CN105154533B - 诊断早期肝癌的miRNA组合及其试剂盒 - Google Patents

诊断早期肝癌的miRNA组合及其试剂盒 Download PDF

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Abstract

本发明涉及诊断早期肝癌的miRNA组合及其试剂盒。首次揭示一种通过协同检测五种miRNAs的表达情况来诊断肝癌、特别是早期肝癌的方法，本发明还提供了用于实施所述诊断的试剂。

Description

诊断早期肝癌的miRNA组合及其试剂盒
技术领域
本发明属于医学生物检测技术领域，更具体地，本发明涉及诊断早期肝癌的miRNA组合及其试剂盒，以及其在无症状高风险个体的群体中鉴定早期肝癌中的应用。
背景技术
肝细胞性肝癌(HCC)是世界范围内最常见的实体恶性肿瘤之一，占世界范围内癌症相关死亡的第二位。由于缺乏有效的早期诊断或对肝癌潜在高危人群的临床前筛查方法，因此利用现有的肝癌诊断方法确诊的病人仅有1/3适合手术切除。而这些患者的5年生存率也非常不理想，整体不高于14％；而肝癌早期患者的5年存活率则可提高近一倍，约为27％。所以有力的、可信的，特别是针对无症状高风险人群的肝癌极早期诊断工具将有效提高肝癌患者的生存率。
目前使用得最广泛的肝癌筛检方法包括血清甲胎蛋白(AFP)检测和B超等影像学检查等。AFP是目前全世界应用最广泛的肝癌肿瘤标志物，已经应用了数十年。然而，这种单一的标志物灵敏度低，且经常出现假阳性结果，例如在大量的肝硬化患者中，AFP也会升高。此外，血清AFP仅能检测出60％的肝癌患者。如此的敏感性、特异性目前均不令人满意。而虽然改进的成像技术使人们有可能发现肝脏局灶性小病变，但是还很难区分良性病变与肿瘤，并且检测通量低，需要昂贵的检测设备，不适合于多中心大样本的临床筛查。
因此，各国学者们从来没有停止过寻找新的更好的肝癌标志物的脚步。理想的肿瘤标志物需要有较高的特异性，能够将肝癌与肝硬化、肝炎、肝脏再生结节等区别开来；同时还需较高的敏感性，能够在肝癌早期提示诊断，且有易检测、可重复、侵入少的特点。
miRNAs是一种内源性的、长约22nt的RNA，它通过靶向mRNA导致其降解或翻译抑制而在动、植物中起到重要的调节作用。miRNAs广泛存在于灵长类、啮齿类、鸟类、鱼类、蝇类、蠕虫类、植物、病毒中，从2002年有统计的200多种到2008年底的将近9000种，miRNAs的发现呈现爆发性增长，并且不断有新物种中的miRNAs被发现。人类miRNAs基因仅约占基因总数的2％-3％，但却能调控人体内1/3的蛋白表达，这种转录后调控作用直接影响了这些靶基因的功能，参与了包括消化系统在内的多个系统的生理、病理过程。miRNAs在消化系统中的作用涉及发育、老化、分泌、代谢、病毒感染、免疫反应、肿瘤等等方面。
因此，鉴于miRNAs参与了人体内大量的调控，找到与肿瘤的发生发展有关的miRNAs，可以为肿瘤的诊断或治疗提供新的有效途径。
发明内容
本发明的目的在于提供诊断早期肝癌的miRNA组合及其试剂盒。
在本发明的第一方面，提供一种用于检测肝癌的试剂盒，所述的试剂盒中包括：
特异性检测人hsa-miR-193a-3p的检测试剂；
特异性检测人hsa-miR-369-5p的检测试剂；
特异性检测人hsa-miR-672的检测试剂；
特异性检测人hsa-miR-429的检测试剂；和
特异性检测人let-7i*的检测试剂。
在一个优选例中，所述的试剂盒中，所述的检测试剂是RNA逆转录引物、DNA扩增引物和DNA探针。
在另一优选例中，所述的试剂盒中，特异性检测人hsa-miR-193a-3p的检测试剂是SEQ ID NO:6所示的逆转录引物、SEQ ID NO:7和SEQ ID NO:8所示的扩增引物，SEQ ID NO:9所示的探针；
特异性检测人hsa-miR-369-5p的检测试剂是SEQ ID NO:10所示的逆转录引物、SEQ ID NO:11和SEQ ID NO:12所示的扩增引物，SEQ ID NO:13所示的探针；
特异性检测人hsa-miR-672的检测试剂是SEQ ID NO:14所示的逆转录引物、SEQID NO:15和SEQ ID NO:16所示的扩增引物，SEQ ID NO:17所示的探针；
特异性检测人hsa-miR-429的检测试剂是SEQ ID NO:18所示的逆转录引物、SEQID NO:19和SEQ ID NO:20所示的扩增引物，SEQ ID NO:21所示的探针；
特异性检测人let-7i*的检测试剂是SEQ ID NO:22所示的逆转录引物、SEQ IDNO:23和SEQ ID NO:24所示的扩增引物，SEQ ID NO:25所示的探针。
在另一优选例中，所述的试剂盒中还包括：
特异性检测内参基因的检测试剂；较佳地，所述的特异性检测内参基因的检测试剂是针对人U6 SnRNA的逆转录引物、扩增引物和探针；更佳地，所述的特异性检测内参基因的检测试剂是SEQ ID NO:26所示的逆转录引物、SEQ ID NO:27和SEQ ID NO:28所示的扩增引物，SEQ ID NO:29所示的探针。
在另一优选例中，针对每一miRNA或内参的探针连接有特定的荧光基团。
在另一优选例中，所述试剂盒中还可包括用于检测AFP的检测试剂。
在另一优选例中，该试剂盒中还包括：阴性质控品和/或阳性质控品。
在另一优选例中，该试剂盒中还包括：RNA提取试剂，逆转录反应试剂，PCR扩增试剂和/或使用说明书。
在本发明的另一方面，提供hsa-miR-193a-3p、hsa-miR-369-5p、hsa-miR-672、hsa-miR-429和let-7i*的用途，用于制备检测肝癌的试剂或试剂盒。
在本发明的另一方面，提供特异性检测人hsa-miR-193a-3p、hsa-miR-369-5p、hsa-miR-672、hsa-miR-429和let-7i*的检测试剂的用途，用于制备检测肝癌的试剂盒。
在一个优选例中，所述的肝癌是早期肝癌，所述的早期肝癌包括极早期肝癌。
在另一优选例中，所述的检测试剂是RNA逆转录引物、DNA扩增引物和DNA探针。
本发明的其它方面由于本文的公开内容，对本领域的技术人员而言是显而易见的。
附图说明
图1、用于鉴定肝癌诊断标志物miRNA组合的筛选、训练以及验证阶段的实验设计流程图。
图2、为确定本发明用于诊断肝细胞肝癌，特别是在无症状高风险患者中鉴定极早期肝细胞肝癌的血液中标志物miRNA组合的主要方法步骤图。对照组包括健康、慢性乙肝、非酒精性脂肪肝+酒精性脂肪肝、血管瘤受试者。
图3、说明了包含本发明用于确定无症状高风险患者中鉴定极早期肝细胞肝癌的血液中标志物miRNA组合(let-7i*、hsa-miR-193a-3p、hsa-miR-369-5p、hsa-miR-429、hsa-miR-672)的逻辑回归模型。
A、训练集(n＝170)中极早期肝癌组与对照组比较时miRNA组合的诊断价值的ROC曲线图。与AFP(AUC＝0.603)相比，miRNA组合在区分极早期肝癌组血清和对照组血清时具有显著高的诊断准确度(AUC＝0.764)。
B、验证集(n＝408)中极早期肝癌组与对照组比较时miRNA组合的诊断价值的ROC曲线图。与AFP(AUC＝0.635)相比，miRNA组合在区分极早期肝癌组血清和对照组血清时具有显著高的诊断准确度(AUC＝0.798)。
图4、RNA逆转录过程中的条件。
具体实施方式
本发明人经过深入的研究，首次揭示一种通过协同检测五种miRNAs的表达情况来诊断肝癌，特别是早期肝癌的方法，本发明还提供了用于实施所述诊断的试剂或试剂盒。
如本文所用，“待测样本”、“待测样品”、“分析物”或“待测核酸(如DNA，RNA)样品”是指待检测的样本，其中含有一种核酸或多种核酸，需要了解其中是否存在目标核酸。本发明中，所述的待测样本可以是：血浆，血清等。
如本文所用，“目标核酸”是指感兴趣的核酸片段，除非另外说明，其是指人源的hsa-miR-193a-3p、hsa-miR-369-5p、hsa-miR-672、hsa-miR-429和let-7i*。
如本文所用，“探针”是指一种具有已知核苷酸序列的单链核酸，其具有与目标核酸基本上互补的核苷酸序列结构，可以与“目标核酸”形成双链。所述的“探针”可以携带标记物。例如，标记物可以连接在探针的5’末端或3’末端。
如本文所用，所述的“miRNA组合”是指由hsa-miR-193a-3p、hsa-miR-369-5p、hsa-miR-672、hsa-miR-429和let-7i*组成的一组miRNAs，该组合可应用于检测肝癌，特别是早期肝癌。
本发明人通过对近万例慢性HBsAg-阳性病人的每年体检的队列进行研究，并收集了其中发生肝癌的患者确诊半年至一年半以前的血清，通过筛选出与未发生肝癌者相比差异表达的miRNAs谱，得到了能够预测病毒性肝炎患者高风险人群发生肝癌的可能性的特异性miRNAs分子标记。
基于本发明人的上述新发现，提供了特异性检测所述的hsa-miR-193a-3p、hsa-miR-369-5p、hsa-miR-672、hsa-miR-429和let-7i*的检测试剂的用途，用于制备检测肝癌，特别是早期肝癌的试剂盒。
可采用各种本领域已知的技术来检测所述的hsa-miR-193a-3p、hsa-miR-369-5p、hsa-miR-672、hsa-miR-429和let-7i*的存在或表达情况，这些技术均包含在本发明中。例如可用已有的技术如聚合酶链式反应技术(PCR)，Southern印迹法，原位杂交法，DNA序列分析等，这些方法也可结合使用。
本发明还提供了用于在分析物中检测所述的hsa-miR-193a-3p、hsa-miR-369-5p、hsa-miR-672、hsa-miR-429和let-7i*的存在表达情况的试剂。作为一种优选方式，可以采用其特异性扩增引物或特异性探针，通过RCR法来确定所述miRNA的量。针对miRNA的特异性引物和探针的设计是本领域人员熟知的技术。
作为本发明的优选方式，检测血浆或血清中的hsa-miR-193a-3p、hsa-miR-369-5p、hsa-miR-672、hsa-miR-429和let-7i*。
本发明还提供了用于检测肝癌，特别是早期肝癌的试剂盒，包含：特异性检测人hsa-miR-193a-3p的检测试剂；特异性检测人hsa-miR-369-5p的检测试剂；特异性检测人hsa-miR-672的检测试剂；特异性检测人hsa-miR-429的检测试剂和特异性检测人let-7i*的检测试剂。作为一种优选方式，所述的检测试剂是RNA逆转录引物、DNA扩增引物和DNA探针。
可选的，所述的试剂盒中还包含：用于检测甲胎蛋白(AFP)的检测试剂。上述的miRNA组合再联合AFP检测，从而获得更为准确的诊断结果。
所述的试剂盒中还可包含RNA提取试剂、逆转录试剂、核酸扩增试剂、无RNA酶的纯水、阴性质控品、阳性质控品等。
可选的，所述用于提取RNA的试剂为Trizol试剂、磁珠法抽提RNA所用的试剂、柱法抽提RNA所用的试剂。
本发明所述的试剂盒中逆转录试剂包括：检测所述miRNA组合中的各miRNA的逆转录引物、逆转录酶、逆转录反应体系。
所述逆转录酶可以为M-MLV逆转录酶或AMV逆转录酶。
所述逆转录反应体系可以包括：逆转录缓冲液、DTT、dNTPs、无RNA酶的纯水，RNA酶抑制剂，及对照或提取出的RNA。
本发明所述的核酸扩增试剂可以包括：正向引物、反向引物、寡核苷酸探针、核酸扩增酶、定量核酸扩增反应体系。
所述核酸扩增酶可以为DNA扩增酶；
所述定量核酸扩增反应体系可以包括定量缓冲液、dNTPs、纯水，及逆转录得到的cDNA。
本发明所述的阴性质控品可以为正常人血清、无肝癌的慢性乙肝患者血清、牛血清白蛋白溶液或生理盐水溶液；阳性质控品可以为经过测定为阳性的早期肝癌患者血清，或为特定拷贝数的hsa-miR-193a-3p、hsa-miR-369-5p、hsa-miR-672、hsa-miR-429、let-7i*寡核苷酸。
为了避免扩增产生的误差，还可设置内参。在本发明的实施例中，以U6SnRNA作为内参。应理解，选择其它类似的基因作为内参也是可行的。
本发明还进一步提供了肝脏肿瘤极早期诊断相关血清小分子核酸的检测方法，包括以下步骤：
(1)血清标本中RNA的提取：
取待测病人血清、阴性对照血清、阳性对照血清，按照所选用的RNA抽提试剂盒的标准操作方法，或使用的核酸抽提试剂盒的说明书，抽提血清标本中的RNA；
(2)用上述试剂盒进行检测：
对内参和所述miRNA组合同时进行定量测定。将提取的RNA加入至预混合的含有逆转录引物、逆转录酶、逆转录反应体系的反应管中，进行逆转录；然后使用cDNA加入至含有正向引物、反向引物、寡核苷酸探针、核酸扩增酶、定量核算扩增反应体系的定量核酸扩增反应管中，进行扩增，使用荧光定量PCR检测仪进行检测。
(3)通过logistic regression模型联合分析循环系统中多个特定的小分子核酸，用以判断肝癌发生的可行性：
较优但不仅限于利用logistic regression方程：
Log(P/(1-P))＝(0.15501)+(0.01785)let-7i*+(-0.02857)miR-193a-3p+(-0.01955)miR-369-5p+(0.03704)miR-429+(0.04277)miR-672及临界值判断肝癌发生的可行性；其中，let-7i*、hsa-miR-193a-3p、hsa-miR-369-5p、hsa-miR-429、hsa-miR-672的表达水平是以U6 SnRNA为内参检测得到，模型中的Log(P/(1-P))值在至少一种极早期肝癌患者血浆中的表达与在至少一种阴性对照血浆中的表达相比被上调。
本发明首次提出通过检测患者体液中(特别是循环系统中)特异性miRNAs分子标记的拷贝数，并利用诊断模型对病毒性肝炎患者发生肝癌的风险进行判定，在诊断肝细胞癌，尤其是在无症状高风险个体的群体中鉴定早期肝癌具有80％以上的准确性。
下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件如J.萨姆布鲁克等编著，分子克隆实验指南，第三版，科学出版社，2002中所述的条件，或按照制造厂商所建议的条件。
实施例1、队列筛选能够预测病毒性肝炎患者高风险人群发生肝癌可能性的特异性miRNAs分子标记
对近万例慢性HBsAg-阳性病人的每年体检的队列进行研究，并收集了其中发生肝癌的患者的确诊患病的半年至一年半以前的血清，筛选出与未发生肝癌者相比差异表达的miRNAs谱，筛选能够预测病毒性肝炎患者高风险人群发生肝癌的可能性的特异性miRNAs分子标记。
研究用的主要血浆样本来自于东方肝胆外科医院，收集来自2007年4月至2014年3月的每年进行体检的队列，其中包含9287个慢性乙肝表面抗原(HBsAg)阳性(HBsAg-阳性)的患者。这些参与者体检时进行HBsAg、谷丙转氨酶(ALT，alanine aminotransferase)、B超和甲胎蛋白(AFP)检查。每次体检的血浆均被有效的保存起来。
取研究期间，被临床诊断为肝癌的195个HBsAg-阳性的患者做后续研究，主要依据如下：(1)发生肿瘤时以及发生之前的两次血浆都有收集储存；(2)循环miRNA数据与ALT、B超和AFP等各项指标能够相互比较的样本。(3)肝癌筛查间隔在半年-一年之间。此195个患者临床诊断约一年以前的血浆编入G2:极早期肝癌患者组；另外，从没有肝癌临床诊断的HBsAg-阳性的患者中随机选择了435例，这435例病人约一年以前的血浆仍然诊断为HBsAg-阳性，将之编入G1:慢性乙肝患者组。通过比较G2和G1组的循环miRNA表达差异，在影象学以及AFP诊断肝癌之前，通过循环miRNA特征预测肝癌发生的可能。
首先，从G2和G1组中分别选出各项基本特征基本一致的各26例样本作为发现集(图1，发现集)，利用可以检测669种人源miRNAs的Taqman miRNAs芯片筛选二者之间的差异表达miRNAs谱，得到8个差异表达的miRNAs(见表1)，这些miRNAs可以有效地区分G2和G1组。
表1、G2和G1组中8个差异表达的miRNAs
发现集
其中，▼表示表达显著性下降，▲表示显著性上升
通过进一步扩大样本量，获取105个慢性乙肝病毒感染患者(G1组)及65个极早期肝癌患者(G2组)作为训练集，用定量RT-PCR方法对8个候选miRNAs进行进一步的验证。以并行检测AFP的结果作为对比。同时检测上述miRNA组合与AFP联合诊断的结果。
检测AFP采用甲胎蛋白(AFP)测定试剂盒(胶乳增强免疫比浊法)(南京建成生物工程研究所，E014)。结果发现，下列5个miRNAs可以显著地区分G1及G2组：hsa-miR-193a-3p、hsa-miR-369-5p、hsa-miR-672、hsa-miR-429、let-7i*，在早期肝癌患者中它们的表达的上调或下调与表1相符，该结果表明这5个循环miRNAs是肝癌筛查的新的标志物(图3A)。
各个miRNA的序列分别如下：
hsa-miR-193a-3p：AACUGGCCUACAAAGUCCCAGU(SEQ ID NO:1)；
hsa-miR-369-5p：AGAUCGACCGUGUUAUAUUCGC(SEQ ID NO:2)；
hsa-miR-672：UGAGGUUGGUGUACUGUGUGUGA(SEQ ID NO:3)；
hsa-miR-429：UAAUACUGUCUGGUAAAACCGU(SEQ ID NO:4)；
let-7i*：CUGCGCAAGCUACUGCCUUGCU(SEQ ID NO:5)。
实施例2、制备检测试剂及对训练集病人血清进行检测
基于前述鉴定的5种miRNAs，设计检测试剂，通过检测该5种miRNAs来鉴定早期或极早期肝癌。
1、引物设计
设计如下逆转录引物和上下游引物及探针：
针对hsa-miR-193a-3p：
逆转录引物：5’-CTCAACTGGTGTCGTGGAGTCGGCAATTCAGTTGAGACTGGGACTTTG-3’(SEQID NO:6)；
上游引物：5’-ACACTCCAGCTGGGAACTGGCCTACAAAGT-3’(SEQ ID NO:7)；
下游引物：5’-GTACGACTCACTATAGGGACTCAACTGGTGTCGTGGAG-3’(SEQ ID NO:8)；
探针：5’-TTCAGTTGAGACTGGGACTTTG-3’(SEQ ID NO:9)。该探针的5’-端带有FAM；3’-端带有BHQ。
针对hsa-miR-369-5p：
逆转录引物：5’-CTCAACTGGTGTCGTGGAGTCGGCAATTCAGTTGAGGC GAATATAACAC-3’(SEQ ID NO:10)；
上游引物：5’-ACACTCCAGCTGGGAGATCGACCGTGTTAT-3’(SEQ ID NO:11)；
下游引物：5’-GTACGACTCACTATAGGGACTCAACTGGTGTCGTGGAG-3’(SEQ ID NO:12)；
探针：5’-TTCAGTTGAGGCGAATATAACAC-3’(SEQ ID NO:13)。该探针的5’-端带有FAM；3’-端带有BHQ。
针对hsa-miR-672：
逆转录引物：5’-CTCAACTGGTGTCGTGGAGTCGGCAATTCAGTTGAGTCAC ACACAGTAC-3’(SEQ ID NO:14)；
上游引物：5’-ACACTCCAGCTGGGTGAGGTTGGTGTACTG-3’(SEQ ID NO:15)；
下游引物：5’-GTACGACTCACTATAGGGACTCAACTGGTGTCGTGGAG-3’(SEQ ID NO:16)；
探针：5’-TTCAGTTGAGTCACACACAGTAC-3’(SEQ ID NO:17)。该探针的5’-端带有FAM；3’-端带有BHQ。
针对hsa-miR-429：
逆转录引物：5’-CTCAACTGGTGTCGTGGAGTCGGCAATTCAGTTGAGACGGTTTTACCAG-3’(SEQ ID NO:18)；
上游引物：5’-ACACTCCAGCTGGGTAATACTGTCTGGTA-3’(SEQ ID NO:19)；
下游引物：5’-GTACGACTCACTATAGGGACTCAACTGGTGTCGTGGAG-3’(SEQ ID NO:20)；
探针：5’-TTCAGTTGAGAGCAAGGCAGTAG-3’(SEQ ID NO:21)。该探针的5’-端带有FAM；3’-端带有BHQ。
针对let-7i*：
逆转录引物：5’-CTCAACTGGTGTCGTGGAGTCGGCAATTCAGTTGAGAGCAAGGCAGTAG-3’(SEQ ID NO:22)；
上游引物：5’-ACACTCCAGCTGGGCTGCGCAAGCTACTGCC-3’(SEQ ID NO:23)；
下游引物：5’-GTACGACTCACTATAGGGACTCAACTGGTGTCGTGGAG-3’(SEQ ID NO:24)；
探针：5’-TTCAGTTGAGACGGTTTTACCAG-3’(SEQ ID NO:25)。该探针的5’-端带有FAM；3’-端带有BHQ。
以U6 SnRNA作为内参，相关引物如下：
U6 SnRNA逆转录引物：
SEQ ID NO:6：5’-CACGAATTTGCGTGTCATCC-3’(SEQ ID NO:26)；
U6 SnRNA上游引物：
SEQ ID NO:7：5’-GTGCTCGCTTCGGCAGC-3’(SEQ ID NO:27)；
U6 SnRNA下游引物：
SEQ ID NO:8：5’-CACGAATTTGCGTGTCATCC-3’(SEQ ID NO:28)；
U6 SnRNA探针：
SEQ ID NO:9：5’-CGCAGGGGCCATGCTAAT-3’(SEQ ID NO:29)。该探针的5’-端带有FAM；3’-端带有BHQ。
2、总RNA抽提
如图2，运用Trizol试剂，对病人血清进行总RNA抽提，步骤如下：
a)将50μl样本血清与1ml Trizol混合后，室温放置5min，使其充分裂解；
b)加入200μl氯仿(Sigma)，振荡混匀后室温放置15min；
c)4℃12,000g离心15min；
d)吸取上层水相，至另一离心管中，加入0.5ml异丙醇(sigma)混匀，室温放置5-10min；
e)4℃12,000g离心10min，弃上清，RNA沉于管底；
f)加入1ml 75％乙醇，漂洗沉淀后弃上清；
g)室温晾干或真空干燥5-10min，后用50μl无RNA酶H2O溶解。
3、样本RNA逆转录反应
各取50μl抽提好的样本RNA，阳性对照RNA，阴性对照加入10×转录反应的缓冲液10μl，震荡混匀后，放入70℃水浴或空气浴中孵育10分钟，结束后迅速放入冰浴中处理2分钟左右；随后加入其中，40μl逆转录酶混合液中含有：
其中，逆转录过程中的条件按照如图4设置。
4、样本cDNA荧光定量PCR检测
逆转录得到的cDNA片段，在独立的反应孔中分别对hsa-miR-193a-3p、hsa-miR-369-5p、hsa-miR-672、hsa-miR-429、let-7i*、U6 SnRNA进行荧光定量PCR检测，并用Applied Biosystems 7500Fast Real-Time PCR System软件分析结果。
其中，每反应孔中荧光定量PCR检测体系和实验条件如下：
荧光定量PCR的循环次数为40次，具体的，在95℃预变性4分钟，94℃变性15秒，58℃复性30秒，72℃延伸35秒。
荧光定量PCR结果，阳性对照的扩增曲线呈典型的S型曲线，且Ct值均小于40，认为是阳性扩增曲线；而阴性对照的扩增曲线不呈S型，Ct值大于40，认为是阴性扩增曲线。
将“早期肝癌特异分子标记1”的Ct值和内参U6 SnRNA的Ct值相减，得到的差值(△Ct)作为后续ROC曲线分析的协变量。
5、样本通过logistic regression模型联合分析用以判断肝癌发生的可行性：
将独立反应孔中的hsa-miR-193a-3p、hsa-miR-369-5p、hsa-miR-672、hsa-miR-429、let-7i*的Ct值和内参U6 SnRNA的Ct值相减，得到的差值作为协变量，用于ROC曲线分析(见图3A)，较优但不仅限于利用下述logistic regression方程及临界值判断肝癌发生的可行性进行判定：
Log(P/(1-P))＝(0.15501)+(0.01785)let-7i*+(-0.02857)miR-193a-3p+(-0.01955)miR-369-5p+(0.03704)miR-429+(0.04277)miR-672。
其中，let-7i*、hsa-miR-193a-3p、hsa-miR-369-5p、hsa-miR-429、hsa-miR-672的表达水平是以U6 SnRNA为内参检测得到，模型中的Log(P/(1-P))的cutoff值介于-0.5～0.5之间，较优为-0.3～-0.1之间。待测样本经模型分析后Log(P/(1-P))值高于cutoff值，则认为是极早期肝癌高危患者。
实施例3、制备一种本发明的试剂盒
本实施例中，以实施例2中设计的检测试剂，制备包含如下组分或组件的试剂盒：RNA提取试剂、针对每一待测miRNAs及内参的逆转录试剂、针对每一待测miRNAs及内参的PCR扩增上游引物及下游引物、无RNA酶的纯水、阴性质控品、阳性质控品。
1、RNA提取试剂：本实施例中使用的是Trizol试剂(Life Technologies公司，美国)；
2、逆转录引物、正向引物、反向引物、寡核苷酸探针，及阳性对照，委托上海生工生物科技有限公司合成；
3、逆转录酶M-MLV、逆转录反应体系、核酸扩增酶及定量PCR反应体系购自LifeTechnologies公司；
4、阴性质控品为灭菌生理盐水，阳性质控品为各5000拷贝数的hsa-miR-193a-3p、hsa-miR-369-5p、hsa-miR-672、hsa-miR-429、let-7i*、U6 SnRNA寡核苷酸。
上述每一种试剂置于独立的试剂瓶或管中，将这些试剂瓶或管有效分隔，集中包装于包装盒中。
实施例4、大样本验证试剂盒应用于早期肝癌检测的特异性、敏感性
为了进一步验证实施例3制备的试剂盒应用于无症状高风险个体的群体的极早期肝癌鉴定的特异性、敏感性，获取408个受试者的血浆样本(验证集，其中304例慢行乙肝患者，104例极早期肝癌患者)，验证上述miRNA组合(hsa-miR-193a-3p、hsa-miR-369-5p、hsa-miR-672、hsa-miR-429、let-7i*)应用于早期肝癌检测的特异性和敏感性。以并行检测AFP的结果作为对比。同时检测上述miRNA组合与AFP联合诊断的结果。检测miRNA组合及内参或检测AFP的试剂同实施例1。
采用定量RT-PCR检测方法来进行实验。预测概率被用来建立受试者工作特征曲线(见图3B)。
miRNA组合与AFP之间的AUC的比较表明，miRNA组合的诊断准确度显著高于AFP(AUC：0.80vs.0.64，p＜0.001，图3B)。
实施例5、检测试剂盒的临床应用
对于医院随访的慢性HBsAg-阳性患者，收集患者的血清，如实施例2的方法抽提RNA逆转录，以上述miRNA组合(hsa-miR-193a-3p、hsa-miR-369-5p、hsa-miR-672、hsa-miR-429、let-7i*)作为标志物，以U6 SnRNA作为内参，以实施例2设计的引物和探针进行定量PCR检测。
cutoff值设为-0.272。如实施例2对样本进行模型分析，如果测得的cutoff值高于-0.272，则认为是极早期肝癌高危患者，建议后续进行积极随访检查和治疗。
在本发明提及的所有文献都在本申请中引用作为参考，就如同每一篇文献被单独引用作为参考那样。此外应理解，在阅读了本发明的上述讲授内容之后，本领域技术人员可以对本发明作各种改动或修改，这些等价形式同样落于本申请所附权利要求书所限定的范围。

Claims (11)

1.一种用于检测肝癌的试剂盒，其特征在于，所述的试剂盒中包括：
特异性检测人hsa-miR-193a-3p的检测试剂；
特异性检测人hsa-miR-369-5p的检测试剂；
特异性检测人hsa-miR-672的检测试剂；
特异性检测人hsa-miR-429的检测试剂；和
特异性检测人let-7i*的检测试剂。
2.如权利要求1所述的试剂盒，其特征在于，所述的检测试剂是RNA逆转录引物、DNA扩增引物和DNA探针。
3.如权利要求2所述的试剂盒，其特征在于，
特异性检测人hsa-miR-193a-3p的检测试剂是SEQ ID NO:6所示的逆转录引物、SEQ IDNO:7和SEQ ID NO:8所示的扩增引物，SEQ ID NO:9所示的探针；
特异性检测人hsa-miR-369-5p的检测试剂是SEQ ID NO:10所示的逆转录引物、SEQ IDNO:11和SEQ ID NO:12所示的扩增引物，SEQ ID NO:13所示的探针；
特异性检测人hsa-miR-672的检测试剂是SEQ ID NO:14所示的逆转录引物、SEQ IDNO:15和SEQ ID NO:16所示的扩增引物，SEQ ID NO:17所示的探针；
特异性检测人hsa-miR-429的检测试剂是SEQ ID NO:18所示的逆转录引物、SEQ IDNO:19和SEQ ID NO:20所示的扩增引物，SEQ ID NO:21所示的探针；
特异性检测人let-7i*的检测试剂是SEQ ID NO:22所示的逆转录引物、SEQ ID NO:23和SEQ ID NO:24所示的扩增引物，SEQ ID NO:25所示的探针。
4.如权利要求1所述的试剂盒，其特征在于，所述的试剂盒中还包括：
特异性检测内参基因的检测试剂。
5.如权利要求4所述的试剂盒，其特征在于，所述的特异性检测内参基因的检测试剂是针对人U6SnRNA的逆转录引物、扩增引物和探针。
6.如权利要求5所述的试剂盒，其特征在于，所述的特异性检测内参基因的检测试剂是SEQ ID NO:26所示的逆转录引物、SEQ ID NO:27和SEQ ID NO:28所示的扩增引物，SEQ IDNO:29所示的探针。
7.权利要求1-6任一所述的试剂盒，其特征在于，该试剂盒中还包括：阴性质控品和/或阳性质控品。
8.如权利要求1-6任一所述的试剂盒，其特征在于，该试剂盒中还包括：RNA提取试剂，逆转录反应试剂，PCR扩增试剂和/或使用说明书。
9.特异性检测人hsa-miR-193a-3p、hsa-miR-369-5p、hsa-miR-672、hsa-miR-429和let-7i*的检测试剂的用途，用于制备检测肝癌的试剂盒。
10.如权利要求9所述的用途，其特征在于，所述的肝癌是早期肝癌。
11.如权利要求10所述的用途，其特征在于，所述的检测试剂是RNA逆转录引物、DNA扩增引物和DNA探针。
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