CN101555520A - 早期预测慢性乙肝发展成肝硬化的hsa-mir-122试剂盒及检测方法 - Google Patents

Abstract

本发明涉及医学生物检测技术领域，是一种用于检测血浆或血清中的hsa－mir－122的含量，来早期预测慢性乙肝发展成肝硬化的试剂盒，及其检测方法。目前还没有一种有效的方法来预测慢性乙肝转归成肝硬化，给临床上早期预测及治疗带来不便。本发明通过对健康人群、慢性乙肝病人，以及四种不同病情的慢性乙肝病人血浆中hsa－mir－122的含量比较发现：hsa－mir－122的含量变化情况可以作为慢性乙肝发展为肝硬化的早期预测手段。本发明提供一种早期预测慢性乙型肝炎发展成肝硬化的hsa－mir－122检测试剂盒，该试剂盒包括反转录引物、Real－time PCR的上下游引物和扩增系统等，经临床试用，检测的准确率达85％左右，因此本发明试剂盒可用于早期预测慢性乙肝发展成肝硬化。

Description

早期预测慢性乙肝发展成肝硬化的hsa-mir-122试剂盒及检测方法

技术领域

本发明涉及医学生物检测技术领域，是一种用于检测血浆或血清中的hsa-mir-122的含量，来早期预测慢性乙肝发展成肝硬化的试剂盒，及其检测方法。

背景技术

慢性乙型肝炎是由乙型肝炎病毒(HBV)感染引起的一种慢性传染性疾病，易发展为肝硬化、肝癌。全球大约有20亿人曾经感染过乙型肝炎病毒，目前大约有3.5亿慢性乙型肝炎病毒携带者，而且70％都在我们亚洲地区。

肝硬化是一种以肝组织弥漫性纤维化，假小叶和再生结节形成为特征的慢性疾病，是慢性乙型肝炎的一个严重结局，如能阻断、减轻乃至逆转慢性乙型肝炎的进一步发展，就能在很大程度上改善肝病的预后。早期肝硬化系指临床上无任何特异性症状或体征，肝功能检查无明显异常，但在肝脏组织学上已有明显的病理变化。由于早期肝硬化在临床上无任何特异性的症状和体征，故处于亚临床的病理变化阶段，当患者出现明显症状时，大多数病情已经进展到了严重程度，给患者带来精神和经济上的沉重负担。因此，早期预测肝硬化的发生发展，对指导临床实践有重要意义。

目前还没有可靠的实验室或影像学方法对慢性肝炎发展成肝硬化进行早期预测。尽管肝脏活检、进行组织病理学检查仍是诊断肝硬化的“金标准”，但只能在肝硬化发生以后对其进行确诊，而且还存在技术上的限制和危险，如肝脏病变的不均匀性而导致的取样误差。由于存在一定的损伤性，患者难以接受反复取材，故而不能动态观察肝纤维化及肝纤维化形成的情况。因此，寻找令人满意的预测肝硬化发展的有效、非侵袭性的实验室指标是目前肝病临床研究的一个热点。

microRNA(miRNA)是一类长度约21～25碱基的非编码蛋白质单链小分子RNA，广泛存在于多细胞生物和病毒体内，主要通过核酸序列互补匹配结合到特定的靶mRNA上，抑制靶mRNA翻译过程或降解靶mRNA，是一种起负调控作用的分子。目前越来越多的研究显示，miRNA广泛参与了生物体多种生理过程，且相关研究报道也表明其表达及功能失调可能导致肿瘤发生、白血病以及病毒感染等多种病理现象。

对于miRNA能否作为一种实验室无创性检测手段，目前更多的研究集中在对于癌症早期诊断方面。这一新兴研究领域仅仅在测定血清标志物上开始得到应用。已有实验证实，miRNA在血浆和血清中非常稳定，它们被有效保护以免接触RNases，在严酷环境条件下仍能保持稳定。因此，它们的稳定性使得其实际值与在病人身上得到的测试值吻合得很好。

目前，对于miRNA的早期预测功能主要集中在肿瘤方面，比如：CharlesH.Lawrie等人证实：弥漫性B细胞淋巴瘤病人的血清hsa-mir-21水平很高，后者与不复发存活率密切相关(参见文献Lawrie CH，Gal S，Dunlop HM，et al.Detection of elevated levels of tumourassociated microRNAs in serum of patientswith diffuse large B-cell lymphoma.Br J Haematol 2008；141：672-675)。ChenX等人在细胞研究杂志上的报道对肺癌、结肠癌和糖尿病的患者血清miRNAs水平进行了分析，确定这些疾病都有其特异性的血清miRNA表型(参见文献Chen X，Ba Y，MaL，et al.Characterization of miRNAs in serum：a novel class ofbiomarkers for diagnosis of cancer and other diseases.Cell Res2008；18：997-1006)。

hsa-mir-122(Mature sequence MIMAT0000421)是一种在人肝脏中特异性表达的miRNA。无论是在成人或是胎儿肝脏中，都大量存在。成人肝脏中，hsa-mir-122的量占总miRNAs的70％左右。目前对于hsa-mir-122的报道，主要集中在其对于原发性肝癌、应激反应、脂代谢等的相关研究上，比如：在肝癌形成的过程中，mir-122显著下调，并且逆向表达细胞周期调节蛋白G1(Gramantieri L，Ferracin M，Fornari F，Veronese A，Sabbioni S，Liu CG，et al.Cyclin G1 is a target of miR-122a，a microRNAfrequently down-regulated inhuman hepatocellular carcinoma.Cancer Res 2007；67：6092-6099.)；miR-122通过对于CAT-13’UTR的抑制作用起到对细胞的应激反应(Bhattacharyya SN，Habermacher R，Martine U，Closs EI，Filipowicz W.Relief of microRNA-mediated translational repressionin human cells subjected to stress.Cell2006；125：1111-1124.)；miR-122的表达沉默，导致血浆胆固醇水平显著增高(Czech MP.MicroRNAs as therapeutic targets.N Engl J Med2006；354：1194-1195.)等等。

至今未见一种用于检测血浆或血清中的hsa-mir-122含量，来早期预测慢性乙肝发展成肝硬化的试剂盒的报道。

发明内容

本发明的目的在于提供一种早期预测慢性乙型肝炎发展成肝硬化的hsa-mir-122检测试剂盒，及其检测方法。

本发明的一种早期预测慢性乙型肝炎发展成肝硬化的hsa-mir-122检测试剂盒，是通过检测血浆或血清中的hsa-mir-122分子含量的变化，监测或早期预测慢性乙型肝炎发展成肝硬化的可能或进程，以便尽早采取措施或药物治疗，防止肝硬化的发生或发展，进而防止转变成肝癌。

本发明通过对正常人血浆中hsa-mir-122的含量比较；健康人群与慢性乙肝病人血浆中hsa-mir-122的含量比较；以及四种不同病情的慢性乙肝病人血浆中hsa-mir-122的含量比较，发现：慢性乙肝中度的病人血浆中hsa-mir-122含量明显高于健康人群，约是健康人群的8倍左右，病情发展到重度时，血浆当中hsa-mir-122的含量最高，约是健康人群的10倍左右；当发展成为肝硬化后，从肝硬化的代偿期到失代偿期，hsa-mir-122含量逐渐减少，但平均含量还是高于健康人群，约是健康人群的3倍左右。这个结果显示了随着慢性肝炎病情发展，hsa-mir-122的含量变化情况，hsa-mir-122从高变低的过程，可以作为慢性肝炎进展为肝硬化的早期预测手段。

本发明提供一种早期预测慢性乙型肝炎发展成肝硬化的hsa-mir-122检测试剂盒，该试剂盒由反转录系统、引物系统和扩增系统组成，其中的引物系统由特异性的hsa-mir-122反转录引物及Real-time PCR的上、下游引物组成。

hsa-mir-122反转录引物为：

GTCGTATCCAGTGCGAACTGTGGCGATCGGTACGGGCTACACTCGGCA

ATTGCACTGGATACGAC CAAACA(SEQ ID NO：1)；

Real-time PCR上游引物为：GCGTGGAGTGTGACAATGG(SEQ ID NO：2)；

Real-time PCR下游引物为：AGTGCGAACTGTGGCGAT(SEQ ID NO：3)。

本发明试剂盒的引物是根据已知的生物信息学查得hsa-mir-122的成熟体序列而设计的(详见http://microrna.sanger.ac.uk/sequences/)，包括其特异性的反转录引物、Real-time PCR的上下游引物均通过Primer 5引物设计软件设计。

hsa-mir-122的成熟体序列：UGGAGUGUGACAAUGGUGUUUG(SEQID NO：4)

上述试剂盒的反转录系统由反转录酶、反转录体系缓冲液和RNA酶抑制剂组成，扩增系统由SYBR Premix Ex Taq^TM试剂组成。

本发明的试剂盒，具体组成如下：

A)hsa-mir-122反转录引物(SEQ ID NO：1)，1管，浓度：10μM，100μl/管；

B)Real-time PCR上游引物(SEQ ID NO：2)，1管，浓度：10μM，100μl/管；

Real-time PCR下游引物(SEQ ID NO：2)，1管，浓度：10μM，100μl/管；

C)Trizol reagent(总RNA提取试剂)，1管，2000μl/管

D)氯仿1管，500μl/管；

E)无水乙醇1管，7ml/管；

F)DEPC H₂O(经焦炭酸乙二酯处理的纯水)1管，1000μl/管

G)dd H₂O(双蒸水)1管，2000μl/管。

使用本发明试剂盒监测或早期预测慢性乙肝发展成肝硬化，首先，将若干已知的健康人、慢性乙肝病人、肝硬化病人编组，用本发明试剂盒分别检测健康人组、慢性乙肝病人组、肝硬化病人组血清中hsa-mir-122含量，以此作为对照的标准数据。再用相同的方法检测未知患者血清中hsa-mir-122含量，对照上述标准数据，即可初步确定该患者是否为健康人、慢性乙肝病人或肝硬化病人，以便作进一步检查确诊。

本发明还提供上述早期预测慢性乙型肝炎发展成肝硬化的hsa-mir-122检测试剂盒的检测方法，如下：

按常规抽血取血清或血浆，用总RNA提取试剂处理血清或血浆，加氯仿离心后取上层水相，并富集血清或血浆中的小RNA；由反转录系统反转录hsa-mir-122成cDNA；用扩增系统进行Real-time PCR扩增，测定hsa-mir-122含量。

在临床上随机抽取了20例慢性乙肝无肝硬化病人，使用本发明所提供的试剂盒，对其外周血进行跟踪检测，有11例病人的外周血hsa-mir-122含量有下降的趋势，在随访的这11人中，有9例后被确诊为肝硬化，检测的准确率达85％左右。因此本发明试剂盒可用于早期预测慢性乙肝发展成肝硬化。本发明试剂盒制备方法简单，使用方便，为非侵入性检测方法，检测的准确率较高，有利于早期预测慢性乙肝发展成肝硬化。

附图说明

图1：健康人血浆中hsa-mir-122的含量比较；

图2：定量RT-PCR验证健康人群与慢性乙肝病人相比血浆中hsa-mir-122的差异表达柱状图；

图3：定量RT-PCR验证五种不同病情的慢性乙肝病人相比血浆中hsa-mir-122的差异表达柱状图。

具体实施方式：

下面结合附图和实施例对本发明作进一步描述，但本发明的实施不仅限于此。

实施例1：制备本发明的试剂盒(供一人用)

本发明的试剂盒组成如下：

1.反转录引物1管，100μl/管浓度：10μM反转录引物为：

GTCGTATCCAGTGCGAACTGTGGCGATCGGTACGGGCTACACTCGGCA

ATTGCACTGGATACGAC CAAACA

2.Real-time PCR的上、下游引物各1管，100μl/管浓度：10μM；

上游引物为：GCGTGGAGTGTGACAATGG

下游引物为：AGTGCGAACTGTGGCGAT

3.Trizol reagent 1管    2000μl/管

4.氯仿           1管    500μl/管

5.无水乙醇       1管    7ml/管

6.DEPC H₂O       1管    1000μl/管

7.dd H₂O         1管    2000μl/管。

本发明根据已知的生物信息学查得hsa-mir-122的成熟体序列UGGAGUGUGACAAUGGUGUUUG，其特异性的反转录引物、Real-timePCR的上下游引物均通过Primer 5引物设计软件设计，由美国invitrogen公司负责引物合成。

设计的引物序列如下：

(1)反转录引物：

GTCGTATCCAGTGCGAACTGTGGCGATCGGTACGGGCTACACTCGG

CAATTGCACTGGATACGAC CAAACA(SEQ ID NO：1)

(2)Real-time PCR的上下游引物：

上游引物：GCGTGGAGTGTGACAATGG(SEQ ID NO：2)

下游引物：AGTGCGAACTGTGGCGAT(SEQ ID NO：3)

制备包括下列组成成分的试剂盒：总RNA提取试剂、氯仿、无水乙醇、特异性hsa-mir-122反转录引物(100μl/管浓度：10μM)、特异性的hsa-mir-122上游引物(100μl/管浓度：10μM)、下游引物(100μl/管浓度：10μM)、DEPC H₂O(1000μl/管)、dd H₂O(2000μl/管)

DEPC H₂O的配置：用购买的DEPC(焦碳酸二乙酯)，纯度＞99％，密度为1.12g/ml，配置DEPC H₂O。100mlMiliQ纯水中加0.1mlDEPC，放在100ml干烤过的容量瓶中静置4小时后高压灭菌，制成千分之一浓度的DEPC H₂O，经检测不含RNase、DNase和proteinase。用来溶解合成的反转录引物，并作为反转录时的稀释用水。

dd H₂O的配置：MiljQ纯水经高压灭菌后，配置成Real-time PCR用的dd H₂O。

特异性hsa-mir-122反转录引物：通过Primer 5引物设计软件设计，由美国invitrogen公司负责引物合成，纯度为PAGE级，合成后的引物用DEPC H₂O溶解，终浓度为10μM。

特异性的hsa-mir-122上游引物：通过Primer 5引物设计软件设计，由美国invitrogen公司负责引物合成，纯度为PAGE级，合成后的引物用ddH₂O溶解，终浓度为10μM。

实施例2：本发明的试剂盒的检测

一、采集血浆样本及样本准备：

由于血浆具有取材方便、无创伤性、连续检测的优点，因此从血浆中检测慢性肝炎生物标志物可以将预测慢性肝炎到肝硬化的转归提高到一个新的水平，从而达到早预防、早治疗的目的。

血浆样本在上海长海医院住院部部采集：25例慢性乙肝中度病人(男：18例女：7例)，28例慢性乙肝重度病人(男：20例女：8例)，25例乙肝合并肝硬化(代偿期)病人(男：21例女：4例)，25例乙肝合并肝硬化(失代偿期)病人(男：15女：4例)，健康对照组10例为健康献血员(男：6例女：4例)。临床诊断符合2005年中华医学会肝病学分会与感染病学分会制订的《慢性乙型肝炎防治指南》，病理诊断参照2000年西安全国病毒性肝炎及肝病学术会议修订的标准。合并急性病毒性肝炎、自身免疫性肝病、酒精性肝病、药物性肝病、代谢性肝病、遗传性肝病、隐源性肝病、血吸虫性肝病的患者被排除；所有患者均无血液、肾脏、肿瘤等可能影响血清水平的疾病，并且近1月内无输血液制品史。入院后均经B超或CT检查排除肝癌。样品收集：收集约4ml病人的外周血放入含360μl EDTA的抗凝管中，静置约1小时。

二、采集血浆样本的处理及提取其中的小RNA：

(1)血浆样本处理：采集的外周血样品4℃离心两次，首先1600g离心10min，取上清，加入新的离心管中，再12000g离心10min，取上清，加入新离心管中。加Trizol reagent(Invitrogen公司购买)，使Trizol reagent∶血浆＝1∶0.8左右。

(2)小RNA提取：添加过Trizol reagent的样本摇晃混匀，放置冰上15min，1000g，4℃离心10min，取上清，分别放入经DEPC处理过的2ml EP管中。每管加入200μl氯仿，摇晃混匀，放置冰上10min左右，12000g、4℃离心15min，取上层水相。下面的步骤按照Applied Biosystems公司购买的mirVana miRNA Isolation Kit中提取小RNA的步骤进行。使用Eppendorf紫外分光光度仪测定RNA的A260值和A260/A280的比值(1.8-2.2)，以评估其浓度和质量。符合定量检测要求的样本进行下一步反应。

三、miRNA的实时定量

1.反转录成hsa-mir-122的cDNA

取富集液50ng为模板，以设计的特异性hsa-mir-122反转录引物进行反转录。按照5×PrimeScript^TM Buffer(for Real Time)4μl、PrimeScript^TM RTEnzyme Mix 0.5μl(PrimeScript^TM RT reagent Kit)(TaKaRa公司)、hsa-mir-122反转录引物0.5μl、富集的小RNA50ng、DEPC H2O(补充H2O使总体积达到20μl)进行反转录。以上步骤所用的tip头、EP管均经过DEPC水处理后高压灭菌。

2.Real-time PCR定量miRNA

采用TaKaRa公司的SYBR Premix Ex Taq^TM试剂和美国AppliedBiosystems公司的：Step Plus One实时定量PCR仪，按照下述体系进行PCR反应：

Premix Ex Taq^TM(2×)            10μl

上游引物(10μM)                 0.4μl(终浓度0.2μM)

下游引物(10μM)                 0.4μl(终浓度0.2μM)

ROX Reference Dye(50×)         0.4μl

反转录产物                      1μl

双蒸水                          7.8μl

总体系                          20μl

经过预实验确立了hsa-mir-122引物的合适退火温度，最终确定以下条件：

本实验采用标准反转录产物倍比稀释法建立标准曲线，每20μl体系分别添加标准反转录产物2，1，0.5，0.25，0.125μl，每种浓度设立3个平行复管。

按照上述Real-time PCR条件，对前期制备的各样本的反转录产物进行检测。每批次PCR均设立标准曲线作为批次间参照，并依据标准曲线设立CT值阈值。每样本均做3个平行复管，取其平均值分析，每个PCR测定中都包括阴性(水)对照。为防止污染，所有反应均在专区的清洁实验台进行，模板添加和引物添加不在同区操作。为防止引物二聚体和非特异性扩增，所有反应均在冰上操作。

获得的各样本hsa-mir-122表达量均由标准曲线转换为相对定量值，目标基因表达量/持家基因U 6表达量进行标准归一化处理。最终获得比值进行比较和统计分析。通过2^-ΔΔCt法计算hsa-mir-122在慢性乙型肝炎及肝硬化病人血浆当中的相对表达量，慢性乙肝中hsa-mir-122的表达平均水平均为健康人表达水平的倍数，健康人外周血中的hsa-mir-122量视为1。

实施例3：健康人外周血血浆当中hsa-mir-122含量比较

有文献报道，在健康人的外周血中，miRNA含量十分稳定，从性别上看，男女之间相差非常小(参见文献：Chen X，Ba Y，Ma L，et al.Characterization ofmiRNAs in serum：a novel class of biomarkers for diagnosis of cancer and otherdiseases.Cell Res 2008；18：997-1006)。在比较病人外周血血浆中miRNA的含量之前，按照实施例1、2相同的方法，先对健康人血浆中hsa-mir-122的量做了一个比较，共10例(男：6例，女：4例)(见图1)。Real-time PCR结果，验证了文献中报道的健康人外周血中miRNA含量基本保持稳定这一说法。

实施例4：健康人群与慢性乙肝病人相比血浆中hsa-mir-122含量比较

按照实施例1、2相同的方法，把采集的所有慢性肝炎病人血浆中hsa-mir-122与健康人血浆中的hsa-mir-122作比较，结果为慢性肝炎病人血浆中hsa-mir-122的含量是健康人血浆中的7.5倍左右。采用t检验，结果P＜0.05，认为慢性乙肝病人血浆中hsa-mir-122的平均含量高于健康人。(见图2)

实施例5：五种不同病情的慢性乙肝病人相比血浆中hsa-mir-122含量比较

我们把慢性乙肝病人随病情发展分为4类：慢性乙肝中度、慢性乙肝重度、慢性乙肝肝硬化代偿期、慢性乙肝肝硬化失代偿期。分别对这五种类型病人血浆中的hsa-mir-122进行检测，与健康人群血浆中hsa-mir-122比较后发现，慢性乙肝中度的病人血浆中hsa-mir-122含量明显高于健康人群，约是健康人群的8倍左右。病情发展到重度时，血浆当中hsa-mir-122的含量最高，约是健康人群的10倍左右(P＜0.01)。当发展成为肝硬化后，从肝硬化的代偿期到失代偿期，hsa-mir-122含量逐渐减少，但平均含量还是高于健康人群，约是健康人群的3倍左右(P＜0.05)(见图3)。这个结果显示了随着慢性肝炎病情发展，hsa-mir-122的变化情况，hsa-mir-122从高变低的过程，可以作为慢性肝炎进展为肝硬化的早期预测手段。

SEQUENCE LISTING

<110>中国人民解放军第二军医大学

<120>早期预测慢性乙肝发展成肝硬化的hsa-mir-122试剂盒及检测方法

<130>说明书，权利要求书

<160>4

<170>PatentIn version 3.1

<210>1

<211>71

<212>DNA

<213>人工序列

<400>1

gtcgtatcca gtgcgaactg tggcgatcgg tacgggctac actcggcaat tgcactggat    60

acgaccaaac a                                                         71

<210>2

<211>19

<212>DNA

<213>人工序列

<400>2

gcgtggagtg tgacaatgg                                                19

<210>3

<211>18

<212>DNA

<213>人工序列

<400>3

agtgcgaact gtggcgat                                                 18

<210>4

<211>22

<212>RNA

<213>人工序列

<400>4

uggaguguga caaugguguu ug                                            22

Claims (3)

1、一种早期预测慢性乙型肝炎发展成肝硬化的hsa-mir-122检测试剂盒，其特征在于该试剂盒包括

hsa-mir-122反转录引物，序列如SEQ ID NO：1所示；

Real-time PCR上游引物，序列如SEQ ID NO：2所示；

Real-time PCR下游引物，序列如SEQ ID NO：3所示。

2、根据权利要求1所述的一种早期预测慢性乙型肝炎发展成肝硬化的hsa-mir-122检测试剂盒，其特征在于该试剂盒主要由以下试剂组成：

A)hsa-mir-122反转录引物，序列如SEQ ID NO：1所示，1管，浓度：10μM，100μl/管；

B)Real-time PCR上游引物，序列如SEQ ID NO：2所示，1管，浓度：10μM，100μl/管；

Real-time PCR下游引物，序列如SEQ ID NO：3所示，1管，浓度：10μM，100μl/管；

C)Trizol reagent，1管，2000μl/管；

D)氯仿，1管，500μl/管；

E)无水乙醇，1管，7ml/管；

F)DEPC H₂O，1管，1000μl/管；

G)dd H₂O，1管，2000μl/管。

3、一种如权利要求1所述的早期预测慢性乙型肝炎发展成肝硬化的hsa-mir-122检测试剂盒的检测方法，其特征在于该检测方法包括以下步聚：

按常规抽血取血清或血浆，用总RNA提取试剂处理血清或血浆，加氯仿离心后取上层水相，并富集血清或血浆中的小RNA；由反转录系统反转录hsa-mir-122成cDNA；用扩增系统进行Real-time PCR扩增，测定hsa-mir-122含量。

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