CN109321640A - 检测样本中psf-tfe3融合基因的寡核苷酸、方法和试剂盒 - Google Patents

检测样本中psf-tfe3融合基因的寡核苷酸、方法和试剂盒 Download PDF

Info

Publication number
CN109321640A
CN109321640A CN201811199328.5A CN201811199328A CN109321640A CN 109321640 A CN109321640 A CN 109321640A CN 201811199328 A CN201811199328 A CN 201811199328A CN 109321640 A CN109321640 A CN 109321640A
Authority
CN
China
Prior art keywords
psf
tfe3
probe
sample
upstream
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Pending
Application number
CN201811199328.5A
Other languages
English (en)
Inventor
桑志高
吴鹏飞
王淑
王淑一
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
NANJING ADICON CLINICAL LABORATORIES Co Ltd
Original Assignee
NANJING ADICON CLINICAL LABORATORIES Co Ltd
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by NANJING ADICON CLINICAL LABORATORIES Co Ltd filed Critical NANJING ADICON CLINICAL LABORATORIES Co Ltd
Priority to CN201811199328.5A priority Critical patent/CN109321640A/zh
Publication of CN109321640A publication Critical patent/CN109321640A/zh
Pending legal-status Critical Current

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
    • C12Q1/6844—Nucleic acid amplification reactions
    • C12Q1/6858—Allele-specific amplification

Landscapes

  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Analytical Chemistry (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)

Abstract

本发明公开用于检测样本中PSF‑TFE3融合基因的寡核苷酸、方法和试剂盒，其包括针对1型PSF‑TFE3的上下游引物和探针，针对2型PSF‑TFE3的上下游引物和探针，以及针对β‑actin内参基因的上下游引物和探针。本发明可快速检测样品中是否存在PSF‑TFE3融合基因及其表达量的多少。利用本发明完成的检测结果准确，灵敏，可辅助为Xp11.2易位/TFE3融合基因相关性肾癌患者制定个体化治疗方案。

Description

检测样本中PSF-TFE3融合基因的寡核苷酸、方法和试剂盒
技术领域
本发明属于生物科学和生物技术领域，特别涉及一种检测样本中PSF-TFE3融合基因的方法、寡核苷酸和试剂盒，采用荧光PCR技术，检测人类Xp11.2易位/TFE3融合基因相关性肾癌患者体内PSF-TFE3融合基因的表达水平。
背景技术
肾细胞癌(renal cell carcinoma,RCC)是临床泌尿系统中最为常见的恶性肿瘤，起源于肾小管上皮细胞。2012年,世界范围内报道RCC发病率位列所有男性和女性恶性肿瘤发病率的第9位(214000例)和第14位(124000例)，且正以每年2％的速度增长。接近70％的新发病例与高度发展的社会经济水平相关。肾细胞癌的发病率男性多于女性(约为2:1)，儿童少见。Xp11.2易位/TFE3基因融合相关性肾癌，简称Xp11.2易位性肾癌，于1986年最早发现，直至2004年WHO泌尿及男性生殖系统肿瘤分类学会中被首次单独列出，是肾脏细胞癌的一种亚型。正是因为此类肾脏肿瘤临床较为罕见，目前对其诊断、治疗及预后等方面的认识仍具有一定的局限性，包括其病理学特点、影像学、生物学行为及预后等很多方面都不如其他类型的肾癌有较为确切的临床结论。
Xp11.2易位性肾癌融合基因PSF-TFE3是X染色体短臂一区一带二亚带TFE3基因处发生断裂，并与1号染色体短臂三区四带PSF基因发生易位形成的。PSF-TFE3融合基因检测的常用技术有荧光原位杂交技术(FISH)、实时定量PCR技术(RQ-PCR)等方法。FISH检测结果较为直观，但是试验过程繁琐，涉及试剂种类繁多，费时费力，且结果需经验丰富的专业人士来判读，结果判读存在较大的主观性。实时荧光定量PCR中常见的方法有SYBR Green I染料法，双探针杂交法以及Taqman技术等。其中SYBR GreenI由于是非饱和染料，特异性不如双探针杂交法以及Taqman法，必须通过观察溶解曲线来判断其特异性；而双探针法杂交法成本又较为昂贵。在Taqman技术中，RQ-PCR采用Taqman探针荧光定量技术，综合生物学、酶学和荧光化学于一体，从扩增到结果分析均在PCR反应管封闭状态下进行，解决了PCR产物污染而导致假阳性的问题，同时也提高了敏感度，其结果用拷贝数表示，实现了对PCR产物的准确定量，易于统一标准，与定性PCR技术相比，具有特异度好，灵敏度高，线性关系好，操作简单，自动化程度高、防污染，有较大的线性范围等优点。
发明内容
本发明设计了检测内参/目的基因用引物、探针序列，采用荧光定量PCR技术，利用双标准曲线的方法，分别构建内参基因β-actin和目的基因PSF-TFE3的定量标准曲线，检测目的基因PSF-TFE3相对于内参基因β-actin的表达水平。通过调整目的基因和内参基因的引物探针比例，以及PCR反应条件，使扩增效率和速率均达到最佳。
本发明中的“PSF-TFE3cDNA序列”指的是PSF-TFE3融合基因经转录后产生的mRNA再经逆转录后产生的cDNA序列，或者根据这种cDNA序列通过化学合成手段直接合成出。将不论是经过逆转录还是通过化学合成手段直接产生的cDNA序列插入到合适的质粒后，可作为阳性对照品进行使用。
PSF-TFE3融合基因目前主要发现两种融合形式：1型PSF-TFE3，它是由PSF基因的第9外显子与TFE3基因的第5外显子融合在一起形成的；2型PSF-TFE3，它是由PSF基因的第9外显子与TFE3基因的第6外显子融合在一起形成的。
本发明提供了用于检测样本中PSF-TFE3融合基因的寡核苷酸，所述寡核苷酸包括(1)和(2)中的至少一种：(1)针对1型PSF-TFE3的上下游引物和探针，其碱基序列分别为SEQID NO:1、2和3；(2)针对2型PSF-TFE3的上下游引物和探针，其碱基序列分别为SEQ ID NO:4、5和6。
进一步地，所述寡核苷酸还包括针对β-actin内参基因的上下游引物和探针，其碱基序列分别为SEQ ID NO:7、8和9。
本发明还提供了一种检测样本中PSF-TFE3融合基因的方法，所述方法包括以下步骤：(1)提取样本中的RNA；
(2)将(1)提取出的RNA逆转录为cDNA；
(3)加入(2)中所述的cDNA到反应管中，利用针对1型PSF-TFE3的上下游引物和探针检测样本中的1型PSF-TFE3的荧光信号，其碱基序列分别为SEQ IDNO:1、2和3；利用针对2型PSF-TFE3的上下游引物和探针检测样本中的2型PSF-TFE3的荧光信号，其碱基序列分别为SEQ ID NO:4、5和6；利用针对β-actin内参基因的上下游引物和探针检测样本中的β-actin内参基因的荧光信号，其碱基序列分别为SEQ ID NO:7、8和9；
(4)根据(3)中的1型PSF-TFE3和2型PSF-TFE3的荧光信号和β-actin内参基因的荧光信号，确定样本中的1型PSF-TFE3和2型PSF-TFE3的相对表达量。
本发明还提供了一种检测样本中PSF-TFE3融合基因的试剂盒，所述试剂盒包括检测体系PCR反应液，所述检测体系PCR反应液包括(1)和(2)中的至少一种：(1)针对1型PSF-TFE3的上下游引物和探针，其碱基序列分别为SEQ IDNO:1、2和3；(2)针对2型PSF-TFE3的上下游引物和探针，其碱基序列分别为SEQ ID NO:4、5和6。
进一步地，所述引物和探针还包括针对β-actin内参基因的上下游引物和探针，其碱基序列分别为SEQ ID NO:7、8和9。
进一步地，所述试剂盒还包括阳性对照品、阴性对照品和空白对照品，其特征在于，所述阳性对照品为含有PSF-TFE3cDNA序列的阳性质粒溶液，所述阴性对照品为不含有PSF-TFE3cDNA序列的质粒溶液，所述空白对照品为生理盐水或不加任何物质。
进一步地，所述阳性质粒包括含有1型PSF-TFE3cDNA序列的阳性质粒和含有2型PSF-TFE3cDNA序列的阳性质粒。
进一步地，所述试剂盒还包括样本RNA提取试剂，所述样本RNA提取试剂包括TRIzol、氯仿、异丙醇、75％乙醇和RNase-free水。
进一步地，所述样本RNA提取试剂还包括红细胞裂解液，所述红细胞裂解液包括16μmol/L氯化铵、1mmol/L碳酸氢钠和12.5μmol/L EDTA-Na2。
本发明的有益效果：本发明将实时荧光PCR技术结合采用Taqman探针，利用双标准曲线的方法，分别构建内参基因β-actin和PSF-TFE3目的基因的定量标准曲线，检测受测者体内PSF-TFE3目的基因相对于内参基因的表达水平；它综合生物学、酶学和荧光化学于一体，从扩增到结果分析均在PCR反应管封闭状态下进行，解决了PCR产物污染而导致假阳性的问题，同时也提高了敏感度，具有特异度好，灵敏度高，操作简单，自动化程度高、防污染等优点。相比于以往的FISH和△△CT法等检测手段，该方法具有精确度高，结果便于判读等优点。采用Taqman探针荧光定量技术；相比于多重巢式PCR，该方法具有方便，经济，快捷，灵敏度高，特异性好，通量大等优点，避免巢式PCR的开盖反应，提高了结果的准确性，避免污染的发生；也提高了结果的易判断性，使检测记过更加客观易读。加之该方法将反应体系所需的引物、探针进行合理配比和优化，使实验条件达到最佳，从而省去了繁琐的条件摸索环节，大大提升了实验效率。该方法有助于临床上Xp11.2易位性肾癌患者体内PSF-TFE3融合基因的微量残留检测(灵敏度可达100个拷贝)，对于及时干预治疗避免复发、调整治疗方案、评价治疗效果、预测预后、预防临床复发都具有重要意义。该方法可有效的节约检测时间，提高检测精度。本方法用于辅助临床上人类肾细胞癌的早期预防、早期诊断的辅助性指标；还可对对高危人群进行较为准确的筛查。
附图说明
图1为阳性质粒扩增曲线图：(a)为PMD18-T/PSF-TFE3-1阳性质粒扩增曲线图；(b)PMD18-T/PSF-TFE3-2阳性质粒扩增曲线图。
图2为灵敏度检测结果图：(a)100copies/μL PMD18-T/PSF-TFE3-1阳性质粒扩增曲线图；(b)100copies/μL PMD18-T/PSF-TFE3-2阳性质粒扩增曲线图。
图3为临床血液样本(2号样本)的荧光PCR检测结果图：(a)2号样本的1型PSF-TFE3扩增曲线图；(b)2号样本的2型PSF-TFE3扩增曲线图。
图4为临床肾组织样本(2号样本)的荧光PCR检测结果图：(a)2号样本的1型PSF-TFE3扩增曲线图；(b)2号样本的2型PSF-TFE3扩增曲线图。
具体实施方式
下面结合具体实施例和附图，进一步阐述本发明。应当注意的是，实施例中未说明的常规条件和方法，通常按照所属领域实验人员常规采用方法：譬如，奥斯柏和金斯顿主编的《精编分子生物学实验指南》第四版，或者按照制造厂商所建议的步骤和条件。
实施例1
用于检测样本中PSF-TFE3融合基因的寡核苷酸，所述寡核苷酸包括(1)和(2)中的至少一种：(1)针对1型PSF-TFE3的上下游引物和探针，其碱基序列分别为SEQ ID NO:1、2和3，如表1所示；(2)针对2型PSF-TFE3的上下游引物和探针，其碱基序列分别为SEQ ID NO:4、5和6，如表1所示。
进一步地，所述寡核苷酸还包括针对β-actin内参基因的上下游引物和探针，其碱基序列分别为SEQ ID NO:7、8和9，如表1所示。
用于检测样本中PSF-TFE3融合基因的寡核苷酸，所述寡核苷酸包括(1)和(2)：(1)针对1型PSF-TFE3的上下游引物和探针，其碱基序列分别为SEQ ID NO:1、2和3，如表1所示；(2)针对2型PSF-TFE3的上下游引物和探针，其碱基序列分别为SEQ ID NO:4、5和6，如表1所示。
进一步地，所述寡核苷酸还包括针对β-actin内参基因的上下游引物和探针，其碱基序列分别为SEQ ID NO:7、8和9，如表1所示。
表1.引物和探针序列
引物,探针/primer，probe 序列编号 序列/Sequence(5’→3’)
PSF-TFE3-1-F SEQ ID NO:1 AGTCCTGTGGTGCCTCCG
PSF-TFE3-1-R SEQ ID NO:2 CCAGCAACCATGAGTGGTTC
PSF-TFE3-1-Probe SEQ ID NO:3 FAM-AGCTGAGCATTTCATCATTGTAACTGGAC-TAMRA
PSF-TFE3-2-F SEQ ID NO:4 TGCCACGCCTTGACTACTGT
PSF-TFE3-2-R SEQ ID NO:5 TCCACCAGCAACCATGAGTG
PSF-TFE3-2-Probe SEQ ID NO:6 FAM-ACACATCAAGCAGATTCCCTGACACA-TAMRA
β-actin-F SEQ ID NO:7 TGAGCGAGGCTACAGCTT
β-actin-R SEQ ID NO:8 TCCTTGATGTCGCGCACGATTT
β-actin Probe SEQ ID NO:9 FAM-ACCACCACGGCCGAGCGG-TAMRA
一种检测样本中PSF-TFE3融合基因的方法，所述方法包括以下步骤：
(1)提取样本中的RNA；
(2)将(1)提取出的RNA逆转录为cDNA；
(3)加入(2)中所述的cDNA到反应管中，利用针对1型PSF-TFE3的上下游引物和探针检测样本中的1型PSF-TFE3的荧光信号，其碱基序列分别为SEQ ID NO:1、2和3，如表1所示；利用针对2型PSF-TFE3的上下游引物和探针检测样本中的2型PSF-TFE3的荧光信号，其碱基序列分别为SEQ ID NO:4、5和6，如表1所示；利用针对β-actin内参基因的上下游引物和探针检测样本中的β-actin内参基因的荧光信号，其碱基序列分别为SEQ ID NO:7、8和9，如表1所示；
(4)根据(3)中的1型PSF-TFE3和2型PSF-TFE3的荧光信号和β-actin内参基因的荧光信号，确定样本中的1型PSF-TFE3和2型PSF-TFE3的相对表达量。
一种检测样本中PSF-TFE3融合基因的试剂盒，所述试剂盒包括检测体系PCR反应液，所述检测体系PCR反应液包括(1)和(2)中的至少一种：(1)针对1型PSF-TFE3的上下游引物和探针，其碱基序列分别为SEQ ID NO:1、2和3，如表1所示；(2)针对2型PSF-TFE3的上下游引物和探针，其碱基序列分别为SEQ ID NO:4、5和6，如表1所示。
一种检测样本中PSF-TFE3融合基因的试剂盒，所述试剂盒包括检测体系PCR反应液，所述检测体系PCR反应液包括(1)和(2)：(1)针对1型PSF-TFE3的上下游引物和探针，其碱基序列分别为SEQ ID NO:1、2和3，如表1所示；(2)针对2型PSF-TFE3的上下游引物和探针，其碱基序列分别为SEQ ID NO:4、5和6，如表1所示。
进一步地，所述寡核苷酸还包括针对β-actin内参基因的上下游引物和探针，其碱基序列分别为SEQ ID NO:7、8和9，如表1所示。
进一步地，所述试剂盒还包括阳性对照品、阴性对照品和空白对照品，所述阳性对照品为含有PSF-TFE3cDNA序列的阳性质粒溶液，所述阴性对照品为不含有PSF-TFE3cDNA序列的质粒溶液，所述空白对照品为生理盐水或不加任何物质。进一步地，阳性质粒包括含有1型PSF-TFE3cDNA序列的阳性质粒和含有2型PSF-TFE3cDNA序列的阳性质粒。
所述试剂盒的检测体系PCR反应液还包括THNDERBIRD Probe qPCR Mix(2×)(TOYOBO公司)。
所述试剂盒还包括样本提取试剂，所述样本提取试剂可选自组织RNA抽提试剂或血液RNA抽提试剂。组织RNA抽提试剂可购买自TOYOBO和QIAGEN等公司的商业化试剂盒，当然也可自行配制；血液RNA抽提试剂包括红细胞裂解液、TRIzol、氯仿、异丙醇、75％乙醇和RNase-free水，其中红细胞裂解液包括16μmol/L氯化铵、1mmol/L碳酸氢钠和12.5μmol/LEDTA-Na2。当然，血液RNA抽提试剂也购买自TOYOBO和QIAGEN等公司的商业化试剂盒。
所述试剂盒还包括RNA逆转录试剂，所述RNA逆转录试剂可自行配制，也可购买自TOYOBO等公司的商业化试剂盒，如TOYOBO公司的Rever Tra Ace qPCRRT Kit试剂盒。
实施例2
本发明方法的操作流程：
(1)抽提血液样本中的组织RNA：在洁净的1.5ml的离心管中加入1ml实施例1中的红细胞裂解液，取抗凝血0.5ml混匀，室温静置10min；5000rpm离心5min，弃上清，收集底部的细胞；再次加入0.5ml实施例1中的红细胞裂解液，5000rpm离心5min，弃上清，收集底部的细胞；向细胞中加入1ml TRIzol，反复吹打直至沉淀完全溶解，室温静止5min；加入0.2ml氯仿，震荡均匀；14000rpm 4℃离心10min，吸取上清层转移至另一新的离心管中(不要吸取白色中间层)；加入等体积的异丙醇，上下充分混匀，室温静置10min；14000rpm 4℃离心10min，弃上清，加入75％乙醇1ml，轻轻上下颠倒洗涤管壁；14000rpm 4℃离心5min，弃乙醇；室温干燥10～15min，加入20ulRNase-free水溶解沉淀。采用NanoDrop2000(购自ThermoScientific公司)检测制备出的RNA浓度及纯度，-30℃保存备用。
此外，也可提取肾组织样本的RNA，其制备方法为：切取组织或者刮取石蜡玻片样本于1.5ml离心管中，加入1ml组织透明液(杭州西奈山生物科技有限公司)，振荡混匀后13000rpm离心1min。去除上清，加入500ml组织透明液(杭州西奈山生物科技有限公司)，振荡混匀后13000rpm离心1min。去除上清，加入1ml无水乙醇，振荡混匀后13000rpm离心1min。去除上清，置于37℃金属浴至干燥(开盖)。加入150ul PKD buffer(来自RNeasy FFPE KIT，QIAGEN公司)，振荡混匀。加入10ul PK(来自RNeasy FFPE KIT，QIAGEN公司)，上下颠倒混匀。在56℃金属浴15min，后80℃金属浴15min。冰上放置3min后，13200rpm离心15min，吸取上清至新的1.5ml EP管，加入DNase Booster buffer(来自RNeasy FFPE KIT，QIAGEN公司)16ul和DNase1(来自RNeasy FFPE KIT，QIAGEN)10ul振荡混匀后低速离心，室温静置15min。加入320ul RBC buffer(来自RNeasy FFPE KIT，QIAGEN公司)混匀后加入720ul无水乙醇混匀。向层析柱(来自RNeasy FFPE KIT，QIAGEN公司)内加入700ul前一步液体，10000rpm15s，弃去管中液体，向层析柱内加入剩下液体，10000rpm 15S，弃去管中液体。向层析柱内加入500ul RPE buffer(来自RNeasy FFPE KIT，QIAGEN公司)，10000rpm 15s，弃去废液。向层析柱内加入500ul RPE buffer，10000rpm 2min，弃去废液，打开盖子，全速离心5min。将层析柱置于新的1.5ml EP管，向层析柱中加入30ulDEPC水，静置2min后，全速离心1min。采用NanoDrop 2000(购自Thermo Scientific公司)检测RNA浓度及纯度，-30℃保存备用。
(2)cDNA制备：参考TOYOBO公司的Rever Tra Ace qPCR RT Kit试剂盒说明书，将(1)中制备出的RNA反转为cDNA。
(3)试剂配制：按检测人份数配置检测体系PCR反应液各X ul，每人份23ul分装，如表2所示：
X＝23ul反应液×(8份内参(标准曲线)+8份目的基因(标准曲线)+n份样本+1份阳性对照+1份阴性对照+1份空白对照)；
表2 PSF-TFE3反应体系
其中Forward Primer、Reverse Primer和Taqman Probe分别选自PSF-TFE3-1-F、PSF-TFE3-1-R和PSF-TFE3-1-Probe，或者PSF-TFE3-2-F、PSF-TFE3-2-R和PSF-TFE3-2-Probe，或者β-actin-F、β-actin-R和β-actin Probe。
(4)加样：将(3)中配制的检测体系PCR反应液和步骤(2)中制备出的cDNA2μl加入到96孔板的孔或者反应管中；阳性对照和阴性对照直接加2μl阳性对照品和阴性对照品；空白对照加2μl生理盐水或不加任何物质。
(5)检测：检测在实时荧光PCR仪上进行，可用仪器包括ABI7300，7500(美国Applied Biosystems公司)等。反应条件：95℃预变性1min；95℃15s，58℃35sec 40个循环，荧光信号于58℃35sec时采集。
(6)结果判断：将阈值线调整至背景信号及阴性扩增线以上，系统根据标准曲线和Ct值自动计算出拷贝数。
1)内参阳性时，检测结果才认为有效；
2)阳性判断标准：Ct<36，为阳性；35≤Ct≤38，为疑似阳性，需要再次
验证；Ct＞38，为阴性。
实施例3阳性质粒检测和灵敏度检测
鉴于PSF-TFE3融合基因有两种类型：1型PSF-TFE3和2型PSF-TFE3，因此相应的阳性质粒也有两种：携带着1型PSF-TFE3cDNA的PMD18-T质粒，即PMD18-T/PSF-TFE3-1阳性质粒；携带着2型PSF-TFE3cDNA的PMD18-T质粒，即PMD18-T/PSF-TFE3-2阳性质粒。先直接合成出1型PSF-TFE3cDNA和2型PSF-TFE3cDNA，再分别插入到PMD18-T质粒中，制备出PMD18-T/PSF-TFE3-1阳性质粒和PMD18-T/PSF-TFE3-2阳性质粒。
以浓度106copies/μL的阳性质粒(PMD18-T/PSF-TFE3-1和PMD18-T/PSF-TFE3-2)作为模板，结果如图1所示，PSF-TFE3-1、PSF-TFE3-2和β-actin均起线，说明本发明的引物和探针可用来检测阳性质粒。以质粒浓度为103、102、10copies/μL作为模板进行实验，每个浓度重复10次，结果发现本发明对这两种阳性质粒(PMD18-T/PSF-TFE3-1和PMD18-T/PSF-TFE3-2)的检测下限均为100copies，结果如图2。
实施例4检测临床血液样本
取待测临床外周血样品10例，按实施例2所述方法提取RNA、配制试剂并检测。
每份样品加入检测体系PCR反应液中2ul。同时做阳性，阴性，空白对照各一份。用荧光PCR仪检测，时间为100分钟。10例筛查样本中所有样本的β-actin均起线，但PSF-TFE3融合基因(PSF-TFE3-1和PSF-TFE3-2)未有样本出现起线，结果图表3所述，其中2号样本的检测结果如图1和图2所示。
表3 10例临床血液样本PSF-TFE3mRNA表达水平
实施例5检测临床肾组织标本
取待测的临床肾组织标本10例，按实施例2所述方法提取RNA、配制试剂并检测。
每份样品加入检测体系PCR反应液中2ul。同时做阳性，阴性，空白对照各一份。用荧光PCR仪检测，时间为100分钟。10例筛查样本中所有标本的β-actin均起线，但PSF-TFE3融合基因(PSF-TFE3-1和PSF-TFE3-2)未有标本出现起线，实验结果如表4所示，其中3号标本的检测结果如图4所示。
表4 10例临床肾组织样本PSF-TFE3mRNA表达水平
序列表
<110> 南京艾迪康医学检验所有限公司
<120> 检测样本中PSF-TFE3融合基因的寡核苷酸、方法和试剂盒
<160> 9
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 18
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 1
agtcctgtgg tgcctccg 18
<210> 2
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 2
ccagcaacca tgagtggttc 20
<210> 3
<211> 29
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 3
agctgagcat ttcatcattg taactggac 29
<210> 4
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 4
tgccacgcct tgactactgt 20
<210> 5
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 5
tccaccagca accatgagtg 20
<210> 6
<211> 26
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 6
acacatcaag cagattccct gacaca 26
<210> 7
<211> 18
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 7
tgagcgaggc tacagctt 18
<210> 8
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 8
tccttgatgt cgcgcacgat tt 22
<210> 9
<211> 18
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 9
accaccacgg ccgagcgg 18

Claims (9)

1.用于检测样本中PSF-TFE3融合基因的寡核苷酸，其特征在于，所述寡核苷酸包括(1)和(2)中的至少一种：(1)针对1型PSF-TFE3的上下游引物和探针，其碱基序列分别为SEQ IDNO:1、2和3；(2)针对2型PSF-TFE3的上下游引物和探针，其碱基序列分别为SEQ ID NO:4、5和6。
2.根据权利要求1所述的寡核苷酸，其特征在于，所述寡核苷酸还包括针对β-actin内参基因的上下游引物和探针，其碱基序列分别为SEQ ID NO:7、8和9。
3.一种检测样本中PSF-TFE3融合基因的方法，其特征在于，所述方法包括以下步骤：
(1)提取样本中的RNA；
(2)将(1)提取出的RNA逆转录为cDNA；
(3)加入(2)中所述的cDNA到反应管中，利用针对1型PSF-TFE3的上下游引物和探针检测样本中的1型PSF-TFE3的荧光信号，其碱基序列分别为SEQ ID NO:1、2和3；利用针对2型PSF-TFE3的上下游引物和探针检测样本中的2型PSF-TFE3的荧光信号，其碱基序列分别为SEQ ID NO:4、5和6；利用针对β-actin内参基因的上下游引物和探针检测样本中的β-actin内参基因的荧光信号，其碱基序列分别为SEQ ID NO:7、8和9；
(4)根据(3)中的1型PSF-TFE3和2型PSF-TFE3的荧光信号和β-actin内参基因的荧光信号，确定样本中的1型PSF-TFE3和2型PSF-TFE3的相对表达量。
4.一种检测样本中PSF-TFE3融合基因的试剂盒，所述试剂盒包括检测体系PCR反应液，其特征在于，所述检测体系PCR反应液包括(1)和(2)中的至少一种：(1)针对1型PSF-TFE3的上下游引物和探针，其碱基序列分别为SEQ ID NO:1、2和3；(2)针对2型PSF-TFE3的上下游引物和探针，其碱基序列分别为SEQ ID NO:4、5和6。
5.根据权利要求4所述的寡核苷酸，其特征在于，所述引物和探针还包括针对β-actin内参基因的上下游引物和探针，其碱基序列分别为SEQ ID NO:7、8和9。
6.根据权利要求4所述的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒还包括阳性对照品、阴性对照品和空白对照品，所述阳性对照品为含有PSF-TFE3cDNA序列的阳性质粒溶液，所述阴性对照品为不含有PSF-TFE3cDNA序列的质粒溶液，所述空白对照品为生理盐水或不加任何物质。
7.根据权利要求6所述的试剂盒，其特征在于，所述阳性质粒包括含有1型PSF-TFE3cDNA序列的阳性质粒和含有2型PSF-TFE3cDNA序列的阳性质粒。
8.根据权利要求4所述的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒还包括样本RNA提取试剂，所述样本RNA提取试剂包括TRIzol、氯仿、异丙醇、75％乙醇和RNase-free水。
9.根据权利要求8所述的试剂盒，其特征在于，所述样本RNA提取试剂还包括红细胞裂解液，所述红细胞裂解液包括16μmol/L氯化铵、1mmol/L碳酸氢钠和12.5μmol/L EDTA-Na2。
CN201811199328.5A 2018-10-15 2018-10-15 检测样本中psf-tfe3融合基因的寡核苷酸、方法和试剂盒 Pending CN109321640A (zh)

Priority Applications (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN201811199328.5A CN109321640A (zh) 2018-10-15 2018-10-15 检测样本中psf-tfe3融合基因的寡核苷酸、方法和试剂盒

Applications Claiming Priority (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN201811199328.5A CN109321640A (zh) 2018-10-15 2018-10-15 检测样本中psf-tfe3融合基因的寡核苷酸、方法和试剂盒

Publications (1)

Publication Number Publication Date
CN109321640A true CN109321640A (zh) 2019-02-12

Family

ID=65262589

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
CN201811199328.5A Pending CN109321640A (zh) 2018-10-15 2018-10-15 检测样本中psf-tfe3融合基因的寡核苷酸、方法和试剂盒

Country Status (1)

Country Link
CN (1) CN109321640A (zh)

Cited By (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN109234362A (zh) * 2018-10-15 2019-01-18 北京艾迪康医学检验实验室有限公司 检测样本中cltc-tfe3融合基因的寡核苷酸、方法和试剂盒

Citations (6)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO1998006871A1 (en) * 1996-08-13 1998-02-19 Cancer Research Campaign Technology Limited Materials and methods relating to the diagnosis and prophylactic and therapeutic treatment of papillary renal cell carcinoma
CN102094074A (zh) * 2009-12-11 2011-06-15 上海裕隆临床检验中心有限公司 定量检测白血病融合基因tel-aml1荧光rt-pcr试剂盒
WO2012018613A2 (en) * 2010-07-26 2012-02-09 The Johns Hopkins University Genetic make-up modifies cancer outcome
CN102634572A (zh) * 2012-01-16 2012-08-15 中山大学达安基因股份有限公司 一种荧光定量RT-PCR检测融合基因E2A-PBX1 mRNA表达的试剂盒
CN102719540A (zh) * 2012-06-12 2012-10-10 福州艾迪康医学检验所有限公司 利用荧光定量PCR技术检测PML-RARα融合基因相对表达量的检测试剂盒
CN107299134A (zh) * 2017-06-16 2017-10-27 中国人民解放军南京军区南京总医院 一种用于诊断prcc‑tfe3易位性肿瘤的pcr引物组合及其应用

Patent Citations (6)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO1998006871A1 (en) * 1996-08-13 1998-02-19 Cancer Research Campaign Technology Limited Materials and methods relating to the diagnosis and prophylactic and therapeutic treatment of papillary renal cell carcinoma
CN102094074A (zh) * 2009-12-11 2011-06-15 上海裕隆临床检验中心有限公司 定量检测白血病融合基因tel-aml1荧光rt-pcr试剂盒
WO2012018613A2 (en) * 2010-07-26 2012-02-09 The Johns Hopkins University Genetic make-up modifies cancer outcome
CN102634572A (zh) * 2012-01-16 2012-08-15 中山大学达安基因股份有限公司 一种荧光定量RT-PCR检测融合基因E2A-PBX1 mRNA表达的试剂盒
CN102719540A (zh) * 2012-06-12 2012-10-10 福州艾迪康医学检验所有限公司 利用荧光定量PCR技术检测PML-RARα融合基因相对表达量的检测试剂盒
CN107299134A (zh) * 2017-06-16 2017-10-27 中国人民解放军南京军区南京总医院 一种用于诊断prcc‑tfe3易位性肿瘤的pcr引物组合及其应用

Non-Patent Citations (5)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
DOROTHEE PFLUEGER 等: "Identification of Molecular Tumor Markers in Renal Cell Carcinomas with TFE3 Protein Expression by RNA Sequencing", 《NEOPLASIA》 *
XIAO-TONG WANG 等: "SFPQ/PSF-TFE3 renal cell carcinoma: a clinicopathologic study emphasizing extended morphology and reviewing the differences between SFPQ-TFE3 RCC and the corresponding mesenchymal neoplasm despite an identical gene fusion", 《HUMAN PATHOLOGY》 *
宋善俊 等: "《白血病》", 31 May 2004, 湖北科学技术出版社 *
李自刚 等: "《生物检测技术》", 31 August 2016 *
赵晶晶 等: "使用Taqman技术检测慢性粒细胞白血病患者微小残留病灶", 《分子诊断与治疗杂志》 *

Cited By (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN109234362A (zh) * 2018-10-15 2019-01-18 北京艾迪康医学检验实验室有限公司 检测样本中cltc-tfe3融合基因的寡核苷酸、方法和试剂盒

Similar Documents

Publication Publication Date Title
Day et al. PCA3: from basic molecular science to the clinical lab
Halling et al. Bladder cancer detection using FISH (UroVysion assay)
US9493839B2 (en) Non-invasive cancer diagnosis
CN108624688B (zh) hsa_circ_0012755作为前列腺癌分子靶标在制备药物和试剂盒中的应用
CN108048570A (zh) 用于结直肠癌相关基因Septin9甲基化检测的引物对、试剂盒及方法
CN109055555B (zh) 一种肺癌早期转移诊断标志物及其试剂盒和应用
CN104004840A (zh) 用于早期筛查与诊断前列腺癌的试剂盒
CN102719540A (zh) 利用荧光定量PCR技术检测PML-RARα融合基因相对表达量的检测试剂盒
CN109439757A (zh) 血浆外泌体miR-455-3p作为早期肝癌诊断标志物的应用
CN110699454A (zh) 检测样本中mll5基因相对表达量的寡核苷酸、方法和试剂盒
CN103627802B (zh) 检测白血病BCR/ABL m-bcr融合基因相对表达量的引物和方法
CN109880825A (zh) 一种环状RNA hsa_circ_0012152及其应用
CN105925703A (zh) 一种筛选肾癌外周血miRNA标志物的方法及肾癌诊断标志物miR-210
CN105648075A (zh) 一种肝癌诊断组合及含有该组合的试剂盒
CN105154533B (zh) 诊断早期肝癌的miRNA组合及其试剂盒
CN109321640A (zh) 检测样本中psf-tfe3融合基因的寡核苷酸、方法和试剂盒
CN109371126A (zh) 检测样本中tfe3融合基因的寡核苷酸、方法和试剂盒
CN108753981A (zh) Hoxb8基因的定量检测在结直肠癌预后判断中的应用
CN112391478B (zh) 外泌体mRNA在乳腺疾病诊断中的应用
US20230265523A1 (en) Molecular marker for early pancreatic neoplasm detection, detection method and use thereof
CN108424962A (zh) 系膜增生性肾小球肾炎的miRNA检测标志物及其诊断试剂盒
CN109136379A (zh) 检测样本中NonO-TFE3融合基因的寡核苷酸、方法和试剂盒
CN102021169A (zh) 一种血清/血浆miRNA组合物及其应用
Miura et al. A diagnostic evaluation of serum human telomerase reverse transcriptase mRNA as a novel tumor marker for gynecologic malignancies
CN107858425A (zh) miRNA‑4741作为原发性肝癌诊断标志物的应用及检测方法

Legal Events

Date Code Title Description
PB01 Publication
PB01 Publication
SE01 Entry into force of request for substantive examination
SE01 Entry into force of request for substantive examination
RJ01 Rejection of invention patent application after publication

Application publication date: 20190212

RJ01 Rejection of invention patent application after publication