CN102719540A - 利用荧光定量PCR技术检测PML-RARα融合基因相对表达量的检测试剂盒 - Google Patents

利用荧光定量PCR技术检测PML-RARα融合基因相对表达量的检测试剂盒 Download PDF

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周晓椟
王淑一
徐建成
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Abstract

本发明涉及一种利用荧光定量PCR技术检测PML-RARα融合基因相对表达量的检测试剂盒，它包括下列份数比的物质：红细胞裂解液、TRIzol、氯仿、无水乙醇、反转录PCR试剂、检测体系PCR反应液、阳性对照品和阴性对照品；本发明该试剂盒具有精度高，结果便于判读、扩增效率和速率均达到最佳等优点，省去了繁琐的条件摸索环节，大大提升了实验效率。该试剂盒经测试特异性好，灵敏度高，操作简便。有助于临床上急性早幼粒细胞白血病(APL)患者体内PML-RARα(L型/S型)融合基因的微量残留检测，对于及时干预治疗避免血液学复发、调整治疗方案、评价治疗效果、预测预后、预防临床复发都具有重要意义。

Description

利用荧光定量PCR技术检测PML-RARα融合基因相对表达量的检测试剂盒
所属技术领域
本发明涉及一种临床检验用途的基因相对表达量的检测试剂盒，采用Taqman探针实时荧光定量PCR技术，用于检测人类急性早幼粒细胞白血病(APL)患者体内的PML-RARα(L型/S型)融合基因表达水平，同时对高危人群进行较为准确的筛查。该试剂盒可有效的节约检测时间，提高检测精度。 
技术背景
急性早幼粒细胞白血病(Acute promyelocyticleukemia，APL)是急性髓系白血病的一种特殊类型，其特异性标志为染色体t(15；17)(q22；q21)易位，形成PML-RARα融合基因。约85％以上的APL患者存在特异性染色体易位t(15；17)(q22；q21)，形成PML-RARα融合基因。约95％的PML-RARα基因存在细胞内，是判断APL预后、复发的重要依据，大规模临床调研表明分子学复发的患者在早期给予干预治疗可获得较好的预后。 
PML-RARα融合基因具有异质性，在其形成过程中，RARα上的断裂点总是位于第2个内含子内，但是PML上的断裂点存在很多变异，主要集中在3个断裂点丛集区(bcr)：断裂点bcrl在PML第6个内含子内，形成长型转录本(L)；断裂点bcr2在PML第6个外显子内，产生可变型转录本(V)；断裂点bcr3在PML第3个内含子内，产生短型转录本(S)。其中以长型(L型)和短型(S型)异构体为主，可变型(V型)最少见。通过对PML-RARα融合基因亚型的长期临床观测，L型APL患者的预后优于S型，因此跟踪检测PML-RARα融合基因可早期发现分子复发，及时干预治疗，避免血液学复发，并根据PML-RARα融合基因结果调整治疗方案，这对评价治疗效果、预测预后、预防临床复发都具有重要意义。 
目前临床上已经将PML-RARα融合基因作为动态评估患者病情及预后的手段之一。常用的检测技术有荧光原位杂交技术(FISH)、RT-PCR、RQ-PCR等方法。FISH法尽管结果较为直观，但是试验过程繁琐，涉及试剂种类繁多，费时费力，且结果需经验丰富的专业人士来判读，结果判读存在较大的主观性。而单纯RT-PCR法则为终点定量，无法对起始模板量进行准确的估算。此外，由于砷剂及全反式维甲酸的应用，APL治疗效果得到很大的提高，微小残留病是其复发的主要原因，因而急需一种高敏感性、高特异性、高自动化程度、污染控制好的方法来对PML-RARα融合基因mRNA残留进行检测。 
RQ-PCR采用Taqman探针荧光定量技术，综合生物学、酶学和荧光化学于一体，从扩增到结果分析均在PCR反应管封闭状态下进行，解决了PCR产物污染而导致假阳性的问题，同 时也提高了敏感度，其结果用拷贝数表示，实现了对PCR产物的准确定量，易于统一标准，与定性PCR技术相比，具有特异度好，灵敏度高，线性关系好，操作简单，自动化程度高、防污染，有较大的线性范围等优点。能够满足PML-RARα融合基因mRNA微量残留的检测，被认为是目前首选检测方法，用于评价治疗效果、预测预后。实时荧光定量PCR中常见的方法有SYBR GreenI染料法，双探针杂交法以及Taqman技术等。其中SYBR GreenI由于是非饱和染料，特异性不如双探针杂交法以及Taqman法，必须通过观察溶解曲线来判断其特异性；而双探针法杂交法成本又较为昂贵。 
发明内容
本发明的目的在于提供一种扩增效率和速率均最佳的利用荧光定量PCR技术检测PML-RARα融合基因相对表达量的检测试剂盒。 
本发明的技术方案如下：其特征在于：它包括下列份数比的物质：红细胞裂解液（50人份，50ml）、TRIzol（Invitrogen公司）（50人份，50ml）、氯仿（50人份，30ml）、无水乙醇（50人份，40ml）、反转录PCR试剂（50人份，0.8ml）、检测体系PCR反应液（50人份，1.15ml）、阳性对照品和阴性对照品； 
其中反转录PCR试剂包括：5×RT buffer（120μl)、RT Enzyme（25μl）、Random Primer（30μl）。 
检测体系PCR反应液包括:Taq聚合酶(1μl)，dNTPs(4μl)，Tris-HCl buffer(12.5μl)，镁离子(2μl)，检测目的基因用上游引物为：L-F（0.8μl）或S-F（0.8μl），下游引物为L/S-R（0.8μl）（L-R与S-R相同，故L/S-R既可以表示为L-R也可以表示为S-R），目的基因探针为L\S-Probe（0.4μl），检测内参基因Abl用引物为abl-F（0.8μl），abl-R（0.8μl），内参基因探针为abl-Probe（0.4μl）。其中，检测目的基因用上下游引物和目的基因探针的比例优选为：S-F：L/S-R：L\S-Probe的摩尔比为2；2；1。 
检测内参基因Abl用上下游引物和内参基因探针的比例优选为：abl-F：abl-R：abl-Probe的摩尔比为2：2：1。 
L-F:AGGTCTTCCTGCCCAACAG 
S-F:TGCGCCTGCAGGACCTCAG 
L/S-R:AAGGCTTGTAGATGCGGGGTA 
L/S-Probe:FAM-CAGAGCAGCAGTTCTGAAGA-TAMRA 
abl-F:GCCGTGAAGACCTTGAAGGAG 
abl-R:ATGATATAGAACGGGGGCTC 
abl-Probe:FAM-ACCTGGTGCAGCTCCTTGGG-TAMRA 
进一步地，所述阳性对照品分别为含有PML-RARα(L型或者S型，或者同时包含有L型和S型；上述几种类型合并简写成：L型/S型)融合基因的溶液；所述阴性对照品为无PML-RARα(L型/S型)融合基因的溶液。 
本发明的有益效果：本发明将实时荧光PCR技术结合采用Tapman探针，利用双标准曲线的方法，分别构建内参基因abl和目的基因PML-RARα(L型/S型)融合基因的定量标准曲线，检测受测者体内的PML-RARα(L型/S型)融合基因相对于内参基因的表达水平。相比于以往的免疫组化方法和现今流行的△△CT法，该试剂盒具有精度高，结果便于判读、扩增效率和速率均达到最佳等优点。加之该试剂盒将反应体系所需的引物、探针进行合理配比和优化，使实验条件达到最佳，从而省去了繁琐的条件摸索环节，大大提升了实验效率。该试剂盒经测试特异性好，灵敏度高，操作简便。有助于临床上急性早幼粒细胞白血病(APL)患者体内PML-RARα(L型/S型)融合基因的微量残留检测，对于及时干预治疗避免血液学复发、调整治疗方案、评价治疗效果、预测预后、预防临床复发都具有重要意义。本试剂盒用于辅助临床上人类急性早幼粒细胞白血病(APL)早期预防、早期诊断的辅助性指标；还可对高危人群进行较为准确的筛查。 
附图说明：
图1是应用本发明试剂盒检测PML-RARαL型为阳性的结果图。 
图2是应用本发明试剂盒检测PML-RARαL型为阴性的结果图。 
图3是应用本发明试剂盒检测PML-RARαS型为阳性的结果图。 
图4是应用本发明试剂盒检测PML-RARαS型为阴性的结果图。 
具体实施方式
实施例1 
本发明试剂盒包括：它包括下列份数比的物质：红细胞裂解液（50人份，50ml，10×）、TRIzol（50人份，50ml）、氯仿（50人份，30ml）、无水乙醇（50人份，40ml）、反转录PCR试剂（50人份，0.8ml）、检测体系PCR反应液（50人份，1.15ml）、阳性对照品和阴性对照品； 
其中10×红细胞裂解液（NH4CL 82mg/ml、NAHCO3 8.4mg/ml、EDTA-NA2 3.72mg/ml、DEPC-ddH2O定容至配制体积）。 
反转录PCR试剂包括:5×RT buffer（120μl)、RT Enzyme（25μl）、Random Primer（30μl）。 
检测体系PCR反应液包括:Taq聚合酶(1μl)，dNTPs(4μl)，Tris-HCl buffer(12.5μl)，镁 离子(2μl)，检测目的基因用上游引物为：L-F（0.8μl）或S-F（0.8μl），下游引物为L/S-R（0.8μl）（L-R与S-R相同，故L/S-R既可以表示为L-R也可以表示为S-R），目的基因探针为L\S-Probe（0.4μl），检测内参基因Abl用引物为abl-F（0.8μl），abl-R（0.8μl），内参基因探针为abl-Probe（0.4μl）。其中，检测目的基因用上下游引物和目的基因探针的比例优选为：S-F：L/S-R：L\S-Probe的摩尔比为2；2；1。 
检测内参基因Abl用上下游引物和内参基因探针的比例优选为：abl-F：abl-R：abl-Probe的摩尔比为2：2：1。 
其中：L-F:AGGTCTTCCTGCCCAACAG； 
S-F:TGCGCCTGCAGGACCTCAG； 
L/S-R:AAGGCTTGTAGATGCGGGGTA； 
L/S-Probe:FAM-CAGAGCAGCAGTTCTGAAGA-TAMRA； 
abl-F:GCCGTGAAGACCTTGAAGGAG； 
abl-R:ATGATATAGAACGGGGGCTC； 
abl-Probe:FAM-ACCTGGTGCAGCTCCTTGGG-TAMRA 
所述阳性对照品分别为含有PML-RARα(L型/S型)融合基因组溶液；所述阴性对照品为不含PML-RARα(L型/S型)融合基因组溶液。 
实施例2 
本方法的操作流程： 
（1）抽提血液中的组织RNA:在洁净的1.5ml的离心管中加入1ml红细胞裂解液，取抗凝血0.5ml混匀。室温静置10min；5000rpm离心5min，弃上清，收集底部的细胞；再次加入0.5ml红细胞裂解液，5000rpm离心5min，弃上清，收集底部的细胞；向细胞中加入1ml TRIzol，反复吹打直至沉淀完全溶解，室温静止5min；加入0.2ml氯仿，震荡均匀；14000rpm 4℃离心10min，吸取上清层转移至另一新的离心管中；加入等体积的异丙醇，上下充分混匀，室温静置10min；14000rpm 4℃离心10min，弃上清，加入75%乙醇1ml，轻轻上下颠倒洗涤管壁；14000rpm 4℃离心5min，弃乙醇；室温干燥10-15min，加入20μlRNase-free水溶解沉淀。 
（2）采用反转录PCR试剂将RNA反转为cDNA。 
（3）试剂配置：按检测人份数配置检测体系PCR反应液各Xμl，每人份23μl分装： 
X=23μl反应液×（8份内参（标准曲线）+8份目的基因（标准曲线）+n份标本+1份阳性对照+1份阴性对照+1份空白对照）；n≥0 
（4）加样：向检测体系PCR反应液中加入2μl的cDNA；阳性对照和阴性对照直接加2μ l阳性对照品和阴性对照品；空白对照加2μl生理盐水或不加任何物质。 
（5）检测：检测在实时荧光PCR仪上进行，可用仪器包括ABI7300，7500（美国Applied Biosystems公司）等。反应条件：95℃预变性1min；95℃ 15s，58℃ 35sec 40个循环，荧光信号于58℃ 35sec时采集。 
（6）结果判断：将阈值线调整至背景信号及阴性扩增线以上，系统根据标准曲线和CT值自动计算出拷贝数。 
1）内参阳性时，检测结果才认为有效； 
2）阳性判断标准：，Ct<35，为阳性；35≤Ct≤38，为疑似阳性，需要再次验证；Ct＞38，为阴性。 
实施例3 
采用本发明检测试剂盒检测临床标本 
取送检的急性早幼粒细胞白血病(APL)患者抗凝血标本共80例，按实施例2所述方法提取基因组RNA、配制试剂并检测。 
取2μl的每份标本加入检测体系PCR反应液中。同时做阳性，阴性，空白对照，内参基因/目的基因的标准曲线各一份。一台96孔的荧光PCR仪可同时检测38份样品，每个样本重复检测2次，一份阳性对照，一份阴性对照和一份空白对照。检测时间仅为100分钟。 
实验结果与特检实验室的报告结果相比较，确定样品检测的准确率。部分阳性结果如下表： 
Figure DEST_PATH_GDA00001886299900061
表1为本次实验结果和PCR实验室结果的对比，从上表可以看出，60例样本中59例与特检实验室的检测结果相符，仅1例不符，尤其是微量残留检测结果，与特检实验室的结果完全吻合，整体符合率达到98.33%。说明本发明检测试剂盒与特检利用常规荧光定量方法相比，不但检测结果准确性高，而且缩短了检测时间，提高了检测效率。 
实施例4 临床样品检测 
取待检的临床样品4份，按实施例2所述方法提取基因组、配制试剂并检测。 
取2μl的每份样品加入检测体系PCR反应液中。同时做阳性，阴性，空白对照各一份。用荧光PCR仪检测，时间为100分钟。 
样品1的检测结果图如图1所示，内参基因abl的扩增信号显示被检样本基因组提取成功，检测结果有效，样品1的PML-RARαL型CT值<35之前有扩增信号，所以样品1为PML-RARα融合基因L型阳性。 
样品2的检测结果图如图2所示，内参基因abl的扩增信号显示被检样本基因组提取成功，检测结果有效，样品2的PML-RARαL值>38之后无扩增信号，所以样品2为PML-RARα融合基因L阴性。 
样品3的检测结果图如图3所示，内参基因abl的扩增信号显示被检样本基因组提取成功，检测结果有效，样品1的PML-RARαS型CT值<36之前有扩增信号，所以样品3为PML-RARα融合基因S型阳性。 
样品4的检测结果图如图4所示，内参基因abl的扩增信号显示被检样本基因组提取成功，检测结果有效，样品4的PML-RARαS值>38之后无扩增信号，所以样品4为PML-RARα融合基因S阴性。 
Figure IDA00001886300100011
Figure IDA00001886300100021
Figure IDA00001886300100031

Claims (6)

1.一种利用荧光定量PCR技术检测PML-RARα融合基因相对表达量的检测试剂盒，其特征在于：它包括下列份数比的物质：10×红细胞裂解液50人份，50ml，、TRIzol50人份，50ml、氯仿50人份，30ml、无水乙醇50人份，40ml、反转录PCR试剂50人份，0.8ml、检测体系PCR反应液50人份，1.15ml、阳性对照品和阴性对照品。
2.根据权利要求要求1所述的利用荧光定量PCR技术检测PML-RARα融合基因相对表达量的检测试剂盒，其特征在于：所述的10×红细胞裂解液为：NH4CL 82mg/ml、NAHCO38.4mg/ml、EDTA-NA2 3.72mg/ml、DEPC-ddH2O定容至配制体积。
3.根据权利要求要求1所述的利用荧光定量PCR技术检测PML-RARα融合基因相对表达量的检测试剂盒，其特征在于：所述的反转录PCR试剂包括：5×RT buffer 120μl、RT Enzyme 25μl、Random Primer 30μl。
4.根据权利要求要求1所述的利用荧光定量PCR技术检测PML-RARα融合基因相对表达量的检测试剂盒，其特征在于：所述的检测体系PCR反应液包括：Taq聚合酶1μl，dNTPs4μl，Tris-HCl buffer 12.5μl，镁离子2μl，检测目的基因用上游引物为：L-F0.8μl或S-F0.8μl，下游引物为L/S-R0.8μl，目的基因探针为L\S-Probe 0.4μl，检测内参基因Abl用引物为abl-F0.8μl，abl-R 0.8μl，内参基因探针为abl-Probe 0.4μl；
其中，检测目的基因用上下游引物和目的基因探针的比例优选为：S-F：L/S-R：L\S-Probe的摩尔比为2；2；1；
检测内参基因abl用上下游引物和内参基因探针的比例优选为：abl-F：abl-R：abl-Probe的摩尔比为2：2：1；
所使用的扩增PML-RARαL型/S型融合基因的引物和探针分别为：
L-F:AGGTCTTCCTGCCCAACAG
S-F:TGCGCCTGCAGGACCTCAG
L/S-R:AAGGCTTGTAGATGCGGGGTA
L/S-Probe:FAM-CAGAGCAGCAGTTCTGAAGA-TAMRA
所使用的扩增abl内参基因的引物和探针，分别为：
abl-F:GCCGTGAAGACCTTGAAGGAG
abl-R:ATGATATAGAACGGGGGCTC
abl-Probe:FAM-ACCTGGTGCAGCTCCTTGGG-TAMRA。
5.根据权利要求要求1所述的利用荧光定量PCR技术检测PML-RARα融合基因相对表达量的检测试剂盒，其特征在于：所述阳性对照品分别为含有PML-RARαL型/S型融合基因的溶液；所述阴性对照品为无PML-RARα(L型/S型)融合基因的溶液。
6.根据专利要求1-5所述的利用荧光定量PCR技术检测PML-RARα融合基因相对表达量的检测试剂盒，其特征还在于：它作为检测急性早幼粒细胞白血病患者体内PML-RARαL型或S型融合基因微量残留。
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