：
GTCGTATCCAGTGCGAACTGTGGCGATCGGTACGGGCTACACTCGGCAATTGCACTGGATACGACCAAGC(SEQIDNO:9)
(3)加入GreenRealtimePCRMasterMix进行PCR反应，反应体系如下：
PCR反应步骤：
(4)检测并比较后纵韧带骨化病例与健康人对照血清样本中miRNA的含量的变化。PCR产物含量计算采用比较Ct值法进行相对定量。比较Ct值法前提是假设每个循环增加一倍的产物数量，在PCR反应的指数期得到Ct值来反应起始模板的量，一个循环(Ct＝1)的不同相当于起始模板数2倍的差异。
定义：ΔCt＝Ct目的基因-Ct内标
ΔΔCt＝(Ct目的基因-Ct内标)已处理-(Ct目的基因-Ct内标)未处理
RQ＝2-ΔΔCt
利用EXCEL里面的统计分析工具，计算各组的平均值和标准差，两组之间用t检验，P<0.05认为有统计学意义，P<0.01认为差异显著。
三、研究结果
病例组血清miRNA-563、miRNA-196b、miRNA-10a、miRNA-129表达水平较对照组显著上调，具体如表1和图3所示：
表1：对照组与病例组血清miRNA水平比较(ΔCT)(X±SD)
上述结果显示血清miRNA-563、miRNA-196b、miRNA-10a、miRNA-129水平在对照组及病例组中具有明显差异，提示其中任一miRNA的上调均对发生韧带骨化具有提示意义。
实施例3：通过检测血清OPLL特异性miRNA对患者进行OPLL的筛查
一、研究对象
病例组为2015年6月至2015年10月在上海长征医院脊柱一科收集的68例OPLL病例，均经颈椎CT三维重建确诊后纵韧带骨化症，采血前未经任何治疗。对照组为骨科门诊接诊病人45例，该45例患者均未见明显OPLL症状、体征或影像学表现。所有样本采集前告知采集目的并获得患者同意。病例组与对照组的年龄、吸烟、饮酒等因素的分部差异无统计学意义(P>0.05)。
二、研究方法
同实施例2。
为了明确血清中4种miRNA的具体含量，我们利用标准曲线及绝对定量real-timePCR对上述4种指标进行分析。
此外，为了检测前述4种miRNA指标的特异性及敏感性，利用SPSS软件对测得数值进行统计分析，并通过线性回归方程拟合联合参数，将4种miRNA拟合成新值，并对该新值进行特异性的检验。
三、研究结果
病例组血清miRNA-563、miRNA-196b、miRNA-10a、miRNA-129表达水平较对照组显著上调，具体如图4所示。
利用SPSS进行ROC曲线分析，我们发现上述4种miRNA均有较好的特异性及敏感性，如图5所示。
为了将4种阳性指标联合分析，我们采取线性回归方程进行拟合，拟合出的新值其ROC曲线分析结果显示其特异性及敏感性均较4种miRNA单一作为诊断指标要更高，如图5所示。
以上已对本发明创造的较佳实施例进行了具体说明，但本发明创造并不限于所述实施例，熟悉本领域的技术人员在不违背本发明创造精神的前提下还可作出种种的等同的变型或替换，这些等同的变型或替换均包含在本申请权利要求所限定的范围内。
Claims (10)
1.miRNA在制备后纵韧带骨化的诊断试剂或试剂盒中的应用，所述的miRNA选自miRNA-563、miRNA-196b、miRNA-10a、miRNA-129中的一种或两种以上，所述的miRNA-563、miRNA-196b、miRNA-10a、miRNA-129的核苷酸序列分别如SEQIDNO:1、SEQIDNO:2、SEQIDNO:3、SEQIDNO:4所示。
2.根据权利要求1所述的miRNA在制备后纵韧带骨化的诊断试剂或试剂盒中的应用，其特征在于，所述的诊断试剂或试剂盒为血清学诊断试剂或诊断试剂盒。
3.根据权利要求1所述的miRNA在制备后纵韧带骨化的诊断试剂或试剂盒中的应用，其特征在于，所述的诊断试剂或试剂盒检测生物样品中miRNA-563、miRNA-196b、miRNA-10a、miRNA-129中的一种或两种以上的miRNA的表达量。
4.根据权利要求3所述的miRNA在制备后纵韧带骨化的诊断试剂或试剂盒中的应用，其特征在于，所述的生物样品选自：获自对象的新鲜组织或细胞、福尔马林固定或石蜡包埋组织或细胞、血液或体液。
5.根据权利要求3所述的miRNA在制备后纵韧带骨化的诊断试剂或试剂盒中的应用，其特征在于，所述的生物样品为血清。
6.根据权利要求1所述的miRNA在制备后纵韧带骨化的诊断试剂或试剂盒中的应用，其特征在于，所述的诊断试剂或试剂盒包括：对miRNA-563、miRNA-196b、miRNA-10a、miRNA-129中的一种或两种以上具有检测特异性的探针、基因芯片，或PCR引物。
7.根据权利要求1所述的miRNA在制备后纵韧带骨化的诊断试剂或试剂盒中的应用，其特征在于，所述的诊断试剂或试剂盒为采用Real-timeRT-PCR方法检测miRNA表达量的试剂或试剂盒。
8.根据权利要求6所述的miRNA在制备后纵韧带骨化的诊断试剂或试剂盒中的应用，其特征在于，所述的对miRNA-563、miRNA-196b、miRNA-10a、miRNA-129具有检测特异性的PCR引物的核苷酸序列分别如SEQIDNO:5、SEQIDNO:6、SEQIDNO:7、SEQIDNO:8所示。
9.一种诊断后纵韧带骨化的试剂盒，其特征在于，所述的试剂盒中包括用于检测miRNA表达量的试剂，所述的miRNA选自miRNA-563、miRNA-196b、miRNA-10a、miRNA-129中的一种或两种以上。
10.根据权利要求9所述的诊断后纵韧带骨化的试剂盒，其特征在于，所述的用于检测miRNA表达量的试剂为采用Real-timeRT-PCR方法检测miRNA表达量的试剂。
Priority Applications (3)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| CN201510936874.2A CN105400882B (zh) | 2015-12-15 | 2015-12-15 | 一种适用于后纵韧带骨化诊断的血清miRNA标志物及应用 |
| US16/063,195 US11124832B2 (en) | 2015-12-15 | 2016-12-07 | Serum miRNA marker for OPLL diagnosis and application thereof |
| PCT/CN2016/000675 WO2017101172A1 (zh) | 2015-12-15 | 2016-12-07 | 一种适用于后纵韧带骨化诊断的血清miRNA标志物及应用 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| CN201510936874.2A CN105400882B (zh) | 2015-12-15 | 2015-12-15 | 一种适用于后纵韧带骨化诊断的血清miRNA标志物及应用 |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| CN105400882A true CN105400882A (zh) | 2016-03-16 |
| CN105400882B CN105400882B (zh) | 2019-04-02 |
Family
ID=55466637
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| CN201510936874.2A Active CN105400882B (zh) | 2015-12-15 | 2015-12-15 | 一种适用于后纵韧带骨化诊断的血清miRNA标志物及应用 |
Country Status (3)
| Country | Link |
|---|---|
| US (1) | US11124832B2 (zh) |
| CN (1) | CN105400882B (zh) |
| WO (1) | WO2017101172A1 (zh) |
Cited By (3)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| WO2017101172A1 (zh) * | 2015-12-15 | 2017-06-22 | 中国人民解放军第二军医大学 | 一种适用于后纵韧带骨化诊断的血清miRNA标志物及应用 |
| CN109946411A (zh) * | 2017-12-21 | 2019-06-28 | 中国医学科学院北京协和医院 | 用于胸椎黄韧带骨化诊断的生物标记物及其筛选方法 |
| CN110075115A (zh) * | 2019-04-29 | 2019-08-02 | 上海交通大学医学院附属新华医院 | miR-337-3p过表达方案在预防治疗肌腱病及韧带骨化或钙化病中的应用 |
Citations (3)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN101368213A (zh) * | 2008-10-13 | 2009-02-18 | 南京大学 | 血清微小核糖核酸试剂盒及其在乙肝早期诊断中的应用 |
| CN102933719A (zh) * | 2009-12-24 | 2013-02-13 | 复旦大学 | 用于结直肠癌血浆中的微rna表达谱分析的组合物和方法 |
| CN103614468A (zh) * | 2013-11-18 | 2014-03-05 | 常州市第一人民医院 | 一种判断晚期胃癌治疗疗效的试剂盒及其使用方法 |
Family Cites Families (8)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| EP2041317A4 (en) * | 2006-07-13 | 2009-10-14 | Univ Ohio State Res Found | METHODS AND COMPOSITIONS BASED ON MICRO-RNA FOR THE DIAGNOSIS AND TREATMENT OF COLON CANCER RELATED DISEASES |
| CN101386848A (zh) * | 2008-08-12 | 2009-03-18 | 南京大学 | 细胞微粒子所载微小核糖核酸及其制备研究方法和应用 |
| CN102725632A (zh) * | 2009-08-28 | 2012-10-10 | 奥斯瑞根公司 | 肺病的miRNA生物标志物 |
| NZ704322A (en) * | 2010-07-06 | 2016-07-29 | Interna Technologies Bv | Mirna and its diagnostic and therapeutic uses in diseases or conditions associated with melanoma, or in diseases or conditions associated with activated braf pathway |
| CN103205430B (zh) * | 2013-04-28 | 2015-04-15 | 夏彦恺 | 人类重度子痫前期发生相关的血清微小核糖核酸标志物及其应用 |
| WO2014186462A1 (en) * | 2013-05-15 | 2014-11-20 | The Research Foundation For The State University Of New York | Microrna-129 as a biomarker for colorectal cancer |
| WO2015153909A2 (en) * | 2014-04-02 | 2015-10-08 | Chevillet John R | High intensity focused ultrasound and methods of performing non-invasive biopsies using same |
| CN105400882B (zh) * | 2015-12-15 | 2019-04-02 | 中国人民解放军第二军医大学 | 一种适用于后纵韧带骨化诊断的血清miRNA标志物及应用 |
-
2015
- 2015-12-15 CN CN201510936874.2A patent/CN105400882B/zh active Active
-
2016
- 2016-12-07 US US16/063,195 patent/US11124832B2/en active Active
- 2016-12-07 WO PCT/CN2016/000675 patent/WO2017101172A1/zh active Application Filing
Patent Citations (3)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN101368213A (zh) * | 2008-10-13 | 2009-02-18 | 南京大学 | 血清微小核糖核酸试剂盒及其在乙肝早期诊断中的应用 |
| CN102933719A (zh) * | 2009-12-24 | 2013-02-13 | 复旦大学 | 用于结直肠癌血浆中的微rna表达谱分析的组合物和方法 |
| CN103614468A (zh) * | 2013-11-18 | 2014-03-05 | 常州市第一人民医院 | 一种判断晚期胃癌治疗疗效的试剂盒及其使用方法 |
Non-Patent Citations (1)
| Title |
|---|
| 《SCIENTIFIC REPORTS》 * |
Cited By (5)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| WO2017101172A1 (zh) * | 2015-12-15 | 2017-06-22 | 中国人民解放军第二军医大学 | 一种适用于后纵韧带骨化诊断的血清miRNA标志物及应用 |
| US11124832B2 (en) | 2015-12-15 | 2021-09-21 | The Second Military Medical University | Serum miRNA marker for OPLL diagnosis and application thereof |
| CN109946411A (zh) * | 2017-12-21 | 2019-06-28 | 中国医学科学院北京协和医院 | 用于胸椎黄韧带骨化诊断的生物标记物及其筛选方法 |
| CN109946411B (zh) * | 2017-12-21 | 2021-08-13 | 中国医学科学院北京协和医院 | 用于胸椎黄韧带骨化诊断的生物标记物及其筛选方法 |
| CN110075115A (zh) * | 2019-04-29 | 2019-08-02 | 上海交通大学医学院附属新华医院 | miR-337-3p过表达方案在预防治疗肌腱病及韧带骨化或钙化病中的应用 |
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| US11124832B2 (en) | 2021-09-21 |
| CN105400882B (zh) | 2019-04-02 |
| WO2017101172A1 (zh) | 2017-06-22 |
| US20190002983A1 (en) | 2019-01-03 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| CN106459867A (zh) | 肝癌的检测试剂盒或装置以及检测方法 | |
| CN109295218B (zh) | 环状RNA标志物hsa_circ_0001788及其应用 | |
| CN102358900B (zh) | 与人类先天性巨结肠发生相关的血浆微小核糖核酸标志物及其应用 | |
| CN111172287B (zh) | 外泌体lncRNA RN7SL5P作为内参基因在胃癌lncRNA检测中的应用 | |
| CN104293914A (zh) | 用于检测原发性肝细胞癌的血清miRNA标志物组合及应用 | |
| CN105176983A (zh) | 一种用于检测食管鳞癌相关血清miRNAs基因的试剂盒 | |
| CN105518154A (zh) | 脑癌检测 | |
| CN105400882A (zh) | 一种适用于后纵韧带骨化诊断的血清miRNA标志物及应用 | |
| CN104293908A (zh) | 用于检测非酒精性脂肪肝的血清miRNA标志物组合及应用 | |
| CN104818322B (zh) | miRNA和Cyfra21‑1联合在检测非小细胞肺癌中的应用 | |
| CN109722474A (zh) | 与骨代谢疾病相关的miRNA标志物miR-19b及其应用 | |
| CN101988062A (zh) | 宫颈癌检测标记物及其检测方法、试剂盒和生物芯片 | |
| CN105219841B (zh) | 一种肺癌差异性表达microRNA的检测试剂盒及其应用 | |
| CN103602747B (zh) | 一种用于膀胱癌血清miRNA检测的内参及其检测引物与应用 | |
| CN105087758A (zh) | 一种肺癌预后预测miRNA检测试剂盒 | |
| CN109136373A (zh) | 一种用于早期诊断肺癌转移的lncRNA检测试剂盒及其应用 | |
| CN108004318A (zh) | 用于早期乳腺癌筛查的血清miRNA标志物组合及其应用 | |
| EP3904535A1 (en) | Health risk assessment method | |
| CN111172285A (zh) | 用于胰腺癌早期诊断和/或预后监测的miRNA组及其应用 | |
| CN105671178B (zh) | 血清microRNA肝癌诊断标志物及试剂盒 | |
| CN104164500A (zh) | miRNA标志物hsa-miR-486-5p的应用 | |
| CN116240281B (zh) | 一种评估肾移植物排斥风险的miRNA标志物、反转录和检测引物组合、试剂盒及应用 | |
| CN104232741A (zh) | MiR-17,miR-20a,miR-29c和miR-223作为鼻咽癌分子标志物的应用 | |
| CN109913555B (zh) | 一种前列腺癌诊断标志物、测定方法及其应用 | |
| CN106434655B (zh) | 一种长链非编码rna及其血液定量检测方法 |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| C06 | Publication | ||
| PB01 | Publication | ||
| C10 | Entry into substantive examination | ||
| SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
| GR01 | Patent grant | ||
| GR01 | Patent grant | ||
| TR01 | Transfer of patent right | ||
| TR01 | Transfer of patent right |
Effective date of registration: 20231130 Address after: 200092 room 22a-5, No. 5, Anshan Road, Yangpu District, Shanghai Patentee after: Shanghai Yuhua Life Science and Technology Development Co.,Ltd. Address before: 200433 No. 800 Xiang Yin Road, Shanghai, Yangpu District Patentee before: THE SECOND MILITARY MEDICAL University |