CN102586487A

CN102586487A - 鸭i型肝炎病毒和番鸭细小病毒的二重荧光定量rt-pcr检测试剂盒

Info

Publication number: CN102586487A
Application number: CN2012100691994A
Authority: CN
Inventors: 谢芝勋; 谢丽基; 邓显文; 谢志勤; 庞耀珊; 范晴; 刘加波
Original assignee: Guangxi Veterinary Research Institute
Current assignee: Guangxi Veterinary Research Institute
Priority date: 2012-03-15
Filing date: 2012-03-15
Publication date: 2012-07-18
Anticipated expiration: 2032-03-15
Also published as: CN102586487B

Abstract

本发明公开了一种鸭I型肝炎病毒和番鸭细小病毒的二重荧光定量RT-PCR检测试剂盒。本发明提供了检测鸭I型肝炎病毒和番鸭细小病毒的二重荧光PCR的引物组，由引物1、引物2、引物3和引物4组成；所述引物1、所述引物2、所述引物3和所述引物4的核苷酸序列分别依次为序列表中的序列1、序列2、序列4和序列5。本发明的实验证明，本发明的引物和方法具有检测时间短、灵敏度高和特异性强的特点。

Description

鸭I型肝炎病毒和番鸭细小病毒的二重荧光定量RT-PCR检测试剂盒

技术领域

本发明涉及生物技术领域，尤其涉及一种鸭I型肝炎病毒和番鸭细小病毒的二重荧光定量RT-PCR检测试剂盒。

背景技术

鸭I型肝炎病毒(Duck Hepatitis Virus type I，DHV I)是雏鸭的一种高度致死性的病毒性传染病的病原。该病主要侵害4周龄以内的雏鸭，死亡率高达90％以上，是危害养鸭业最为严重的传染病之一。番鸭细小病毒(Muscovy duckling parvovirus，MDPV)，是危害番鸭养殖的重要病原，可引起1周龄-3周龄雏番鸭发病，致死率可达到50％-80％。这两种病毒是雏鸭最易感并且致死率也非常高的病毒。鸭I型肝炎病毒和番鸭细小病毒是危害雏鸭的最重要病原，并且感染发病后致死率非常高，因此迫切需要建立一种快速敏感的鸭I型肝炎病毒和番鸭细小病毒检测方法，在感染早期就能检测出这些病毒，从而为这些病的控制争取宝贵的时间。

目前，这两种病毒的传统检测方法有血清中和试验、琼脂扩散试验和ELISA等，但这些检测存在耗时长、敏感性较低、不易标准化等缺点，在实际应用中具有一定的局限性。

荧光定量PCR技术实现了对模板的定量，而且具有敏感、特异、准确可靠、能实现多重反应和实时性好等特点。在实际应用中，当样品量非常大时，单重荧光PCR在成本和时间方面就存在一定的劣势，迫切需要一种高通量、低成本、高效率的方法来进行批量的快速检测。多重荧光PCR采用多对引物扩增检测多个模板，克服了单重荧光PCR的不足。但是建立一个多重荧光PCR方法比单重的要复杂得多，其对试剂和引物的要求更高，同时需要保证不同探针所标记的荧光基团间无相互干扰，使用的荧光定量PCR仪具有相应的多个检测通道。

目前，还未见有应用多重荧光定量PCR技术对鸭I型肝炎病毒和番鸭细小病毒进行检测和诊断的报道。

发明内容

本发明的一个目的是提供一种检测鸭I型肝炎病毒和番鸭细小病毒的二重荧光PCR的引物组。

本发明提供的引物组，由引物1、引物2、引物3和引物4组成；

所述引物1、所述引物2、所述引物3和所述引物4的核苷酸序列分别依次为序列表中的序列1、序列2、序列4和序列5。

本发明的另一个目的是提供检测鸭I型肝炎病毒和番鸭细小病毒的二重荧光PCR的试剂。

本发明提供的试剂由上述的引物组、探针A和探针B组成；

所述探针A的核苷酸序列为序列表中的序列3，且所述探针A的5’端标记有报告荧光染料A，3’端标记有淬灭荧光染料C；

所述探针B的核苷酸序列为序列表中的序列6，且所述探针B的5’端标记有报告荧光染料B，3’端标记有淬灭荧光染料D。

上述试剂中，所述报告荧光染料A为FAM，所述报告荧光染料B为ROX；所述淬灭荧光染料C为BHQ1，所述淬灭荧光染料D为BHQ2；

所述试剂中所述引物1、所述引物2、所述探针A、所述引物3、所述引物4和所述探针B的摩尔比为3∶3∶3∶1∶1∶1。

本发明的第三个目的是提供一种检测鸭I型肝炎病毒和番鸭细小病毒的二重荧光PCR试剂B。

本发明提供的试剂B，由上述的试剂A、PCR扩增缓冲液和水组成。

本发明提供的试剂B，所述引物1、所述引物2和所述探针A在所述试剂B中的浓度均为0.6μM；

所述引物3、所述引物4和所述探针B在所述试剂B中的浓度均为0.2μM。

本发明的第四个目的是提供一种检测鸭I型肝炎病毒和番鸭细小病毒的二重荧光PCR的试剂盒。

本发明提供的试剂盒，包括上述的引物组或上述的试剂A或上述的试剂B。

上述的引物组或上述的试剂A或上述的试剂B或上述试剂盒在制备检测和/或辅助检测待测样品中是否含有鸭I型肝炎病毒和/或番鸭细小病毒产品中的应用也是本发明保护的范围。

上述检测和/或辅助检测待测样品中是否含有鸭I型肝炎病毒和/或番鸭细小病毒为用上述的试剂A或上述的试剂B或上述试剂盒对所述待测样品进行二重荧光PCR反应。

本发明的实验证明，本发明的引物和方法具有如下优点：

1)检测时间短

本研究通过Primer Express 3.0软件，设计了多套探针和引物，通过分析其引物之间的二聚体，筛选出了2套探针和引物。对筛选出的2套探针和引物进行不同浓度的配比，选出了其最佳引物和探针的浓度组合，建立了鸭I型肝炎病毒和番鸭细小病毒的二重荧光定量RT-PCR方法。该方法实现了一管二检的目的，并且反转录和PCR是一步完成，仅需要约30分钟的时间，并且反应结果可以直接通过电脑观察，而常规的RT-PCR方法起码需要3.5小时来完成扩增反应，然后需要花2小时进行凝胶电泳来观察结果；

2)检测敏感性高且特异性强

当鸭I型肝炎病毒和番鸭细小病毒同时存在时，所建立的方法对其检测的CT值与单个病毒检测的CT值比较，结果基本一样，并未影响对鸭I型肝炎病毒和番鸭细小病毒的检出及检出的敏感性。另外，建立的方法可以对样品中相应的病原含量进行定量，并且检测的敏感性非常高，均能检测到200个拷贝的鸭I型肝炎病毒和番鸭细小病毒，比常规PCR方法敏感性高10倍，可用于鸭I型肝炎病毒和番鸭细小病毒疫苗和药物疗效的评估，以及其致病机理等方面的研究，因此该方法的建立对鸭I型肝炎病毒和番鸭细小病毒的防治有重要意义。

附图说明

图1为检测鸭肝炎病毒的敏感性及标准曲线

图2为检测鸭肝炎病毒的敏感性及标准曲线

图3为检测鸭I型肝炎病毒的特异性

图4为检测番鸭细小病毒的特异性

图5为批内重复性

具体实施方式

下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。

下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。

下述实施例中所用一些材料和试剂如下：

Lightcycler2.0荧光定量PCR仪(Roche)。DNA片断回收试剂盒和质粒小量提取试剂盒购自BioDev公司；pGEM-T Easy试剂盒购自Promega公司；T7体外转录试剂盒购自Fermengtas公司；One Step PrimeScript RT-PCR Kit购自大连宝生物公司；TIANamp病毒基因组DNA/RNA提取试剂盒购自天根生化科技有限公司。

鸭I型肝炎病毒AV2111株(以下简称为DHV I)购自中国兽医药品监察所；

番鸭细小病毒(MDPV)记载在“广西番鸭细小病毒的分离和鉴定”，广西畜牧兽医，2002，18(6)：5-7，公众可从广西壮族自治区兽医研究所获得；

鸭圆环病毒记载在“广西部分地区鸭圆环病毒感染情况调查”，中国畜牧兽医，2010，37(11)：156-158，公众可从广西壮族自治区兽医研究所获得；

小鹅瘟病毒记载在“小鹅瘟病毒荧光定量PCR检测方法的建立”，上海畜牧兽医通讯，2008，160(06)：30-31，公众可从广西壮族自治区兽医研究所获得；

新城疫病毒记载在“新城疫植物油乳剂苗的研究”，中国预防兽医学报，2000，(04)：23-27，公众可从广西壮族自治区兽医研究所获得；

鸭瘟病毒AV1221株购自中国兽医药品监察所；

H9亚型禽流感病毒记载在“多重反转录聚合酶链反应快速检测鉴别H9亚型禽流感病毒方法的建立”，中国人兽共患病学报，2006，(09)：858-860，公众可从广西壮族自治区兽医研究所获得；

实施例1、引物与Taqman探针的设计与合成

根据GenBank中鸭I型肝炎病毒和番鸭细小病毒的保守序列，采用Primer Express3.0软件，设计两对特异性引物和两条Taqmam探针(表1)。

表1为引物和TaqMan探针序列(5’-3’)

实施例2、荧光定量RT-PCR检测

一、荧光定量RT-PCR检测方法的确定

1、样本的制备

1)、核酸的提取

参照TIANamp病毒基因组DNA/RNA提取试剂盒说明书，提取鸭I型肝炎病毒AV2111(DHV I)、新城疫病毒和H9亚型禽流感的RNA，提取番鸭细小病毒、鸭圆环病毒、小鹅瘟病毒和鸭瘟病毒AV1221株的DNA。

2)、RNA的反转录

鸭I型肝炎病毒AV2111RNA反转录合成cDNA，具体如下：建立如下反转录体系，总反应体积为20μL，上述1)的鸭I型肝炎病毒AV2111RNA为2μL(约20μg)，4μL 8mM MgCl₂(大连宝生物工程有限公司，产品目录号：DRR0019A)，2μL 10×PCR缓冲液(大连宝生物工程有限公司，产品目录号：DRR0019A)，2μL 10mM dNTP(四种碱基)，1μL RNA抑制剂(大连宝生物工程有限公司，产品目录号：DRR0019A)，1μL随机引物(大连宝生物工程有限公司，产品目录号：DRR0019A)，1μL AMV反转录酶(大连宝生物工程有限公司，产品目录号：DRR0019A)，用无Rnase水加至总体积为20μL，离心均匀，于25℃10min，42℃60min，95℃5min，4℃结束，得到鸭I型肝炎病毒AV2111cDNA。

2、标准品的制备

分别以上述得到的鸭I型肝炎病毒AV2111的cDNA和番鸭细小病毒的DNA为模板进行PCR扩增，反应体系为50μL(含0.2mmol/L dNTP、2.5mmol/L MgCl₂、0.5μmol/L引物(分别为表2)、1.25U Taq聚合酶、1×PCR buffer、5μLDNA模板)，反应条件为：95℃预变性5min，94℃60s，50℃60s，70℃60s，35个循环，72℃延伸10min。

PCR产物经2％琼脂糖凝胶电泳，回收目的片断后克隆至pGEM-T Easy载体，阳性克隆菌(pGEM-DHV和pGEM-MDPV)送大连宝生生物技术有限公司进行测序，pGEM-DHV菌中含有的PCR产物大小为234bp，具有序列表中序列11的第1-234位核苷酸(为DHVHDHV1-GD株的3’端的UTR序列，genbank号为FJ157179.1，第7379-7612位核苷酸)，说明为阳性克隆，含有DHV病毒；

pGEM-MDPV菌中含有的PCR产物大小为571bp，具有序列表中序列12的第1-571位核苷酸(为MDPV FM株的rep基因，genbank号为NC_006147.2，第1157-1727位核苷酸)，说明为为阳性克隆，含有MDPV病毒；

表2试验所使用引物序列

分别提取pGEM-DHV菌和pGEM-MDPV菌中的质粒，得到pGEM-DHV质粒和pGEM-MDPV质粒。

将pGEM-MDPV质粒作为阳性标准品，按照文献(Vaitomaa，J.，Rantala A.，Halinen K.，Rouhiainen L.，Tallberg P.，Mokelke L.& Sivonen K.(2003)Quantitative Real-Time PCR for Determination of Microcystin Synthetase E CopyNumbers for Microcystis and Anabaena in Lakes.Applied and EnvironmentalMicrobiology.69：7289-7297.)计算拷贝数，结果为拷贝数为3.9×10¹⁰拷贝/μl。

将pGEM-DHV质粒，37℃Sa1I单酶切过夜，使质粒线性化，琼脂糖凝胶电泳及试剂盒回收纯化质粒DNA线性化产物，用于体外转录，按T7体外转录试剂盒说明加入反应试剂37℃作用2h，然后加DNase I酶1uL，37℃消化转录产物中未转录的DNA20min，70℃灭活DNase I酶15min，用等体积盐酸饱和苯酚、氯仿抽提，再用等体积氯仿抽提，取上清用0.5倍体积5M醋酸氨和2倍体积冰乙醇沉淀，再用75％冰乙醇洗沉淀，最后用DEPC水溶解，得到DHV-RNA，紫外分光光度计测DHV-RNA浓度和纯度，-70℃保存备用，结果为DHV-RNA浓度为1.3×10¹³拷贝/μl。

3、荧光定量RT-PCR的反应体系中引物和探针浓度的确立

用DHV-RNA和质粒pGEM-MDPV(二者的拷贝比为1∶1)作为模板，将表1中的引物和探针在终浓度为0.2-0.8umol/L之间，进行不同浓度的配比进行荧光定量RT-PCR，选择引物和探针的最佳浓度。

扩增反应总体积为20uL，其中2×One Step RT-PCR BufferIII(大连宝生物工程有限公司，产品目录号：DRR064A)10uL；Takara Ex Taq HS(大连宝生物工程有限公司，产品目录号：DRR064A)0.4uL；PrimeScript RT Enzyme MixII(大连宝生物工程有限公司，产品目录号：DRR064A)0.4uL；2uL模板，终浓度均为0.2-0.8umol/L的MDPV1590、MDPV1642和MDPV1613T；终浓度均为0.2-0.8umol/L的DHV82、DHV134和DHV108T；余下用灭菌DEPC水补足，均匀混合，置Lightcycler荧光定量PCR仪上进行自动化扩增反应。温度转换率为20℃/s，在每个循环的延伸结束时进行荧光信号检测。反应程序为：42℃5min；95℃10s；然后按95℃变性10s、60℃退火延伸20s进行50个循环；最后于40℃结束反应。

结果显示，不同的引物和探针终浓度对试验结果影响比较大，鸭I型肝炎病毒上、下游引物及探针终浓度分别为0.2umol/L，番鸭细小病毒虫上、下游引物及探针终浓度分别为0.6umol/L，对标准品的检测可获得较小的Ct值。

因此，优化的荧光定量RT-PCR的反应体系如下：扩增反应总体积为20uL，其中2×One Step RT-PCR BufferIII(大连宝生物工程有限公司，产品目录号：DRR064A)10uL；Takara Ex Taq HS(大连宝生物工程有限公司，产品目录号：DRR064A)0.4uL；PrimeScript RT Enzyme MixII(大连宝生物工程有限公司，产品目录号：DRR064A)0.4uL；2uL模板，终浓度均为0.6μM的MDPV1590、MDPV1642和MDPV1613T；终浓度均为0.2μM的DHV82、DHV134和DHV108T；余下用灭菌DEPC水补足，均匀混合，置Lightcycler荧光定量PCR仪上进行自动化扩增反应。温度转换率为20℃/s，在每个循环的延伸结束时进行荧光信号检测。反应程序为：42℃5min；95℃10s；然后按95℃变性10s、60℃退火延伸20s进行50个循环；最后于40℃结束反应。

FAM在530nm激发光下发荧光，用来检测番鸭细小病毒；

ROX在610nm激发光下发荧光，用来检测鸭I型肝炎病毒；

二、荧光定量RT-PCR的敏感性试验

分别以10倍系列稀释的DHV-RNA(鸭I型肝炎病毒)和pGEM-MDPV质粒(番鸭细小病毒)，得到拷贝数均为1×10⁷-1×10²拷贝/uL的DHV-RNA和pGEM-MDPV质粒，再将各种拷贝数的DHV-RNA和pGEM-MDPV质粒混合作为模板进行二重荧光定量PCR扩增，扩增体系和条件如一的3。

在610nm激发光下的结果(ROX)如图1为，检测鸭I型肝炎病毒的敏感性(左图)及标准曲线(右图)，1-6分别为1×10⁷-1×10²拷贝/μl，7空白对照(为DEPC水)；在530nm激发光下的结果(FAM)如图2，检测番鸭细小病毒的敏感性(左图)及标准曲线(右图)，1-6分别为1×10⁷-1×10²拷贝/μl，7空白对照(为DEPC水)；

从图中的荧光曲线可见，对鸭I型肝炎病毒和番鸭细小病毒的检测200拷贝仍有荧光曲线，表明该检测方法对鸭I型肝炎病毒和番鸭细小病毒的灵敏度均为200拷贝，比常规PCR方法敏感性高10倍，重复检测的结果一致。从标准曲线可见扩增成线性，说明所建立的方法具有很好的扩增效率。

三、荧光定量RT-PCR的特异性试验及干扰性试验

1、荧光定量RT-PCR的特异性试验

按照上述一的3进行荧光定量RT-PCR，不同的是模板分别为鸭I型肝炎病毒AV2111RNA、鸭I型肝炎病毒AV2111RNA+番鸭细小病毒DNA、番鸭细小病毒DNA、鸭圆环病毒DNA、小鹅瘟病毒DNA、新城疫病毒RNA、鸭瘟病毒DNA、H9亚型禽流感RNA，以模板为dH₂O作为阴性对照。

在610nm激发光下的结果(ROX)如图3所示，检测鸭I型肝炎病毒的特异性，其中，1.鸭I型肝炎病毒，2.鸭I型肝炎病毒+番鸭细小病毒；3.番鸭细小病毒，4.鸭圆环病毒，5.小鹅瘟病毒，6.新诚疫病毒，7.鸭瘟病毒，8.H9亚型禽流感，9.dH₂O；可以看出，1和2有PCR产物，得到相应病毒的特异性荧光曲线，而3-9均没有特异性荧光曲线，证实所设计的引物探针具有特异性，该方法特异性强，与其它检测对象无交叉反应。

在530nm激发光下的结果(FAM)如图4所示，检测番鸭细小病毒的特异性，其中，1.鸭I型肝炎病毒，2.鸭I型肝炎病毒+番鸭细小病毒，3.番鸭细小病毒，4.鸭圆环病毒，5.小鹅瘟病毒，6.新城疫病毒，7.鸭瘟病毒，8.H9亚型禽流感，9.dH₂O；可以看出，2和3有PCR产物，得到相应病毒的特异性荧光曲线，而1、4-9均没有特异性荧光曲线，证实所设计的引物探针具有特异性，该方法特异性强，与其它检测对象无交叉反应。

应用建立的二重荧光定量PCR，进行检测以确定两种模板存在时是否对检测的Ct值产生影响，图3中鸭I型肝炎病毒AV2111RNA、鸭I型肝炎病毒AV2111RNA+番鸭细小病毒DNA混合样本(2)检测的CT值分别为14.92和15.10；图4中，番鸭细小病毒DNA(3)、鸭I型肝炎病毒AV2111RNA+番鸭细小病毒DNA混合样本(2)检测的CT值分别为18.66和18.58。结果说明，样品中存在两种病毒与存在单种病毒，检测的CT值变异非常小，并未影响对鸭I型肝炎病毒和番鸭细小病毒的检出及检出的敏感性。

因此，上述引物针、探针和方法可应用于鉴定未知样本是否感染鸭I型肝炎病毒和鸭I型肝炎病毒：

说明，二重荧光PCR反应结果的判断如下：

反应结果为一条直线，则为阴性；反应结果为S型曲线，则为阳性；

若在610nm激发光下(ROX)的反应结果为S型曲线，则待测样本中含有鸭I型肝炎病毒；反之，则样品中不含有鸭I型肝炎病毒；

若在530nm激发光下(FAM)的反应结果为S型曲线，则待测样本中含有番鸭细小病毒；反之，则样品中不含有番鸭细小病毒；

若在610nm激发光下(ROX)和530nm激发光下(FAM)的反应结果均为S型曲线，则样品中含有鸭I型肝炎病毒和番鸭细小病毒；

若在610nm激发光下(ROX)和530nm激发光下(FAM)的反应结果均不为S型曲线，则样品中均不含有鸭I型肝炎病毒和番鸭细小病毒。

四、重复性试验

按照上述一的3进行荧光定量RT-PCR，不同的是模板为拷贝数均为1×10⁶拷贝/uL的鸭I型肝炎病毒AV2111RNA和番鸭细小病毒DNA混合的阳性样品。

分为3个标本同时检测。通过计算Ct值的标准差(S)和变异系数(CV)来验证荧光定量RT-PCR的批内重复性。三天后重复检测保存于-20℃的模板，来验证模板的稳定性及荧光定量RT-PCR的批间重复性。

检测结果见图5和表3所示，左图为在610nm激发光(ROX)下检测鸭I型肝炎病毒AV2111RNA通道，右图为在530nm激发光(FAM)下检测番鸭细小病毒通道，1-3分别为第一天、第四天和第七天；4.空白对照；可以看出，变异系数均小于3％(表3)。结果说明此方法具有良好的准确性和重复性。

表3批间重复性

实施例3、临床病料的检测

待测样本为广西地区鸭群收集的118份病料(编号为1-118)，分别提取鸭病料(病鸭的肝、病鸭的脾脏或病鸭的肺脏)的RNA和DNA。

分别将编号为1-118各个样本的DNA和RNA混合(体积比为1∶1)作为模板，按照实施例2的一的3进行荧光定量RT-PCR。

结果如下：

检出鸭I型肝炎病毒2份(阳性率为1.69％，编号为14和15)，检出番鸭细小病毒13份(阳性率为11.02％，编号为1-13)，其他样本均未检出鸭I型肝炎病毒和番鸭细小病毒。

将118份病料(编号为1-118)分别按照参照文献[1]赵金花；沈志强；朱辉；李峰；甄洪花；苗立中；单虎；新型鸭肝炎病毒的分离鉴定及VP1基因序列分析[J].中国预防兽医学报，2011，v.33(10)：772-775+780.和参照文献[2]刘家森；姜骞；司昌德；甘一迪；韩凌霞；曲连东；番鸭细小病毒与鹅细小病毒PCR鉴别诊断方法的建立[J].中国兽医科学，2007，37(06)：469-472.中的方法进行鸭肝炎病毒和番鸭细小病毒检测，结果与本发明的方法一致，说明本发明的方法正确。

上述结果说明广西地区的鸭群存在鸭I型肝炎病毒的感染，并且番鸭细小病毒的感染普遍存在，该二重荧光定量RT-PCR方法的建立，对广西地区鸭群的疫病控制有指导意义。

Claims

1.检测鸭I型肝炎病毒和番鸭细小病毒的二重荧光PCR的引物组，由引物1、引物2、引物3和引物4组成；

2.检测鸭I型肝炎病毒和番鸭细小病毒的二重荧光PCR的试剂A，由权利要求1所述的引物组、探针A和探针B组成；

3.根据权利要求2所述的试剂A，其特征在于：

所述报告荧光染料A为FAM，

所述报告荧光染料B为ROX；

所述淬灭荧光染料C为BHQ1；

所述淬灭荧光染料D为BHQ2；

4.检测鸭I型肝炎病毒和番鸭细小病毒的二重荧光PCR试剂B，由权利要2或3所示的试剂A、PCR扩增缓冲液和水组成。

5.根据权利要求4所示的试剂B，其特征在于：

所述引物1、所述引物2和所述探针A在所述试剂B中的浓度均为0.6μM；

6.检测鸭I型肝炎病毒和番鸭细小病毒的二重荧光PCR的试剂盒，包括权利要求1所述的引物组或权利要求2或3所述的试剂A或权利要求4或5所述的试剂B。

7.权利要求1所述的引物组或权利要求2或3所述的试剂A或权利要求4或5所述的试剂B或权利要求6所述试剂盒在制备检测和/或辅助检测待测样品中是否含有鸭I型肝炎病毒和/或番鸭细小病毒产品中的应用。

8.根据权利要求7所述应用，其特征在于：所述检测和/或辅助检测待测样品中是否含有鸭I型肝炎病毒和/或番鸭细小病毒为用权利要求2或3所述的试剂A或权利要求4或5所述的试剂B或权利要求6所述试剂盒对所述待测样品进行二重荧光PCR反应。