CN102743765A

CN102743765A - 非小细胞肺癌中miR-10a基因的应用

Info

Publication number: CN102743765A
Application number: CN2012101629990A
Authority: CN
Inventors: 金由辛; 马中良; 韦嘉励; 王德韬; 侯品品
Original assignee: University of Shanghai for Science and Technology
Current assignee: University of Shanghai for Science and Technology
Priority date: 2012-05-24
Filing date: 2012-05-24
Publication date: 2012-10-24

Abstract

本发明涉及一种非小细胞非癌中miRNA基因的应用。H1299细胞系中miR-10a的一种靶基因，miR-10a通过与靶基因mRNA的3′-UTR互补，抑制靶基因mRNA的翻译或直接降解靶基因的mRNA。结合生理生化试验，确定了在H1299细胞系中miR-10a与MAP3K7有相互作用。这种相互作用影响了H1299细胞的增殖、凋亡等生命活动。本实验通过软件预测、solexa测序分析，并构建载体，在HEK293T细胞中利用荧光素酶报告基因分析验证了MAP3K7是miR-10a的靶基因，并在H1299细胞中利用过表达和western-blot的技术，进一步验证了该发现。所公开的为在H1299细胞系中MAP3K7是miR-10a的靶基因的首次报道，该发明在临床上为利用miRNA来诊断和治疗非小细胞肺癌，以及提供药物靶点方面提供了一定的应用价值。

Description

非小细胞肺癌中miR-10a基因的应用

技术领域

本发明涉及一种非小细胞非癌中miRNA基因的应用。

背景技术

微RNA( microRNA , miRNA )功能调控是当前生命科学的重要前沿。微RNA是一类长度为21-22 nt 的非编码RNA分子，其通过转录后基因沉默调控靶基因的活性。通过对miRNA生物学功能及其调控的靶基因的研究表明，miRNA在肿瘤发生过程中起重要作用，miRNA很有可能成为癌症治疗新的途径。miRNA与靶基因mRNA的非编码序列（3′-UTR或 5′-UTR）存在着一对多的关系。miRNA通常是在细胞核内由RNA聚合酶Ⅱ转录，初产物为pri—miRNA，pri—miRNA被核酸酶RNase Ⅲ Drosha和其辅助因子Drasha加工成为发卡型前体miRNA(pre—miRNA)，pre—miRNA被转运蛋白Exportin 5从细胞核输出到细胞质，之后被Dicer酶复合物剪切成为短的miRNA双链，在解旋酶的帮助下miRNA双链被解离，成熟的miRNA和RNA诱导的沉默复合体(RISC)结合。miRNA与RISC的复合体通过碱基配对可与靶基因mRNA 3′- UTR中的互补序列相结合，随即依据miRNA与其靶基因序列的互补性高低，或是抑制蛋白质翻译延伸，或是引发mRNA降解，从而负调控靶基因的表达。

肺癌是导致全球癌症死亡的最主要原因，每年因肺癌死亡的人数超过100万，并且每年新增病例120万。肺腺癌(lung adenocarcinoma)是最常见的癌症，其中约80%的肺癌是非小细胞肺癌(non- small cell lung cancer, NSCLC)，其5年存活率仅为15%，主要原因是缺乏有效的针对肺癌的早期诊断和治疗手段。miRNA通过调控靶基因mRNA的翻译，在肺癌发生、发展及转移发挥重要作用。miRNA可能成为新的肺癌早期诊断和癌症进程相关的标记物，有助于疾病的准确诊断及个性化治疗。这一切设想的实现必须建立在miRNA靶基因功能研究工作的基础上。

发明内容

本发明的目的之一在于提供一种非小细胞肺癌中miR-10a基因在抑制癌细胞的增殖中的应用。

本发明的目的之二在于提供一种miR-10a基因在促进癌细胞的凋亡中的应用。

本发明的目的之三在于提供一种miR-10a基因在下调H1299细胞系中非小细胞肺癌旁组织的表达中应用。

本发明首先分别从正常肺组织和非小细胞肺癌的肺组织中提取RNA。通过反转录构建二者的cDNA 文库，利用solexa测序技术，得到二者的miRNA表达图谱。

第二步，分析得到的数据，鉴定出二者有显著表达差异的miRNA，并从中选择了miR-10a。

第三步，利用qRT-PCR 的技术检测多种非小细胞肺癌细胞系中的miR-10a的表达量变化，并从中选择一种miR-10a表达下调的非小细胞肺癌细胞系，在此细胞系中过表达miR-10a以检测其功能。

第四步，利用流式细胞仪技术和MTS技术，分别检测过表达miR-10a后H1299细胞的凋亡和增殖情况的变化。

第五步，通过Targetscan软件预测miR-10a的靶基因，并将其m RNA的3′-UTR连接pGL-3载体。将miR-10a与重组质粒共转入HEK-293T细胞48h后检测荧光。

第六步，在H1299细胞中过表达miR-10a，检测MAP3K7编码的蛋白含量变化。

H1299细胞系中miR-10a基因通过与其靶基因MAP3K7的mRNA的3′-UTR互补，抑制靶基因mRNA的翻译或直接降解靶基因的mRNA。结合生理生化试验，确定了在H1299细胞系中miR-10a与MAP3K7有相互作用。这种相互作用影响了H1299细胞的增殖、凋亡等生命活动。本实验通过软件预测、solexa测序分析，并构建载体，在HEK293T细胞中利用荧光素酶报告基因分析验证了MAP3K7是miR-10a的靶基因，并在H1299细胞中利用过表达和western-blot的技术，进一步验证了该发现。所公开的为在H1299细胞系中MAP3K7是miR-10a的靶基因的首次报道，该发明在临床上为利用miRNA来诊断和治疗非小细胞肺癌，以及提供药物靶点方面提供了一定的应用价值。

附图说明

图1 solexa测序结果

图2 H1299细胞中miR-10a的相对表达含量

图3 过表达miR-10a后促进H1299细胞凋亡

图4 过表达miR-10a后抑制H1299的增殖

图5 MAP3K7是miR-10a的靶基因。

具体实施方式

下面将结合具体实例进一步阐述本发明。应理解，这些实例仅用于阐述本发明，而不用于限制本发明的范围。下列实例中未注明具体实验条件的实验方法，通常按照分子克隆（Molecular Cloning: A Laboratory Manual,3rd ed.）中所述的条件，或按照制造厂商所建议的条件。

实施例一：根据solexa测序结果，确定miR-10a抑制非小细胞肺癌生长

本发明所用到的k-ras基因突变小鼠肺癌模型(L703T2)和正常肺癌模型(L1805)由中科院生化细胞所季宏斌教授课题组提供。

将正常小鼠的肺组织和患有非小细胞肺癌的小鼠的肺组织取样，用TRIZOL法裂解组织，加入氯仿，待蛋白与核酸分层，离心之后吸取上清并加入异丙醇沉淀。再次离心后以乙醇洗涤沉淀，晾干，获得总RNA。利用TaKaRa公司的反转录试剂盒构建两种组织的cDNA文库，以oligo dt为引物进行反转录，通过变性反应和反转录2步获得后续实验的cDNA。

将样品利用solexa方法测序（Solexa测序由华大基因公司完成），参见图1和图2。

利用得到的数据，分析后发现在非小细胞肺癌肺组织中miR-10a的表达显著的下调，参见表1，说明miR-10a具有抑制非小细胞肺癌的作用。

表1 miR-10a的表达丰度及变化

miRNA	Non-tumor lung tissues	NSCLC	Fold change(Log₂)
				mmu-miR-10a	312223	85674	-1.865647465
mmu-miR-21	156283	2033314	3.701600265
				mmu-miR-184	2548	26900	3.40016899
mmu-miR-29b	1938	10700	2.464970321
				mmu-miR-183	32296	132551	2.037120157
mmu-miR-182	50656	196996	1.95936127
				mmu-miR-200b*	1622	6094	1.90961568
mmu-miR-20a	1748	6261	1.840687916
				mmu-miR-429	5550	19495	1.812544478

实施例二： miR-10a对H1299细胞增殖的影响

非小细胞肺癌细胞株H1299被培养在含有10%胎牛血清的DMEM培养基中。CO₂培养箱中含有5% CO-₂并且湿润，温度为37℃。为了降低细胞密度、试剂用量，转染等因素造成的孔间差异，保证实验的可靠性和重复性，本实验中每个转染样品设置了3个复孔。接种细胞时，每孔接种的细胞数量尽量保持一致，并且细胞在各孔的表面平均分布。

转染步骤如下：

Figure 2012101629990100002DEST_PATH_IMAGE001

转染非小细胞肺癌的前一天，接种适当数量的细胞至培养板中，每孔加入不含抗生素的培养基，使转染时的细胞密度能够达到50%。转染时，细胞密度是影响转染效率的关键因素之一，细胞生长过度会削弱细胞活力，降低细胞的转染效率。

准备mimic-lipo2000混合液：a.稀释miRNA mimic：用50μl不含血清培养基Opti-MEM稀释miRNA mimics，使加入细胞中的终浓度为60nmol/L轻轻混匀，室温孵育5min;b.稀释lipo2000：用50μl不含血清的Opti-MEM稀释1μl lipo2000，轻轻混匀并室温孵育5min；c.将a与b轻轻混匀，室温孵育20min。注意：稀释好的lipo2000长时间放置可能导致转染试剂活性的降低，应尽量在25min之内与稀释好的mimics混合。在混合试剂时，不能剧烈吹打或震荡，手指轻弹管壁即可，过度用力可能会破坏脂质体的结构和miRNA-mimics-lipo2000混合物的形成。

Figure 2012101629990100002DEST_PATH_IMAGE003

将miRNA-mimics-lipo2000混合液加入含有细胞及培养液的培养孔中，轻轻混匀；

将培养板置于37℃的CO₂培养箱中36h。培养4h后，将孔里含有mimics-lipo2000混合液的培养基移去，更换新鲜培养基。

本实验采用Promega公司的MTS分析试剂盒。该试剂盒包含两种新型溶液，一种是四唑化合物[3-(4,5-dimethylthiazol-2-yl)-5-(3-carboxymethoxyphenyl)-2-(4-sulfophenyl)-2H-tetrazolium, 内盐；MTS]，另一种是电子耦合试剂PMS( 吩嗪硫酸甲酯)。MTS 可被生物还原为甲，后者可溶于组织培养基。甲在490nm的吸光度可直接在96孔板读出，而无需额外处理。MTS到水溶性甲的转化由脱氢酶催化，而后者存在于有代谢活性的活细胞中。由490nm 处吸光度确定的甲的量直接与培养物中活细胞的数量成正比。

将H1299细胞均匀的铺在96孔板中，使用的培养基为1640。24h后将miR-10a的mimics通过lipo 2000为转染试剂，通过无血清培养液的共孵育后转入H1299细胞中，转染6小时后换掉细胞培养液，放入新鲜的培养液。转染36h后，开始用MTS法检测细胞的活力，每隔24h测量一次，检测波长为490nm。

检验发现，转染组对比对照组的吸光度有显著的下降，也即转染了miR-10a的细胞的增殖速度显著低于对照组，说明miR-10a具有抑制H1299细胞增殖的作用。参见图4。

实施例三： miR-10a对H1299细胞凋亡的影响

荧光染料碘化丙啶(PI)是一种可对DNA染色的细胞核染色剂，常用于细胞凋亡检测。PI是一种溴化乙锭的类似物，在嵌入双链DNA后释放红色荧光。PI不能穿过活细胞膜，却能穿过破损的细胞膜而对核染色。AnnexinV是一种检测细胞凋亡的试剂，在正常的细胞中，磷脂酰丝氨酸只分布在细胞膜脂双层内侧，细胞发生凋亡早期，膜磷脂酰丝氨酸由脂膜内侧翻向外侧。AnnexinV作为一种磷脂结合蛋白，与磷脂酰丝氨酸有高度亲和力，它通过细胞外侧暴露的磷脂酰丝氨酸与凋亡早期细胞的胞膜结合。将AnnexinV与PI匹配使用，可以将凋亡早期的细胞和晚期的细胞以及死细胞区分开来。

将H1299细胞均匀的铺在96孔板中，24h后将miR-10a的mimics通过lipo 2000与无血清培养液共孵育后转入H1299细胞中，转染6小时后换掉细胞培养液为新鲜培养液。转染36h后，将收集到的细胞用annexin V-fluorescein isothiocyanate (FITC) 凋亡检测试剂盒（Sigma-Aldrich, USA）染色细胞。用流式细胞技术检测H1299细胞的凋亡情况。结果证明，转染了miR-10a的H1299细胞凋亡率显著大于对照组。参见图3。

实施例四：双荧光素酶报告基因分析

人胚肾细胞HEK-293T被培养在含有10%胎牛血清的DMEM培养基中。CO₂培养箱中含有5% CO-₂并且湿润，温度为37℃。人胚肾细胞HEK-293T购自中科院生化细胞所细胞库。

细胞转染所用的转染试剂为lipo2000(Invitrogen)。为了降低细胞密度、试剂用量，转染等因素造成的孔间差异，保证实验的可靠性和重复性，本实验中每个转染样品设置了3个复孔。接种细胞时，每孔接种的细胞数量尽量保持一致，并且细胞在各孔的表面平均分布。

用来检测的仪器为Bio-Rad公司的iQ5系统，试剂为TaKaRa公司的SYBR Green Mix。这种试剂里面含有Taq DNA聚合酶，dNTP mix，SYBR Green dye。U6用来作为内参基因。本实验所用到的引物为：miR-10a引物 Forward： 5′-TACCCTGTAGATCCGAATTTGTG-3′，Reverse：为Uni-miR qPCR primer；U6引物为Forward：5′-CTCGCTTCGGCAGCACA- 3′Reverse: 5′-AACGCTTCACGAATTTGCGT-3′。细胞总RNA的提取采用生工生物公司的Trizol试剂。具体提取步骤如下：

直接在培养板中加入Total RNA Extractor裂解细胞，每10cm²面积加1ml TotalRNA Extractor，用移液器吹打混匀。

将裂解后样品或匀浆液室温放置 5-10min，使得核蛋白与核酸完全分离。

加入0.2ml 氯仿，剧烈振荡15sec，室温放置3min。12,000rpm 4℃离心10min。

吸取水相转移至干净的离心管中，加入等体积异丙醇，混匀，室温放置20min。

Figure 2012101629990100002DEST_PATH_IMAGE005

12,000 rpm 4℃ 离心10 min，弃上清。

加入1ml 75%乙醇洗涤沉淀。12,000 rpm 4℃ 离心3min，弃上清。室温干燥5-10 min。

Figure 2012101629990100002DEST_PATH_IMAGE007

加入30-50 μl RNase-free ddH₂O，充分溶解RNA。将所得到的RNA溶液置于-70℃保存或用于后续试验。

反转录PCR采用Takara公司 One Step PrimeScript miRNA cDNA Synthesis Kit。由于miRNA与mRNA不同，miRNA不具有Poly(A)结构，但在本转录试剂盒中可以同时对样品中的miRNA以及它的small noncoding RNA进行Poly(A)加尾反应，然后利用Universal Adaptor Primer将经过加尾的RNA以及mRNA进行反转录反应得到的cDNA，并引入了Uni-miR qPCR Primer的结合位点，利用这一位置可以对样品中任何cDNA进行定量PCR反应。

通过查找NCBI数据库，查找到MAP3K7基因的mRNA序列，进而查找到该mRNA的3′-UTR序列。查找TargetScan数据库，发现在该mRNA的3′-UTR序列的603-610位点上含有miR-10a种子序列的结合位点。设计引物，进行PCR，将该位点包含在内。引物为Forward: 5′-CTAGTCTAGACAGCAGCAGAAACGACAA-3′ Reverse: 5′-CCGGAATTCCATCAAAGCCCTTACACG-3′。该引物引入了Xba I和EcoR I两个酶切位点。产物的退火温度为50℃，长度为570bp。

将MAP3K7mRNA的3′-UTR（570bp）连接在pGL-3质粒上，该质粒上含有SV40的启动子，连接上的3′-UTR包含了miR-10a与MAP3K7的结合位点。用lipo 2000转染试剂把miR-10a的mimics与构建好的质粒共转入HEK-293T细胞中，并同时转入pRL质粒作为背景信号，在转染6h后更换培养液为新鲜培养液，转染48h后，用Promega公司的双荧光素酶报告基因分析试剂盒检测pGL和pRL的荧光表达。转染的质粒的终浓度为400nmol/L，mimics的终浓度为60nmol/L。结果发现，转染了miR-10a的HEK-293T细胞中双荧光素酶的表达显著低于对照组，说明MAP3K7是miR-10a的靶基因。参见图5。

实施例五：western-blot验证miR-10a对H1299细胞内源MAP3K7基因的抑制作用

非小细胞肺癌细胞株H1299被培养在含有10%胎牛血清的DMEM培养基中。CO₂培养箱中含有5% CO-₂并且湿润，温度为37℃。A549和SPC-A-1购自中科院生化细胞所细胞库，H1299细胞购自ATCC。

将单层贴壁细胞吸掉培养液，用PBS清洗两遍。按每1ml裂解液加10μlPMSF，摇匀置于冰上。每瓶细胞加入200μl含PMSF的裂解液，于冰上裂解30min。裂解完后，用干净的刮棒刮拭培养瓶的一侧，在4℃下12000rpm离心5min。本实验采用12%SDS-PAGE胶进行蛋白电泳后，将蛋白转移到硝酸纤维素膜上。转膜缓冲液和膜清洗液的配制均参照分子克隆。MAP3K7蛋白的抗体按照1:800稀释，GAPDH蛋白的抗体按照1:1000稀释。所采用的二抗带有HRP标记，按照1:10000稀释。

将H1299细胞均匀的铺在96孔板中，24h后将miR-10a的mimics通过与Lipo 2000及无血清培养液的共孵育转入H1299细胞中，转染6h后换掉细胞培养液。转染36h后，收集、裂解细胞，并定量各样品中的蛋白含量。定量蛋白采用Lowry法。用MAP3K7的抗体来检测样品中MAP3K7基因编码的蛋白含量。该抗体为Abcam公司生产。结果显示转染了miR-10a的H1299细胞中MAP3K7基因编码的蛋白含量显著低于对照组。说明在H1299细胞中MAP3K7是miR-10a的靶基因。

尽管本发明描述了具体的例子，但是有一点对于本领域技术人员来说是明显的，即在不脱离本发明的精神和范围的前提下可对本发明作各种变化和改动。因此，所附权利要求覆盖了所有这些在本发明范围内的变动。

Claims

1.一种非小细胞肺癌中miR-10a基因在抑制癌细胞的增殖中的应用。

2.一种非小细胞肺癌中miR-10a基因在促进癌细胞的凋亡中的应用。

3.一种非小细胞肺癌中miR-10a基因在下调H1299细胞系中非小细胞肺癌旁组织的表达中应用。