CN102725632A - 肺病的miRNA生物标志物 - Google Patents

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Abstract

本发明描述可用作表征患者肺部疾病的血清或血浆生物标志物的miRNA。这些miRNA生物标志物可以单独使用或者与其它用于疾病如肺癌的诊断、预后或监测的其它标志物组合使用。在一个实施方案中，用于表征有肺部肿瘤或损伤的患者中的肺癌的方法，所述方法包括如下步骤：测量血清样本中miRNA的水平，和确定样本中miRNA下降或上升的水平，从而表征所述患者中的肺癌。

Description

肺病的miRNA生物标志物
本发明要求于2009年8月28日提交的美国临时申请No.61/237,972的优先权，所述文件通过提述并入本文。
本申请所述工作部分由联邦政府根据美国癌症研究所/NIH Grant No.1R43CA141786-01资助。因此，联邦政府对本发明可享有一定权利。
在美国，肺癌在所有癌症中具有最高的发生率和致死率(http://seer.cancer.gov/statistics/)。肺癌分为两个主要类型：小细胞肺癌(SCLC)和非小细胞肺癌(NSCLC)，前者感染20％的患者而后者感染80％的患者。NSCLC由三种主要亚型组成：腺癌、鳞状细胞癌(SCC)和大细胞癌，其中腺癌和鳞状细胞癌占大多数(Sekido等，Biochim Biophys Acta，1378：F21-59；Forgacs等，Pathol Oncol Res，7：6-13(2001))。据估计2008年美国发生215,000例肺癌新病例，肺癌患者死亡约162,000人(Jemal等，J Natl Cancer Inst，100：1672-94(2008))。肺癌的高致死率一部分是由于超过75％的肺癌患者在刚刚出现症状时即诊断为局部或远端转移，还有一部分是由于缺乏针对肺癌的高效治疗方法。尽管目前对于肺癌的治疗选择有限，但是已经显示，最早期得到诊断的患者的5年存活率(50％)优于晚期诊断的患者(＜10％)(参见，例如，http://seer.cancer.gov/statistics；Horner等(编).SEER Cancer Statistics Review，1975-2006，National Cancer Institute.Bethesda，MD)。因此，已经有更多研究致力于检测早期肺癌，使医疗干预可以提高存活率。
肺癌的风险因素包括年龄和通过吸烟(一手和二手)的烟草消耗。全部肺癌案例中约90％出现在吸烟者中。此外，男性和女性之间肺癌的发病率和致死率存在显著差异，表明两种性别之间存在遗传生物过程的可能性。肺癌中的最一贯报道的显著风险因素中都存在这些差异(Visbal等，Ann Thorac Surg，78：209-15(2004))。
已经进行了几项筛选研究，所述研究经设计用于检测早期肺癌。这些研究中很多使用两种主要的成像技术：胸部X-射线和计算机断层扫描(CT)。胸部X-射线可以显示肺内块状物质(mass)，其可以通过活检而对肺癌进行确证和分类。成像技术的改进，最明显的是螺旋计算机断层扫描(螺旋CT)的发展，使临床医生可以检测未出现症状的个体中的较小肺部肿瘤。早期肺癌行动项目(ELCAP)，使用胸部X-射线和低剂量CT，设计用于筛选无症状高风险吸烟者，这显示CT大大改进了对较小的、潜在可治愈损伤的检测(Henschke等，Lancet，354：99-105(1999))。然而，主要的缺点是假阳性率和高成本(平均600美元)，难以证明其可作为筛选范例(也参见Henschke等，N Engl J Med，255：1763-71(2006))。
这些研究在科学界引发了激烈的讨论，讨论集中于研究的设计上，特别是研究设计缺乏随机性，和考虑到高成本和高假阳性率而得出的结论(Henschke等，1999；Gould等，N Engl J Med，356：743-747(2007))。吸烟者和曾经的吸烟者的螺旋CT扫描中25-60％表现出良性的异常(Swensen等，Am J Respir Crit CareMed，165：508-13(2002))。无症状患者的成像筛选不能将良性与早期恶性损伤相区别。也有报道称重复暴露于低剂量CT扫描可使患者暴露于潜在的有害水平的辐射(Brenner等，Radiology，231：440-5(2004))。
目前，仍然需要用于肺病(包括癌症)的非侵入性检测，监测对疗法的响应，或者检测肺癌复发的临床相关标志物。同样明确的是，这种试验必须具备高度特异性和合理的灵敏度，并且以合理的成本容易使用。循环的生物标志物提供了一种成像的替换方案，其具有下述优势：1)它们在最小侵入、易于收集的样品类型(血液或血液来源流体)中发现，2)它们可在受试者中随时间频繁监测以建立精确的基线，使其易于检测随时间的变化，3)它们能以合理的低成本提供，4)它们可以限制正在进行重复的昂贵并且可能有害的CT扫描的患者的数目，和/或5)不同于CT扫描，生物标志物可能区别无害的肺部损伤和更具侵略性的肺部损伤(参见，例如，Greenberg和Lee，Opin Pulm Med，13：249-55(2007))。
现有的生物标志物测定法包括几种血清蛋白标志物如CEA(Okada等，Ann Thorac Surg，78：216-21(2004))，CYFRA 21-1(Schneider，Adv Clin Chem，42：1-41(2006))，CRP(Siemes等，J Clin Oncol，24：5216-22(2006))，CA-125(Schneider，2006)和神经元特异性烯醇化酶和鳞状细胞癌抗原(Siemes等，2006)。低灵敏度和特异性，以及由于良性肺病产生的显著数量的假阳性结果限制了这些测定法的应用。
也已经评价了循环的核酸如DNA和mRNA作为肺癌的可能的诊断标志物的作用。这些研究基于这样的观察：循环的核酸显示出可指示癌症的差异表达(参见，例如，Bremnes等，Lung Cancer，49：1-12(2005)；Johnson等，Cell，120：635-47(2005)；Yanaihara等，Cancer Cell，9：189-98(2006)；Chen等，Cell Res，18：997-1006(2008)；Fabbri等，Cancer J，14：1-6(2008)；Garofalo等，Oncogene，27：3845-55(2008)；Mitchell等，Proc Natl Acad Sci，105：10513-8(2008)；Schickel等，Oncogene，27：5959-74(2008)；Weiss等，Ann Oncol，19：1053-9(2008)；和Yu等，Cancer Cell，13：48-57(2008))。循环中游离DNA的来源还未完全了解，但是认为它们代表来自受损(凋亡、坏死)肿瘤细胞的稳定残余部分(Jahr等，Cancer Res，61：1659-65(2001)；Bianchi，Placenta，25 Suppl A：S93-S101(2004))。
我们在本文描述了通过测量血清或血浆中的miRNA而检测、诊断或监测肺病的方法。
在一些实施方案中，本发明涉及通过检测血清或血浆中的miRNA而检测或监测肺病如小细胞肺癌或非小细胞肺癌。本发明的方法包括生物标志物的检测，所述生物标志物能用于诊断疾病和/或评价肺病的预后或侵略性。进一步地，所述方法可以用于表征肺病的进程。在某些实施方案中，本发明的方法可以用于确定患者中的肺部肿瘤或损伤是否为癌或良性。使用本发明的方法进行测试的患者也可以使用本领域其它已知方法进行测试。
在本发明的某些实施方案中，可以通过测量患肺病的受试者血清或血浆中以上升或下降的水平存在的miRNA量而实现诊断或预后。在一些实例中，可以检测(例如，扩增并测量)一种血清或血浆miRNA以表征肺病，而在其它实施方案中，检测来自血清或血浆的两种或多种miRNA。一些实施方案包括检测miRNA对。在一些实例中，对中的一个miRNA在肺病或肺癌患者的血清或血浆中上升，而对中的另一个miRNA下降。在其它实例中，对中的两个miRNA均上升或下降。在某些实施方案中，也可以检测非miRNA生物标志物如蛋白标志物。本发明的一些实施方案涉及肺癌的诊断或预后，或者确定患者中的肺癌的类型。在一些实施方案中，所述患者先前进行了肺病的筛选。
本申请中讨论了本发明的其它实施方案。本发明的其它目的、特性和优势由下述详细描述显而易见。关于本发明的一个方面讨论的任何实施方案也适用于本发明的其它方面，反之亦然。实施例部分的实施方案应理解为可应用于本发明所有方面的本发明的实施方案。
然而，应理解的是，详细描述和特定的实施例，虽然指示了本发明的特定实施方案，仅通过阐述方式给出，因为在本发明的精神和范围内的各种变化和修饰由本申请对于本领域的技术人员显而易见。
附图简述
下述图形成本说明书的一部分，并且包括在本文中进一步说明本发明的某些方面。通过提述这些图中的一个或多个，结合本文所述的特定实施方案的详细描述，可以更好地理解本发明。
图1是用于肺癌小鼠模型研究设计的示意概图。对一百一十五只A/J小鼠在时间(0)和第一次强饲后10周以所示剂量口服强饲苯并芘。十只对照小鼠在第0周/天接受不含致癌物的200μl棉籽油的口服强饲。每个时间点处死的小鼠数量示于箭头下方。剩余的小鼠每两周取血一次，直至18周，之后每四周取血一次。在34周末期，处死所有剩余小鼠。
图2A和图2B显示在发生肺部肿瘤的小鼠和对照小鼠中miR-183和miR-182(图2A)和miR-365和miR-141(图2B)血浆miRNA表达的瞬时变化。
图3显示线性判别分析(LDA)分类器的曲线下面积(AUC)数值的分布作为生物标志物数量的函数，如实施例5中所述。这个过程确定了用于分类器的生物标志物的最优数量。实心黑色圆形代表来自训练组的结果；空心三角形代表来自测试组的结果。垂直虚线是性能水平降低处。最大平均AUC为特征数＝9处。
图4显示实施例5的线性判别分析中训练和测试数据的性能估计。SENS，灵敏度；SPEC，特异性；NPV，阴性预测值；PPV，阳性预测值。使用六对不同的miRNA对：miR-142-5p和miR181d；miR-142-3p和miR181d；miR-142-3p和miR-422a；miR-142-5p和miR-422a；miR-92和miR-27b；和miR-24和miR-27a。
图5显示人类前体miRNA(前-miRNA)序列(按照出现的顺序，分别为SEQID NO 1-323)，由miRBase::Sequences Database的13.0版(http://microrna.sanger.ac.uk；Griffiths-Jones等，Nucleic Acids Research，2008，36，Database Issue，D154-D158；Griffiths-Jones等，Nucleic Acids Research，2006，34，Database Issue，D140-D144；Griffiths-Jones，Nucleic Acids Research，2004，32，Database Issue，D109-D111)提供。也提供了表1-5中成熟miRNA的名称。
示例实施方案
在某些方面，本发明的方法提供扩增并测量血清或血浆样本中miRNA量的测定法，从而表征肺病。
为了帮助理解本发明，首先定义某些术语。其它定义在本申请全文中提供。
如本文所使用的，术语“microRNA”(miRNA或miR)包括人miRNA、成熟单链miRNA、前体miRNA(前-miR)和它们的变体，所述miRNA可以天然存在。在一些实例中，术语“miRNA”还包括初级miRNA转录物和双链体miRNA。除非另外指出，否则在本文中使用时，特定miRNA的名称指前体miRNA的成熟miRNA。例如，miR-122a指源自前-miR-122的成熟miRNA序列。miRBase::Sequences Database(http://microrna.sanger.ac.uk(2010年4月发布的版本15)；Griffiths-Jones等，Nucleic Acids Research、2008、36、Database Issue、D154-D158；Griffiths-Jones等，Nucleic Acids Research、2006、34、Database Issue、D140-D144；Griffiths-Jones、Nucleic Acids Research、2004、32、Database Issue、D109-D111)中报道了特定miRNA的序列，包括人成熟和前体序列。对于某些miRNA，单个前体包含多于一个成熟miRNA序列。在其它实例中，多个前体miRNA包含相同的成熟序列。在一些实例中，已经根据新的科学一致性重新命名了成熟miRNA。例如，如本文所使用的，miR-213指来自前-miR-181a-1的成熟miRNA，也称作miR-181a*。已经重新命名的其它miRNA包括miR-189(也称作miR-24*)，其来自前-miR-24-1；miR-368(也称作miR-376c)；和miR-422b(也称作miR-378*)。技术人员理解对于给定miRNA，特别是对于miRNA的成熟形式，关于精确核苷酸序列的科学一致性可以随时间改变。通过本申请的测定法检测的miRNA包括miRNA的天然存在的序列。
术语“表征”在本文中使用以涵盖检测和预后，并且包括检测miRNA以做出诊断或预后确定或疾病预测。在一些实例中，表征将鉴定受试者是否有肺病如癌症，或者确定疾病状态。此外，根据本文方法检测miRNA包括测量miRNA的量，所述miRNA可以用于区分肺癌患者和其它肺部疾病患者，或者确定有肺部肿瘤的患者是否患癌症。在其它实例中，“表征”包括检测miRNA以确定疾病状态如肺癌的阶段或侵略性，或者确定肺病的适当治疗方法。
在权利要求和/或正文中与术语“包含”组合使用时，“一个”或“这个”可以表示“一个”，但是也可以与“一个或多个”、“至少一个”和“一个或多于一个”的意义一致。
I.样本
血清通常为凝结血液的流体、非细胞部分。血浆也是非细胞血液样本，但是不同于血清，血浆包含凝血因子。在一些实施方案中，血清或血浆样本获得自先前使用另一种诊断方法进行肺病筛选的人类患者。在多个实施方案中，血清或血浆样本获得自经测试对肿瘤或肺部损伤呈阳性的患者。在某些实施方案中，患者进行成像检测，例如，通过胸部X-射线或CT扫描。在其它实施方案中，所述方法涉及检测肺病成像结果为阳性的患者中的miRNA。在一些实例中，样本获得自有肺部肿瘤或损伤的患者。可以通过胸部X-射线或CT扫描，或者通过本领域已知的其它成像或检测方法检测肿瘤或损伤。其它实施方案包括测量来自先前或目前正进行肺病治疗的患者的样本中的miRNA。在其它实施方案中，所述样本来自怀疑患有肺癌或有发生肺癌的风险的患者。获得并用于所述测定法的血浆或血清的体积可以根据临床目的而变化。
本领域的技术人员将可以识别现有用于获得和制备血清样本的很多方法。通常地，使用标准方法将血液引入收集管并使其凝结。然后由凝结血液的细胞部分分离血清。在一些方法中，向血液收集管中加入凝结激活剂如二氧化硅颗粒。在其它方法中，不对血液进行处理以加速凝结。血液收集管可由很多来源商业上得到，并且有多种形式(例如，Becton Dickenson
Figure BDA0000157615080000061
管-SSTTM、玻璃血清管或塑料血清管)。
在一些方法中，通过静脉穿刺收集血液并在抽血后三小时内处理以将溶血现象降至最低，并将miRNA由完整细胞到血液的释放降至最低。在一些方法中，在冰上保存血液直至使用。可以通过离心将血液分级以去除细胞成分。在一些实施方案中，制备血清的离心可以在至少500、1000、2000、3000、4000或5000X G的速度进行。在某些实施方案中，可以将血液温育至少10、20、30、40、50、60、90、120或150分钟以使其凝结。在其它实施方案中，血液温育至多3小时。在使用血浆时，分离细胞和非细胞成分之前不使血液凝结。可以在从血液的细胞部分分离之后冷冻血清或血浆，直至进一步试验。
分析前，可以从血清或血浆提取RNA并使用本领域已知的方法纯化。已知很多方法用于分离总RNA，或者专门提取小RNA，包括miRNA。可以使用商业上可得到的试剂盒(例如Perfect RNA Total RNA Isolation Kit，FivePrime-Three Prime，Inc.；mir VanaTM试剂盒，Ambion、Inc.)提取RNA。可替换地，可以改编用于提取哺乳动物胞内RNA或病毒RNA的RNA提取方法，按照发表的方法或者经过修改，用于从血浆或血清提取RNA。可以使用二氧化硅颗粒、玻璃珠或硅藻(diatom)从血浆或血清提取RNA，如美国公开No.2008/0057502中所述的方法或其改编形式。
II.肺病的miRNA标志物
本发明的某些实施方案提供血清或血浆miRNA作为肺病的标志物。在一些实施方案中，使用肺病患者的血清和/或血浆中以上升水平存在的miRNA作为标志物。在其它实施方案中，使用水平下降的miRNA作为标志物。在一些实施方案中，使用来自血清或血浆的多于一个miRNA作为标志物。当使用多于一个miRNA生物标志物时，miRNA可全部具有上升的水平，全部具有下降的水平，或者可以使用水平上升和下降的miRNA的混合物。
术语“下降水平”或“上升水平”指患者血清或血浆样本中miRNA的量与未患有测试患者所患肺病的群体的血清或血浆中miRNA的量相比较。例如，肺癌患者血清中水平下降的miRNA在肺癌患者中存在的量低于未患肺癌供体(例如有良性肿瘤的患者或正常患者)的血清中的量。对于某些miRNA，患者血清或血浆样本中水平的上升表明肺病的存在或预后。其它miRNA以下降的水平存在于肺病患者中。
肺病包括癌症和良性病症。肺癌指肺部的恶性肿瘤，并且可以分为小细胞或非小细胞肺癌。在一些实施方案中，非小细胞肺癌可以进一步表征为腺癌、鳞状细胞癌(SCC)和大细胞癌。此外，可以根据X-射线或CT扫描结果、侵略性、病理学和非miRNA生物标志物的检测，以及本领域已知的其它方法将癌症分类。在某些方面，通过TNM原理(T-原发肿瘤、N-局部淋巴结、M-远端转移)和/或0、IA、IB、IIA、IIB、IIIA、IIIB或IV期将肺癌分类(参见，例如，Lababede等，Chest、115：233-235(1999))。在一些实施方案中，本文所述方法可以用于以至少75、80、85、90、91、92、93、94、95、96、97、98或99％灵敏度表征患者中的肺病。灵敏度的程度指示阳性表征为患有疾病的患病患者的百分比。在其它实施方案中，所述方法具有至少75、80、85、90、91、92、93、94、95、96、97、98或99％的特异性(例如，正确表征的非患病患者的百分比)。可以调整测定参数以同时优化灵敏度和特异性。
在一些实例中，将miRNA标志物的水平与对照相比较以确定水平是否下降或上升。对照可以是外部对照，如来自已知没有肺病的受试者的血清或血浆样本中的miRNA。外部对照可以是来自正常(非患病)受试者或者患有良性肺病的患者的样本。在其它情况中，外部对照可以是来自非血清样本如组织样本的miRNA或已知量的合成RNA。外部对照可以是汇集的、平均或个体样本；可以与测量的miRNA相同或不同。内部对照是来自与测试样本相同的血浆或血清样本的标志物，如miRNA对照。参见，例如，美国公开No.US2009/0075258，其通过提述全文并入本文。
表1列出了肺病患者血清中水平上升或下降的miRNA。可以根据本发明使用这些miRNA。一些miRNA可用于表征肺癌，包括区别癌症类型和/或区分癌症与良性肺病。此外，一些miRNA可以用于预测肺癌的侵略性或结果。
表1.肺癌患者血清中水平上升或下降的miRNA。水平为肺癌患者中miRNA与良性肿瘤或损伤患者相比较的结果。
  miRNA   水平   miRNA   水平   miRNA   水平
  let-7a   下降   miR-181a   上升   miR-30b   下降
  let-7b   下降   miR-181b   上升   miR-30c   下降
  let-7c   下降   miR-181d   上升   miR-30d   上升
  let-7d   下降   miR-185   下降   miR-30e-3p   下降
  let-7e   下降   miR-186   上升   miR-30e-5p   下降
  let-7f   下降   miR-18a   下降   miR-320   上升
  let-7g   下降   miR-190   下降   miR-324-3p   上升
  let-7i   下降   miR-191   上升   miR-324-5p   上升
  miR-100   下降   miR-192   下降   miR-328   上升
  miR-101   下降   miR-193b   上升   miR-335   上升
  miR-103   上升   miR-194   上升   miR-339   下降
  miR-106a   下降   miR-195   下降   miR-340   下降
  miR-106b   下降   miR-196b   下降   miR-342   上升
  miR-10a   下降   miR-197   上升   miR-345   上升
  miR-10b   下降   miR-199a＊   下降   miR-346   下降
  miR-125a   上升   miR-19a   下降   miR-361   上升
  miR-126   下降   miR-19b   上升   miR-365   上升
  miR-126＊   下降   miR-202   上升   miR-374a   下降
  miR-130a   下降   miR-204   上升   miR-375   上升
  miR-130b   上升   miR-205   下降   miR-378   上升
  miR-132   上升   miR-206   下降   miR-382   上升
  miR-133a   上升   miR-20a   下降   miR-422a   上升
  miR-133b   下降   miR-20b   上升   miR-423   上升
  miR-134   上升   miR-21   下降   miR-432   下降
  miR-139   下降   miR-210   上升   miR-433   上升
  miR-140   下降   miR-214   下降   miR-483   上升
  miR-142-3p   下降   miR-22   上升   miR-485-3p   下降
  miR-142-5p   下降   miR-221   上升   miR-486-5p   上升
  miR-143   下降   miR-222   上升   miR-496   下降
  miR-145   上升   miR-223   上升   miR-497   下降
 miRNA   水平   miRNA   水平   miRNA   水平
 miR-146a   上升   miR-23a   上升   miR-501   上升
 miR-146b   下降   miR-24   上升   miR-502   上升
 miR-148a   下降   miR-25   上升   miR-505   上升
 miR-150   上升   miR-26a   下降   miR-518b   上升
 miR-151   上升   miR-26b   下降   miR-525   下降
 miR-152   下降   miR-27a   下降   miR-566   上升
 miR-155   上升   miR-27b   下降   miR-584   上升
 miR-15a   下降   miR-296   上升   miR-605   上升
 miR-15b   下降   miR-29a   下降   miR-638   下降
 miR-16   下降   miR-29c   下降   miR-660   下降
 miR-17-5p   上升   miR-301   上升   miR-92   上升
  miR-30a-5p   上升   miR-93   上升
  miR-98   下降   miR-99a   上升
在某些实施方案中，使用一种血清miRNA检测、诊断、表征或监测肺病和/或肺癌。在其它实施方案中，使用多于一种miRNA作为标志物。在其它实施方案中，使用两种或多种miRNA表征肺病。在某些实施方案中，在本发明的方法中检测至少2、3、4、5、6、7、8、9或10种miRNA。在某些实施方案中，使用肺病患者血清或血浆中水平下降的miRNA作为生物标志物。在其它实施方案中，可以使用血清或血浆中水平上升的miRNA作为生物标志物。在某些实施方案中，患者有肺部肿瘤或损伤。在其它实施方案中，患者先前经过肺病的筛选。
在一些实施方案中，用于诊断肺癌的miRNA选自miR-375、miR-499、miR-22、miR-122a、miR-206、miR-103、miR-24、miR-26a、miR-498、miR-205、miR-222和let-7c。
在某些实施方案中，miRNA选自let-7a、let-7b、let-7c、let-7d、let-7e、let-7f、let-7g、miR-106a、miR-106b、miR-125a、miR-126、miR-130b、miR-132、miR-133a、miR-133b、miR-140、miR-142-3p、miR-143、miR-146a、miR-150、miR-151、miR-155、miR-15a、miR-15b、miR-16、miR-181a、miR-181b、miR-181d、miR-186、miR-18a、miR-190、miR-191、miR-195、miR-197、miR-19b、miR-202、miR-206、miR-20a、miR-210、miR-214、miR-22、miR-221、miR-222、miR-223、miR-23a、miR-24、miR-25、miR-26a、miR-26b、miR-27b、miR-30a-5p、miR-30b、miR-30c、miR-30d、miR-30e-3p、miR-320、miR-324-3p、miR-324-5p、miR-335、miR-342、miR-345、miR-346、miR-361、miR-365、miR-374、miR-378、miR-382、miR-422a、miR-432、miR-485-3p、miR-486、miR-496、miR-502、miR-584、miR-638、miR-660、miR-92和miR-93。
在其它实施方案中，miRNA选自let-7f、let-7g、let-7i、miR-106b、miR-126、miR-126*、miR-140、miR-142-3p、miR-142-5p、miR-143、miR-145、miR-150、miR-15a、miR-15b、miR-181a、miR-181b、miR-181d、miR-202、miR-214、miR-27a、miR-27b、miR-30e-5p、miR-320、miR-324-3p、miR-340、miR-342、miR-345、miR-374、miR-378、miR-422a、miR-486、miR-518b和miR-92。
在其它实施方案中，至少一种miRNA选自let-7b、let-7c、let-7d、let-7e、miR-10a、miR-10b、miR-130b、miR-132、miR-133b、miR-139、miR-143、miR-152、miR-155、miR-15b、miR-17-5p、miR-193、miR-194、miR-195、miR-196b、miR-199a*、miR-19b、miR-202、miR-204、miR-205、miR-206、miR-20b、miR-21、miR-210、miR-214、miR-221、miR-27a、miR-27b、miR-296、miR-29a、miR-301、miR-324-3p、miR-324-5p、miR-339、miR-346、miR-365、miR-378、miR-422a、miR-432、miR-485-3p、miR-496、miR-497、miR-505、miR-518b、miR-525、miR-566、miR-605、miR-638、miR-660和miR-93。
在其它实施方案中，miRNA选自miR-106a、miR-106b、miR-126*、miR-142-3p、miR-15b、miR-181c、miR-182、miR-26b、miR-30b、miR-30e-5p、miR-422b、let-7i和let-7g。
在进一步的实施方案中，miRNA选自miR-24、miR-92、miR-142-3p、miR-142-5p、miR-181d、miR-27a、miR-27b、miR-422a、miR-29b、miR-15a、miR-106b、miR-126、miR-140和miR-202。在一些实施方案中，可以使用这些miR中的2、3、4、5、6、7或8个区别肺癌患者与良性肺部肿瘤或损伤患者。在其它实施方案中，2、3、4、5、6、7或8个miRNA选自miR-24、miR-92、miR-142-3p、miR-142-5p、miR-181d、miR-27a、miR-27b和miR-422a。
在某些实施方案中，表征肺癌相对于非癌症样本的miRNA选自miR-15b、miR-182、miR-15a、miR-30b、miR-26b、miR-106b、let-7g、miR-142-3p、miR-301、miR-181c、miR-126、miR-346、miR-422b和miR-92。非癌样本包括来自有良性肺部肿瘤或损伤的受试者或来自正常受试者的样本。
某些实施方案包括用于表征患者中的肺病和/或肺癌的方法，所述方法包括测量血清样本中miRNA水平，其中miRNA选自let-7b、let-7c、let-7d、let-7e、miR-10a、miR-10b、miR-130b、miR-132、miR-133b、miR-139、miR-143、miR-152、miR-155、miR-15b、miR-17-5p、miR-193、miR-194、miR-195、miR-196b、miR-199a*、miR-19b、miR-202、miR-204、miR-205、miR-206、miR-20b、miR-21、miR-210、miR-214、miR-221、miR-27a、miR-27b、miR-296、miR-29a、miR-301、miR-324-3p、miR-324-5p、miR-339、miR-346、miR-365、miR-378、miR-422a、miR-432、miR-485-3p、miR-496、miR-497、miR-505、miR-518b、miR-525、miR-566、miR-605、miR-638、miR-660和miR-93；并确定所述样本中miRNA的下降或上升水平，从而表征肺病或肺癌的步骤。
表2列出了在肺病患者血浆中水平上升或下降的miRNA。可以根据本发明使用这些miRNA。
表2.在肺病患者血浆中水平上升或下降的miRNA。水平为肺癌患者中的miRNA与无肺癌患者相比较的结果。
  miRNA   水平   miRNA   水平
  let-7c   上升   let-7a   下降
  miR-100   上升   let-7d   下降
  miR-10a   上升   let-7e   下降
  miR-10b   上升   let-7g   下降
  miR-122a   上升   let-7i   下降
  miR-125b   上升   miR-1   下降
  miR-129   上升   miR-103   下降
  miR-148a   上升   miR-106a   下降
  miR-150   上升   miR-125a   下降
  miR-17-5p   上升   miR-130a   下降
  miR-183   上升   miR-130b   下降
  miR-18a*   上升   miR-133a   下降
  miR-18b   上升   miR-145   下降
  miR-190   上升   miR-148b   下降
  miR-192   上升   miR-15a   下降
  miR-193a   上升   miR-15b   下降
  miR-196b   上升   miR-17-3p   下降
  miR-197   上升   miR-181d   下降
  miR-19a   上升   miR-18a   下降
  miR-19b   上升   miR-196a   下降
  miR-200c   上升   miR-198   下降
  miR-203   上升   miR-199a   下降
  miR-206   上升   miR-199a*   下降
  miR-20b   上升   miR-212   下降
  miRNA   水平   miRNA   水平
  miR-210   上升   miR-22   下降
  miR-214   上升   miR-221   下降
  miR-218   上升   miR-23a   下降
  miR-296   上升   miR-23b   下降
  miR-30a-3p   上升   miR-26a   下降
  miR-31   上升   miR-27a   下降
  miR-346   上升   miR-27b   下降
  miR-34c   上升   miR-29b   下降
  miR-375   上升   miR-30b   下降
  miR-383   上升   miR-30d   下降
  miR-422a   上升   miR-30e-3p   下降
  miR-429   上升   miR-320   下降
  miR-448   上升   miR-323   下降
  miR-449   上升   miR-326   下降
  miR-452   上升   miR-331   下降
  miR-483   上升   miR-335   下降
  miR-486   上升   miR-339   下降
  miR-489   上升   miR-374   下降
  miR-497   上升   miR-377   下降
  miR-500   上升   miR-379   下降
  miR-501   上升   miR-410   下降
  miR-507   上升   miR-423   下降
  miR-511   上升   miR-433   下降
  miR-514   上升   miR-485-3p   下降
  miR-516-3p   上升   miR-485-5p   下降
  miR-520d   上升   miR-487b   下降
  miR-527   上升   miR-490   下降
  miR-7   上升   miR-491   下降
  miR-92   上升   miR-493   下降
  miR-93   上升   miR-493-3p   下降
  miR-99a   上升   miR-494   下降
  miR-496   下降
  miR-502   下降
  miR-505   下降
  miR-519d   下降
  miR-539   下降
  miR-542-3p   下降
  miR-98   下降
在一些实施方案中，可以使用单个血浆miRNA表征肺癌。在其它实施方案中，可以使用来自表2的miRNA之一表征肺癌，其可以单独或与一种或多种其它miRNA标志物组合使用。
在某些实施方案中，所述方法可以区分肺癌与良性肺病。在一些实例中，与良性病症或无病患者相比，肺癌患者的血清或血浆中至少一种测量的miRNA上升。在一些实例中，至少一种测量的miRNA下降。在某些实施方案中，至少一种测量的miRNA上升并且至少一种miRNA下降。在其它实施方案中，测量至少两种上升的miRNA或至少两种下降的miRNA。
在某些实施方案中，下述miRNA之一与至少一种其它miRNA生物标志物组合使用以确定患者是否患有肺癌：let-7a、let-7b、let-7d、let-7f、let-7g、let-7i、miR-101、miR-106a、miR-106b、miR-125a、miR-126、miR-126*、miR-130b、miR-132、miR-133b、miR-140、miR-142-3p、miR-142-5p、miR-145、miR-146a、miR-146b、miR-148b、miR-150、miR-151、miR-15a、miR-15b、miR-181a、miR-181b、miR-181d、miR-185、miR-186、miR-190、miR-191、miR-193a、miR-199a*、miR-202、miR-210、miR-214、miR-222、miR-23a、miR-24、miR-26a、miR-26b、miR-27a、miR-27b、miR-29b、miR-301、miR-30a-5p、miR-30b、miR-30c、miR-30d、miR-30e-5p、miR-320、miR-324-3p、miR-326、miR-335、miR-340、miR-342、miR-345、miR-346、miR-34a、miR-374、miR-375、miR-378、miR-422a、miR-422b、miR-425、miR-486、miR-496、miR-518b、miR-660、miR-7、miR-92、miR-93、miR-98、miR-99a或miR-99b。
在其它实施方案中，下述miRNA之一与至少一种其它miRNA生物标志物组合使用，以确定患者是否患有肺癌或区分肺癌与良性肺病：miR-422a、miR-29b、miR-92、miR-142-5p、miR-142-3p、miR-181d、miR-27b、miR-378、miR-27a、miR-30e-5p、miR-181a、miR-126、miR-342、miR-140、miR-15a、miR-324-3p、miR-374、miR-486、miR-518b、miR-106b、miR-145、miR-150、miR-191、miR-345、miR-126*、miR-148b、miR-214、miR-320、let-7g、let-7i、miR-146a、miR-15b、miR-185、miR-186、miR-23a、miR-24、miR-30a-5p、miR-340、miR-34a、miR-101、miR-132、miR-181b、miR-199a*、miR-202、miR-222、miR-422b、miR-660、miR-7或miR-93。
在其它实施方案中，下述miRNA之一与至少一种其它miRNA生物标志物组合使用，以确定患者是否患有肺癌：let-7g、miR-106b、miR-126、miR-126*、miR-132、miR-140、miR-142-3p、miR-146a、miR-150、miR-15a、miR-15b、miR-181a、miR-181b、miR-181d、miR-214、miR-24、miR-30a-5p、miR-320、miR-342、miR-345、miR-374、miR-422a、miR-422b、miR-486或miR-92。
本发明的一些实施方案涉及扩增并测量来自血清的至少一对miRNA。表3包括可以用于表征肺病的对。这些对可以与其它肺病生物标志物组合使用。
表3.在血清样本中测量的miRNA对。
Figure BDA0000157615080000141
Figure BDA0000157615080000151
Figure BDA0000157615080000161
在某些实施方案中，miRNA对选自miR-202和miR-29b；miR-142-5p和miR-422a；miR-24和miR-27a；miR-27b和miR-422a；miR-140和miR-422a；miR-185和miR-93；miR-126和miR-181d；miR-142-3p和miR-422a；miR-30e-5p和miR-345；miR-29b和miR-422a；miR-324-5p和miR-422a；miR-374和miR-422a；miR-140和miR-345；miR-23a和miR-27a；miR-29b和miR-378；miR-30e-5p和miR-422a；miR-30e-5p和miR-92；miR-660和miR-92；miR-106b和miR-422a；let-7g和miR-422a；miR-101和miR-92；miR-126和miR-92；miR-126*和miR-422a；miR-126*和miR-92；miR-150和miR-29a；miR-15a和miR-92；miR-30e-5p和miR-324-3p；miR-126和miR-378；miR-126和miR-422a；miR-132和miR-29b；miR-142-3p和miR-181a；miR-142-3p和miR-378；miR-148b和miR-92；miR-181b和miR-29b；miR-26a和miR-422a；miR-15a和miR-422a；miR-146a和miR-27b；miR-148b和miR-422a；let-7i和miR-422a；miR-340和miR-422a；miR-143和miR-150；miR-15a和miR-378；miR-15b和miR-422a；miR-27b和miR-92；miR-30e-3p和miR-422a；miR-30b和miR-422a；miR-142-3p和miR-92；miR-27a和miR-422a；miR-142-5p和miR-342；miR-142-5p和miR-223；miR-27b和miR-378；miR-186和miR-27a；miR-106b和miR-324-3p；miR-34a和miR-518b；miR-27a和miR-92；miR-30a-3p和miR-422a；miR-181d和miR-29b；miR-15b和miR-191；miR-192和miR-422a；miR-422a和miR-576；miR-30c和miR-422a；miR-142-3p和miR-145；miR-142-3p和miR-181d；miR-181d和miR-27b；miR-142-5p和miR-186；miR-150和miR-29c；miR-200c和miR-422a；miR-185和miR-92；miR-148a和miR-422a；miR-34a和miR-422a；miR-32和miR-422a；miR-214和miR-566；miR-206和miR-422a；miR-214和miR-518b；miR-142-3p和miR-320；miR-331和miR-422a；miR-26b和miR-422a；miR-142-5p和miR-345；miR-27b和miR-324-3p；miR-30a-5p和miR-30e-5p；miR-29b和miR-92；miR-191和miR-27a；miR-140和miR-181d；miR-422a和miR-660；miR-126和miR-181a；miR-126*和miR-378；miR-15a和miR-181d；let-7f和miR-422a；miR-181a和miR-27b；miR-29b和miR-324-3p；miR-132和miR-30e-5p；miR-214和miR-422b；miR-140和miR-378；miR-29b和miR-30a-5p；let-7a和miR-422a；miR-142-5p和miR-191；miR-24和miR-27b；miR-126*和miR-181d；miR-181d和miR-30e-5p；miR-142-3p和miR-191；miR-181c和miR-29b；miR-181d和miR-27a；miR-148b和miR-378；miR-15a和miR-320；miR-199a*和miR-422a；miR-146a和miR-27a；miR-142-5p和miR-181a；miR-15a和miR-486；miR-27b和miR-342；miR-181a和miR-27a；let-7g和miR-342；miR-29b和miR-345；let-7e和miR-422a；miR-29b和miR-422b；miR-142-3p和miR-202；miR-214和miR-422a；miR-142-5p和miR-145；miR-422a和miR-497；miR-29b和miR-433；miR-140和miR-92；miR-142-5p和miR-92；miR-142-3p和miR-181b；miR-30e-5p和miR-486；miR-196b和miR-422a；miR-222和miR-29b；miR-142-3p和miR-518b；miR-29b和miR-30d；miR-29b和miR-361；miR-342和miR-34a；miR-106b和miR-181d；miR-340和miR-92；miR-486和miR-7；miR-21和miR-422a；miR-106b和miR-92；let-7i和miR-92；miR-101和miR-486；miR-181a和miR-29b；miR-142-5p和miR-150；miR-142-3p和miR-342；miR-29b和miR-518b；miR-142-5p和miR-181d；miR-193b和miR-29b；miR-146b和miR-422a；miR-15b和miR-92；miR-142-5p和miR-23a；miR-27a和miR-378；miR-197和miR-29b；miR-342和miR-374；miR-422a和miR-487b；miR-142-3p和miR-99b；miR-29b和miR-320；miR-340和miR-378；miR-29b和miR-486；miR-23a和miR-422a；miR-222和miR-27b；miR-142-5p和miR-24；miR-148b和miR-181d；miR-29b和miR-342；miR-152和miR-422a；miR-7和miR-92；miR-210和miR-422a；let-7c和miR-422a；miR-27b和miR-518b；miR-145和miR-374；miR-27a和miR-324-3p；miR-140和miR-186；miR-185和miR-486；miR-422a和miR-496；miR-181a和miR-199a*；miR-422a和miR-432；miR-181d和miR-23b；miR-125b和miR-422a；miR-145和miR-29b；miR-142-5p和miR-146a；miR-126和miR-320；miR-191和miR-374；miR-126和miR-145；miR-150和miR-29b；miR-133b和miR-422a；miR-142-5p和miR-324-3p；miR-27b和miR-345；miR-374和miR-378；let-7b和miR-422a；miR-346和miR-432*；miR-142-5p和miR-518b；miR-142-3p和miR-328；miR-181a和miR-374；let-7g和miR-181d；miR-106b和miR-378；miR-30a-5p和miR-422a；miR-339和miR-422a；let-7i和miR-378；miR-142-5p和miR-93；和miR-224和miR-422a。
在某些实施方案中，miRNA对选自let-7a和miR-181a；let-7a和miR-181d；let-7b和miR-150；let-7b和miR-181d；let-7b和miR-92；let-7c和miR-150；let-7c和miR-181d；let-7c和miR-92；let-7e和miR-378；let-7f和miR-181a；let-7f和miR-181d；let-7f和miR-342；let-7f和miR-92；let-7g和miR-150；let-7g和miR-181a；let-7g和miR-181d；let-7g和miR-342；let-7g和miR-92；let-7i和miR-486；let-7i和miR-92；miR-106b和miR-150；miR-106b和miR-181d；miR-106b和miR-92；miR-125a和miR-142-3p；miR-125a和miR-374；miR-126*和miR-181d；miR-126*和miR-30a-5p；miR-126*和miR-92；miR-126和miR-146a；miR-126和miR-150；miR-126和miR-181a；miR-126和miR-181d；miR-126和miR-342；miR-126和miR-92；miR-130b和miR-142-3p；miR-132和miR-142-3p；miR-132和miR-214；miR-140和miR-150；miR-140和miR-30a-5p；miR-140和miR-345；miR-140和miR-92；miR-142-3p和miR-146a；miR-142-3p和miR-150；miR-142-3p和miR-151；miR-142-3p和miR-181a；miR-142-3p和miR-181b；miR-142-3p和miR-181d；miR-142-3p和miR-186；miR-142-3p和miR-210；miR-142-3p和miR-22；miR-142-3p和miR-23a；miR-142-3p和miR-24；miR-142-3p和miR-30a-5p；miR-142-3p和miR-342；miR-142-3p和miR-345；miR-142-3p和miR-425；miR-142-3p和miR-486；miR-142-3p和miR-92；miR-142-3p和miR-99b；miR-142-5p和miR-30a-5p；miR-143和miR-223；miR-143和miR-486；miR-150和miR-15b；miR-150和miR-214；miR-150和miR-29b；miR-150和miR-374；miR-150和miR-576；miR-15a和miR-181a；miR-15a和miR-181b；miR-15a和miR-181d；miR-15a和miR-210；miR-15a和miR-30a-5p；miR-15a和miR-342；miR-15a和miR-345；miR-15a和miR-486；miR-15a和miR-92；miR-15b和miR-17-5p；miR-15b和miR-181a；miR-15b和miR-181d；miR-15b和miR-24；miR-15b和miR-342；miR-15b和miR-92；miR-16和miR-486；miR-16和miR-92；miR-181a和miR-214；miR-181a和miR-26a；miR-181a和miR-26b；miR-181a和miR-30b；miR-181a和miR-30c；miR-181a和miR-374；miR-181a和miR-98；miR-181b和miR-214；miR-181b和miR-374；miR-181d和miR-214；miR-181d和miR-26b；miR-181d和miR-30b；miR-181d和miR-30c；miR-181d和miR-374；miR-181d和miR-432；miR-181d和miR-496；miR-181d和miR-638；miR-181d和miR-98；miR-193a和miR-422a；miR-195和miR-486；miR-199a*和miR-92；miR-20a和miR-92；miR-214和miR-342；miR-214和miR-422b；miR-214和miR-92；miR-24和miR-374；miR-26a和miR-342；miR-26a和miR-92；miR-26b和miR-342；miR-26b和miR-92；miR-27a和miR-30a-5p；miR-27b和miR-30d；miR-29b和miR-30a-5p；miR-30b和miR-342；miR-30b和miR-92；miR-30c和miR-342；miR-30c和miR-92；miR-320和miR-98；miR-342和miR-374；miR-346和miR-422a；miR-346和miR-518b；miR-346和miR-566；miR-374和miR-92；miR-422a和miR-496；miR-422a和miR-638；miR-422a和miR-98；miR-432和miR-92；miR-496和miR-92；和miR-7和miR-92。
在其它实施方案中，miRNA对选自miR-142-5p和miR181d；miR-142-3p和miR181d；miR-142-3p和miR-422a；miR-142-5p和miR-422a；miR-92和miR-27b；和miR-24和miR-27a。在其它实施方案中，miRNAs对选自miR-106a和miR-422b；miR-126*和miR-26b；miR-106a和miR-26b；miR-15b和miR-30a-5p；let-7a和miR-26b；let-7g和miR-106a；miR-126*和miR-15b；miR-126*和miR-30b；和miR-106a和miR-106b。
在一些实施方案中，在血清样本中测量所述对。任选地，测量一个或多个其它miRNA。
在其它实施方案中，可以使用某些miRNA对表征女性或男性患者中的肺病(表4)。在某些实施方案中，所述方法检测性别特异性的miRNA生物标志物。
表4：用于表征女性或男性患者中的肺病的miRNA对
  miRNA生物标志物对(女性)   miRNA生物标志物对(男性)
  miR-15a，miR-422a   miR-185，miR-93
  miR-181d，miR-27b   miR-30e-5p，miR-433
  miR-27b，miR-422a   miR-126，miR-378
  miR-15b，miR-191   miR-342，miR-497
  miR-181d，miR-29b   let-7f，miR-342
  miR-142-3p，miR-422a   miR-142-5p，miR-422a
  miR-23a，miR-27a   miR-145，miR-200c
  miR-222，miR-27a   miR-148a，miR-19b
  miR-126，miR-422a   miR-191，miR-340
  miRNA生物标志物对(女性)   miRNA生物标志物对(男性)
  miR-142-5p，miR-145   miR-200b，miR-422a
  miR-142-3p，miR-145   miR-340，miR-378
  miR-143，miR-223
  miR-324-5p，miR-422a
  miR-30e-5p，miR-422a
  miR-27a，miR-422a
  miR-126*，miR-222
  miR-140，miR-422a
  miR-101，miR-92
  miR-202，miR-29b
  miR-29b，miR-422a
  miR-30e-5p，miR-324-3p
  miR-181b，miR-29b
  miR-142-5p，miR-181a
  miR-126*，miR-422a
  miR-195，miR-93
  miR-140，miR-222
  miR-126，miR-181d
  miR-142-5p，miR-422a
  miR-24，miR-27a
  miR-27a，miR-361
  miR-346，miR-518b
  miR-222，miR-27b
  miR-15b，miR-181a
  miR-142-5p，miR-191
  miR-433，miR-487b
  miR-29b，miR-518b
  miR-106b，miR-422a
  miR-21，miR-422a
  miR-15b，miR-422a
  miR-181a，miR-27a
  miR-142-5p，miR-345
  miR-32，miR-422a
  miR-30e-5p，miR-92
  miR-148b，miR-422a
  miR-192，miR-422a
  let-7i，miR-422a
  miR-19b，miR-486
  miR-15a，miR-181d
  miR-142-3p，miR-26a
  miRNA生物标志物对(女性)   miRNA生物标志物对(男性)
  miR-142-3p，miR-181a
  miR-29b，miR-378
  miR-15a，miR-181b
  miR-142-3p，miR-342
  miR-195，miR-20b
  miR-145，miR-27a
  miR-374，miR-422a
  miR-27b，miR-361
  miR-142-3p，miR-518b
  miR-140，miR-181d
  miR-27b，miR-326
  miR-139，miR-422a
  let-7g，miR-422a
  miR-140，miR-345
  miR-148b，miR-326
  miR-20a，miR-92
  miR-133b，miR-181b
  miR-132，miR-30e-5p
  miR-19b，miR-92
  miR-181a，miR-30c
  miR-197，miR-422a
  miR-142-5p，miR-222
  miR-148a，miR-422a
  let-7g，miR-181d
  miR-197，miR-29b
  miR-331，miR-422a
  miR-15a，miR-181a
  miR-339，miR-422a
  miR-181b，miR-215
  miR-145，miR-374
  miR-206，miR-518b
  miR-106b，miR-486
  miR-126*，miR-181a
  miR-422a，miR-576
  miR-17-5p，miR-422a
  miR-106b，miR-345
  miR-126，miR-342
  miR-139，miR-181d
  miR-140，miR-30a-5p
  miR-142-3p，miR-26b
  miRNA生物标志物对(女性)   miRNA生物标志物对(男性)
  miR-142-3p，miR-361
  miR-19a，miR-92
  miR-222，miR-422a
  miR-296，miR-422a
  miR-29b，miR-382
本发明的一些实施方案涉及扩增并测量来自血浆的两种或多种miRNA。下述miRNA血浆生物标志物中的一种可以与至少一种其它miRNA组合使用：miR-10b、miR-192、miR-206、miR-101、miR-205、miR-16、miR-151、miR-137、miR-215、miR-181a、miR-218、miR-126*、miR-125b、miR-326、miR-100、miR-31、miR-197、miR-222、miR-191、miR-200c、miR-186、miR-145、miR-155、miR-29c、let-7c、miR-181c、miR-125a、miR-134、miR-181d、let-7b、miR-127、miR-146a、miR-139、miR-152、miR-190、miR-30e-5p、miR-106b、miR-10a、miR-132、miR-148a、miR-213、miR-29a、miR-375、miR-133b、miR-15a、miR-107、miR-148b、miR-19a、miR-106a、miR-130a、miR-17-3p、miR-18a*、miR-195、miR-20b、miR-301、miR-339、miR-410、miR-188、miR-193a、let-7g、let-7i、miR-140、miR-181b、miR-25、miR-328、miR-133a、miR-150、miR-17-5p、miR-21、miR-214、miR-370、miR-383、miR-130b、miR-199a、miR-212、miR-221、miR-27b、miR-30e-3p、miR-338、miR-361、miR-141、miR-142-5p、miR-30a-3p、miR-30a-5p、miR-451、miR-142-3p、miR-146b、miR-15b、miR-18a、miR-210、miR-296、miR-323、miR-362、let-7a、miR-196b、miR-223、miR-29b、miR-324-5p、miR-376a、miR-379、miR-491、let-7d、miR-126、miR-182、miR-185、miR-204、miR-23a、miR-27a、miR-324-3p、miR-342、miR-34c、miR-382、miR-425、miR-432*、miR-103、miR-193b、miR-196a、miR-199a*、miR-199b、miR-28、miR-30d、miR-330、miR-423、miR-433、miR-485-5p、miR-20a、miR-23b、miR-26a、miR-30b、miR-30c、miR-320、miR-345、miR-422b、miR-335、miR-365、miR-486、miR-24、miR-26b、miR-331、miR-340、miR-34a、miR-374、miR-452、miR-483、miR-512-5p、let-7e、miR-32、miR-422a、miR-424、miR-432、miR-485-3p、miR-487b、miR-496、miR-505、miR-7、miR-202、miR-369-3p、miR-495、miR-502、miR-511、miR-516-3p、miR-517c、miR-92、miR-93、miR-99a或miR-99b。
表5包括来自血浆样本的可用于表征肺癌的miRNA对。任选地，测量一种或多种其它miRNA。
表5.在血浆样本中测量的miRNA对
Figure BDA0000157615080000231
可在本发明的方法中使用的其它miRNA和miRNA组由本文所述实施例显而易见。
III.测量miRNA水平的方法
涵盖很多测量miRNA水平或量的方法。可以使用任何可靠、灵敏并特异性的方法。在一些实施方案中，在测量前扩增miRNA。在其它实施方案中，在扩增过程中测量miRNA的水平。在其它方法中，测量前不扩增miRNA。
A.扩增反应
存在很多方法扩增miRNA核苷酸序列如成熟miRNA、前体miRNA和初级miRNA。合适的核酸聚合和扩增技术包括反转录(RT)、聚合酶链式反应(PCR)、实时PCR(定量PCR(q-PCR))、基于核酸序列的扩增(NASBA)、连接酶链式反应、多重可连接探针扩增、侵染技术(Third Wave)、滚环扩增、体外转录(IVT)、链置换扩增、转录介导的扩增(TMA)、RNA(Eberwine)扩增和本领域技术人员已知的其它方法。在某些实施方案中，使用多于一种扩增方法，如反转录之后进行实时定量PCR(qRT-PCR)(Chen等，Nucleic Acids Research，33(20)：e179(2005))。
典型的PCR反应包括多个扩增步骤，或者循环，其选择性扩增靶核酸：变性步骤，其中将靶核酸变性；退火步骤，其中将一组PCR引物(正向和反向引物)与互补DNA链退火；和延伸步骤，其中热稳定的DNA聚合酶将引物延伸。通过多次重复这些步骤，扩增DNA片段而产生扩增子，与靶DNA序列相对应。典型的PCR反应包括变性、退火和延伸的20或更多个循环。在很多情况下，退火和延伸步骤可以同时进行，此时循环仅包含两个步骤。因为成熟miRNA是单链，所以可以在PCR反应前进行反转录反应(产生互补cDNA序列)。反转录反应包括使用，例如，基于RNA的DNA聚合酶(反转录酶)和引物。
在PCR和q-PCR方法中，例如，对每个靶序列使用一组引物。在某些实施方案中，引物的长度依赖于很多因素，包括，但不限于，引物之间理想的杂交温度、靶核酸序列和待扩增的不同靶核酸序列的复杂程度。在某些实施方案中，引物长约15-约35个核苷酸。在其它实施方案中，引物的长度等于或小于15、20、25、30或35个核苷酸。在其它实施方案中，引物至少长35个核苷酸。
在进一步的方面，正向引物可以包含至少一个与miRNA生物标记物退火的序列，并且可替换地可以包含额外的5’非互补区。在另一个方面，可以设计反向引物使其与反转录miRNA的互补序列退火。反向引物可以独立于miRNA生物标志物序列，并且可以使用相同的反向引物扩增多个miRNA生物标志物。可替换地，反向引物可以对miRNA生物标志物具有特异性。
在一些实施方案中，在一个反应体积中扩增两个或多个miRNA。一个方面包括多重q-PCR，如qRT-PCR，其可以通过使用多于一对引物和/或多于一个探针，同时扩增并定量一个反应体积中的至少两个目的miRNA。引物对包含至少一个独特结合各miRNA的扩增引物，并且标记探针使它们可以彼此区分，从而同时定量多个miRNA。多重qRT-PCR具有研究和诊断用途，包括但不限于检测miRNA以进行诊断、预后和治疗应用。
可以通过同时包括反转录酶和基于DNA的热稳定DNA聚合酶而将qRT-PCR反应进一步与反转录反应组合。当使用两种聚合酶时，可以使用“热启动”方法使测定法性能最大化(美国专利No.5,411,876和5,985,619)。例如，反转录酶反应和PCR反应的成分可以使用一种或多种热激活方法或化学改变分隔以改进聚合效率(美国专利No 5,550,044、5,413,924和6,403,341)。
B.miRNA的检测
在某些实施方案中，可以使用标记、染料或标记的探针和/或引物检测扩增或未扩增的miRNA。技术人员可以根据检测方法的灵敏度和靶的丰度识别哪种检测方法合适。依赖于检测方法的灵敏度和靶的丰度，在检测前可以或者可以不需要扩增。本领域的技术人员可以识别优选miRNA扩增的检测方法。
探针或引物可包括Watson-Crick碱基或修饰的碱基。修饰的碱基包括，但不限于，AEGIS碱基(来自Eragen Biosciences)，其已在例如，美国专利No5,432,272、5,965,364和6,001,983中描述。在某些实施方案中，碱基通过天然磷酸二酯键或不同的化学连接相结合。不同的化学连接包括，但不限于，肽键或锁核酸(LNA)连接，其已在例如美国专利No.7,060,809中描述。
在进一步的方面，扩增反应中存在的寡核苷酸探针或引物适合于监测产生的扩增产物的量作为时间的函数。在某些方面，使用具有相对于双链不同的单链性质的探针检测核酸。探针包括，但不限于，5’-外切核酸酶测定法(例如TaqManTM)探针(参见美国专利No.5,538,848)、茎环分子信标(参见，例如，美国专利No.6,103,476和5,925,517)、无茎或线性信标(参见，例如，WO9921881、美国专利No.6,485,901和6,649,349)、肽核酸(PNA)分子信标(参见，例如，美国专利No.6,355,421和6,593,091)、线性PNA信标(参见，例如美国专利No.6,329,144)、非-FRET探针(参见，例如，美国专利No.6,150,097)、SunriseTM/AmplifluorBTM探针(参见，例如，美国专利No.6,548,250)、茎环和双重ScorpionTM探针(参见，例如，美国专利No.6,589,743)、凸环探针(参见，例如，美国专利No.6,590,091)、伪结探针(参见，例如，美国专利No.6,548,250)、Cyclicons(参见，例如，美国专利No.6,383,752)、MGB EclipseTM探针(EpochBiosciences)、发夹探针(参见，例如，美国专利No.6,596,490)、PNA Light-up探针、拮抗引物淬灭探针(Li等，Clin.Chem.53：624-633(2006))、自组装纳米颗粒探针和例如在美国专利No.6,485,901中所述的二茂铁-修饰探针。
在某些实施方案中，扩增反应中的一个或多个引物包括标记。在进一步的实施方案中，不同的探针或引物包含彼此相区别的可检测标记。在一些实施方案中，可以用两种或多种可区分的标记来标记核酸，如探针或引物。
在一些方面，将标记附接于一个或多个探针，并且标记具有一种或多种下述性质：(i)提供可检测信号；(ii)与第二标记相互作用以修饰由第二标记，例如，FRET(荧光共振能量转移)提供的可检测信号；(iii)稳定杂交，例如，双链体的形成；和(iv)提供多个结合复合物或亲和组，例如，亲和性，抗体-抗原，离子复合物、半抗原-配体(例如，生物素-亲和素)。在其它方面，可以使用采用已知标记、连接、连接基团、试剂、反应条件和分析及纯化方法的大量已知技术中的任一种来实现标记的用途。
可以通过直接或间接方法检测miRNA。在直接检测方法中，通过与核酸分子连接的可检测标记检测一种或多种miRNA。在这种方法中，可以在结合探针前标记miRNA。因此，通过筛选与探针结合的标记miRNA而检测结合。探针任选地与反应体积中的珠连接。
在某些实施方案中，通过直接结合标记探针，然后检测探针而检测核酸。在本发明的一个实施方案中，使用与探针缀合的FlexMAP微球(Luminex)捕获所需的核酸从而检测核酸，如扩增的miRNA。一些方法可涉及用多核苷酸探针检测，所述探针用例如荧光标记或支链DNA(bDNA)修饰。
在其它实施方案中，通过间接检测方法检测核酸。例如，生物素化的探针可以与缀合链霉亲和素的染料组合以检测结合的核酸。链霉亲和素分子结合扩增miRNA上的生物素标记，并且通过检测附接于链霉亲和素分子的染料分子而检测结合的miRNA。在一个实施方案中，缀合链霉亲和素的染料分子包含
Figure BDA0000157615080000261
链霉亲和素R-藻红蛋白(PROzyme)。本领域技术人员已知其它缀合的染料分子。
标记包括，但不限于：产生或淬灭可检测荧光、化学发光或生物发光信号的光发射、光散射和光吸收化合物(参见，例如，Kricka，L.，Nonisotopic DNAProbe Techniques，Academic Press，San Diego(1992)和Garman A.，Non-Radioactive Labeling，Academic Press(1997))。可用作标记的荧光报告染料包括，但不限于，荧光素(参见，例如，美国专利No.5,188,934、6,008,379和6,020,481)，罗丹明(参见，例如，美国专利No.5,366,860、5,847,162、5,936,087、6,051,719和6,191,278)，苯并吩噁嗪(benzophenoxazine)(参见，例如，美国专利No.6,140,500)，能量-转移荧光染料，其包含供体和受体对(参见，例如，美国专利No.5,863,727、5,800,996和5,945,526)和青色素(cyanine)(参见，例如，WO 9745539)，丽丝胺，藻红蛋白，Cy2，Cy3，Cy3.5，Cy5，Cy5.5，Cy7，FluorX(Amersham)，Alexa 350，Alexa 430，AMCA，BODIPY630/650，BODIPY 650/665，BODIPY-FL，BODIPY-R6G，BODIPY-TMR，BODIPY-TRX，Cascade Blue，Cy3，Cy5，6-FAM，异硫氰酸(酯)荧光素，HEX，6-JOE，俄勒冈绿488，俄勒冈绿500，俄勒冈绿514，太平洋蓝，REG，罗丹明绿，罗丹明红，Renographin，ROX，SYPRO，TAMRA，四甲基罗丹明，和/或德克萨斯红，以及能产生可检测信号的任何其它荧光分子。荧光染料的实例包括，但不限于，6-羧基荧光素；2’，4’，1，4-四氯荧光素；和2’，4’，5’，7’，1，4-六氯荧光素。在某些方面，荧光标记选自SYBR-绿，6-羧基荧光素(“FAM”)，TET，ROX，VICTM和JOE。例如，在某些实施方案中，标记是能在不同的、可解析的波长发射光的不同荧光团(例如，4种不同的彩色荧光团)；某些这种标记探针在本领域中已知并如上文和美国专利No.6,140,054中所述。在一些实施方案中使用包括报告荧光团和淬灭荧光团的双重标记荧光探针。应了解的是，选择具有不同发射谱的荧光团对，使它们能轻易地相互区分。
在进一步的方面，标记是杂交-稳定部分，可用于双链体的增强、稳定或影响双链体的杂交，例如，嵌入剂和嵌入染料(包括，但不限于，溴化乙锭和SYBR-绿)，小沟结合物，和交联官能团(参见，例如，Blackbum等编，“DNA andRNA Structure”于Nucleic Acids in Chemistry and Biology(1996))。
在进一步的方面，可以使用依赖杂交和/或连接而定量miRNA的方法，包括寡核苷酸连接(OLA)方法和允许与靶核酸序列杂交的可识别探针与未结合探针相分离的方法。作为实例，如美国公开No.2006/0078894中披露的，HARP-类探针，可以用于测量miRNA的量。在这种方法中，探针和靶核酸之间杂交后，修饰探针以区分杂交探针和未杂交探针。然后，可以扩增和/或检测探针。通常地，探针失活区包含探针的靶杂交区中的核苷酸子集。为了降低或防止未与其靶核酸杂交的HARP探针的扩增和检测，并且从而检测靶核酸，使用能区分与其靶核酸序列杂交的HARP探针和相应的未杂交HARP探针的试剂进行杂交后探针失活步骤。所述试剂能失活或修饰未杂交探针，使其不能扩增。
在本方法的其它实施方案中，可以使用探针连接反应定量miRNA。在多重连接-依赖型探针扩增(MLPA)技术(Schouten等，Nucleic Acids Research30：e57(2002))中，仅在存在靶核酸的情况下，靶分子上彼此紧邻杂交的探针对相互连接。在一些方面，MLPA探针具有侧翼PCR引物结合位点。如果已经连接，MLPA探针只能扩增，从而检测和扩增miRNA生物标志物。
IV.实施例
下述实施例阐述本发明的各个实施方案，并且不意欲限制本发明的范畴。
本文所述实施例包括qRT-PCR的用途，其包括在指数期实时监测PCR产物，替代终点测量。实施例中的阈值循环(Ct)测量指达到荧光信号预定点所需的循环数。
实施例还描述了受试者操作特性(ROC)分析的用途。受试者操作特性曲线是二元分类器系统随着其判别阈值变化的灵敏度对特异性的图线。ROC分析提供工具，选择可能的优化模型和抛弃独立于类型分布(并且在详明之前)的次优化模型。文献中存在大量ROC分析的实例，包括在选择和应用生物标志物以诊断疾病中的应用(Pepe等，Biometrics 62：221-229(2006)；Dodd等，Biometrics 59：614-623(2003))。ROC分析捕获灵敏度和特异性的连续组，但是能概括为单个数量，即，ROC的曲线下面积(AUC)。AUC与非参数Wilcox测试密切相关并且总结了跨越所有阈值的类型的分离。ROC技术的优势包括(1)不按照逻辑回归方法的要求假设类型概率的参数形式，(2)适合于输出依赖的取样，例如，案例-控制设计，其广泛应用于医药研究中，和(3)相对直接地将不同“成本”分配给假阳性和假阴性(Dodd 2003；Pepe 2006)。
实施例1.用于肺癌早期检测的小鼠模型
使用A/J小鼠模型化学诱导肺部肿瘤并监测血浆中的miRNA表达谱。使用苯并芘(benzo[a]pyrene)(Sigma Aldrich，St.Louis，MO，USA；目录号48564)作为致癌物化学诱导小鼠中的肺部肿瘤。A/J小鼠(67只雄性和68只雌性)购自The Jackson Laboratory(Bar Harbor，Maine，USA；货号000646)并送至PerryScientific Inc.(San Diego，CA，USA)，小鼠年龄为六周。Perry Scientific进行所有动物相关试验，包括致癌物施用、动物监测、抽血和血浆处理。
为了获得基线数据，在施用致癌物前两周，将125只小鼠通过眼窝取血，并通过异氟烷吸入而处死10只小鼠并通过心脏穿刺而取血。在第0天，通过口服强饲以相当于20μM的200μl(250mg/kg体重)棉籽油(Sigma-Aldrich，目录号C7767)的剂量给实验组的小鼠服用致癌物。十只对照小鼠(5只雄性和5只雌性)接受不含致癌物的200μl棉籽油的口服强饲。在第一次强饲后10周给测试组服用第二次致癌物(250mg/kg体重)，对照动物如上所述接受第二次棉籽油强饲。在特定时间点处死小鼠(图1)，并对剩余小鼠每两周取一次血(图1)。结束时，对动物称重，通过心脏穿刺取血，并收集肺叶。在研究过程中为对照小鼠取血，并在施用致癌物后34周处死对照小鼠。
将血液样本单独加工成血浆。对于血浆制备，将血液样本收集在BD
Figure BDA0000157615080000291
K2EDTA管(Becton，Dickinson and Company；Franklin Lakes，NJ，USA；目录号367841)中。以2,000xg将血液离心10分钟，然后向血浆层吹入空气并放在新管中，以2,500xg离心10分钟。通过加入来自mirVanaTM分离试剂盒(Ambion Inc.，Austin，TX，USA；目录号AM1560)的2X变性缓冲液至终浓度为1X，立即稳定得到的血浆。通过涡漩震荡混合血浆和缓冲液并立即冷冻于-80℃直至在干冰上运至Asuragen。细胞团也冷冻于-80℃并与血浆样本一起运至Asuragen。
使用mirVana PARISTM试剂盒(Ambion，Inc.；编号AM1556)的有机提取纯化血浆RNA，过程经过下述修正。加入酸性酚:氯仿并涡漩震荡后，在冰上温育样本5分钟，然后以13,000xg于4℃离心10分钟。去除含水层，用氯仿提取，并再次离心。从第二次提取物去除含水层，并向样本加入3M NaOAc(1/10体积)、糖原(5mg/ml)和100％乙醇(1.5体积)。使裂解物/乙醇混合物通过mirVanaPARISTM滤柱，并用650μl Wash 1缓冲液洗涤一次，用650μl Wash 2/3缓冲液洗涤两次。用两等份不含核酸酶的水(50μl)洗脱RNA并保存于-80℃。
将来自每只小鼠的半个肺叶在10％缓冲福尔马林中过夜固定，包埋在石蜡(FFPE)中，并处理成用苏木紫和伊红(H&E)染色的切片。另外半个肺叶急冻于-80℃。每隔5mm将FFPE肺部分切片。使用下述切片方式：如果肺中不存在可见肿瘤，从每个肺各取三个随机的5x5x5mm切片急冻并用于FFPE制备。如果存在可见肿瘤，从每个肺的一个肿瘤取一个5x5x5mm切片急冻并将另一半制备用于FFPE。如果只有一个肺有肿瘤，将来自无关肺的随机区急冻并制备FFPE。对于组织病理学，将保存在福尔马林中的肺叶送至Pacific Pathology Inc.(San Diego，CA，USA)，在那里包埋在石蜡中，切片，用苏木紫和伊红染色，并制备成切片。
将H&E-染色的切片送至Asuragen并由董事会(board)认可的病理学家分析，并按照肺的正常、增生、腺瘤或腺癌分类。表6显示每只处死动物中观察到的可见肿瘤数量，和每个肺叶中的病理诊断。
表6.来自实验和对照小鼠的肺部肿瘤和病理诊断。SCC，鳞状细胞癌。
Figure BDA0000157615080000301
Figure BDA0000157615080000311
Figure BDA0000157615080000321
Figure BDA0000157615080000331
评价经过病理学确认患有肺部腺癌的小鼠和未接受致癌物的对照小鼠的血浆样本中miRNA的表达。对照小鼠的年龄与患腺癌小鼠相匹配。通过qRT-PCR，使用对每个miRNA特异性的
Figure BDA0000157615080000341
MicroRNA Assays(AppliedBiosystems)，评价329个miRNA的表达水平。一个miRNA的子集(170)具有在小鼠和人类体内均相同的成熟序列，其余则是相应人类miRNA的小鼠同源物。在加入RNA模版前在冰上组装反转录(RT)反应成分(表7)，每10μl反应包括～1ng血浆RNA。在384孔
Figure BDA0000157615080000342
PCR System 9700(AppliedBiosystems)中将RT反应于16℃温育30分钟，然后42℃ 30分钟，然后85℃ 5分钟。然后将RT反应物冷冻于-20℃。
表7.反转录反应成分
Figure BDA0000157615080000343
在加入RT反应的cDNA(2μl)之前在冰上组装PCR成分(表8)。在ABIPRISMTM 7900HT Fast Real-Time PCR系统(Applied Biosystems)中如下温育反应：95℃1分钟，然后共50个循环，每个循环为95℃ 5秒和60℃ 30秒。用7900HT Fast Real-Time PCR系统SDS V2.3软件(Applied Biosystems)分析结果。
表8.PCR成分
  qPCR试剂   终浓度
  MgCl2(50mM)   5mM
  10X Platinum PCR缓冲液，不含MgCl2(Invitrogen；目录号53286)   1X
  dNTPs(各2.5mM)(GE Healthcare；目录号28-4065-53)   1mM
  20X TaqMan miRNA引物/探针混合物(Applied Biosystems)   0.4X
  50X ROX(Asuragen，Inc.)   1X
  Platinum Taq DNA聚合酶(5U/μl)(Invitrogen，Corp.；目录号10966-083)   0.033U/μl
  来自RT反应的cDNA   2μl
表9显示来自qRT-PCR试验的癌症相对对照小鼠的平均Ct数据和ddCt值。显示p-值为0.1或更小的miRNA。
表9.来自经病理学确认的肺腺癌的小鼠和未接受致癌物的对照小鼠的血浆样本中的miRNA表达
  正常   正常   癌症   癌症   癌症-正常   t-检验
  miR-ID   平均dCT   SD   平均dCT   SD   ddCT   p-值
  miR-124a   5.024   0.207   1.823   0.400   -3.201   0.009745
  miR-141   -2.319   1.108   -4.446   1.887   -2.127   0.011532
  miR-183   1.025   1.294   -1.054   1.848   -2.080   0.02066
  miR-182   -2.074   1.340   -3.989   1.711   -1.915   0.020695
  mmu-miR-718   5.556   0.220   3.416   0.997   -2.140   0.030195
  miR-27b   -1.343   1.872   -3.049   0.996   -1.705   0.036353
  miR-452   1.601   0.674   -0.313   1.708   -1.914   0.040553
  miR-379   3.021   0.764   1.287   0.988   -1.735   0.041625
  mmu-miR-429   -4.873   0.781   -6.663   1.970   -1.790   0.042703
  mmu-miR-83   3.704   1.371   1.304   0.781   -2.400   0.043659
  miR-433   2.504   1.310   0.867   1.784   -1.636   0.046172
  mmu-miR-715   3.353   1.520   1.169   1.327   -2.185   0.050614
  miR-200a   -4.099   1.544   -5.861   1.901   -1.762   0.052236
  mmu-miR-694   -0.132   3.124   2.744   2.058   2.875   0.059031
  miR-205   -3.726   1.365   -5.323   1.875   -1.597   0.060958
  miR-423   -3.359   6.935   -12.157   11.792   -8.797   0.076461
  mmu-miR-706   0.017   1.072   -1.309   1.650   -1.327   0.077327
  miR-422b   -0.914   1.839   -2.576   1.930   -1.662   0.089258
  miR-324-5p   0.864   1.571   -0.388   0.503   -1.252   0.089557
  miR-200c   -5.662   1.485   -7.159   1.966   -1.497   0.09453
  miR-378   -0.322   2.275   -1.960   0.738   -1.638   0.095018
  miR-365   -3.013   1.678   -4.707   2.275   -1.694   0.098461
  mmu-miR-542-5p   2.291   1.603   0.917   0.836   -1.374   0.099749
此外，进行短期研究以检查已经诊断患肺腺癌的动物中的miRNA表达。图2A和2B显示在检测肿瘤之前，所选miRNA的表达随时间的变化。这张图显示早在施用致癌物后10周-至少在检测肿瘤前6周，可以检测miRNA的差异表达。这些结果证明miRNA可以用于检测早期肺癌并且适合肺癌的筛选。
实施例2.用于检测肺癌的miRNA生物标志物的qRT-PCR鉴定
评价八名肺癌患者和八名正常患者的血清样本中12种miRNA的表达。将来自肺癌患者和正常供体的血液收集在BD
Figure BDA0000157615080000351
Plus塑料血清管中。在进行诊断但尚未进行任何药物干预如肿瘤切除或治疗时收集所有血液。在1,000xg将血液离心10分钟，并将血清转移至新管中并立即冷冻于-80℃。使用mirVana PARISTM试剂盒(Ambion，Inc.，Austin，TX，USA；编号AM1556)的有机提取提取血清RNA，过程经过下述修正。加入酸性酚:氯仿并涡漩震荡后，在冰上温育样本5分钟，然后在4℃以13,000xg离心10分钟。去除含水层，用氯仿提取，并再次离心。从第二次提取去除含水层，并向样本加入3M NaOAc(1/10体积)、糖原(5mg/ml)和100％乙醇(1.5体积)。使裂解物/乙醇混合物通过mirVana PARISTM滤柱，并用650μl Wash 1缓冲液洗涤一次，并用650μl Wash 2/3缓冲液洗涤两次。用两等份不含核酸酶的水(50μl)洗脱RNA并保存于-80℃。
通过qRT-PCR，使用对每个miRNA有特异性的
Figure BDA0000157615080000361
MicroRNAAssays(Applied Biosystems；Foster City，CA，USA)，确定miRNA的表达水平。使用
Figure BDA0000157615080000362
MicroRNA反转录试剂盒(Applied Biosystems，Foster City，CA，USA；目录号4366597)进行反转录(RT)反应。在加入RNA模板前在冰上组装表10中所列反应成分。所有反应成分由生产商(Applied Biosystems；Foster City，CA，USA)作为多成分试剂盒提供。加入血清RNA(1ng总RNA每反应)并混合。在384孔
Figure BDA0000157615080000363
PCR System 9700(Applied Biosystems)中将RT反应于16℃温育30分钟，然后42℃ 30分钟，然后85℃ 5分钟。然后将RT反应物冷冻于-20℃。
表10.反转录反应成分。
  RT试剂   终浓度
  10XRT缓冲液   1X
  dNTPs(100mM)   1mM
  5X TaqMan MicroRNA RT引物   0.25X
  Rnase抑制剂(20U/μl)   0.26U/μl
  Multiscribe MML V-RT酶(50U/μl)   3.35U/μl
  人血清RNA   ～1ng
在加入RT反应的cDNA(4μl)之前在冰上组装PCR成分(表11)。在ABIPRISMTM 7900HT Fast Real-Time PCR系统(Applied Biosystems)中如下温育反应：95℃ 1分钟，然后为50个循环，每个循环95℃ 5秒和60℃ 30秒。用7900HTFast Real-Time PCR system SDS V2.3软件(Applied Biosystems)分析结果。
表11.PCR成分
  qPCR试剂   终浓度
  MgCl2(50mM)(Invitrogen，Corp.；目录号52723)   5mM
  10X Platinum PCR缓冲液，不含Mg(Invitrogen Corp.；目录号53286)   1X
  dNTPs(各2.5mM)(GE Healthcare；目录号28-4065-53)   1mM
  qPCR试剂   终浓度
  20X TaqMan miRNA引物/探针混合物(Applied Biosystems)   0.4X
  50X ROX内部标志物(Asuragen，Inc.)   1X
  Platinum Taq DNA聚合酶(5U/μl)(Invitrogen，Corp.；目录号10966-083)   0.033U/μl
表12提供每种miRNA的癌症和正常样本的平均dCt值。此外，ddCt值代表癌症和正常样本之间表达的差异。
表12：患肺癌和未患肺癌的患者血清中miRNA的表达
  正常   正常   癌症   癌症   癌症-正常   t-检验
  miR-ID   平均dCT   SD   评价dCT   SD   ddCT   p-值
  miR-375   2.595   1.470   -0.284   1.624   -2.878   0.002304
  miR-499   9.492   2.276   13.093   1.348   3.600   0.022561
  miR-22   -1.705   1.115   -2.715   0.787   -1.010   0.055164
  miR-122a   2.547   1.088   3.925   1.642   1.378   0.067827
  miR-206   1.039   1.870   2.816   1.781   1.777   0.071915
  miR-103   -5.317   1.051   -4.264   1.195   1.053   0.08225
  miR-24   -6.105   0.998   -6.920   1.020   -0.815   0.12848
  miR-26a   -7.577   1.080   -6.754   1.316   0.823   0.193305
  miR-498   9.488   2.253   10.945   3.831   1.457   0.439918
  miR-205   5.380   1.864   6.265   2.862   0.886   0.497533
  miR-222   -4.169   1.014   -4.005   0.888   0.164   0.735768
  let7c   -1.414   1.090   -1.300   0.688   0.114   0.805489
在扩展研究中，评价来自十六名肺癌患者和十二名患良性肺部病症的个体的血清样本中180种miRNA的表达(表13)。在表13中，Diff代表肿瘤的差异状态；MOD代表适中；AC代表腺癌；SCC代表鳞状细胞癌；R代表右；RUL代表右上叶；RML代表右中叶；RLL代表右下叶；LUL代表左上叶；而LLL代表左下叶。
表13.肺癌和良性样本的组织病理学和患者信息
Figure BDA0000157615080000371
Figure BDA0000157615080000381
将来自肺癌患者和参比供体的血液收集在BD
Figure BDA0000157615080000382
Plus塑料血清管中，并如前所述对初始人样本的方法进行处理。
表14以癌症和良性样本平均dCt值的形式提供miRNA的差异表达数据。此外，ddCt值代表癌症和良性样本之间表达的差异。
表14.肺癌和良性肺部病症患者的血清中miRNA的表达
Figure BDA0000157615080000383
Figure BDA0000157615080000391
Figure BDA0000157615080000401
Figure BDA0000157615080000411
还评价了miRNA生物标志物对的区别患者血清和这些样本的能力。使用未标准化的qRT-PCR数据计算评价的每个miRNA对的dCt值。使用受试者工作操作特性(ROC)分析方法分析多个miRNA对的dCt值，鉴定肺癌的诊断miRNA对。在这个实例中，使用ROC曲线评价生物标志物候选者的个体和组合区分患者类别的能力。测量生物标志物候选者的丰度，并使用测量结果开发分类器，在ROC曲线上标出所述分类器的真阳性和假阳性率。然后计算每种分类器的AUC。理想的分类器的ROC AUC值为1，并且根据它们的ROCAUC接近于1的程度将分类器排名。
表15包括可区分癌症患者和良性肺部病症患者的miRNA对。表15中的miRNA对按照ROCAUC的降序排列。给出了用于将癌症患者与良性肺部病症患者分类的血清miRNA生物标志物对。平均值代表miRNA对中两个miRNA的Ct值之间的平均差异。在表15中，“良性均值”代表来自12个良性肺部病症受试者的数据的平均值；“癌症均值”是来自16名肺癌患者的数据的平均值；“良性SD”是来自良性肺部病症患者的数据的标准偏差；“癌症SD”是来自肺癌患者的数据的标准偏差；“良性对癌症相关性”指与良性/肺癌诊断相关的p-值；ROC代表受试者操作特性；而AUS是曲线下面积。
表15.microRNA生物标志物对-良性肺和肺癌患者血清。
Figure BDA0000157615080000431
Figure BDA0000157615080000441
Figure BDA0000157615080000461
Figure BDA0000157615080000471
Figure BDA0000157615080000491
Figure BDA0000157615080000511
Figure BDA0000157615080000521
Figure BDA0000157615080000531
Figure BDA0000157615080000541
Figure BDA0000157615080000551
Figure BDA0000157615080000561
Figure BDA0000157615080000571
Figure BDA0000157615080000581
Figure BDA0000157615080000591
Figure BDA0000157615080000601
Figure BDA0000157615080000611
Figure BDA0000157615080000621
Figure BDA0000157615080000631
Figure BDA0000157615080000641
表15的成对分析中血清生物标志物的普遍性(prevalence)示于表16中。
表16：血清生物标志物在标志物对中的普遍性
Figure BDA0000157615080000652
表15和16中的数据显示血清中能区分肺部良性病症患者和肺癌患者的miRNA和miRNA生物标志物对，其与患者性别或癌症类型无关。这些miRNA可用于肺癌的诊断。癌症患者的血清样本来自早期I期至III期肺癌的患者。这些结果显示miRNA适合检测早期肺癌，并且可有效筛选患者并区分良性肺部病症患者和肺癌患者。
实施例3.男性和女性肺癌患者血清中的差异表达的miRNA
尽管表15和16中的血清miRNA能区分良性肺部病症和肺癌患者，对来自实施例2的数据的进一步分析表明某些miRNA对能更好地区分特定性别的患者群。具体地，一些miRNA对的AUC ROC为1.00(表17)。在区分女性良性肺部病症患者和女性肺癌患者时，这些对的ROC AUC得到显著改善。相似地，在区分良性肺部病症男性患者和肺癌男性患者时，特定miRNA对也观察到了AUC的改进(表18)。表17和18中的miRNA和miRNA对可用于分别诊断女性和男性患者的肺癌。这些miRNA能以两个或多个的组合使用。
表17.与女性肺癌患者相比，良性肺部病症女性患者的血清中差异表达的microRNA对。
Figure BDA0000157615080000661
Figure BDA0000157615080000671
Figure BDA0000157615080000681
Figure BDA0000157615080000691
表18.与男性肺癌患者相比，良性肺部病症男性患者的血清中差异表达的microRNA对。
Figure BDA0000157615080000692
实施例4.区分肺癌与患或未患良性病症的无癌受试者的miRNA标志物
在另外的研究中，鉴定了区分肺癌与患或未患良性病症的无癌受试者的血清miRNA。血清样本获得自良性病症患者、正常患者和肺癌患者(表19)。所有过程和数据分析如上所述进行。
表19.肺癌和良性样本的组织病理学和患者信息
  样本ID   年龄   性别   癌症状态   诊断   细胞类型
  1   59   F   其它   良性   NA
  2   60   F   其它   良性   NA
  3   64   F   其它   良性   NA
  4   69   F   其它   良性   NA
  5   71   F   其它   良性   NA
  样本ID   年龄   性别   癌症状态   诊断   细胞类型
  6   73   F   其它   良性   NA
  7   77   F   其它   良性   NA
  8   56   M   其它   良性   NA
  9   58   M   其它   良性   NA
  10   60   M   其它   良性   NA
  11   69   M   其它   良性   NA
  12   71   M   其它   良性   NA
  13   59   F   癌症   癌症   ADCA
  14   64   F   癌症   癌症   ADCA
  15   66   F   癌症   癌症   ADCA
  15   66   F   癌症   癌症   ADCA
  16   66   F   癌症   癌症   SCC
  17   72   F   癌症   癌症   SCC
  18   73   F   癌症   癌症   SCC
  19   73   F   癌症   癌症   SCC
  20   56   M   癌症   癌症   SCC
  20   56   M   癌症   癌症   SCC
  21   60   M   癌症   癌症   ADCA
  21   60   M   癌症   癌症   ADCA
  22   63   M   癌症   癌症   ADCA
  23   66   M   癌症   癌症   SCC
  24   69   M   癌症   癌症   ADCA
  25   69   M   癌症   癌症   SCC
  26   69   M   癌症   癌症   SCC
  27   71   M   癌症   癌症   SCC
  28   72   M   癌症   癌症   ADCA
  29   79   M   癌症   癌症   ADCA
  30   67   M   癌症   癌症   ADCA
  31   82   F   癌症   癌症   SCC
  32   77   M   癌症   癌症   ADCA
  33   41   M   其它   正常   NA
  34   40   F   其它   正常   NA
  35   66   F   其它   正常   NA
  36   65   F   其它   正常   NA
  37   20   F   其它   正常   NA
  38   41   M   其它   正常   NA
  39   37   M   其它   正常   NA
  样本ID   年龄   性别   癌症状态   诊断   细胞类型
  40   50   M   其它   正常   NA
  41   47   F   其它   正常   NA
  42   50   F   其它   正常   NA
  43   51   F   其它   正常   NA
  44   70   F   其它   正常   NA
  45   55   F   其它   正常   NA
  46   69   M   其它   正常   NA
  47   61   M   其它   正常   NA
  48   60   M   其它   正常   NA
  49   58   M   其它   正常   NA
  50   53   M   其它   正常   NA
  51   75   M   其它   正常   NA
  52   55   M   其它   正常   NA
表20以癌症和其它样本的平均dCt值的形式(其它＝良性和正常)提供miRNA的差异表达数据。表21显示区分肺癌患者与正常患者和良性肿瘤患者的差异表达miRNA生物标志物对。这种miRNA和生物标志物对能用于肺癌的筛选和诊断。
表20.肺癌患者或良性或正常情况患者的血清中miRNA的表达。其它＝良性和正常案例。
Figure BDA0000157615080000711
Figure BDA0000157615080000721
Figure BDA0000157615080000731
Figure BDA0000157615080000741
Figure BDA0000157615080000751
表21.区分肺癌患者与无肺部肿瘤的正常患者或良性肺部肿瘤患者的差异表达的miRNA生物标志物对。其它＝良性和正常案例。
Figure BDA0000157615080000752
Figure BDA0000157615080000761
Figure BDA0000157615080000771
Figure BDA0000157615080000781
Figure BDA0000157615080000791
Figure BDA0000157615080000801
Figure BDA0000157615080000811
Figure BDA0000157615080000821
Figure BDA0000157615080000831
Figure BDA0000157615080000841
表22显示能与其它miRNA生物标志物组合使用以表征肺癌的miRNA，以及这些生物标志物在表21的生物标志物对中的普遍性。
表22：血清生物标志物在癌症对(正常和良性)患者的成对分析中的普遍性。
Figure BDA0000157615080000842
Figure BDA0000157615080000851
实施例5.肺癌分类器开发
从表15的miRNA对中选择14个miRNA作为初始训练组，以进一步确认它们的诊断能力。这些miRNA如上文所示表现出具备诊断能力，可用于区分良性肺部病症患者和肺癌患者，如包括这些miRNA的miRNA生物标志物对的高AUC ROC分值所证明的。从20个良性肺部样本和34个肺癌样本组成的组中(表23)，在年龄和性别相匹配的患者中选择训练样本组(12个良性，16个肺癌)。如实施例2中所述进行qRT-PCR。
表23.肺癌和良性样本的组织病理学和患者信息
Figure BDA0000157615080000861
Figure BDA0000157615080000871
为了验证训练组中的14种miRNA的子集，从表23选择分离的测试样本组，所述组由8个良性和18个LuCa样本组成。通过在训练样本上进行25次重复的5-倍交互验证，并测量作为miRNA生物标志物数量(特征)的函数的AUC ROC值，产生miRNA生物标志物选择和分类器评价。使用多种生物标志物，从而确定用于分类的最优特征数。五倍交互验证是将训练组再划分为80％样本组和20％样本组的过程，并且在80％训练样本上进行特征选择和分类器训练。通过将未用于特征选择和分类器训练的剩余20％样本分类而测量性能。将这个过程重复5次，从而使所有样本都在20％测试组中出现一次，并且仅出现一次。5-倍交互验证的一次迭代产生一个单一的AUC值。重复五倍交互验证25次，从而实现较优的80％和20％组的组合的取样，并对于分类器中指定数目的生物标志物，鉴定经验的AUC值分布。使用根据简单Welch t-检验得到的最佳生物标志物作为用于训练的线性判别分析(LDA)分类器的输入。将生物标志物定义为miRNA对(两个miRNA的差异表达)，其中将一种miRNA的表达值从另一种miRNA的表达值中减去。考察所有可能的miRNA对。图3显示LDA分类器的AUC值分布作为生物标志物数目的函数。这个过程确定用于分类器的生物标志物最优数量，并且提高性能预期。将6对差异表达的miRNA对(miR-142-5p和miR181d；miR-142-3p和miR181d；miR-142-3p和miR-422a；miR-142-5p和miR-422a；miR-92和miR-27b；miR-24和miR-27a)的分类器鉴定为用于本实验中肺癌诊断的最优分类器。在图3中用垂直虚线标出这个分类器。对LDA分类器设置截止，将连续定值的分类几率转化为调用对患肺癌(分类器-阳性)或良性(分类器-阴性)肿瘤的患者的诊断。为简单起见，选择0.5的截点作为阈值。这个数值产生接近最大的灵敏度和特异性。图4中给出了使用0.5的LDA分类器截点，在六对生物标志物上训练的训练和测试数据的性能估计。标出了灵敏度(SENS)、特异性(SPEC)、阴性预测值(NPV)和阳性预测值(PPV)。
可以使用在本实验中鉴定为分类器的一部分的六对中任何一对诊断肺癌。预测精度可随着来自最优分类器组的多于一对的使用而增加。
实施例6.用于评价人类肺癌患者血浆RNA中microRNA表达的qRT-PCR
为了鉴定人类血浆中肺癌的miRNA生物标志物，使用qRT-PCR比较肺癌患者(n＝14)血浆中存在的miRNA水平和无肺癌患者(n＝12)中的水平。患者信息和肺癌病理学信息示于表24中。
表24.人类肺癌和正常患者信息和肿瘤病理学。TNM阶段(Sobin和Wittekind，2002)
Figure BDA0000157615080000891
为了分离血浆，将来自每个供体的全血(10ml)收集进BD
Figure BDA0000157615080000892
K2EDTA管(Becton，Dickinson and Company；Franklin Lakes，NJ，USA)。采血后立即将管反转8-10次，然后在采血后两个小时内以2,000xg离心10分钟。使用血清移液管将血浆转至新管中并于-80℃冷冻，直至进行RNA分离。
使用mirVana PARISTM试剂盒(编号AM1556；Applied Biosystems/Ambion；Austin，TX，USA)的有机提取纯化血浆RNA，提取过程做如下修改。在冰上解冻血浆后，加入mirVana PARISTM试剂盒的等体积2X变性溶液，并在冰上温育混合物五分钟。加入等体积酸性酚:氯仿，然后将混合物涡漩震荡一分钟，并在冰上温育五分钟。在4℃以13,000xg将管离心15分钟，并将含水相移出至新管中。向样本加入糖原(5mg/ml)、3M NaOAc(1/10体积)和100％乙醇(1.5体积)。通过反转混合样本并室温温育。使裂解液/乙醇混合物通过mirVanaPARISTM滤柱，并用650μl Wash 1缓冲液洗涤滤器一次，用650μl Wash 2/3缓冲液洗涤两次。通过在10,000xg离心1分钟，用不含核酸酶的水(50μl，加热至95℃)洗脱RNA。
使用对每种个体miRNA特异性的
Figure BDA0000157615080000893
MicroRNA Assays(AppliedBiosystems；Foster City，CA，USA)进行qRT-PCR反应。加入RNA模板之前在冰上组装反转录实验(表25)。接着，每反应加入0.25μl血浆RNA模板并混合。在384孔
Figure BDA0000157615080000894
PCR System 9700(Applied Biosystems)中将RT反应于16℃温育30分钟，然后42℃ 30分钟，然后85℃ 5分钟。然后冷冻于-20℃冰箱中。
表25.反转录实验成分。
Figure BDA0000157615080000895
Figure BDA0000157615080000901
加入来自RT反应的cDNA之前在冰上组装PCR成分(表26)。在ABIPRISMTM 7900HT Fast Real-Time PCR系统(Applied Biosystems)中温育PCR，条件为95℃ 1分钟，然后50个循环，每个循环95℃ 5秒，和60℃ 30秒。使用7500 Fast System SDS V2.3软件(Applied Biosystems)完成初步数据分析。
表26.实时PCR成分。
Figure BDA0000157615080000902
首先评价qRT-PCR数据的异常值。消除原始Ct值为50的给定样本中的所有miRNA，以进行进一步分析。消除来自原始Ct值小于50的少于150个miRNA的样本中的所有数据。对每个个体样本，计算每个血浆样本中检测的50个miRNA的平均原始Ct。从给定样本中每个miRNA的原始Ct值中减去相应样本的平均Ct，得到检测的每个miRNA的dCt。使用这些标准化的测量值鉴定在正常供体和肺癌患者的血浆样本中以显著差异水平存在的miRNA。
计算正常供体和肺癌患者样本中每个miRNA的平均dCt值。从正常供体的平均dCt值中减去肺癌患者的平均dCt值，确定两个患者组之间各个miRNA的水平变化。然后使用student t-检验评价多个miRNA区分肺癌患者和正常供体的血浆的能力。
表27以癌症和正常样本平均dCt值的形式提供miRNA的差异表达数据。此外，ddCt值代表癌症和正常样本之间表达的差异。
表27.在肺癌患者的血浆样本和正常患者的血浆样本之间差异表达的miRNA生物标志物
Figure BDA0000157615080000911
Figure BDA0000157615080000921
Figure BDA0000157615080000931
Figure BDA0000157615080000941
Figure BDA0000157615080000951
Figure BDA0000157615080000961
Figure BDA0000157615080000971
Figure BDA0000157615080000991
实施例7.用于评价人类肺癌患者血浆RNA中microRNA表达的QRT-PCR
使用第二个血浆样本组，所述组分离自不同的肺癌和正常患者组(表28)，进行在肺癌和正常患者中表达的miRNA的额外比较。在表28中，TNM(肿瘤、瘤/结节(node)、转移)阶段如Sobin和Wittekind，New Jersey：John Wiley &Sons，2002所述。表28中使用下述缩略语：腺癌(ADCA)；支气管肺泡(BA)，鳞状细胞癌(SCC)，和未提供(NA)。
表28.人类肺癌和正常患者信息和肿瘤病理学
Figure BDA0000157615080000992
Figure BDA0000157615080001001
为了评价miRNA的表达，使用实时RT-PCR检测，用
Figure BDA0000157615080001002
MicroRNA Assays(Applied Biosystems，Foster City，CA，USA)对从七个正常人血浆和九个肺癌患者血浆样本中分离的RNA进行筛选。
如实施例6中所述分离血浆RNA。使用对每个个体miRNA特异性的
Figure BDA0000157615080001003
MicroRNA Assays(Applied Biosystems；Foster City，CA，USA)进行qRT-PCR反应。加入RNA模板前在冰上组装反转录实验(表29)。接着，每个反应加入0.25μl血浆RNA模板并混合。在384孔
Figure BDA0000157615080001004
PCR System9700(Applied Biosystems)中将RT反应于16℃温育30分钟，然后42℃ 30分钟，然后85℃ 5分钟，然后冷冻于-20℃冰箱中。
表29.反转录实验成分。
加入来自RT反应的cDNA前在冰上组装PCR成分(表30)。在ABIPRISMTM 7900HT Fast Real-Time PCR系统(Applied Biosystems)中温育PCR，条件为：95℃ 1分钟，然后50个循环，每个循环95℃ 5秒和60℃ 30秒。使用7500 Fast System SDS V2.3软件(Applied Biosystems)完成初始数据分析。
表30.实时PCR成分
Figure BDA0000157615080001006
Figure BDA0000157615080001011
首先评价qRT-PCR数据的异常值。消除原始Ct值为50的给定样本中的所有miRNA，以进行进一步分析。消除来自原始Ct值小于50的少于150个miRNA的样本中的所有数据。对每个个体样本计算每个血浆样本中检测的50种miRNA的平均原始Ct。从给定样本中每个miRNA的原始Ct值中减去相应样本的平均Ct，产生检测的每个miRNA的dCt。使用这些标准化的测量值鉴定在正常供体和肺癌患者的血浆样本中以显著差异水平存在的miRNA。
计算正常供体和肺癌患者样本中每个miRNA的平均dCt值。从正常供体的平均dCt值中减去肺癌患者样本的平均dCt值以确定两个患者组之间多个miRNA水平的变化。然后使用student t-检验评价多个miRNA区分肺癌患者和正常供体的血浆的能力。
表31提供正常和癌症患者的dCt值，以及对于每个miRNA的癌症对正常样本的ddCt值。
表31.在肺癌患者的血浆样本和正常患者的血浆样本之间差异表达的miRNA生物标志物
Figure BDA0000157615080001012
Figure BDA0000157615080001041
Figure BDA0000157615080001051
Figure BDA0000157615080001061
实施例8.可区分肺癌患者的血浆和正常患者的血浆的miRNA组合
使用如实施例6中所述而产生的、未标准化的qRT-PCR数据来计算定量的每个miRNA对的dCt值。使用受试者工作特性(ROC)分析来分析肺癌和正常供体血浆样本中多个miRNA对的dCt结果，以确定哪对miRNA具有区分肺癌患者血浆样本和来自正常患者的样本的能力。一个miRNA对(let-7c：miR-326)精确地将分析的14个肺癌患者样本和12个正常供体样本分类(表32)。其他20个miRNA对精确分类26个样本中除了一个样本之外的所有样本(ROC AUC＞0.98)，并且221对miRNA的ROC AUC分数至少为0.93(表32)。表32的221对miRNA中至少包括一次166个独立的miRNA(表33)。很多miRNA在多对生物标志物中使用，表明它们在肺癌患者和正常供体血浆中可变水平的强度。
表32.能用于鉴定肺癌患者血浆的生物标志物对。
Figure BDA0000157615080001072
Figure BDA0000157615080001081
Figure BDA0000157615080001091
Figure BDA0000157615080001101
Figure BDA0000157615080001111
Figure BDA0000157615080001121
Figure BDA0000157615080001131
Figure BDA0000157615080001151
Figure BDA0000157615080001161
表33.能组合使用以鉴定肺癌患者血浆的生物标志物，以及每种miRNA的普遍性。
  生物标志物   使用次数   生物标志物   使用次数   生物标志物   使用次数
  miR-10b   65   miR-410   15   miR-425   7
  miR-192   62   miR-188   14   miR-432*   7
  miR-206   61   miR-193a   14   miR-103   6
  miR-101   58   let-7g   13   miR-193b   6
  miR-205   52   let-7i   13   miR-196a   6
  miR-16   50   miR-140   13   miR-199a*   6
  miR-151   44   miR-181b   13   miR-199b   6
  miR-137   43   miR-25   13   miR-28   6
  miR-215   43   miR-328   13   miR-30d   6
  miR-181a   42   miR-133a   12   miR-330   6
  miR-218   42   miR-150   12   miR-423   6
  生物标志物   使用次数   生物标志物   使用次数   生物标志物   使用次数
  miR-126*   41   miR-17-5p   12   miR-433   6
  miR-125b   39   miR-21   12   miR-485-5p   6
  miR-326   39   miR-214   12   miR-20a   5
  miR-100   38   miR-370   12   miR-23b   5
  miR-31   36   miR-383   12   miR-26a   5
  miR-197   35   miR-130b   11   miR-30b   5
  miR-222   34   miR-199a   11   miR-30c   5
  miR-191   32   miR-212   11   miR-320   5
  miR-200c   32   miR-221   11   miR-345   5
  miR-186   31   miR-27b   11   miR-422b   5
  miR-145   30   miR-30e-3p   11   miR-335   4
  miR-155   30   miR-338   11   miR-365   4
  miR-29c   30   miR-361   11   miR-486   4
  let-7c   28   miR-141   10   miR-24   3
  miR-181c   27   miR-142-5p   10   miR-26b   3
  miR-125a   26   miR-30a-3p   10   miR-331   3
  miR-134   25   miR-30a-5p   10   miR-340   3
  miR-181d   25   miR-451   10   miR-34a   3
  let-7b   24   miR-142-3p   9   miR-374   3
  miR-127   24   miR-146b   9   miR-452   3
  miR-146a   24   miR-15b   9   miR-483   3
  miR-139   23   miR-18a   9   miR-512-5p   3
  miR-152   23   miR-210   9   let-7e   2
  miR-190   23   miR-296   9   miR-32   2
  miR-30e-5p   23   miR-323   9   miR-422a   2
  miR-106b   22   miR-362   9   miR-424   2
  miR-10a   22   let-7a   8   miR-432   2
  miR-132   21   miR-196b   8   miR-485-3p   2
  miR-148a   21   miR-223   8   miR-487b   2
  miR-213   21   miR-29b   8   miR-496   2
  miR-29a   21   miR-324-5p   8   miR-505   2
  miR-375   21   miR-376a   8   miR-7   2
  miR-133b   19   miR-379   8   miR-202   1
  miR-15a   18   miR-491   8   miR-369-3p   1
  miR-107   17   let-7d   7   miR-495   1
  miR-148b   17   miR-126   7   miR-502   1
  miR-19a   17   miR-182   7   miR-511   1
  生物标志物   使用次数   生物标志物   使用次数   生物标志物   使用次数
  miR-106a   15   miR-185   7   miR-516-3p   1
  miR-130a   15   miR-204   7   miR-517c   1
  miR-17-3p   15   miR-23a   7   miR-92   1
  miR-18a*   15   miR-27a   7   miR-93   1
  miR-195   15   miR-324-3p   7   miR-99a   1
  miR-20b   15   miR-342   7   miR-99b   1
  miR-301   15   miR-34c   7
  miR-339   15   miR-382   7
实施例9.用于评价人类肺癌患者血清RNA中microRNA表达的qRT-PCR
为了进一步评价某些miRNA和miRNA组合的选择性和灵敏度，使用分离自不同的肺癌患者和正常受试者组的额外血清样本组(表34)，比较肺癌患者和正常受试者血清中表达的miRNA。由多名有资格的病理学家对癌症患者和正常受试者的肺叶切片进行组织病理学分析，确定病理诊断。
表34.血清样本的组织病理学和患者信息。ADCA，腺癌；SCCA，鳞状细胞癌。
  样本ID   性别   诊断   细胞类型
  1   M   癌症   ADCA
  2   M   癌症   ADCA
  3   M   癌症   ADCA
  4   M   癌症   SCCA
  5   M   癌症   SCCA
  6   F   癌症   ADCA
  7   F   癌症   SCCA
  8   M   癌症   SCCA
  9   M   癌症   ADCA
  10   F   癌症   ADCA
  11   M   癌症   ADCA
  12   F   癌症   ADCA
  13   F   癌症   ADCA
  14   M   癌症   ADCA
  15   F   癌症   SCCA
  16   F   癌症   ADCA
  17   M   癌症   SCCA
  18   M   癌症   ADCA
  19   M   癌症   ADCA
  20   M   癌症   SCCA
  21   F   癌症   ADCA
  22   F   癌症   ADCA
  23   F   癌症   ADCA
  24   F   癌症   SCCA
  25   F   癌症   SCCA
  26   M   癌症   SCCA
  27   M   癌症   ADCA
  28   M   癌症   ADCA
  29   M   癌症   SCCA
  30   M   癌症   ADCA
  31   F   正常   正常
  32   F   正常   正常
  33   F   正常   正常
  34   M   正常   正常
  35   F   正常   正常
  36   M   正常   正常
  37   M   正常   正常
  38   M   正常   正常
  39   M   正常   正常
  40   M   正常   正常
  41   M   正常   正常
  42   M   正常   正常
  43   M   正常   正常
  44   F   正常   正常
  45   M   正常   正常
  46   F   正常   正常
  47   F   正常   正常
  48   F   正常   正常
  49   F   正常   正常
  50   M   正常   正常
首先，评价来自30名肺癌患者和20名正常受试者的血清RNA中180种miRNA的表达(表34)。采血、血清RNA提取和qRT-PCR如实施例2中所述进行。表35显示从血清样本中PCR扩增miRNA后的平均dCt和ddCt值。如下计算dCt值：特定miRNA的Ct和前50种表达miRNA之间的差值，以此作为标准化元素。按照t-检验p-值的升序排列miRNA。
表35.肺癌患者和正常受试者血清中miRNA的表达。
Figure BDA0000157615080001201
Figure BDA0000157615080001211
Figure BDA0000157615080001221
Figure BDA0000157615080001231
根据差异表达的miRNA对，选择27种miRNA在其他55名肺癌患者和75名无肺癌、据推测正常的个体的血清样本中进一步验证(表36)。
表36.肺癌患者、肿瘤病理学和正常受试者信息。TNM阶段(Sobin和Wittekind，2002)；AJCC阶段(Greene，2002)；ADCA，腺癌；ADCA/BA，支气管肺泡的腺癌；SCCA，鳞状细胞癌；NA，不适用。
  样本ID   年龄   性别   细胞类型  TNM阶段   AJCC阶段   吸烟史
  1   80   M   正常  NA   NA   是
  2   66   M   正常  NA   NA   是
  3   78   M   正常  NA   NA   否
  4   70   M   正常  NA   NA   是
  5   38   M   正常  NA   NA   否
  6   66   M   正常  NA   NA   是
  7   67   F   正常  NA   NA   否
  8   62   M   正常  NA   NA   是
  9   63   F   正常  NA   NA   是
  10   69   M   正常  NA   NA   是
  11   82   M   正常  NA   NA   是
  12   55   F   正常  NA   NA   否
  13   55   M   正常  NA   NA   是
  14   79   M   正常  NA   NA   是
  15   71   F   正常  NA   NA   否
  16   62   F   正常  NA   NA   否
  17   79   M   正常  NA   NA   是
  18   77   M   正常  NA   NA   是
  19   78   M   正常  NA   NA   是
  20   69   M   正常  NA   NA   是
  21   62   M   正常  NA   NA   是
  22   55   F   正常  NA   NA   是
  23   56   M   正常  NA   NA   是
  24   55   F   正常  NA   NA   是
  25   79   M   正常  NA   NA   是
  26   77   M   正常  NA   NA   是
  27   79   M   正常  NA   NA   是
  28   55   F   正常  NA   NA   是
  29   51   M   正常  NA   NA   是
  30   56   M   正常  NA   NA   是
  31   78   F   正常  NA   NA   否
  32   52   M   正常  NA   NA   是
  33   75   M   正常  NA   NA   是
  34   68   F   正常  NA   NA   是
  35   57   M   正常   NA   NA   否
  36   67   M   正常   NA   NA   是
  37   85   M   正常   NA   NA   是
  38   76   M   正常   NA   NA   是
  39   53   M   正常   NA   NA   是
  40   51   M   正常   NA   NA   是
  41   65   M   正常   NA   NA   是
  42   78   F   正常   NA   NA   是
  43   83   M   正常   NA   NA   是
  44   72   M   正常   NA   NA   是
  45   61   F   正常   NA   NA   是
  46   69   M   正常   NA   NA   否
  47   55   F   正常   NA   NA   是
  48   51   M   正常   NA   NA   是
  49   56   F   正常   NA   NA   是
  50   70   M   正常   NA   NA   是
  51   57   M   正常   NA   NA   是
  52   63   M   正常   NA   NA   是
  53   73   M   正常   NA   NA   是
  54   70   M   正常   NA   NA   是
  55   75   F   正常   NA   NA   是
  56   73   F   正常   NA   NA   是
  57   57   F   正常   NA   NA   是
  58   78   M   正常   NA   NA   是
  59   63   M   正常   NA   NA   是
  60   74   M   正常   NA   NA   是
  61   79   M   正常   NA   NA   是
  62   55   M   正常   NA   NA   是
  63   84   F   正常   NA   NA   是
  64   54   F   正常   NA   NA   是
  65   56   F   正常   NA   NA   是
  66   82   M   正常   NA   NA   是
  67   64   F   正常   NA   NA   是
  68   77   M   正常   NA   NA   是
  69   51   F   正常   NA   NA   是
  70   37   M   正常   NA   NA   是
  71   54   M   正常   NA   NA   是
  72   68   F   正常   NA   NA   是
  73   54   M   正常   NA   NA   是
  74   62   F   正常   NA   NA   是
  75   54   F   正常   NA   NA   否
  76   77   M   ADCA   T1N1   IIA   是
  77   77   M   SCCA   T2N0   IB   是
  78   84   M   SCCA   T2N0   IB   是
  79   52   M   SCCA   TN2   IIIA   是
  80   49   F   ADCA   T1N1   IIA   是
  81   60   M   ADCA   T2NOMO   IB   是
  82   66   F   ADCA/BA   T1N0   IA   是
  83   69   M   SCCA   T2N1MO   IIB   是
  84   68   M   ADCA   N2   IIIA   是
  85   56   M   SCCA   T2N1M0   IIB   是
  86   85   M   ADCA   T2N0   IB   是
  87   68   F   SCCA   T2N1MO   IIB   是
  88   66   M   SCCA   T2N0M0   IB   是
  89   61   M   SCCA   T2N1   IIB   是
  90   58   M   ADCA   M1   IV   是
  91   64   F   ADCA   T1N0M0   IA   是
  92   72   F   SCCA   T2N0   IB   是
  93   67   M   ADCA   T1Nx   IA   是
  94   63   F   ADCA   T1N0   IA   是
  95   80   M   ADCA   T2N0   IB   是
  96   63   F   ADCA   T1NOMO   IA   是
  97   48   F   ADCA/BA   T1N0M0   IA   是
  98   70   F   SCCA   T1N0M0   IA   是
  99   71   M   SCCA   T3N0   IIB   是
  100   73   F   SCCA   T3N0M0   IIB   是
  101   72   M   ADCA/BA   T2N0   IB   是
  102   74   M   SCCA   T2N0   IB   是
  103   51   F   ADCA   T1N0   IA   是
  104   83   M   SCCA   T1N0   IA   是
  105   66   M   ADCA   T2N1M0   IIB   是
  106   65   F   SCCA   T2N0   IB   是
  107   74   F   ADCA   T1N0M0   IA   是
  108   77   M   SCCA   T2N1M0   IIB   是
  109   82   F   SCCA   T2N0   IB   是
  110   67   M   ADCA   T1N0   IA   是
  111   61   M   ADCA   TN2   IIIA   是
  112   82   F   SCCA   T2N1M0   IIB   是
  113   58   M   SCCA   T1N0M1   IV   是
  114   78   M   ADCA   T1NOMO   IA   是
  115   77   M   ADCA   T1N2   IIIA   是
  116   72   M   ADCA   T2N0   IB   是
  117   59   F   ADCA   T2N0   IB   是
  118   72   M   SCCA   T1NOMO   IA   是
  119   71   F   ADCA   T2N1   IIB   是
  120   72   F   SCCA   T2NO   IB   是
  121   73   F   ADCA   T2N2M0   IIIA   是
  122   69   M   SCCA   T2N0   IB   是
  123   66   F   SCCA   T2N1M0   IIB   是
  124   55   M   ADCA   T4   IIIB   是
  125   68   F   ADCA/BA   T1N0M0   IA   是
  126   64   F   ADCA   T2NOMO   IB   是
  127   77   M   SCCA   T1N0   IA   是
  128   76   F   ADCA   N2   IIIA   是
  129   60   F   ADCA   T1N0   IA   是
  130   66   M   SCCA   T2N0M0   IB   是
评价27种miRNA区分表36中所示肺癌患者样本和正常受试者样本的能力。表37显示每种miRNA对于癌症和正常组的平均Ct值和标准偏差。dCt值代表癌症和正常组之间Ct的差别。按照t-检验p-值的升序排列miRNA。27种miRNA中有二十四种以高统计显著性水平差异表达，t-检验p-值小于0.001。这二十四种miRNA能用于诊断肺癌。
表37.miRNA在肺癌患者或正常受试者血清中的表达。
Figure BDA0000157615080001271
Figure BDA0000157615080001281
使用受试者操作特性(ROC)分析鉴定具有区分肺癌患者和正常患者血清样本能力的miRNA对。选择表38中所示能区分正常患者和肺癌患者的差异表达miRNA对，并按照AUC降序(0.99至0.74)排列。
表38.能用于鉴定肺癌患者血清的miRNA生物标志物对。
Figure BDA0000157615080001282
Figure BDA0000157615080001291
Figure BDA0000157615080001301
Figure BDA0000157615080001311
除了miRNA的差异成对分析(表38)，评价了几个基于miRNA生物标志物的能区分肺癌和正常(无癌)受试者的分类器模型。用从表34中所述样本获得的数据设计分类器模型。当用于表36中所示的无关样本时，模型证明在区分肺癌患者和正常受试者中具有很好的性能。
具体地，使用简单的Welch t-检验和Relief(Kira和Rendel，Proc 10th NatlConf on Artificial Intelligence，MIT Press，pp.129-134(1992))方法选择特性(即，miRNA)作为输入，并且使用线性判别分析(LDA)和线性支持向量机(LSVM)作为训练过程中的分类器(Burges，Data Mining and Drug Discovery 2：121-167(1998))。表39显示区分训练和测试组中肺癌和无癌受试者的分类器模型的代表性实例。
表39.正常受试者和肺癌患者的训练和测试组中分类模型的性能和特性选择。
Figure BDA0000157615080001321
通过在训练样本上重复25次5-倍交互验证并如实施例5所述测量ROCAUC值，评价模型在训练数据上的性能。每个分类模型中miRNA对出现的频率如表40中所示。
表40.成对生物标志物在分类器生成中的普遍性。分类模型如文中所述。
Figure BDA0000157615080001331
与表40中分类器模型相关频率最高并且可区分肺癌和无癌受试者的独特miRNA示于表41中。可以使用这些miRNA区分肺癌患者和无癌受试者，并且因此可以用于表征或诊断肺癌。
表41：能用于区分肺癌患者和无癌受试者的miRNA
  LSVM训练+T检验+7   LSVM训练+Relief+7   LDA训练+T检验+7   LDA训练+Relief+7
  106a   106a   106a   106a
  106b   106b
  126*   126*   126*   126*
  142-3p   142-3p
  15b   15b   15b   15b
  181c   181c
  182   182
  26b   26b   26b   26b
  30a-5p   30a-5p   30a-5p   30a-5p
  30b   30b
  30d   30d
  30e-5p   30e-5p   30e-5p   30e-5p
  422b   422b   422b   422b
  let-7i   let-7i
  let-7g   let-7g
考虑到本说明书和本文所披露的发明的实施，本发明的其它实施方案对于本领域的技术人员显而易见。意欲仅将说明书和实施例仅作为示例考虑，本发明的真实范围和精神通过所附权利要求指示。
本文所引用的所有参考文献通过提述以其整体并入本文。当通过提述并入的出版物和专利或专利申请与说明书中包含的本发明相矛盾时，本说明书将替代任何矛盾的材料。
Figure IDA0000157615140000011
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Claims (19)

1.用于表征有肺部肿瘤或损伤的患者中的肺癌的方法，所述方法包括如下步骤：
a.测量血清样本中miRNA的水平，其中所述miRNA选自let-7b、let-7c、let-7d、let-7e、miR-10a、miR-10b、miR-130b、miR-132、miR-133b、miR-139、miR-143、miR-152、miR-155、miR-15b、miR-17-5p、miR-193、miR-194、miR-195、miR-196b、miR-199a*、miR-19b、miR-202、miR-204、miR-205、miR-206、miR-20b、miR-21、miR-210、miR-214、miR-221、miR-27a、miR-27b、miR-296、miR-29a、miR-301、miR-324-3p、miR-324-5p、miR-339、miR-346、miR-365、miR-378、miR-422a、miR-432、miR-485-3p、miR-496、miR-497、miR-505、miR-518b、miR-525、miR-566、miR-605、miR-638、miR-660和miR-93；和
b.确定样本中miRNA下降或上升的水平，从而表征所述患者中的肺癌。
2.根据权利要求1的方法，其中所述肺癌是小细胞或非小细胞肺癌。
3.根据权利要求1的方法，其中所述患者先前经过肺病的筛选。
4.根据权利要求1的方法，其中所述患者怀疑患有肺癌或者有发生肺癌的风险。
5.根据权利要求3的方法，其中所述筛选通过CT扫描或胸部x-射线进行。
6.根据权利要求1的方法，其进一步包括扩增所述miRNA。
7.根据权利要求6的方法，其中所述扩增通过定量反转录酶聚合酶链式反应进行。
8.根据权利要求1的方法，其进一步包括扩增、测量并确定第二miRNA下降或上升的水平。
9.用于表征患者中的肺病的方法，所述方法包括如下步骤：
a.测量血清样本中第一miRNA和第二miRNA的水平，其中第一miRNA选自let-7a、let-7b、let-7d、let-7f、let-7g、let-7i、miR-101、miR-106a、miR-106b、miR-125a、miR-126、miR-126*、miR-130b、miR-132、miR-133b、miR-140、miR-142-3p、miR-142-5p、miR-145、miR-146a、miR-146b、miR-148b、miR-150、miR-151、miR-15a、miR-15b、miR-181a、miR-181b、miR-181d、miR-185、miR-186、miR-190、miR-191、miR-193a、miR-199a*、miR-202、miR-210、miR-214、miR-222、miR-23a、miR-24、miR-26a、miR-26b、miR-27a、miR-27b、miR-29b、miR-301、miR-30a-5p、miR-30b、miR-30c、miR-30d、miR-30e-5p、miR-320、miR-324-3p、miR-326、miR-335、miR-340、miR-342、miR-345、miR-346、miR-34a、miR-374、miR-375、miR-378、miR-422a、miR-422b、miR-425、miR-486、miR-496、miR-518b、miR-660、miR-7、miR-92、miR-93、miR-98、miR-99a和miR-99b；和。
b.检测所述样本中第一和第二miRNA下降或上升的水平，从而表征患者中的肺病。
10.根据权利要求9的方法，其中所述第一miRNA选自let-7g、miR-106b、miR-126、miR-126*、miR-132、miR-140、miR-142-3p、miR-146a、miR-150、miR-15a、miR-15b、miR-181a、miR-181b、miR-181d、miR-214、miR-24、miR-30a-5p、miR-320、miR-342、miR-345、miR-374、miR-422a、miR-422b、miR-486和miR-92。
11.根据权利要求9的方法，其中所述第一和第二miRNA是选自表3的对。
12.根据权利要求9的方法，其中所述肺病是癌症。
13.根据权利要求9的方法，其中所述患者有肺部肿瘤或损伤。
14.根据权利要求9的方法，其中所述患者先前经过肺病的筛选。
15.根据权利要求12的方法，其中所述癌症是小细胞或非小细胞肺癌。
16.根据权利要求9的方法，其进一步包括扩增第一miRNA和第二miRNA。
17.根据权利要求16的方法，其中所述扩增通过定量反转录酶聚合酶链式反应进行。
18.根据权利要求9的方法，其中所述患者为男性。
19.根据权利要求9的方法，其中所述患者为女性。
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