CN105838784A - miR-99a作为急性髓系白血病干细胞分子标志的应用 - Google Patents

Abstract

本发明提供了miR‑99a作为急性髓系白血病干细胞分子标志的应用，本发明还提供了其在作为评价髓系白血病预后、疾病进展和治疗中的用途。本发明以流式分选和实时荧光定量PCR技术为基础，以白血病患者的骨髓miR‑99a为检测对象，通过比对白血病患者异常细胞群中白血病干细胞和非干性白血病细胞、白血病干细胞和正常造血干细胞中的表达水平，发现miR‑99a在复发和难治患者的白血病干细胞中异常高表达，并且与患者预后不良相关。因此，将miR‑99a作为白血病干细胞的标志物和分子靶标，为白血病的预后评估提供了新的分子标志，同时也为个体化治疗提供了新的分子靶标，用于制备以检测miR‑99a表达为基础的诊断治疗产品，该产品将对肿瘤的治疗具有重要意义和临床应用价值，有广阔的应用前景。

Description

miR-99a作为急性髓系白血病干细胞分子标志的应用

技术领域

本发明涉及急性髓系白血病预后诊断领域，具体来说涉及一种急性髓系白血病干细胞分子标志miR-99a，其可应用于急性髓系白血病预后评估、疾病进展和靶向治疗，给患者进行精准诊疗，以期达到完全缓解和长期生存。

背景技术

白血病(leukemia)是一类恶性造血细胞异常增殖疾病，在我国被列为十大高发恶性肿瘤之一，在儿童和35岁以下成人中居第一位。其中，急性髓系白血病(Acute myeloid leukemia,AML)在我国发病率最高，并且有逐年上升的趋势。随着近年来各种治疗方法的发展，白血病化疗的完全缓解率(complete remission，CR)有所提高，但仍有60～70％的患者治疗后耐药或复发。白血病被认为是正常造血干祖细胞发生染色体异常或多基因突变引起的表达谱改变的结果。具有自我更新、分化和无限增殖能力的白血病干细胞的存在被认为是白血病治疗后耐药和复发的根源。白血病干细胞自我更新和耐药的特性正是由异常表达的基因所维持，如果能找到特定基因作为精准诊断、预后评价和治疗的靶点，对于白血病患者疾病进展监控、实现长期生存具有重要意义。

急性髓系白血病的治疗不仅需要明确的诊断和预后评价，选择准确的疗法，完全缓解后还需要监测疾病进展，预防复发。目前急性髓系白血病的治疗是针对快速分裂的白血病细胞群，但在根除功能不同的白血病干细胞群上收效甚微。白血病预后评价方面，基因突变与白血病预后的最为密切相关，如P53、DNMT3a、Flt3/ITDs、C-KIT等基因突变的急性髓系白血病患者大多预后不良。但由于这些基因突变的检测技术要求高，价格昂贵，耗时较长，并不适于普遍开展。无论基因突变，还是染色体异常，均影响信号通路中基因表达水平的改变，最终影响疾病进程和预后。因此基于检测基因表达的实时荧光定量PCR技术，耗时短、易操作、可重复、费用低等优点，更适于临床检测。

microRNA(miRNA)广泛参与包括细胞增殖、分化、凋亡、肿瘤发生在内的多种病理生理过程的调控。miRNA是非编码单链小RNA，通过与靶mRNA 3’-UTR互补配对结合，在转录后水平调控基因表达。单一的miRNA能够靶向多个mRNA，从而调节相应的多个蛋白的表达，处在基因与蛋白相互连接网络中心的重要环节。近年来miRNA成为研究热点，在各种肿瘤疾病的临床诊断、预后进展评估及治疗方面起重要作用。大量研究表明，miRNA的异常表达参与白血病的发生与进展。miR-17-92能够通过抑制祖B细胞(Pro-B)向前B细胞(Pre-B)转化来抑制B细胞发育。在混合谱系白血病基因(MLL)重排的白血病细胞中，该miR-17-92簇则过度表达，通过抑制正常造血发生来参与白血病进程。此外，miR-125b在儿童APL患者中表达增高，与患者化疗反应和复发相关。体外过表达miR-125b，可通过调节肿瘤抑制基因Bak1的表达促进细胞增殖，抑制凋亡，并增加对化疗药的耐受。尽管已有研究以miRNA作为急性髓系白血病标志物评价预后和进展，但是这些研究均忽略了白血病难治和复发的根源——白血病干细胞。在临床和研究中，需要寻找与预后进展及靶向治疗相关的白血病干细胞标志物。

发明内容

本发明提供了miR-99a作为急性髓系白血病干细胞分子标志物中的新的应用。

该miR-99a，其序列为5’-AACCCGUAGAUCCGAUCUUGUG-3’。

在上述发现的基础上，本发明还提供了急性髓系白血病干细胞分子标志物miR-99a在制备诊断急性髓系白血病疾病预后和进展的诊断试剂中的用途。

具体地，所述诊断试剂通过检测被试者骨髓白血病干细胞中的miR-99a的表达量，并与正常对照平均值相比较来诊断疾病进展，评价预后。

其中miR-99a在急性髓系白血病干细胞较非干性白血病细胞高表达，较正常造血干细胞高表达，特别在难治和复发后的标本中异常高表达。miR-99a在CD34⁺髓系白血病细胞系和耐药细胞系中高表达。在细胞系中过表达miR-99a，可使细胞获得增殖增强和耐药的特性。由此可见，miR-99a可作用急性髓系白血病干细胞的分子标志，并与预后和进展相关。

本发明还提供了一种急性髓系白血病预后进展辅助诊断试剂盒，该试剂盒包括：

(1)、骨髓单个核细胞分离试剂Ficoll(购自Sigma公司)，白血病干细胞富集标志FITC-CD45、PE-CD34抗体(购自BD Biosciences公司)；

(2)、miR-99a的特异引物和探针(购自Invitrogen^TM公司)；

(3)、U6内参标志物的特异引物和探针(购自Invitrogen^TM公司)；

进一步,该试剂盒还包括：

(4)、逆转录酶、qPCR Mix、10mM dNTPs、逆转录缓冲液、RNase抑制剂(购自Invitrogen^TM)，DEPC水；

(5)、总RNA提取试剂Trizol(购自Invitrogen^TM)，异丙醇，无水乙醇，氯仿，PBS缓冲液。

本发明所具有的有益效果：

本发明提供的微小核糖核酸标志物miR-99a作为急性髓系白血病进展诊断标志物的优越性在于操作简单、检测精确、重复好、代价低，适合大量筛查和临床应用。

附图说明

图1为急性髓系白血病复发患者复发前后白血病干细胞miRNA表达谱分析；

A.复发前后单个核细胞中白血病干细胞的富集；

B.复发后白血病干细胞中表达显著上调的miRNA。

图2为qPCR技术检测miR-99a在AML患者和髓系细胞系中的表达差异；

A.13个AML患者白血病干细胞和非干性白血病细胞miR-99a的表达差异；

B.miR-99a在AML患者白血病干细胞和正常脐血造血干祖细胞中的表达差异；

C.D.miR-99a在髓系白血病细胞系和耐药细胞系中的表达变化。

图3为miR-99a在急性髓系白血病干细胞中的不同表达患者累积生存(A)和无事件生存(B)比较。

具体实施方式

下面结合具体实施例对本发明进行进一步说明，但不限定本发明的保护范围。

实施例1

1、接受急性髓系白血病患者骨髓13例和正常脐血对照5例，于15ml离心管中预置Ficoll3ml，将骨髓液缓慢加之其上，不要破坏界面。流式分选获取白血病干细胞和正常造血干细胞；20℃，2000rpm离心20分钟；吸弃上清后小心收集单个核细胞层(白膜层)于含有10mlPBS的离心管中，离心(同上)；弃上清，重悬，计数，离心，每10⁷细胞用100μl的PBS缓冲液重悬，加FITC-CD45、PE-CD34抗体各2μl，避光30分钟；洗涤细胞，上机分选CD34⁺细胞和CD34^-细胞。

2、使用1ml Trizol裂解细胞，加入0.2ml氯仿，15-30℃剧烈振荡15s，静置3min；4℃，12000g离心15分钟，加入0.5ml(0.8倍体积)异丙醇，将管中液体轻轻混匀，室温静置10min；4℃，12000g离心15分钟，弃上清。加入1ml 75％乙醇(DEPC水或无酶水配制)，涡旋震荡，轻轻洗涤沉淀，2min。4℃，7500g离心15分钟，弃上清；晾干，加入适量的DEPCH₂O(10-30μl)溶解RNA，使用Thermo NanoDrop2000测定浓度，琼脂凝胶电泳检测RNA的提取质量。

3、逆转录得到cDNA

使用Invitrogen^TM生物公司的逆转录试剂，包括逆转录酶、特异性miRNA逆转录引物等，配制miR-99a逆转体系如下：

配制miR-99a逆转体系如下：

配制以上液体混匀，16℃孵育30分钟，42℃孵育30分钟，85℃孵育5分钟，4℃冷却，-20℃保存cDNA。

4、实时定量PCR(Real-time Quantitative PCR，qPCR)检测

按下列体系配制miR-99a反应液：

按下列体系配制U6反应液：

miR-99a及内参miRNA(U6)qPCR引物及探针荧光定量检测试剂等购自Invitrogen^TM生物公司。将上述反应液置于8连管(购自ABI公司)，每个样品三个重复孔，放入ABI7500仪器中，设定反应条件为：

5、数据的标准化处理：

以三次实验的平均值作为特定miRNA的Ct值，具体过程可参见产品使用说明；根据测得的样品中miRNA的Ct值，以U6为参照，以经典的2^-△△Ct相对定量PCR求得选定miRNA在白血病干细胞中的相对含量；

在本发明中，以Ficoll分离出复发病人复发前后骨髓单个核细胞，并标记FITC-CD45、PE-CD34抗体，BD FACS AriaIII分析并分选异常细胞群中白血病细胞和白血病干细胞。图1A所示，AML患者复发后骨髓中异常细胞群比例增高，同时白血病干细胞比例增高。表明白血病干细胞与AML病症进程相关。Trizol裂解分选细胞并送公司检测miRNA表达谱。图1B所示，复发后AML骨髓标本白血病干细胞中miR-99a的表达明显增高，是初诊的5.8倍。用相同的方法从另外13个AML标本中分选白血病干细胞和非干性白血病细胞(图2A)，结果均显示，miR-99a在白血病干细胞中高表达，表明miR-99a为AML白血病干细胞标记基因。图2B显示，与正常脐血造血干细胞相比，miR-99a在急性髓系白血病干细胞中高表达。另外，在CD34⁺髓系白血病细胞系中和耐药细胞株中，miR-99a高表达(图2C、D)。累积生存和无事件生存分析结果表明(图3A、B)，miR-99a高表达患者总生存期和无事件生存期缩短。总之，不仅为AML白血病干细胞标记基因，明显高表达，并且miR-99a高表达与耐药复发相关，为预后不良标志。

实施例2

一种急性髓系白血病预后进展辅助诊断试剂盒，该试剂盒包括：

(1)、骨髓单个核细胞分离试剂Ficoll(购自Sigma公司)，白血病干细胞富集标志FITC-CD45、PE-CD34抗体(购自BD Biosciences公司)；

(2)、miR-99a的特异引物和探针(购自Invitrogen^TM公司)；

(3)、U6内参标志物的特异引物和探针(购自Invitrogen^TM公司)；

(4)、逆转录酶、qPCR Mix、10mM dNTPs、逆转录缓冲液、RNase抑制剂(购自Invitrogen^TM)，DEPC水；

(5)、总RNA提取试剂Trizol(购自Invitrogen^TM)，异丙醇，无水乙醇，氯仿，PBS缓冲液。

Claims (6)

1.miR-99a作为急性髓系白血病干细胞分子标志物中的应用。

2.急性髓系白血病干细胞分子标志物miR-99a在制备诊断急性髓系白血病疾病预后和进展的诊断试剂中的应用。

3.根据权利要求2所述的应用，其特征在于：所述诊断试剂通过检测被试者骨髓白血病干细胞中的miR-99a的表达量，并与正常对照平均值相比较来诊断疾病进展，评价预后。

4.根据权利要求3所述的应用，其特征在于：miR-99a在急性髓系白血病干细胞较非干性白血病细胞高表达，较正常造血干细胞高表达，特别在难治和复发后的标本中异常高表达，miR-99a在CD34⁺髓系白血病细胞系和耐药细胞系中高表达。

5.一种急性髓系白血病预后进展辅助诊断试剂盒，其特征在于：该试剂盒包括：

(1)、骨髓单个核细胞分离试剂Ficoll，白血病干细胞富集标志FITC-CD45、PE-CD34抗体；

(2)、miR-99a的特异引物和探针；

(3)、U6内参标志物的特异引物和探针。

6.根据权利要求5所述的一种急性髓系白血病预后进展辅助诊断试剂盒，其特征在于：该试剂盒还包括：

(4)、逆转录酶、qPCR Mix、10mM dNTPs、逆转录缓冲液、RNase抑制剂，DEPC水；

(5)、总RNA提取试剂Trizol(购自Invitrogen^TM)，异丙醇，无水乙醇，氯仿，PBS缓冲液。