CN104208723B - miR-638在抗急性髓系白血病中的应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种miR‑638在抗急性髓系白血病中的应用，属于分子生物学领域。实验表明，在正常造血细胞分化发育和急性髓系白血病发生发展过程中，miR‑638的表达水平存在明显的变化；在白血病细胞系和原代急性髓系白血病细胞中miR‑638表达水平的上调或下调，可以显著促进或抑制细胞分化进程。本发明研究结果表明通过上调miR‑638的表达能够达到治疗急性髓系白血病的目的。基于miR‑638的功能其可用于制备抗急性髓系白血病药物，其模拟物或表达载体也可用于制备抗急性髓系白血病药物。本发明为开发新的抗急性髓系白血病的药物或诊断试剂提供了重要的基础。

Description

miR-638在抗急性髓系白血病中的应用

技术领域

本发明属于分子生物学领域，涉及一种灵长类特异的非编码微小RNA——hsa-miR-638(以下称为miR-638)在抗急性髓系白血病中的应用。

背景技术

微小RNA(microRNAs，miRNAs)是一类长约19～25个核苷酸(nt)的单链小分子RNA，主要通过抑制蛋白翻译或破坏靶基因转录本稳定性而调节转录后基因表达。1993年，分别由两个研究小组在线虫中发现了第一种miRNA——lin-4，2001年将之正式命名为microRNA。随后大量的研究表明，miRNAs的生物学功能几乎涉及到动植物生命活动的方方面面，包括胚胎发育和肿瘤发生过程。胚胎发育是动植物从受精卵到成体的必经之路；肿瘤，包括恶性血液疾病和实体瘤，是生长失控和分化异常的细胞群体，恶性肿瘤严重威胁着人们的身心健康。越来越多的研究已经表明，早期胚胎发育与肿瘤发生发展的生物学行为之间存在许多相似之处。这些研究为从发育生物学角度理解肿瘤的发生发展和为开发下一代肿瘤诊断治疗技术提供了新的科学思维方法。

为了全面深入剖析人类早期胚胎发育过程中基因表达调控特点和寻找新的肿瘤诊断和治疗靶标，申请人和其他研究组曾利用cDNA表达文库制备和筛选、大规模表达谱芯片等方法对人胚早期发育4-9周(人胚大多数组织器官形成、分化和发育的关键时期)的基因表达谱进行了分析，并且对筛选的相关性基因在恶性疾病中的生物学功能开展了一系列研究。随后还利用微流体miRNAs表达谱芯片分析鉴定了人胚发育4-6周中miRNAs的表达特点：人类早期胚胎发育4-6周中大多数miRNAs的表达均很低，只有约5％的miRNAs呈现高表达；并首次定义了50种人胚特异高表达的miRNAs(HES-miRNAs)，包括miR-638、miR-720和miR-1280等(Characterization of MicroRNA Expression Profiles and the Discoveryof Novel MicroRNAs Involved in Cancer during Human Embryonic Development.PLoSONE2013,8(8):e69230)。

对大量的肿瘤样本进行的miRNA芯片研究表明，几乎所有的肿瘤中都出现了miRNA的异常表达。异常表达miRNA对肿瘤发生的影响主要可以总结为以下几个方面：(1)异常表达的miRNA调控原癌基因或抑癌基因异常表达。比如，miR-155基因位于非编码基因BIC的转录本中，而在各种淋巴瘤尤其是弥漫性大B细胞淋巴瘤中，这种非编码RNA的表达水平都显著上升；miR-17-92基因簇位于一个在B细胞淋巴瘤病人中常见的基因扩增区域内，故一般该簇表达的miRNA在这类淋巴瘤病人中异常高表达。在小鼠模型中，过表达miR-17-92基因簇阻碍了细胞的凋亡并能促进由c-myc基因诱导的B细胞淋巴瘤的形成；而c-myc基因本身也能转录调控miR-17-92基因簇及其该类miRNA的靶基因之一的细胞周期正调控因子E2F1，形成对细胞生长增殖的严密调控。(2)异常表达的miRNA导致细胞周期的异常。例如miR-221/222报道在许多肿瘤中都表达上调，功能研究表明它们能直接调控p27kip1和p57kip2的表达，后者能通过与CDK蛋白与周期蛋白复合体的结合抑制细胞G1/S期的转换。(3)异常表达的miRNA影响肿瘤的发展和转移。研究表明在高度转移性的乳腺癌和恶性肝癌细胞中抑制原癌性的miR-21的表达，能有效抑制肿瘤细胞的侵袭和转移，而这一过程与其靶基因PDCD4和maspin的相应表达上调有关。

miRNA在细胞调控网络中发挥着平衡基因表达水平的作用，而肿瘤细胞中异常表达的miRNA往往会打乱这种平衡，因而导致了肿瘤的发生发展。大量的芯片研究表明，miRNA可以用作区分不同肿瘤以及同一肿瘤类型中的不同亚型的分子标志物。人们通过对334例不同肿瘤样本的miRNA表达谱分析表明，miRNA的表达模式可以用于区分不同组织发育起源的肿瘤。另外，Murakami和其合作者报道，miR-222、miR-106a和miR-17-92基因簇的表达水平共同决定了肝细胞癌的分化程度，而miR-21的高表达与胰腺癌病人的低生存率密切相关。

鉴于miRNA在肿瘤发生发展过程中的重要作用，对miRNA表达水平的调控可以作为肿瘤治疗的一个有效手段。众多的研究指出miRNA的异常表达与肿瘤的耐药性密不可分，故miRNA或miRNA的抑制剂能单独用于或者辅助用于对那些已经产生抗药性肿瘤的治疗。

已经有许多研究组也对miRNA在小鼠和人造血系统中的表达模式进行了深入研究。报道表明，miRNA作为一种小分子非编码RNA几乎在造血过程的每一个阶段都发挥着极其重要的调控作用。急性髓系白血病(acute myeloid leukemia，AML)是由造血干细胞异常导致的髓系前体细胞分化受阻，且过度增殖而形成造血异常的疾病。AML患者外周血和骨髓中的髓系前体细胞分化受阻，并丧失了分化成正常髓系终末细胞的能力。有大约25～30％的基因组突变能引发造血异常，比如t(15；17)、t(8；21)和inv(16)等。

大量的研究表明，miRNA在肿瘤尤其是白血病的发生中也发挥着重要的功能。Mi和其合作者首次研究了AML患者中miRNA的表达谱(MicroRNA expression signaturesaccurately discriminate acute lymphoblastic leukemia from acute myeloidleukemia.Proc Natl Acad Sci USA104(50):19971-19976)。他们采用11例急性淋巴细胞白血病(acute lymphoblastic leukemia，ALL)病人，47例AML病人和7株相应的白血病细胞系进行miRNA表达谱分析，结果发现有27个miRNA在两种急性白血病中呈现差异表达，其中miR-128a、miR-128b、let-7b及miR-223的表达出现显著差异，并且运用其中的2个miRNA作为指标就可以精确的区分急性髓系和淋巴系白血病，准确率达到了97-98％。Isken等分析了50例AML病人和健康人样本中154个miRNA的表达谱发现，miR-26a、miR-26b和miR-29b的表达水平介于CD34+细胞和正常的骨髓样本之间，而AML病人中的miR-23b、miR-34a和miR-221/miR-222基因簇的表达水平与正常骨髓样本比较则出现了显著差异(Identificationof acute myeloid leukaemia associated microRNA expression patterns.Br JHaematol140(2):153-161)。而在一些肿瘤细胞中miR-221/miR-222基因簇的高表达会抑制抑癌基因CDKN1B的表达，进而促进细胞增殖。此外人们还发现miR-181a在AML亚型FAB(French-American-British)M4型和M5型的表达水平远低于M1型和M2型，提示miR-181a可以作为区分急性髓系白血病亚型的指标。

为了发掘针对AML这一疾病的miRNA诊断可能性，Wang等人分析了10例AML(M1型到M5型)病人和6例健康人外周血单个核细胞中的miRNA表达谱。对照样本相比，大量的miRNA在总的AML样本或不同亚型中出现了差异表达，其中miR-29a和miR-142-3p在AML病例中显著下调，且其表达水平能作为AML的诊断指标之一(miR-29a and miR-142-3pdownregulation and diagnostic implication in human acute myeloid leukemia.MolBiol Rep39(3):2713-2722)。随后，他们又详细研究了miR-29a和miR-142-3p是如何参与调控AML疾病的发生的。功能研究显示，过表达miR-29a或miR-142-3p都能促进诱导剂诱导下的白血病细胞系的髓系分化，抑制其表达则相反。而且在原发性AML病人的CD34+细胞中重建这两个miRNA的表达能促进其体外诱导的粒系和单核/巨噬系的分化。进一步的实验表明，miR-29a和miR-142-3p能同时调控CCNT2，进而阻碍磷酸化Rb蛋白的释放，细胞周期受阻，分化得以顺利进行。此外miR-29a还能单独调控CDK6，而miR-142-3p则能调控TAB2蛋白的表达，其中TAB2同时参与了粒系和单核巨噬系分化的调控。以上结论表明miR-29a和miR-142-3p是髓系造血分化的关键调控因子，其表达异常与AML疾病的发生密切相关(MicroRNA-29a and microRNA-142-3p are regulators of myeloid differentiationand acute myeloid leukemia.Blood119(21):4992-5004)。

最近，Marcucci等人研究了60岁以下成年AML病人的miRNA表达谱，病人分为核型正常或伴有FLT3-ITD(fms-related tyrosine kinase3gene)基因的内部串联重复，或二者兼有。其中有12个miRNA的表达与病人的临床诊断相关，其中miR-181家族在高危AML病人中显著下调，而且其表达水平与toll样受体和白介素1β信号通路中相关蛋白的水平变化高度相关(MicroRNA expression in cytogenetically normal acute myeloid leukemia.NEngl J Med358(18):1919-1928)。

如上所述，miRNA在许多肿瘤包括白血病中都能扮演原癌基因或者抑癌基因的角色。于是将miRNA作为疾病治疗的作用靶标或者直接用于疾病治疗就成为了可能。迄今，研究的比较充分的是miRNA的抑制分子，比如用锁核酸(locked nucleic acid，LNA)合成的miRNA互补链抑制剂，用2-氧-甲基修饰的miRNA互补小RNA都被广泛用于临床研究。2-氧-甲基修饰的miRNA互补RNA最早被用于在果蝇和线虫体内直接沉默siRNA或者miRNA。在一项基础研究中发现，将miR-16、miR-122、miR-192和miR-194修饰后的抑制剂直接注入小鼠体内，能有效的抑制这些miRNA在各个组织中的表达。另外，miR-122非常特异的在肝组织中高表达，如果小鼠体内注入miR-122的拮抗剂(修饰后的抑制剂)能有效的下调miR-122的表达，且持续时间能达到23天。其后的实验表明miR-122调控胆固醇代谢这一重要功能完全被拮抗剂所阻断，显示了miRNA可以作为一种非常有前景的疾病治疗靶标。除了miR-122，另外几种miRNA也在小鼠中被沉默表达，比如在小鼠内皮细胞特异的miR-126的表达能有效的被其抑制剂下调。

迄今为止，世界范围内首例把miRNA作为临床治疗靶标的案例来自于miR-122。人们研究了用LNA合成的miR-122抑制剂在抗HCV感染中的应用前景，并完成了在部分临床试验。肝脏中高表达的miR-122通过与HCV基因组5’非编码区的结合能增强HCV相关蛋白的翻译。另外，一种非常吸引人们注意的方式就是将miRNA和肿瘤的化疗相结合，同时检测化疗前后miRNA的表达谱变化来指导治疗。一项对头颈鳞状细胞癌的研究发现，HMGA2表达水平与该肿瘤对阿霉素的敏感性相关。HMGA2是非组蛋白染色体高迁移率蛋白家族成员，其在低氧条件下表达下调，与之相应的是miR-98的上调，而在常氧条件下过表达miR-96能下调HMGA2，并导致该类肿瘤细胞对于阿霉素敏感性的增加。

除此之外，人们观察到在一些肿瘤中miRNA基因被甲基化而沉默，是否可以将沉默的miRNA激活作为疾病治疗的靶标之一呢？比如，在ALL患者中，DNA甲基化导致部分miRNA下调，而用5-硫唑嘌呤-2-脱氧胞苷处理就能激活这些沉默的miRNA。miRNA的甲基化导致ALL病人miR-124表达下调，后者又可以下调控制ALL细胞生长增殖的蛋白CDK6，而拥有低水平miR-124的ALL病人疾病易复发且死亡率高。所以，甲基化的miRNA基因在该类疾病的治疗中可以作为一种非常有前景的靶标，或者将其作为疾病诊断非常有效的指标。

最后，miRNA还可以作为疾病预后的检测指标。在CLL病人中，miR-29c和miR-223在由A期向C期转换，或者预后差的病人样本中表达下调。因此，这些miRNA可以预测病人的非治疗生存率(treatment-free survival，TFS)和总体生存率(overall survival，OS)。Stamatopoulos等人介绍了一个由miR-29c、miR-223、ZAP-70和LPL四个分子共同组成的评分系统，以评价不同亚型的CLL病人预后情况。

综上所述，虽然还需要人们进行更系统的基础研究和大量的临床数据，但是将miRNA用于多种重大恶性疾病的临床诊断和治疗，仍然具有非常光明的前景。

发明内容

本发明的目的在于确定与人胚发育相关的、灵长类特异的非编码小RNA miR-638在髓系造血分化中的调控作用，以及miR-638与急性髓系白血病发生的关系，提供一种miR-638在抗急性髓系白血病中的应用。

本发明的目的通过下述技术方案实现：

本发明确定了miR-638在髓系造血分化中的调控作用，以及miR-638与急性髓系白血病发生的关系，研究结果如下：

1、miR-638在造血细胞不同分化发育阶段以及造血细胞不同谱系间的表达、在白血病细胞系和健康人外周血细胞之间的表达、以及在AML病人和健康人对照组的外周血单个核细胞之间的表达，均具有显著的差异性。

2、miR-638在PMA诱导白血病细胞THP-1和HL-60向单核/巨噬细胞系分化过程中、在ATRA诱导白血病细胞HL-60和NB4向粒细胞系分化过程中、以及在PMA和ATRA分别诱导原发性AML患者外周血原始细胞(blasts)向单核/巨噬细胞系和粒细胞系分化过程中，均表现为显著的表达上调。

3、miR-638在白血病细胞分化过程中的功能，即在白血病细胞THP-1和HL-60中分别瞬时上调miR-638表达后，可以促进PMA诱导THP-1向单核/巨噬细胞系的分化过程、以及促进ATRA诱导HL-60向粒细胞系的分化过程；反之，在白血病细胞THP-1和HL-60中分别下调miR-638表达后，可以抑制PMA诱导THP-1向单核/巨噬细胞系的分化过程、以及抑制ATRA诱导HL-60向粒细胞系的分化过程。

4、miR-638在白血病细胞HL-60中瞬时过表达或稳定过表达后，可以显著地抑制细胞增殖和软琼脂克隆形成能力。

5、miR-638在原发性AML患者外周血原始细胞中表达上调，可以显著地促进诱导剂PMA和ATRA诱导的细胞分化过程。

本发明通过如下方法得出上述结果：

通过商品化的设计引物(购自中国广东广州市锐博生物科技有限公司)检测了miR-638在正常造血细胞分化发育过程以及不同细胞谱系中的表达，也检测了miR-638在白血病细胞在诱导剂诱导下向不同分化方向分化过程中的表达，以及在健康人和AML患者中的表达，结果表明，miR-638的表达均有明显变化或显著差异，这些结果暗示miR-638可能涉及到正常造血细胞发育过程和AML的发生发展过程。

通过瞬时表达或稳定过表达手段，上调或下调白血病细胞和原代AML患者外周血原始细胞中miR-638的表达，结果显示，miR-638的表达变化显著影响了白血病细胞和原代AML患者外周血原始细胞的细胞分化进程，这些结果提示miR-638可能作为一种潜在的诊治靶标用于AML的防治作用。

利用逆转录病毒载体MDH1-PGK-GFP2.0(该载体为一种常规商品化质粒载体，详见网站http://www.addgene.org/11375/和引用文献(MicroRNAs modulate hematopoieticlineage differentiation.Science,2004,303(5654):83-6)和对应的感染人细胞系的辅助载体pCL-Eco(一种常规商品化质粒载体，详见网站http://www.addgene.org/12371/)，以及从人基因组中克隆到的miR-638基因序列，构建了miR-638的逆转录病毒表达载体MDH1-miR-638，构建逆转录病毒表达载体MDH1-miR-638所用到的引物分别为：

MDH1-638-FP：5’-AATATCTCGAGCCCGGGAGCAACGGCTACAGA-3’，

MDH1-638-RP：5’-GAGTTGAATTCAATTAATTTTTATGGACAGCCCGAAAGAG-3’。

构建上述逆转录病毒表达载体MDH1-miR-638的方法，包括如下步骤：

1)miR-638基因片段扩增：利用上述设计的引物从人基因组序列中克隆得到miR-638的表达基因片段；

2)PCR产物凝胶电泳回收：参考武汉摩尔生物公司提供的试剂盒操作流程；

3)PCR片段和载体的双酶切、回收、连接及转化：采用常规的分子生物学方法；

4)阳性克隆的鉴定与测序：将筛选到的阳性克隆通过常规PCR和测序方法进行鉴定。

5)逆转录病毒包装、病毒滴度的检测及细胞感染：以MDH1-PGK-GFP2.0或MDH1-miR-638和其辅助载体包装形成逆转录病毒，用以感染HL-60细胞，以筛选稳转细胞系。

上述逆转录病毒表达载体MDH1-miR-638构建成功后，将该载体和相应的对照载体MDH1-PGK-GFP2.0转染白血病细胞HL-60，通过大量筛选和实验验证分析工作，筛选到分别稳定表达相应载体及miR-638的HL-60亚细胞株：稳转细胞HL-60-MDH1-Vector和HL-60-MDH1-miR-638。将上述表达载体转染白血病细胞或原代AML患者外周血原始细胞中，用于miR-638基因的稳定过表达。

利用商业化miR-638的模拟物和抑制剂可以在细胞中分别瞬时过表达miR-638和抑制miR-638的表达；构建的逆转录病毒表达载体MDH1-miR-638具有在肿瘤细胞中特异性高表达miR-638基因的能力，这为进一步研究miR-638基因的生物学功能提供更加可靠和便捷的研究手段，同时为针对miR-638基因的相关基因治疗药物的开发提供了可能。

上述结果表明miR-638在AML患者中的异常表达与白血病的发生间存在关联，上调miR-638表达能促进原始细胞在诱导剂作用下的单核/巨噬或粒系分化。而加快AML患者外周血中的原始细胞的细胞分化进程，促进那些处于低分化或去分化状态的恶性肿瘤细胞向成熟细胞方向分化，重建正常血细胞表型，恢复正常造血功能，并最终促进恶性白血病细胞凋亡和抑制增殖，从而达到治愈白血病的目的。即miR-638的表达能够促进恶性白血病细胞凋亡和抑制增殖，促进恶性肿瘤细胞向正常血细胞分化，恢复正常造血功能。

上述结果表明，通过上调miR-638的表达能够达到治疗急性髓系白血病的目的；miR-638在髓系细胞中的表达量也能够用于诊断髓系白血病的发生。

基于上述结果，本发明提供的miR-638在抗急性髓系白血病中的应用如下：

miR-638在制备抗急性髓系白血病药物中的应用。

miR-638的模拟物在制备抗急性髓系白血病药物中的应用。

miR-638的表达载体在制备抗急性髓系白血病药物中的应用。

一种抗急性髓系白血病药物，包含miR-638。

一种抗急性髓系白血病药物，包含miR-638的模拟物。

一种抗急性髓系白血病药物，包含miR-638的表达载体。

所述的miR-638的表达载体可以为上述构建的逆转录病毒表达载体MDH1-miR-638。

miR-638在制备急性髓系白血病的诊断试剂中的应用。

本发明首次发现了miR-638在髓系造血分化中的调控作用，以及miR-638与急性髓系白血病发生的关系，即通过上调miR-638的表达能够达到治疗急性髓系白血病的目的。根据miR-638功能，可将其应用于制备抗急性髓系白血病的药物，为开发新的抗AML疾病的药物或诊断试剂提供了重要的基础。

附图说明

图1实时荧光定量PCR检测miR-638在人血液谱系特异性细胞中的相对表达情况。

图2 miR-638在白血病细胞和急性髓系白血病病人中的表达水平检测。A、6例健康人外周血MNC与白血病细胞系THP-1、HL-60、NB4和U937中miR-638表达水平比较，p<0.05；每组实验重复三次，结果显示为“均值±SD”；B、13例健康人与9例急性髓系白血病(AML)病人外周血单个核细胞中miR-638表达水平比较，结果显示为箱线图。

图3瑞氏吉姆萨染色法分析THP-1和HL-60分别诱导向单核/巨噬系和粒系分化。图示诱导0h和诱导24h、48h、72h和96h时细胞的形态变化，其中以诱导96h时间点用黑色箭头指示了典型的单核/巨噬系和粒系分化的细胞形态；图片中细胞放大倍数为250倍。

图4 miR-638在白血病细胞系体外诱导分化过程中表达上调。流式细胞术检测髓系分化指标(单核/巨噬细系：CD14；粒系：CD11b，A～D，右侧)表达和实时定量PCR检测(A～D，左侧)。每组实验重复三次，miR-638表达柱状图结果显示为“均值±SD”。)

图5 miR-638在原发白血病细胞体外诱导分化过程中表达上调。每组实验重复三次，miR-638表达柱状图结果显示为“均值±SD”。

图6半定量和实时荧光定量PCR检测转染后THP-1和HL-60细胞内miR-638表达。A、B图中表示模拟物对照；C、D图中表示抑制剂对照，inh.表示抑制剂；每组实验重复三次，miR-638表达柱状图结果显示为“均值±SD”。

图7流式分析和统计调节THP-1和HL-60细胞内miR-638表达对诱导髓系分化的影响；图示中流式检测结果，每一小图中“右边的峰图”表示细胞经对应的诱导剂诱导，“左边的峰图”表示细胞经诱导剂对照(0.1％DMSO)诱导。A、B图中表示模拟物对照；C、D图中表示抑制剂对照，Inh.为抑制剂的缩写。每组实验重复三次，CD14、CD11b表达柱状图结果显示为“均值±SD”。)

图8瑞氏吉姆萨复合染色法检测细胞形态学的变化。图片中细胞放大倍数为250倍，黑色箭头指示为分化较为典型的细胞。

图9实时荧光定量PCR检测模拟物转染后诱导THP-1和HL-60细胞髓系特异基因转录本的表达。miR-638表示miR-638模拟物。**，p<0.01；GAPDH为荧光定量的内参基因。

图10实时定量PCR检测抑制剂转染后诱导THP-1和HL-60细胞髓系特异基因转录本的表达。miR-638(inh.)表示miR-638抑制剂。**，p<0.01；GAPDH为内参基因。每组实验重复三次，结果显示为“均值±SD”。

图11过表达miR-638影响HL-60细胞增殖。A、转染miR-638模拟物(或对照)后，HL-60生长曲线绘制(细胞计数)；B、转染miR-638模拟物(或对照)并添加PMA诱导剂后，HL-60生长曲线的绘制(CCK-8检测)。图中数据显示为“均值±SD”。

图12 miR-638稳转细胞(HL-60)的构建。A、流式细胞术分析分选后病毒转导阳性细胞的比例；B、实时荧光定量PCR检测稳转细胞中miR-638表达水平。图中数据显示为“均值±SD”。

图13 miR-638稳转细胞(HL-60)增殖情况分析。A、B：诱导剂(PMA和ATRA)作用下，稳转细胞生长曲线绘制。图中数据显示为“均值±SD”。

图14 miR-638抑制HL-60细胞的软琼脂克隆形成能力。A、miR-638(或对照)稳转细胞在软琼脂中形成的克隆图，每组设置两组重复；B、对克隆数目进行统计分析，图中数据显示为“均值±SD”。**，p<0.01。

图15过表达miR-638促进原发性AML细胞在诱导剂作用下的髓系分化。A、实时荧光定量PCR检测转染24h后细胞中miR-638的表达水平；B和C、流式细胞术分析诱导髓系分化特异标志物CD14和CD11b的表达。

具体实施方式

下面结合具体实施例对本发明做进一步详细的描述。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。

下列实施例中未注明具体实验条件的实验方法，通常按照常规实验条件，如Sambrook等编，《分子克隆：实验室手册》(New York：Cold Spring Harbor laboratoryPress，2002)中所述的实验条件，或按照制造厂商所建议的实验条件。

实施例1miR-638在不同来源血细胞中的表达调查

为了探索miR-638是否涉及到正常造血过程和白血病发生发展过程，本实施例分离并检测了miR-638在健康人外周血的髓系、淋巴系以及造血多能干细胞群落中的本底表达水平；以及健康人对照外周血单个核细胞、多种白血病细胞系和AML患者外周血原始细胞中的表达水平。

AML患者外周血和脐带血取自武汉大学中南医院、华中科技大学附属同济医院和江苏省中医院，每份样本均得到患者知情同意以及相应的医学伦理委员会批准。白血病细胞系包括HL-60、THP-1、NB4细胞(均购自中国科学院典型培养物保藏委员会细胞库)，以及U937细胞。

从外周血样本中分离单个核细胞(mononuclear cells，MNCs)的方法是采用密度梯度离心法。其原理在于Ficoll-paque TM Plus分离液(美国GE Healthcare公司产品)的密度为1.077g/mL，MNCs的密度大约在1.076～1.090g/mL之间，而红细胞密度为1.093g/mL，粒细胞密度为1.092g/mL，它们密度都大于MNCs，所以用与MNCs密度相近的Ficoll-paqueTM Plus，再结合密度梯度离心可以分离得到比较纯的单个核细胞。具体步骤参照商品化试剂盒的详细说明。

一、miR-638在造血细胞不同分化发育阶段以及造血细胞不同谱系间的表达调查

使用加拿大StemCell公司的CD34+分选试剂盒采用磁珠正向吸附法从单个核细胞中分离纯化CD34阳性细胞。其原理是：使用偶联有抗CD34抗体的磁珠颗粒，结合强力磁极将阳性细胞从细胞群体中分离出来。根据StemCell公司实验手册，所用起始MNCs来源于脐带血，因为其含有较高比例的CD34阳性细胞。具体步骤参照试剂盒的详细说明。

通过磁珠正向分离法在健康人脐带血的单个核细胞中得到纯度在90％以上的CD34+细胞。将通过密度梯度离心的方法得到了健康人外周血中的单个核细胞(PBMC)采用流式细胞术分选，得到了高纯度的CD14+和CD11b+的髓系细胞亚群和CD3ε+和CD45R+的淋巴细胞亚群(流式细胞分析采用的荧光标记抗体：FITC-CD11b、APC-CD11b、PE-CD14、FITC-CD14、FITC-CD45R、PE-CD3ε和APC-CD34均购自Biolegend公司)。实时荧光定量PCR检测miR-638(miRNA定量检测试剂盒Bulge-LoopTM miRNA qRT-PCR Kit，包括miR-638检测引物和内参引物均购自广州锐博生物科技公司)在这些细胞中的表达水平显示(如图1)：(1)miR-638在髓系细胞发育过程中表达水平显著上调(与CD34+细胞相比，CD11b+细胞水平上调约10倍，而CD14+细胞水平上调约30倍)；(2)与CD34+细胞相比，miR-638在淋巴细胞亚群中的表达水基本检测不到。这些结果表明miR-638可能在正常的髓系造血分化中发挥作用。

二、miR-638在健康人外周血单个核细胞、白血病细胞系以及AML患者样本中的表达调查

为了探索miR-638与白血病的相关性，本实施例检测了miR-638在白血病细胞中的表达。实时荧光定量PCR结果显示，与健康人的MNC比较，miR-638在4个被检测的白血病细胞系中的表达水平都比较低，与正常人PBMCs存在显著差异(图2A)。另外，本实施例还检测了从AML病人外周血分离获得了单个核细胞miR-638的表达水平。类似的，miR-638在AML白血病病人外周血细胞中表达水平显著低于正常人(图2B)。结合miR-638在正常髓系细胞中的高表达，这些结果表明miR-638的表达失调可能与白血病发生发展过程相关。

实施例2miR-638在白血病细胞和AML患者外周血原始细胞的诱导分化过程中的表达变化分析

一、miR-638在白血病细胞诱导分化过程中的表达变化分析

为了进一步验证miR638与白血病发生发展的相关性，本实施例利用白血病细胞体外分化的模型来分析miR-638的表达与白血病细胞分化的关系。HL-60和NB4细胞在全反式维甲酸(ATRA)的处理下，可以向粒系成熟细胞分化；THP-1和HL-60细胞在佛波酯(PMA)的诱导下，可以向单核细胞分化。通过瑞氏吉姆萨染色法观察白血病细胞分化时的细胞形态变化。图3展示了THP-1和HL-60分别在PMA和ATRA的诱导下向单核细胞核和粒细胞分化时的细胞形态变化，图示中分化的单核细胞与未诱导细胞相比，细胞核明显变小，核质比也变小；分化成熟的粒系细胞不仅核质比变小，细胞核分成多个小叶。

通过流式细胞术检测了细胞分化的程度(如图4)，表现为单核细胞特异性表面标志物CD14和粒系细胞特异性表面标志物CD11b的峰随着诱导时间增加而明显向右偏移，表明细胞逐渐分化成熟。随后，通过实时荧光定量PCR对3种细胞系分别向2个方向诱导分化过程中miR-638的表达水平进行了检测。如图4所示，无论是在单核细胞还是在粒细胞分化成熟的过程中，miR-638的表达水平都是持续上调的，尤其是HL-60由PMA诱导的末期(96h)，miR-638表达水平相比诱导前上调有约90倍之多。这些发现与之前分析得到的miR-638在髓系血细胞中特异高表达的现象是吻合的，也进一步提示miR-638很可能参与正常髓系造血过程，其异常表达可能参与髓系白血病的发生。

二、miR-638在AML患者外周血原始细胞的诱导分化过程中的表达变化分析

此外，本实施例也将从AML(FAB-M1型)病人外周血中分离得到的单个核细胞(含大量髓系前体母细胞)进行体外诱导分化，并检测了miR-638的表达水平。如图5所示，白血病细胞经PMA诱导向单核细胞分化和ATRA诱导向粒系分化时，miR-638表达水平显著上调，而用对照(Vehicle，即0.1％DMSO溶液)试剂处理的细胞表达水平基本不变。该结果与在白血病细胞系的诱导分化实验结果一致。

从正常的或异常的造血过程以及体外诱导分化等实验结论可以得出miR-638很可能是人髓系造血分化过程中一个重要的调控因子，其表达异常可能参与髓系白血病的发生。

实施例3miR-638在白血病细胞中的表达变化显著影响细胞分化进程

为了研究miR-638对髓系白血病细胞系体外诱导分化的影响，本实施例通过瞬时转染miRNA模拟物(mimics)和抑制剂(inhibitors)及其对照的方法，人为调节细胞(THP-1和HL-60)内miR-638的表达水平。miRNA模拟物(mimics)和抑制剂(inhibitors)及各自对照均购自中国广东广州市锐博(Ribio)生物技术有限公司，模拟物序列与成熟miR-638的序列完全一致，抑制剂序列与成熟miR-638的序列完全互补配对。通过使用IfectRNA Plus转染试剂(PharmInova公司产品)和BLOCK-iT荧光分子(FITC)标记寡核苷酸(Invitrogen公司产品)，初步观察这些寡核苷酸的转染效率均达到了90％以上。

通过半定量(所使用检测miR-638和内参引物序列与实施例1所述的荧光定量PCR引物序列一致)和荧光定量PCR的方法(所使用的方法与实施例1一致)对转染细胞系中miR-638的表达水平进行了定性和定量的分析。如图6所示，THP-1和HL-60细胞在转染miR-638mimics24h之后，细胞内miR-638表达水平得到了显著的提高；而转染miR-638的抑制剂，其表达水平显著降低。

通过流式细胞术分析和统计了调节THP-1和HL-60细胞内miR-638表达对诱导髓系分化的影响，结果见图7。如图7A所示，在THP-1细胞中，与转染模拟物对照相比，PMA诱导72小时后，转染miR-638mimics的单核细胞特异表达的表面标志物CD14的表达水平明显上调；模拟物对照组分化水平为23.8％，而过表达miR-638的实验组细胞CD14表达水平为34.6％。图7B左侧对流式的三次重复实验进行统计，发现二者之间存在显著差异。相似地，在HL-60细胞中，ATRA诱导向粒系分化时，过表达miR-638能显著提高粒系特异表面标志物CD11b的表达，对照组分化水平为29.4％，过表达miR-638则达到41.4％。图7B右侧对流式细胞分析的三次重复实验进行统计，发现二者之间也存在显著差异。

同样地，在转染miRNA的抑制剂时(如图7C)，THP-1由PMA诱导的单核细胞分化被显著抑制，其分化比例由对照组的37.6％下降到实验组的27.3％。相似的结果也在HL-60由ATRA诱导向粒系分化时发现，抑制miR-638的表达水平后分化比例由对照组的30.5％下降到实验组的18.3％。图7D对抑制剂作用下的实验结果进行了统计分析，结果表明在THP-1和HL-60细胞中，抑制miR-638表达能显著抑制诱导剂作用下的髓系分化表面标志物的表达。

同时通过瑞氏吉姆萨复合染色法对诱导分化末期的细胞进行了细胞形态学的观察，如图8所示，染色后能清楚地显示细胞核和细胞质的状态。如图8A未分化的THP-1细胞(左上角)核质比较大，细胞核基本占据整个细胞，细胞质很少；而经过PMA诱导细胞质比例增加，细胞核明显变小，此为分化的典型特征。与右上角转染miRNA模拟物对照的THP-1细胞相比，如黑色箭头所示，过表达miR-638后更多比例的细胞呈现分化状态。同样地，如图8B，HL-60在未分化时，细胞核几乎占据整个细胞；分化后细胞核出现小叶(箭头所示)或呈现马蹄状。与右上角转染miRNA模拟物对照的HL-60细胞相比，过表达miR-638后更多比例的细胞呈现分化状态(右下角)。

下调miR-638的结果与过表达恰好完全相反，抑制miR-638的表达显著的抑制了THP-1和HL-60在PMA或ATRA诱导剂作用下的髓系分化。结果如图8C，与左上角转染miRNA模拟物对照的THP-1细胞相比，如黑色箭头所示，抑制miR-638表达后的呈现单核系分化状态的细胞比例明显降低；相似的在HL-60细胞中，抑制miR-638表达导致ATRA诱导的粒系分化细胞比例比对照组更低(如图8D)。

此外，通过实时荧光定量PCR对诱导72小时后细胞内髓系特异性基因表达情况进行了检测(所使用的各对荧光定量PCR引物序列如表1所示，荧光定量PCR方法与实施例1所述一致)。对髓系分化的两个方向，分别选取了常见的几个特异性基因作为分化指标，如单核/巨噬系分化过程中CD14、ITGAM(即CD11b)和CSF1R表达水平明显上调；而粒系分化过程中，ITGAM和CSF3R的表达水平上调的同时MPO表达水平却出现下调。MPO为髓系祖细胞或前提细胞特异表达的基因，在向粒系分化时其表达水平会逐渐下调。如图9A所示，与转染对照相比，在诱导剂PMA作用下，过表达miR-638能显著提升CD14、ITGAM和CSF1R三个髓系特异性基因mRNA的表达水平；相似的结果也在HL-60诱导向粒系分化时发现(如图9B)，与转染对照相比，在诱导剂ATRA作用下，过表达miR-638显著提升ITGAM和CSF3R的表达水平。而MPO这一髓系前体细胞特异表达的基因，在miR-638过表达的细胞中下降的水平比对照细胞更为明显。

表1实时荧光定量PCR引物列表

相反地，转染miR-638抑制剂及其对照对诱导髓系分化特异性基因的表达变化情况与图9的结果完全相反。下调miR-638的同时也抑制了THP-1诱导向单核细胞分化特异性基因CD14、ITGAM和CSF1R mRNA的表达(如图10A)；同时也抑制了HL-60诱导向粒系分化特异性基因ITGAM和CSF3R的表达水平，而祖细胞特异性表达的MPO水平要高于对照(如图10B)。

综合上述几部分的实验结果，表明miR-638能促进髓系白血病细胞系THP-1和HL-60在体外诱导向单核/巨噬系或粒系的分化。

实施例4miR-638能抑制HL-60细胞增殖及克隆形成能力

在HL-60细胞中，本实施例通过瞬时转染miR-638模拟物的方法，检测了过表达miR-638后，对HL-60细胞增殖能力的影响。HL-60细胞在转染24小时之后，分别对转染模拟物对照和miR-638模拟物的细胞进行计数，并绘制生长曲线。如图11A所示，过表达miR-638导致HL-60细胞的增殖明显低于转染阴性对照的细胞。而且，在同样的细胞中，用CCK-8试剂检测了在添加PMA诱导剂情况下，二者之间的生长趋势：在处理后的第二天即出现了极显著的差异；转染miR-638的实验组细胞基本未出现明显的增殖，而对照组则缓慢生长(图11B)。这些结果表明，过表达miR-638能导致细胞增殖受阻。

此外，本实施例还将miR-638基因(610bp)克隆到MDH1-PGK-GFP2.0载体(该载体为一种常规商品化质粒载体，详见网站http://www.addgene.org/11375/和引用文献MicroRNAs modulate hematopoietic lineage differentiation.Science,2004,303(5654):83-6，由美国德州农工大学的周北雁博士馈赠)，相应的感染人细胞系的辅助载体pCL-Eco(一种常规商品化质粒载体，详见网站http://www.addgene.org/12371/)，然后通过逆转录病毒感染的方式导入HL-60细胞，构建稳转细胞系HL-60-MDH1-miR-638，使miR-638能持续过表达。空载体包装病毒感染得到的稳转细胞HL-60-MDH1-Vector，作为阴性对照。

构建稳转细胞系HL-60-MDH1-miR-638及其阴性对照细胞系HL-60-MDH1-Vector的实验流程简介如下：

1、miR-638基因片段扩增

利用设计的引物从人基因组序列中扩增得到miR-638的表达基因片段。miR-638基因片段扩增所用的PCR引物如下：

MDH1-638-FP：5’-AATATCTCGAGCCCGGGAGCAACGGCTACAGA-3’，

MDH1-638-RP：5’-GAGTTGAATTCAATTAATTTTTATGGACAGCCCGAAAGAG-3’。

注：粗体序列表示酶切位点；下划线序列分别根据载体要求添加，以促进转录起始(MDH1-638-FP)和终止(MDH1-638-RP)的序列。利用常规PCR方法，以人基因组序列作为模板，扩增得到miR-638的基因序列(610bp长，如SEQ ID NO.1所示)。

对于阴性对照细胞系HL-60-MDH1-Vector中所转染的质粒载体，可直接采用MDH1-PGK-GFP2.0即可。

2、PCR产物凝胶电泳回收

具体实验方法参照武汉摩尔生物公司提供的试剂盒操作流程。

3、PCR片段和载体的双酶切、回收、连接及转化

采用常规的分子生物学方法进行如上一些列的分子生物学实验操作。

4、阳性克隆的鉴定与测序

将筛选到的阳性克隆通过常规PCR和测序方法进行鉴定，得到miR-638的逆转录病毒表达载体MDH1-miR-638。

5、逆转录病毒包装、病毒滴度的检测及细胞感染

以MDH1-PGK-GFP2.0或MDH1-miR-638和其辅助载体pCL-Eco包装形成逆转录病毒，用以感染HL-60细胞，以筛选稳转细胞系。使用10cm细胞培养皿进行转染和病毒包装，转染试剂选用Invitrogen公司的Lipofectamine2000。具体实验方法如下：

(1)转染前一天接种HEK293T细胞(购自中国科学院上海细胞库)，每10cm培养皿接种4～7×10⁶个细胞。

(2)细胞的转染。高纯质粒转染用量分别为：12μg MDH1-PGK-GFP2.0(或MDH1-miR-638)和12μg pCL-Eco质粒。流程如下：

(a)用1.5mL Opti-MEM(美国Gibco公司产品)稀释总共24μg的质粒混合液；另外用1.5mL Opti-MEM稀释60μL的Lipofectamine2000转染试剂，室温静置5min；

(b)将转染试剂的稀释液缓慢滴加到DNA稀释液中，混匀，室温静置20min；

(c)将DNA和Lipofectamine2000混合液滴加到细胞皿中，二氧化碳培养箱继续培养4～6小时后，更换新鲜的、预热过的DMEM培养基(美国Gibco公司产品，含10％FBS)；

(d)再次更换新鲜培养液，并将细胞转移至32℃培养。

(3)转染后48小时，收集培养上清液(包含病毒颗粒)，用0.45μm滤器过滤上清，得到病毒原液，可直接进行细胞感染或2mL分装后，-80℃保存。培养皿中的细胞再次添加新鲜的、预热过的DMEM培养基，以便收集二次病毒液。

(4)在细胞感染前需检查病毒液滴度，具体方法如下：

(a)第一天：将293T细胞接种于24孔板中，每孔细胞1×10⁴个；

(b)第二天：将病毒原液以1:1、1:10、1:100、1:1000的比例用DMEM培养基(美国Gibco公司产品)稀释至1mL，加入聚凝胺(Sigma公司产品，8mg/mL)；

(c)第三天：更换培养基，继续培养24小时；

(d)第四天：消化收集细胞，500μL PBS缓冲液重悬，流式细胞术检测GFP阳性细胞比例(MDH1-PGK-GFP2.0载体表达GFP，被感染细胞为阳性)；计算病毒液的滴度＝细胞数×GFP％×稀释倍数。

(5)细胞感染：根据计算的病毒滴度，离心得到合适的细胞数量，重悬细胞；加入病毒液，然后加入聚凝胺至终浓度为8μg/mL。2500rpm(1400×g)，室温离心1小时，然后将细胞转移至37℃培养箱孵育3小时。

(6)可以再次重复步骤5的感染过程。

(7)感染细胞继续培养2～3天后，进行稳转细胞的常规筛选即可。

如图12A所示，经转染的HL-60细胞经流式细胞术分选后，对照组和实验组中阳性细胞(GFP+)的比例均在98％以上。随后，通过实时荧光定量PCR对miR-638在这两个稳转细胞中的表达水平进行了检测，如图12B所示，过表达miR-638的稳转细胞内成熟miR-638的表达水平约为整合空载体对照细胞的2倍左右。该结果表明，HL-60稳转过表达miR-638细胞系构建成功。随后在添加PMA或者ATRA的情况下，对细胞进行计数，并绘制生长曲线，细胞增殖分析显示，过表达miR-638的稳转细胞增殖能力要低于对照细胞(图13A、B)。综合以上结果，表明miR-638的过表达能显著抑制其细胞增殖能力。

肿瘤细胞在软琼脂中的克隆形成能力，是衡量肿瘤恶性程度的重要指标之一。本实施例还对过表达miR-638的稳转细胞及其对照细胞，进行了软琼脂克隆形成实验。如图14所示，在HL-60细胞中过表达miR-638后，形成克隆的数量显著低于对照细胞(图14B为重复实验的统计结果)，而且形成克隆的大小也要明显不及对照组(p<0.01)。

实施例5miR-638促进原代AML病人白血病细胞体外诱导的髓系分化

为了研究过表达miR-638对原代AML原始细胞髓系分化的影响，本实施例从一例AML-M1型病人的外周血中分离得到了单个核细胞，然后瞬时转染miR-638模拟物，并检测到miR-638上调表达(图15A)。异位过表达miR-63824小时后，添加PMA诱导48小时，检测单核细胞的特异分化标志物CD14的比例比对照组高出约6.1％；而对ATRA诱导的向粒系分化的比例比对照在高出5％左右(图15B)。结果表明miR-638在一定程度上促进了AML原始细胞在PMA或ATRA诱导下的髓系分化。

表1原代AML细胞中miR-638对PMA诱导的单核细胞分化的统计数据

注：*，为慢性髓系白血病的慢性期转为急性期的病人，且取样前未经过治疗；&，平均荧光信号强度(Mean Fluorescence Intensity)；N.A.，not analyzed，未分析。

此外，本实施例还从两例白血病病人(CML急转和AML-M5型)的的外周血中分离得到了单个核细胞，详细分析和统计了上调miR-638表达对诱导剂诱导的髓系分化的影响(如表1和表2所示)。

表2原代AML细胞中miR-638对ATRA诱导的粒系分化的统计数据

注：*，为慢性髓系白血病的慢性期转为急性期的病人，且取样前未经过治疗；&，平均荧光信号强度(Mean Fluorescence Intensity)。

综上所述，miR-638在AML患者中的异常表达与白血病的发生间存在关联，重新上调miR-638表达能促进原始细胞在诱导剂作用下的单核/巨噬或粒系分化，该发现与在细胞系中的功能研究结果是一致的。而加快AML患者外周血中的原始细胞的细胞分化进程，促进那些处于低分化或去分化状态的恶性肿瘤细胞向成熟细胞方向分化，重建正常血细胞表型，恢复正常造血功能，并最终促进恶性白血病细胞凋亡和抑制增殖，从而达到治愈白血病的目的。

Claims (5)

1.miR-638在制备抗急性髓系白血病药物中的应用。

2.miR-638的表达载体在制备抗急性髓系白血病药物中的应用。

3.一种抗急性髓系白血病药物，其特征在于：包含miR-638。

4.一种抗急性髓系白血病药物，其特征在于：包含miR-638的表达载体。

5.根据权利要求2所述的应用或权利要求4所述的药物，其特征在于：所述的miR-638的表达载体的骨架载体为MDH1-PGK-GFP 2.0。