CN104278106B - 鸭坦布苏病毒和减蛋综合症病毒二重荧光定量rt-pcr检测试剂盒 - Google Patents

鸭坦布苏病毒和减蛋综合症病毒二重荧光定量rt-pcr检测试剂盒 Download PDF

Info

Publication number
CN104278106B
CN104278106B CN201410452098.4A CN201410452098A CN104278106B CN 104278106 B CN104278106 B CN 104278106B CN 201410452098 A CN201410452098 A CN 201410452098A CN 104278106 B CN104278106 B CN 104278106B
Authority
CN
China
Prior art keywords
primer
virus
probe
egg
duck tembusu
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Active
Application number
CN201410452098.4A
Other languages
English (en)
Other versions
CN104278106A (zh
Inventor
谢芝勋
曾婷婷
谢丽基
刘加波
庞耀珊
范晴
罗思思
邓显文
谢志勤
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Guangxi Veterinary Research Institute
Original Assignee
Guangxi Veterinary Research Institute
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Guangxi Veterinary Research Institute filed Critical Guangxi Veterinary Research Institute
Priority to CN201410452098.4A priority Critical patent/CN104278106B/zh
Publication of CN104278106A publication Critical patent/CN104278106A/zh
Application granted granted Critical
Publication of CN104278106B publication Critical patent/CN104278106B/zh
Active legal-status Critical Current
Anticipated expiration legal-status Critical

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/70—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving virus or bacteriophage
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
    • C12Q1/6844—Nucleic acid amplification reactions
    • C12Q1/6851—Quantitative amplification

Landscapes

  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Analytical Chemistry (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • Virology (AREA)
  • Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)

Abstract

本发明公开了一种鸭坦布苏病毒和减蛋综合症病毒二重荧光定量RT‑PCR检测试剂盒，包括引物组和探针组；引物组有引物1至4，它们分别具有序列表SEQ.ID.No.1和2、SEQ.ID.No.4和5的碱基序列；探针组有探针A和探针B，它们分别具有序列表SEQ.ID.No.3和6的碱基序列。实验证明，本发明具有检测时间短、检测敏感性高且特异性强的优点，可实现同时检测和鉴别鸭坦布苏病毒和减蛋综合症病毒两种病原体，并对其相应病原含量进行定量，因而可用于鸭坦布苏病毒和减蛋综合症病毒疫苗和药物疗效的评估，以及其致病机理等方面的研究，因此本发明对鸭坦布苏病毒和减蛋综合症病毒的防治有重要意义。

Description

鸭坦布苏病毒和减蛋综合症病毒二重荧光定量RT-PCR检测试 剂盒
技术领域
本发明属于RT-PCR检测试剂盒技术领域，尤其涉及一种鸭坦布苏病毒和减蛋综合症病毒二重荧光定量RT-PCR检测试剂盒。
背景技术
鸭坦布苏病毒(Duck Tembusu Virus,DTMUV)是危害病原。该病主要侵害产蛋鸭和雏鸭，引起产蛋鸭产蛋急剧下降和少量死亡，导致产蛋鸭高淘汰率，自2010年爆发以来严重危害养鸭业。减蛋综合症病毒(Egg Dropping Syndrome Virus，EDSV)，同样引起产蛋鸭的产蛋下降。鸭坦布苏病毒和减蛋综合症病毒感染产蛋鸭后，引起相似的症状即产蛋下降，因此迫切需要建立一种快速敏感的鸭坦布苏病毒和减蛋综合症病毒检测方法，以便在感染早期就能检测出这些病毒，从而为这些病的控制争取宝贵的时间。目前，这两种病毒的传统检测方法有病毒分离、琼脂扩散试验等，但这些检测存在耗时长、敏感性较低、不易标准化等缺点，在实际应用中具有一定的局限性。
荧光定量PCR技术实现了对模板的定量，而且具有敏感、特异、准确可靠、能实现多重反应和实时性好等特点。在实际应用中，当样品量非常大时，单重荧光PCR在成本和时间方面就存在一定的劣势，迫切需要一种高通量、低成本、高效率的方法来进行批量的快速检测。多重荧光PCR采用多对引物扩增检测多个模板，克服了单重荧光PCR的不足。但是，建立一个多重荧光PCR方法比单重的要复杂得多，其对试剂和引物的要求更高，同时需要保证不同探针所标记的荧光基团间无相互干扰，使用的荧光定量PCR仪具有相应的多个检测通道。目前，还未见有应用多重荧光定量PCR技术对鸭坦布苏病毒和减蛋综合症病毒进行检测和诊断的报道。
发明内容
本发明要解决的技术问题是提供一种敏感性好、特异性高、准确可靠、快速方便的鸭坦布苏病毒和减蛋综合症病毒二重荧光定量RT-PCR检测试剂盒，以实现同时检测并定量鸭坦布苏病毒和减蛋综合症病毒两种病原体。
为解决上述技术问题，本发明采用以下技术方案：鸭坦布苏病毒和减蛋综合症病毒二重荧光定量RT-PCR检测引物组，包括两对特异性引物，分别是引物1和2、引物3和4，它们分别具有序列表SEQ.ID.No.1和2、SEQ.ID.No.4和5的碱基序列。
鸭坦布苏病毒和减蛋综合症病毒二重荧光定量RT-PCR检测试剂盒，包括引物组和探针组；引物组有引物1至4，它们分别具有序列表SEQ.ID.No.1和2、SEQ.ID.No.4和5的碱基序列；探针组有探针A和探针B，它们分别具有序列表SEQ.ID.No.3和6的碱基序列。
探针A的5’端标记有报告荧光染料FAM，3’端标记有淬灭荧光染料BHQ1；探针B的5’端标记有报告荧光染料ROX，3’端标记有淬灭荧光染料BHQ2。
引物1、引物2、探针A、引物3、引物4和探针B的摩尔比为5：5：5：2：2：2。
该试剂盒含有以下试剂：
A液：PCR扩增缓冲液、引物1、引物2、探针A、引物3、引物4、探针B；
B液：DTMUV+EDSV模板，作为阳性对照；
C液：ddH2O，作为阴性对照。
A液中引物1、引物2、探针A终浓度均为0.5μmol/L，引物3、引物4、探针B终浓度均为0.2μmol/L。
针对目前缺乏对鸭坦布苏病毒和减蛋综合症病毒同时进行检测和诊断的有效可靠的技术，发明人研究筛选了两套特异性的探针和引物，并通过进行不同浓度的配比，获得最佳引物和探针的浓度组合，据此建立了鸭坦布苏病毒和减蛋综合症病毒的二重荧光定量RT-PCR的检测方法，并制备了相应的检测试剂盒。实验证明，本发明具有如下优点：
1)检测时间短
应用本发明可实现一管二检的目的，并且反转录和PCR一步完成，仅需约30分钟，并且反应结果可以直接通过电脑观察，而常规的RT-PCR方法起码需要3.5小时来完成扩增反应，然后还得花2小时进行凝胶电泳来观察结果；
2)检测敏感性高且特异性强
当鸭坦布苏病毒和减蛋综合症病毒同时存在时，本发明对其检测的CT值与单个病毒检测的CT值比较，结果基本一样，并未影响对鸭坦布苏病毒和减蛋综合症病毒的检出及检出的敏感性。另外，利用本发明还可对样品中相应病原含量进行定量，并且检测敏感性非常高，均能检测到200个拷贝的鸭坦布苏病毒和减蛋综合症病毒，比常规PCR方法敏感性高10倍，因而可用于鸭坦布苏病毒和减蛋综合症病毒疫苗和药物疗效的评估，以及其致病机理等方面的研究，因此本发明对鸭坦布苏病毒和减蛋综合症病毒的防治有重要意义。
附图说明
图1是荧光定量RT-PCR检测鸭坦布苏病毒的敏感性(ROX通道)结果图，图中：1～8分别为1×109～1×102拷贝/μl，9和10空白对照(为DEPC水)。
图2是荧光定量RT-PCR检测鸭坦布苏病毒的敏感性(ROX通道)的标准曲线。
图3是荧光定量RT-PCR检测减蛋综合症病毒的敏感性(FAM通道)结果图，图中：1～8分别为1×109～1×102拷贝/μl，9空白对照(为DEPC水)。
图4是荧光定量RT-PCR检测减蛋综合症病毒的敏感性(FAM通道)的标准曲线。
图5是荧光定量RT-PCR检测鸭坦布苏病毒的特异性(ROX通道)结果图，图中：1鸭坦布苏病毒，2鸭坦布苏病毒+减蛋综合症病毒，3番鸭细小病毒，4鸭圆环病毒，5新城疫病毒，6鸭瘟病毒，7H9亚型禽流感，8ddH2O。
图6是荧光定量RT-PCR检测减蛋综合症病毒的特异性(FAM通道)结果图，图中：其中1减蛋综合症病毒，2鸭坦布苏病毒+减蛋综合症病毒，3番鸭细小病毒，4鸭圆环病毒，5新城疫病毒，6鸭瘟病毒，7H9亚型禽流感，8ddH2O。
图7是荧光定量RT-PCR检测鸭坦布苏病毒的批内重复性(ROX通道)结果图，图中：1-3分别同一批次内三个重复样品,4和5为阴性对照。
图8是荧光定量RT-PCR检测减蛋综合症病毒的批内重复性(FAM通道)结果图，图中：1-3分别为同一批次内3个重复样品，4空白对照。
具体实施方式
以下实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法；所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。具体所用材料和试剂如下：
Lightcycler2.0荧光定量PCR仪(Roche)；DNA片断回收试剂盒和质粒小量提取试剂盒购自BioDev公司；pGEM-T Easy试剂盒购自Promega公司；T7体外转录试剂盒购自Fermengtas公司；One Step PrimeScript RT-PCR Kit购自大连宝生物公司；TIANamp病毒基因组DNA/RNA提取试剂盒购自天根生化科技有限公司。
鸭坦布苏病毒记载在“4株广西鸭源坦布苏病毒分离及初步鉴定”，中国动物检疫，2013，30(6):31-35，公众可从广西壮族自治区兽医研究所获得；
减蛋综合症病毒记载在“减蛋综合症植物油乳剂苗的研究”，中国预防兽医学报，2000，(04):23-27,公众可从广西壮族自治区兽医研究所获得；
鸭圆环病毒记载在“广西部分地区鸭圆环病毒感染情况调查”，中国畜牧兽医,2010，37(11):156-158,公众可从广西壮族自治区兽医研究所获得；
小鹅瘟病毒记载在“小鹅瘟病毒荧光定量PCR检测方法的建立”，上海畜牧兽医通讯,2008，160(06):30-31，公众可从广西壮族自治区兽医研究所获得；
新城疫病毒记载在“新城疫植物油乳剂苗的研究”，中国预防兽医学报,2000,(04):23-27,公众可从广西壮族自治区兽医研究所获得；
鸭瘟病毒AV1221株购自中国兽医药品监察所；
H9亚型禽流感病毒记载在“多重反转录聚合酶链反应快速检测鉴别H9亚型禽流感病毒方法的建立”，中国人兽共患病学报,2006,(09):858-860，公众可从广西壮族自治区兽医研究所获得。
实施例1、引物与Taqman探针的设计与合成
根据GenBank中鸭坦布苏病毒和减蛋综合症病毒的保守序列，采用PrimerExpress 3.0软件，设计了多套探针和引物，通过分析其引物之间的二聚体，选定两对特异性引物和两条Taqmam探针(表1)。
表1为引物和TaqMan探针序列(5’-3’)
实施例2、荧光定量RT-PCR检测的建立
一、荧光定量RT-PCR检测方法的确定
1、样本的制备
1)、核酸的提取
参照TIANamp病毒基因组DNA/RNA提取试剂盒说明书，提取鸭坦布苏病毒、新城疫病毒和H9亚型禽流感的RNA，提取减蛋综合症病毒、鸭圆环病毒、小鹅瘟病毒和鸭瘟病毒的DNA。
2)、RNA的反转录
鸭坦布苏病毒反转录合成cDNA，具体如下：建立如下反转录体系，总反应体积为20μL)的鸭坦布苏病毒AV2111RNA为2μL(约20μg)，4μL 8mM MgCl2(大连宝生物工程有限公司，产品目录号：DRR0019A)，2μL 10×PCR缓冲液(大连宝生物工程有限公司，产品目录号：DRR0019A)，2μL 10mM dNTP(四种碱基)，1μL RNA抑制剂(大连宝生物工程有限公司，产品目录号：DRR0019A)，1μL随机引物(大连宝生物工程有限公司，产品目录号：DRR0019A)，1μLAMV反转录酶(大连宝生物工程有限公司，产品目录号：DRR0019A)，用无Rnase水加至总体积为20μL，离心均匀，于25℃10min，42℃60min，95℃5min，4℃结束，得到鸭坦布苏病毒cDNA。
2、标准品的制备
分别以上述得到的鸭坦布苏病毒的cDNA和减蛋综合症病毒的DNA为模板进行PCR扩增，反应体系为50μL(含0.2mmol/L dNTP、2.5mmol/L MgCl2、0.5μmol/L引物(表1)、1.25UTaq聚合酶、1×PCR buffer、5μL DNA模板)，反应条件为：95℃预变性5min，94℃60s，50℃60s，70℃60s，35个循环，72℃延伸10min。
PCR产物经2％琼脂糖凝胶电泳，回收目的片断后克隆至pGEM-T Easy载体，阳性克隆菌(pGEM-EDSV和pGEM-TMUV)送大连宝生生物技术有限公司进行测序，pGEM-EDSV菌中含有的PCR产物大小为65bp，具有序列表中SEQ.ID.No.7的第1-65位核苷酸(为EDSV FJ12025株的penton protein序列，genbank号为KF286430.1，第12957-13022位核苷酸)，说明为阳性克隆，含有EDSV病毒；pGEM-TMUV菌中含有的PCR产物大小为71bp，具有序列表中SEQ.ID.No.8的的第1-71位核苷酸(为GX2013H株的NS5基因，genbank号为:KJ700462.1，第9764-9837位核苷酸)，说明为阳性克隆，含有TMUV病毒。
分别提取pGEM-EDSV菌和pGEM-TMUV菌中的质粒，得到pGEM-EDSV质粒和pGEM-TMUV质粒。
将pGEM-TMUV质粒作为阳性标准品，按照文献(Vaitomaa,J.,Rantala A.,HalinenK.,Rouhiainen L.,Tallberg P.,Mokelke L.&Sivonen K.(2003)Quantitative Real-Time PCR for Determination of Microcystin Synthetase E Copy Numbers forMicrocystis and Anabaena in Lakes.Applied and Environmental Microbiology.69:7289-7297.)计算拷贝数，结果为拷贝数为2.1×1010拷贝/μl。
将pGEM-TMUV质粒，37℃SalⅠ单酶切过夜，使质粒线性化，琼脂糖凝胶电泳及试剂盒回收纯化质粒DNA线性化产物，用于体外转录，按T7体外转录试剂盒说明加入反应试剂37℃作用2h，然后加DNaseⅠ酶1μl，37℃消化转录产物中未转录的DNA 20min，70℃灭活DNaseⅠ酶15min，用等体积盐酸饱和苯酚、氯仿抽提，再用等体积氯仿抽提，取上清用0.5倍体积5M醋酸氨和2倍体积冰乙醇沉淀，再用75％冰乙醇洗沉淀，最后用DEPC水溶解，得到DHV-RNA，紫外分光光度计测DHV-RNA浓度和纯度，-70℃保存备用，结果为TMUV-RNA浓度为1.3×1013拷贝/μl。
3、荧光定量RT-PCR的反应体系中引物和探针浓度的确立
用TMUV-RNA和质粒pGEM-EDSV(二者的拷贝比为1:1)作为模板，将表1中的引物和探针在终浓度为0.2-0.8μmol/L之间，进行不同浓度的配比进行荧光定量RT-PCR，选择引物和探针的最佳浓度。
扩增反应总体积为20μl，其中2×One Step RT-PCR Buffer III(大连宝生物工程有限公司，产品目录号：DRR064A)10μl；Takara Ex Taq HS(大连宝生物工程有限公司，产品目录号：DRR064A)0.4μl；PrimeScript RT Enzyme Mix II(大连宝生物工程有限公司，产品目录号：DRR064A)0.4μl；2μl模板，终浓度均为0.2-0.8μmol/L的TMUV-F、TMUV-R和TMUV-probe；终浓度均为0.2-0.8μmol/L的EDSV-F、EDSV-R和EDSV-probe；余下用灭菌DEPC水补足，均匀混合，置Lightcycler荧光定量PCR仪上进行自动化扩增反应。温度转换率为20℃/s，在每个循环的延伸结束时进行荧光信号检测。反应程序为：42℃5min；95℃10s；然后按95℃变性10s、60℃退火延伸20s进行40个循环；最后于40℃结束反应。
结果显示，不同的引物和探针终浓度对试验结果影响比较大，鸭坦布苏病毒上、下游引物及探针终浓度分别为0.2μmol/L，减蛋综合症病毒上、下游引物及探针终浓度分别为0.5μmol/L，对标准品的检测可获得较小的Ct值。
因此，优化的荧光定量RT-PCR的反应体系如下：扩增反应总体积为20μl，其中2×One Step RT-PCR Buffer III(大连宝生物工程有限公司，产品目录号：DRR064A)10μl；Takara Ex Taq HS(大连宝生物工程有限公司，产品目录号：DRR064A)0.4μl；PrimeScriptRT Enzyme Mix II(大连宝生物工程有限公司，产品目录号：DRR064A)0.4μl；2μl模板，终浓度均为0.2μM的TMUV-F、TMUV-R和TMUV-probe；终浓度均为0.5μM的EDSV-F、EDSV-R和EDSV-probe；余下用灭菌DEPC水补足，均匀混合，置Lightcycler荧光定量PCR仪上进行自动化扩增反应。温度转换率为20℃/s，在每个循环的延伸结束时进行荧光信号检测。反应程序为：42℃5min；95℃10s；然后按95℃变性10s、60℃退火延伸20s进行50个循环；最后于40℃结束反应。
FAM在530nm激发光下发荧光，用来检测减蛋综合症病毒；ROX在610nm激发光下发荧光，用来检测鸭坦布苏病毒；
二、荧光定量RT-PCR的敏感性试验
分别以10倍系列稀释的TMUV-RNA(鸭坦布苏病毒)和pGEM-EDSV质粒(减蛋综合症病毒)，得到拷贝数均为1×107-1×102拷贝/μl的TMUV-RNA和pGEM-EDSV质粒，再将各种拷贝数的TMUV-RNA和pGEM-EDSV质粒混合作为模板进行二重荧光定量PCR扩增，扩增体系和条件如一、3中优化的荧光定量RT-PCR的反应体系和反应程序。
在610nm激发光下的结果(ROX)如图1和2所示；在530nm激发光下的结果(FAM)如图3和4所示。从荧光曲线可见，对鸭坦布苏病毒和减蛋综合症病毒的检测100拷贝仍有荧光曲线，表明该检测方法对鸭坦布苏病毒和减蛋综合症病毒的灵敏度均为100拷贝，比常规PCR方法敏感性高10倍，重复检测的结果一致。从标准曲线可见扩增成线性，说明所建立的方法具有很好的扩增效率。
三、荧光定量RT-PCR的特异性试验及干扰性试验
1、荧光定量RT-PCR的特异性试验
按照上述一、3中优化的荧光定量RT-PCR的反应体系和反应程序进行荧光定量RT-PCR，不同的是模板分别为鸭坦布苏病毒RNA、鸭坦布苏病毒RNA+减蛋综合症病毒DNA、番鸭细小病毒RNA、鸭圆环病毒DNA、新城疫病毒RNA、鸭瘟病毒DNA、H9亚型禽流感RNA，以ddH2O作为阴性对照。
在610nm激发光下检测鸭坦布苏病毒的特异性，结果(ROX)如图5所示，可见，样品1和2有PCR产物，得到相应病毒的特异性荧光曲线，而样品3-8均没有特异性荧光曲线，证实所设计的引物探针具有特异性，该方法特异性强，与其它检测对象无交叉反应。
在530nm激发光下检测减蛋综合症病毒的特异性，结果(FAM)如图6所示，可见，样品1和2有PCR产物，得到相应病毒的特异性荧光曲线，而样品3-8均没有特异性荧光曲线，证实所设计的引物探针具有特异性，该方法特异性强，与其它检测对象无交叉反应。
应用建立的二重荧光定量PCR，进行检测以确定两种模板存在时是否对检测的Ct值产生影响，图5中鸭坦布苏病毒、鸭坦布苏病毒RNA+减蛋综合症病毒DNA混合样本(2)检测的CT值分别为7.26和7.68；图6中，减蛋综合症病毒DNA、鸭坦布苏病毒RNA+减蛋综合症病毒DNA混合样本检测的CT值分别为8.31和8.79。结果说明，样品中存在两种病毒与存在单种病毒，检测的CT值变异非常小，并未影响对鸭坦布苏病毒和减蛋综合症病毒的检出及检出的敏感性。因此，本发明的引物、探针和及其建立的二重荧光定量RT-PCR检测方法可应用于鉴定未知样本是否感染鸭坦布苏病毒和鸭坦布苏病毒，二重荧光PCR反应结果的判断如下：
反应结果为一条直线，则为阴性；反应结果为S型曲线，则为阳性；
若在610nm激发光下(ROX)的反应结果为S型曲线，则待测样本中含有鸭坦布苏病毒；反之，则样品中不含有鸭坦布苏病毒；若在530nm激发光下(FAM)的反应结果为S型曲线，则待测样本中含有减蛋综合症病毒；反之，则样品中不含有减蛋综合症病毒；
若在610nm激发光下(ROX)和530nm激发光下(FAM)的反应结果均为S型曲线，则样品中含有鸭坦布苏病毒和减蛋综合症病毒；若在610nm激发光下(ROX)和530nm激发光下(FAM)的反应结果均不为S型曲线，则样品中均不含有鸭坦布苏病毒和减蛋综合症病毒。
四、重复性试验
按照上述一、3中优化的荧光定量RT-PCR的反应体系和反应程序进行荧光定量RT-PCR，不同的是模板为拷贝数均为1×108拷贝/μl的鸭坦布苏病毒RNA和减蛋综合症病毒DNA混合的阳性样品。分为3个标本同时检测。通过计算Ct值的标准差(SD)和变异系数(CV)来验证荧光定量RT-PCR的批内重复性。三天后重复检测保存于-20℃的模板，来验证模板的稳定性及荧光定量RT-PCR的批间重复性。
检测结果见图7-8和表3所示，图7为在610nm激发光(ROX)下检测鸭坦布苏病毒RNA通道，图8为在530nm激发光(FAM)下检测减蛋综合症病毒通道，可见，变异系数均小于3％(表3)。结果说明此方法具有良好的准确性和重复性。
表3批间重复性
实施例3、检测试剂盒的组装
根据实施例1和2的研究结果，组装检测试剂盒以方便使用。
A液：PCR扩增缓冲液、引物1、引物2、探针A、引物3、引物4、探针B；其中，PrimeScriptTM Reverse Transcriptase(大连宝生物工程有限公司,产品目录号:2680A)；Premix Ex TaqTM(Probe qPCR)(大连宝生物工程有限公司,产品目录号:RR390A)；引物1、引物2、探针A终浓度均为0.5μmol/L，引物3、引物4、探针B终浓度均为0.2μmol/L；
B液：DTMUV+EDSV模板，作为阳性对照；
C液：ddH2O，作为阴性对照。
实施例4、临床病料的检测
待测样本为广西地区鸭群收集的100份病料(编号为1-100)，分别提取鸭病料(病鸭的肝、病鸭的脾脏或病鸭的肺脏)的RNA和DNA。分别将编号为1-100各个样本的DNA和RNA混合(体积比为1:1)作为模板，使用实施例3的试剂盒，按照实施例2一、3中优化的荧光定量RT-PCR的反应体系和反应程序进行荧光定量RT-PCR。
参照上述判断标准评价检测结果如下：
检出鸭坦布苏病毒15份(阳性率为15％)，检出减蛋综合症病毒5份(阳性率为5％)，其他样本均未检出鸭坦布苏病毒和减蛋综合症病毒。
同时，将100份病料(编号为1-100)分别按照参照文献[1]李庆阳，陈芳艳，刘平,等.鸭坦布苏病毒TaqMan荧光定量RT－PCR检测方法的建立[J].动物医学进展,2012,33(7):18-22.和参照文献[2]李文贵,宋建领；减蛋综合征病毒套式PCR检测技术的研究[J].中国兽医科技,2000,12:5-8.中的方法进行鸭坦布苏病毒和减蛋综合症病毒检测，结果与本发明一致，说明本发明的方法正确。
上述结果说明广西地区的鸭群存在鸭坦布苏病毒和减蛋综合症病毒的感染，该二重荧光定量RT-PCR方法的建立，对广西地区鸭群的疫病控制有指导意义。

Claims (6)

1.鸭坦布苏病毒和减蛋综合症病毒二重荧光定量RT-PCR检测引物组，其特征在于包括两对特异性引物，分别是引物1和2、引物3和4，它们分别为序列表SEQ.ID.No.1和2、SEQ.ID.No.4和5的碱基序列。
2.一种鸭坦布苏病毒和减蛋综合症病毒二重荧光定量RT-PCR检测试剂盒，其特征在于包括引物组和探针组；引物组有引物1至4，它们分别为序列表SEQ.ID.No.1和2、SEQ.ID.No.4和5的碱基序列；探针组有探针A和探针B，它们分别为序列表SEQ.ID.No.3和6的碱基序列。
3.根据权利要求2所述的鸭坦布苏病毒和减蛋综合症病毒二重荧光定量RT-PCR检测试剂盒，其特征在于：所述探针A的5’端标记有报告荧光染料FAM，3’端标记有淬灭荧光染料BHQ1；所述探针B的5’端标记有报告荧光染料ROX，3’端标记有淬灭荧光染料BHQ2。
4.根据权利要求2所述的鸭坦布苏病毒和减蛋综合症病毒二重荧光定量RT-PCR检测试剂盒，其特征在于：所述引物1、引物2、探针A、引物3、引物4和探针B的摩尔比为5：5：5：2：2：2。
5.根据权利要求3所述的鸭坦布苏病毒和减蛋综合症病毒二重荧光定量RT-PCR检测试剂盒，其特征在于该试剂盒含有以下试剂：
A液：PCR扩增缓冲液、引物1、引物2、探针A、引物3、引物4、探针B；
B液：鸭坦布苏病毒+减蛋综合症病毒模板，作为阳性对照；
C液：ddH2O，作为阴性对照。
6.根据权利要求5所述的鸭坦布苏病毒和减蛋综合症病毒二重荧光定量RT-PCR检测试剂盒，其特征在于：所述A液中引物1、引物2、探针A终浓度均为0.5μmol/L，引物3、引物4、探针B终浓度均为0.2μmol/L。
CN201410452098.4A 2014-09-05 2014-09-05 鸭坦布苏病毒和减蛋综合症病毒二重荧光定量rt-pcr检测试剂盒 Active CN104278106B (zh)

Priority Applications (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN201410452098.4A CN104278106B (zh) 2014-09-05 2014-09-05 鸭坦布苏病毒和减蛋综合症病毒二重荧光定量rt-pcr检测试剂盒

Applications Claiming Priority (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN201410452098.4A CN104278106B (zh) 2014-09-05 2014-09-05 鸭坦布苏病毒和减蛋综合症病毒二重荧光定量rt-pcr检测试剂盒

Publications (2)

Publication Number Publication Date
CN104278106A CN104278106A (zh) 2015-01-14
CN104278106B true CN104278106B (zh) 2017-01-11

Family

ID=52253448

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
CN201410452098.4A Active CN104278106B (zh) 2014-09-05 2014-09-05 鸭坦布苏病毒和减蛋综合症病毒二重荧光定量rt-pcr检测试剂盒

Country Status (1)

Country Link
CN (1) CN104278106B (zh)

Families Citing this family (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN108728419A (zh) * 2018-06-07 2018-11-02 扬州大学 表达禽腺病毒penton蛋白重组新城疫疫苗候选株rAI4-penton及构建方法
CN111378782B (zh) * 2018-12-27 2022-11-29 中国农业科学院上海兽医研究所(中国动物卫生与流行病学中心上海分中心) 鸭蛋减产综合征病毒检测方法及其试剂盒

Family Cites Families (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN103320540B (zh) * 2013-07-11 2016-08-10 广西壮族自治区兽医研究所 鸭坦布苏病毒、减蛋综合症病毒和新城疫病毒的三重rt-pcr试剂盒
CN103320538B (zh) * 2013-07-11 2016-09-07 广西壮族自治区兽医研究所 鸭坦布苏病毒和减蛋综合症病毒的二重rt-pcr试剂盒

Also Published As

Publication number Publication date
CN104278106A (zh) 2015-01-14

Similar Documents

Publication Publication Date Title
CN103773899B (zh) 鉴别11种鸭病毒病的GeXP检测试剂盒
CN107513584B (zh) 一种检测肠道病毒的五重荧光定量试剂盒
CN104263858B (zh) 鸡滑液囊支原体和禽呼肠孤病毒的二重荧光定量rt-pcr检测试剂盒及其引物组
CN107299155A (zh) 一种鹅星状病毒实时荧光定量pcr检测的引物和探针
CN103045755B (zh) 一种检测埃博拉病毒的荧光定量pcr检测方法及其引物和试剂盒
AU2005252615A1 (en) Diagnostics primers and method for detecting avian influenza virus subtype H5 and H5N1
CN106555012A (zh) 用于a型动物流感病毒检测的试剂、检测方法及应用
Borm et al. A universal avian endogenous real-time reverse transcriptase–polymerase chain reaction control and its application to avian influenza diagnosis and quantification
CN104046704A (zh) 一种快速鉴别1型和3型鸭甲肝病毒的双重荧光定量方法
CN104498627A (zh) H3n8亚型禽流感病毒一步法实时荧光定量rt-pcr检测试剂盒
Yin et al. Visual detection of duck tembusu virus with CRISPR/Cas13: a sensitive and specific point-of-care detection
CN110343784A (zh) 基于熔解曲线的四重流感病毒核酸检测的组合物及试剂盒
CN105950785A (zh) 禽流感病毒、新城疫病毒和传染性支气管炎病毒的三重荧光rt-pcr检测试剂盒及引物、探针
CN104278106B (zh) 鸭坦布苏病毒和减蛋综合症病毒二重荧光定量rt-pcr检测试剂盒
Xu et al. Simultaneous detection of novel H7N9 and other influenza A viruses in poultry by multiplex real-time RT-PCR
CN102586487B (zh) 鸭i型肝炎病毒和番鸭细小病毒的二重荧光定量rt-pcr检测试剂盒
CN101392299B (zh) 一种马流感检测试剂盒和检测方法
CN109722492B (zh) 一种检测h5和h7n9亚型高致病性禽流感病毒和h9亚型禽流感病毒的方法
CN104593357A (zh) 用于检测肠道病毒的核酸及其应用
CN107287347B (zh) 戊型肝炎病毒实时荧光逆转录pcr检测引物、探针、检测试剂盒和检测方法
CN104531899B (zh) 禽流感病毒及其H6亚型和N1亚型的GeXP快速检测试剂盒
CN105525038A (zh) 新城疫病毒强、弱毒一步法实时荧光rt-pcr检测试剂盒
CN103320527B (zh) 一种用于以荧光rt-pcr检测样品中禽流感病毒的引物对、探针和包含其的试剂盒
CN103320528B (zh) 一种用于以荧光rt-pcr检测样品中禽流感病毒的引物对、探针和包含其的试剂盒
Kuriakose et al. Detection of avian influenza viruses and differentiation of H5, H7, N1, and N2 subtypes using a multiplex microsphere assay

Legal Events

Date Code Title Description
C06 Publication
PB01 Publication
C10 Entry into substantive examination
SE01 Entry into force of request for substantive examination
GR01 Patent grant
GR01 Patent grant