CN102936629B - 用于肝硬化及肝癌早期诊断的基于微小rna的方法和组合物 - Google Patents
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Abstract
本发明提供了用于肝纤维化/肝硬化及肝癌早期诊断的基于微小RNA的方法和组合物。本发明还提供了微小RNA和/或所述微小RNA的检测引物在制备肝纤维化/肝硬化及肝癌诊断用组合物中的应用。本发明首次揭示并证明了血清miRNA-101-5p水平可以作为一个潜在的无创的早期诊断乙肝/肝硬化相关性肝癌的指标，同时也可以作为一个与肝纤维化/肝硬化诊断相关的指标。
Description
技术领域
本发明涉及生物技术领域，更具体地，本发明涉及用于肝纤维化/肝硬化及肝癌早期诊断的基于微小RNA的方法和组合物。
背景技术
肝纤维化是肝细胞损伤后的一种修复机制，一旦发展成弥漫性伴结节性增生，使正常肝组织结构紊乱，就形成了肝硬化。肝硬化是肝癌的主要风险因素。目前，用于肝纤维化/肝硬化的诊断手段包括：肝组织病理检查、临床评估、血清生化指标、影像学检查、瞬时弹性波扫描（Fibroscan）、蛋白质组学和糖组学技术。但是，这些手段要么灵敏度、特异度较低，要么费用昂贵，限制了其在临床上的便捷使用。
肝癌是世界上第五大常见的癌症，也是死亡率排行第三的癌症。80%的肝癌常与慢性乙型肝炎病毒和/或丙型肝炎病毒感染有关。如此高的致死率是因为缺乏敏感而特异的无创性指标来进行早期诊断。由于早期肝癌症状不明显，通常在晚期才得以确诊，那时，由于大多存在癌细胞肝内或/及肝外转移，病人已经丧失了手术切除病灶的机会。目前，肝癌的诊断主要依赖于影像学上发现肝内肿物，包括超声、CT、核磁共振（MRI）等，同时结合血清中的肿瘤标志物如AFP等。但是，这两种方法的敏感性及特异性都不是十分令人满意。
miRNA是一类小的非编码的RNA，它们在细胞的增殖、分化及凋亡过程中发挥了重要的作用。miRNA通过结合在靶mRNA的3’-非编码区的特异位点上来抑制翻译或使靶mRNA降解。miRNA的失调可导致内环境的紊乱，最终导致肿瘤的发生。位于肿瘤相关的基因区域或脆性位点的miRNA基因在肿瘤中常常会扩增或缺失，这意味着miRNA在恶变过程中发挥了重要作用。miRNA可作为癌基因或抑癌基因，几乎所有的人类肿瘤中都可以发现miRNA的失调。miRNA能以稳定的形式在人类的体液如血清、血浆中检测到，这使它有可能成为无创的检查指标。
肝纤维化/肝硬化尤其肝癌的早期诊断可以使疾病获得根治性治疗。尽管目前对肝纤维化/肝硬化以及肝癌的相关诊断投入了很多研究，也取得一定进展，但是目前临床上肝纤维化/肝硬化及肝癌的血清学早期诊断仍然是瓶颈问题，需要敏感而特异的无创性血清学指标，尤其是基于miRNA的无创性指标。
发明内容
本发明的目的在于提供一种诊断受试者是否具有肝纤维化/肝硬化或肝癌的方法
本发明的另一目的在于提供微小RNA和/或所述微小RNA的检测引物在制备所述诊断组合物中的应用。
本发明的又一目的在于提供用于检测肝纤维化/肝硬化或肝癌的诊断组合物。
在本发明的第一方面，本发明提供了一种诊断受试者是否具有肝纤维化/肝硬化或处于肝纤维化/肝硬化的风险中的方法，其包括测定来自所述受试者的受试样品中的微小RNA的水平，其中相对于对照样品中的相应微小RNA的水平，受试样品中的微小RNA水平的改变表明受试者具有肝纤维化/肝硬化或处于肝纤维化/肝硬化的风险中。
在一个实施方案中，本发明提供了微小RNA和/或所述微小RNA的特异性探针/检测引物在制备诊断组合物中的应用，其中所述诊断组合物用于通过测定来自所述受试者的受试样品中的上述微小RNA的水平从而诊断受试者是否具有肝纤维化/肝硬化或处于肝纤维化/肝硬化的风险中，其中相对于对照样品中的相应微小RNA的水平，受试样品中的所述微小RNA水平的改变表明受试者具有肝纤维化/肝硬化或处于肝纤维化/肝硬化的风险中。
在某些优选的实施方案中，所述受试样品中的微小RNA的水平高于对照样品中的相应微小RNA的水平。
在本发明的第二方面，本发明提供了一种诊断受试者是否具有肝癌或处于肝癌的风险中的方法，其包括测定来自所述受试者的受试样品中的微小RNA的水平，其中相对于对照样品中的相应微小RNA的水平，受试样品中的微小RNA水平的改变表明受试者具有肝癌或处于肝癌的风险中。
在一个实施方案中，本发明提供了微小RNA和/或所述微小RNA的特异性探针/检测引物在制备诊断组合物中的应用，其中所述诊断组合物用于通过测定来自所述受试者的受试样品中的上述微小RNA的水平从而诊断受试者是否具有肝癌或处于肝癌的风险中，其中相对于对照样品中的相应微小RNA的水平，受试样品中的所述微小RNA水平的改变表明受试者具有肝癌或处于肝癌的风险中。
在某些优选的实施方案中，所述受试样品中的微小RNA的水平低于对照样品中的相应微小RNA的水平。
在某些优选的实施方案中，所述受试者是肝纤维化/肝硬化患者。
在某些优选的实施方案中，所述受试者是乙肝阳性受试者，优选地，所述受试者是乙肝表面抗原（HBsAg）阳性受试者，更优选地，所述受试者是乙肝表面抗原阳性的肝炎患者，最优选地，所述受试者是乙肝表面抗原阳性的肝纤维化/肝硬化患者。
在本发明的第三方面，本发明提供了一种用于检测肝纤维化/肝硬化或肝癌的诊断组合物，其中所述诊断组合物包含微小RNA的特异性探针/检测引物。
在本发明某些优选的实施方案中，所述微小RNA为miRNA-101，优选地，所述微小RNA选自miRNA-101-1、miRNA-101-2、miRNA-101-5p和miRNA-101-3p中的一种或更多种，更优选地，所述微小RNA为miRNA-101-5p。
在本发明某些优选的实施方案中，所述受试样品来自受试者的体液，优选地，来自血液，更优选地，来自血清。
在本发明某些优选的实施方案中，所述特异性探针/检测引物的核酸序列包含SEQ ID NO:5。
在本文中，术语“微小RNA”、“miRNA”和“miR”可交换地使用，指来自miR基因的未加工的或加工的RNA转录物。未加工的miR基因转录物也称作“miR前体”并且通常包括长度约70-100个核苷酸的RNA转录物，通过RNA酶（例如Dicer或RNAase III，如大肠杆菌的RNAase III）消化将miR前体加工成长度约18-26个核苷酸的活性RNA分子。该长度约18-26个核苷酸的活性RNA分子也称作“加工的”miR基因转录物或“成熟”miRNA。应当理解的是本文所用术语“微小RNA”、“miRNA”或“miR”包括一种或多种miR-寡核苷酸，包括成熟miR、前-miR（pre-miR）、原-miR（pri-miR）和它们的变体。在某些实施方案中，还可使用各种miR核酸的混合物。
在本文中，术语“miRNA-101”或“miR-101”指目前包括miRNA-101-1、miRNA-101-2、miRNA-101-5p、miRNA-101-3p的miRNA家族。术语“miRNA-101”或“miR-101”也包括任何迄今未鉴定的miRNA-101家族的成员。用于本发明中的“miRNA-101”或“miR-101”的特征如表1所示。在本发明某些优选的实施方案中，可使用各种miR-101核酸的混合物，例如miRNA-101-1、miRNA-101-2、miRNA-101-5p和miRNA-101-3p的各种组合所获得的混合物。
表1.用于本发明中的miRNA-101的特征
在本文中，“受试者”可以是具有或怀疑具有肝纤维化/肝硬化或肝癌的任何哺乳动物，包括但不限于人。
在特定的实施方案中，当本发明的方法用于诊断受试者是否具有肝纤维化/肝硬化或处于肝纤维化/肝硬化的风险时，所述受试者是具有或怀疑具有肝纤维化/肝硬化的人；在优选的实施方案中，所述受试者是乙肝阳性受试者，优选地，所述受试者是乙肝表面抗原阳性受试者，更优选地，所述受试者是乙肝表面抗原阳性的肝炎患者，例如乙肝表面抗原阳性的慢性乙型肝炎患者；在优选的实施方案中，所述受试者在进行本发明的诊断前，未进行乙肝检查，例如未检测乙肝表面抗原。
在特定的实施方案中，当本发明的方法用于诊断受试者是否具有肝癌或处于肝癌的风险中，所述受试者是具有或怀疑具有肝癌的人；在优选的实施方案中，所述受试者是肝纤维化/肝硬化患者，所述患者可以是乙肝阳性如乙肝表面抗原阳性的患者、或不是乙肝阳性的患者，在进一步优选的实施方案中，所述肝纤维化/肝硬化患者在进行本发明的肝癌诊断前，未进行乙肝检查，例如未检测乙肝表面抗原；在优选的实施方案中，所述受试者是乙肝阳性受试者，优选地，所述受试者是乙肝表面抗原阳性受试者，更优选地，所述受试者是乙肝表面抗原阳性的肝炎患者，例如乙肝表面抗原阳性的慢性乙型肝炎患者，最优选地，所述受试者是乙肝表面抗原阳性的肝纤维化/肝硬化患者。
在本文中，“受试样品”来自受试者的组织、细胞和/或体液（例如血液、血浆和/或血清）。在某些实施方案中，所述受试样品来自受试者的患病组织和/或邻近的正常组织，例如肝纤维化/肝硬化组织和/或邻近的正常组织，或者肝癌组织和/或邻近的正常组织。在某些实施方案中，所述受试样品来自受试者的患病组织的细胞和/或邻近的正常组织的细胞，例如肝纤维化/肝硬化组织的细胞和/或邻近的正常组织的细胞，或者肝癌组织的细胞和/或邻近的正常组织的细胞。在优选的实施方案中，所述受试样品来自受试者的体液，例如血液（如外周血）；在进一步优选的实施方案中，所述受试样品来自受试者的血清，如外周血的血清。
在特定的实施方案中，当本发明的方法用于诊断受试者是否具有肝纤维化/肝硬化或处于肝纤维化/肝硬化的风险时，所使用的“对照样品”来自预先选定的未被诊断为肝纤维化/肝硬化或肝癌的肝炎患者和/或健康正常人的组织、细胞和/或体液（例如血液、血浆和/或血清），这样的肝炎患者是乙肝阳性的肝炎患者，更优选地是乙肝表面抗原阳性的肝炎患者，例如乙肝表面抗原阳性的慢性乙型肝炎患者，以及这样的健康正常人是乙肝阴性的健康正常人，例如乙肝表面抗原阴性的健康正常人。
在特定的实施方案中，当本发明的方法用于诊断受试者是否具有肝癌或处于肝癌的风险中，所使用的“对照样品”来自对照组例如预先选定未被诊断为肝癌的肝炎患者和/或肝纤维化/肝硬化患者的组织、细胞和/或体液（例如血液、血浆和/或血清），这样的肝炎患者是乙肝阳性的肝炎患者，更优选地是乙肝表面抗原阳性的肝炎患者，例如乙肝表面抗原阳性的慢性乙型肝炎患者，以及这样的肝纤维化/肝硬化患者可以是乙肝阳性的肝纤维化/肝硬化患者，更优选地是乙肝表面抗原阳性的肝纤维化/肝硬化患者，或者也可以是乙肝阴性（例如乙肝表面抗原阴性）的肝纤维化/肝硬化患者。
可使用本领域技术人员所熟知的多种技术（例如定量或半定量RT-PCR，RNA印迹分析，溶液杂交检测等）测定本发明受试样品和/或对照样品中的微小RNA的水平。在一个特定的实施方案中，使用如下手段测定本发明受试样品中的微小RNA的水平：从获自受试者的受试样品中提取RNA，逆转录RNA，以提供一组靶寡脱氧核苷酸（如cDNA），使所述靶寡脱氧核苷酸与一种或多种miRNA-特异性探针/检测引物寡核苷酸杂交（例如与包含一种或几种miRNA-特异性探针/检测引物寡核苷酸的微阵列杂交），以提供受试样品的杂交谱，并对比受试样品杂交谱与从对照样品产生的杂交谱。受试样品中至少一种miRNA的信号相对于对照样品的变化指示着受试者患有疾病或处于疾病的风险中。在一个特定的实施方案中，使靶寡核苷酸与包含miRNA-101-特异性探针/检测引物寡核苷酸的微阵列杂交。在一个特定的实施方案中，使靶寡核苷酸与包含选自下述的一种或更多种miRNA的miRNA-特异性探针/引物寡核苷酸的微阵列杂交：miRNA-101-1、miRNA-101-2、miRNA-101-5p和miRNA-101-3p。
对于miRNA-特异性探针/检测引物而言，可使用前体或成熟的miRNA的核酸序列，来设计这些探针/检测引物。在一个特定的实施方案中，可使用SEQ IDNOs:1-4所示的核酸序列来设计本发明的miRNA-101-特异性探针/检测引物，一种优选的检测引物例如其核酸序列包含SEQ ID NO:5。
相对于对照样品中的相应的微小RNA的水平，获自受试者的样品中的微小RNA的水平的改变（即增加或减少）表明受试者中存在或可能存在疾病，例如肝纤维化/肝硬化或肝癌。在本文中，当来自受试者的组织、细胞和/或体液样品中的微小RNA的量比对照组织、细胞和/或体液样品中的相应的微小RNA的量大时，所述微小RNA的表达被“上调”，当来自受试者的组织、细胞和/或体液样品中的微小RNA的量比对照组织、细胞和/或体液样品中的相应的微小RNA的量小时，所述微小RNA的表达被“下调”。可就一种或更多种RNA表达标准确定对照和正常样品中的相对微小RNA表达。标准可包括例如零微小RNA表达水平、体液中的微小RNA表达水平或之前获得的正常人对照群体的微小RNA表达的平均水平。
在本文中，“肝纤维化”是指由各种致病因子所致肝内结缔组织异常增生，导致肝内弥漫性细胞外基质过度沉积的病理过程；“肝硬化”是临床常见的慢性进行性肝病，由一种或多种病因长期或反复作用形成的弥漫性肝损害，病理组织学上有肝小叶结构破坏和假小叶形成，肝脏逐渐变形、变硬而发展为肝硬化；“肝癌”是指发生于肝脏的恶性肿瘤。
因此，在本发明的一个实施方案中，提供了一种诊断受试者是否具有肝纤维化/肝硬化或处于肝纤维化/肝硬化的风险中的方法，其包括测定来自所述受试者的受试样品中的miRNA-101的水平，其中相对于对照样品中的相应miRNA-101的水平，受试样品中的miRNA-101水平的上调表明受试者具有肝纤维化/肝硬化或处于肝纤维化/肝硬化的风险中。在优选的实施方案中，所述miRNA-101为miRNA-101-5p。在进一步优选的实施方案中，所述受试者为乙肝表面抗原阳性受试者。在更进一步优选的实施方案中，所述受试样品来自受试者的血清。
在本发明的一个实施方案中，提供了一种诊断受试者是否具有肝癌或处于肝癌的风险中的方法，其包括测定来自所述受试者的受试样品中的miRNA-101的水平，其中相对于对照样品中的相应miRNA-101的水平，受试样品中的miRNA-101水平的下调表明受试者具有肝癌或处于肝癌的风险中。在优选的实施方案中，所述miRNA-101为miRNA-101-5p。在进一步优选的实施方案中，所述受试者为乙肝表面抗原阳性的肝纤维化/肝硬化患者。在更进一步优选的实施方案中，所述受试样品来自受试者的血清。
本发明的微小RNA和/或所述微小RNA的特异性探针/检测引物还可用于制备用于诊断受试者是否具有肝纤维化/肝硬化或处于肝纤维化/肝硬化的风险中，或者用于诊断受试者是否具有肝癌或处于肝癌的风险中的诊断组合物，这样的诊断组合物可以是诊断试剂、检测试剂盒或微阵列。对于本发明的诊断组合物例如检测试剂盒，其可包含miRNA-101例如miRNA-101-5p的特异性探针/检测引物，这样的特异性探针/检测引物的核酸序列如SEQ ID NO:5所示。优选地，这样的诊断组合物例如检测试剂盒还可包含用于提取RNA、PCR、杂交、显色等所需的各种试剂，包括但不限于：抽提液、扩增液、杂交液、酶、对照液、显色液、洗液、抗体等。或者，这样的诊断组合物例如检测试剂盒还可包含用于计算相对表达水平的外源性参照物，例如miRNA-67（Accession：MI0000038，秀丽隐杆线虫（Caenorhabditis elegans）miR-67茎-环（stem-loop））和miRNA-356（Accession：MI0000755，秀丽隐杆线虫（Caenorhabditis elegans）miR-356茎-环（stem-loop））。或者，这样的诊断组合物例如检测试剂盒还可包含使用说明书和/或盛放上述探针、引物、试剂等的容器。
因此，在本发明的一个实施方案中，提供了一种用于检测肝纤维化/肝硬化或肝癌的检测试剂盒，包含miRNA-101-5p的特异性探针/检测引物，以及用于计算相对表达水平的外源性参照物。在进一步优选的实施方案中，所述miRNA-101-5p的特异性探针/检测引物的核酸序列包含SEQ ID NO:5，以及所述外源性参照物为miRNA-67和miRNA-356。
本发明的主要优点在于：首次发现了血清中miRNA-101-5p的表达在肝炎肝硬化时升高而发生肝癌后又出现降低，提示其可作为一个有价值的、无创的、用于动态监测肝硬化是否发生肝癌的早期诊断指标。同时，也首次揭示了血清中miRNA-101-5p的上调是一个预测肝纤维化/肝硬化的无创的诊断指标。
附图说明
图1显示了血清中miRNA-101-5p水平在肝癌组、肝硬化组、肝炎组及正常组中的分布情况。
图2显示了血清中miRNA-101-5p区分肝硬化和肝炎的ROC曲线。
图3显示了（A）血清中miRNA-101-5p区分肝癌和肝硬化的ROC曲线；（B）联合血清中miRNA-101-5p及AFP区分肝癌和肝硬化的ROC曲线。
具体实施方式
下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件如Sambrook等人，分子克隆：实验室手册（New York：Cold Spring Harbor Laboratory Press，1989）中所述的条件，或按照制造厂商所建议的条件。
实施例1研究对象
在该研究中共使用了122例研究对象，分成患者组和健康正常人组，其中患者组进一步分成三组：慢性乙型肝炎组（下称肝炎组，30例）、乙肝相关性肝硬化组（下称肝硬化组，30例）和乙肝相关性肝癌组（下称肝癌组，32例）；健康正常人组（下称正常组，30例）。该研究符合《赫尔辛基宣言》的要求，志愿者已被告知使用他们的血液、组织标本和临床数据。
患者组中所有的病人都是乙肝表面抗原阳性，并且没有其他类型的肝脏疾病如慢性丙型肝炎、酒精性肝病、自身免疫性肝病或代谢性肝病等。所有数据均来自病人的病历、病理报告及随访获得。收集的数据包括年龄、性别、血清白蛋白水平、总胆红素、谷丙转氨酶（ALT）、碱性磷酸酶、γ-谷氨酰基转移酶、凝血酶原时间、乙肝病毒载量、癌胚抗原、糖类抗原199（CA199）、糖类抗原125（CA125）、甲胎蛋白（AFP）、肿瘤数量、大小、分期、复发时间及死亡时间。所有肝癌患者均进行了肝癌的手术切除术，肝癌的临床分期采用手术时TNM分期，Child-Pugh评分用于评估肝硬化及肝癌患者的肝功能情况。
实施例2血清样本获取和样本RNA提取
对于患者组，在肝活检或者手术前分别取患者10ml外周血存放在血清试管中。对于正常组，分别取健康正常人10ml外周血存放在血清试管中。试管以4℃1500g离心10min。然后将血清等份，再以4℃3000g离心15min以去除细胞碎片和其他残余的细胞。血清样本保存在-80℃下。
所有的RNA都是用血清Total RNA提取试剂盒（QuantoBio,Beijing,CN）从200μl血清中提取的。首先，加入200μl裂解缓冲液（Lysis Buffer）至每个样本中，涡旋均匀；然后加入40μl裂解增强溶液（Lysis Enhancer Solution），手摇震荡混匀15s；再加入440μl酸化苯酚：氯仿（Acidfied Phenol:Chloroform），手摇震荡混匀30s。4℃16,000g离心10min，样本分层。转移上清液至新的无核糖核酸酶（RNase-free）离心管中。在该离心管中加入上清液体积0.43倍的100%乙醇（乙醇的最后浓度为30%，例如向500μl上清液中加入215μl 100%的乙醇）。震荡混匀15s。将一个离心柱置于收集管中，抽取650μl上述混合液至离心柱中。盖好帽，室温下10,000g离心30s。保留流出液，里面含有分子量小的RNA。如果上清液大于650μl，再放一个离心柱至收集管中，并重复上述步骤。如果只纯化分子量小的RNA，则弃掉离心柱并按纯化小RNA的方案纯化流出液。如果同时纯化大分子量的RNA，则将离心柱置于一个新的收集管中保存以便后续大分子RNA的纯化。RNA的浓度和纯度都是用NanoDrop 8000（Thermo FisherScientific,Wilmington,DE）测定。
实施例3逆转录获得cDNA
cDNA是通过聚腺苷酸化的方法从RNA逆转录而来。将10pg-1μg的总RNA模板与2μl 10×缓冲液（buffer）、2μl dATP（10mM）、0.5μl polyA多聚酶（NEB）、0.5μl核糖核酸酶（RNase）抑制剂（Promega）和无核糖核酸酶水（RNase freewater）（Promega）混合，体积最后为20μl，37℃孵育1h。然后反应管中加入1μl0.5μg/μl的RT引物（QuantoBio,Beijing,CN），70℃孵育5min后立刻冰上孵育至少2min，打断RNA和引物的二级结构。最后，将上述20μl反应混合物与4μl5×缓冲液（buffer）、1μl dNTP（10mM）（Sigma），0.5μl M-MLV逆转录酶（Promega），0.5μl核糖核酸酶（RNase）抑制剂（Promega），10μl polyA反应混合液和4μl无核糖核酸酶水（RNase free water）（Promega），42℃孵育1h。未稀释的cDNA模板保存在-20℃以备用。
实施例4实时定量PCR（qPCR）
在ABI 7900 HT实时（real-time）PCR系统（Applied Biosystems）上进行PCR扩增。1μl cDNA与10.4μl含有ROX（6-羧基-X-若丹明（6-Carboxyl-X-Rhodamine），通用校正染料，0.4μl）的2×qPCR Mix，2μl 10×通用逆转录引物（QuantoBio,Beijing,CN），2μl 10×miR-101-5p（Accession:MIMAT0004513）的引物（CAGTTATCACAG（SEQ ID NO:5））以及4.6μl无核糖核酸酶水（RNase free water），定容至最终体积为20μl。PCR反应预变性（95℃）5min，然后40个PCR循环（95℃30s，60℃1min）。所有的反应都重复一次。用miRNA-67（Accession：MI0000038，秀丽隐杆线虫（Caenorhabditiselegans）miR-67茎-环（stem-loop））和miRNA-356（Accession：MI0000755，秀丽隐杆线虫（Caenorhabditis elegans）miR-356茎-环（stem-loop））作为外源性参照物。相对表达水平用2-ΔCt计算，ΔCt=Ct（miRNA）-Ct（外源性参照物）。Ct代表RT-PCR反应管内的荧光信号到达设定的阈值时所经历的循环数。
实施例5数据处理
数据用SPSS 16.0软件分析处理。Pearson卡方检验用于分析不同组间性别、饮酒情况、ALT、TBIL分布是否有差异。不同组间血清中miRNA-101-5p表达水平的差异比较用Kolmogorov-Smirnov Z检验或T检验（P＜0.017时才考虑有统计学意义）。Logistic回归用于评估血清中miRNA-101-5p表达水平高低与肝硬化转变成肝癌的风险的关系（控制病人的性别、饮酒情况及ALT值）。Hosmer和Lemeshow检验用于计算模型的拟合度。Spearman非参数检验用于分析血清中miRNA-101-5p表达水平与临床参数的关系。受试者工作特征曲线（ROC）用于计算血清中miRNA-101-5p在区分肝癌和肝硬化，肝硬化和肝炎时的敏感性和特异性。通过计算Youden指数来选取临界值。P值是双侧的，P＜0.05时才考虑有统计学意义。用NCSS-PASS计算统计功效。
实施例6结果及讨论
1、结果
1.1研究对象特征
患者组和正常组的特征见表2。所有患者都是乙肝表面抗原（HBsAg）阳性，正常组是HBsAg阴性。所有患者肝脏病理的炎症程度都在G1-G2级。正常组未作肝脏病理检查，认定为G0级。肝硬化组和肝癌组患者的纤维化/硬化程度基本一致，均在S3-S4期。如下述实施例6所述的进行数据处理，结果如下：各组之间性别（P=0.47）和ALT值（P=0.471）的分布差异没有统计学意义。肝硬化组和肝癌组之间年龄（P=0.488）与饮酒情况（P=0.773）分布差异没有统计学意义。肝炎组和正常组在年龄分布上差异没有统计学意义。但肝炎组/正常组和肝硬化组/肝癌组间年龄分布差异有统计学意义（P＜0.001）。肝炎组、肝硬化组和肝癌组间饮酒情况差异有统计学意义（P=0.013）。三组病人间总胆红素（P=0.012）、病毒载量（P=0.010）及甲胎蛋白含量（P<0.001）差异有统计学意义。所有肝癌组患者肝功能均为Child-Pugh A级，并且都做了肝癌切除手术。其中，有13例（40.63%）一年内复发，17例（53.12%）超过一年复发，2例复发时间不明。有24例（75%）肿瘤大小≤5cm，有8例（25%）肿瘤大小＞5cm。肿瘤分化良好的有4例（12.5%），分化中等的有13例（40.6%），分化差的有15例（46.9%）。肝癌组患者中有26例（81.3%）TNM分期在I期，1例（3.1%）在II期，5例（15.6%）在III-IV期。
表2.肝癌组、肝硬化组、肝炎组及正常组的特征
1.2血清中miRNA-101-5p在肝癌组、肝硬化组、肝炎组及正常组中的分布情况
从肝癌组（32例）、肝硬化组（30例）、肝炎组（30例）及正常组（30例）血清中分别提取RNA，进行RT-PCR扩增和实时荧光定量qPCR检测miRNA-101-5p的表达水平。血清中miRNA-101-5p水平在四组中的分布情况见图1。
1.3肝炎组和正常组相比，血清中miRNA-101-5p表达水平没有显著性差异
肝炎患者肝脏的病理炎症程度都在G1-G2级。比较了肝炎组与正常组之间血清中miRNA-101-5p的表达水平，结果显示没有统计学意义（P=0.071）。
1.4血清中miRNA-101-5p表达水平在肝硬化组显著升高
由于乙肝肝硬化常常由慢性乙型肝炎进展而来，为了探讨miRNA-101-5p的表达在乙肝肝硬化患者血清中是否改变，比较了其在肝硬化组、肝炎组及正常组中的表达情况。结果显示，与肝炎组（P＜0.001）和正常组（P＜0.001）相比，血清中miRNA-101-5p表达水平在肝硬化组中明显升高。ROC曲线也提示血清中miRNA-101-5p在区分肝硬化和肝炎时有意义（曲线下面积AUC为0.798，95%可信区间为0.687-0.908）。在临界值是11.382时，敏感性为0.600，特异性为0.867（见图2）。
1.5血清中miRNA-101-5p表达水平在肝癌组显著下降
肝癌常常由肝硬化发展而来，因此比较了血清中miRNA-101-5p表达水平在肝癌组与肝硬化组、肝炎组及正常组的差别。结果显示，与肝硬化组（P＜0.001）、肝炎组（P＜0.001）及正常组（P=0.064）相比，血清中miRNA-101-5p的表达水平在肝癌组中显著下降。
Logistic回归用于探讨血清中miRNA-101-5p表达水平与肝硬化发展成肝癌的风险关系（控制性别、年龄、饮酒情况及ALT值在同一个水平）。如表3所示，血清中miRNA-101-5p表达水平升高可显著降低肝硬化发展成肝癌的风险（优势比（OR）=0.052，95%可信区间为0.008-0.316，P=0.001）。模型的准确性为87.1%。
表3.血清中miRNA-101-5p用于评估肝硬化癌变的风险的logistic回归
1.6联合血清中miRNA-101-5p和AFP两指标监测乙肝肝硬化相关性肝癌的发生，比单用miRNA-101-5p指标的特异性高、但敏感性低
在该研究中，所选肝癌组患者的乙肝肝硬化背景与肝硬化组患者基本一致，肝脏病理的炎症程度都在G1-G2级，纤维化/硬化程度都在S3-S4期。ROC曲线分析显示，单用血清中miRNA-101-5p来区分肝癌组与肝硬化组，其AUC为0.956，在临界值是10.31时，敏感性为0.969，特异性为0.833（见图3A）。当联合血清中miRNA-101-5p和AFP两个指标来区分肝癌组与肝硬化组时，结果显示AUC为0.960，敏感性为0.812，特异性为0.966（见图3B）。提示联合两个血清学指标比miRNA-101-5p作为单一指标的特异性高，但敏感性明显降低。
1.7血清中miRNA-101-5p表达水平与患者其他临床参数的关系
统计学分析没有显示血清中miRNA-101-5p表达与肝癌患者的其他临床指标有显著性关联。这些临床特征包括年龄、性别、ALT、碱性磷酸酶、γ-谷氨酰基转移酶、凝血酶原时间、癌胚抗原、CA199、CA125、病毒载量、肿瘤大小及Child-Pugh分级等。
2、讨论
本发明的研究是最早报道将血清中miRNA-101-5p作为监测乙肝相关性肝硬化发生肝癌的早期诊断指标。该研究首次表明血清中miRNA-101-5p在肝硬化中升高，而在肝硬化相关性肝癌中降低。ROC曲线分析用其来区分肝硬化及肝硬化相关性肝癌，结果显示AUC为0.956，敏感性为0.969，特异性为0.833。另外，血清中miRNA-101-5p在肝硬化时表达升高，也可以作为一个诊断肝纤维化/肝硬化的指标。ROC曲线分析用其来区分肝硬化及肝炎，结果显示AUC为0.798，敏感性为0.600，特异性为0.867。
多项研究证实血清中的miRNA能以稳定的形式存在，也能够被检测出来，并且和肿瘤组织相关（Wang K,Zhang S,Weber J,Baxter D,Galas DJ:Export ofmicroRNAs and microRNA-protective protein by mammalian cells.NucleicAcids Res 2010,38(20):7248-7259；Akhtar N,Haqqi TM:MicroRNA-199a*regulates the expression of cyclooxygenase-2 in human chondrocytes.Ann RheumDis 2012,71(6):1073-1080.）。有研究报道当血清饥饿处理HepG2细胞后，释放大量的细胞外miRNA（Hao Y,Gu X,Zhao Y,Greene S,Sha W，Smoot DT，CalifanoJ,Wu TC,Pang X:Enforced expression of miR-101 inhibits prostate cancer cellgrowth by modulating the COX-2 pathway in vivo.Cancer Prev Res(Phila)2011,4(7):1073-1083.）。这些研究证实了血清中miRNA的改变可以反映组织自身的变化，有可能作为一个评估疾病变化（如肿瘤）的无创性指标。因此，在一定情况下，通过检测血清中RNA-101-5p表达水平的变化来反映其在组织的改变，同时，组织中其含量的改变也可反映其在血清中含量的变化。
本发明的研究表明，与乙肝相关性肝硬化相比，血清中miRNA-101-5p在早期乙肝相关性肝癌中的表达显著下降，因此，可以将血清miRNA-101-5p作为一个早期监测肝硬化发生癌变的无创性诊断指标。
在该研究中，肝硬化和肝癌两组患者的基线完全相同，包括年龄、性别、饮酒情况、ALT值、G分级（G1-G2）、S分期（S3-S4）。81.3%的肝癌患者TNM分期为I期（早期），但是他们肝硬化的程度与肝硬化组患者完全一致。尽管总胆红素及病毒载量在两组中有差别，但经统计学相关性分析，结果证实它们与血清中miRNA-101-5p表达水平的高低无关。
为了探讨血清中miRNA-101-5p在区分肝癌和肝硬化时的有效性，本发明用ROC曲线分析单用血清miRNA-101-5p指标，及其与AFP两指标联合应用时的敏感性和特异性，结果显示，联合应用比单独应用的特异性高，但敏感性低。良好的早期诊断指标应该是方便简单易测、经济、有效、无创。本发明的研究表明，miRNA-101-5p是一个方便有效的、无创的、易于监测肝硬化发生肝癌的早期诊断血清学指标。
miRNA-101主要有两种（miRNA-101-1，miRNA-101-2），来源于不同的染色体，在该研究中，miRNA-101-5p测的是血清中这两种RNA-101的总体（成熟体），没有区分，结果显示与肝炎组相比，血清miRNA-101-5p在肝硬化组中明显升高。ROC曲线分析结果显示，血清miRNA-101-5p在区分肝硬化和肝炎时，AUC为0.798，敏感性为0.600，特异性为0.867。研究所选两组患者的肝脏病理炎症程度都比较轻，均在G1-G2级，所以本发明提出，在这项研究中血清中miRNA-101-5p的上调与组织的纤维化/硬化有关。有研究报道miRNA-101可以刺激心肌纤维原细胞增生，miRNA-101抑制剂可减缓心肌纤维原细胞增生（Sharma A,Kumar M,Aich J,Hariharan M,Brahmachari SK,Agrawal A,Ghosh B:Posttranscriptional regulation of interleukin-10 expression by hsa-miR-106a.Proc Natl Acad Sci U S A 2009,106(14):5761-5766.），这与本发明的结果类似。但是，也有研究报道过度表达的miRNA-101可减轻间质纤维化，恶化小鼠心梗后的心功能（Katakowski M,Buller B,Wang X,Rogers T,Chopp M:FunctionalmicroRNA is transferred between glioma cells.Cancer Res 2010,70(21):8259-8263.）。这结果互相矛盾的原因目前尚不清楚。但是，目前还没有miRNA-101与肝纤维化的相关研究。
综上，本发明的研究显示，血清中miRNA-101-5p的表达在肝炎肝硬化时升高而发生肝癌后又出现降低，提示其可作为一个有价值的、无创的、简单方便、易于动态监测肝硬化是否发生肝癌的早期诊断指标。同时，本发明的结果也提示血清中miRNA-101-5p的上调也是一个潜在的、预测肝纤维化/肝硬化的无创的诊断指标。
在本发明提及的所有文献都在本申请中引用作为参考，就如同每一篇文献被单独引用作为参考那样。此外应理解，在阅读了本发明的上述讲授内容之后，本领域技术人员可以对本发明作各种改动或修改，这些等价形式同样落于本申请所附权利要求书所限定的范围。
序列表
<110> 首都医科大学附属北京佑安医院
<120> 用于肝硬化及肝癌早期诊断的基于微小RNA的方法和组合物
<130> AZ1/0121388
<160> 5
<170> PatentIn version 3.5
<210> 1
<211> 75
<212> RNA
<213> 智人
<400> 1
ugcccuggcu caguuaucac agugcugaug cugucuauuc uaaagguaca guacugugau 60
aacugaagga uggca 75
<210> 2
<211> 79
<212> RNA
<213> 智人
<400> 2
acuguccuuu uucgguuauc augguaccga ugcuguauau cugaaaggua caguacugug 60
auaacugaag aaugguggu 79
<210> 3
<211> 22
<212> RNA
<213> 智人
<400> 3
caguuaucac agugcugaug cu 22
<210> 4
<211> 21
<212> RNA
<213> 智人
<400> 4
uacaguacug ugauaacuga a 21
<210> 5
<211> 12
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> miR-101-5p的引物
<400> 5
cagttatcac ag 12
Claims (6)
1.微小RNA和/或所述微小RNA的特异性探针/检测引物在制备诊断组合物中的应用，其中所述诊断组合物用于通过测定来自乙肝表面抗原阳性的受试者的受试样品中的上述微小RNA的水平从而诊断受试者是否具有肝纤维化或肝硬化或者处于肝纤维化或肝硬化的风险中，其中相对于对照样品中的相应微小RNA的水平，受试样品中的所述微小RNA水平的改变表明乙肝表面抗原阳性受试者具有肝纤维化或肝硬化或者处于肝纤维化或肝硬化的风险中，所述微小RNA为miRNA-101-5p；其中受试样品中的miRNA-101-5p的水平高于对照样品中的相应微小RNA的水平。
2.微小RNA和/或所述微小RNA的特异性探针/检测引物在制备诊断组合物中的应用，其中所述诊断组合物用于通过测定来自受试者的受试样品中的上述微小RNA的水平从而诊断受试者是否具有肝癌或处于肝癌的风险中，所述受试者是乙肝表面抗原阳性的肝纤维化或肝硬化患者，所述微小RNA为miRNA-101-5p；其中相对于乙肝表面抗原阳性的肝纤维化或肝硬化患者的对照样品中的相应微小RNA的水平，受试样品中的所述微小RNA水平的改变表明受试者具有肝癌或处于肝癌的风险中；其中受试样品中的miRNA-101-5p的水平低于乙肝表面抗原阳性的肝纤维化或肝硬化患者的对照样品中的相应微小RNA的水平。
3.根据权利要求1或2的应用，其中所述受试样品来自体液。
4.根据权利要求3的应用，其中所述受试样品来自血液。
5.根据权利要求4的应用，其中所述受试样品来自血清。
6.根据权利要求1或2的应用，其中所述诊断组合物中包含miRNA-101-5p的特异性探针/检测引物，其核酸序列如SEQ ID NO:5所示。
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