CN108841864A - 一种利用rna干扰机制的分子传感器 - Google Patents
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Abstract
本发明提供了一种利用RNA干扰机制的分子传感器,所述分子传感器包括以下几个部分:1.核酸酶缺陷型CRISPR‑Cas9蛋白;2.前体合成引导RNA(pre‑sgRNA),所述前体合成引导RNA含有与目标miRNA或siRNA完全互补的序列以及合成引导RNA(sgRNA)的序列;3.报告基因;所述分子传感器用于检测细胞内目标miRNA或siRNA的表达活性。
Description
技术领域
本发明涉及分子生物学领域,具体而言涉及一种利用RNA干扰机制的分子传感器。
背景技术
RNA干扰机制
RNA干扰(RNA interference,RNAi)是指由单链或双链RNA(double-strandedRNA, dsRNA)诱发的同源mRNA高效特异性降解的现象。RNAi具有如下特征:1)RNAi是转录后水平的基因沉默机制;2)RNAi具有很高的特异性,只降解与之序列相应的单个内源基因的mRNA;3)RNAi抑制基因表达具有很高的效率,表型可以达到缺失突变体表型的程度,而且相对很少量的dsRNA分子(数量远远少于内源mRNA的数量)就能完全抑制相应基因的表达,是以催化放大的方式进行的;4)RNAi抑制基因表达的效应可以穿过细胞界限,在不同细胞间长距离传递和维持信号甚至传播至整个有机体以及可遗传等特点;5)dsRNA不得短于21个碱基,并且长链dsRNA也在细胞内被Dicer酶切割为21bp左右的siRNA,并由siRNA来介导mRNA切割。而且大于30bp的dsRNA不能在哺乳动物中诱导特异的RNA干扰,而是细胞非特异性和全面的基因表达受抑和凋亡;6)ATP依赖性:在去除ATP的样品中RNA干扰现象降低或消失显示RNA干扰是一个ATP依赖的过程。可能是Dicer和RISC的酶切反应必须由ATP提供能量。
小干扰RNA(SiRNA)
病毒基因、人工转入基因、转座子等外源性基因随机整合到宿主细胞基因组内,并利用宿主细胞进行转录时,常产生一些dsRNA。宿主细胞对这些dsRNA迅即产生反应,其胞质中的核酸内切酶Dicer将dsRNA切割成多个具有特定长度和结构的小片段RNA (大约21~23bp),即siRNA(小干扰RNA,small interfering RNA)。siRNA在细胞内 RNA解旋酶的作用下解链成正义链和反义链,继之由反义siRNA再与体内一些酶(包括内切酶、外切酶、解旋酶等)结合形成RNA诱导的沉默复合物(RNA-induced silencing complex,RISC)。RISC与外源性基因表达的mRNA的同源区进行特异性结合,RISC具有核酸酶的功能,在结合部位切割mRNA,切割位点即是与siRNA中反义链互补结合的两端。被切割后的断裂mRNA随即降解,从而诱发宿主细胞针对这些mRNA的降解反应。siRNA不仅能引导RISC切割同源单链mRNA,而且可作为引物与靶RNA结合并在 RNA聚合酶(RNA-dependent RNA polymerase,RdRP)作用下合成更多新的dsRNA,新合成的dsRNA再由Dicer切割产生大量的次级siRNA,从而使RNAi的作用进一步放大,最终将靶mRNA完全降解。
siRNA通常作为RNAi的工具被人工合成,但是后来发现很多生物包括线虫还有人类一些特殊的细胞也会合成内源性siRNA,以用于基因表达的调控。
微小RNA(miRNA)
微小RNA(microRNA,miRNA)是一类长度为20-25个核苷酸的非编码小RNA,可以在转录后水平调控基因表达。miRBase数据库最新预测结果显示,人类基因组可能表达2656种miRNA,这些miRNA广泛分布在人体各种组织和器官中。大部分组织和器官都具有专一的miRNA表达谱。
掌握各种miRNA在不同组织中的表达谱,对于理解相关组织的发育和疾病形成至关重要。2016年Nicole Ludiwig和他的同事利用芯片技术检测了1997种miRNA在两具男性尸体61种组织样本中的表达量。最后他们只检测到1364种miRNA至少在其中一种组织中表达,有143种miRNA在每种组织中都表达。他们利用组织特异指数TSI(tissue specificityindex)来定义miRNA的分布情况。当某个miRNA在每种组织中都表达,那么TSI定义为0,如果这个miRNA只在一种组织中特异表达,那么它的TSI则为1。大部分(82.9%)的miRNA TSI在分布0.5到0.85之间,表明miRNA具有很高的组织特异性。
某些miRNA在特定组织中表达量极高。例如,miR-122在成体每个肝脏细胞中的表达量高达66000个分子,是组织中表达量最高的miRNA。miR-7和miR-375以及miR-141 和miR-200a在脑下垂体中特异表达,miR-142,miR-144,miR-150,miR-155和miR-223 在造血细胞中特异表达。miR-144在血管和脾脏中表达量最高,在甲状腺中也有较高表达的量,而在甲状腺乳头癌中降低。另外miR-1-3p,miR-133a-3p,miR-133b在心肌和肌肉中特异表达。这些miRNA在肌肉发育中调控关键的基因。miR-338-3p,miR-219-5p, miR-124-3p和miR-9-5p在脑组织中特异表达。miR-507,miR-514a-3p和miR-509-5p只在睾丸中表达。而miR-205-5p只在皮肤中表达,其表达量在生黑色素细胞中最高,随着黑色素瘤的形成下降。
另外,鉴定组织特异表达的miRNA可以作为某种疾病在血液中的生物标记物。例如药物导致的肝脏损伤,脂肪肝,乙肝和丙肝的感染以及肝癌都会导致血清中肝脏特异的miR-122表达量的上升。血清中miR-1,miR-206和miR-133a/b的上升,可以作为心脏衰竭以及不同肌肉萎缩症状的生物标记物。另外跑完半程马拉松也会导致血液中这些miRNA上升。
各种miRNA对基因表达的影响主要在转录后水平。miRNA与其靶mRNA之间的部分互补导致靶mRNA的去稳定化和/或翻译抑制,而miRNA与其靶mRNA之间的完全或接近完全互补导致靶mRNA在特定位置处的切割。许多miRNA只在特定组织,细胞类型和发育或疾病阶段表达。因此,miRNA谱已被成功用于表征人类肿瘤的发育谱系和分化状态,并且在很多情况下,miRNA谱比mRNA谱更准确和翔实。另外,在疾病的分化或进展过程中,miRNA表达常常动态改变。
综上所述,siRNA和miRNA表达活性的检测对于跟踪干细胞的分化状态和疾病进展具有重大意义。然而,由于siRNA和miRNA对基因表达的抑制性质,可被siRNA或 miRNA激活从而表征siRNA或miRNA活性的报告物目前仍然是生物技术领域中的空白。
发明内容
本发明人利用miRNA介导的sgRNA释放策略创建了本发明的MICR-ON平台系统,该平台系统可以被特定的内源或外源miRNA/siRNA打开从而激活报告基因的表达,从而使得表征细胞内表征siRNA或miRNA的活性。
据此,本发明提供了一种利用RNA干扰机制的分子传感器,所述分子传感器包括以下几个部分:
1.核酸酶缺陷型CRISPR-Cas9蛋白;
2.前体合成引导RNA(pre-sgRNA),所述前体合成引导RNA含有与目标miRNA 或siRNA完全互补的序列以及合成引导RNA(sgRNA)的序列;
3.报告基因;
所述分子传感器用于检测细胞内目标miRNA或siRNA的表达活性。
在本发明的一个具体实施方案中,所述核酸酶缺陷型CRISPR-Cas9蛋白与转录激活因子相连接。
在本发明的一个具体实施方案中,所述转录激活因子为VP64、p65和Rta中的一种或多种。
在本发明的另一个具体实施方案中,所述前体合成引导RNA仅在合成引导RNA(sgRNA)序列的一端含有与目标miRNA或siRNA完全互补的序列。
在本发明的另一个具体实施方案中,所述前体合成引导RNA在合成引导RNA(sgRNA)的序列两端均含有与目标miRNA或siRNA完全互补的序列。
在本发明的另一个具体实施方案中,所述前体合成引导RNA在合成引导RNA(sgRNA)的序列两端含有的与目标miRNA或siRNA完全互补的序列是相同的序列。
在本发明的另一个具体实施方案中,所述前体合成引导RNA在合成引导RNA(sgRNA)的序列两端含有的与目标miRNA或siRNA完全互补的序列是不同的序列。
在本发明的另一个具体实施方案中,所述前体合成引导RNA在合成引导RNA的序列两端含有与一个或多个目标miRNA或siRNA完全互补的序列。
在本发明的另一个具体实施方案中,所述合成引导RNA含有与所述报告基因的启动子或转录起始位点的一段序列互补的序列,以使得所述sgRNA可以将所述核酸酶缺陷型CRISPR-Cas9蛋白引导至所述报告基因的启动子或转录起始位点的位置。
在本发明的另一个具体实施方案中,所述报告基因为红色荧光蛋白(RFP)或绿色荧光蛋白(GFP)基因。
在本发明的另一个具体实施方案中,所述报告基因为内源基因。
在本发明的另一方面,还提供了一种检测细胞内目标miRNA或siRNA的表达活性的方法,所述方法包括以下步骤:
(1)根据待检测的miRNA或siRNA的序列与所使用的报告基因,构建前体合成引导RNA,所述前体合成引导RNA含有与目标miRNA或siRNA完全互补的序列以及合成引导RNA的序列;
(2)将步骤(1)中构建的前体合成引导RNA和核酸酶缺陷型CRISPR-Cas9蛋白引入待测细胞中,如果需要的话,将报告基因也引入待测细胞中;
(3)检测所述报告基因的表达,以确定待测细胞中待检测miRNA或siRNA的表达活性。
本发明提供的分子传感器通过利用RNA干扰机制和CRISPR-Cas9系统相结合,将原本对基因表达起抑制作用的miRNA和/或siRNA转变为激活基因表达的信号,从而有效地实现了细胞内miRNA和/或siRNA表达的检测,不但可以用于跟踪干细胞的分化状态,也可以用于一些特定疾病和人体状态的表征。RNA干扰机制与常规RNA检测手段相比,具有极高的灵敏度和特异性。因此本发明的系统和方法具有重大的实际意义和广泛的应用前景。
附图说明
参考随附的附图,本发明更多的目的、功能和优点将通过本发明实施方式的如下描述得以阐明,其中:
图1为将响应miR-294表达的MICR-ON系统转染入野生型胚胎干细胞和Dgcr8-/-胚胎干细胞的对比,图中所示为代表性的显微图像。比例尺:200微米。
图2显示的是将不同剂量的miR-294模拟物注入响应miR-294表达的Dgcr8-/-胚胎干细胞的报告基因表达,图2左侧为显示代表性的显微图像。比例尺:100微米。图2 右侧为平均荧光强度与miRNA模拟物拷贝数的作图。显示的是平均值±SD,n=3。
图3为将不同的miRNA模拟物注入响应miR-294表达的Dgcr8-/-胚胎干细胞的报告基因表达。
图4为本发明的MICR-ON系统在siRNA诱导后激活报告基因的表达。图4a:在响应siHNRNPA0表达的HEK293T细胞中的RFP表达。上方:具有代表性的显微图像。下方:相对荧光强度,数据相对于阴性对照进行标准化。显示的是平均值±SD,n=3。比例尺:200μm。图4b:在响应siPABPC1表达的HEK293T细胞中的RFP表达。上方:具有代表性的显微图像。下方:相对荧光强度,数据相对于阴性对照进行标准化。显示的是平均值±SD,n=3。比例尺:200μm。
图5显示的是本发明的MICR-ON系统在胚胎干细胞分化过程中响应miNRA-294表达的下降而下调。图5a显示随着胚胎干细胞的分化,miRNA-294的表达量下降。图5b 显示本发明的MICR-ON系统激活报告基因的表达量随着miRNA-294表达量的下降而下调。比例尺:100μm。
图6显示的是本发明的MICR-ON系统在C2C12细胞分化过程中响应miNRA-1表达的增加而上调。图6a显示随着C2C12细胞分化为骨骼肌细胞,miRNA-1的表达量增加。图6b显示本发明的MICR-ON系统激活报告基因的表达量随着miRNA-1表达量的增加而上调。比例尺:200μm。
图7显示的是不同的细胞群体中miR-1表达与RFP荧光强度之间的相关性。图7a 显示了通过定量RT-PCR测定的不同细胞群中的miRNA-1的相对表达量。图7b显示了 miRNA-1的相对表达量与平均荧光强度之间的相关性,皮尔逊相关系数R=0.96。
图8显示的是使用本发明的MICR系统检测两种miRNA同时表达的情况。图左侧为代表性显微图像,比例尺:200μm;图右侧为相对荧光强度。数据相对于阴性对照进行标准化。显示的是平均值±SD,n=3。
图9显示的是使用本发明的MICR系统检测两种miRNA任一表达的情况。图左侧为代表性显微图像,比例尺:200μm;图右侧为相对荧光强度。数据相对于阴性对照进行标准化。显示的是平均值±SD,n=3。
图10为检测本发明的MICR-ON系统在被细胞特异性miRNA诱导后激活内源基因表达的情况。通过TTN的qRT-PCR进行检测。GAPDH基因被用作对照。用对照质粒和阴性对照miRNA模拟物转染的HEK293T细胞的mRNA水平作为阴性对照,对数据进行标准化。显示的是平均值±SD,n=3。
具体实施方式
CRISPR-Cas9系统
CRISPR全称是clustered regularly interspaced short palindromicrepeats,中文译作周期间隔短回文重复序列簇,是一类发现于细菌和古细菌中的基因组序列。Cas9全称是 CRISPR-associated protein 9,属于一类核酸酶,Cas蛋白最初于2005-2006年左右被鉴定发现。此后几年(2007-2011)的一系列研究逐渐揭示CRISPR/Cas系统作为细菌和古细菌免疫系统对抗病毒侵染的机制:研究发现CRISPR序列实际上来源于侵入细菌的质粒或者病毒DNA,并且CRISPR序列可以被转录并加工产生短的RNA,这些RNA片段与Cas蛋白结合起到对抗病毒的作用,因此这些RNA被称为cas related RNA,简称crRNA。后来又发现细菌需要同时表达另外一种RNA来激活Cas蛋白的活性,即tracrRNA (trans-activation Cas related RNA,反式激活crRNA)。最终在2012年的研究中证明Cas9 可以和tracrRNA、crRNA结合,切割质粒DNA;研究同时发现tracrRNA和crRNA可以被串联成一条RNA,即sgRNA。至此,CRISPR/Cas9系统作为基因编辑工具的条件已经具备,并在2013年被成功应用在哺乳动物的基因编辑上,CRISPR-Cas9时代正式开始。
CRISPR-Cas9系统是目前应用最为广泛的基因编辑系统。这个系统主要由两部分构成:Cas9和sgRNA。Cas9为核酸酶,可以切割DNA,造成双链断裂(double strand break,DSB);sgRNA全称为合成引导RNA(synthetic guide RNA),当Cas9和sgRNA结合以后,sgRNA可以激活并引导Cas9蛋白定位到基因组特定位点,由此启动Cas9的基因编辑或调控活性。
由于Cas9包含两个相对独立的功能区域,结合DNA的结构域和切割DNA的结构域。将Cas9的切割DNA活性的结构域突变使其失活后并不会影响Cas9结合DNA的能力,这种Cas9称之为dead Cas9,简写为dCas9。而将其他具有基因调控功能的蛋白与 dCas9融合表达后可以赋予dCas9相应的基因调控功能。例如,将VP64、p65和Rta(简称VPR)3种转录激活因子采用串联的形式与dCas9融合表达后(即 dCas9-VP64-P65-Rta,简写为dCas9-VPR),可以用与激活与dCas9结合的目标基因的表达水平,而不会造成基因突变。
sgRNA:sgRNA是一类基于细菌CRISPR系统、人为自主设计的介导Cas9或者dCas9靶向结合目标DNA的嵌合RNA分子。这类RNA含有一个发卡结构,模拟了细菌中 tracrRNA-crRNA复合物结构,用于将Cas9或者dCas9蛋白引导至目标基因位点。本发明中使用的是基于酿脓链球菌(Streptococcus pyogenes)的改造过的sgRNA,包含有三个部分:分别是人为自主设计的长度为20个核苷酸的与报告基因的启动子的一段序列互补的部分,长度为40个核苷酸左右的dCas9结合序列,以及长度为40个核苷酸左右的细菌来源的稳定区域。由于该合成引导RNA(sgRNA)含有人为自主设计的与目标基因的启动子的一段序列互补配对的序列,可以与报告基因的启动子相结合,从而将Cas9或 dCas9蛋白引导至报告基因的启动子位置,所以它被称为合成引导RNA(sgRNA)。在通常的应用中,一般使用U6启动子来表达sgRNA。这种启动子通过III型RNA聚合酶转录产生有活性的sgRNA。而本发明中使用II型RNA聚合酶的启动子进行转录,那么转录出来的sgRNA由于含有5’帽子和3’多聚核苷酸尾巴(PolyA),不能够发挥功能,因此被称为无活性sgRNA。需要通过设计去掉5’帽子和3’PolyA才能够将其转变为有活性的 sgRNA。
MICR-ON平台
本发明人建立了一种可被miRNA诱导的CRISPR-Cas9激活基因表达的实验平台系统(miRNA-inducible CRISPR-Cas9express-on platform,简称为MICR-ON平台),也就是本发明所述的分子传感器,该平台包括以下三个主要部分:1.核酸酶缺陷型 CRISPR-Cas9蛋白,即dCas9蛋白;2.前体合成引导RNA(pre-sgRNA),所述前体合成引导RNA含有与目标miRNA或siRNA完全互补的序列以及合成引导RNA(sgRNA) 的序列;3.报告基因。该平台可以有效地用于检测细胞内目标miRNA或siRNA的表达活性。
在本发明的一个具体实施方案中,所使用的报告基因是红色荧光蛋白,该红色荧光蛋白基因被该基因上游的启动子控制表达。因此可设计与该上游启动子序列互补的sgRNA序列,并在该sgRNA序列的一端或两端连接与目标miRNA或siRNA序列完全互补的RNA序列,这个就是所述的前体合成引导RNA(pre-sgRNA,在本发明中也表示为 miRT-sgRNA-miRT,miRT表示与目标miRNA完全互补的序列),在pre-sgRNA的两端分别有5’帽子和3’PolyA,使得该pre-sgRNA处于无活性的状态。同时,将dCas9蛋白与转录激活因子相连接以增强其转录活性。在本发明的另一个具体实施方案中,所述合成引导RNA含有与所述报告基因的转录起始位点的一段序列互补的序列,以使得所述 sgRNA可以将所述核酸酶缺陷型CRISPR-Cas9蛋白引导至所述报告基因的转录起始位点的位置。
将该平台导入目标细胞后,如果该目标细胞中没有目标miRNA的表达,则整个系统处于未被激活的状态,报告基因也不会表达。如果该目标细胞中表达目标miRNA或 siRNA,则该目标miRNA或siRNA就会与pre-sgRNA两端的与其完全互补的RNA序列相结合,从而启动RNA干扰机制而导致该完全互补RNA序列被降解。而该完全互补RNA 序列的降解则导致sgRNA与其两端的5’帽子和3’PolyA相脱离从而具有引导活性。有活性的sgRNA就会将dCas9蛋白引导至报告基因上游的启动子或转录起始位点的位置,使得dCas9蛋白与该启动子或转录起始位点相结合。在结合之后,dCas9蛋白上携带的转录激活因子就驱动了报告基因的表达。以上过程就是本发明的主要原理。
在本发明的具体实施方案中,所述报告基因可以是红色荧光蛋白、绿色荧光蛋白或内源基因等各种可检测其表达的基因。
在本发明的具体实施方案中,所述报告基因的启动子可以是能够驱动报告基因表达的各种启动子,例如为VP64、p65和Rta中的一种或多种。
在本发明的具体实施方案中,dCas9蛋白所携带的转录激活因子可以是各种本领域技术人员已知的转录激活因子。
在本发明的具体实施方案中,与目标miRNA或siRNA完全互补的RNA序列可以存在于所述sgRNA的一端或两端。
在本发明的具体实施方案中,存在于所述sgRNA两端的与目标miRNA或siRNA 完全互补的RNA序列可以相同或不同,即该完全互补的RNA序列可以针对于相同或不同的miRNA或siRNA。
在本发明的另一个具体实施方案中,所述前体合成引导RNA在合成引导RNA的序列两端含有与一个或多个目标miRNA或siRNA完全互补的序列,这样使得本发明的分子传感器可以被一个或多个目标miRNA或siRNA信号所激活。
同样的,在本发明的另一方面,还提供了一种检测细胞内目标miRNA或siRNA的表达活性的方法,所述方法包括以下步骤:
(1)根据待检测的miRNA或siRNA的序列与所使用的报告基因,构建前体合成引导RNA,所述前体合成引导RNA含有与目标miRNA或siRNA完全互补的序列以及合成引导RNA的序列;
(2)将步骤(1)中构建的前体合成引导RNA和核酸酶缺陷型CRISPR-Cas9蛋白引入待测细胞中,如果需要的话,将报告基因也引入待测细胞中;
(3)检测所述报告基因的表达,以确定待测细胞中待检测miRNA或siRNA的表达活性。
本发明提供的分子传感器即MICR-ON平台系统通过利用RNA干扰机制和 CRISPR-Cas9系统相结合,将原本对基因表达起抑制作用的miRNA和/或siRNA转变为激活基因表达的信号,从而有效地实现了细胞内miRNA和/或siRNA表达的检测,不但可以用于跟踪干细胞的分化状态,也可以用于一些特定疾病和人体状态的表征。因此具有重大的实际意义和广泛的应用前景。
术语和缩写
在本说明书中使用了一些术语和缩写,其含义如下所述,未特别说明的术语和缩写具有本领域技术人员公知的含义。
RNAi:RNA干扰(RNA interference);
SiRNA:小干扰RNA(small interfering RNA);
miRNA:微小RNA(microRNA);
miR:各种miRNA的缩写,通常后面跟有数字及字母编号以表示其命名,各种miR 的编号及其序列在本领域中都是公知的;
miRT:表示与目标miRNA或siRNA完全互补的序列;
sgRNA:合成引导RNA(synthetic guide RNA);
pre-sgRNA:前体合成引导RNA,含有与目标miRNA或siRNA完全互补的序列以及sgRNA的序列,亦可表示为miRT-sgRNA或者miRT-sgRNA-miRT;
CRISPR:周期间隔短回文重复序列簇(clustered regularly interspaced shortpalindromic repeats);
Cas9:周期间隔短回文重复序列簇相关蛋白9(CRISPR-associated protein 9);
dCas9:核酸酶缺陷型Cas9,由于其核酸酶活性区域被突变,从而丧失了DNA切割活性而仅保留了DNA结合活性;
MICR-ON:可被miRNA诱导的CRISPR-Cas9激活基因表达的平台系统 (miRNA-inducible CRISPR-Cas9express-on platform);
RFP:红色荧光蛋白(red fluorescent protein);
GFP:绿色荧光蛋白(green fluorescent protein);
TRE3G-RFP:由具有TRE3G元件的上游CMV小启动子控制的红色荧光蛋白基因;
dCas9-VPR:将VP64、p65和Rta(简称VPR)3种转录激活因子采用串联的形式与dCas9连接的产物。
通过下面的参考示范性实施例以及附图,本发明的目的和功能以及用于实现这些目的和功能的方法将得以阐明。然而,本发明并不受限于以下所公开的示范性实施例;可以通过不同形式来对其加以实现。说明书的实质仅仅是帮助相关领域技术人员综合理解本发明的具体细节。
实施例1
材料和方法
质粒和载体的构建
将dCas9-VPR连接于含有由PGK启动子驱动的潮霉素抗性基因的piggyBac载体中,所述dCas9-VPR由CAGGS启动子驱动。将pre-sgRNA(两端含有与目标miRNA或 siRNA完全互补的RNA序列的sgRNA序列,简称为miRT-sgRNA-miRT)连接于含有由 PGK启动子驱动的博来霉素(zeocin)抗性基因的piggyBac载体中,所述pre-sgRNA也由CAGGS启动子驱动。将由具有TRE3G元件的上游CMV小启动子控制的红色荧光蛋白(RFP)连接于具有杀稻瘟菌素抗性基因的piggyBac载体中。为了制备对目标miRNA 或siRNA敏感的miRT-sgRNA-miRT构建体,使用Fastpfu聚合酶(Transgene公司),以含有sgRNA的质粒为模板(所述sgRNA含有与TRE3G元件的一段序列互补的序列),用与miRT相对应的引物进行PCR。PCR产物与EcoRI-HF(20U,NEB公司)和BamHI-HF (20U,NEB公司)在37℃下孵育2h,用旋转柱(Magen公司)纯化,并用T4连接酶 (Life Technology公司)连接到经过EcoRI和BamHI消化的piggyBac载体上。
细胞培养,质粒转染和小RNA转染
如前人所报道的方法,在明胶或辐照的小鼠成纤维细胞上培养野生型的和Dgcr8-/- 胚胎干细胞(ESC)。在添加有10%FBS(PANSera公司)的高糖DMEM培养基(Gibco公司)上,以5%CO2和37℃的条件培养HEK293T和HeLa细胞。在添加有10%FBS (PANSera)的DMEM/F-12培养基(Gibco公司)上,以5%CO2和37℃的条件培养C2C12 成肌细胞。
为了产生能响应miR-294(目标miRNA)表达的胚胎干细胞,使用Lipofectamine3000 转染试剂盒(Life Technology公司)将上述制备的含有dCas9-VPR,TRE3G-RFP和pre-sgRNA的质粒与PBase表达质粒一起共转染胚胎干细胞。转染后,用10μg/ml杀稻瘟菌素S(Gibco公司),150μg/ml潮霉素(Roche公司)和100μg/ml博来霉素(Invitrogen 公司)处理细胞4天。之后,用trizol试剂盒提取细胞的RNA,或者将细胞以单细胞密度铺板以供集落挑取。对于单细胞密度铺板,使用含有100nM全反式维甲酸以及不含LIF 的ESC培养基在明胶化平板上培养所述胚胎干细胞。
为了产生能响应miR-1(另一种目标miRNA)表达的C2C12细胞,使用Lipofectamine3000转染试剂盒(Life Technology公司)将实施例1中制备的含有dCas9-VPR,TRE3G-RFP和pre-sgRNA的质粒与PBase表达质粒一起共转染C2C12细胞。转染后,用10μg/ml 杀稻瘟菌素S(Gibco公司),300μg/ml潮霉素(Roche公司)和500μg/ml博来霉素 (Invitrogen公司)处理细胞一周。在筛选后,将单细胞分选到96孔板中以生长菌落。为了诱导C2C12细胞分化,首先使细胞生长至约100%汇合,随后更换为分化培养基 (DMEM/F-12,含4μg/ml转铁蛋白,30nM亚硒酸钠,1μg/ml维生素E,0.5μg/ml 乙醇胺,0.5μg/ml胰岛素,100μg/ml BSA)。用Trizol试剂盒提取分化的肌管细胞的总RNA,用于miRNA qRT-PCR。对于细胞分选,诱导4天后,使用FACSAria II型细胞分选仪(BD Biosciences公司)分选细胞。将分选的细胞用Trizol试剂盒提取总RNA,用于miRNA qRT-PCR。
对于siRNA活化实验,将HEK293T细胞以50,000个细胞/孔的密度接种于聚-D-赖氨酸包被的48孔板(Sigma-Aldrich公司)中。18小时后,用20nM终浓度的siRNA或阴性对照物转染细胞。6小时后,用含有100ng dCas9-VPR,50ng TRE3G-RFP和100ng pre-sgRNA的质粒转染细胞,并同时用空质粒转染细胞设为阴性对照。转染后48小时,收集细胞进行流式细胞术分析。
对于“和”和“或”操纵子试验,将HEK293T细胞以30,000个细胞/孔的密度接种于聚-D-赖氨酸包被的48孔板(Sigma-Aldrich公司)中。18小时后,用20nM终浓度的miRNA 模拟物或阴性对照物转染细胞。6小时后,用含有100ng dCas9-VPR,50ng TRE3G-RFP 和100ngpre-sgRNA的质粒转染细胞。转染后48小时,收获细胞进行流式细胞术分析。
对于内源基因活化实验,将HEK293T细胞以50,000个细胞/孔的密度接种于聚-D-赖氨酸包被的48孔板(Sigma-Aldrich公司)中。18小时后,用20nM终浓度的miR-122 模拟物或阴性对照物转染细胞。6小时后,用含有125ng dCas9-VPR和125ng pre-SgRNA 的质粒转染细胞,并同时用空质粒转染细胞设为阴性对照。转染48小时后,收集细胞并用Trizol试剂盒提取总RNA,用于mRNA的qRT-PCR。
流式细胞术分析
首先用0.1%胰蛋白酶解离细胞,然后在180g条件下离心沉淀细胞。之后,将细胞在磷酸盐缓冲液(PBS)中洗涤两次,并最后用PBS重悬细胞。使用BD LSR Fortessa SORP 流式细胞仪(Becton Dickinson公司)进行流式细胞术分析。
qRT-PCR和miRNA qRT-PCR
使用Trizol试剂盒(Roche公司)提取RNA,并用Biodropsis BD2000超微量核酸蛋白分析仪进行定量。将500ng左右的RNA使用第一cDNA合成试剂盒(Vazyme公司) 进行反转录。用ABI Step One Plus实时荧光定量PCR系统(Applied Biosystems公司) 进行定量PCR。对于miRNA qPCR,根据生产商的说明书,使用Vazyme公司的miRNA 第一链cDNA合成试剂盒(通过茎环)反转录RNA样品。使用miRNA Universal SYBR qPCR Master Mix系统(Vazyme公司)进行qPCR反应。使用V6.5胚胎干细胞作为对照,基于qPCR结果计算miRNA拷贝数。根据前人报道的方法,V6.5胚胎干细胞中的miR-294 的拷贝数估算为每细胞2339拷贝。
统计学分析
除非另有说明,数据以平均值±SD表示。我们进行双尾不成对Student’s t检验以确定统计学显著性。P值<0.05被认为是具有统计学显著性。
实施例2
MICR-ON系统在被miRNA诱导后激活报告基因的表达
本实施例的MICR-ON平台包含以下三个组分:表达dCas9-VPR的质粒,表达 pre-sgRNA(miRT-sgRNA-miRT)的质粒,和含有被四环素诱导型启动子控制的红色荧光 蛋白(RFP)基因的质粒。我们首先在小鼠胚胎干细胞(ESC)中测试了该MICR-ON系 统。我们构建了一个表达pre-sgRNA(miR294T-sgRNA-miR-294T)的质粒,,它产生的 pre-sgRNA的两端均含有与目标miRNA即miR-294-3p(也被称为miR-294)完全互补的 序列,miR-294是一种在小鼠胚胎干细胞中高表达的miRNA。我们将含有dCas9-VPR、 miR294T-sgRNA-miR-294T和TRE3G-RFP的质粒转染入V6.5胚胎干细胞和Dgcr8-/-胚胎 干细胞(一种不能产生成熟miRNA的胚胎干细胞)中,得到了能响应miR-294表达的胚 胎干细胞。正如所料,如图1所示,报告基因RFP在V6.5胚胎干细胞中有效表达,在 Dgcr8-/-胚胎干细胞中没有表达,表明有活性的sgRNA仅在表达miR-294的V6.5胚胎干 细胞中产生。为了进一步验证上述结论(即miR-294诱导产生有活性的sgRNA),我们 将miR-294模拟物转染进上述Dgcr8-/-胚胎干细胞中,如图2所示,结果发现这样的转染 使得原本不表达RFP的上述Dgcr8-/-胚胎干细胞强表达RFP,并且,随着miR-294模拟 物剂量的增加,RFP的表达也相应增加。因此,上述结果表明,MICR-ON系统可以通过 同源miRNA以剂量响应的方式启动。
实施例3
MICR-ON系统对miRNA的高特异性
为了测试MICR-ON系统的特异性,我们另外构建了表达pre-sgRNA为 miR20bT-sgRNA-miR20bT的质粒,该pre-sgRNA两端含有与miR-20b-5p(也称为 miR-20b)完全互补的序列,由于miR-20b具有与miR-294具有相似的种子序列,因此被用于进行特异性研究(种子序列是指miRNA或siRNA的5’端的第二至第七个核苷酸,这一区域通常被认为是决定miRNA或siRNA功能的重要区域)。我们分别将含有序列为 miR20bT-sgRNA-miR20bT和miR294T-sgRNA-miR-294T的两种MICR-ON系统如上所述地转染至Dgcr8-/-胚胎干细胞中,当然所述Dgcr8-/-胚胎干细胞并没有表达报告基因GFP,然后我们又分别将miR-20b和miR-294模拟物转染至上述含有两种MICR-ON系统的 Dgcr8-/-胚胎干细胞中。结果显示RFP仅在所述miRNA模拟物和所述pre-sgRNA同源配对的情况下才能表达,这表明本发明的MICR-ON系统具有高特异性。此外,我们还合成了另一种miR-294模拟物的突变体,其仅在miR-294的种子序列区中突变了两个核苷酸。与预想的相同,该miR-294模拟物突变体未能激活含有miR294T-sgRNA-miR-294T 的MICR-ON系统的Dgcr8-/-ESC中RFP的表达。我们还使用了miR-182和miR-293的模拟物,由于miR-182和miR-293与miR-294的种子序列完全不同,他们当然也不能激活含有miR294T-sgRNA-miR294T的MICR-ON系统的Dgcr8-/-ESC中RFP的表达。此外,我们又试验了miR-295和miR-302a的模拟物,这两种miRNA与miR-294具有完全相同的种子序列。然而,转染miR-295和miR-302a模拟物仍然不能激活含有 miR294T-sgRNA-miR-294T的MICR-ON系统的Dgcr8-/-ESC中RFP的表达。所有以上结果示于图3。以上数据表明本发明的MICR-ON系统是高度特异性的。
实施例4
MICR-ON适用于被siRNA诱导而激活报告基因表达
在本实施例中,我们测试了MICR-ON是否可以被siRNA激活。本实施例中我们在pre-sgRNA没有设置miRNA结合位点,而是分别设计了针对hnRNPA0的siRNA的两个侧翼结合位点和针对PABPC1的siRNA的两个侧翼结合位点。然后我们将dCas9-VPR,两种pre-sgRNA和TRE-RFP质粒转染到HEK293T细胞中。正如预期的那样,如图4所示,针对hnRNPA0和PABPC1的合成siRNA成功触发了RFP基因的激活。以上数据表明MICR-ON可适用于在被siRNA诱导而激活转基因表达。
实施例5
MICR-ON系统用于检测在细胞分化过程中特定miRNA的活性
在本实施例中,我们测试了本发明的MICR-ON系统是否可以用于监测细胞分化过程中内源miRNA表达或活性的变化。我们首先测试了本发明的MICR-ON系统是否可以被下调,因为miRNA表达在细胞分化过程中降低。我们使用含有100nM全反式维甲酸以及不含LIF的ESC培养基在明胶化平板上培养转染有本发明的MICR-ON系统的V6.5 胚胎干细胞使其分化。在这种情况下,分化后miR-294的表达量会显著降低(图5a)。不出所料,分化细胞中RFP的表达也显著降低(图5b)。
另外,我们还测试了本发明的MICR-ON系统是否可以在细胞分化过程中随着miRNA表达的增加而开启。我们在将含有miR1T-sgRNA-miR1T的本发明的MICR-ON 系统转染进C2C12细胞中,并使它们分化成骨骼肌细胞。与前人报道相一致,我们验证了C2C12细胞向骨骼肌细胞分化过程中miR-1的表达显著增加(图6a)。如图6b所示,我们观察到在C2C12细胞分化过程中RFP表达与miR-1水平成比例上调。此外,我们根据RFP强度将第4天分化的C2C12细胞分为4组(分别命名为L1、L2、L3和L4),并通过miRNA qRT-PCR定量这些细胞中miR-1的表达(图7a)。不出所料,如图7b所示, miR-1的表达水平与分选细胞群中的RFP强度密切相关(R=0.96)。上述数据表明 MICR-ON系统可以可靠地在细胞水平上检测miRNA表达或活性。
实施例6
利用本发明的MICR-ON系统对两种miRNA具有“和”和“或”关系的表达的检测
1.对于“和”关系的表达检测
本发明的MICR系统可以用于检测两种miRNA同时表达的情况,即本实施例所述“和”关系的表达,即只有两种目标miRNA同时表达的时候才激活报告基因的强表达。
为此,我们构建了含有pre-sgRNA序列为miR1T-sgRNA-miR294T的MICR-ON系统,即所述sgRNA的两端分别连接与两种目标miRNA互补的序列。然后将该MICR-ON系统转染到不表达miR-1或miR-294的HeLa细胞中,然后向该细胞中转染miR-1和miR-294 模拟物的一种或两种。结果示于图8,如图8所示,仅转染miR-1和miR-294模拟物中的一种也可以激活报告基因GFP的表达,不过激活程度远远低于同时转染两种模拟物的情况。以上数据表明,本发明的MICR-ON系统可以用于需要检测两种miRNA是否同时表达的情况。
2.对于“或”关系的表达检测
本发明的MICR系统可以用于检测两种miRNA任一表达的情况,即本实施例所述“或”关系的表达,即只要两种目标miRNA中有一种表达的时候就可以激活报告基因的强表达。
为此,我们构建了含有两条pre-sgRNA序列的MICR-ON系统,该系统中含有 miR1T-sgRNA-miR1T和miR294T-sgRNA-miR294T这两种pre-sgRNA。然后将该 MICR-ON系统转染到不表达miR-1或miR-294的HeLa细胞中,然后向该细胞中转染 miR-1和miR-294模拟物的一种或两种,结果示于图9,如图9所示,仅转染仅转染miR-1 或miR-294模拟物中的一种就可以激活报告基因GFP的强表达。以上数据表明,本发明 的MICR-ON系统可以用于需要检测两种miRNA任一表达的情况。
当然,本领域技术人员可以理解的是,根据本实施例的结果,上述前体合成引导RNA在合成引导RNA的序列两端可以含有与一个或多个、相同或不同的目标miRNA或 siRNA完全互补的序列,这样使得本发明的基因调控或编辑系统可以被一个或多个目标 miRNA或siRNA信号所激活,它们之间也可以是“和”或者“或”的关系。
实施例7
本发明的MICR-ON系统在细胞类型特异性miRNA诱导后激活内源基因表达
在本实施例中,我们测试了本发明的MICR-ON系统是否可以由细胞类型特异性miRNA触发以调节内源基因的转录,即本发明的MICR-ON系统是否可以使用内源基因作为报告基因。激活内源基因只需要引入dCas9-VPR和pre-sgRNA质粒,不需要引入含有外源报告基因的质粒。我们设计了两种pre-sgRNA,分别为miR17T-sgRNA-miR17T和 miR122T-sgRNA-miR122T,其中的sgRNA均靶向于人类肌联蛋白(titin,TTN)的转录起始位点(transcriptional start site,TSS)。然后,我们将含有dCas9-VPR和含有两种 pre-sgRNA的质粒分别转染到HEK293T细胞中,该细胞表达高水平的miR-17但不表达 miR-122。结果示于图10,如图所示,在含有dCas9-VPR和miR17T-sgRNA-miR17T的细胞中TTN的表达显著增加,而在含有dCas9-VPR和miR122T-sgRNA-miR122T的细胞中或不含有任何pre-sgRNA的细胞(阴性对照)中没有TTN的表达;此外,将miR-122 模拟物转染到含有dCas9-VPR和miR122T-sgRNA-miR122T的HEK293T细胞以后,可导致TTN转录的显著增加。以上数据表明,本发明的MICR-ON系统可被细胞类型特异性 miRNA诱导后激活内源基因表达,即可以使用内源基因作为本发明的MICR-ON系统的报告基因。
通过公开的上述实施例,本发明的其他实施例对于本领域技术人员都是易于想到和理解的。说明书中的具体描述仅被认为是示例性的,本发明的真正范围和主旨均由本发明的权利要求书所限定。
Claims (10)
1.一种利用RNA干扰机制的分子传感器,所述分子传感器包括以下几个部分:
(1)核酸酶缺陷型CRISPR-Cas9蛋白;
(2)前体合成引导RNA,所述前体合成引导RNA含有与目标miRNA或siRNA完全互补的序列以及合成引导RNA(sgRNA)的序列;
(3)报告基因;
所述分子传感器用于检测细胞内目标miRNA或siRNA的表达活性。
2.根据权利要求1所述的利用RNA干扰机制的分子传感器,其中所述核酸酶缺陷型CRISPR-Cas9蛋白与转录激活因子相连接。
3.根据权利要求2所述的利用RNA干扰机制的分子传感器,其中所述转录激活因子为VP64、p65和Rta中的一种或多种。
4.根据权利要求1或2任一项所述的利用RNA干扰机制的分子传感器,其中所述前体合成引导RNA仅在合成引导RNA序列的一端含有与目标miRNA或siRNA完全互补的序列,或者其中所述前体合成引导RNA在合成引导RNA的序列两端均含有与目标miRNA或siRNA完全互补的序列。
5.根据权利要求1或2任一项所述的利用RNA干扰机制的分子传感器,其中所述前体合成引导RNA在合成引导RNA的序列两端含有的与目标miRNA或siRNA完全互补的序列是相同或不同的序列。
6.根据权利要求1或2任一项所述的利用RNA干扰机制的分子传感器,其中所述前体合成引导RNA在合成引导RNA的序列两端含有与一个或多个目标miRNA或siRNA完全互补的序列。
7.根据权利要求1或2任一项所述的利用RNA干扰机制的分子传感器,其中所述合成引导RNA含有与所述报告基因的启动子或转录起始位点的一段序列互补的序列,以使得所述sgRNA可以将所述核酸酶缺陷型CRISPR-Cas9蛋白引导至所述报告基因的启动子或转录起始位点的位置。
8.根据权利要求1或2任一项所述的利用RNA干扰机制的分子传感器,其中所述报告基因为红色荧光蛋白(RFP)或绿色荧光蛋白(GFP)基因。
9.根据权利要求1或2任一项所述的利用RNA干扰机制的分子传感器,其中所述报告基因为内源基因。
10.一种检测细胞内目标miRNA或siRNA的表达活性的方法,所述方法包括以下步骤:
(1)根据待检测的miRNA或siRNA的序列与所使用的报告基因,构建前体合成引导RNA,所述前体合成引导RNA含有与目标miRNA或siRNA完全互补的序列以及合成引导RNA的序列;
(2)将步骤(1)中构建的前体合成引导RNA和核酸酶缺陷型CRISPR-Cas9蛋白引入待测细胞中,如果需要的话,将报告基因也引入待测细胞中;
(3)检测所述报告基因的表达,以确定待测细胞中待检测miRNA或siRNA的表达活性。
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Cited By (3)
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CN113897386A (zh) * | 2021-08-03 | 2022-01-07 | 南京景瑞康分子医药科技有限公司 | 一种利用rna干扰机制诱导多位点切割基因组实现选择性杀死细胞的dna系统 |
CN113897385A (zh) * | 2021-08-03 | 2022-01-07 | 南京景瑞康分子医药科技有限公司 | 一种利用rna干扰机制诱导毒素基因表达实现选择性杀死细胞的dna系统 |
CN117512076A (zh) * | 2023-12-25 | 2024-02-06 | 中国农业科学院农业质量标准与检测技术研究所 | 一种基于劈裂式Cas9系统的RNA免反转录的检测方法 |
Citations (2)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
CN103314003A (zh) * | 2010-10-28 | 2013-09-18 | 纳诺杜克有限公司 | 通过特异性内源miRNA 激活表达的组合物和方法 |
CN105543223A (zh) * | 2015-12-25 | 2016-05-04 | 华侨大学 | 一种基于miRNA/shRNA转录加工机制转录sgRNA的方法 |
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Patent Citations (2)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
CN103314003A (zh) * | 2010-10-28 | 2013-09-18 | 纳诺杜克有限公司 | 通过特异性内源miRNA 激活表达的组合物和方法 |
CN105543223A (zh) * | 2015-12-25 | 2016-05-04 | 华侨大学 | 一种基于miRNA/shRNA转录加工机制转录sgRNA的方法 |
Non-Patent Citations (1)
Title |
---|
CHEN XIE ET AL.: "SgRNA Expression of CRIPSR-Cas9 System Based on MiRNA Polycistrons as a Versatile Tool to Manipulate Multiple and Tissue-Specific Genome Editing", 《SCIENTIFIC REPORTS》 * |
Cited By (4)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
CN113897386A (zh) * | 2021-08-03 | 2022-01-07 | 南京景瑞康分子医药科技有限公司 | 一种利用rna干扰机制诱导多位点切割基因组实现选择性杀死细胞的dna系统 |
CN113897385A (zh) * | 2021-08-03 | 2022-01-07 | 南京景瑞康分子医药科技有限公司 | 一种利用rna干扰机制诱导毒素基因表达实现选择性杀死细胞的dna系统 |
CN117512076A (zh) * | 2023-12-25 | 2024-02-06 | 中国农业科学院农业质量标准与检测技术研究所 | 一种基于劈裂式Cas9系统的RNA免反转录的检测方法 |
CN117512076B (zh) * | 2023-12-25 | 2024-04-12 | 中国农业科学院农业质量标准与检测技术研究所 | 一种基于劈裂式Cas9系统的RNA免反转录的检测方法 |
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